CN117355541A - 伯克霍尔德氏菌荚膜多糖的纯化 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本公开内容提供了一种从伯克霍尔德氏菌物种中分离和纯化荚膜多糖(CPS)的方法。在一个实施方式中，伯克霍尔德氏菌物种是O‑多糖突变菌株泰国伯克霍尔德氏菌BT2683。在一个实施方式中，CPS是6‑脱氧‑庚烷CPS。在另一个方面，本公开内容进一步提供了通过所公开的方法分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。

Description

伯克霍尔德氏菌荚膜多糖的纯化
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)享有2021年4月30日提交的美国临时专利申请号63/182,356的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
关于联邦政府主持的研究的声明
本发明是在国防威胁降低局颁布的HDTRA1-18-C-0062下政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
类鼻疽是一种新出现的传染病，其在世界各地的热带地区被越来越多认识到。虽然已知该疾病在东南亚、南亚、中东、非洲、中美洲和南美洲的至少48个不同国家流行，但目前的模型预测该疾病可能在另外34个尚未报告的国家流行。类鼻疽的认识不足，部分原因是大多数病例发生在农村人口众多、微生物实验室能力有限的资源匮乏国家。由于类鼻疽的临床表现多种多样，从皮肤脓肿到急性肺炎和败血症，诊断可能很困难。2015年，估计全球人类类鼻疽总负担为约165,000例，其中约89,000人死亡，相当于麻疹，超过了钩端螺旋体病和登革热的感染水平，突显了该疾病在全球范围内的潜在影响。
类鼻疽的病原体假鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)是一种兼性细胞内革兰氏阴性细菌，其可以从诸如流行地区的稻田、静水或死水以及潮湿土壤等环境生态位中分离出来。人类可以通过在职业或娱乐暴露期间的皮肤擦伤、吸入雾化灰尘或水中的细菌或摄入受污染的水进行经皮接种，获得假鼻疽伯克霍尔德氏菌感染。大多数自然感染发生在有一种或多种危险因素诸如糖尿病、酒精中毒、慢性肺病、慢性肾病或地中海贫血的个体中。
目前，类鼻疽的感染途径与临床表现之间的关系尚不明确。然而，最近的研究表明，在恶劣天气事件中吸入雾化的假鼻疽伯克霍尔德氏菌与肺炎之间存在联系。值得注意的是，超过一半的类鼻疽病例表现为可在轻度至严重疾病范围内的肺炎。
除了是一个重要的公共卫生问题外，假鼻疽伯克霍尔德氏菌还被认为是一种潜在的生物武器，目前被美国疾病控制和预防中心列为一级选择制剂。在故意释放的情况下，据信最有可能的传播方式是通过导致呼吸道疾病的传染性气溶胶。由于假鼻疽伯克霍尔德氏菌对许多常规使用的抗生素具有内在耐药性，类鼻疽的治疗可能很复杂。对于培养证实的病例，目前推荐的抗生素方案很长，通常需要最少两周的静脉注射治疗，然后长达六个月的口服治疗。假鼻疽伯克霍尔德氏菌在宿主细胞内持续存在的能力使根除感染变得困难，即使进行适当的化疗干预，复发也是可能的。此外，在成功治疗后，可能会再次感染不同的假鼻疽伯克霍尔德氏菌菌株。
目前，还没有可用于类鼻疽免疫的人类疫苗。由于这些挑战，近年来开发防治类鼻疽的医疗对策已成为当务之急。然而，从伯克霍尔德氏菌物种中提取抗原的程序漫长、昂贵且难以扩大规模，因此很难提取疫苗所需的抗原量。为了大规模生产对抗类鼻疽或鼻疽病(glander)(一种由相关细菌鼻疽伯克霍尔德氏菌引起的传染病)的疫苗，需要一种从假鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.mallei)或相关伯克霍尔德氏菌物种中提取大量抗原的快速方法。
本领域需要一种从伯克霍尔德氏菌物种中提取大量多糖的快速且具有成本效益的方法。本发明满足了这些未满足的需求。
发明内容
本发明基于分离和纯化伯克霍尔德氏菌荚膜多糖的新方法的发现。该方法提供了高产率的均匀多糖材料。
在一个方面，提供了一种从伯克霍尔德氏菌物种分离和纯化荚膜多糖(CPS)的方法，该方法包括(a)培养伯克霍尔德氏菌细胞；(b)将细胞沉淀(pellet)，将细胞重悬于水中，向重悬的细胞中添加醇以形成细胞浆液；(c)将细胞浆液沉淀，去除上清液；(d)向上清液中添加醇，形成包含CPS的沉淀物；(e)将CPS沉淀物沉淀，将沉淀物重悬于水中，透析重悬的CPS沉淀物；(f)浓缩透析的CPS沉淀物，将CPS溶解在弱酸中，将溶解的CPS与固体杂质分离；(g)浓缩溶解的CPS，向浓缩的溶解的CPS中添加缓冲液以形成溶液，将溶液加载到凝胶过滤树脂上；和(h)从凝胶过滤树脂中洗脱纯化的CPS。
在一些实施方式中，伯克霍尔德氏菌物种是泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderiathailandensis)。在一些实施方式中，伯克霍尔德氏菌物种是泰国伯克霍尔德氏菌的O-多糖突变菌株。在一些实施方式中，泰国伯克霍尔德氏菌的O-多糖突变体菌株是泰国伯克霍尔德氏菌BT2683。在一些实施方式中，CPS是6-脱氧-庚烷CPS。
在一些实施方式中，从伯克霍尔德氏菌物种分离和纯化荚膜多糖的方法的步骤(b)包括在搅拌下向重悬的细胞中添加与重悬的细胞的体积相比相等体积的乙醇以形成细胞浆液。
在一些实施方式中，方法的步骤(d)包括向上清液中添加乙醇以达到约90％(v/v)乙醇的最终浓度，形成包含CPS的沉淀物。
在一些实施方式中，方法的步骤(e)包括用水透析重悬的CPS沉淀物。
在一些实施方式中，方法的步骤(f)包括将CPS溶解在包含约1体积％至3体积％的乙酸的水溶液中，以形成浓度为约2至7mg/ml CPS的混合物。在一些实施方式中，将混合物在约100℃的温度下温育约2小时。
在一些实施方式中，方法的步骤(g)包括向浓缩的CPS中添加磷酸盐缓冲盐水以形成CPS浓度在约20至30mg/ml之间的溶液，并将该溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中凝胶过滤树脂包括交联的葡聚糖凝胶过滤树脂。在一些实施方式中，步骤(g)包括向浓缩的CPS中添加去离子水以形成CPS浓度在约20至30mg/ml之间的溶液，并将该溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中凝胶过滤树脂包括交联葡聚糖凝胶过滤树脂。
在一些实施方式中，方法的步骤(h)包括使用磷酸盐缓冲盐水从凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。在一些实施方式中，方法的步骤(h)包括使用去离子水从凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。在一些实施方式中，方法的步骤(h)之后是包括透析纯化的CPS的步骤(i)。在一些实施方式中，将纯化的CPS相对于水进行透析。
在一些实施方式中，方法的步骤(h)或步骤(i)之后是包括浓缩纯化的CPS的步骤(j)。
在一些实施方式中，醇是乙醇。
在一个方面，本公开内容提供了通过任何上述方法分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。在一些实施方式中，通过任何上述方法从O-多糖突变菌株泰国伯克霍尔德氏菌BT2683分离和纯化伯克霍尔德氏菌CPS。在一些实施方式中，通过任何上述方法分离和纯化6-脱氧-庚烷CPS。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的示例性实施方式的以下详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了非限制性实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确布置和工具。
图1是使用InBios AMD LFIs对泰国伯克霍尔德氏菌荚膜多糖(CPS)提取物进行分析的图像。将重新溶解在30ml的dH2O中的1μl等份的沉淀的CPS在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续稀释至1/100000。然后将50μl的稀释样品添加到AMD LFI盒中，然后添加3-4滴的追踪缓冲液。
图2是使用苯酚-硫酸测定法对Sephadex G-50柱级分进行分析的图。将25μl的每个柱级分与100μl dH2O、200μl 5％苯酚和1ml硫酸混合。在Eppendorf分光光度计上在OD490nm处读取级分。
图3是使用InBios AMD-LFI盒对泰国伯克霍尔德氏菌CPS透析液进行分析的图像。将1μl等分的透析液在PBS中连续稀释至1/100000。然后将50μl稀释样品添加到AMD LFI盒中，然后添加3-4滴的追踪缓冲液。
图4A-4B描绘了在PBS(S1；图4A)或水中(S2；图4B)从Sephadex G-50柱洗脱的泰国伯克霍尔德氏菌CPS样品的1H NMR谱。
图5A-5B描述G-50纯化的Bt-CPS样品的尺寸排阻色谱(SEC)分析。使用苯酚提取法(P-CPS)或乙醇提取法(E-CPS)纯化Bt-CPS样品，在PBS中以2mg/ml溶解，并在Superdex200Increase 10/300GL柱上以相同流速运行(P-CPS，图5A；E-CPS，图5B)。
具体实施方式
在一个方面，本公开内容涉及分离和纯化伯克霍尔德氏菌荚膜多糖的新方法。在一个实施方式中，方法包括分离和纯化6-脱氧-庚烷CPS。在一个实施方式中，方法包括从泰国伯克霍尔德氏菌分离和纯化6-脱氧-庚烷CPS。在一个实施方式中，对泰国伯克霍尔德氏菌菌株进行基因工程改造以简化CPS纯化。在一个实施方式中，对泰国伯克霍尔德氏菌的E555菌株进行基因工程改造以简化CPS纯化。在一些实施方式中，基因工程改造的泰国伯克霍尔德氏菌菌株不再产生O-多糖。所公开的方法的一个优点是它比先前公开的纯化CPS的方法花费更少的天数。另一个优点是所公开的方法比先前公开的纯化CPS的方法更具成本效益。所公开的方法的又另一个优点是，它比先前公开的纯化CPS的方法更容易放大规模。所公开的方法的又另一个优点是在CPS的纯化期间避免了使用苯酚、超速离心和酶。因此，在一些实施方式中，所公开的方法可用于从泰国伯克霍尔德氏菌分离和纯化大量的6-脱氧-庚烷CPS。在一个实施方式中，所公开的方法可用于分离和纯化6-脱氧-庚烷CPS，其可用于类鼻疽和/或鼻疽病的疫苗中。
在另一个方面，本公开内容涉及使用所公开的方法分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。在一个实施方式中，使用所公开的方法从O-多糖突变菌株泰国伯克霍尔德氏菌BT2683分离和纯化伯克霍尔德氏菌CPS。在一个实施方式中，BT2683是rmID敲除，因此不产生O-多糖。在一个实施方式中，使用所公开的方法分离和纯化6-脱氧-庚烷CPS。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的测试实践中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在是限制性的。
如本文所用，冠词“一”(“a”和“an”)用于指代该冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一种元素”是指一种元素或多于一种元素。
如本文所用，当提及可测量值(诸如量、持续时间等)时，术语“约”是指包含与指定值相差±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，并且仍更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。
范围：贯穿本公开内容，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，对范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围有多大，这都适用。
如本文所用，凝胶过滤色谱法或尺寸排阻色谱法(SEC)可互换使用，并且是指其中基于其尺寸或分子量差异来分离水溶液中的分子的色谱方法。凝胶过滤色谱法是一种广泛使用的聚合物表征方法，因为它能够提供聚合物的良好分离和摩尔质量分布(Mw)。不限于此，色谱柱用含有多孔珠的树脂材料填充。聚合物多糖的分离是通过在样品穿过多孔颗粒床时将聚合物从填料的孔中区别排除来实现的。不限于此，树脂材料可以由葡聚糖聚合物(Sephadex)、琼脂糖(Sepharose)或聚丙烯酰胺(Sephacryl或BioGel P)组成。示例性树脂材料是G-50和Superdex 200Increase 10/300GL。在一些实施方式中，通过色谱分离的聚合物是多糖。在一些实施方式中，通过凝胶过滤色谱分离的多糖从伯克霍尔德氏菌中提取。
方法
在一个方面，本发明涉及一种从伯克霍尔德氏菌物种中分离和纯化荚膜多糖(CPS)的方法，该方法包括
(a)培养伯克霍尔德氏菌细胞；
(b)将细胞沉淀，将细胞重悬于水中，向重悬的细胞中添加醇以形成细胞浆液；
(c)将细胞浆液沉淀，除去上清液；
(d)向上清液中添加醇，形成包含CPS的沉淀物；
(e)将CPS沉淀物沉淀，将沉淀物重悬于水中，透析重悬的CPS沉淀物；
(f)浓缩透析的CPS沉淀物，将CPS溶解在弱酸中，将溶解的CPS与固体杂质分离；
(g)浓缩溶解的CPS，向浓缩的CPS中添加缓冲液以形成溶液，将溶液加载到凝胶过滤树脂上；和
(h)从凝胶过滤树脂中洗脱纯化的CPS。
步骤(a)中的伯克霍尔德氏菌细胞可以包括已知产生CPS的任何伯克霍尔德氏菌物种的细胞。示例性伯克霍尔德氏菌物种包括但不限于假鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)、石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacaryophylli)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)、茄科伯克霍尔德氏菌(Burkholderia solanacearum)、皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacenocepacia)和稳定伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)。在一个实施方式中，伯克霍尔德氏菌细胞来自假鼻疽伯克霍尔德菌物种。在另一个实施方式中，伯克霍尔德氏菌细胞来自鼻疽伯克霍尔德菌物种。在又另一个实施方式中，伯克霍尔德氏菌细胞来自泰国伯克霍尔德氏菌物种。在一个实施方式中，伯克霍尔德氏菌细胞是泰国伯克霍尔德氏菌BT2683的O-多糖突变菌株(Δrm1D)。在其他实施方式中，伯克霍尔德氏菌细胞是本文其它地方描述的伯克霍尔德氏菌物种的一种的O-多糖突变菌株。尽管不希望受到理论的限制，但据信O-多糖突变菌株消除了其他多糖(即O-多糖)的污染。此外，虽然不希望受到理论的限制，但据信本文所述伯克霍尔德氏菌物种的O-多糖缺陷突变也将简化CPS的纯化。在一个实施方式中，CPS是6-脱氧-庚烷荚膜多糖。
步骤(a)中的伯克霍尔德氏菌细胞可使用本领域技术人员已知的标准细胞培养方法进行培养。在一个实施方式中，用伯克霍尔德氏菌原液接种约25ml包含M9微量盐和胰蛋白酶的M9TG培养基。在一个实施方式中，接种的培养基在约37℃下剧烈振荡温育约18小时，以形成起始培养物。在一些实施方式中，在约18小时后，将一部分起始培养物添加到含有约600ml的M9TG培养基的多个烧瓶中。烧瓶在约37℃下剧烈振荡培养约24小时。
一旦步骤(a)的细胞培养物达到足够的密度，就在步骤(b)中将伯克霍尔德氏菌细胞沉淀。在一些实施方式中，使用离心法对细胞进行沉淀。在一个实施方式中，通过在约8000x g下离心约10分钟对细胞进行沉淀。在一些实施方式中，将沉淀的细胞重悬于约200ml的水中。在一个实施方式中，水是去离子水。在一些实施方式中，在搅拌下进行在(b)中向重悬的细胞中添加醇的步骤。在一个实施方式中，在搅拌下向细胞中添加与重悬的细胞的体积相比大约相等体积的醇。在一些实施方式中，醇是乙醇。在一些实施方式中，将(b)的细胞浆液在室温下搅拌约30分钟。
在步骤(c)中将(b)的细胞浆液沉淀。在一些实施方式中，使用离心法将细胞浆液沉淀。在一个实施方式中，通过在约8000x g下离心约10分钟来将细胞浆液沉淀。在一些实施方式中，(c)中去除上清液的步骤进一步包括使用0.45μm过滤器过滤上清液。
在步骤(d)中，将醇添加到(c)的上清液中。在一个实施方式中，醇是乙醇。在一些实施方式中，将醇以足以形成沉淀物的量添加到上清液中。在其中所述方法用于分离和纯化6-脱氧-庚烷荚膜多糖的一些实施方式中，添加醇以达到约90％(v/v)的最终浓度。在一个实施方式中，向上清液中添加醇的步骤进一步包括在室温下使醇/上清液混合物周期性地旋转约60分钟以形成沉淀物。
在步骤(e)中，将步骤(d)中形成的沉淀物沉淀。在一些实施方式中，使用离心法将沉淀物沉淀。在一个实施方式中，通过在约12,000x g下离心约30分钟而将沉淀物沉淀。在一些实施方式中，将沉淀的沉淀物重悬于去离子水中。在一个实施方式中，将重悬的CPS沉淀物相对于水进行透析。在一些实施方式中，水是去离子水。在一个实施方式中，基于正在分离和纯化的CPS的分子量来选择透析管的分子量截止值。在其中CPS是6-脱氧-庚烷荚膜多糖的一个实施方式中，透析管具有约3,500道尔顿的分子量截止值。
在步骤(f)中，透析的CPS沉淀物可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行浓缩。在一个实施方式中，CPS沉淀物通过冷冻干燥进行浓缩。在一些实施方式中，在浓缩CPS沉淀物之前，使用0.45μm过滤器过滤透析的CPS沉淀物。然后将浓缩的CPS溶解在弱酸中。示例性弱酸包括但不限于乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、草酸、尿酸、苹果酸、酒石酸及其组合。在一个实施方式中，弱酸是乙酸。在一个实施方式中，弱酸是包含按体积计在约0.1％至20％、约0.1％至15％、约0.1至10％、约0.1％至5％或约1％至3％之间的弱酸的水溶液。在一些实施方式中，弱酸是包含按体积计约2％的乙酸的水溶液。在一个实施方式中，将浓缩的CPS溶解在弱酸中以形成浓度为约0.1至30mg/ml、约0.1至25mg/ml、约0.1-20mg/ml、约0.1-15mg/ml、约0.1至10mg/ml、约1至10mg/ml或约2至7mg/ml CPS的混合物。在一些实施方式中，将溶解的CPS在约100℃的温度下温育约2小时。(f)中将溶解的CPS与固体杂质分离的步骤可以使用本领域技术人员已知的任何方法。在一个实施方式中，使用离心法将溶解的CPS与固体杂质分离。在一个实施方式中，将包含固体杂质的溶解的CPS在17000x g下离心约20分钟以将固体杂质沉淀。在一个实施方式中，将包含溶解的CPS的上清液进行到步骤(g)。
在步骤(g)中，可使用本领域技术人员已知的任何方法来浓缩溶解的CPS。在一个实施方式中，通过冷冻干燥来浓缩溶解的CPS。在(g)中向浓缩的CPS添加缓冲液的步骤可以使用已知或相信将用于凝胶过滤的任何缓冲液(例如，已知或相信基于要使用的凝胶过滤树脂和/或要纯化的CPS将导致良好的分离)。在一个实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在另一个实施方式中，缓冲液是水。当缓冲液是水时，水可以来自任何清洁水源，诸如过滤水、蒸馏水或去离子水。在又另一个实施方式中，缓冲液是不包含胺的任何生物缓冲液。在一个实施方式中，缓冲液具有约7.2的pH。在一些实施方式中，将缓冲液添加到浓缩的CPS中以形成包含约5至50mg/ml、约5至40mg/ml、约5至30mg/ml、约15至30mg/ml和约20至30mg/ml的CPS的溶液。在一些实施方式中，缓冲液和浓缩的CPS的溶液在加载到凝胶过滤树脂上之前被过滤。在一个实施方式中，过滤器是0.45μm过滤器。凝胶过滤树脂可以是已知或相信可用于纯化荚膜多糖的任何色谱树脂。在一个实施方式中，凝胶过滤树脂是用于尺寸排阻色谱的树脂。示例性的尺寸排阻凝胶过滤树脂包括但不限于和/>树脂。在一个实施方式中，凝胶过滤树脂是交联葡聚糖凝胶。在一些实施方式中，交联葡聚糖凝胶是在一个实施方式中，凝胶过滤树脂是/>G-50。在另一个实施方式中，凝胶过滤树脂是具有与/>G-50类似的分解能力的树脂。在一些实施方式中，凝胶过滤树脂是/>或/>树脂，其具有与G-50类似的分解能力。在一些实施方式中，凝胶过滤树脂具有与/>G-50树脂相似的分子量范围。在一个实施方式中，凝胶过滤树脂用添加到浓缩的CPS的相同缓冲液平衡。在一个实施方式中，凝胶过滤树脂用pH为7.2的PBS缓冲液平衡。在另一个实施方式中，凝胶过滤树脂用水平衡。在又另一个实施方式中，凝胶过滤树脂用不包含胺的生物缓冲液平衡。
在步骤(h)中，使用已知或相信可用于从凝胶过滤树脂洗脱CPS的任何缓冲液来洗脱纯化的CPS。在一个实施方式中，凝胶过滤树脂在标准色谱柱中。在一个实施方式中，缓冲液是在步骤(g)中添加到浓缩的CPS中的相同缓冲液。因此，在一个实施方式中，缓冲液是pH为7.2的PBS。在另一个实施方式中，用水洗脱纯化的CPS。在又另一个实施方式中，用不包含胺的生物缓冲液洗脱纯化的CPS。在一个实施方式中，苯酚-硫酸测定法用于确定从凝胶过滤树脂洗脱的哪些级分含有CPS。
在一些实施方式中，步骤(h)之后是包括透析纯化的CPS的步骤(i)。在一个实施方式中，将纯化的CPS相对于水进行透析。在一些实施方式中，水是去离子水。在一个实施方式中，基于纯化的CPS的分子量来选择透析管的分子量截止值。在其中纯化的CPS是6-脱氧-庚烷荚膜多糖的一个实施方式中，透析管具有约3,500道尔顿的分子量截止值。在一些实施方式中，在透析之后过滤纯化的CPS。在一个实施方式中，过滤器是0.45μm过滤器。在其中使用水洗脱步骤(h)中纯化的CPS的一个实施方式中，不进行步骤(i)。在其中使用PBS洗脱步骤(h)中纯化的CPS的一个实施方式中，进行步骤(i)。
在一些实施方式中，步骤(h)或步骤(i)之后是包括浓缩纯化的CPS的步骤(j)。纯化的CPS可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行浓缩。在一个实施方式中，纯化的CPS通过冷冻干燥进行浓缩。
在一些实施方式中，该方法进一步包括以下步骤：(j)向浓缩的CPS中添加缓冲液以形成溶液；(k)将溶液加载到第二凝胶过滤树脂上；和(l)从第二凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。在一些实施方式中，第二凝胶过滤树脂选自G-50、 或/>树脂。在一些实施方式中，第二凝胶过滤树脂是Superdex200Increase 10/300GL树脂。
在一个实施方式中，分离和纯化CPS的方法需要约7至9天。在一个实施方式中，当在步骤(g)和(h)中使用CPS缓冲液时，分离和纯化CPS的方法需要9天。在另一个实施方式中，当在步骤(g)和(h)中使用水作为缓冲液时，分离和纯化CPS的方法需要7天。因此，所公开的方法比需要约20天的先前的分离和纯化CPS的方法快。进一步地，所公开的方法产生比先前方法更高的CPS产率。与从4.8升的细胞培养物产生约36mg纯化的CPS的先前方法相比，所公开的方法从相同量的细胞培养物中产生约70mg纯化的CPS。在一个实施方式中，所公开的分离和纯化CPS的方法优于先前方法，因为它不涉使用及苯酚、核酸酶、蛋白酶和超速离心。在一些实施方式中，所公开的分离和纯化CPS的方法优于先前的方法，因为它可以容易地放大用于分离大量伯克霍尔德氏菌CPS的工业过程。因此，在一些实施方式中，所公开的方法进一步考虑使用类似于(a)-(h)的步骤，以及经过修改的可选步骤(i)和(j)，使得它们可以在工业规模上进行。在一些实施方式中，所公开的方法可用于在工业规模上从50mL或更大的细胞培养物中分离和纯化伯克霍尔德氏菌CPS。
在另一个方面，本公开内容涉及使用所公开的方法分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。在一个实施方式中，使用所公开的方法从O-多糖突变菌株泰国伯克霍尔德氏菌BT2683分离和纯化伯克霍尔德氏菌CPS。在一个实施方式中，使用所公开的方法分离和纯化6-脱氧-庚烷CPS。
实验实施例
通过参考以下实验实施例来进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明目的，并且除非另有规定，否则不具有限制性。因此，本发明不应以任何方式被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
在没有进一步描述的情况下，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方式，并且不应被解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
实施例1：从泰国伯克霍尔德氏菌BT2683纯化CPS
材料和方法
试剂和耗材的来源
M9微量盐，5x(Difco 248510)
胰蛋白酶(Bacto 211705)
0.45μM快速流动瓶过滤单元，75mm(Nalgene 295-4545)
0.45μm注射器过滤器，33mm(Millex HA SLHA033SB)
BupH PBS pH 7.2(Thermo 28372)
Sephadex G-50，培养基(Sigma G50150)
样品制备
BT2683的样品S1和S2(各约5mg)分别溶解在525μL D2O(99.96％ D，CambridgeIsotope Laboratories)中，并转移到5-mm NMR管中。
NMR谱
NMR数据在50℃下在配备有冷冻探针的Bruker Avance III波谱仪(1H，600.13MHz)上获得。获得了定量1H NMR谱，其中波谱宽度为9615Hz，16384个复杂数据点，4个瞬态，每个瞬态之间的总恢复延迟为62s。1H化学位移参考了先前报道的泰国伯克霍尔德氏菌CPS信号的位置。在Mestrenova(版本14.1.1-24571)中对数据进行了处理和分析。
多糖定量
基于多糖A、B和C的所有重叠和非重叠信号的积分强度来确定多糖的相对摩尔百分数。变量a、b和c被定义为分别对应于多糖A、B和C的重复单元中的一个氢的理论积分强度。然后将每个信号的理论积分强度表示为系数a、b和c的和，每个系数乘以信号中表示的A、B和C的氢的数量(表1)。系数a、b和c的值通过Excel Solver中的非线性回归来确定，其方法是最小化实验和理论积分强度之间的平方差之和。
表1.理论积分的积分范围和表达式
积分范围(ppm) 分配 理论积分
5.36-5.19 A2+C2 a+c
5.14-5.05 B1 b
4.95-4.81 A1+C1 a+c
4.24-4.15 B2 b
4.03-3.85 A3+B3+B6+C3 a+2b+c
3.85-3.67 A7+A7’+B4+B5+B6’ 2a+3b
3.58-3.33 A4+A5+C5+C4 2a+2c
2.21-2.04 A6+AAc+CAc 4a+3c
1.81-1.63 A6’ a
1.38-1.25 C6 3c
Bt-CPS纯化步骤
第1天
1.使用泰国伯克霍尔德氏菌BT2683(O-多糖突变体；ΔrmlD)的冷冻原液在125mlErlenmeyer烧瓶中接种25ml的M9微量盐+胰蛋白酶(M9TG)，并在37℃下剧烈振荡(～200rpm)温育约18小时。这是起始培养物。
第2天
2.用125ml Erlenmeyer烧瓶中的1ml培养物(每个烧瓶)在2L带挡板烧瓶中接种8x600ml M9TG，并在37℃下剧烈振荡(～200rpm)温育24小时。
第3天
3.将细胞沉淀(10分钟@8,000x g)，并重悬于总计200ml的dH2O中。将细菌悬浮液添加到装有搅拌棒的1L Pyrex瓶中。向瓶中添加等体积的无水乙醇，并在室温下搅拌(约400rpm)30分钟。
4.将细胞沉淀(10分钟@8000x g)，并小心地将上清液转移到1L Pyrex瓶中。使用0.45μm快速流动瓶过滤单元将上清液过滤到2L Pyrex瓶中。
5.向上清液中添加1600ml无水EtOH，以达到90％EtOH(v/v)的最终浓度。轻轻搅拌，然后在室温下静置(定期旋转)60分钟。将不溶性材料沉淀(12000x g下30分钟)，小心倾析上清液，并将CPS颗粒重悬于总计30ml的dH2O中(图1)。使用3500MWCO管对溶解的CPS进行dH2O透析。定期混合透析管中的内容物。
第4天
6.用0.45μm注射器过滤器澄清透析液，然后冷冻干燥以浓缩。
第5天
7.冻干材料的质量为约120mg。将CPS溶解在5mg/ml的2％乙酸中，并在100℃的加热块中温育2小时。定期倒置管道进行混合。建议在此阶段使用50ml聚四氟乙烯管。
8.冷却至室温并通过离心(17000x g下20分钟)澄清水解产物。小心地取出上清液并冷冻干燥以浓缩。
第6天
9.Bt-CPS冻干材料的质量为约96mg。将酸水解的样品以约25mg/ml溶解在pH 7.2的PBS中，并用0.45μm注射器过滤器澄清。
凝胶过滤步骤
10.将Bt-CPS样品加载到用PBS pH 7.2平衡的Sephadex G-50柱(40cm x 2.6cm；约180ml树脂)上，并用相同的缓冲液以约0.75ml/min的流速洗脱。使用苯酚-硫酸测定法测定碳水化合物的级分(～6ml)(图2)。注意，可选地，柱可以用水平衡，其中样品然后用水洗脱。
11.池级分#13-19，使用3500MWCO管对dH2O进行透析，然后通过0.45μm注射器过滤器(图3)。注意，如果使用水代替PBS来制备Sephadex柱并洗脱CPS，则不需要该步骤。
第8天
12.将透析液冷冻以浓缩。
第9天
G-50柱纯化的BT2683 CPS的质量为约70mg。
注意：CPS可以使用dH2O作为缓冲(溶剂)系统从G-50柱洗脱。使用水作为溶剂系统可以将纯化时间从9天减少到7天。
结果
在PBS(S1；图4A)或水(S2；图4B)中从Sephadex G-50柱洗脱的BT2683样品的1HNMR波谱实际上是相同的。该波谱与先前获得的泰国伯克霍尔德氏菌CPS的波谱非常相似，并且主要包含三种不同多糖的混合物的信号。表2中所示的三种多糖的信号分配是基于与先前分配的泰国伯克霍尔德氏菌CPS的化学位移比较。因为聚合物A和C只有一个分离的信号可用，并且为了最小化由于分离的信号与次要物种的潜在信号的潜在重叠而导致的定量偏差，通过使用所有可用的多糖信号的拟合程序来进行三种多糖的相对定量(见“方法”)。
表2.BT2683 CPS的1H NMR信号的分配
BT2863样品S1和S2的所得多糖组合物显示在表3中。样品S1和S2中多糖A和B的量略有不同。
表3.BT2683样品的多糖组合物
为了比较使用经典苯酚提取法(P-CPS)或乙醇提取法(E-CPS)获得的Bt-CPS的组合物，在G-50树脂上纯化在PBS中以2mg/ml溶解的样品，随后在Superdex 200Increase 10/300GL柱上运行。分析结果(图5)显示E-CPS材料(图5B)在尺寸上更均匀(即，多分散性更小)并且包含比P-CPS材料更少的污染物(图5A)。这些观察结果与使用E-CPS材料而非P-CPS材料生产的更高质量的糖缀合物材料(例如，CPS-CRM197)相关。
所公开的乙醇沉淀方法比以前纯化伯克霍尔德氏菌CPS的苯酚提取方法更快并且产生更高的产率和更均匀的材料。进一步地，与先前方法的20天相比，所公开的方法仅需要7至9天就可以达到纯化的CPS。与从4.8升细胞培养物中产生约36mg CPS的苯酚提取方法相比，所公开的方法还从相同量的培养物中常规产生约70mg CPS。此外，所公开的方法比先前的伯克霍尔德氏菌CPS纯化方法更容易放大并且更具成本效益，因为它不使用苯酚、超速离心或酶。
本文引用的每一项专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用的方式以其整体并入本文。虽然已经参考特定实施方式公开了本发明，但是很明显，在不脱离本公开内容的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其他实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等效变型。
列举的实施方式
实施方式1提供了一种从伯克霍尔德氏菌物种分离和纯化荚膜多糖(CPS)的方法，该方法包括(a)培养伯克霍尔德氏菌细胞；(b)将细胞沉淀，将细胞重悬于水中，向重悬的细胞中添加醇以形成细胞浆液；(c)将细胞浆液沉淀，除去上清液；(d)向上清液中添加醇，形成包含CPS的沉淀物；(e)将CPS沉淀物沉淀，将沉淀物重悬于水中，透析重悬的CPS沉淀物；(f)浓缩透析的CPS沉淀物，将CPS溶解在弱酸中，将溶解的CPS与固体杂质分离；(g)浓缩溶解的CPS，向浓缩的溶解的CPS中添加缓冲液以形成溶液，将溶液加载到凝胶过滤树脂上；和(h)从凝胶过滤树脂中洗脱纯化的CPS。
实施方式2提供了实施方式1的方法，其中伯克霍尔德氏菌物种为泰国伯克霍尔德氏菌。
实施方式3提供了实施方式1或2的方法，其中伯克霍尔德氏菌物种是泰国伯克霍尔德氏菌的O-多糖突变菌株。
实施方式4提供了实施方式3的方法，其中泰国伯克霍尔德氏菌的O-多糖突变体菌株是泰国伯克霍尔德氏菌BT2683。
实施方式5提供了实施方式1-4中任一项的方法，其中CPS是6-脱氧-庚烷CPS。
实施方式6提供了实施方式1-5中任一项的方法，其中步骤(b)包括在搅拌下向重悬的细胞中添加与重悬的细胞体积相比相等体积的乙醇，以形成细胞浆液。
实施方式7提供了实施方式1-6中任一项的方法，其中步骤(d)包括向上清液中添加乙醇以达到约90％(v/v)乙醇的最终浓度，形成包含CPS的沉淀物。
实施方式8提供了实施方式1-7中任一项的方法，其中步骤(e)包括用水透析重悬的CPS沉淀物。
实施方式9提供了实施方式1-8中任一项的方法，其中步骤(f)包括将CPS溶解在包含按体积计约1％至3％之间的乙酸的水溶液中，以形成浓度为约2至7mg/ml CPS的混合物。
实施方式10提供了实施方式9的方法，其中混合物在约100℃的温度下温育约2小时。
实施方式11提供了实施方式1-10中任一项的方法，其中步骤(g)包括将磷酸盐-缓冲盐水添加到浓缩的CPS中以形成具有在约20至30mg/ml之间的CPS浓度的溶液，并将该溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中凝胶过滤树脂包括交联葡聚糖凝胶过滤树脂。
实施方式12提供了实施方式1-10中任一项的方法，其中步骤(g)包括向浓缩的CPS中添加去离子水以形成具有在约20至30mg/ml之间的CPS浓度的溶液，并将该溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中凝胶过滤树脂包括交联葡聚糖凝胶过滤树脂。
实施方式13提供了实施方式11的方法，其中步骤(h)包括使用磷酸盐-缓冲盐水从凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。
实施方式14提供了实施方式12的方法，其中步骤(h)包括使用去离子水从凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。
实施方式15提供了实施方式1-11中任一项的方法，其中步骤(h)之后是包括透析纯化的CPS的步骤(i)。
实施方式16提供了实施方式15的方法，其中将纯化的CPS用水透析。
实施方式17提供了实施方式1-16中任一项的方法，其中步骤(h)或步骤(i)之后是包括浓缩纯化的CPS的步骤(j)。
实施方式18提供了实施方式1-16中任一项的方法，其中醇是乙醇。
实施方式19提供通过实施方式1-18中任一项的方法从O-多糖突变菌株泰国伯克霍尔德氏菌BT2683分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。
实施方式20提供通过实施方式1-18中任一项的方法分离和纯化的6-脱氧-庚烷CPS。

Claims (21)

1.一种从伯克霍尔德氏菌物种中分离和纯化荚膜多糖(CPS)的方法，所述方法包括
(a)培养伯克霍尔德氏菌细胞；
(b)将所述细胞沉淀，将所述细胞重悬于水中，向所述重悬的细胞中添加醇以形成细胞浆液；
(c)将所述细胞浆液沉淀，除去上清液；
(d)向所述上清液中添加醇，形成包含所述CPS的沉淀物；
(e)将所述CPS沉淀物沉淀，将所述沉淀物重悬于水中，透析所述重悬的CPS沉淀物；
(f)浓缩所述透析的CPS沉淀物，将所述CPS溶解在弱酸中，将所述溶解的CPS与固体杂质分离；
(g)浓缩所述溶解的CPS，向所述浓缩的CPS中添加缓冲液以形成溶液，将所述溶液加载到凝胶过滤树脂上；和
(h)从所述凝胶过滤树脂中洗脱纯化的CPS。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述伯克霍尔德氏菌物种是泰国伯克霍尔德氏菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述伯克霍尔德氏菌种是泰国伯克霍尔德菌的O-多糖突变菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述泰国伯克霍尔德氏菌的O-多糖突变菌株是泰国伯克霍尔德氏菌BT2683。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述CPS是6-脱氧-庚烷CPS。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在搅拌下向所述重悬的细胞中添加与所述重悬的细胞的体积相比相等体积的乙醇，以形成细胞浆液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括向所述上清液中添加乙醇以达到约90％(v/v)乙醇的最终浓度，形成包含所述CPS的沉淀物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(e)包括用水透析所述重悬的CPS沉淀物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(f)包括将所述CPS溶解在包含按体积计在约1％至3％之间的乙酸的水溶液中，以形成CPS浓度在约2至7mg/ml之间的混合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述混合物在约100℃的温度下温育约2小时。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(g)包括向所述浓缩的CPS中添加磷酸盐-缓冲盐水以形成具有在约20至30mg/ml之间浓度的所述CPS的溶液，并将所述溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中所述凝胶过滤树脂包括交联葡聚糖凝胶过滤树脂。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中步骤(g)包括向所述浓缩的CPS中添加去离子水以形成浓度在约20至30mg/ml之间的所述CPS的溶液，并将所述溶液加载到凝胶过滤树脂上，其中所述凝胶过滤树脂包括交联葡聚糖凝胶过滤树脂。
13.根据权利要求11的方法，其中步骤(h)包括使用磷酸盐-缓冲盐水从所述凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。
14.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(h)包括使用去离子水从所述凝胶过滤树脂洗脱纯化的CPS。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(h)之后是包括透析所述纯化的CPS的步骤(i)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述纯化的CPS用水进行透析。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤(h)或步骤(i)之后是包括浓缩所述纯化的CPS的步骤(j)。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述醇为乙醇。
19.通过权利要求1-18中任一项所述的方法分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。
20.通过权利要求1-18中任一项所述的方法从O-多糖突变菌株泰国伯克霍尔德氏菌BT2683分离和纯化的伯克霍尔德氏菌CPS。
21.通过权利要求1-18中任一项所述的方法分离和纯化的6-脱氧-庚烷CPS。
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