KR20220168776A - 삼면홍회백 식별을 위한 바이오마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

삼면홍회백 식별을 위한 바이오마커 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼면홍회백 검출용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 프라이머 세트를 이용하여 신규 누에의 품종 비교 분석을 통한 계통 연구 및 정보 분석이 가능하고, 본 발명의 키트를 이용하면 누에 품종 중 삼면홍회백만을 간편하고 신속하게 특이적으로 검출할 수 있어, 누에 품종 간 비교 분석을 통한 누에의 분자육종 및 신품종 개발을 위한 기반을 구축할 수 있다.

Description

삼면홍회백 식별을 위한 바이오마커 조성물 및 이의 용도{Bio marker composition for identification of Sammyeonhonghoeback Bombyx mori, and uses thereof}
본 발명은 누에인 삼면홍회백 식별을 위한 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
누에는 집에서 사육되는 가잠(家蠶)과 야생에서 사육되는 야잠(野蠶)으로 분류할 수 있다. 가잠은 농번기를 피하여 여름이나 겨울에 사육하며, 뽕잎만 있으면 사육할 수 있으므로 알을 냉장해 두었다가 필요에 따라 사육하고 있다. 야잠은 그 종류가 많으나 가장 유명한 것은 작잠이고, 그 외에 천잠과 율충견이 있다.
도토리나무나 가락나무 등의 잎을 먹고 자라는 작잠(Antheraea pernyi)은 산둥성, 랴오둥반도, 인도 등지에서 다량 생산되며, 떡갈나무 잎을 먹는 천잠(Antheraea Yamamai)은 일본의 장야(長野), 광도(廣島) 등의 특산품으로 담녹황색의 고치를 지으며, 산고치견(Yamamai silk)이라고도 한다. 어스랑이라고도 불리는 율충(Caligula Japonica, 밤나무산누에나방)은 밤나무 잎을 먹으며, 회갈색의 딱딱한 고치를 짓는 누에이다.
누에는 그 시발지인 중국으로부터 세계의 여러 지역으로 전파되어 서로 다른 각 지역의 자연환경에 적응하면서 각 지역에 따른 형질적 특징을 갖게 되었다. 중국종계 누에알은 연한 녹색 기운이 도는 회색으로 일본종계보다 빛깔이 연하다. 유충은 희잠(plain)으로 성장이 비교적 빠른 편이다. 익은 누에는 푸른 빛을 띠며, 병과 환경에 대한 저항성이 강한 편이다. 고치의 형태는 타원형이고, 고치에서 나오는 견사는 가늘다.
일본종계 누에알의 색은 회갈색이며 익은 누에는 붉은빛을 띤다. 유충은 형잠(normal marking)으로 유충기간이 중국종보다 약간 길고, 고치는 땅콩형으로 짓는다. 견사는 길이가 굵고 짧은 편이다. 유럽종계 누에알의 색은 일본종계보다 연하며, 몸이 길고 다른 종보다 크고 무거운 것이 특징이다. 중국종계와는 달리 누에병과 환경에 대한 저항성이 약하여 사육하기가 어렵다. 고치는 긴 타원형이며, 실로 만들기가 가장 좋은 종자이다.
열대종계는 인도와 동남아시아가 원산지로 방추형의 작은 고치를 지으며, 고치색은 황색 또는 녹색이 대부분이다. 누에알은 작고 광택이 있으며, 유충기간은 짧지만, 매우 튼튼하다. 재래종은 19세기까지 사육되어온 우리나라의 누에로 흰색 또는 황색 고치를 짓는 삼면잠누에가 있다.
세계적으로 약 3,000여 품종의 누에가 다양한 목적에 의해서 보전되고 있는 가운데 국내에서는 340여 계통을 국가 유전자원으로 보존하고 있으며, 매년 육종을 통하여 한별누에 등 신품종을 육성하고 있다. 이들 누에 계통과 함께 삼면홍회백을 비롯한 5종의 우리 고유 재래종이 있으나, 실크 생산을 위한 1차 산업적인 유용성이 매우 낮아 재래종에 대한 연구 및 산업적 활용이 거의 없는 실정이다.
각 누에 유전자원은 오랜 기간 순화로 유전자원 내 고유 유전적 형질이 존재하나 국내 고유 품종을 비롯한 보존된 유전자원에 관한 비교 연구는 전무한 실정으로, 품종 구분을 위한 적절한 분자 마커의 개발이 시급하다.
본 발명자들은 다양한 누에 종 중 특정 종인 삼면홍회백을 정확하게 식별하기 위하여 연구하던 중, 삼면홍회백의 특정 유전자에서 특정 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)를 발견하고 이를 기반으로 프라이머를 설계한 후, 상기 프라이머가 삼면홍회백을 정확하게 검출함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 삼면홍회백 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 삼면홍회백 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 삼면홍회백 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 삼면홍회백 식별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼면홍회백의 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 NADH 탈수소효소 서브유닛 5(NADH dehydrogenase subunit 5, ND5) 유전자의 염기서열 중 7,025번째 위치의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 삼면홍회백 검출용 조성물을 제공한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 삼면홍회백 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 검출용 조성물 및 본 발명에 따른 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 삼면홍회백 검출용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 누에 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 검출용 조성물 및 본 발명에 따른 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용한 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 삼면홍회백 식별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 프라이머 세트를 이용하여 신규 누에의 품종 비교 분석을 통한 계통 연구 및 정보 분석이 가능하고, 본 발명의 키트를 이용하면 누에 품종 중 삼면홍회백만을 간편하고 신속하게 특이적으로 검출할 수 있어, 누에 품종 간 비교 분석을 통한 누에의 분자육종 및 신품종 개발을 위한 기반을 구축할 수 있다.
도 1은 삼면홍회백을 포함한 5개의 고유종 및 34개 품종의 누에의 NADH 탈수소효소 서브유닛 5(NADH dehydrogenase subunit 5, ND5) 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 방법에 의해 검출된 삼면홍회백을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 1반복구 도이다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 검출된 삼면홍회백을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 2반복구 도이다.
도 4는 본 발명의 방법에 의해 검출된 삼면홍회백을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 3반복구 도이다.
도 5는 본 발명의 방법에 의해 검출된 삼면홍회백을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 4반복구 도이다.
도 6은 본 발명의 방법에 의해 검출된 삼면홍회백을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 5반복구 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 누에종인 삼면홍회백을 특이적으로 검출하기 위한 삼면홍회백의 특정 유전자의 SNP 부위 및 이를 기반으로 제작한 프라이머 세트에 대한 것이다.
따라서 본 발명은 삼면홍회백의 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 NADH 탈수소효소 서브유닛 5(NADH dehydrogenase subunit 5, ND5) 유전자의 염기서열 중 7,025번째 위치의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 삼면홍회백 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “삼면홍회백”은 농촌진흥청 국립농과학원 씨앗은행에 등록번호 "KE10147"으로 등록되어 있다. 누에유충무늬는 희잠이고, 화성은 2화성이며, 면성은 4면성이고, 의장체색은 갈색이다. 또한, 유충체색은 노랑연회색이고, 월년난색은 회색이며, 견색은 엷은노랑이다. 고치모양은 표형이며, 혈색은 백색을 띤다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 삼면홍회백을 포함한 5개의 고유종(삼면홍회백(SH) 외 고려삼면(GS), 한삼면(HS), 선7호(S7) 및 산동삼면(SD)) 및 34개 품종 누에의 ND5 유전자의 염기서열을 비교 분석해 본 바, 삼면홍회백만 ND5 유전자 내 7,025번째 염기서열이 티민(thymine)인 것을 확인하였다(도 1 참고).
본 발명의 “NADH 탈수소효소 서브유닛 5(NADH dehydrogenase subunit 5, ND5)”에 있어서, 상기 “NADH 탈수소효소(NADH dehydrogenase)”는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)의 환원 형태(NADH)에서 산화 형태(NAD+)로 변환하는 효소이다. NADH 탈수소효소는 철-황 반응중심을 갖는 플라보단백질(flavoprotein)이며, 미토콘드리아에서의 ATP 합성을 위한 전자전달 과정에 작용하는 것으로 잘 알려져 있다.
본 발명에 있어서 상기 ND5 유전자는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "단일염기다형성(single nucleotide polmorphism, SNP)"이란 개체간 DNA 염기서열 하나에서 나타나는 차이를 말한다. DNA 염기서열의 특정 부위에 어떤 작물이 아데닌(adenine)을 가지고 있는 반면 어떤 작물은 시토신(cytosine)을 가지고 있는 것으로, 이러한 미세한 차이에 의하여 각 유전자의 기능이 달라질 수 있고, 이런 것들이 상호 작용하여 서로 다른 모양의 초형을 만들고 서로 다른 질병에 대한 감수성의 차이를 만들어 낸다.
SNP는 지금까지 알려진 DNA 다형성의 약 80%를 차지하는 것으로 알려졌다. 인간 유전체에서 SNP는 약 1kb 마다 하나씩 존재하는 것으로 알려졌으며, 벼에서는 자포니카와 인디카 품종 간 약 170bp 마다 하나씩 SNP가 나타나는 것으로 보고되었다.
이론적으로 네 종류의 뉴클레오티드 중 어느 것이든 한 위치에 존재할 수 있기 때문에 각 SNP는 네 개의 대립인자를 가질 수 있다. 작은 크기 염기의 삽입과 결실도 SNP에 포함된다. 다만, SNP는 유전체의 점 돌연변이에 의해 생기므로 대부분의 SNP는 단지 두 가지 변형으로만 존재한다.
SNP는 존재하는 위치에 따라 유전자의 프로모터(promoter) 등 전사활성조절에 관계하는 영역에 존재하는 regulatory SNP (rSNP), 유전자의 인트론(intron) 부분에 존재하는 intronic SNP (iSNP), 유전자와 유전자 사이에 존재하는 genomic SNP (gSNP) 및 유전자의 엑손(exon) 부분으로 아미노산 변이를 일으키는 영역에 존재하는 coding SNP (cSNP)로 구분할 수 있다. cSNP는 아미노산의 변경이 없는 sSNP(synonymous SNP)와 아미노산이 변경되는 nsSNP(nonsynonymous SNP) 등으로 분류된다.
유전체 상에서 SNP를 동정하는 가장 직접적인 방법은 서로 다른 개체나 종의 유전체 전체의 DNA 염기서열을 직접 비교, 분석하는 것이며, 더 효율적인 전략으로는 여러 개체의 유전체 상의 일부분의 염기서열을 확보하여 비교 분석하는 것이다.
본 발명에 있어서, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌(genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 마커의 유전자 지도 상의 위치는 유전자 좌로 표시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 단일염기 다형성마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화(hybridization)하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한 상기 폴리뉴클레오타이드는 단염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 프라이머는 3‘마지막 염기가 단일염기다형성 부위에 상보적으로 결합할 수 있다.
특히 본 발명은 본 발명에서 확인한 SNP 변이 지역을 기반으로, 삼면홍회백을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다.
따라서 본 발명은 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 삼면홍회백 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 “프라이머”는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기 프라이머의 길이는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하는 온도와 밀접한 관계를 가지는데 일반적으로 길이가 길어질수록 온도는 높아지게 된다. 사용 목적에 따라 달라질 수는 있으나 통상 10 내지 30 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "프라이머 세트"는 목적하는 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭시키기 위하여 사용되는 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머로 구성된 세트를 의미하며, 용어 "프라이머 쌍"과 호환된다.
본 발명에 있어서, "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
본 발명의 삼면홍회백 검출용 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 A; 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 B;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 삼면홍회백 검출용 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트 A는, 삼면홍회백 특이적 SNP 마커를 증폭하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 삼면홍회백 검출용 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트 B는, 삼면홍회백 특이적 SNP 마커의 증폭 산물 중 대립유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 것임이 바람직하다.
또한 본 발명의 삼면홍회백 검출용 프라이머 세트는 테트라 프라이머 ARMS-PCR(tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction, tetra-primer ARMS)용인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 tetra-primer ARMS (tetra-primer amplification refractory mutation system)는 한 번의 PCR 수행 후 전기영동 결과를 바탕으로 SNP를 판별하는 방식을 의미한다. 구체적으로 tetra-primer ARMS는 한 번의 PCR에서 4개의 프라이머를 사용하여 SNP 유전자형을 판별하는데, 상기 프라이머는 SNP 영역을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 2개의 외부 프라이머(outer primer; OF 및 OR) 및 SNP 유전자형 판별을 위한 대립유전자 특이적 단편을 증폭하는 2개의 내부 프라이머(inner primer; IF 및 IR)로 구성된다.
외부 프라이머를 사용하여 증폭된 단편은 대립유전자 특이적 단편을 생성하는 내부 프라이머의 주형 가닥으로 이용된다. 내부 프라이머는 3' 말단에 SNP 각각의 대립유전자를 포함한 특이적 프라이머로 제작하여 해당 대립유전자에는 특이적으로 반응하나 다른 대립유전자에는 반응하지 않음으로써 각각 다른 단편을 증폭하게 되는 것이다.
SNP 영역을 중심으로 외부 프라이머를 각각 다른 영역(region)에 배치하여, 두 개의 대립유전자 단편이 서로 다른 크기로 증폭되어 전기영동 시 육안 구분이 가능하다. 즉, 본 발명에서는 외부 프라이머를 각각 ND5 유전자 내 6,784 - 6,806 bp에 해당하는 영역(SH_SNP2-OF) 및 7,408 - 7,428 bp에 해당하는 영역(SH_SNP2-OR)에 배치함으로써, SNP 영역을 포함하는 645bp의 산물을 수득할 수 있었다. 더불어 더불어 내부 프라이머를 각각 ND5 유전자 내 7,006 - 7,025 bp에 해당하는 영역(SH_SNP2-IF) 및 7,025 - 7,045 bp에 해당하는 영역(SH_SNP2-IR)에 배치함으로써 삼면홍회백에만 반응한 262bp의 산물을 수득할 수 있어, 본 발명의 방법을 이용하면, 삼면홍회백 시료에서는 645bp 및 262bp의 밴드를 확인할 수 있다.
반면, 삼면홍회백에 해당하지 않는 시료는 423bp의 산물을 수득할 수 있어, 이의 시료에서는 645bp 및 423bp의 밴드를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 대립유전자 밴드 크기 상이에 따라 쉽게 식별할 수 있어, 삼면홍회백을 포함한 5개의 고유종 및 34개 품종 중에서 삼면홍회백만을 특이적으로 검출할 수 있는 것이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 검출용 조성물 및 본 발명에 따른 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 삼면홍회백 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 삼면홍회백 검출용 키트는 본 발명에 따른 검출용 조성물 또는 프라이머 세트를 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조할 수 있다. 더불어 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 증폭 반응에 첨가될 수 있는 시약이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 폴리머라제, dNTPs 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 이에 시약 및 도구로서 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 더불어 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
상기 키트는 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 테트라 프라이머 ARMS-PCR 키트, 다중 중합소연쇄반응(multiplex PCR) 키트, 리가아제 연쇄 반응(LCR) 키트, Gap-LCR, 복구연쇄반응(repair chain reaction) 키트, 전사-중재 증폭(TMA) 키트, 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication) 키트, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences) 키트, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(CP-PCR) 키트, 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR) 키트, 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA) 키트, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 키트, 고리-중재 항온성 증폭(LAMP) 키트, 이중 중합효소연쇄반응(nested-PCR) 키트, 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR) 키트, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 상기 테트라 프라이머 ARMS-PCR 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한, 삼면홍회백 식별 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 누에 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 검출용 조성물 및 본 발명에 따른 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용한 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 시료에서 게놈 DNA를 추출하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하거나 단지 배양액을 증류수에 희석시켜 끓이는 방법으로도 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 본 발명에 따른 삼면홍회백 식별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 테트라 프라이머 ARMS-PCR, 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction, multiplex PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction, nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction, single tube nested-PCR), 다중 역전사-중합효소연쇄반응(multiplex reverse transcription Polymerase chain reaction, multiplex RT-PCR), 단일 역전사-중합효소연쇄반응 (reverse transcription Polymerase chain reaction, RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction, RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction, RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 들 수 있다. 바람직하게는 테트라 프라이머 ARMS-PCR을 이용하여 수행될 수 있다.
더불어 상기 판별 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트의 농도는 2.5 내지 15 pmol/μl일 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 pmol/μl일 수 있다.
또한 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에 따른 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다.
본 발명의 삼면홍회백 식별 방법에 있어서, 상기 증폭 반응은, a) 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 A를 이용하여 삼면홍회백 특이적 SNP 마커를 증폭하는 단계; 및 b) 서열번호 4로 표시되는 염기서열 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 B를 이용하여 상기 a) 단계의 증폭 산물 중 대립유전자를 특이적으로 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계;를 통해 수행될 수 있다.
더불어 상기 증폭 반응은 90 내지 95℃에서 2 내지 8분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 90 내지 95℃에서 30초 내지 3분, 40 내지 60℃에서 30초 내지 3분, 65 내지 80℃에서 30초 내지 3분을 한 세트로 30 내지 40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 68 내지 75℃, 1 내지 10분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서는 94℃에서 4분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하였고, 순차적으로 94℃에서 1분, 51.5℃에서 1분, 72℃에서 1분을 한 세트로 30 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하였으며, 72℃에서 7분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하였다.
상기 변성을 수행하는 과정에서 30초 미만의 반응시간에서는 변성이 원활하게 이루어지지 않으며, 3분이 초과하면 과도한 변성이 일어나 다음 단계의 증폭 반응을 수행하는데 부적합하게 된다. 상기 신장을 수행하는 과정에서 40~60℃에서 30초~3분간 반응시킨 다음, 반응 온도가 40℃ 미만이라면 충분히 원하는 서열이 증폭되지 않아 시료 내 삼면홍회백의 존재를 검출할 수 없게 되며, 60℃를 초과하면 과도한 증폭이 일어날 수 있다. 또한, 마지막 사이클에서 68℃, 1분 미만의 반응시간에서는 원하는 서열의 신장이 충분히 이루어지지 않으며, 75℃, 10분 초과인 경우에는 과도한 서열의 신장이 발생할 수 있다. 따라서, 상기 조건은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 혼재된 DNA 속에서 삼면홍회백을 증폭하여 진단, 검출하기 위한 최적의 조건인 것이다. 상기 수치 범위를 벗어나는 경우, 시료 내 삼면홍회백의 증폭이 원활하게 이루어지지 않아, 삼면홍회백의 존재를 검출하는데 어려움이 있을 수 있다.
상기 증폭 반응에서 온도 및 시간 조건은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 테트라 프라이머 ARMS-PCR을 수행할 때 산물을 생성하기 위해 설정된 수치로, 실험방법 및 기기의 변경 등에 따라 통상의 당업자의 적절한 선택에 의한 타당한 수치로 변경될 수 있다.
상기 '증폭'은 누에 샘플로부터 추출된 DNA 내에 혼합된 ND5 유전자의 DNA를 주형(Template)으로 하여, 상기 주형 내의 특정 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하여 반복하여 시험관 내에서 해당 DNA 부위를 대량 합성하도록 반응시킨 후, 전기영동에서 뚜렷한 밴드로 가시화하여 판별하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 '검출'은 증폭된 표적 서열에 검출가능한 표지 물질로 표지함으로써, 수행될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 검출에 사용될 수 있는 상기 표지 물질은 Cy5 또는 Cy3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지시킬 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명에 따른 삼면홍회백 검출용 조성물의 제작
삼면홍회백을 포함한 5개의 고유종 및 34개 품종의 염기서열을 분석하였다. 그 중 삼면홍회백의 염기서열은 하기 표 1의 서열번호 2 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 분석하였다. 그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이(SNP 부위를 포함하는 일부 서열만 기재), 삼면홍회백의 ND5 유전자 내 319 bp (6807-7104 bp)를 증폭하였고, 상기 유전자 내 7,025번째 염기서열이 사이토신(cytosine)에서 티민(thymine)으로 변이된 것을 확인하였다. 이를 기반으로 tetra-primer ARMS (tetra-primer amplification refractory mutation system) 수행을 위한 서열번호 2 내지 서열번호 5의 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 프라이머 세트의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머 명칭 서열(5'→3') 서열번호
SH_SNP2-OF CCTAAAATTGAACCTAAAATACT 2
SH_SNP2-OR ATTTATATCTGGTATTTCTGC 3
SH_SNP2-IF AAACGAAAAGTATAAAACAC 4
SH_SNP2-IR ATTTATCTACGGGTTTAAATA 5
SH_SNP2-R ATCTGGATTTTATTCTAAAGA 6
실시예 2. 본 발명 프라이머 세트의 특이도 검증
본 발명 프라이머 세트의 특이도를 검증하기 위하여 tetra-primer ARMS (tetra-primer amplification refractory mutation system)기법을 수행하였다. PCR 반응을 수행을 위한 프라이머 조성은 하기 표 2에 나타내었고, 반응 조건은 하기 표 3에 나타내었다.
실험에 사용된 누에 품종은 총 39종으로, 구체적으로 삼면홍회백, Jam123, Jam124, Jam125, Jam126, Jam140, Jam143, Jam144, Jam145, Jam149, Jam150, Jam151, Jam152, Jam153, Jam154, Jam155, Jam156, Jam157, Jam158, Jam159, Jam160, Jam161, Jam162, Jam307, Jam311, Jam312, Jam313, Jam314, Jam315, Jam316, Jam317, Jam318, Jam319, Jam320, Jam321, 고려삼면, 한삼면, 선7호, 산동삼면이 이용되었다.
DNA (1/10 희석) 1㎕
10pmol SD_SNP4-OF 0.5㎕
10pmol SD_SNP4-OR 0.5㎕
10pmol SD_SNP4-IF 1㎕
10pmol SD_SNP4-IR 1㎕
Distilled water 16㎕
총 20㎕
온도(℃) 시간(분) 싸이클
(Cycle)
94 4 1
94 1 30
51.5 1
72 1
72 7 1
tetra-primer ARMS PCR 수행 후, 결과는 전기영동을 통해 확인하였다. 전기영동은 1×TBE 버퍼(buffer)를 사용하여 2% 아가로오스 겔(agarose gel)을 제작하여 사용하였고, 100V에서 30분 동안 전기영동을 수행하였다.
도 2 내지 6에 나타난 바와 같이, 서열번호 2 및 3에 해당하는 외부 프라이머의 작용에 의해 645bp의 밴드가 나타났고, 서열번호 4 및 5에 해당하는 내부 프라이머의 작용에 의해 262bp 및 423bp의 밴드가 나타났다(도 2 내지 도 6[1번 라인: 삼면홍회백, 2번 라인: Jam123, 3번 라인: Jam124, 4번 라인: Jam125, 5번 라인: Jam126, 6번 라인: Jam140, 7번 라인: Jam143, 8번 라인: Jam144, 9번 라인: Jam145, 10번 라인: Jam149, 11번 라인: Jam150, 12번 라인: Jam151, 13번 라인: Jam152, 14번 라인: Jam153, 15번 라인: Jam154, 16번 라인: Jam155, 17번 라인: Jam156, 18번 라인: Jam157, 19번 라인: Jam158, 20번 라인: Jam159, 21번 라인: 삼면홍회백, 22번 라인: Jam160, 23번 라인: Jam161, 24번 라인: Jam162, 25번 라인: Jam307, 26번 라인: Jam311, 27번 라인: Jam312, 28번 라인: Jam313, 29번 라인: Jam314, 30번 라인: Jam315, 31번 라인: Jam316, 32번 라인: Jam317, 33번 라인: Jam318, 34번 라인: Jam319, 35번 라인: Jam320, 36번 라인: Jam321, 37번 라인: 고려삼면, 38번 라인: 한삼면, 39번 라인: 선7호, 40번 라인: 산동삼면]).
구체적으로, 삼면홍회백에 반응한 산물은 645bp 및 262bp의 밴드가 나타났고, 삼면홍회백을 제외한 고유종 및 원종에 반응한 산물은 645bp 및 423bp의 밴드가 나타나, 삼면홍회백과 그 외 고유종 및 원종을 쉽게 식별할 수 있었다. 즉, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 삼면홍회백만을 특이적으로 검출할 수 있었다.
종합적으로 본 발명은 삼면홍회백을 특이적으로 검출하여, 다양한 누에종 중 상기 삼면홍회백을 식별할 수 있는 바이오 마커 조성물에 대한 것으로, 본 발명에 따른 삼면홍회백의 ND5 유전자의 SNP 부위를 기반으로 제작한 프라이머 세트를 이용하여 tetra-primer ARMS PCR을 수행하였을 때 삼면홍회백을 정확하게 검출한 바, 이를 이용하여 누에 품종 간 비교 분석을 통한 누에의 분자육종 및 신품종 개발을 위한 기반 구축에 활용할 수 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Bio marker composition for identification of Sammyeonhonghoeback Bombyx mori, and uses thereof <130> 1-180P <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15652 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NADH dehydrogenase subunit 5 gene <400> 1 ttaaaaataa gctaataaaa gcttttgggc tcatacctca aatataaagg aaataccttt 60 tttttaaata aagtgcctga ataaaggatt attctgatag aataaattaa gtagaaatat 120 ctacctttat tatattttat agaattaaac tatatctaat aatatcaaaa attattgtgc 180 attttacact aaaatataat ttaaataatt aaaataaaga atttataatt ctattaaata 240 tatttatatt tttttttatt ttaacaaata ataattcaaa taaaatattt tttttattta 300 ttctattttt tagaacatta atttctattt cttcaaactc atgatttgga tgttgaattg 360 gattagaaat taacttatta agatttatcc ccctaatttc aaactcaaaa aatttattat 420 ctgtagaaac ctcattaaaa tattttctaa cacaatcttt agcatcaatt aattttttat 480 ttataatttt aattaaattt agcttattaa aaaattttaa cataaataat attatttcaa 540 ttataataaa ctcttcatta ttaataaaaa taggatcagc 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aaaaaaaaaa 6480 ataaataaaa ttataaacca taaaataaat ctaaataaat aaattttaaa attatttatt 6540 tgataaatat tataaaatac agaataattc tttaaaatat taaaaatacc cttacctcta 6600 taaatttctc ttcaacctat atcaatattt ttaaataaaa tttgtctaaa atttaaataa 6660 atataactta aaccataagt agataaatta ggtataaatc atattaaaca taaaaaactt 6720 cttaaattat atcttaataa taatttattt aaactataaa ttcccatatt tctaaccata 6780 aaacctaaaa ttgaacctaa aatactaaca taaattacca ttaattttaa attaaaaggt 6840 aaataaatta tataaggata agaaaaaata aatcaactta aaaaactacc acttaataat 6900 cttataaata ataaaacaaa tattctattt aacataatat aatcttcatc atataaatta 6960 taaattatta tcaaattaaa atcattaatt ataacatata taattaaacg aaaagtataa 7020 aaaatagtta aacccgtaga taaataaaat aaaataaaaa ctatcaaatt aaaactatta 7080 aaactaacca tttctaaaat taaatcttta gaataaaatc cagataaaaa aggaatacca 7140 cacaaagata agtttgaaat atttaaacac aaagaagtta aaggaatata taaagataaa 7200 ccccctatat aacgaatatc ttgaatatca tttattatat gaataataac cccagcacat 7260 ataaataata aagctttaaa tatagcatga gttaataaat gaaaaaaagc 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aaaaaataaa 8160 aaaaaaaaag aattaaaaca aattaaatta ttatttttta aaataattta aaatgatatt 8220 ttatcacatc tatgacccca caaatcatta ttttatttaa actatttaaa tatatatata 8280 tatatattga ttgattgttg ttttgttttt gttgttattt tttatttaaa atcaaataga 8340 aataaaatca acctttaaaa ttatcatatt taaaggaaat caatgcaaaa ataataataa 8400 atactcacga gatgaaccaa cataaaatct atataaacct tgaaaatatt taccatgttg 8460 aatataagaa tataaatata aactataacc agcactaaaa aaagaaatta ttattaataa 8520 aattattgaa atatttgatc atcttactaa tctattaatc aaactaattt cacctaataa 8580 atttaaagag gggggagctg ctatgtttga ggataataat aaaaatcatc ataatctcat 8640 agaaggtata aaatttatca ttcccctatt aatatataaa ctacgactat gtaaacgttc 8700 ataattaata ttagctaaac aaaatatacc agaagaacat aaaccatgac taattattaa 8760 aatataagaa ccaataaatc ctcaataatt tataactata ataccaccaa taactattct 8820 tatatgagct acagaagaat aagcaattaa agattttata tcaacctgac aaaaacattt 8880 tattctaata aataaacccc caactaatct aataataatt caaatataat ttaattttaa 8940 atttacttcc tgtaaaaaaa ttataacccg taataagcca taaccaccta attttaatat 9000 aataccagct aaaattattg accctgaaac tggggcttca acatgagctt tgggtaatca 9060 taaatgaaca aaatatatag gtattttaac taaaaaagca aaaattatag aaatatataa 9120 taaatacata ttcatattaa aaaattttaa aaagtaaatt gttattgtat ttaaatcatt 9180 aaaaatataa ataattccta ttaataaagg taaagaacca aataaagtat aaaataataa 9240 atatatacca gcttgaatac gctctggttg ataacctcaa ccaataatca ataataaagt 9300 gggaattaaa ctcgcctcaa aaaaaaaata aaataataat aaatttaaaa ctctaaatgt 9360 caaatataat ataattaaca aaaaaattac attaaataaa aaaaaattaa aataaaaatt 9420 taacttaaat aatctttcac ttgctataat cattaaacta caaattcaaa ttcttaataa 9480 aattaaacca aaagaaataa tatcgcaata aaatatatat cttatattaa aaaaacatat 9540 aatattcaaa tttaaattta taaacaaaaa tattataaaa aataatatta tttgaaccaa 9600 tcaaaatata ttttttataa aacataaagg aattataaaa attattataa ataaaaattt 9660 tatcattata atattctaaa tctttgaaaa taatcattac catgactacg aattattgaa 9720 actaaaattg ataaacctaa agaaccttca caaacagaaa aaactaaaaa aactatcaat 9780 atatatatat cataatcaat aaacattaat aaaaccaaaa aaaaaaaaaa 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aatataaatg ataatatttt 10680 ttaaatcaat tcgaaaaaca cacccaattt ttaaaatcat taacaactca ttaattgact 10740 tacctagccc atctaatatt tcttcttgat gaaatatagg atccctacta gctttatgtc 10800 taataattca aattattact ggattatttt taacaatata ttacacagca aatattgaaa 10860 tagcttttta tagagtaaat tatatttgcc gaaatgtaaa ctatggttga ataattcgaa 10920 cattacatgc taatggagct tcattttttt ttatttgcat ttatttacat atcggacgag 10980 gaatttacta tgaatctttt aacttaaaat atgtatgatt aattggaatt ataattttat 11040 ttatactaat agcaactgct ttcataggtt atgtcttacc ctgaggtcaa atatcttttt 11100 ggggggcaac cgtaattaca aatctattat ctgcaatccc ttatttagga actatattag 11160 taaattgaat ttgaggggga tttgctgtag ataatgctac attaacccga ttttacacat 11220 ttcatttttt attaccgttc attattttaa tattaacaat aatccattta ttatttttac 11280 accaaacagg atctaataac cctttaggat taaatagaaa cttagataaa attccatttc 11340 atccattttt tacttttaaa gatttaattg gatttattat tttaattaaa atattaactt 11400 tattaacctt aattaatcct tatttattag gtgatccaga taatttcaca ccagcaaatc 11460 cattagtaac accagttcat attcaacccg aatgatattt tttatttgct tatgcaattc 11520 ttcgatcaat cccaaataaa ttaggaggag taattgcctt aattatatca attataattt 11580 taattatctt accatttaca ttaaaaaaaa aaattcaagg aattcaattt tatccaatta 11640 atcaaattat tttttgaata ttcttagtaa ttataatttt attaacatga atcggagccc 11700 gacctgtaga aaatccatat attattacag gacaattatt aacaattata tattttttat 11760 attttttttt aaatccaatt atcggaatat actgagataa aattttattt aataaaaaaa 11820 aataattaaa ttaatgagct tgttataagc atttgttttg aaagcttaag aaagaataat 11880 cattctatta attttttatt aatactaaaa atattacaat taaaataaat aaaattttaa 11940 gcctaaaaat aataataaat aatttaatga aataggtaaa tatctttttc aagctaaata 12000 tattaactta tcataacgat aacgaggtaa agtaccacga actcaaataa ataaaaaaga 12060 aattaatctt aattttaaat aaaaaaaaaa tcttaaatta taaccgccca tatttataat 12120 aactaaaatc attcttataa ataaaatact tgaatattca gccaaaaaaa ttaaagcaaa 12180 tccccctctt ctatattcaa tattaaatcc agaaactaac tctctttcac cttcagcaaa 12240 atcaaaagga gttcgatttg tttcagctaa taaagaagaa aaaaaacata aaaataaagg 12300 aattataata aatataaatc 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taataatagg 14820 gtatctaatc ctagttttta ataaaatttt ttaattcata attcaatata aaattttcat 14880 aaattaaaat ttcacttaat aatttaaatt ttaattttat tatataatct attattaatt 14940 aatccctaaa aaaatttaat ttaatttttg tataaccgca actgctggca caaaatttgt 15000 tattaattta aatattacta aatcttaatt acttaaattt ttaattctaa ttactacaaa 15060 taaatattaa ttattattta aataaattaa aaattaacac taaaatttat atgtaaaata 15120 aatttataat aaatttttaa accataaata attttattat ttaatgtaat tttttttaca 15180 tagatttttt tttttttttt ttatattaat ttatttatta attattatta ttattaattt 15240 aaatatttaa tttaatattt ttttattaaa ataaatcaat aaatgattaa ttaataaata 15300 aattaaatat ttaatgatta tttaatattt aaatttaaat attaattgat taattaatat 15360 aaattattaa atttttaata tttctcttat tttttttctt ataatattaa gtttaaatat 15420 aaaatcaata ttcaacctat aatattcatt aaaataaaaa aaaattaata taattaatat 15480 taatttttta ataatttatt atatatatat atatattaat tatataaata atttattata 15540 tataaattta tattaataaa ttaaaaattt aatatatata tatatatata agtattattt 15600 atttaaatta ataacaaaac cattgttaat tttttttcat taaaaaaaaa aa 15652 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH_SNP2-OF <400> 2 cctaaaattg aacctaaaat act 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH_SNP2-OR <400> 3 atttatatct ggtatttctg c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH_SNP2-IF <400> 4 aaacgaaaag tataaaacac 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH_SNP2-IR <400> 5 atttatctac gggtttaaat a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH_SNP2-R <400> 6 atctggattt tattctaaag a 21

Claims (15)

  1. 삼면홍회백의 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 NADH 탈수소효소 서브유닛 5(NADH dehydrogenase subunit 5, ND5) 유전자의 염기서열 중 7,025번째 위치의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 삼면홍회백 검출용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단일염기다형성 마커는, 삼면홍회백의 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 ND5 유전자의 염기서열 중 7,025번째 염기가 T인 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서
    상기 제제는 상기 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화(hybridization)하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
  5. 서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 삼면홍회백 검출용 프라이머 세트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 A; 및
    서열번호 4로 표시되는 염기서열 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 B;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 프라이머 세트 A는,
    삼면홍회백 특이적 SNP 마커를 증폭하기 위한 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 프라이머 세트 B는,
    삼면홍회백 특이적 SNP 마커의 증폭 산물 중 대립유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  9. 제 5항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 테트라 프라이머 ARMS-PCR(tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  10. 제 1항에 따른 검출용 조성물 및 제 5항에 따른 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 삼면홍회백 검출용 키트.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출용 키트.
  12. 누에 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항에 따른 검출용 조성물 및 제 5항에 따른 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용한 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 삼면홍회백 식별 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 증폭 반응은 테트라 프라이머 ARMS-PCR(tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 식별 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 증폭 반응은,
    a) 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 A를 이용하여 삼면홍회백 특이적 SNP 마커를 증폭하는 단계; 및
    b) 서열번호 4로 표시되는 염기서열 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트 B를 이용하여 상기 a) 단계의 증폭 산물 중 대립유전자를 특이적으로 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계;를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 식별 방법.

  15. 제 12항에 있어서,
    상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 식별 방법.
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