KR20220169928A - 박테리아 유래 고순도 세포밖 소포체의 상업적 정제 방법 - Google Patents
박테리아 유래 고순도 세포밖 소포체의 상업적 정제 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220169928A KR20220169928A KR1020220075636A KR20220075636A KR20220169928A KR 20220169928 A KR20220169928 A KR 20220169928A KR 1020220075636 A KR1020220075636 A KR 1020220075636A KR 20220075636 A KR20220075636 A KR 20220075636A KR 20220169928 A KR20220169928 A KR 20220169928A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- extracellular vesicles
- bacterial
- bacteria
- derived extracellular
- precipitation
- Prior art date
Links
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 112
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 97
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 50
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 41
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims abstract description 33
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 20
- -1 cobalt cations Chemical class 0.000 claims description 46
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 41
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 15
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000000710 polymer precipitation Methods 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 8
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 claims description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 6
- 229950007919 egtazic acid Drugs 0.000 claims description 6
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical group OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 6
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 4
- OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N ethylenediaminetriacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCCN(CC(O)=O)CC(O)=O OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 4
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 4
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ITWBWJFEJCHKSN-UHFFFAOYSA-N 1,4,7-triazonane Chemical compound C1CNCCNCCN1 ITWBWJFEJCHKSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000005263 alkylenediamine group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 claims description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N triacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CC(O)=O ILJSQTXMGCGYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 2
- BKIMMITUMNQMOS-UHFFFAOYSA-N nonane Chemical compound CCCCCCCCC BKIMMITUMNQMOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 abstract description 33
- 239000011575 calcium Substances 0.000 abstract description 33
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 21
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 8
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101100021843 Shigella flexneri lpxM1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100021844 Shigella flexneri lpxM2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 101150060640 lpxM gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000002583 cell-derived microparticle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 150000004697 chelate complex Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- GPTJTTCOVDDHER-UHFFFAOYSA-N cyclononane Chemical compound C1CCCCCCCC1 GPTJTTCOVDDHER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/145—Ultrafiltration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
- B01D2311/26—Further operations combined with membrane separation processes
- B01D2311/2642—Aggregation, sedimentation, flocculation, precipitation or coagulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 박테리아 유래 세포밖 소포체(bacterial extracellular vesicle)의 고순도 대량 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 본 발명은 칼슘 또는 코발트를 이용하여 대량의 박테리아 세포 배양물로부터 고순도의 박테리아 유래 세포밖 소포체를 신속하고 간편하게 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 정제 방법은 대량의 박테리아 세포 배양물을 처리하여 고순도의 박테리아 유래 세포밖 소포체를 상업적인 스케일로 수득하는데 적합하며, 특히 인체에 무해한 칼슘을 이용하는 경우 인체 대상 의약품 용도의 박테리아 유래 세포밖 소포체를 정제하는데 보다 유리하다.
Description
본 발명은 박테리아 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicle, EV)를 고순도로 대량 정제할 수 있는 효율적인 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로 본 발명은 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 이용하여 대량의 박테리아 세포 배양물로부터 고순도의 박테리아 유래 세포밖 소포체를 신속하고 간편하게 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
박테리아를 포함한 모든 세포는 세포밖 소포체를 자연적으로 분비하는 것으로 알려져 있다. 박테리아 유래 세포밖 소포체는 대략 10 nm 내지 1000 nm의 크기를 가지는 소낭으로, 단백질, 지질, 유전 물질(DNA, RNA), 병독성 인자(virulence factor) 등 기원하는 박테리아의 다양한 생물학적 활성 물질들을 포함하고 있다. 박테리아 유래 세포밖 소포체는 그람음성(gram-negative) 박테리아 유래 세포밖 소포체 및 그람양성(gram-positive) 박테리아 유래 세포밖 소포체로 분류될 수 있으며, 그람음성 박테리아에서 분비되는 세포밖 소포체는 외막 소포체(outer membrane vesicle, OMV)로도 알려져 있다. 이러한 박테리아 유래 세포밖 소포체는 동종 박테리아 간의 단백질 또는 유전 물질의 전달과 같은 정보 전달체로서의 기능과 경쟁 박테리아의 제거, 박테리아의 생존 증진에 기여하며, 숙주에 병원성 독소 등을 전달함으로써 박테리아 감염 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다.
최근 다양한 박테리아 유래 세포밖 소포체가 암을 비롯한 여러 질병에 대해 직접적인 치료 효능이 있으며, 이들 질병을 치료하기 위한 약물 전달체로서도 효과적으로 작용한다는 사실이 밝혀졌다(한국 등록특허공보 제10-1752506호). 또한 박테리아 유래 세포밖 소포체는 뇌수막염 등 병원성 박테리아에 의한 감염증을 예방하거나 치료하기 위한 백신으로서의 응용 연구 개발도 이루어지고 있다. 이러한 박테리아 유래 세포밖 소포체는 살아있는 세포가 아니기 때문에 오래 보관하고 운송할 수 있으며 감염 우려가 낮은 이점이 있다.
박테리아 유래 세포밖 소포체의 질병 치료를 포함한 다양한 용도로의 활용 가능성이 증대되면서, 박테리아 세포 배양물로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체를 다량으로 수득하는 방법이 필요하게 되었다. 그러나 박테리아 유래 세포밖 소포체는 크기가 나노 미터 수준으로 작고, 박테리아 세포 배양물에는 세포밖 소포체 이외에도 세포밖 소포체와 유사한 밀도, 질량, 크기나 전하 등을 지니는 다른 단백질 입자(예를 들어, 플라젤린(flagellin) 단백질 입자) 및 핵산 입자 등 수많은 미세 물질이 존재하기 때문에, 세포밖 소포체의 구조와 기능을 온전히 보존하면서 대량의 박테리아 세포 배양물로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체를 순수하게 단리하는 것을 어렵게 만든다.
기존의 박테리아 유래 세포밖 소포체의 분리 기술로는 밀도차 분리법, 입자 크기 분리법, 면역친화성 분리법 등이 알려져 있으며, 예를 들어 초원심분리법(ultra-centrifugation)(Momen-Heravi et al., Methods Mol. Biol., 1660: 25-32, 2017), 크기별 배제법(size exclusion)(Gamez-Valero et al., Sci. Rep. 6: 33641, 2016), 면역친화성 분리법(immunoaffinity isolation), 미세유체 칩 기술(microfluidics chip) 및 폴리머 침전법(polymer precipitation)(Niu et al., PLoS ONE, 0186534, 2017) 등이 사용되고 있다.
밀도차 분리법은 세포밖 소포체의 밀도가 1.13 내지 1.19 정도인데 반하여 액체의 밀도가 1.0 정도인 것을 이용하여 분리하는 방법으로, 대표적으로 초원심분리법이 가장 널리 사용되고 있는데 원리가 간단하여 가장 신뢰성 있는 분리 방법이다. 그러나 분리 단계가 복잡하여 노동력과 시간이 많이 소요되며, 고가의 장비를 필요로 할 뿐만 아니라, 한 회에 허용되는 유체의 양이 최대 0.6 L 수준에 불과하고, 수율과 순도가 현저히 낮은 한계가 있어, 다량의 박테리아 유래 세포밖 소포체를 얻는 데는 적합하지 않다.
크기별 배제법은 박테리아 유래 세포밖 소포체보다 기공 크기가 작거나 유사한 필터를 사용하여 세포밖 소포체를 걸러내는 방법으로, 반응 시간을 요구하지 않아 분리 시간이 빠르고 세포밖 소포체의 순도를 높일 수 있다는 장점이 있지만, 세포밖 소포체가 필터에 달라붙거나 빠져나가는 비율이 높아 분리 후의 수율이 낮다는 한계가 있다.
면역친화성 분리법은 항체를 박테리아 유래 세포밖 소포체에 붙여서 분리하는 방법으로 선별성(specificity)이 매우 높다는 장점이 있지만, 항체를 만드는 과정이 오래 걸리며 많은 비용이 들기 때문에 실용성 문제가 제기된다.
폴리머 침전법은 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)과 같은 친수성 폴리머를 추가하여 박테리아 유래 세포밖 소포체의 용해도를 감소시켜 용출 및 침전시키는 방법으로, 적은 원심력으로 분리시킬 수 있는 장점을 지니고 있다. 하지만 첨가된 폴리머에 의해 시료 용액 내부에 존재하는 단백질들이 함께 침전하면서 단백질에 의한 오염 문제가 발생하는 문제가 있다.
현재 그람음성 박테리아의 OMV 분리 키트로서 SBI사의 제품(ExoBacteriaTM OMV Kit)이 상업적으로 시판되고 있다. 그러나 OMV 친화성 수지 칼럼을 사용하는 상기 제품은 1회 칼럼으로의 분리 용량이 30 ml에 불과하여 대량 생산 공정에는 적합하지 않다.
따라서 박테리아 유래 세포밖 소포체에 적용 가능한 간편한 대량 정제 방법이 필요하며, 그 구조와 기능을 보존하면서 박테리아의 다른 단백질 입자(예: 플라젤린 입자)나 핵산 입자로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체를 고순도, 고효율로 단리 및 정제해낼 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
Momen-Heravi et al., Methods Mol. Biol., 1660: 25-32, 2017
Gamez-Valero et al., Sci. Rep. 6: 33641, 2016
Niu et al., PLoS ONE, 0186534, 2017
본 발명의 목적은 대량의 박테리아 세포 배양물을 처리하여 이로부터 고순도의 박테리아 유래 세포밖 소포체를 간편하고 신속하게 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 종래 분리 기술을 사용하는 경우 박테리아 유래 세포밖 소포체 이외에 다른 단백질 입자나 핵산 입자 등이 함께 단리되는 문제를 해결한, 박테리아 유래 세포밖 소포체에 적용 가능한 고순도 및 고효율 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온이 박테리아 유래 세포밖 소포체의 고순도 정제를 가능하게 하며 대량 처리에 유용하다는 예상치 못한 연구 결과에 기초하여 완성된 것이다.
본 발명에서는 박테리아 세포 배양물에 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 처리하여 반응시키면, 박테리아 유래 세포밖 소포체와 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온이 결합하여 불용성 복합체를 형성하게 된다. 이때 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온은 박테리아 유래 세포밖 소포체 이외의 박테리아 유래의 다른 단백질 입자나 핵산 입자가 함께 공침전되는 것을 효과적으로 억제함으로써, 박테리아 세포 배양물로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체를 고순도로 분리 및 정제할 수 있게 한다. 형성된 박테리아 유래 세포밖 소포체-칼슘 양이온 복합체 또는 박테리아 유래 세포밖 소포체-코발트 양이온 복합체는 원심분리나 중력에 의한 침전 등 다양한 방법에 의해 분리되며, 이후 상기 복합체에서 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 탈착함으로써 박테리아 유래 세포밖 소포체를 고효율로 간편하게 정제할 수 있다.
본 발명은 (a) 박테리아 세포 배양물에 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 첨가하는 단계; (b) 상기 박테리아 세포 배양물에 포함된 박테리아 유래 세포밖 소포체와 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 반응시켜 불용성 복합체를 형성하는 단계; (c) 상기 박테리아 세포 배양물로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체와 칼슘 양이온의 복합체 또는 박테리아 유래 세포밖 소포체와 코발트 양이온의 복합체를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 복합체로부터 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 분리시켜 박테리아 유래 세포밖 소포체를 정제하는 단계를 포함하는, 박테리아 유래 세포밖 소포체의 대량 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 박테리아 세포 배양물의 처리량에 제한이 없어 대량 처리가 가능하다. 따라서 본 발명의 방법은 대량의 박테리아 세포 배양물을 처리하여 다량의 고순도 박테리아 유래 세포밖 소포체를 간편하고 신속하게 정제할 수 있으며, 상업적인 스케일로 실시가 가능하다.
본 발명의 "박테리아 유래 세포밖 소포체"는 박테리아로부터 기원한 외막 소포체, 쉐딩 소포체(shedding vesicle), 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로베시클(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle), 나노베시클(nanovesicle) 등으로 지칭될 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 박테리아 유래 세포밖 소포체의 범위에 포함되는 것으로 이해된다. 또한 그람음성 박테리아 유래 세포밖 소포체에는 외막 유래 세포밖 소포체, 내막 유래 세포밖 소포체, 그리고 내막/외막 유래 세포밖 소포체(외막과 내막 성분이 동시에 존재하거나, 외막 안에 내막이 있는 형태, 반대로 내막 안에 외막이 있는 형태 등)가 포함되며, 이들 역시 본 발명의 박테리아 유래 세포밖 소포체에 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 "박테리아 세포 배양물"은 박테리아(유전공학적으로 변형된 박테리아를 포함한다) 세포를 배양 배지에서 배양한 배양액을 의미한다. 상기 배양 배지는 박테리아 세포를 배양하는데 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 혈청, 조직 추출물 등 조성이 불분명한 자연 유래 소재를 사용한 "자연 배지"와 성분 구성과 화학적 성상이 분명한 물질만으로 제조한 "화학 조성 배지"를 포함한다. 균일한 효과를 나타내는 박테리아 유래 세포밖 소포체를 생산하기 위해서, 상기 박테리아 세포 배양물은 박테리아를 화학 조성 배지에서 배양시킨 것이 바람직할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 화학 조성 배지는 M9 배지, DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute medium 1640)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 박테리아의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명에 있어서 "박테리아"는 자연적으로 존재하는 그람음성 및 그람양성 박테리아 및 유전공학적으로 변형된 박테리아를 포함한다.
상기 유전공학적으로 변형된 박테리아는 상기 세포밖 소포체의 독성이 약화되도록 형질전환된 박테리아를 포함하며, 그 예로 내독소(endotoxin) 생성 유전자가 결손되거나 변형된 박테리아를 들 수 있다. 바람직하게는, 지질다당류의 독성이 약화되도록 형질전환된 그람음성 박테리아 또는 리포테이코산의 독성이 약화되도록 형질전환된 그람양성 박테리아일 수 있다. 보다 바람직하게는, 지질다당류의 지질 성분인 지질 A 아실트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자(msbB)가 결손되도록 형질전환된(ΔmsbB) 박테리아, 가장 바람직하게는 ΔmsbB 형질전환 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온의 농도는 1 내지 1000 mM이며, 바람직하게는 1 내지 500 mM, 1 내지 100 mM, 5 내지 100 mM, 5 내지 50 mM, 5 내지 20 mM, 5 내지 15 mM, 또는 5 내지 10 mM이다. 특히 바람직하게는, 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온의 농도는 5 내지 20 mM이다. 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온의 농도가 5 mM 미만이면 박테리아 유래 세포밖 소포체의 침전이 충분하지 않으며, 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온의 농도 20 mM 이상에서는 양이온의 농도를 더 높여도 수득되는 박테리아 유래 세포밖 소포체의 양이 비례하여 증가하지 않는다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 첨가하는 방법은 박테리아 세포 배양물에 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 포함하는 용액을 첨가하는 방법과 고체 형태로 첨가하여 용해시키는 방법을 포함하나, 양이온 상태로 박테리아 세포 배양물 내의 세포밖 소포체와 반응할 수 있는 형태라면 특별히 한정되지 않는다.
세포밖 소포체는 양이온과 특이적으로 결합하여 불용성 세포밖 소포체 양이온 복합체를 형성하며, 상기 불용성 복합체는 중력에 의하여 가라앉기 때문에 쉽게 분리할 수 있다. 그러나 박테리아 세포 배양물에는 박테리아 유래 세포밖 소포체와 유사한 질량, 밀도, 크기 또는 전하를 띠는 다수의 박테리아 유래 단백질 입자나 핵산 입자 등의 불순물이 다량 포함되어 있어, 양이온에 의한 박테리아 유래 세포밖 소포체의 침전시 상기 불순물 입자들이 함께 공침전되어 오염되기 쉽다. 상기 불순물 입자로는 박테리아의 편모에서 유래하는 플라젤린 단백질 입자나 핵산 입자 등이 있다.
그런데 본 발명의 방법에 있어서, 칼슘 양이온은 박테리아 세포밖 소포체와 함께 불용성 복합체를 형성 및 침전시, 박테리아 유래의 플라젤린과 같은 불순물 단백질 입자나 핵산 입자가 공침전되는 것을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 박테리아 세포 배양물로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체와 칼슘 양이온의 불용성 복합체 또는 박테리아 유래 세포밖 소포체와 코발트 양이온의 불용성 복합체를 분리하는 단계((c) 단계)에 이용되는 방법은 수용성 물질이 포함된 시료로부터 불용성 물질을 분리해내는데 사용되는 방법이면 특별히 제한되지 않으며, 원심분리법, 초원심분리법, 여과법, 한외여과법, 중력, 투석법, 음파처리법, 밀도 구배법, 크기 배제법 등의 방법이 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 (c) 단계에 여과법, 원심분리법 또는 한외여과법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 복합체로부터 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 분리시켜 박테리아 유래 세포밖 소포체를 정제하는 단계((d) 단계)에 이용되는 방법은 박테리아 유래 세포밖 소포체와 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온의 특이적 결합 상태를 제거하여 복합체로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체만 분리할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명이 속한 기술분야의 당업자가 이해할 수 있는 다양한 방법 또는 조건을 적용할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 (d) 단계는 분리된 박테리아 유래 세포밖 소포체와 칼슘 양이온 복합체 또는 박테리아 유래 세포밖 소포체와 코발트 양이온 복합체에 킬레이트제를 첨가하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "킬레이트제(chelate agents)"는 금속 이온에 배위하여 안정된 킬레이트 착물을 형성하는 2개 이상의 배위 원자를 포함한 이온, 분자 또는 원자단을 의미하며, 배위 원자 수에 따라 세자리 리간드(tridentrate ligand), 네자리 리간드(tetradentrate ligand), 다섯자리 리간드(pentadentrate ligand), 여섯자리 리간드(hexadentrate ligand) 등으로 부른다. 본 발명의 킬레이트제는 이미노디아세트산(IDA, iminodiacetic acid), 니트릴로트리아세트산(NTA, nitrilotriacetic acid), 트리스(카르복시메틸)에틸렌디아민(TED, tris-(carboxymethyl)ethylenediamine), 에틸렌디아민(ethylenediamine), 에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA, ethylendiamine tetraacetate), 알킬렌디아민 트리아세트산(alkylenediamine triacetic acid), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA, diethylenetriaminepentaacetic acid), 에틸렌글리콜 비스(베타-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA, ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid), 포스포세린(phosphoserine) 및 1,4,7-트리아조사이클로노난(TACN, 1,4,7-triazocyclononane)으로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택될 수 있으나, 본 발명에서 사용되는 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온에 특이적으로 결합하여 복합체로부터 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 특이적으로 분리할 수 있는 것이라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 (d) 단계는 분리된 박테리아 유래 세포밖 소포체와 칼슘 양이온의 복합체 또는 박테리아 유래 세포밖 소포체와 코발트 양이온의 복합체가 포함된 용액의 pH 값을 변화시키는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 상기 (d) 단계는 분리된 박테리아 유래 세포밖 소포체와 칼슘 양이온의 복합체 또는 박테리아 유래 세포밖 소포체와 코발트 양이온의 복합체가 포함된 용액에서 이미다졸(imidazole), 히스티딘(histidine), 에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA) 또는 염(salts)의 농도를 변화시킴으로써 복합체로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체를 분리하는 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 (d) 단계는 pH 10 이하의 완충액, 0 내지 5 M NaCl, 0 내지 2 M 이미다졸, 0 내지 2 M의 금속 킬레이트제 또는 상기 조건의 조합을 적용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 박테리아 세포 배양물에 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온을 첨가하기 이전에(즉, (a) 단계 이전에) 박테리아 세포 배양물의 전처리 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 전처리 단계는 박테리아 세포 배양물을 농축하여 후속 정제 단계에 투입될 시료의 양을 줄임과 동시에 비정제 박테리아 세포 배양물에서 박테리아 세포를 제거하거나 박테리아 유래의 다른 단백질 입자 또는 핵산 입자를 제거하기 위한 부분 정제 단계로서, 원심분리법, 여과법, 한외여과법, 크기 배제법, 탈염 컬럼 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 폴리머 침전법, 염 침전법, 유기용매 침전법, 수성 이상계법 및 효소처리법 중 하나 이상의 방법이 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 전처리 단계에서 원심분리법, 여과법, 폴리머 침전법 또는 염 침전법이 사용될 수 있으며, 접선유동여과법 (TFF: tangential flow filtration)이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 (d) 단계 이후에 정제된 박테리아 유래 세포밖 소포체를 후처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 후처리 단계는 정제된 박테리아 유래 세포밖 소포체의 추가 정제 단계로서, 원심분리법, 여과법, 한외여과법, 투석법, 음파처리법, 밀도 구배법, 크기 배제법, 탈염 컬럼 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 폴리머 침전법, 염 침전법, 유기용매 침전법, 수성 이상계법 및 효소처리법 중 하나 이상의 방법이 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 후처리 단계에서 한외여과법, 투석법, 크기 배제법, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 폴리머 침전법 또는 염 침전법이 사용될 수 있으며, 한외여과법 또는 크기배제법이 특히 바람직하다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온에 의한 침전 단계 이전 또는 이후에 박테리아 유래 세포밖 소포체 이외의 다른 단백질 입자 또는 핵산 입자를 제거하기 위한 여과 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 칼슘 양이온 또는 코발트 양이온에 의한 침전 단계 이전 또는 이후에 박테리아 유래의 핵산 입자를 제거하기 위한 효소처리 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 효소는 박테리아 세포 배양물로부터 핵산 입자를 분해하는데 사용될 수 있는 효소이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 벤조나아제(benzonase) 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 효소처리 단계는 바람직하게는 벤조나아제와 병용하여 또는 벤조나아제 처리 후에 이온교환 크로마토그래피를 실시할 수 있다.
본 발명의 박테리아 유래 세포밖 소포체의 대량 정제 방법은 분리 효율을 극대화하기 위해 필요에 따라 종래의 분리 기술과 병용될 수 있다.
본 발명에 따른 박테리아 유래 세포밖 소포체의 대량 정제 방법은 플라젤린과 같은 박테리아 유래 단백질 입자 또는 핵산 입자를 효율적으로 제거할 수 있으며, 분리 과정에서 극한의 환경에 노출되지 않기 때문에 박테리아 유래 세포밖 소포체의 구조나 기능을 보존하면서 효과적으로 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 방법은 박테리아 세포 배양물의 처리량에 제한이 없어 대량의 박테리아 세포 배양물을 처리하여 박테리아 유래 세포밖 소포체를 다량으로 수득할 수 있으며, 고가의 장비나 항체 등의 재료가 필요하지 않고, 높은 수율과 순도를 달성할 수 있기 때문에, 고순도 박테리아 유래 세포밖 소포체를 상업적인 스케일로 간편하게 수득할 수 있다.
특히, 칼슘 양이온은 인체에 무해하므로 칼슘 양이온을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 얻어진 박테리아 유래 세포밖 소포체는 인체 대상 의약품으로 개발하는데 보다 유리하다.
도 1a는 무세포(cell-free) 박테리아 세포 배양물에 포함된 불순물을 보여주는 총 단백질 염색 사진 및 OmpA 및 FliC 웨스턴 블롯 사진이다.
도 1b는 무세포 박테리아 세포 배양물에 포함된 불순물을 보여주는 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 6종의 금속 양이온과 폴리머(PEG)를 이용한 박테리아 EV의 침전분리 정제능을 보여주는 총 단백질 염색 사진 및 OmpA 및 FliC 웨스턴 블롯 사진이다.
도 2b는 6종의 금속 양이온을 이용한 박테리아 EV 침전분리물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 다양한 농도의 칼슘을 처리하여 얻은 EV 침전물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 다양한 농도의 칼슘 또는 PEG를 처리하여 얻은 EV 침전물의 총 단백질 염색 사진이다.
도 4는 본 발명의 정제 방법을 파일럿 규모의 50 리터 배양물에 대해 실시하여 얻은 박테리아 EV의 SEC-HPLC(a), DLS(b) 및 NTA(c) 분석 결과를 도시한 것이다.
도 5는 도 4에서 얻은 박테리아 EV의 투자전자현미경 사진(a), SDS-PAGE 분석 사진(b), OmpA 웨스턴 블롯 사진(c), 및 나노 유세포분석 결과를 나타낸 그래프(d)이다.
도 1b는 무세포 박테리아 세포 배양물에 포함된 불순물을 보여주는 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 6종의 금속 양이온과 폴리머(PEG)를 이용한 박테리아 EV의 침전분리 정제능을 보여주는 총 단백질 염색 사진 및 OmpA 및 FliC 웨스턴 블롯 사진이다.
도 2b는 6종의 금속 양이온을 이용한 박테리아 EV 침전분리물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 다양한 농도의 칼슘을 처리하여 얻은 EV 침전물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 다양한 농도의 칼슘 또는 PEG를 처리하여 얻은 EV 침전물의 총 단백질 염색 사진이다.
도 4는 본 발명의 정제 방법을 파일럿 규모의 50 리터 배양물에 대해 실시하여 얻은 박테리아 EV의 SEC-HPLC(a), DLS(b) 및 NTA(c) 분석 결과를 도시한 것이다.
도 5는 도 4에서 얻은 박테리아 EV의 투자전자현미경 사진(a), SDS-PAGE 분석 사진(b), OmpA 웨스턴 블롯 사진(c), 및 나노 유세포분석 결과를 나타낸 그래프(d)이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 정당한 권리범위를 제한하고자 제공되는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
실시예 1: 무세포(cell-free) 박테리아 세포 배양물의 불순물 확인 및 제거
E. coli w3110 (msbB mutant) 배양물을 6000 xg에서 20분간 원심분리하여 침전되는 세포를 제거하고, 상층액을 접선유동필터(TFF)를 통과시켜 10배 농축하였다. 10X로 농축된 cell-free 세포 배양물 1 mL을 각각 얼음과 37℃에서 30분간 방치한 후 원심분리(12000 xg, 10분)하였다. 한편, 10X로 농축된 cell-free 세포 배양물 1 mL은 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 후 얻어진 여과물을 원심분리(12000 xg, 10분)하였다. 원심분리 후 얻어진 펠렛은 HBS 완충용액에 현탁시킨 후 단백질 분석과 HPLC 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 도시하였다.
분석 대상 물질의 단백질 구성 패턴을 분석하기 위하여 동일 부피 또는 동일 단백질 함량의 각 시료에 0.1% SDS를 첨가하고 100℃ 5분간 가열하여 denaturation한 후 SDS-polyacrylamide gel (4-20% linear gradient)의 각 well에 로딩하여 전기영동을 수행하였다. 총 단백질 염색을 위하여 심플리블루(SimplyBlue™, invitrogen) 용액과 반응시킨 후 각 시료를 구성하는 총 단백질 패턴을 분석하였다.
또한, 분석 대상 시료의 FliC 및 OmpA 단백질의 함량을 추가로 분석하기 위하여 각 시료를 SDS-PAGE 수행 후 PVDF membrane에 elecrotransfer를 통하여 blot을 제작하였다. 준비된 Blot과 In-house 제작된 Rabbit polyclonal anti-FliC 또는 Rabbit polyclonal anti-OmpA 항체 용액과 4시간 이상 반응시킨 후 Blot을 세척하고 2차 항체, HRP-conjugated anti-rabbit IgG 항체(Santa Cruz) 용액과 1시간 동안 반응시킨 후 세척하였다. 이 후 ECL(Enhanced chemiluminescence, Thermo Scientific) 용액으로 발광 반응 유도하여 FliC 또는 OmpA 단백질의 발광 신호를 검출하였다.
상기 분석과 더불어, 각 분석 대상 물질에 대한 크로마토그램 및 파장별 흡광도의 차이를 분석하기 위해, SEC-HPLC system (Ultimate 3000, Thermo Scientific) 및 다파장 UV Detector를 통하여 각 물질에 대한 다파장 흡광 크로마토그램을 기록하고 분석하였다. 구체적으로, 고정상으로 세파크릴 S300 (GE healthcare) 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 (10 x 100 mm)을 이용하였으며, 이동상인 완충용액(20 mM Hepes, 500 mM NaCl, pH7.2)을 0.5 mL/min의 유속으로 평형을 이룬 후, 50 ㎕의 각 시료를 주입하였다. 시료 주입 후 용출되는 용액의 260 nm, 280 nm, 450 nm 파장의 흡광도를 동시에 실시간으로 기록하여 흡광 크로마토그램을 얻고 이를 분석하였다. 박테리아 유래 세포밖 소포체를 포함한 다양한 입자들은 해당 컬럼과 용출 조건에서 약 4.9 - 5.2분에 피크가 검출되며, 이 후에 용출되는 피크는 다양한 물질로 구성된 크기가 작은 비입자성 물질이다(이들 비입자성 물질은 투석법 등으로 손쉽게 제거할 수 있다).
12000 xg에서 10분 간의 원심분리로는 세포밖 소포체(EV)가 침전되지 않으므로, 상기 원심분리로 얻은 펠렛에 대한 분석으로 박테리아 세포 배양물에 포함된 불순물을 확인할 수 있었다.
펠렛의 단백질 분석 결과(도 1a)에서와 같이, 불순물로 다양한 사이즈의 단백질 밴드가 관찰되었고, 웨스턴 블럿으로 확인한 결과 OmpA를 포함하는 단백질 입자와 플라젤린(FliC)이 다량 포함되어 있음을 확인하였다(도 1a의 첫 번째 및 두 번째 레인). 한편, 원심분리 단계 이전에 0.2 μm 필터를 통과시킨 경우 이들 불순물이 상당히 제거됨을 확인하였다(도 1a의 세 번째 레인).
유사하게, 이들 펠렛의 HPLC 결과(도 1b)를 보면, 5분 근처에서 발견되는 입자성 불순물 피크가 0.2 μm 필터를 통과시킨 경우(F22) 대부분 사라짐을 확인하였다. 즉, 무세포 박테리아 세포 배양물에 포함된 이들 입자성 불순물은 0.2 μm의 필터로 여과하면 대부분 제거할 수 있었다.
상기 입자성 불순물은 크기가 매우 큰 입자로서 세포 사멸의 산물일 수 있고, 변형된 불활성화된 세포밖 소포체일 수 있으며, EV 침전 분리시 EV와 함께 침전될 수 있고 EV의 최종 정제 후에는 OmpA를 갖는 EV 입자와 구별이 어려울 수 있으므로, EV 침전 단계 이전 또는 이후에 여과법 등을 통해 제거하는 것이 바람직하다. 본 발명의 후속 실시예에서는 EV 침전 단계 이전에 제거하였다.
실시예 2: 다양한 침전법을 이용한 박테리아 EV 분리 정제 효능 시험
다양한 금속 양이온(CA, CO, CU, MN, NI, ZN)과 폴리머(PEG)를 이용하여 박테리아 EV의 분리정제 효능을 비교하였다.
실시예 1의 10X로 농축된 무세포 세포 배양물을 0.2 ㎛ 필터를 통과시킨 후 각각 6종의 금속 양이온(CA, CO, CU, MN, NI, ZN) 25 mM 또는 12% PEG6000을 첨가한 후 10분간 방치하고, 12000 xg에서 10분 원심분리하여 펠렛을 얻고, 펠렛에 대해 실시예 1과 같은 단백질 분석 및 HPLC 분석을 수행하여 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 도시하였다.
도 2a의 총 단백질 염색 결과를 보면, CU, ZN은 EV 이외에 다수의 다양한 단백질 불순물이 다수 공침전(co-precipitation)되는 것을 알 수 있다. PEG의 경우도 다수 단백질 불순물이 공침전되고 특히 FliC 불순물 양이 높은 것을 관찰하였다.
도 2a의 웨스턴 블롯 결과를 보면 NI의 경우 상대적으로 OmpA 신호가 낮아 EV 수득 효율이 낮은 것을 알 수 있다.
결과적으로, 다른 불순물을 제외한 EV 수득 측면에서 CA, CO, MN이 우수하였다.
도 2b의 (A)에서 보는 바와 같이, HPLC 결과도 유사한 결과를 보여준다. 즉 CA, CO, MN의 경우 비교적 불순물의 농도가 낮으며, NI의 경우 5분 근처의 EV에 해당하는 피크 신호가 약한 것을 알 수 있다.
그런데, 벤조나아제를 처리하여 핵산을 제거한 후의 HPLC 결과(도 2b의 (B))와 비교해 볼 때, CO, CU, MN, ZN의 경우 벤조나아제 처리 전에는 핵산 입자가 다수 포함되어 있음을 알 수 있다.
결국, 칼슘(CA)을 이용하여 침전시켰을 때 플라젤린이나 다른 단백질 입자, 핵산 입자의 불순물이 가장 효과적으로 제거되면서도, 세포밖 소포체 (EV)를 가장 효율적으로 얻을 수 있었다.
실시예 3: 칼슘 농도에 따른 EV 정제 효율 시험
다양한 농도의 칼슘(CA)을 사용하여 박테리아 EV의 분리정제 효능을 비교하였다.
실시예 1의 10X로 농축된 무세포 세포 배양물을 0.2 ㎛ 필터를 통과시킨 후 다양한 농도의 칼슘 양이온을 첨가한 후 10분간 방치하고, 12000 xg에서 10분 원심분리하여 펠렛을 얻고, 펠렛에 대해 실시예 1과 같은 방법으로 HPLC 분석 및 단백질 분석을 수행하여 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 도시하였다.
도 3a의 HPLC 결과를 보면, 칼슘 이온 농도를 5 mM 부터 100 mM까지 높여가면서 실험한 결과, 시험한 가장 낮은 농도인 5 mM에서부터도 EV가 침전되며, 칼슘 농도가 높아질수록 EV 침전율이 증가하나, 20 mM 이상에서는 칼슘 농도를 높여도 분리되는 EV 양이 비례하여 증가하지는 않았다.
도 3b의 총단백질 분석 결과는 칼슘 농도를 100 mM까지 증가시켜도 총 단백질 패턴에 거의 변함이 없었고(도 3b 좌측 사진), PEG 침전 결과와 비교시 EV와 함께 침전되는 불순물 단백질의 종류와 양이 대폭 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 3b 우측 사진).
실시예 4: 박테리아 세포밖 소포체(EV)의 대량 생산 정제
박테리아 세포밖 소포체의 대량 정제를 위하여 75리터 퍼맨터 시스템을 이용하여 E. coli BL21(DE3) ΔmsbB strain을 호기적 조건에서 16시간 배양한 후 6,000 xg, 20분 간의 원심분리를 통하여 세포가 제거된 배양액을 준비하였다. 해당 배양액을 0.2 μm 필터 여과 후, 100 kDa MWCO(Molecular weight cut-off)의 멤브레인 필터와 접선유도 한외여과를 통하여 10배 농축된 배양액을 생산하였다. 농축된 배양액을 50 μM의 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 30분간 진탕 반응시켜 단백질 분해 효소를 불활화하였다. 해당 농축 배양액을 다시 0.2 μm 필터 후, 2 mM의 MgSO4와 벤조나아제(250 U/100 mL)를 첨가하여 상온에서 1 시간 진탕 반응하여 불순물 입자를 제거하였다. 상기 배양액에 25 mM의 CaCl2을 포함한 완충용액(pH 7.2)을 첨가하고 1시간 동안 냉장 진탕 반응시켜 박테리아 EV를 선택적으로 침전시켰다. 해당 반응물을 13,000 xg, 40분간 원심분리하여 침전체를 수획한 후, 이를 킬레이트제를 포함한 완충용액(pH 7.2)에 진탕 반응하여 녹이고 0.2 μm 필터 여과하였다. 이후 박테리아 EV 보다 분자량이 작은 비입자성 오염체 및 완충용액 교환을 위하여 100 kDa MWCO의 투석막에 해당 용액을 담고 4℃에서 총 18시간 동안 5회 투석액을 교체하며 박테리아 세포밖 소포체를 추가 정제하였다.
결과적으로, 50 리터의 배양액에서 총 200 mg의 박테리아 세포밖 소포체를 수획하였고(4 mg/Liter-배양액), 상기 방법을 통하여 정제한 박테리아 EV를 SEC-HPLC를 통해 분석한 결과, 260 nm 및 280 nm 흡광도 기준, 99% 이상의 높은 순도가 확인되었다(도 4a). 또한, Dynamic Light Scattering(DLS) 분석을 통하여 해당 박테리아 EV의 평균 입자 크기가 24.3 (±5.09) nm이며, 입자 균일도 지표인 Polydispersity Index(PDI)는 0.304 (±0.036)로 상당히 균일한 입자로 구성되었음을 확인하였다(도 4b). 그리고, Nanoparticle Tracking Analysis(NTA) 분석 및 Bradford 단백질 정량 분석을 통하여 Particle/Protein Index는 3.3으로 단위 단백질 당 3.3 x 109 개의 매우 높은 수준의 입자들로 구성됨을 확인하였다(도 4c).
또한, 해당 정제된 박테리아 EV의 소포체 형태 및 지질이중층의 구조를 확인하기 위하여 투과전자현미경 분석을 수행하였다. 그 결과, 상기 방법으로 정제한 박테리아 EV는 모두 지질 이중층 구조를 가지면서 균일한 구형의 전형적인 소포체의 형태임을 확인하였으며(도 5a), SDS-PAGE 분석을 통하여 해당 균주에서 분비되는 박테리아 EV는 10여 개의 Major Protein과 다양한 minor protein들로 구성되었음을 알 수 있었고(도 5b), 또한 대장균의 주된 Outer membrane 단백질인 OmpA 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 본 기술로 정제한 박테리아 EV에 OmpA가 강하게 검출됨을 확인하였다(도 5c). 이는 추가로 Nano Flowcytometry 분석을 통하여 OmpA 단백질 신호가 대부분의 나노입자에서 검출되는 것을 확인함으로써 정제한 박테리아 EV는 대부분 OmpA 단백질을 발현하고 있음이 확인되었다(도 5d).
이와 같이 본 발명에 따른 칼슘 침전법을 이용할 경우 고가의 장비나 항체 등의 재료 없이도 대용량의 박테리아 배양물로부터 높은 수율과 순도를 갖는 박테리아 EV를 대량으로 정제할 수 있었다. 또한, 정제된 EV는 극한의 환경에 노출되지 않기 때문에 박테리아 유래 세포밖 소포체의 구조나 기능을 잘 보존하면서 효과적으로 정제할 수 있다.
Claims (16)
- (a) 박테리아 세포 배양물에 코발트 양이온을 첨가하는 단계;
(b) 상기 박테리아 세포 배양물에 포함된 박테리아 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicle)와 코발트 양이온을 반응시켜 불용성 복합체를 형성하는 단계;
(c) 상기 박테리아 세포 배양물로부터 박테리아 유래 세포밖 소포체와 코발트 양이온의 복합체를 분리하는 단계; 및
(d) 상기 복합체로부터 코발트 양이온을 분리시켜 박테리아 유래 세포밖 소포체를 정제하는 단계
를 포함하는, 박테리아 유래 세포밖 소포체의 대량 정제 방법. - 제1항에 있어서, 상기 코발트 양이온의 농도가 1 내지 1000 mM, 1 내지 500 mM, 1 내지 100 mM, 5 내지 100 mM, 5 내지 50 mM, 5 내지 20 mM, 5 내지 15 mM, 또는 5 내지 10 mM인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 코발트 양이온의 농도가 5 내지 20 mM인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계가 원심분리법, 초원심분리법, 여과법, 한외여과법, 중력, 투석법, 음파처리법, 밀도 구배법 및 크기 배제법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계가 킬레이트제를 첨가하는 방법; pH 값을 변화시키는 방법; 및 이미다졸, 히스티딘, 에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA) 또는 염(salts)의 농도를 변화시키는 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 킬레이트제가 이미노디아세트산(IDA, iminodiacetic acid), 니트릴로트리아세트산(NTA, nitrilotriacetic acid), 트리스(카복시메틸)에틸렌디아민(TED, tris-(carboxymethyl)ethylenediamine), 에틸렌디아민(ethylenediamine), 에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA), 알킬렌디아민 트리아세트산(alkylenediamine triacetic acid), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA, diethylenetriaminepentaacetic acid), 에틸렌글리콜 비스(베타-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA, ethyleneglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid), 포스포세린(phosphoserine) 및 1,4,7-트리아조사이클로노난(TACN, 1,4,7-triazocyclononane)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계 이전에 박테리아 세포 배양물의 전처리 단계를 더 포함하거나, 상기 (d) 단계 이후에 정제된 박테리아 세포 배양물의 후처리 단계를 더 포함하거나, 또는 상기 전처리 및 후처리 단계를 둘 다 포함하는 것인 더 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 전처리 단계가 원심분리법, 여과법, 한외여과법, 크기 배제법, 탈염 컬럼 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 폴리머 침전법, 염 침전법, 유기용매 침전법, 수성 이상계법 및 효소처리법 중 하나 이상의 방법을 이용하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 전처리 단계가 원심분리법, 여과법, 폴리머 침전법 또는 염 침전법을 이용하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 전처리 단계가 접선유동여과법(tangential flow filtration, TFF)을 이용하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 전처리 단계가 접선유동여과법 후에 폴리머 침전법 또는 염 침전법을 추가로 실시하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 후처리 단계가 원심분리법, 여과법, 한외여과법, 투석법, 음파처리법, 밀도 구배법, 크기 배제법, 탈염 컬럼 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 폴리머 침전법, 염 침전법, 유기용매 침전법, 수성 이상계법 및 효소처리법 중 하나 이상의 방법을 이용하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 후처리 단계가 한외여과법, 투석법, 크기 배제법, 크기 배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 폴리머 침전법 또는 염 침전법을 이용하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계 이전, 상기 (b) 단계 이후, 상기 (c) 단계 이후, 또는 상기 (d) 단계 이후에, 박테리아 유래의 핵산 입자를 제거하기 위한 효소처리 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 효소처리 단계가 벤조나아제(benzonase)를 이용하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 벤조나아제 처리와 병용하여 또는 벤조나아제 처리 후에 이온교환 크로마토그래피를 실시하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210080108A KR102413278B1 (ko) | 2021-06-21 | 2021-06-21 | 박테리아 유래 고순도 세포밖 소포체의 상업적 정제 방법 |
| KR1020210080108 | 2021-06-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220169928A true KR20220169928A (ko) | 2022-12-28 |
Family
ID=82247088
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210080108A KR102413278B1 (ko) | 2021-06-21 | 2021-06-21 | 박테리아 유래 고순도 세포밖 소포체의 상업적 정제 방법 |
| KR1020220075636A KR20220169928A (ko) | 2021-06-21 | 2022-06-21 | 박테리아 유래 고순도 세포밖 소포체의 상업적 정제 방법 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210080108A KR102413278B1 (ko) | 2021-06-21 | 2021-06-21 | 박테리아 유래 고순도 세포밖 소포체의 상업적 정제 방법 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240293776A1 (ko) |
| EP (1) | EP4361252A1 (ko) |
| JP (1) | JP2024522830A (ko) |
| KR (2) | KR102413278B1 (ko) |
| CN (1) | CN117836401A (ko) |
| WO (1) | WO2022270872A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118240723B (zh) * | 2024-05-29 | 2024-08-23 | 上海羽冠生物技术有限公司 | 一种通过发酵产生细菌外膜囊泡的方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0900815A2 (pt) * | 2009-04-23 | 2010-12-28 | Sociedade Benef Israelita Bras Hospital Albert Einstein | método para isolamento de exossomos a partir de soluções biológicas utilizando nanopartìculas de óxido de ferro |
| WO2012002760A2 (ko) | 2010-07-01 | 2012-01-05 | 포항공과대학교 산학협력단 | 세균유래 마이크로베시클을 이용한 암치료 및 암진단 방법 |
| KR101875594B1 (ko) * | 2017-01-13 | 2018-07-06 | ㈜로제타엑소좀 | 금속을 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법 |
| KR102107844B1 (ko) * | 2017-07-26 | 2020-05-07 | ㈜로제타엑소좀 | 양이온을 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법 |
| JP2021506324A (ja) * | 2017-12-19 | 2021-02-22 | ウニヴェルシタ デリ ストゥディ ディ トレント | 生体材料から細胞外小胞を単離する方法および固定相 |
| WO2020191369A1 (en) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | Codiak Biosciences, Inc. | Process for preparing extracellular vesicles |
-
2021
- 2021-06-21 KR KR1020210080108A patent/KR102413278B1/ko active IP Right Grant
-
2022
- 2022-06-21 KR KR1020220075636A patent/KR20220169928A/ko not_active Application Discontinuation
- 2022-06-21 JP JP2023578749A patent/JP2024522830A/ja active Pending
- 2022-06-21 US US18/573,095 patent/US20240293776A1/en active Pending
- 2022-06-21 WO PCT/KR2022/008791 patent/WO2022270872A1/ko active Application Filing
- 2022-06-21 CN CN202280056840.2A patent/CN117836401A/zh active Pending
- 2022-06-21 EP EP22828719.9A patent/EP4361252A1/en active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Gamez-Valero et al., Sci. Rep. 6: 33641, 2016 |
| Momen-Heravi et al., Methods Mol. Biol., 1660: 25-32, 2017 |
| Niu et al., PLoS ONE, 0186534, 2017 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2024522830A (ja) | 2024-06-21 |
| CN117836401A (zh) | 2024-04-05 |
| KR102413278B1 (ko) | 2022-06-27 |
| EP4361252A1 (en) | 2024-05-01 |
| WO2022270872A1 (ko) | 2022-12-29 |
| US20240293776A1 (en) | 2024-09-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Alves et al. | Affinity purification of bacterial outer membrane vesicles (OMVs) utilizing a His-tag mutant | |
| KR102107844B1 (ko) | 양이온을 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법 | |
| KR20220169928A (ko) | 박테리아 유래 고순도 세포밖 소포체의 상업적 정제 방법 | |
| CN112409477B (zh) | IgM纯化方法 | |
| CN104507953A (zh) | 通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平的方法 | |
| KR20080065590A (ko) | 동물 유래 성분을 사용하지 않는 단백질 ａ 생성 및 정제 | |
| JP2007039454A (ja) | ベジタリアンプロテインａ調製物およびその方法 | |
| JPH01502556A (ja) | イー・コリにおいて発現したピー・ファルシパラム・ｃｓタンパク質ワクチンの単離および精製方法 | |
| JPH046348B2 (ko) | ||
| CN101402946A (zh) | 提取大蒜超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN107446905B (zh) | 一种重组人溶菌酶纯化方法 | |
| RU2230325C2 (ru) | Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а | |
| EP0692966B1 (en) | A process for separation of components from red blood cells | |
| KR102426041B1 (ko) | 냉동 및 해동 과정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법 | |
| EP4273229A1 (en) | Method for isolating exosomes with high efficiency and high purity | |
| CN103467597B (zh) | 一种脱除乳铁蛋白制品中的内毒素的方法 | |
| CN117355541A (zh) | 伯克霍尔德氏菌荚膜多糖的纯化 | |
| CN116063391B (zh) | 高细胞选择性的色氨酸和精氨酸富集的抗菌肽wrt6及其制备方法和应用 | |
| CN117715924A (zh) | 对已去除无毒蛋白的肉毒梭菌神经毒素蛋白进行纯化的方法 | |
| Kawai-Harada et al. | Scalable isolation of surface-engineered extracellular vesicles and separation of free proteins via tangential flow filtration and size exclusion chromatography (TFF-SEC) | |
| Razdan | Polymeric nanoparticle as a new platform for high removal of endotoxins from biopharmaceutical solutions | |
| JPH02150291A (ja) | 生理活性物質 | |
| PL212811B1 (pl) | Sposób uzyskiwania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |