KR20230002233A - Development of SNP markers and use thereof for discrimination of Pyogo mushroom cultivar Chamaram - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 표고버섯 품종 중 참아람 판별용 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a SNP marker composition for discriminating chamaram among shiitake mushroom varieties and its use.
본 발명은 산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 개발하여 국내에서 주력으로 재배되고 있는 표고버섯 품종 중 산조701호 또는 참아람 판별용 SNP 마커 및 이를 이용한 HRM-PCR 분석에 관한 것으로서, 산조701호 또는 참아람의 특이적인 SNP를 포함하는 마커 서열인 RL-LE-202, RL-LE-203을 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 중폭시킬 수 있는 프라이머 서열, 상기 마커 서열과 프라이머 서열을 이용한 HRM-PCR 분석방법을 통해 위의 품종을 판별하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a SNP marker for distinguishing Sanjo 701 or Chamaram among shiitake mushroom varieties developed by the Forest Mushroom Research Center of the National Forestry Cooperative Federation and cultivated in Korea, and HRM-PCR analysis using the same. Primer sequences capable of amplifying RL-LE-202 and RL-LE-203, which are marker sequences containing Aram-specific SNPs, by polymerase chain reaction (PCR), HRM-PCR analysis using the marker sequences and primer sequences It is about how to determine the above varieties through the method.
표고(Lentinula edodes)는 주름버섯목(Agaricales)에 속하는 백색부후균으로, 나무의 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌을 분해하며 자란다. 지난 20여 년간 표고의 재배는 크게 증가하여, 현재는 세계 버섯 생산량의 약 22%를 구성하며 가장 많이 재배되는 식용버섯으로 알려져 있다. 한국, 중국, 일본 등 아시아 국가에서 주로 재배되며, 미국, 캐나다, 네덜란드 등 서구 국가에서도 상업적으로 재배되고 있다. 2019년 기준 표고버섯은 국내 임산버섯 생산량의 약 98%를 차지하며 약 2,018억 원의 생산액을 기록하였다. 표고는 다양한 영양소와 다당류가 풍부하고 맛과 향이 독특하여 요리 재료로 사용되고 있을 뿐만 아니라 항암효과, 면역조절, 항바이러스효과 등의 의학적 가치도 입증되고 있다.Shiitake ( Lentinula edodes ) is a white rotting fungus belonging to the order Agaricales , which grows while decomposing cellulose, hemicellulose, and lignin of trees. Over the past 20 years, shiitake cultivation has greatly increased, and now accounts for about 22% of world mushroom production, and is known as the most cultivated edible mushroom. It is mainly cultivated in Asian countries such as Korea, China, and Japan, and is also commercially grown in Western countries such as the United States, Canada, and the Netherlands. As of 2019, shiitake mushrooms accounted for about 98% of domestic forest mushroom production, recording a production value of about KRW 201.8 billion. Shiitake is rich in various nutrients and polysaccharides, and has a unique taste and aroma, so it is not only used as a cooking ingredient, but also has medical values such as anticancer, immune regulation, and antiviral effects.
한국은 2002년 UPOV에 가입하였고, 2008년부터 종자산업법에 의거해 표고가 품종보호 대상 작물로 지정되었다. 그리고 2010년 유전자원 접근 및 이익공유에 관한 나고야 의정서가 채택되어 2017년에 국내에 발효됨에 따라, 신품종 및 개발된 품종들에 대한 구별성 확보의 중요성이 증대되고 있다. 현재까지 약 57여 개의 표고 품종이 개발되어 출원 및 등록되어 있고, 품종들의 구별은 산림청에서 제작한 표고버섯 특성조사요령에 의해 외부 형태적 특성에 기반하여 이루어지고 있어 정확한 판별이 매우 어렵다.Korea joined UPOV in 2002, and since 2008, shiitake has been designated as a crop subject to variety protection in accordance with the Seed Industry Act. And as the Nagoya Protocol on Access to Genetic Resources and Benefit Sharing was adopted in 2010 and entered into force in Korea in 2017, the importance of securing distinction for new and developed varieties is increasing. Up to now, about 57 varieties of shiitake have been developed, applied for and registered, and the classification of varieties is based on the external morphological characteristics of shiitake mushrooms produced by the Korea Forest Service, making accurate identification very difficult.
분자 마커는 DNA의 염기서열의 차이를 기반으로 개체간 다형성을 나타내기 때문에 재배 환경이나 발달 단계에 영향을 받지 않고 신속하게 판별할 수 있다는 장점이 있다. 또한 조기 선발 및 계통 분석을 통한 육종기간의 단축과 육성을 위한 비용 감축도 가능하다. UPOV에서는 재현성 및 품종별 다형성이 높은 SSR (simple sequence repeat)이나 SNP (single nucleotide polymorphism) 마커 활용을 권장하고 있는데, 일반적으로 SSR을 이용한 변이 분석은 비용이 많이 소요되고 증폭 산물의 길이를 측정하여 비교하기 때문에 SNP 등 길이 차이가 없는 염기서열 변화는 확인이 어렵다는 단점이 있다. HRM (high-resolurion melting)은 증폭산물의 해리 온도 변화를 측정함으로써 GC 비율, 길이, 염기서열의 차이를 분석하는 방법으로, 저렴한 비용으로 빠른 시간 내 다수의 샘플을 분석할 수 있다.Molecular markers show polymorphisms among individuals based on differences in DNA nucleotide sequences, so they have the advantage of being able to quickly discriminate without being affected by the cultivation environment or developmental stage. In addition, it is possible to shorten the breeding period and reduce costs for breeding through early selection and systematic analysis. UPOV recommends the use of SSR (simple sequence repeat) or SNP (single nucleotide polymorphism) markers with high reproducibility and polymorphism for each breed. In general, mutation analysis using SSR is expensive, and the length of the amplification product is measured and compared. Therefore, it has the disadvantage that it is difficult to identify nucleotide sequence changes without length differences, such as SNPs. HRM (high-resolurion melting) is a method of analyzing differences in GC ratio, length, and base sequence by measuring the change in dissociation temperature of amplification products, and it is possible to analyze a large number of samples in a short time at low cost.
산림조합 중앙회 산림버섯연구센터에서 개발된 산조701호와 참아람은 국내에서 가장 많이 선호되는 톱밥배지 종균으로, 2020년 두 종균의 선호율은 각각 45.2%, 25.2%였다. 산조701호는 버섯의 색이 밝고 육질이 매우 단단하며 개체중량이 무겁다는 특징을 지니고 있고, 참아람은 산조701호와 버섯수량이 비슷하면서도 낮은 온도에서 버섯생육 및 품질이 우수하여 출하시기 다변화가 가능하다는 장점을 가지고 있다.Sanjo 701 and Chamaram, developed at the Forestry Mushroom Research Center of the National Forestry Cooperative Federation, are the most preferred sawdust medium spawn in Korea, and the preference rates for the two spawn in 2020 were 45.2% and 25.2%, respectively. Sanjo 701 has the characteristics of bright mushroom color, very hard flesh, and heavy individual weight. It has the advantage of being possible.
본 발명자들은 표고버섯의 게놈 염기서열을 이용하여 국내에서 가장 많이 재배되고 있는 표고 품종인 산조701호 또는 참아람을 구분할 수 있는 SNP 마커 및 분석법을 개발하였다. 각 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 마커 서열의 해리 온도를 HRM 분석함으로써 상기 품종들을 간단하게 구분할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors developed a SNP marker and analysis method capable of distinguishing Sanjo 701 or Chamaram, which are the most cultivated shiitake varieties in Korea, using the genome sequence of shiitake mushrooms. The present invention was completed by confirming that the cultivars can be easily distinguished by HRM analysis of the dissociation temperature of the marker sequence amplified using each primer pair.
본 발명은 표고버섯 품종인 산조701호 또는 참아람을 구분하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 산조701호 또는 참아람을 빠르고 정확하게 판별할 수 있는 바이오 마커를 제공하는 것이다. 본 발명은 표고버섯 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 마커 서열의 해리 온도를 HRM 분석함으로써 상기 품종들을 간단하게 구분할 수 있는 것을 특징으로 한다.The present invention relates to a SNP marker composition for distinguishing shiitake mushroom variety Sanjo 701 or Cham Aram and its use, and to provide a biomarker capable of quickly and accurately identifying Sanjo 701 or Cham Aram. The present invention is characterized in that the varieties can be simply distinguished by HRM analysis of the dissociation temperature of a marker sequence amplified using a pair of shiitake mushroom primers.
본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 표고 품종 산조701호 판별용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a biomarker composition for discrimination of shiitake cultivar Sanjo 701, including a primer set represented by each of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1로 표시되는 산조701호의 마커 서열 RL-LE-202에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the primer is characterized in that it specifically binds to the marker sequence RL-LE-202 of Sanjo 701 represented by SEQ ID NO: 1.
또한, 본 발명은 서열번호 5 및 서열번호 6의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 표고 품종 참아람 판별용 바이오마커 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a biomarker composition for discriminating shiitake cultivar Chamaram, including a primer set represented by each of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 4로 표시되는 참아람의 마커 서열 RL-LE-203에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the primer is characterized in that it specifically binds to the marker sequence RL-LE-203 of Chamaram represented by SEQ ID NO: 4.
또한, 본 발명은 상기 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 판별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for discrimination comprising the above composition and a reagent for carrying out an amplification reaction.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, reagents for performing the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, and a buffer, but are not limited thereto.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 산조701호 판별 방법:In addition, the present invention Sanjo 701 identification method comprising the following steps:
(a) 표고버섯으로부터 DNA를 추출하는 단계;(a) extracting DNA from shiitake mushrooms;
(b) 상기 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 이용하여, 상기 단계 (a)에서 분리된 DNA의 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 단계;(b) preparing an amplification product by performing an amplification reaction of the DNA separated in step (a) using the composition containing the primer set according to
(c) 상기 증폭 단계에서 melt curve를 측정하는 단계;(c) measuring a melt curve in the amplification step;
(d) 단계 (c)의 측정결과를 분석하는 단계; 및(d) analyzing the measurement result of step (c); and
(e) 측정결과가 Rl-LE-202 마커에 대해 헤테로 타입은 산조701로 판별하는 단계를 포함하는, 산조701호 판별 방법을 제공한다.(e) determining that the heterotype is Sanjo 701 for the Rl-LE-202 marker based on the measurement result, providing a method for determining Sanjo 701.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 참아람 판별 방법:In addition, the present invention is a true alarm determination method comprising the following steps:
(a) 표고버섯으로부터 DNA를 추출하는 단계;(a) extracting DNA from shiitake mushrooms;
(b) 상기 제2항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 이용하여, 상기 단계 (a)에서 분리된 DNA의 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 단계;(b) preparing an amplification product by performing an amplification reaction of the DNA separated in step (a) using the composition containing the primer set according to
(c) 상기 증폭 단계에서 melt curve를 측정하는 단계;(c) measuring a melt curve in the amplification step;
(d) 단계 (c)의 측정결과를 분석하는 단계; 및(d) analyzing the measurement result of step (c); and
(e) 측정결과가 Rl-LE-203 마커에 대해 헤테로 타입은 참아람으로 판별하는 단계를 포함하는, 참아람 판별 방법을 제공한다.(e) providing a method for determining whether the heterotype is true for the Rl-LE-203 marker based on the measurement result;
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 증폭 산물을 제조하는 단계 이후 95℃에서 7~13초간 가열한 뒤 60℃에서 95℃까지 초당 0.025℃씩 온도를 서서히 올리면서 melt curve를 측정하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, after the step of preparing the amplification product, after heating at 95 ° C for 7 to 13 seconds, the melt curve is measured while slowly raising the temperature from 60 ° C to 95 ° C by 0.025 ° C per second. It may be, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 SNP 마커는 real-time PCR을 기반으로 HRM을 통해 분석하기 때문에 빠르고 간편하게 산조701호 및 참아람을 판별할 수 있고, 아가로즈 겔 확인 등의 PCR 산물을 확인하는 절차를 생략 가능하다. SNP를 동정하는데 있어서 특이적인 probe 없이 primer만 사용하므로 품종을 구분하는 데에 드는 비용을 줄일 수 있다.Since the SNP marker according to the present invention is analyzed through HRM based on real-time PCR, Sanjo 701 and Chamaram can be quickly and easily identified, and the procedure of confirming PCR products such as agarose gel confirmation can be omitted. . In identifying SNPs, since only primers are used without specific probes, the cost of identifying varieties can be reduced.
균사 생장 단계에서도 정확한 판별이 가능하기 때문에 특정 품종 내지 계통을 굳이 재배하지 않아도 조기에 판별할 수 있고, 불법 유통된 종균으로 인한 품종혼입 예방과 상기 표고 균주들의 유통 시 품종인증 기술로의 활용이 가능하다.Since accurate identification is possible even at the mycelial growth stage, specific varieties or strains can be identified early without having to cultivate them, prevention of variety mixing due to illegally distributed seed fungi, and use as variety certification technology during distribution of the above shiitake strains is possible. Do.
도 1은 표고버섯 품종 중 산조701호 및 참아람의 염기서열과 프라이머에 관한 것이다.
도 2는 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하고 시퀀싱하여 변이를 나타낸 것이다.
도 3은 표고버섯 품종 중 산조701호 및 참아람을 PCR을 수행하고, HRM-PCR 분석을 수행한 결과에 대해 나타낸 것이다.Figure 1 relates to the base sequence and primers of Sanjo 701 and Cham Aram among shiitake mushroom varieties.
Figure 2 shows mutations by performing PCR and sequencing using primer sequences.
Figure 3 shows the results of performing PCR and HRM-PCR analysis on Sanjo 701 and Chamaram among shiitake mushroom varieties.
본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 표고 품종 산조701호 판별용 바이오마커 조성물에 대해 제공하는 것이다.The present invention provides a biomarker composition for discrimination of shiitake cultivar Sanjo 701, including a primer set represented by each of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
또한, 본 발명은 서열번호 5 및 서열번호 6의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 표고 품종 참아람 판별용 바이오마커 조성물에 대해 제공하는 것이다.In addition, the present invention is to provide a biomarker composition for discriminating shiitake cultivar Chamaram, including a primer set represented by each of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
또한, 본 발명은 상기 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 판별용 키트에 대해 제공하는 것이다.In addition, the present invention is to provide a kit for discrimination including the above composition and a reagent for carrying out an amplification reaction.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 있어서, ‘뉴클레오타이드’는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990))In the present invention, 'nucleotide' is deoxyribonucleotide or ribonucleotide that exists in single-stranded or double-stranded form, and includes analogs of natural nucleotides unless otherwise specified (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990))
본 발명에 있어서, ‘단일염기다형성(SNP)’은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(Individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(Intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(Degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 동의적(Synonymous)이라 하고 침묵 돌연변이라고도 불리는 SNP는 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(Non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.In the present invention, a 'single nucleotide polymorphism (SNP)' is a DNA sequence that occurs when a single base (A, T, C or G) in the genome is different between members of a species or between paired chromosomes of an individual. means the diversity of A single base may be changed (replaced), removed (deleted), or added (inserted) to a polynucleotide sequence. SNPs can cause changes in the translational frame. Single nucleotide polymorphisms may be involved in coding sequences of genes, non-coding regions of genes or intergenic regions between genes. SNPs in the coding sequence of a gene do not necessarily cause changes in the amino acid sequence of a target protein due to degeneracy of the genetic code. SNPs that form the same polypeptide sequence, also called synonymous and silent mutations, are said to be non-synonymous in the case of SNPs that form different polypeptide sequences. Non-synonymous SNPs can be missense or nonsense, with missense changes giving rise to other amino acids while nonsense changes form immature stop codons. SNPs present in non-protein-coding regions can lead to gene silencing, transcription factor binding or non-coding RNA sequences.
본 발명에 있어서, ‘프라이머’는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(Naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.In the present invention, 'primer' means an oligonucleotide, and conditions in which synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template) is induced, that is, the presence of nucleotides and a polymerizer such as DNA polymerase, and suitable It can act as an initiation point for synthesis under conditions of temperature and pH. Specifically, the primers are deoxyribonucleotides and are single-stranded. Primers used in the present invention may include naturally occurring dNMP (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides. In addition, the primer may also contain ribonucleotides.
본 발명에 있어서, ‘프라이머‘는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(Complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 수 있다. 상기 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(Analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(Phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(Peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(Intercalating agent)을 포함할 수 있다.In the present invention, 'primer' refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and may serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow for the synthesis of extension products to begin. The specific length and sequence of the primer may depend on the complexity of the DNA or RNA target required, as well as the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength. The oligonucleotide used as the primer may also contain a nucleotide analog, such as a phosphorothioate, an alkylphosphorothioate or a peptide nucleic acid, or an intercalating material agent) may be included.
본 발명에 이용되는 ‘프라이머’로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(Perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화 될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화 되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.As the 'primer' used in the present invention, a sequence that is perfectly complementary to the sequence containing the SNP may be used, but a sequence that is substantially complementary within a range that does not interfere with specific hybridization may be used. there is. Specifically, the probe used in the present invention includes a sequence capable of hybridizing to a sequence containing 10-30 consecutive nucleotide residues including the SNP of the present invention. More specifically, the 3'-end or 5'-end of the probe has a base complementary to the SNP base. In general, since the stability of duplexes formed by hybridization tends to be determined by the matching of sequences at the ends, in probes having bases complementary to SNP bases at the 3'-end or 5'-end, the terminal portion hybridizes. Otherwise, these duplexes can be broken under stringent conditions.
본 발명의 ‘키트’가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.When the 'kit' of the present invention is applied to a PCR amplification process, the kit of the present invention may optionally include reagents necessary for PCR amplification, such as buffer, DNA polymerase, DNA polymerase cofactor, and dNTPs. The kit of the present invention may be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 산조701호 판별 방법:In addition, the present invention Sanjo 701 identification method comprising the following steps:
(a) 표고버섯으로부터 DNA를 추출하는 단계;(a) extracting DNA from shiitake mushrooms;
(b) 상기 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 이용하여, 상기 단계 (a)에서 분리된 DNA의 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 단계;(b) preparing an amplification product by performing an amplification reaction of the DNA separated in step (a) using the composition containing the primer set according to
(c) 상기 증폭 단계에서 melt curve를 측정하는 단계;(c) measuring a melt curve in the amplification step;
(d) 단계 (c)의 측정결과를 분석하는 단계; 및(d) analyzing the measurement result of step (c); and
(e) 측정결과가 Rl-LE-202 마커에 대해 헤테로 타입은 산조701로 판별하는 단계를 포함하는, 산조701호 판별 방법에 대해 제공하는 것이다.(e) To provide a method for determining Sanjo 701, including the step of determining that Sanjo 701 is the heterotype for the Rl-LE-202 marker based on the measurement result.
마지막으로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 참아람 판별 방법:Finally, the present invention is a method for determining whether to be true, including the following steps:
(a) 표고버섯으로부터 DNA를 추출하는 단계;(a) extracting DNA from shiitake mushrooms;
(b) 상기 제2항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 이용하여, 상기 단계 (a)에서 분리된 DNA의 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 단계;(b) preparing an amplification product by performing an amplification reaction of the DNA separated in step (a) using the composition containing the primer set according to
(c) 상기 증폭 단계에서 melt curve를 측정하는 단계;(c) measuring a melt curve in the amplification step;
(d) 단계 (c)의 측정결과를 분석하는 단계; 및(d) analyzing the measurement result of step (c); and
(e) 측정결과가 Rl-LE-203 마커에 대해 헤테로 타입은 참아람으로 판별하는 단계를 포함하는, 참아람 판별 방법에 대해 제공하는 것이다.(e) To provide a method for determining whether the heterotype is true for the Rl-LE-203 marker as a result of the measurement, including the step of determining true true.
본 발명에 있어서, ‘HRM-PCR‘은 real-time PCR 기법을 기반으로 한 PCR 방법 중 하나이며, PCR 산물(product) 고유의 녹는 온도(melting temperature) 차이를 실시간으로 감지하여 PCR product의 서열 하나의 차이까지 구분하는 PCR 방법에 해당한다.In the present invention, 'HRM-PCR' is one of the PCR methods based on the real-time PCR technique, and detects the difference in melting temperature inherent in the PCR product in real time to obtain one sequence of the PCR product. It corresponds to the PCR method that distinguishes even the difference of
구체적으로 PCR product 가 만들어지면 그 PCR product 는 DNA 서열에 따라 고유의 Tm 값을 갖고, 이중가닥에 끼어들어가는 intercalating dye 는 PCR product 에 끼어들어가게 되고 형광 파장을 방출하게 된다. 이때 온도를 낮은 온도에서 높은 온도로 서서히 올리면, PCR 산물(product)은 고유의 Tm 값(특정온도) 에서 denaturation, 즉 이중 가닥 에서 단일 가닥으로 바뀌게 되고 형광 값이 급격히 떨어지게 된다. 이때의 온도를 녹는 온도(melting temperature)라 하며 이 녹는 온도(melting temperature)의 차이를 탐지하여 PCR product 에서 서열 하나의 차이까지 구분해 내는 기술을 나타낸다.Specifically, when a PCR product is created, the PCR product has a unique Tm value according to the DNA sequence, and the intercalating dye intercalating into the double strand intercalates into the PCR product and emits a fluorescence wavelength. At this time, when the temperature is gradually raised from a low temperature to a high temperature, the PCR product undergoes denaturation at its own Tm value (specific temperature), that is, changes from double-strand to single-strand, and the fluorescence value drops rapidly. The temperature at this time is called melting temperature, and it indicates a technology that detects the difference in melting temperature and distinguishes even one difference in sequence from the PCR product.
본 발명의 방법은 상기 키트와 동일한 방식, 프라이머를 이용하고 PCR 산물(product)의 녹는 온도(melting temperature)를 측정하기에, 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.The method of the present invention uses the same method as the kit, uses primers, and measures the melting temperature of the PCR product, so the common content between the two is to avoid excessive complexity in the present specification. omit
<실시예 1><Example 1> 표고버섯 염기서열 RL-LE-202 및 RL-LE-203과 프라이머Shiitake mushroom sequences RL-LE-202 and RL-LE-203 and primers
도면 1은 프라이머 서열을 이용한 PCR 방법으로 표고버섯 품종 산조701호, 참아람에서 증폭되는 마커 염기서열을 나타낸 것이다. 표 1의 표고균주들의 genomic DNA를 resequencing하여 표고버섯의 표준유전체 B17의 서열과 비교했다. DNA 추출 방법은 다음과 같다.Figure 1 shows the marker nucleotide sequence amplified in shiitake mushroom cultivars Sanjo 701 and Chamaram by PCR using primer sequences. The genomic DNA of the shiitake strains in Table 1 was resequenced and compared with the sequence of the standard genome B17 of shiitake mushroom. The DNA extraction method is as follows.
PDB배지에서 배양한 표고버섯 균사체를 미라클로스에 여과시킨 후 PBS버퍼(NaCl 135mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)를 부어 씻어내고 키친타올로 물기를 제거하고, 건조된 균사를 액체질소에 얼려 막자사발로 곱게 갈은 후 GeneAll® GenEx™ Plant kit를 이용해 Genomic DNA를 추출하였다. 튜브에 옮겨 담은 균사에 PL버퍼 500ul를 넣고 65℃에서 10분간 가열해준 후 파이펫을 이용해 잘 섞어주고, 13000rpm으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮겨준 후 PP버퍼를 상층액의 1/3만큼 넣고 볼텍서를 이용해 잘 섞어준다. 얼음에서 5분간 방치 후 13000rpm으로 5분간 원심분리하며 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮기고 동량의 PCI(phenol : Chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24: 1)를 넣어준 후 뒤집어 섞어준다. 13000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브에 옮기고, 동량의 isopropanol을 넣어준 후 뒤집어 섞어 준다. 얼음에 10분간 방치 후 13000rpm에서 1분간 원심분리하여, 상층액을 제거한 후 70% 에탄올 1ml를 넣어 DNA 펠렛을 살짝 띄우고 13000rpm에서 1분간 원심분리한다. 상층액을 제거한 후 13000rpm에서 1분간 한 번 더 원심분리한다. 남은 에탄올을 전부 제거하고 DNA 펠렛을 상온에서 5분간 건조시킨 후, RE버퍼 100ul를 넣어 DNA 펠렛을 녹인다.Shiitake mushroom mycelium cultured in PDB medium was filtered through Miraclos, washed with PBS buffer (NaCl 135mM, KCl 2.7mM, Na 2 HPO 4 4.3mM, KH 2PO 4 1.4mM), and dried with a kitchen towel. , The dried mycelia were frozen in liquid nitrogen, ground finely in a mortar, and genomic DNA was extracted using the GeneAll® GenEx™ Plant kit. Add 500ul of PL buffer to the mycelia transferred to the tube, heat at 65 ° C for 10 minutes, mix well using a pipette, centrifuge at 13000 rpm for 1 minute, separate the supernatant, transfer to a new tube, and transfer the PP buffer to the upper layer. Add 1/3 of the liquid and mix well using a vortexer. After leaving on ice for 5 minutes, centrifuge at 13,000 rpm for 5 minutes, separate the supernatant, transfer to a new tube, add the same amount of PCI (phenol: chloroform: isoamylalcohol = 25: 24: 1), and mix by inversion. After centrifugation at 13000 rpm for 10 minutes, the supernatant was separated and transferred to a new tube, and the same amount of isopropanol was added and mixed by inversion. After leaving on ice for 10 minutes, centrifuged at 13000 rpm for 1 minute, removing the supernatant, adding 1 ml of 70% ethanol to slightly float the DNA pellet, and centrifuged at 13000 rpm for 1 minute. After removing the supernatant, centrifuge once more for 1 minute at 13000 rpm. After removing all remaining ethanol and drying the DNA pellet at room temperature for 5 minutes, 100ul of RE buffer was added to dissolve the DNA pellet.
서열 비교를 통해 산조701호, 참아람에 특이적인 변이가 생긴 염기서열을 찾았고, 이를 이용하여 프라이머를 제작한다.Through sequence comparison, a base sequence with specific mutations in Sanjo 701 and Chamaram was found, and primers were prepared using this.
<실시예 2> 시퀀싱을 통한 표고버섯 ‘산조701 및 참아람’의 SNP 확인<Example 2> SNP identification of shiitake mushrooms ‘Sanjo 701 and Chamaram’ through sequencing
도면 2에서는 도면 1의 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하고 시퀀싱을 하여 변이를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 표고버섯 표준유전체 균주인 B17과 표고버섯 품종 산조701호, 그리고 참아람에서 추출한 20ng의 genomic DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로는 95℃에서 3분, 다시 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 20초로 35사이클을 증폭한 후, 추가로 72℃에서 5분간 반응시킴으로써 수행되었다.In FIG. 2, PCR is performed using the primer sequence of FIG. 1 and sequencing is performed to show the result of confirming the mutation. PCR was performed using 20ng of genomic DNA extracted from shiitake mushroom standard genome strain B17, shiitake mushroom variety Sanjo 701, and chamaram. As PCR conditions, 35 cycles of amplification were performed at 95°C for 3 minutes, again at 95°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 20 seconds, and then further reacted at 72°C for 5 minutes.
시퀀싱 결과를 대조하여 비교한 결과, 산조701호 또는 참아람에 특이적인 변이가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. RL-LE-202 마커서열 부위의 경우 B17은 호모타입의 G, 산조701호는 헤테로타입의 GA가 확인되었고, RL-LE-203 마커서열 부위의 경우에는 B17에서 호모타입의 A, 참아람에서 헤테로타입의 AC가 확인되었다.As a result of comparing and contrasting the sequencing results, it was confirmed that a mutation specific to Sanjo 701 or Chamaram existed. In the case of the RL-LE-202 marker sequence, B17 was a homotype of G and Sanjo 701 was a heterotype of GA. A heterotype of AC was identified.
<실시예 3> 키트를 사용한 표고버섯 중 ‘산조701호 또는 참아람’ 품종 판별<Example 3> Identification of ‘Sanjo 701 or Cham Aram’ variety among shiitake mushrooms using the kit
도 3은 산조701호, 참아람을 마커 서열인 RL-LE-202, RL-LE-203에 결합하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, melting curve를 측정한 결과이다. HRM 분석은 Applied Biosystems® MeltDoctor™ HRM Master Mix를 사용하여 수행하였다. 20ng의 genomic DNA 1㎕, 2X HRM Master Mix 10㎕, 10pmole/㎕의 프라이머 F, R 각 1㎕씩, DW 7㎕의 조성으로 총 20㎕의 혼합물을 이용하여 real-time PCR을 수행하였다. PCR 조건으로는 95℃에서 10분, 다시 95℃에서 15초, 54℃에서 30초, 72℃에서 30초로 40사이클을 수행하였고, 이후 95℃에서 10초간 가열한 뒤 60℃에서 95℃까지 초당 0.025℃씩 온도를 서서히 올리면서 melt curve를 측정하였다.Figure 3 is the result of performing PCR using primers that bind Sanjo 701 and Chamaram to marker sequences RL-LE-202 and RL-LE-203, and measuring the melting curve. HRM analysis was performed using Applied Biosystems® MeltDoctor™ HRM Master Mix. Real-time PCR was performed using a mixture of 20 μl in total with a composition of 1 μl of 20ng genomic DNA, 10 μl of 2X HRM Master Mix, 1 μl each of primers F and R at 10 pmole/μl, and 7 μl of DW. As PCR conditions, 40 cycles were performed at 95 ° C for 10 minutes, again at 95 ° C for 15 seconds, at 54 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 30 seconds, then heated at 95 ° C for 10 seconds and then heated at 60 ° C to 95 ° C per second. The melt curve was measured while gradually increasing the temperature by 0.025 ° C.
산조701호, 참아람을 포함하는 23개 균주를 대상으로 HRM-PCR 분석을 수행한 결과, Rl-LE-202 마커에 대해 산조701호의 경우 헤테로 타입으로 나타났고 나머지 균주들의 경우 호모타입으로 나타났다. RL-LE-203 마커에 대해서는 참아람의 경우 헤테로 타입, 나머지 균주들의 경우 호모타입으로 나타났다.As a result of HRM-PCR analysis on 23 strains including Sanjo 701 and Chamaram, Sanjo 701 was heterotyped for the Rl-LE-202 marker, and the remaining strains were homotyped. Regarding the RL-LE-203 marker, it was shown as a heterotype in the case of Chamaram and a homotype in the case of the other strains.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Development of SNP markers and use thereof for discrimination of Pyogo mushroom cultivar Chamaram <130> CBNU2022P0448 <150> KR 10-2021-0047781 <151> 2021-04-13 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-LE-202 <220> <221> mutation <222> (36) <223> Y is G or A <400> 1 gcttgatcaa ttcgttggaa gacaaygtca tccaaaccat tattcttcca agtgacagat 60 aatctgaacg ttgtcctctt tcaagatgtc caactttcca ttgc 104 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-LE-202 F <400> 2 gcttgatcaa ttcgttggaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-LE-202 R <400> 3 gcaatggaaa gttggacatc 20 <210> 4 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-LE-203 <220> <221> mutation <222> (69) <223> Y is A or C <400> 4 gcttgatcaa ttcgttggaa gacaaygtca tccaaaccat tattcttcca agtgacagat 60 aatctgaacg ttgtcctctt tcaagatgtc caactttcca ttgc 104 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-LE-203 F <400> 5 actcgttcgt gaagccatag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-LE-203 R <400> 6 tcgggaatga agctgactta 20 <110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Development of SNP markers and use thereof for discrimination of Pyogo mushroom cultivar Chamaram <130> CBNU2022P0448 <150> KR 10-2021-0047781 <151> 2021-04-13 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 104 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RL-LE-202 <220> <221> mutation <222> (36) <223> Y is G or A <400> 1 gcttgatcaa ttcgttggaa gacaaygtca tccaaaccat tattcttcca agtgacagat 60 aatctgaacg ttgtcctctt tcaagatgtc caactttcca ttgc 104 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RL-LE-202F <400> 2 gcttgatcaa ttcgttggaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RL-LE-202R <400> 3 gcaatggaaa gttggacatc 20 <210> 4 <211> 104 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RL-LE-203 <220> <221> mutation <222> (69) <223> Y is A or C <400> 4 gcttgatcaa ttcgttggaa gacaaygtca tccaaaccat tattcttcca agtgacagat 60 aatctgaacg ttgtcctctt tcaagatgtc caactttcca ttgc 104 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RL-LE-203F <400> 5 actcgttcgt gaagccatag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RL-LE-203R <400> 6 tcgggaatga agctgactta 20
Claims (6)
A composition for discriminating shiitake varieties Chamaram, comprising an agent capable of detecting a single nucleotide polymorphism (SNP) located at the 26th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
상기 제제는 서열번호 5 및 서열번호 6의 각각의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 표고 품종 참아람 판별용 조성물.
According to claim 1,
The preparation is characterized in that the primer set represented by each of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, a composition for discrimination of shiitake varieties Chamaram.
A kit for identifying the shiitake cultivar Calamaram, comprising the composition for discrimination of the shiitake cultivar of claim 1 or 2 and a reagent for performing an amplification reaction.
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
According to claim 3,
Reagents for performing the amplification reaction are characterized in that they include DNA polymerase, dNTPs and buffers, the kit.
(a) 표고버섯으로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여, 상기 단계 (a)에서 분리된 DNA를 주형으로 증폭반응을 수행하여 증폭 산물을 제조하는 단계;
(c) 상기 증폭 단계에서 melt curve를 측정하는 단계;
(d) 단계 (c)의 측정결과를 분석하는 단계; 및
(e) 서열번호 4의 26번째 염기서열에 위치하는 표고 품종 참아람 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커에 대해 단계 (d)의 측정결과가 헤테로 타입인 경우 참아람으로 판별하는 단계;
A method for determining shiitake cultivars, including the following steps:
(a) extracting DNA from shiitake mushrooms;
(b) preparing an amplification product by performing an amplification reaction using the DNA isolated in step (a) as a template using the primer set represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6;
(c) measuring a melt curve in the amplification step;
(d) analyzing the measurement result of step (c); and
(e) determining a single nucleotide polymorphism (SNP) marker for shiitake cultivar Chamaram located at the 26th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 as Chamaram if the measurement result of step (d) is a heterotype;
상기 증폭 산물을 제조하는 단계 이후 95℃에서 7~13초간 가열한 뒤 60℃에서 95℃까지 초당 0.025℃씩 온도를 서서히 올리면서 melt curve를 측정하는 것을 특징으로 하는 판별 방법.According to claim 5,
After the step of preparing the amplification product, it is heated at 95 ° C for 7 to 13 seconds, and then the melt curve is measured while slowly raising the temperature from 60 ° C to 95 ° C by 0.025 ° C per second.
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