KR20220159414A - 조작된 면역 세포 및 이의 용도 - Google Patents

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종후이 얀
잉 시옹
롱롱 푸
지앙타오 렌
샤오홍 흐
얀빈 왕
루 한
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Abstract

조작된 면역 세포는, (i) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, (ii) 외인성 인터루킨, 및 (iii) 외인성 Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1 유전자; 를 발현하고,암, 감염 또는 자가면역 질환 치료에서의 용도를 가질 수 있으며; 기존의 조작된 면역 세포세포와 비교하여, 유의하게 향상된 종양 살상 활성을 갖는다.

Description

조작된 면역 세포 및 이의 용도
본 발명은 면역 치료 분야에 속한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 (i) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, (ii) 외인성 인터루킨, 및 (iii) 외인성 Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1 유전자; 를 발현하는 조작된 면역 세포(Engineered Immune Cell)에 관한 것이다. 보다 바람직하게, 상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 키메라 항원 수용체이다.
종양 면역 요법은 주로 인간 면역계와 종양 미세 환경을 조절하여, 궁극적으로 자가 면역에 의존하여 종양 세포를 제거한다. 면역계는 하나의 통일된 전체이며, 선천면역은 종양면역에서 매우 중요한 역할을 한다.
수지상 세포 및 대식 세포와 같은 일부 항원 제시 세포는 선천면역과 후천면역의 연결 다리이다. 항원 제시 세포는 종양 항원을 인식하여 후천면역계에 제시하고, 종양 특이적 T 세포를 활성화함으로써, 종양을 제거할 수 있다. 따라서, 항원 제시 과정을 강화하여 면역계의 종양 살상 효과를 증가시키는 것은 종양 면역의 중요한 연구 방향이다.
CAR세포 치료는 중요한 종양 세포 면역 요법이다. CAR세포의 성공적인 종양 제어는 일반적으로, 면역계 활성화, CAR세포의 활성화 및 증폭, 활성화된 CAR세포의 종양 조직 침윤 및 종양 세포의 사멸의 과정을 거친다. 현재, CAR세포 요법은 보편적으로 종양 미세환경이 CAR세포에 대해 억제 작용이 있어, CAR세포가 종양 조직에 침윤할 수 없다는 문제가 존재한다. 따라서, 일정 수단으로 CAR 세포에 대한 종양 미세 환경의 억제 작용을 줄여 CAR세포의 생존 시간을 향상시키거나, CAR세포와 상승 작용하는 기타 면역 세포를 동원하는 것은 CAR세포의 치료 효과에 매우 중요하다.
인터루킨IL-7 및 케모카인CCL-19는 내인성의 수지상 세포를 종양 조직으로 동원하여, 종양 반응적 내인성 T세포를 활성화하고 기억 T세포로 분화되도록 하여, 통상적인 TCR-T세포(CN109153989A 참조) 또는 CAR-T세포의 항종양 활성을 촉진시키는 것이 보고된 바 있다(Adachi,K.,Kano,Y.,Nagai,T.et al. IL-7 and CCL19 expression in CAR-T cells improves immune cell infiltration and CAR-T cell survival in the tumor.Nat Biotechnol 36,346-351(2018)).
전통적인 1형 수지상 세포(conventional DC1, cDC1)는 수지상 세포의 서브세트로서, 종양 항원을 제시하는 주요한 면역 세포이다. 연구 결과, cDC1은 종양 관련 항원, 특히 괴사 세포 관련 항원을 효과적으로 제시할 수 있어, 항원 특이적 CD8+T세포 응답을 효과적으로 유도하고, 체내 종양 살상 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 마우스 및 인간 연구에서는 모두 cDC1의 종양 미세 환경에서의 분포가 종양 면역 응답과 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 종양 관련 면역 스코어에 대한 중요한 평가 매개변수이다. cDC1은 마우스 및 인간 체내에서 분포가 적으며, 종양 면역 응답률이 낮은 마우스 및 인간 종양 미세 환경에서는 거의 보이지 않는다. 종양 치료에서의 cDC1 작용을 최적화 하는 것은 종양 면역 치료 효과를 향상시키기 위한 중요한 연구 방향이다.
CCL-19는 수지상 세포 및 내인성 T세포를 종양으로 동원하는 능력이 있으나, cDC1수지상 세포에 대한 동원 능력에는 한계가 있어, cDC1수지상 세포를 효과적으로 분화하거나 동원하여, 종양 항원 제시 효율을 향상시키고, 생체 적응 면역 반응을 유도하며, 종양의 이질성 문제를 해결하여, CAR세포 치료의 효능을 향상시키는 새로운 면역 치료 수단이 필요하다.
제1 양태에 있어서, 본 발명은 (i) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, (ii) 외인성 인터루킨(exogenous interleukin), 및 (iii) 외인성 Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1 유전자, 를 발현하는 신규한 조작된 면역 세포를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 키메라 항원 수용체 또는 T세포 수용체이고, 바람직하게는 키메라 항원 수용체이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 인터루킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, 또는 이들의 서브 유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브 유닛의 조합이고, 바람직하게는 IL-7이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 인터루킨, Flt3L, XCL2 또는 XCL1단백질은 프로테아제 가수분해에 저항할 수 있는 융합 단백질 또는 변이체이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 면역 세포는 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 또는 NKT세포로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 T세포는 CD4+/CD8+T세포, CD4+헬퍼T세포, CD8+T세포, 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포, γδ-T세포 또는 αβ-T세포이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 키메라 항원 수용체이고, 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 여기서, 리간드 결합 도메인은 scFv, Fab, 단일 도메인 항체(Single Domain Antibody), 나노 항체(Nanobody), 항원 결합 리간드, 재조합 피브로넥틴 도메인, 안티칼린(anticalin) 및 DARPIN으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 상기 리간드 결합 도메인은 scFv, Fab, 단일 도메인 항체 및 나노 항체로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는, TSHR, CD19, CD123, CD22, BAFF-R, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, AFP, Folate수용체α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CS1, CD138, NCAM, 클라우딘(Claudin)18.2, Prostase, PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈(survivin)및 텔로머라제(telomerase), PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제(intestinal tract carboxylesterase), mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 타겟과 결합된다. 바람직하게, 상기 타겟은 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD123, CD138, CD171, MUC1, AFP, Folate수용체α, CEA, PSCA, PSMA, Her2, EGFR, IL13Ra2, GD2, NKG2D, EGFRvIII, CS1, BCMA, 메소텔린 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 트랜스멤브레인 도메인은, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로부터 선택되는 단백질의 트랜스멤브레인 도메인이다. 바람직하게, 트랜스멤브레인 도메인은 CD8α, CD4, CD28 및 CD278의 트랜스멤브레인 도메인으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 FcRγ, FcR
Figure pct00001
, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 선택되는 단백질의 신호 전달 도메인이다. 바람직하게, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3ζ를 포함하는 신호 전달 도메인이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 공동자극 도메인은, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM, ZAP70 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 단백질의 공동자극 신호 전달 도메인이다. 바람직하게, 상기 공동자극 도메인은 CD27, CD28, CD134, CD137 또는 CD278의 공동자극 신호 전달 도메인 또는 이들의 조합이다.
일 실시형태에 있어서, 외인성 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1의 발현 또는 활성은 구성적 발현이다. 다른 일 실시형태에 있어서, 외인성 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1의 발현 또는 활성은 조건적 발현이다. 예를 들어, 외인성 유전자를 유도형, 억제형 또는 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 조건적 발현을 구현한다.
일 실시형태에 있어서, 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1은 편재화 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 상기 편재화 도메인은 본 발명의 외인성 유전자를 세포막, 세포질내 특정 세포 기관(예를 들어, 소포체, 골지체, 세포핵 등)과 같은 세포 위치에 편재화되도록 발현시킨다. 편재화 도메인은 핵 편재화 신호, 리더 펩타이드(leader peptide), 트랜스멤브레인 도메인 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 외인성 유전자 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1은 트랜스멤브레인 도메인에 작동 가능하게 연결되어, 조작된 면역 세포의 표면에 앵커링(anchoring)되어 발현된다.
제2 양태에 있어서, 본 발명은 (i) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 서열, (ii) 인터루킨을 코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 바람직하게, 상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 키메라 항원 수용체 또는 T세포 수용체이고, 보다 바람직하게는 키메라 항원 수용체이다. 바람직하게, 상기 인터루킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, 또는 이들의 서브 유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브 유닛의 조합이고, 보다 바람직하게는 IL-7, 이의 서브 유닛 또는 이들의 조합이다. 바람직하게, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
본 발명은 또한 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마 및 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 또한 면역 세포에서 자율 복제되는 기점, 선별 마커, 제한 효소 절단 부위, 프로모터, 폴리아데닐산 꼬리(polyA), 3'UTR, 5'UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오페론, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열(protein purification tag) 및/또는 단백질 정제 태그(protein purification tag)와 같은 요소를 포함할 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 상기 벡터는 생체외 전사 벡터이다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 키트를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터, 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물을 제공한다.
제3 양태에 있어서, 본 발명은 또한 (a) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 제1 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자; (b) 인터루킨을 코딩하는 제2 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 인터루킨; (c) XCL1, XCL2 및/또는 Flt3L을 코딩하는 제3 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 XCL1, XCL2 및/또는 Flt3L단백질; 을 상기 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하는 조작된 면역 세포의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 키메라 항원 수용체 또는 키메라 T세포 수용체이고, 보다 바람직하게 키메라 항원 수용체이다. 바람직하게, 상기 인터루킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, 또는 이들의 서브 유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브 유닛의 조합이고, 보다 바람직하게는 IL-7, 이의 서브 유닛 또는 이의 서브 유닛의 조합이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 조성 (a), (b) 및 (c)를 임의의 순서로 순차적으로 면역 세포에 도입할 수 있다. 다른 일 실시형태에 있어서, 상기 조성 (a), (b) 및 (c)를 동시에 면역 세포에 도입할 수도 있되, 예를 들어, (a), (b) 및 (c)를 하나 또는 다수의 벡터에 클로닝시킨다.
제4 양태에 있어서, 본 발명은 또한 피험자에게 유효량의 본 발명에 따른 면역 세포, 핵산 분자, 벡터 또는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암, 감염 또는 자가면역 질환에 걸린 피험자를 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 암은 고형 종양 또는 혈액 종양이다. 구체적으로, 상기 암은, 뇌 신경교종, 모세포종, 육종, 백혈병, 기저세포암, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암(choriocarcinoma), 결장 및 직장암, 결합조직암(connective tissue cancer), 소화기 계통의 암(cancer of digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암, 교모세포종(GBM), 간암, 간세포종양, 상피내종양, 신장암, 후두암, 간종양, 폐암, 림프종, 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기 계통의 암, 타액샘 암종(salivary gland cancer), 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기 계통의 악성 종양, 외음부암 및 기타 암 및 육종, 및 B세포 림프종, 외투세포 림프종, AIDS관련 림프종, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), B세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 종양, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 림프 증식 질환(malignant lymphoproliferative disorder), MALT 림프종, 털세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성(myelodysplasia), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 전백혈병, 형질세포양 수지상 세포 종양, 및 이식후 림프세포증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD)으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 감염은 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충에 의해 유발되는 감염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일 실시형태에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 셀리악병, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 애디슨병, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염(hashimoto thyroiditis), 중증 근무력증, 혈관염, 악성빈혈 및 전신홍반루푸스 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조작된 면역 세포는 다음과 같은 장점이 있다. 공동 발현된 인터루킨 및 Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1은 종양 세포 부위에서 DC세포의 분화 또는 동원을 효과적으로 촉진시킬 수 있고, DC세포의 수를 증가시키며, 조작된 면역 세포의 증식 및 생존 시간을 증가시켜, 한편으로 조작된 면역 세포에 대한 종양 미세 환경의 억제 작용을 감소시키고, 조작된 면역 세포의 종양 살상 능력을 향상시키며, 다른 한편으로는 증가된 DC세포는 생체의 자가 T세포의 적응 면역 인식을 활성화 하고, 조작된 면역 세포와 상승 효과를 형성하여, 궁극적으로 종양에 대한 억제를 증가시킨다.
도 1은 재조합 레트로바이러스 벡터 mCD19-CAR-Flt3L의 구조 모식도이다.
도 2는 재조합 레트로바이러스 벡터 mCD19-CAR-XCL1의 구조 모식도이다.
도 3은 Panc02-mCD19세포의 CD19 발현율을 나타낸다.
도 4는 유세포 분석에 의해 측정된 CAR-T세포의 CAR 발현 정도를 나타낸다.
도 5는 ELISA로 측정된 CAR-T세포의 XCL1 발현 정도를 나타낸다.
도 6은 ELISA로 측정된 CAR-T세포의 IL-7 발현 정도를 나타낸다.
도 7은 ELISA로 측정된 CAR-T세포의 CCL19 발현 정도를 나타낸다.
도 8은 ELISA로 측정된 CAR-T세포의 Flt3L 발현 정도를 나타낸다.
도 9는 CAR-T세포를 타겟 세포 및 비타겟 세포와 각각 공동으로 배양한 후의 IFN-γ 방출 정도를 나타낸다.
도 10은 CAR-T세포로 마우스 췌장암을 치료한 후, 마우스의 체중 변화 그래프이다.
도 11은 CAR-T세포로 마우스 췌장암을 치료한 후, 마우스의 종양 성장 그래프이다.
도 12는 CAR-T세포로 마우스 췌장암을 치료한 후, 마우스의 생존 그래프이다.
달리 명시되지 않는 한, 본문에 사용되는 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자"는 세포 표면에서 발현되고 타겟 분자(예를 들어, 리간드)와 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 이러한 표면 분자는 일반적으로 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 결합 도메인, 표면 분자를 세포 표면에 앵커링하는 트랜스멤브레인 도메인, 및 신호 전달을 책임지는 세포 내 도메인을 포함한다. 흔히 볼 수 있는 이러한 표면 분자의 예시로, 예를 들어, T세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "T세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원 제시에 응답하여 T세포 활성화에 관여하는 막단백질 복합체를 지칭한다. TCR의 자극은 항원 제시 세포에서의 주조직 적합성 복합체 분자(MHC)에 의해 유발되는데, 상기 항원 제시 세포는 항원 펩타이드를 T세포에 제시하고 TCR복합체에 결합되어 일련의 세포 내 신호 전달을 유발한다. TCR은 헤테로다이머를 형성하는 6개의 펩타이드 사슬로 구성되고, 일반적으로 αβ형 및 γδ형으로 분류된다. 각각의 펩타이드 사슬은 불변 영역 및 가변 영역을 포함하고, 여기서, 가변 영역은 특이성의 특정 항원 및 MHC 분자와의 결합을 책임진다. TCR의 가변 영역은 리간드 결합 도메인을 포함하거나 리간드 결합 도메인에 작동 가능(operably)하게 연결될 수 있으며, 여기서 리간드 결합 도메인의 정의는 아래에서 기재한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"는 인공적으로 구축된 하이브리드 폴리펩타이드를 지칭하고, 상기 하이브리드 폴리펩타이드는 일반적으로 하나 또는 다수의 리간드 결합 도메인(예를 들어, 항체의 항원 결합 부분), 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, 각각의 도메인은 링커에 의해 연결된다. CAR는 단일클론 항체의 항원 결합 특성을 이용하여 T 세포 및 기타 면역 세포의 특이성과 반응성을 비 MHC 제한적 방식(non-MHC-restricted manner)으로 선택한 타겟으로 재지향할 수 있다. 비 MHC 제한적 항원 인식은 CAR세포가 항원 처리와 무관하게 항원을 인식할 수 있는 능력을 제공하여, 종양 회피의 주요 메커니즘을 우회하였다. 이 외에, T세포 내에서 발현될 때, CAR은 유리하게 내인성 T세포 수용체(TCR)의 α사슬과 β사슬과 이량체화되지 않는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "리간드 결합 도메인"은 리간드(예를 들어, 항원)에 결합할 수 있는 임의의 구조 또는 기능적 변이체를 지칭한다. 리간드 결합 도메인은 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 및 이들의 기능적 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 구조일 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합 도메인은 Fab, Fab', Fv단편, F(ab')2, 단일 사슬 항체(Single Chain Antibody Fragment, scFv), 단일 도메인 항체(Single Domain Antibody, sdAb), 나노 항체(Nanobody, Nb), 항원 결합 리간드, 재조합 피브로넥틴 도메인, 안티칼린 및 DARPIN 등을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 바람직하게는 Fab, scFv, sdAb 및 나노 항체로부터 선택된다. 본 발명에서, 리간드 결합 도메인은 1가(monovalent) 또는 2가(bivalent)일 수 있고, 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항체일 수 있다. 다른 일 실시형태에 있어서, 리간드 결합 도메인은 특정 단백질의 특이적 결합 폴리펩타이드 또는 수용체 구조일 수도 있으며, 상기 특정 단백질은 예를 들어 PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL 및 NKG2D이다.
"Fab"는 면역글로불린 분자가 파파인에 의해 용해된 후 생성된 2개의 동일한 단편 중 임의의 하나로서, 이황화 결합에 의해 연결된 완전한 경쇄 및 중쇄 N말단 부분으로 이루어진 것을 의미하며, 여기서 중쇄 N말단 부분은 중쇄 가변 영역과 CH1을 포함한다. 완전한 IgG와 비교할 때, Fab는 Fc단편이 없고, 이동성과 조직 침투성이 높으며, 항체 효과의 매개가 필요없이 항원에 1가(monovalent) 결합된다.
"단일 사슬 항체" 또는 "scFv"는 항체 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 링커에 의해 연결된 항체이다. 링커의 최적 길이 및/또는 아미노산의 조성에 대해 선택할 수 있다. 링커의 길이는 scFv의 가변 영역 폴딩 및 상호작용 상황에 현저한 영향을 미친다. 사실상, 더 짧은 링커를 사용하는 경우(예를 들어, 5-10개의 아미노산 사이), 사슬 내 폴딩(intrachain folding)을 방지할 수 있다. 링커의 크기 및 조성의 선택에 대하여, 예를 들어, Hollinger et al., 1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448; 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794; 및 PCT공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715 을 참조할 수 있고, 그 전체 내용은 참조로서 본 발명에 포함된다. scFv는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH와 같은 임의의 순서로 연결된 VH 및 VL을 포함할 수 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 하나의 중쇄 가변 영역(VHH)과 2개의 통상적인 CH2 및 CH3 영역만을 포함하는 경쇄가 천연적으로 결실된 항체를 지칭하며, "중쇄 항체"라고도 한다.
"나노 항체" 또는 "Nb"는 개별적으로 클로닝되고 발현되는 VHH 구조를 지칭하고, 원래의 중쇄 항체와 동등한 구조 안정성과 항원에 대한 결합 활성을 가지며, 현재 공지된 표적 항원에 결합 가능한 가장 작은 단위이다.
용어 "기능적 변이체" 또는 "기능적 단편"은 실질적으로 모체 아미노산 서열을 포함하지만 모체 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형(즉, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는 변이체를 지칭하며, 상기 변이체는 모체 아미노산 서열의 생물학적 활성을 유지하는 것을 조건으로 한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 아미노산 변형은 바람직하게는 보존적 변형(conservative modification)이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 변형(conservative modification)"은 상기 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특성에 유의한 영향을 미치지 않거나 변화되지 않게 하는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보전적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 위치-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 본 분야에 공지된 표준 기술로 본 발명의 키메라 항원 수용체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 본 분야에 정의되어 있고, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 사티닌, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 보존적 변형(conservative modification)은 예를 들어, 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 관련된 잔기의 양친매성의 유사성에 기반하여 선택할 수 있다.
따라서, "기능적 변이체" 또는 "기능적 단편"은 모체 아미노산 서열과 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 모체 아미노산의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 활성)을 유지한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 2개의(뉴클레오티드 또는 아미노산) 서열이 정렬에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 정도를 나타내고, 일반적으로 백분율로 나타낸다. 바람직하게, 동일성은 비교되는 서열의 전체 길이에 의해 결정된다. 따라서, 완전히 동일한 서열을 갖는 2개의 코피(copy)는 100%의 동일성을 갖는다. 당업자는 Blast(Altschul 등 (1997)Nucleic Acids Res.25: 3389-3402), Blast2(Altschul 등(1990)J.Mol.Biol.215: 403-410), Smith-Waterman(Smith 등(1981)J.Mol.Biol.147: 195-197) 및 ClustalW 등과 같은 일부 알고리즘을 표준 매개변수를 사용하여 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있음을 인식하였다.
리간드 결합 도메인의 선택은 구체적인 질병 상태와 관련된 인식될 타겟 세포 상의 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원과 같은 세포 표면 마커에 따라 결정된다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 리간드 결합 도메인은, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, Folate수용체α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp1OO, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체 β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제(telomerase), PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제(intestinal tract carboxylesterase), mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 타겟에 결합된다. 바람직하게, 상기 타겟은 CD19, CD20, CD22, BAFF-R, CD33, EGFRvIII, BCMA, GPRC5D, PSMA, ROR1, FAP, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CAIX, WT1, NY-ESO-1, CD79a, CD79b, GPC3, 클라우딘(Claudin)18.2, NKG2D및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 타겟팅될 항원에 따라, 본 발명의 CAR은 항원에 대한 특이적인 리간드 결합 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CD19가 타겟팅될 항원인 경우, CD19항체는 본 발명의 리간드 결합 도메인으로 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명 CAR은 CD19 scFv를 포함하고, 서열번호2의 제1-107번 또는 서열번호 14의 제1-107번으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 2의 제123-242번 또는 서열번호 14의 제123-238번으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스멤브레인 도메인"은 면역 세포(예를 들어, 림프구, NK세포 또는 NKT세포) 표면에서 키메라 항원 수용체의 발현을 가능하게 하고, 타겟 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 가이드하는 폴리펩타이드 구조를 지칭한다. 트랜스멤브레인 도메인은 천연 또는 합성일 수 있고, 임의의 막 결합 단백질 또는 막 관통 단백질로부터 유래될 수도 있다. 키메라 항원 수용체가 타겟 항원에 결합될 때, 트랜스멤브레인 도메인은 신호를 전달할 수 있다. 본 발명에 특히 적용되는 트랜스멤브레인 도메인은, 예를 들어, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 및 이들의 기능적 단편으로부터 유래된 것일 수 있다. 또는, 트랜스멤브레인 도메인은 합성된 것일 수 있고 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 함유할 수 있다. 바람직하게, 상기 트랜스멤브레인 도메인은 CD8α사슬로부터 유래되고, 이는 서열번호4 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 80％, 보다 바람직하게는 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, 상기 CD8α트랜스멤브레인 도메인의 코딩 서열은 서열번호3 또는 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 80％, 보다 바람직하게는 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 리간드 결합 도메인과 트랜스멤브레인 도메인 사이에 위치하는 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 일반적으로 트랜스멤브레인 도메인 내지 리간드 결합 도메인을 연결하는 역할을 하는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 구체적으로, 힌지 영역은 리간드 결합 도메인에 더 큰 유연성(flexibility)과 접근성(accessibility)을 제공하기 위해 사용된다. 힌지 영역은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10개 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25개 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 전체 또는 일부분이 천연분자로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 전체 또는 일부분이 CD8, CD4 또는 CD28의 세포 외 영역으로부터 유래되거나, 또는 전체 또는 일부분이 항체 불변 영역으로부터 유래된다. 또는, 힌지 영역은 천연적으로 존재하는 힌지 서열에 대응되는 합성 서열일 수 있거나, 완전 합성된 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 CD8α사슬, FcγRIIIα수용체, IgG4 또는 IgG1의 힌지 영역 부분을 포함하고, 보다 바람직하게, CD8α힌지 사슬을 포하하며, 이는 서열번호 12 또는 22로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, CD8α힌지사슬의 코딩 서열은 서열번호11 또는 21으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 내 신호 전달 도메인" 은 이펙터 기능 신호(effector function signal)를 전달하여 세포가 지정된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 지칭한다. 세포 내 신호 전달 도메인은 리간드 결합 도메인에 항원이 결합된 후의 세포 내 1차 신호를 전달하여, 면역 세포와 면역 반응을 활성화시키는 것을 책임지고 있다. 다시 말해서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CAR를 발현하는 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나를 활성화 시키는 것을 책임지고 있다. 예를 들어, T세포의 이펙터 기능은 세포 용해 활성 또는 보조 활성일 수 있고, 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체에 포함된 세포 내 신호 전달 도메인은, 항원 수용체 결합 후 함께 작용하여 1차 신호 전달을 일으키는 T세포 수용체 및 보조 수용체(co-receptor)의 세포질 서열, 및 이러한 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일하거나 유사한 기능을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다. 세포 내 신호 전달 도메인은 많은 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs, ITAM) 를 포함할 수 있다. 본 발명의 세포 내 신호 전달 도메인의 비제한적인 예시로, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d와 같은 것들로부터 유래되는 것들을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명 CAR의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함할 수 있고, 상기 신호 전달 도메인은 서열번호8 또는 20으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, 이의 코딩 서열은 서열번호7 또는 19로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 하나 또는 다수의 공동자극 도메인을 포함한다. 공동자극 도메인은 공동자극 분자로부터 유래된 세포 내 기능성 신호 전달 도메인일 수 있고, 상기 공동자극 분자의 전체 세포 내 부분 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다. "공동자극 분자"는 T세포에서 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T세포의 공동 자극 반응(예를 들어, 증식)을 매개하는 동족 결합파트너(homologous binding partner)를 지칭한다. 공동자극 분자는 I클래스(Class) MHC분자, BTLA 및 Toll리간드 수용체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 공동자극 도메인의 비제한적인 예시로, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM 및 ZAP70으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 공동자극 신호 전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명 CAR의 공동자극 도메인은 4-1BB, CD28, CD27, OX40 또는 이들의 조합으로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 CAR에 포함된 공동자극 도메인은 서열번호6 또는 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, 상기 공동자극 도메인의 코딩 서열은 서열번호5 또는 17로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 CAR는 T세포와 같은 세포에서 발현될 때, 초기 단백질이 소포체로 가이드된 후 세포 표면으로 가이드되도록 하는 시그널 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 시그널 펩타이드의 코어는 단일 α-나선을 형성하는 경향이 있는 긴 소수성 아미노산 세그먼트를 포함할 수 있다. 시그널 펩타이드의 말단에는 통상적으로 시그널 펩티다아제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 세그먼트가 있다. 시그널 펩티다아제는 전위(transposition)되는 동안 또는 완료 후 절단되어, 유리된 시그널 펩타이드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 이 후, 유리된 시그널 펩타이드는 특정 프로테아제에 의해 소화된다. 본 발명에 사용 가능한 시그널 펩타이드는 CD8α, IgG1, GM-CSFRα 으로부터 유래된 것과 같은 당엄자에게 잘 공지된 시그널 펩타이드이다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용 가능한 시그널 펩타이드는 서열번호10 또는 34로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, 상기 시그널 펩타이드의 코딩 서열은 서열번호9 또는 33으로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 CAR은 또한 CAR의 발현 시간을 조절하기 위한 스위치 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스위치 구조는 대응되는 리간드와의 결합을 통해 구조적 변화를 일으켜, 타켓팅된 항원에 결합하도록 세포 외 결합 도메인을 노출시킴으로써 신호 전달 경로를 활성화시키는 이량체화 도메인의 형태일 수 있다. 또는, 스위치 도메인을 사용하여 결합 도메인과 신호 전달 도메인에 각각 연결되되, 스위치 도메인이 서로 결합하는 경우(예를 들어, 유도 화합물의 존재 하)에만, 결합 도메인 및 신호 전달 도메인이 함께 이량체화되어, 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 스위치 구조는 또한 마스킹 펩타이드(masking peptide)의 형태일 수 있다. 마스킹 펩타이드는 세포 외 결합 도메인을 마스킹하여, 타겟 항원이 결합되는 것을 방지할 수 있으며, 예를 들어, 마스킹 펩타이드가 프로테아제에 의해 절단되어 세포 외 결합 도메인이 노출되면, 하나의 "통상"적인 CAR구조가 될 수 있다. 당업자에게 공지된 다양한 스위치 구조는 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 CAR은 또한 자살 유전자를 포함할 수 있으며, 즉, 외부 물질에 의해 유도될 수 있는 세포 사멸 신호를 발현하도록 하여, 필요할 때(예를 들어, 심각한 독성 부작용이 발생할 때), CAR 세포를 제거할 수 있다. 예를 들어, 자살 유전자는 CD20 에피토프, RQR8 등과 같은 삽입 에피토프(inserted epitope)의 형태일 수 있으며, 필요한 경우, 이러한 에피토프를 타겟팅하는 항체 또는 시약을 추가하여 CAR 세포를 제거할 수 있다. 자살 유전자는 단순 포진 바이러스 티미딘키나아제(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)일 수도 있고, 상기 유전자는 간시클로버(ganciclovir) 치료 유도에 의해 세포가 사멸되게 할 수 있다. 자살 유전자는 iCaspase-9일 수도 있고, AP1903, AP20187 등과 같은 화학적 유도 약물에 의해 iCaspase-9의 이량체화를 유도할 수 있어, 다운스트림의 Caspase3분자를 활성화하여 세포 사멸을 유도한다. 당업자에게 공지된 다양한 자살 유전자는 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는, (a) 4-1BB공동자극 도메인 및 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인, (b) CD27공동자극 도메인 및 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인, (c) CD28공동자극 도메인 및 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인, (d) OX40공동자극 도메인 및 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인, (e) CD28공동자극 도메인, 4-1BB공동자극 도메인 및 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인, (f) OX40공동자극 도메인, 4-1BB공동자극 도메인 및 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인, 또는 (g) CD28공동자극 도메인, OX40공동자극 도메인 및 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다.
인터루킨
인터루킨은 백혈구에 의해 생성되고, 백혈구 사이에서 기능을 발휘하는 사이토카인의 일종으로서, 신호 전달, 면역 세포 활성화 및 조절, T, B세포 활성화, 증식 및 분화 매개, 및 염증 반응에서 중요한 역할을 한다. 일반적으로, 인터루킨의 생물학 효과는 상응하는 수용체와의 결합을 통해 구현되며, 예를 들어, IL-7의 생물학적 특정은 IL-7과 이의 수용체IL-7R의 결합에 의해 구현된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용될 수 있는 인터루킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, 또는 이들의 서브 유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브 유닛의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. IL-2는 주로 T세포에 의해 생성되고, 자가분비 및 측분비 방식으로 작용한다. IL-2는 T세포 성장을 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 사이토카인의 생성을 촉진하고, CD8+T세포와 CD4+T세포가 세포 독성 작용을 발휘하도록 유도할 수 있다. 이 외에, IL-2는 또한 NK세포 증식을 자극할 수 있고, NK 살상 활성을 강화하며, NK세포에 의한 IFNγ, TNFβ, TGFβ 등 인자의 생성을 촉진하며, 대식 세포를 활성화하여, 대식 세포의 항원 제시 능력 및 타겟 세포 살상 능력을 증가시킨다. IL-7은 주로 골수와 흉선 기질 세포에서 생성되고, 주요 기능은, 전구 B세포 성장을 촉진하고; 말초 T 세포의 세포 사멸을 억제하여, 세포 증식 및 지속적인 생존을 유도하며; 수지상 세포, 대식 세포의 발달 및 기능에 영향을 미쳐 대식 세포가 다양한 사이토카인을 분비하도록 유도한다. IL-12는 주로 T세포 및 NK세포에 작용한다. 구체적으로, IL-12는 활성화형의 T세포 증식을 자극할 수 있고, Th0세포에서 Th1세포로의 분화를 촉진하며; CTL 및 NK세포의 세포 독성 활성을 유도하고, IFNγ, TNFα, GMCSF 등 사이토카인의 분비를 촉진하며; NK세포와 IL-2Rα, TNF수용체 및 CD56의 발현을 촉진하고, 종양 세포에 대한 ADCC 효과를 증가시킨다. IL-15는 활성화된 대식 세포, 표피 세포 및 섬유아 세포 등 다양한 세포에 의해 생성될 수 있다. IL-15의 분자 구조는 IL-2와 유사하고, IL-2R의 β사슬 및 γ사슬을 이용하여 타겟 세포와 결합할 수 있고, IL-2와 유사한 생물학적 활성을 발휘할 수 있으며, 예를 들어, T세포 및 NK세포의 증식을 자극하고, B세포의 증식 및 분화 등을 유도한다. IL-21은 활성화된 CD4+T세포, NKT세포, Tfh세포 및 Th17세포에 의해 생성되고, IL-2, IL-15 모두와 높은 상동성(homology)을 갖는다. IL-21은 광범위한 면역 조절 기능을 가지고 있으며, 이를 활성화하면 활성화형 CD8+T세포의 증식을 증가시키고, NK세포의 세포 독성 활성을 증가시키며, B세포의 증식과 분화를 촉진할 수 있다. IL-17은 Th17세포에서 분비되는 전염증성 분자(proinflammatory molecule)로서, 조절 T 세포를 억제하고 호중구와 대식세포를 동원 및 활성화시킬 수 있다. IL-18도 전염증성 분자이고, T세포 및 NK세포에서 분비되며, 활성화된 대식 세포도 다량의 IL-18을 분비한다. IL-18은 선천 면역과 적응 면역(adoptive immunity)에서 중요한 역할을 한다고 보도된 바 있다. IL-23도 T세포 및 NK세포에서 분비되며, IL-23은 Th17세포 분화를 촉진할 수 있다. 수지상 세포, 단핵구, 대식 세포는 또한 낮은 수준의 IL-23수용체를 발현한되, IL-23에 의해 활성화될 수 있다. 연구에 따르면, 이러한 인터루킨은 단독으로 또는 조합하여 효과적인 항종양 작용을 나타낼 수 있는 것으로 나타났다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용된 인터루킨은 서열번호 23, 27, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, 이의 코딩 서열은 서열번호 24, 28, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 또는 60으로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
Flt3L 유전자
타이로신 키나아제 수용체 3리간드(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand, Flt3L)는 Fms유사 타이로신 키나아제 수용체 3(Fms-like tyrosine kinase 3 receptor, Flt3R)에 특이적으로 결합되어, DC세포, 자연 살해 세포, 세포 독성 T림프구 등의 증식, 분화 및 성숙을 촉진시킬 수 있는 사이토카인이다. Flt3L은 뮤린의 임의의 조직 및 기관에 널리 존재한다. Flt3L은 인간 말초혈액 단핵구에서 가장 높게 발현되고, 다음으로 심장, 태반, 폐, 비장, 흉선, 난소, 소장, 간, 신장 및 췌장이며, 뇌 조직에서 발현이 제일 낮다.
연구에 따르면, Flt3L은 IL-6, IL-7, IL-13 등과 같은 사이토카인과 T세포 증식을 촉진시킬 수 있는 것으로 나타났다. 이 외에, Flt3L은 B세포의 초기 분화, NK세포, DC 등 혈액성 전구 세포의 분화에 중요한 역할을 한다. 특히, 미성숙된 DC만이 수용체 Flt3R을 발현할 수 있으므로, Flt3L은 DC 전구 세포를 선택적으로 증폭시키고, DC의 분화를 촉진할 수 있다. 연구에 따르면, 마우스에 Flt3L을 피하 주사하면 림프 및 비림프 조직에서 DC의 수를 현저하게 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. Flt3L을 지닌 재조합 아데노바이러스 벡터 및 화학요법 약물 5-플루오로우라실을 간암 또는 직장암의 마우스 모델에 병용하면 현저한 항종양 효과를 얻은 것으로 보도되었다. 구체적으로, Flt3L은 골수 면역 세포의 증식 및 분화를 자극하여, 화학 요법 약물로 인한 골수 손상을 효과적으로 보호하는 반면, 종양 국부에서 증식된 DC는 5-플루오로우라실 및 NK세포에 의해 살상된 종양 세포의 파편(fragments)을 효과적으로 제시하여, 특이적 항종양 면역 반응을 일으킨다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용된 Flt3L은 서열번호 36 또는 38로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, Flt3L의 코딩 서열은 서열번호 35 또는 37로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
XCL1 및 XCL2 유전자
C형 케모카인 패밀리(C-type chemokine family)는 림포탁틴으로도 불리우고, XCL1 및 XCL2 2개의 구성원을 포함하며, 주로 CD8+T세포 및 자연 살해 세포에 의해 생성된다. XCL1은 특유의 서열 특징과 두 가지의 상호 전환 가능한 단백질 공간 배좌(protein space conformations)을 가지고 있어, XCL1은 다른 케모카인과 다르며 특유의 기능을 발휘한다. XCL1 특이적 수용체 XCR1은 G단백질 결합 수용체 패밀리의 구성원으로서, 이 둘의 상호작용은 흉선의 음성 선택과 자가면역 내성 확립에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 교차 항원 제시를 개시하고 세포독성 면역 반응을 매개할 수 있다. XCL1은 면역계의 균형을 조절하고 장내 면역 항상성을 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 자가면역질환, 신장염, 결핵 및 인간 면역결핍바이러스 감염 등과 같은 다양한 질병과 관련이 있다. XCL2는 XCL1의 핵산 서열과 97％의 동일성을 갖고, 여기서 제7번 및 제 8번 2개의 아미노산 잔기가 상이하되, XCL1에서는 Asp 및 Lys이나, XCL2에서는 His 및 Arg이다. 연구에 따르면, XCL2는 XCL1과 발현프로파일, 구조 및 기능에서 매우 유사하고, 예를 들어, XCL1과 마찬가지로, XCL2도 두 개의 상호 전환 가능한 단백질 공간 배좌인 단량체형과 이량체형을 가지고 있으며, 여기서, 단량체형 배좌는 XCR1에 결합되어 활성화시키고, 이량체 배좌는 글리코사미노글리칸류(Glycosaminoglycan, GAG)의 헤어핀 구조에 대해 더 높은 친화력을 갖는 것으로 밝혀졌다. XCL1 및 XCL2의 수용체 XCR1은 선택적으로 항원 제시 능력이 있는 DC(cDC1) 세포에서 발현되며, 일부 연구에서는 XCL1의 도입이 항종양 면역치료 및 타겟 백신의 효능을 효과적으로 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용된 XCL1은 서열번호 26 또는 30으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, XCL1의 코딩 서열은 서열번호 25 또는 29로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용된 XCL2는 서열번호 68로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖거나, XCL2의 코딩 서열은 서열번호 67로 표시되는 핵산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 95％, 97％ 또는 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는다.
외인성 유전자의 발현
본 발명에서의 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1과 같은 외인성 유전자의 발현은 구성적 발현(constitutive expression) 또는 조건적 발현(conditional expression)일 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 외인성 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1의 발현은 조건적 발현이다. 예를 들어, 수요에 따라, 본 발명의 외인성 유전자는 유도형, 억제형 또는 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어, 특정 시간 또는 특정 조직 또는 세포 유형에서 도입된 외인성 유전자의 발현 수준을 조절할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 프로모터는 유도형 프로모터이고, 즉, 특정 환경 조건, 발달 조건, 또는 유도물질의 존재 하에서만 전사를 개시하는 프로모터이다. 이러한 환경 조건은 예를 들어 종양 산성 미세 환경, 종양 저산소 미세 환경 등을 포함한다. 이러한 유도물질은 예를 들어 독시사이클린(doxycycline), 테트라사이클린(tetracycline) 또는 이의 유사체를 포함하고, 테트라사이클린의 유사체는 예를 들어 클로르테트라사이클린(chlortetracycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 디메틸클로르테트라사이클린(Demethyl chlortetracycline), 메타사이크린(methacycline), 독시사이클린(Doxycycline) 및 미노사이클린(minocycline)을 포함한다. 유도형 프로모터는 예를 들어 Lac오페론 서열, 테트라사이클린 오페론 서열, 갈락토스 오페론 서열 또는 독시사이클린 오페론 서열 등을 포함한다. 다른 일 실시형태에 있어서, 프로모터는 억제형 프로모터이고, 즉, 억제형 프로모터에 특이적인 억제물질이 존재하는 경우, 세포에서 외인성 유전자의 발현이 억제되거나 발현되지 않는다. 억제형 프로모터는 예를 들어 Lac억제형 요소 또는 테트라사이클린 억제형 요소를 포함한다. 본 분야 통상의 기술자들에게 공지된 유도형/억제형 발현 시스템은 모두 본 발명에 사용 가능하며, Tet-on시스템, Tet-off시스템, Cre/loxP시스템 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1은 편재화 도메인(localization domain)에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 상기 편재화 도메인은 본 발명의 외인성 유전자를 세포막, 세포질내 특정 세포 기관(예를 들어, 소포체, 골지체, 세포핵 등)과 같은 세포 위치에 편재화되도록 발현시킨다. 편재화 도메인은 핵 편재화 신호, 리더 펩타이드, 트랜스멤브레인 도메인 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 외인성 유전자 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1은 트랜스멤브레인 도메인에 작동 가능하게 연결되어, 조작된 면역 세포의 표면에 앵커링되어 발현된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명에서의 인터루킨, Flt3L, XCL2 또는 XCL1단백질과 같은 외인성 유전자는 야생형 또는 특정 성능(예를 들어, 프로테아제 가수분해에 대한 저항)을 갖는 융합 단백질 또는 변이체일 수 있다.
핵산
본 발명은 또한 (i) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 서열, (ii) 인터루킨을 코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 T세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체이고, 바람직하게는 키메라 항원 수용체이다. 키메라 항원 수용체는 상기에서 정의한 바와 같다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자" 는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 서열을 포함(예를 들어, 변형되거나 변형되지 않은 RNA 또는 DNA)하고, 각각 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 형태인 선형 또는 환형, 또는 이들의 혼합물(하이브리드 분자 포함)이다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산은 DNA(예를 들어, dsDNA, ssDNA, cDNA), RNA(예를 들어, dsRNA, ssRNA, mRNA, ivtRNA), 이들의 조합 또는 유도체(예를 들어, PNA)를 포함한다. 바람직하게, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이고, 보다 바람직하게는 mRNA이다.
핵산은 통상적(conventional)인 포스포디에스터 결합 또는 비통상적(nonconventional)인 결합(예를 들어, 펩타이드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산은 또한 예를 들어 트리틸화 염기 및 흔하지 않은 염기(예: 이노신(inosine))과 같은 하나 이상의 변형된 염기를 함유할 수 있다. 본 발명의 다중쇄 CAR이 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 한, 화학적, 효소적 또는 대사적 변형을 비롯한 다른 변형이 또한 고려될 수 있다. 핵산은 분리된 형태로 제공될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산은 또한 전사 제어 요소(프로모터, 인핸서, 오페론, 리프레서 및 전사 종결 신호 포함), 리보솜 결합 부위, 인트론 등과 같은 조절 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 원하는 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 최적의 발현을 위해, 또는 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 표적 서열에 존재하는 주어진 종(given species)에서 고도로 발현되는 유전자 중의 일반적으로 드문 코돈을 이러한 종에서 고도로 발현된 유전자 중의 일반적으로 흔한 코돈으로 대체하되, 대체 전후의 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하는 것을 의미한다. 따라서, 최적 코돈의 선택은 숙주 게놈의 코돈 사용 선호도에 따라 결정된다.
벡터
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 여기서, 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 서열, IL-7을 코딩하는 핵산 서열, XCL1을 코딩하는 핵산, XCL2를 코딩하는 핵산 및/또는 Flt3L을 코딩하는 핵산 서열은 하나 또는 다수의 벡터에 위치할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 (외인성)유전 물질을 숙주 세포로 전달하기 위한 매개체로 사용되는 핵산 분자이며, 상기 숙주 세포에서 상기 핵산 분자는 예를 들어 복제 및/또는 발현될 수 있다.
벡터는 일반적으로 타겟 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. "타겟 벡터"는 예를 들어 상동 재조합을 통해, 또는 특이적 타겟 부위의 서열의 하이브리드 리콤비나아제(hybrid recombinases)를 사용하여, 분리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 매질이다. "발현 벡터" 는 적합한 숙주 세포에서 이종 핵산 서열(예를 들어, 본 발명의 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 서열)의 전사 및 이들의 mRNA 번역에 사용되는 벡터이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터는 본 분야에 공지되어 있으며, 대부분 상업적으로 구입할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 플라스미드, 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 등), 파지, 파스미드, 코스미드 및 인공 염색체(BAC 및 YAC를 포함)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 벡터 자체는 일반적으로 뉴클레오티드 서열이고, 일반적으로 삽입체(전이 유전자(transgene))의 DNA 서열 및 벡터의 “백본”인 더 큰 서열을 포함한다. 조작된 벡터는 또한 일반적으로 숙주 세포에서 자율 복제되는 기점(폴리뉴클레오티드의 안정적인 발현이 필요한 경우), 선별 마커(selectable marker) 및 제한 효소 절단 부위(예를 들어, 다중 클로닝 부위, MCS)를 포함한다. 벡터는 프로모터, 폴리아데닐산 꼬리(polyA), 3'UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오페론, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열(targeting sequence) 및/또는 단백질 정제 태그(protein purification tag)와 같은 요소를 포함할 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 상기 벡터는 생체외 전사 벡터이다.
조작된 면역 세포 및 이의 제조 방법
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 다시 말해서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, 외인성 IL-7 유전자, 및 XCL1, XCL2 및/또는 Flt3L 유전자를 발현한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포" 는 하나 또는 다수의 이펙터 기능(예를 들어, 세포 독성 세포 살상 활성(cytotoxic cell killing activity), 사이토카인의 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역 세포는 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 및/또는 NKT세포, 또는 제대혈과 같은 줄기 세포 공급원으로부터 수득된 면역 세포일 수 있다. 바람직하게, 면역 세포는 T세포이다. T세포는 체외 배양된 T세포와 같은 임의의 T세포일 수 있고, 예를 들어, 1차 T세포, 또는 Jurkat, SupTl 등과 같은 체외 배양된 T세포주에서 유래된 T세포, 또는 피험자로부터 수득된 T세포일 수 있다. 피험자의 예시로 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 형질전환 종(transgenic species)을 포함한다. T세포는 말초 혈액 단핵구, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T세포는 농축되거나 정제될 수도 있다. T세포는 임의의 발달 단계에 있을 수 있고, CD4+/CD8+T세포, CD4+헬퍼 T 세포(예를 들어, Thl 및 Th2세포), CD8+T세포(예를 들어, 세포 독성 T세포), 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포, γδ-T세포, αβ-T세포 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 면역 세포는 인간 T세포이다. T 세포는 피콜(Ficoll) 분리와 같은 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 피험자의 혈액으로부터 수득될 수 있다. 본 발명에서, 면역 세포는 조작되어 키메라 항원 수용체 및 외인성 IL-7 유전자, 및 XCL1, XCL2 및/또는 Flt3L 유전자를 발현한다.
키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 및 IL-7 유전자 및 XCL1, XCL2 및/또는 Flt3L 유전자는 당업계에 공지된 통상적인 방법(예를 들어, 형질도입, 형질감염, 형질전환 등에 의해)을 사용하여 면역 세포 내로 도입될 수 있다. "형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)를 타겟 세포에 도입하는 과정이다. 일 예로, RNA형질감염은 RNA(예를 들어, 생체외 전사된 RNA, ivtRNA)를 숙주 세포에 도입하는 과정이다. 상기 용어는 주로 진핵 세포에서의 비바이러스성 방법에 사용된다. 용어 "형질도입"은 일반적으로 바이러스에 의해 매개되는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 전이의 설명에 사용된다. 동물 세포의 형질감염은 일반적으로 세포막에 일시적인 기공(pores) 또는 "구멍(holes)"을 열어 물질의 흡수를 허용하는 것에 관한 것이다. 인산칼슘을 사용거나, 전기천공법을 통하거나, 세포 스퀴징을 통하거나, 또는 양이온성 지질을 재료물질과 혼합하여 세포막과 융합되고 내부에 캐리어 물질을 침착시키는 리포솜을 생성함으로써, 형질감염시킬 수 있다. 진핵 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 예시적인 기술은 지질 소포 매개 흡수(lipid vesicle-mediated uptake), 열 충격 매개 흡수, 인산칼슘 매개 형질감염(인산칼슘/DNA공침전), 미세주입 및 전기천공법을 포함한다. 용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)의 박테리아으로의, 또는 비동물성 진핵 세포(식물 세포 포함)로의 비바이러스성 전달의 설명에 사용된다. 따라서, 형질전환은 박테리아(bacteria) 또는 비동물 진핵 세포의 유전학적 변형으로서, 세포막을 통해 주위로부터 직접 흡수 한 후 외인성 유전 물질(핵산 분자)을 도입시킴으로써 발생된다. 형질전환은 인공적 수단으로 구현될 수 있다. 형질전환이 일어나려면 세포나 박테리아가 컴피턴스의 상태(competent state)여야 한다. 원핵 형질전환의 경우, 기술로서 열 충격 매개 흡수, 완전한 세포와의 박테리아 원형질체의 융합, 미세주입 및 전기천공법을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 (a) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 제1 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자; (b) 인터루킨을 코딩하는 제2 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 인터루킨; (c) XCL1, XCL2 및/또는 Flt3L을 코딩하는 제3 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 XCL1, XCL2 및/또는 Flt3L단백질; 을 상기 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하는 조작된 면역 세포의 제조 방법을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 조성 (a), (b) 및 (c)를 임의의 순서로 순차적으로 면역 세포에 도입할 수 있다. 다른 일 실시형태에 있어서, 상기 조성 (a), (b) 및 (c)를 동시에 면역 세포에 도입할 수 있고, 예를 들어, (a), (b) 및 (c)를 하나 또는 다수의 벡터에 클로닝시킨다.
핵산 또는 벡터를 면역 세포에 도입한 후, 본 분야 통상의 기술자들은 통상적인 기술을 통해 얻은 면역 세포를 증폭 및 분화시킬 수 있다.
또 다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 면역 세포는, CD52, GR, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD247ζ, HLA-I, HLA-II, B2M, 및 PD1, CTLA-4, LAG3 및 TIM3과 같은 면역 체크포인트 유전자로부터 선택되는 적어도 하나의 비활성 유전자를 더 포함한다. 더욱 특히, 면역 세포에서 적어도 TCR 성분(TCRα, TCRβ 유전자 포함) 또는 CD3 성분(CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD247ζ 포함)이 비활성화된다. 이러한 비활성화는 TCR-CD3 복합물이 세포에서 기능이 없도록 한다. 이 전략은 이식편대숙주질환(GvHD)을 방지하는데 특히 유용하다. 유전자를 비활성화시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있는 것이고, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE뉴클레아제 또는 CRISPR계에서의 Cas효소에 의해 DNA 절단을 매개하여, 유전자를 비활성화시킨다.
키트 및 약물 조성물
본 발명은 본 발명의 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 키트를 제공한다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 키트는 설명서를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 활성제인 본 발명의 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터, 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 약물 조성물 또는 약물의 제조에서의 상기 핵산 분자, 벡터 또는 조작된 면역 세포의 용도를 더 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 약리학적 및/또는 생리학적으로 피험자 및 활성 성분과 상용(즉, 원하지 않는 국소 또는 전신 작용을 일으키지 않으면서 원하는 치료 효과를 일으킴)되는 벡터 및/또는 부형제를 지칭하고, 당업계에 공지된 것이다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR, 19th ed.Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조). 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예시로, 충진제, 결합제, 붕해제, 피복제, 흡착제, 부착방지제, 활택제, 항산화제, 향미제, 착색제, 감미제, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이트제, 계면활성제, 희석제, 습윤제, 방부제, 유화제, 코팅제, 등장제, 흡수 지연제, 안정제 및 장력 조절제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 원하는 약물 조성물을 제조하기 위해 적합한 부형제를 선택하는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 약물 조성물에 사용하기 위한 예시적인 부형제는 식염수, 완충 식염수, 글루코스 및 물을 포함한다. 통상적으로, 적합한 부형제의 선택은 특히 사용된 활성제, 치료할 질병 및 약물 조성물의 원하는 투여 형태에 따라 결정된다.
본 발명의 약물 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 통상적으로, 비경구적으로 투여된다. 비경구 투여는 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 골수내(intramedullary), 척수강내(intrathecal), 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 설하 또는 비강내 투여를 포함한다.
본 발명의 약물 조성물은, 고체, 액체, 기체 또는 동결건조 형태와 같은 다양한 형태로 제조될 수도 있고, 특히 연고, 크림, 경피 패치, 겔, 분말, 정제, 용액, 에어로졸, 과립, 환제, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 엘릭시르, 엑스제(extract), 팅크제 또는 유동 엑스제(liquid extract) 추출물의 형태일 수 있고, 또는 특히 원하는 투여 방법에 적합한 형태일 수 있다. 발명에 공지된 약물을 생산하기 위한 과정은 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 제립, 당의정 제조, 밀링, 유화, 봉입(encapsulating), 포매 또는 동결건조 과정을 포함할 수 있다. 본 발명에 기재된 것과 같은 면역 세포를 포함하는 약물 조성물은 통상적으로 용액 형태로 제공되고, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 완충제를 포함한다.
본 발명에 따른 약물 조성물은 치료될 질환의 치료 및/또는 예방에 적합한 하나 또는 다수의 기타 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합에 적합한 약제의 바람직한 예시로, 시스플라틴(cisplatin), 메이탄신(maytansine) 유도체, 라켈마이신(rachelmycin), 칼리키아미신(calicheamicin), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 젬시타빈(gemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), 멜파란(melphalan), 미토산트론(mitoxantrone), 소르피머 소듐포토프린II(sorfimer sodiumphotofrin II) , 테모졸로미드(temozolomide), 토포테칸(topotecan), 트리메트레이트 글루쿠로네이트(trimetreate glucuronate), 아우리스타틴E(auristatinE), 빈크리스틴(vincristine) 및 아드리아마이신(adriamycin)과 같은 항암 약물; 리신(ricin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 슈도모나스 균체외 독소A(pseudomonas exotoxin A), DNA효소 및 RNA효소와 같은 펩타이드 세포독소(peptide cytotoxins); 요드131, 레늄186, 인듐111, 이리듐90, 비스무트210 및 213, 악티늄225 및 아스타틴213과 같은 방사성핵종(radionuclide); 항체 지향적 효소 프로드러그와 같은 프로드러그; 혈소판 인자4, 흑색종 성장 자극 단백질(melanoma growth stimulating protein) 등과 같은 면역 자극제; 항CD3항체 또는 이의 단편과 같은 항체 또는 이의 단편, 보체 활성화제, 이종 단백질 도메인, 동종 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인 및 바이러스/박테리아 펩타이드를 포함한다. 이 외에, 본 발명의 약물 조성물은 화학요법, 방사선 요법과 같은 하나 또는 다수의 치료 방법과 함께 조합하여 사용될 수도 있다.
치료 응용
본 발명은 또한 유효량의 본 발명에 따른 면역 세포 또는 약물 조성물을 피험자에 투여하는 단계를 포함하는 암, 감염 또는 자가면역 질환을 앓고 있는 피험자를 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 암, 감염 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 약물 제조에서 상기 조작된 면역 세포의 용도를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 유효량의 본 발명의 면역 세포 및/또는 약물 조성물을 피험자에게 직접 투여한다.
다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 치료 방법은 생체 외 치료(ex-vivo treatment)이다. 구체적으로, 상기 방법은, (a) 면역 세포를 포함하는 시료를 제공하는 단계; (b) 체외에서 본 발명의 키메라 항원 수용체 및 발현될 외인성 유전자를 상기 면역 세포에 도입하여, 변형된 면역 세포를 얻는 단계; (c) 상기 변형된 면역 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계; 를 포함한다. 바람직하게, 단계 (a)에서 제공된 면역 세포는 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, T세포, NK세포 및/또는 NKT세포로부터 선택되고; 상기 면역 세포는 본 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 피험자의 시료(특히, 혈액 시료) 로부터 수득될 수 있다. 그러나, 본 발명의 키메라 항원 수용체 및 외인성 유전자를 발현할 수 있고 본 발명에 기재된 바와 같은 원하는 생물학적 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 기타 면역 세포를 사용할 수도 있다. 이 외에, 통상적으로 선택된 면역 세포는 피험자의 면역계와 상용될 수 있고, 즉, 바람직하게 상기 면역 세포는 면역원성 반응을 유도하지 않는다. 예를 들어, "만능 수용 세포(universal recipient cell)"를 사용할 수 있고, 즉, 원하는 생물학적 이펙터 기능을 발휘하고 보편적으로 상용되며 체외에서 성장 및 증폭될 수 있는 림프구를 사용할 수 있다. 이러한 세포를 사용하는 경우, 피험자 자체의 림프구를 획득 및/또는 제공할 필요가 없다. 단계 (b) 의 생체외 도입은 전기천공을 통해 본 발명에 기술된 핵산 또는 벡터를 면역 세포에 도입하거나 바이러스 벡터로 면역 세포를 감염시킴으로써 수행될 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 전술된 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 기타 이용 가능한 방법으로는 형질감염 시약(예를 들어, 리포솜)을 사용하는 형질감염 또는 일시적 RNA 형질감염이 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 면역 세포는 자가 또는 동원이계(allogeneic)의 세포이고, 바람직하게는 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 및/또는 NKT세포이며, 보다 바람직하게는 T세포, NK세포 또는 NKT세포이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "자가"는 개체로부터 유래된 임의의 물질이 잠시 뒤 동일한 개체에 다시 도입되는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "동원이계(allogeneic)"는 임의의 물질이 유래되는 개체와 당해 물질이 도입되는 개체가 동일한 종의 다른 동물 또는 다른 환자인 것을 의미한다. 하나 또는 다수의 유전자좌에서의 유전자가 상이한 경우, 당해 둘 또는 그 이상의 개체가 서로 동원이계(allogeneic)인 것으로 간주된다. 일부 경우, 같은 종의 개체에서 유래한 동종이계 물질은 유전적으로 달라 충분히 항원 상호작용이 일어날 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비 인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예시에 한정되지 않는다. 인간 이외의 포유동물은 암의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 피험자는 인간이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 암은 리간드 결합 도메인에 결합되는 타겟 발현과 관련된 암이다. 예를 들어, 상기 암은, 뇌 신경교종, 모세포종, 육종, 백혈병, 기저세포암, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암(choriocarcinoma), 결장 및 직장암, 결합조직암(connective tissue cancer), 소화기 계통의 암(cancer of digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암(위장암 포함), 교모세포종(GBM), 간암, 간세포종양, 상피내종양, 신장암, 후두암, 간종양, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암 및 편평상피 폐암), 림프종(호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종 포함), 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 입 및 인두), 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기 계통의 암, 타액샘 암종(salivary gland cancer), 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기 계통의 악성 종양, 외음부암 및 기타 암 및 육종, 및 B세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구성(SL)NHL, 중등급/여포성NHL, 중등급 미만성NHL, 고등급 면역아세포성NHL(high-grade immunoblastic NHL), 고등급 림프아세포성NHL(high-grade lymphoblastic NHL), 고등급 소형 비-절단된 세포NHL(high-grade small non-cracked cell NHL), 벌키병 NHL(bulky disease NHL)), 외투세포 림프종, AIDS관련 림프종, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), B세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 종양, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 림프 증식 질환(malignant lymphoproliferative disorder), MALT 림프종, 털세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성(myelodysplasia), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 전백혈병, 형질세포양 수지상 세포 종양, 및 이식후 림프세포증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD); 및 기타 타겟 발현과 관련된 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 조작된 면역 세포 또는 약물 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 질환은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 뇌 신경교종, 췌장암, 위암 등으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 감염에는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충에 의한 감염이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, 상기 자가면역 질환은 I형 당뇨병, 셀리악병, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 애디슨병, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 혈관염, 악성빈혈 및 전신홍반루푸스 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 또한 하나 또는 다수의 별도의 화학요법제, 생물학적 제제, 약물 또는 치료제를 피험자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시형태에서, 화학요법제, 생물학적 제제, 약물 또는 치료제는 방사선 요법, 수술, 항체 시약 및/또는 소분자 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
본 발명은 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 이하에서 상세히 설명될 것이다. 당업자는 첨부된 도면 및 본 발명의 실시예가 단지 예를 들기 위한 목적이며 본 발명에 대해 어떠한 제한도 구성하지 않는다는 것을 이해해야 한다는 점에 유의해야 한다. 본 출원의 실시예와 실시예의 특징은 모순되지 않는 범위에서 서로 조합될 수 있다.
실시예 1. 마우스 췌장암 세포주Panc02-mCD19의 구축
1. pLV-mCD19플라스미드의 제조
마우스 비장의 총mRNA를 주형으로 하여, 역전사PCR을 통해 마우스 비장의 총cDNA 서열을 얻은 후, 다시 PCR에 의해 XbaI 및 SalI제한 자리가 함유된 마우스mCD19 서열을 얻었다. 이 후, mCD19 유전자를 pLV-BHAm 플라스미드에 재조합하여, pLV-BHAm-mCD19플라스미드를 얻었다.
2. 렌티바이러스 패키징
T175배양 플라스크에서, 30Х106개 cell/플라스크의 밀도로 293T세포를30ml 의 10％의 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지에 접종하고, 37℃, 5％의 CO2의 인큐베이터에서 밤새 배양하였다.
무균 튜브에 3ml의 Opti-MEM(Gibco, Lot No. 31985-070), 34μg의 pLV-BHAm-mCD19플라스미드, 8.5μg의 pMD2.G 벡터(Addgene, Lot No. 12259) 및 17μg의 psPAX2 벡터(Addgene, Lot No. 12260)를 넣었다. 다음, 120μl의 X-treme GENE HP DNA형질감염 시약(Roche, Lot No. 06366236001)을 넣어, 즉시 균일하게 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 다음, 상기 플라스미드/벡터/형질감염 시약 혼합물을 미리 준비된 293T세포의 배양 플라스크에 적가하고, 37℃, 5％의 CO2의 조건 하에서 밤새 배양하였다. 형질감염 후 24시간 및 48시간에 배양물을 수집하고, 합병 후 초원심분리(25000g, 4℃, 2.5h)하여, 농축된pLV-BHAm-mCD19렌티바이러스를 얻었고, -80℃에서 보관하였다.
3. Panc02-mCD19세포주 스크리닝
6웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에, 10％의 소태아혈청이 함유된 RPMI-1640배지(Gibco, Lot No. C12430500BT), 1Х106개의 마우스 췌장암세포 Panc02(중국약학대학 연구실에서 제공) 및 200μl의 pLV-BHAm-mCD19렌티바이러스를 넣고, 37℃, 5％의 CO2의 조건 하에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 0.25％의 트립신으로 세포를 단일 세포 현탁액으로 소화시키고, 세포를 희석하여 단일클론 세포가 나타날 때까지 96웰 플레이트로 옮겨 계속하여 배양하였다. 단일클론 세포를 선택한 후, 재차 0.25％의 트립신을 사용하여 단일 세포로 소화시키고, 200μl의 opti-MEM 배지로 세포를 재현탁시켰다. APC 항-마우스 CD19(APC anti-mouse CD19) 항체(Biolegend, Lot No. 115512)를 사용하여 유세포 분석법으로 감염 효율을 검측하고, CD19-양성 클론을 스크리닝하였다. 양성 클론을 3-4회 계대한 후, 다시 유세포 분석법으로 CD19의 발현 수준을 검측하였다. 바이러스에 감염되지 않은 Panc02 세포를 대조군으로 사용하였다.
결과는 도 3에 도시된 바와 같다. 최종 스크리닝된 Panc02-mCD19세포주에서, CD19발현율은 100％이다.
실시예 2. CAR-T세포의 제조
1. 레트로바이러스 플라스미드의 구축
순차적으로 연결된 mCD19-scFv, mCD8a힌지 사슬 영역 및 막관통 영역, 뮤린 41bb 세포 내 도메인 및 뮤린 CD3ζ 세포 내 도메인의 코딩 서열 단편을 인공 합성하고, 양 말단에 XhoI/EcoRI제한 자리를 추가하였다. 단편을 MSCV벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR플라스미드를 얻었다.
순차적으로 연결된 T2A 및 뮤린 IL-7의 코딩 서열 단편을 인공 합성하고, 양 말단에 EcoRI/SalI제한 자리를 추가하였다. 단편을 MSCV-mCD19-CAR벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR-IL-7플라스미드를 얻었다.
순차적으로 연결된 T2A 및 뮤린 XCL1의 코딩 서열 단편을 인공 합성하고, 양 말단에 EcoRI/SalI제한 자리를 추가하였다. 단편을 MSCV-mCD19-CAR벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR-XCL1플라스미드를 얻었다.
순차적으로 연결된 T2A 및 뮤린 CCL19의 코딩 서열 단편을 인공 합성하고, 양 말단에 EcoRI/SalI제한 자리를 추가하였다. 단편을 MSCV-mCD19-CAR벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR-CCL19플라스미드를 얻었다.
순차적으로 연결된 T2A 및 뮤린 Flt3L의 코딩 서열 단편을 인공 합성하고, 양 말단에EcoRI/SalI제한 자리를 추가하였다. 단편을 MSCV-mCD19-CAR벡터에 클로닝하여, MSCV-mCD19-CAR-Flt3L플라스미드를 얻었다.
2. 레트로바이러스의 제조
T175배양 플라스크에서, 30Х106개 cell/플라스크의 밀도로 293T세포를30ml 의 10％의 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지에 접종하고, 37℃, 5％의 CO2의 인큐베이터에서 밤새 배양하여, 바이러스 패키징에 사용하였다.
무균 튜브에 3ml의Opti-MEM(Gibco, Lot No. 31985-070), 45μg의 레트로바이러스 플라스미드(MSCV-mCD19-CAR플라스미드, MSCV-mCD19-CAR-IL-7플라스미드, MSCV-mCD19-CAR-XCL1플라스미드, MSCV-mCD19-CAR-CCL19 또는 MSCV-mCD19-CAR-Flt3L플라스미드) 및 15μg 패키징 벡터pCL-Eco(상하이 허우 바이오텍 유한회사, Lot No. P3029) 를 넣었다. 다음, 120μl의 X-treme GENE HP DNA형질감염 시약(Roche, Lot No. 06366236001)을 넣어, 즉시 균일하게 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 다음, 상기 플라스미드/벡터/형질감염 시약 혼합물을 미리 준비된 293T세포의 배양 플라스크에 적가하고, 37℃, 5％의 CO2의 조건 하에서 밤새 배양하였다. 형질감염 후 72시간에 배양물을 수집하고, 원심분리(2000g, 4℃, 10분)하여, 레트로바이러스 상등액을 얻었다.
3. CAR-T세포의 제조
마우스 비장으로부터 T림프구를 분리하고, DynaBeads CD3/CD28 CTSTM (Gibco,Lot No. 40203D)로 T세포를 활성화한 후, 37℃ 및 5％의 CO2의 조건 하에서 1일동안 배양하였다.
각 웰당 3Х106개 cell/mL의 밀도로 활성화된 T세포를 RetroNectin로 미리 밤새 코팅한 24웰 플레이트에 접종한 후, 500μL의 완전 배지(NT, 대조), MSCV-mCD19-CAR바이러스, MSCV-mCD19-CAR-XCL1바이러스, MSCV-mCD19-CAR-Flt3L바이러스, MSCV-mCD19-CAR-IL-7바이러스 + MSCV-mCD19-CAR-CCL19바이러스, MSCV-mCD19-CAR-IL-7바이러스 + MSCV-mCD19-CAR-Flt3L바이러스, 또는 MSCV-mCD19-CAR-IL-7바이러스 + MSCV-mCD19-CAR-XCL1바이러스를 넣고, 완전 배지를 2mL까지 보충하였다.
24웰 플레이트를 원심분리기에 넣어 원심분리 감염(centrifuging infection)을 진행하되, 32℃, 2000g에서 2시간 동안 원심분리하였다. 다음, 즉시 24웰 플레이트를 37℃, CO2의 인큐베이터에 넣고 정치하여 배양하였다. 다음날 신선한 배지로 교체하고, 세포 밀도를 1Х106개 cell/mL로 조정하였다. 감염 3일 후, 세포를 수집하여 후속 분석에 사용하였다. 수집된 세포는 NT세포, mCD19-CAR세포, mCD19-CAR-XCL1세포, mCD19-CAR-Flt3L세포, mCD19-CAR-IL-7-CCL19세포, mCD19-CAR-IL-7-Flt3L세포, 및 mCD19-CAR-IL-7-XCL1세포이다.
실시예 3. CAR-T세포 발현에 대한 검측
1. 세포 표면 CAR의 발현 수준
실시예 2에서 제조된 2Х105개의 CAR-T세포를 취하여, 일차 항체로 염소 항-래트IgG(Goat Anti-Rat IgG)(H&L)Biotin(BioVision,Lot No. 6910-250)를 사용하고, 2차 항체로 APC 스트렙타비딘(APC Streptavidin)(BD Pharmingen, Lot No. 554067)을 사용하며, 유세포 분석법으로 CAR T세포에서의 CAR의 발현 수준을 검측하였고, 결과는 도 4에 도시된 바와 같다.
대조군과 비교하여, mCD19-CAR, mCD19-CAR-XCL1, mCD19-CAR-Flt3L, mCD19-CAR-IL-7-XCL1, mCD19-CAR-IL-7-CCL19세포, mCD19-CAR-IL-7-Flt3L세포에서 CAR의 양성 효율이 모두 50％를 초과하였음을 알 수 있으며, 이는 이들 세포가 CAR을 효과적으로 발현할 수 있음을 나타낸다.
2. XCL1의 발현 수준
실시예 2에서 제조된 CAR-T세포의 상등액을 수집하고, 제조업체의 건의에 따라, 마우스 XCL1 DuoSet ELISA 키트(Mouse XCL1 DuoSet ELISA kit)(R&D Systems,Lot No. DY486)를 사용하여 세포에서의 XCL1 분비 수준을 검측하였고, 결과는 도 5에 도시된 바와 같다.
mCD19-CAR-XCL1을 포함하는 두가지의 CAR T세포 모두에서 XCL1을 효과적으로 분비할 수 있음을 알 수 있다.
3. IL-7의 발현 수준
실시예 2에서 제조된 CAR-T세포의 상등액을 수집하고, 제조업체의 건의에 따라, 마우스 IL-7 DuoSet ELISA키트(Mouse IL-7 DuoSet ELISA kit)(R&D Systems,Lot No. DY407) 를 사용하여 세포에서의 IL-7 분비 수준을 검측하였고, 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
mCD19-CAR-IL-7을 포함하는 세가지의CAR T세포 모두에서 IL-7을 효과적으로 분비할 수 있음을 알 수 있다.
4. CCL19의 발현 수준
실시예 2에서 제조된 CAR-T세포의 상등액을 수집하고, 제조업체의 건의에 따라, 마우스 CCL19 DuoSet ELISA키트(Mouse CCL19 DuoSet ELISA kit)(R&D Systems,Lot No. DY440)를 사용하여 세포에서의 CCL19 분비 수준을 검측하였고, 결과는 도 7에 도시된 바와 같다.
mCD19-CAR-CCL19를 포함하는 CAR T세포에서 CCL19을 효과적으로 분비할 수 있음을 알 수 있다.
5. Flt3L의 발현 수준
실시예 2에서 제조된 CAR-T세포의 상등액을 수집하고, 제조업체의 건의에 따라, 마우스 Flt-3 리간드 DuoSet ELISA키트(Mouse Flt-3 Ligand DuoSet ELISA kit)(R&D Systems,Lot No. DY427)를 사용하여 세포에서의 Flt3L 분비 수준을 검측하였고, 결과는 도 8에 도시된 바와 같다.
mCD19-CAR-Flt3L을 포함하는 두가지의 CAR T세포 모두에서 Flt3L을 효과적으로 분비할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. CAR-T세포의 IFN-γ 분비 수준의 검출
96웰 둥근 바닥 플레이트에 2Х105개 cell/100μl의 농도로 NT세포, mCD19-CAR세포, mCD19-CAR-XCL1세포, mCD19-CAR-Flt3L세포, mCD19-CAR-IL-7-CCL19세포, mCD19-CAR-IL-7-Flt3L세포 및 mCD19-CAR-IL-7-XCL1세포를 각각 첨가하였다. 다음, 각 웰에 1Х104개 cell/100μl의 농도로 타겟Panc02-mCD19세포 또는 비타겟 Panc02세포를 넣었다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 배양물의 상등액을 수집하였다. 제조업체의 건의에 따라, 마우스 IFN-γ DuoSet ELISA키트(Mouse IFN-gamma DuoSet ELISA)(R&D, Lot No. DY485) 를 사용하여 배양물 상등액에서 IFN-γ의 발현 수준을 검측하였다.
검측 결과는 도 9에 도시된 바와 같다. 비타겟 세포 Panc02에서 IFN-γ의 방출이 모두 검출되지 않았고, NT세포는 IFN-γ를 발현하지 않음을 알 수 있으며, 이는 본 실시예의 CAR T세포의 살상이 모두 특이적인 것임을 나타낸다. 또한, 타겟 세포 살상시, CAR만을 발현하는 T세포와 비교할 때, Flt3L, IL-7+Flt3L, IL-7+CCL19 또는 IL-7+XCL1를 추가로 발현하여 항원 특이적 IFN-γ수준을 현저하게 증가시켰다.
실시예 5. CAR-T세포의 종양 억제 효과 검증
건강한 C57BL/6마우스의 왼쪽 앞다리 겨드랑이 아래 부위에 5Х105개의 실시예 1에서 제조된 Panc02-mCD19췌장암 세포를 피하 접종하였다.
췌장암 세포를 접종한 마우스를 무작위로 6마리씩 7그룹으로 나누었다. 종양 부피가 100mm3으로 성장했을 때, 각 마우스당 5Х106개의 실시예 2에서 제조된 NT세포, mCD19-CAR세포, mCD19-CAR-XCL1세포, mCD19-CAR-Flt3L세포, mCD19-CAR-IL-7-CCL19세포, mCD19-CAR-IL-7-Flt3L세포, 또는 mCD19-CAR-IL-7-XCL1세포를 미정맥을 통해 주사하였다.
실험이 끝날 때까지 마우스의 체중 및 종양 부피 변화를 모니터링하였다.
마우스의 체중 변화는 도 10에 도시된 바와 같다. CAR-T세포 투여 후, 대조군과 비교하여, 각 그룹의 마우스의 체중은 현저한 차이가 없었으며, 관찰 주기 동안, 마우스 종양이 1500mm3을 초과하지 않는 경우, 마우스는 활동적이고, 털 색상이 정상적인 것을 알 수 있으며, 이는 CAR-T세포 투여가 마우스에 명백한 독성 부작용이 없음을 나타낸다.
마우스의 종양 부피 변화는 도 11에 도시된 바와 같다. NT세포 및 통상적인 CAR-T세포와 비교하여, XCL1 또는 Flt3L만을 발현하는 CAR-T세포는 항종양 효과를 현저하게 향상시킬 수 없었으며, 이는 XCL1 또는 Flt3L 단독으로는 CAR-T세포와 상승 작용을 구현할 수 없음을 나타낸다. 이 외에, IL-7 및 CCL19를 공동으로 발현하는 CAR-T세포의 항종양 효과는 통상적인 CAR-T세포보다 현저하게 우수하고, 이는 이전의 보도와 일치하였다. 그러나, 놀랍게도, 발명자들은 IL-7+XCL1 및 IL-7+Flt3L 조합이 CAR-T세포의 항종양 효과를 현저하게 향상시켰을 뿐만 아니라, 증강 효과가 CAR-T에 대한 IL-7+CCL19 조합의 증강 효과보다 훨씬 우수하였다. 여기서, IL-7 및 XCL1을 공동발현하는 CAR-T세포의 종양 억제 효과가 최고였고, 재발 없이 종양이 거의 완전히 사라졌다.
마우스의 생존 그래프는 도 12에 도시된 바와 같다. 기존의 CAR-T세포 치료와 비교하여, 추가로 발현된 XCL1 또는 Flt3L은 단독으로 마우스의 생존 기간을 현저하게 연장하지 못한 반면, IL-7+CCL19, IL-7+Flt3L 또는 IL-7+XCL1을 공동으로 발현한 CAR-T세포는 마우스의 생존 기간을 효과적으로 연장하였다. 여기서, IL-7+XCL1군에서, 5마이의 마우스는 완전 완화를 달성하였고, 실험이 끝날 때까지 무종양 생존을 유지하였으며, 1마리의 마우스는 매우 바람직한 부분 완화를 달성하였고, 지속적인 종양 억제 상태를 유지하였다. IL-7+Flt3L군에서, 3마리의 마우스가 실험 종료 시 완전 완화를 유지하였다. 그러나, IL-7+CCL19군에서, 2마리의 마우스는 실험 종료시 완전 완화를 유지하였고, 무종양 생존을 유지하였으며, 나머지 마우스에서는 실험 초기 통상적인 CAR-T세포에 비해 일정한 종양 억제 작용을 발휘하였으나, 실험 말기에는 종양 억제 효과가 사라져 마우스가 사망하였다.
상기 결과에 따르면, IL-7+XCL1 또는 IL-7+Flt3L을 공동으로 발현하는 것이 타겟 췌장 암세포에 대한 조작된 면역 세포의 억제 효과를 증진시킬 수 있고, 생존율을 유의하게 향상시킬 수 있으며, 증진 효과는 현재 공지된 IL-7+CCL19 조합보다 우수한 것으로 나타났다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니며, 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 본 발명은 다양한 보정 및 변경을 가할 수 있다. 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 균등한 대체, 개선 등은 본 발명의 보호 범위 내에 포함되어야 한다는 것은 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해된다.
<110> NANJING BIOHENG BIOTECH CO., LTD <120> Engineered Immune Cell and Use Thereof <130> BHCN19 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 scFv <400> 1 gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360 ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420 tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480 cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540 tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600 ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660 tattactacg 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atcttcttgg ggacagtggc ccataaatca 60 agcccccaag ggccagatcg cctcctgatt agacttcgtc accttattga cattgttgaa 120 cagctgaaaa tctatgaaaa tgacttggat cctgaacttc tatcagctcc acaagatgta 180 aaggggcact gtgagcatgc agcttttgcc tgttttcaga aggccaaact caagccatca 240 aaccctggaa acaataagac attcatcatt gacctcgtgg cccagctcag gaggaggctg 300 cctgccagga ggggaggaaa gaaacagaag cacatagcta aatgcccttc ctgtgattcg 360 tatgagaaaa ggacacccaa agaattccta gaaagactaa aatggctcct tcaaaagatg 420 attcatcagc atctctccta g 441 <210> 54 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-21 <400> 54 Met Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr Val 5 9 14 19 Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu 24 29 34 Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp 39 44 49 Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys 54 59 64 Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser 69 74 79 84 Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu 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Leu Leu Leu Leu Leu Ser 5 9 14 19 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 24 29 34 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 39 44 49 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 54 59 64 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 69 74 79 84 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 89 94 99 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 104 109 114 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 119 124 129 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 134 139 144 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 149 154 159 <210> 57 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-17 <400> 57 atgagtccag ggagagcttc atctgtgtct ctgatgctgt tgctgctgct gagcctggcg 60 gctacagtga aggcagcagc gatcatccct caaagctcag cgtgtccaaa cactgaggcc 120 aaggacttcc tccagaatgt gaaggtcaac ctcaaagtct ttaactccct tggcgcaaaa 180 gtgagctcca gaaggccctc agactacctc aaccgttcca cgtcaccctg gactctccac 240 cgcaatgaag accctgatag atatccctct gtgatctggg aagctcagtg ccgccaccag 300 cgctgtgtca atgcggaggg aaagctggac caccacatga attctgttct catccagcaa 360 gagatcctgg tcctgaagag ggagcctgag agctgcccct tcactttcag ggtcgagaag 420 atgctggtgg gtgtgggctg cacctgcgtg gcctcgattg tccgccaggc agcctaa 477 <210> 58 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-17 <400> 58 Met Ser Pro Gly Arg Ala Ser Ser Val Ser Leu Met Leu Leu Leu Leu 5 9 14 19 Leu Ser Leu Ala Ala Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Ile Pro Gln Ser 24 29 34 Ser Ala Cys Pro Asn Thr Glu Ala Lys Asp Phe Leu Gln Asn Val Lys 39 44 49 Val Asn Leu Lys Val Phe Asn Ser Leu Gly Ala Lys Val Ser Ser Arg 54 59 64 Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His 69 74 79 84 Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln 89 94 99 Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His 104 109 114 Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu 119 124 129 Pro Glu Ser Cys Pro Phe Thr Phe Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly 134 139 144 Val Gly Cys Thr Cys Val Ala Ser Ile Val Arg Gln Ala Ala 149 154 159 <210> 59 <211> 582 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIL-18 <400> 59 atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60 aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120 cttgaatcta aattatcagt cataagaaat ttgaatgacc aagttctctt cattgaccaa 180 ggaaatcggc ctctatttga agatatgact gattctgact gtagagataa tgcaccccgg 240 accatattta ttataagtat gtataaagat agccagccta gaggtatggc tgtaactatc 300 tctgtgaagt gtgagaaaat ttcaactctc tcctgtgaga acaaaattat ttcctttaag 360 gaaatgaatc ctcctgataa catcaaggat acaaaaagtg acatcatatt ctttcagaga 420 agtgtcccag gacatgataa taagatgcaa tttgaatctt catcatacga aggatacttt 480 ctagcttgtg aaaaagagag agaccttttt aaactcattt tgaaaaaaga ggatgaattg 540 ggggatagat ctataatgtt cactgttcaa aacgaagact ag 582 <210> 60 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIL-18 <400> 60 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met 5 9 14 19 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn 24 29 34 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile 39 44 49 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro 54 59 64 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 69 74 79 84 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 89 94 99 Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys 104 109 114 Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile 119 124 129 Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 134 139 144 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 149 154 159 164 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys 169 174 179 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 184 189 194 Asp <210> 61 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-18 <400> 61 atggctgcca tgtcagaaga ctcttgcgtc aacttcaagg aaatgatgtt tattgacaac 60 acgctttact ttatacctga agaaaatgga gacctggaat cagacaactt tggccgactt 120 cactgtacaa ccgcagtaat acggaatata aatgaccaag ttctcttcgt tgacaaaaga 180 cagcctgtgt tcgaggatat gactgatatt gatcaaagtg ccagtgaacc ccagaccaga 240 ctgataatat acatgtacaa agacagtgaa gtaagaggac tggctgtgac cctctctgtg 300 aaggatagta aaatgtctac cctctcctgt aagaacaaga tcatttcctt tgaggaaatg 360 gatccacctg aaaatattga tgatatacaa agtgatctca tattctttca gaaacgtgtt 420 ccaggacaca acaagatgga gtttgaatct tcactgtatg aaggacactt tcttgcttgc 480 caaaaggaag atgatgcttt caaactcatt ctgaaaaaaa aggatgaaaa tggggataaa 540 tctgtaatgt tcactctcac taacttacat caaagttag 579 <210> 62 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-18 <400> 62 Met Ala Ala Met Ser Glu Asp Ser Cys Val Asn Phe Lys Glu Met Met 5 9 14 19 Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Pro Glu Glu Asn Gly Asp Leu 24 29 34 Glu Ser Asp Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg 39 44 49 Asn Ile Asn Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe 54 59 64 Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg 69 74 79 84 Leu Ile Ile Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val 89 94 99 Thr Leu Ser Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn 104 109 114 Lys Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp 119 124 129 Ile Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn 134 139 144 Lys Met Glu Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys 149 154 159 164 Gln Lys Glu Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu 169 174 179 Asn Gly Asp Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 184 189 194 <210> 63 <211> 570 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIL-23 <400> 63 atgctgggga gcagagctgt aatgctgctg ttgctgctgc cctggacagc tcagggcaga 60 gctgtgcctg ggggcagcag ccctgcctgg actcagtgcc agcagctttc acagaagctc 120 tgcacactgg cctggagtgc acatccacta gtgggacaca tggatctaag agaagaggga 180 gatgaagaga ctacaaatga tgttccccat atccagtgtg gagatggctg tgacccccaa 240 ggactcaggg acaacagtca gttctgcttg caaaggatcc accagggtct gattttttat 300 gagaagctgc taggatcgga tattttcaca ggggagcctt ctctgctccc tgatagccct 360 gtggcgcagc ttcatgcctc cctactgggc ctcagccaac tcctgcagcc tgagggtcac 420 cactgggaga ctcagcagat tccaagcctc agtcccagcc agccatggca gcgtctcctt 480 ctccgcttca aaatccttcg cagcctccag gcctttgtgg ctgtagccgc ccgggtcttt 540 gcccatggag cagcaaccct gagtccctaa 570 <210> 64 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIL-23 <400> 64 Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr 5 9 14 19 Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln 24 29 34 Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His 39 44 49 Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr 54 59 64 Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln 69 74 79 84 Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly 89 94 99 Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu 104 109 114 Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu 119 124 129 Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr 134 139 144 Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu 149 154 159 164 Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala 169 174 179 Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro 184 189 <210> 65 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-23 <400> 65 atgctggatt gcagagcagt aataatgcta tggctgttgc cctgggtcac tcagggcctg 60 gctgtgccta ggagtagcag tcctgactgg gctcagtgcc agcagctctc tcggaatctc 120 tgcatgctag cctggaacgc acatgcacca gcgggacata tgaatctact aagagaagaa 180 gaggatgaag agactaaaaa taatgtgccc cgtatccagt gtgaagatgg ttgtgaccca 240 caaggactca aggacaacag ccagttctgc ttgcaaagga tccgccaagg tctggctttt 300 tataagcacc tgcttgactc tgacatcttc aaaggggagc ctgctctact ccctgatagc 360 cccatggagc aacttcacac ctccctacta ggactcagcc aactcctcca gccagaggat 420 cacccccggg agacccaaca gatgcccagc ctgagttcta gtcagcagtg gcagcgcccc 480 cttctccgtt ccaagatcct tcgaagcctc caggcctttt tggccatagc tgcccgggtc 540 tttgcccacg gagcagcaac tctgactgag cccttagtgc caacagctta a 591 <210> 66 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-23 <400> 66 Met Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val 5 9 14 19 Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln 24 29 34 Cys Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His 39 44 49 Ala Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu 54 59 64 Thr Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro 69 74 79 84 Gln Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln 89 94 99 Gly Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly 104 109 114 Glu Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser 119 124 129 Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu 134 139 144 Thr Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro 149 154 159 164 Leu Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile 169 174 179 Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu 184 189 194 Val Pro Thr Ala 199 <210> 67 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hXCL2 <400> 67 atgagacttc tcatcctggc cctccttggc atctgctctc tcactgcata cattgtggaa 60 ggtgtaggga gtgaagtctc acataggagg acctgtgtga gcctcactac ccagcgactg 120 ccagttagca gaatcaagac ctacaccatc acggaaggct ccttgagagc agtaattttt 180 attaccaaac gtggcctaaa agtctgtgct gatccacaag ccacgtgggt gagagacgtg 240 gtcaggagca tggacaggaa atccaacacc agaaataaca tgatccagac caagccaaca 300 ggaacccagc aatcgaccaa tacagctgtg accctgactg gctag 345 <210> 68 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hXCL2 <400> 68 Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala 5 9 14 19 Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser His Arg Arg Thr Cys 24 29 34 Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr 39 44 49 Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg 54 59 64 Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val 69 74 79 84 Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln 89 94 99 Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu 104 109 114 Thr Gly

Claims (32)

  1. (i) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자, (ii) 외인성 인터루킨, 및 (iii) 외인성 Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1 유전자를 발현하는 조작된 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 키메라 항원 수용체 또는 T세포 수용체인 조작된 면역 세포.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는, 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체인 조작된 면역 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인터루킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, 또는 이들의 서브 유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브 유닛의 조합인 조작된 면역 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Flt3L 유전자는 서열번호 35 또는 37로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90％의 동일성을 갖거나, 또는 상기 Flt3L 유전자에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 서열번호 36 또는 38로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 갖는 조작된 면역 세포.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 인터루킨의 코딩 유전자는 서열번호 23, 27, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90％의 동일성을 갖거나, 또는 상기 인터루킨은 서열번호 24, 28, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 갖는 조작된 면역 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 XCL1 유전자는 서열번호 25 또는 29로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90％의 동일성을 갖거나, 또는 상기 XCL1 유전자에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 서열번호 26 또는 30으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 갖는 조작된 면역 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 XCL2 유전자는 서열번호 67로 표시되는 핵산 서열과 적어도 90％의 동일성을 갖거나, 상기 XCL2 유전자에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 서열번호 68로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90％의 동일성을 갖는 조작된 면역 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포, 또는 NKT세포로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 T세포는 CD4+/CD8+T세포, CD4+헬퍼T세포, CD8+T세포, 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포, γδ-T세포 또는 αβ-T세포인 조작된 면역 세포.
  11. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드 결합 도메인은 scFv, Fab, 단일 도메인 항체, 나노 항체, 항원 결합 리간드, 재조합 피브로넥틴 도메인, 안티칼린(anticalin) 및 DARPIN으로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  12. 제3항에 있어서,
    상기 리간드 결합 도메인은, TSHR, CD19, CD123, CD22, BAFF-R, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-l lRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, AFP, Folate수용체α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CS1, CD138, NCAM, 클라우딘(Claudin)18.2, Prostase, PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp1oo, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체β TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제(telomerase), PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin Bl, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제(intestinal tract carboxylesterase), mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 타겟과 결합되는 조작된 면역 세포.
  13. 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트랜스멤브레인 도메인은, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로부터 선택되는 단백질의 트랜스멤브레인 도메인인 조작된 면역 세포.
  14. 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 내 신호 전달 도메인은, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 선택되는 단백질의 신호 전달 도메인인 조작된 면역 세포.
  15. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공동자극 도메인은, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18(LFA-1), CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM, ZAP70 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 단백질의 공동자극 신호 전달 도메인인 조작된 면역 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는, CD52, GR, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD247ζ, HLA-I, HLA-II, B2M, PD1, CTLA-4, LAG3 및 TIM3으로부터 선택되는 적어도 하나의 비활성 유전자를 더 포함하는 것인 조작된 면역 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1 유전자의 발현은 조건적 발현인 조작된 면역 세포.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1 유전자는 유도형, 억제형 또는 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 조건적 발현되는 조작된 면역 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인터루킨, Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1 유전자는 편재화 도메인(localization domain)에 작동 가능하게 연결되는 조작된 면역 세포.
  20. (i) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 핵산 서열, (ii) 인터루킨을 코딩하는 핵산 서열, 및 (iii) Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 키메라 항원 수용체인 핵산 분자.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 인터루킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, 이들의 서브 유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브 유닛의 조합인 핵산 분자.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마 및 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 선택되는 것인 벡터.
  25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 키트.
  26. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 및
    하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물.
  27. 조작된 면역 세포의 제조 방법에 있어서,
    (a) 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자를 코딩하는 제1 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자; (b) 인터루킨을 코딩하는 제2 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 인터루킨; 및 (c) Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1을 코딩하는 제3 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 Flt3L, XCL2 및/또는 XCL1단백질; 을 상기 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하는 조작된 면역 세포의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 리간드를 특이적으로 인식하는 세포 표면 분자는 키메라 항원 수용체인 제조 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 인터루킨은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-17, IL-18, IL-23, 또는 이들의 서브 유닛, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 서브 유닛의 조합인 제조 방법.
  30. 제27항에 있어서,
    상기 (a), (b) 및 (c)는 임의의 순서로 순차적으로 면역 세포에 도입되는 제조 방법.
  31. 제27항에 있어서,
    상기 (a), (b) 및 (c)는 동시에 면역 세포에 도입되는 제조 방법.
  32. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포, 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제23항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제25항에 따른 키트 또는 제26항에 따른 약물 조성물의 암, 감염 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약물 제조에서 용도.
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