JP2022536693A

JP2022536693A - 操作されたオフザシェルフ免疫細胞およびそれらの使用方法

Info

Publication number: JP2022536693A
Application number: JP2021573443A
Authority: JP
Inventors: リーリーヤン，; ピンワン，; ユジョンキム，; ジアジユー，; ヤンルイデリー，
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2022-08-18
Also published as: CA3142947A1; CN114929864A; EP3982979A1; AU2020291457A1; EP3982979A4; WO2020252303A1; US20220257655A1

Abstract

本開示の態様は、操作された免疫細胞を含む、免疫細胞の調製に関する方法および組成物に関する。本開示のある特定の実施形態は、臨床治療のためのオフザシェルフ使用のための操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞に関する組成物、細胞および方法を含む。ｉＮＫＴ細胞は、造血幹始原細胞から産生され得、ＨＬＡ陰性であるため同種異系細胞療法に好適であり得る。一部の態様では、これらの細胞にはイメージングおよび自殺標的化能力がある。

Description

本願は、２０１９年６月１２に出願した米国特許仮出願第６２／８６０，６１３号、２０１９年６月１２に出願した米国特許仮出願第６２／８６０，６４４号、２０１９年６月１２に出願した米国特許仮出願第６２／８６０，６６７号、２０１９年１２月１１に出願した米国特許仮出願第６２／９４６，７４７号、および２０１９年１２月１１に出願した米国特許仮出願第６２／９４６，７８８号の利益を主張するものであり、これらの仮出願は、それら全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
１．技術分野

本開示の実施形態は、免疫学分野、細胞生物学分野、分子生物学分野、およびがん医学を少なくとも含む医学分野に、少なくとも関する。

２．背景技術
がんは、世界中で数千万の人々が罹患し、米国の公衆衛生にとって最大の脅威である。治療法が存在するにもかかわらず、がん患者は、これらの処置の効果のなさ、それらの毒性、および再発のリスクに、今もなお悩まされている。それ故、がんの新規治療法が切実に必要とされている。過去１０年の間に、免疫療法が新世代のがん医学になってきた。特に、細胞ベースの細胞療法は、おおいに有望であることが示されている。顕著な例は、目覚ましい有効性で、ある特定の血液細胞を標的とする、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作による養子Ｔ細胞療法である。

しかし、処置のための現行のプロトコールの大部分は、患者から採取された免疫細胞がこの患者一名だけを処置するために作製され、使用される、自家養子細胞移入からなる。このような手法は、費用がかかり、製造が労働集約的であり、必要としているすべての患者への広範な供給が困難である。したがって、より多数の患者を処置するための、大規模に製造することができかつ容易に配給することができる同種異系免疫細胞製品には、大きな需要がある。

治療法が存在するにもかかわらず、がん患者は、これらの処置の効果のなさ、それらの毒性、および再発のリスクに、今もなお悩まされている。したがって、がんおよび自己免疫疾患などの疾患のための新規治療法には、切実な需要がある。本開示は、治療法の長年にわたる要求に対する解決策を提供するが、より広範に供給または配給することができる治療法も提供する。

新規治療法の要求、より詳細には、自家細胞を使用する個別療法に伴う困難により妨げられない細胞療法の要求に応えるための実施形態が、提供される。治療用細胞集団の、または治療用細胞集団を作出するために使用することができる細胞集団の「オフザシェルフ」を製造できることは、新規細胞療法の利用可能性および有用性を増大させる。

本開示の実施形態は、免疫細胞の集団を生成または調製するための方法に関する。免疫細胞は、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、または他の免疫細胞であり得る。一部の実施形態では、免疫細胞は、ｉＮＫＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、ならびに他の自然および養子Ｔ細胞である。したがって、本開示の態様は、Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、ａ）幹または始原細胞を選択するステップ；ｂ）少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；およびｃ）細胞を培養して細胞のＴ細胞への分化を誘導するステップを含み、ａ）、ｂ）および／またはｃ）が、細胞を、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞の集団と接触させるステップを含まない、方法に関する。一部の実施形態では、ｃ）において、細胞は、フィーダーフリーである培地中で培養される。一部の実施形態では、幹または始原細胞は、ＣＤ３４^＋細胞を含む。一部の実施形態では、幹または始原細胞は、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＭＣＰ－４、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された。一部の実施形態では、幹または始原細胞は、レトロネクチン、ＤＬＬ４、ＤＬＬ１、および／またはＶＣＡＭ１でコーティングされた表面で培養された。一部の実施形態では、細胞は、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－３、５～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．５～５ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、ＩＬ－６、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、ＥＰＯ、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、および／または１０～１００ｎｇ／ｍｌのｈＦＬＴ３Ｌのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された。一部の実施形態では、細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－３、２０～２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、ＩＬ－６、１５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、ＥＰＯ、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、および／または５０ｎｇ／ｍｌのｈＦＬＴ３Ｌのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された。一部の実施形態では、細胞は、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数とともに１２～７２時間、培養された。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ｉＮＫＴＴＣＲを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲは、抗原特異的（例えば、がん抗原特異的）ＴＣＲを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を特異的に認識するＴＣＲを含む。一部の実施形態では、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５}を含む。一部の実施形態では、ｃ）は、分化および／または増幅培地中で細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、ｃ）は、細胞をＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数と接触させることを含む。一部の実施形態では、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数は、組織培養プレートまたはマイクロビーズ表面にコーティングされる。一部の実施形態では、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数は、０．１～１０μｇ／ｍｌのＤＬＬ４と０．０１～１μｇ／ｍｌのＶＣＡＭ１とを含むコーティング組成物を使用して組織培養プレートにコーティングされる。一部の実施形態では、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数は、０．５μｇ／ｍｌのＤＬＬ４と０．１μｇ／ｍｌのＶＣＡＭ１とを含むコーティング組成物を使用してコーティングされる。一部の実施形態では、増幅または分化培地は、イスコフＭＤＭ、血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン、および／または２－メルカプトエタノールのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、増幅または分化培地は、アスコルビン酸、ヒト血清、Ｂ２７サプリメント、グルタマックス、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－７、ＭＣＰ－４、ＩＬ－６、ＴＰＯ、およびＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、増幅または分化培地は、５０～５００μＭアスコルビン酸、ヒト血清、１～１０％Ｂ２７サプリメント、０．１～１０％グルタマックス、２～５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ、２～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．１～１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、０～１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、および１．５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、増幅または分化培地は、１００μＭアスコルビン酸、ヒト血清、４％Ｂ２７サプリメント、１％グルタマックス、２～５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ、２～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．１～１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、０～１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、および１．５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を刺激および／または増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、細胞を刺激または増幅するステップは、細胞を、ＴＣＲに特異的に結合する抗原と接触させることを含む。一部の実施形態では、細胞を刺激または増幅するステップは、細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２および／もしくは抗ＣＤ２８抗体、またはその抗原結合断片と接触させることを含む。一部の実施形態では、これらの実施形態では、細胞を刺激または増幅するステップは、増幅培地中で細胞を培養することを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞をα－ＧＣと接触させることにより細胞を刺激および／または増幅するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞をＩＬ－１５およびＩＬ－７の一方または両方と接触させるステップをさらに含み、および／またはこれらの実施形態では、増幅培地は、ＩＬ－１５またはＩＬ－７の一方または両方を含む。一部の実施形態では、増幅培地は、５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および／または５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態では、増幅培地は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および／または５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を、ヒト血清抗体、グルタマックス、緩衝剤、抗菌剤、およびＮ－アセチル－Ｌ－システインのうちの１つまたは複数と接触させるステップをさらに含み、および／またはこれらの実施形態では、増幅培地は、ヒト血清抗体、グルタマックス、緩衝剤、抗菌剤、およびＮ－アセチル－Ｌ－システインのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８コーティングビーズと接触させることにより、細胞を活性化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ＣＡＲ分子および／またはＨＬＡ－Ｅ遺伝子を含む核酸を細胞に移入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子および／またはＨＬＡ－Ｅ遺伝子を含む核酸は、レトロウイルス感染により細胞に移入される。一部の実施形態では、核酸分子は、ＣＡＲ分子を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＮＹ－ＥＳＯに対して特異的である。一部の実施形態では、方法は、細胞をレトロネクチンと接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、または方法全体は、細胞をフィーダー細胞の集団と接触させるステップを含まない。一部の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、または方法全体は、細胞を間質細胞の集団と接触させるステップを含まない。一部の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、または方法全体は、細胞をノッチリガンドともその断片とも接触させるステップを含まない。

さらなる実施形態は、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、または操作されたｉＮＫＴ細胞の集団に関する。したがって、本開示の態様は、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、高レベルのＮＫＧ２Ｄ；ＫＩＲの低発現または検出不可能な発現；および高レベルのグランザイムＢのうちの１つまたは複数を含む、操作されたｉＮＫＴ細胞に関する。さらなる態様は、少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲを発現する、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団であって、高レベルのＮＫＧ２Ｄを有する少なくとも５０％の細胞、高レベルのＫＩＲを有する２％未満の細胞、高レベルのグランザイムＢを有する少なくとも６７％の細胞のうちの１つまたは複数を含む、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団に関する。さらなる態様は、本開示のｉＮＫＴ細胞を調製する方法であって、ａ）複数の造血幹または始原細胞からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；ｂ）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；およびｃ）細胞を培養して細胞のｉＮＫＴ細胞への分化を誘導するステップを含む方法に関する。

なおさらなる態様は、本開示の方法により産生される、細胞または細胞の集団に関する。操作された細胞（例えば、操作されたＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞など）で患者を処置する方法であって、患者に本開示の細胞または細胞の集団を投与するステップを含む方法も、提供される。さらなる態様は、患者におけるがんを処置する方法であって、本開示の細胞を投与するステップを含む方法に関する。追加の態様は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するための方法であって、本開示の細胞を投与するステップを含む方法に関する。

一部の実施形態では、細胞の集団は、高レベルのＮＫＧ２Ｄを有する少なくとも、多くとも、または約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は、高レベルのＫＩＲを有する０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０％未満、多くとも、少なくともまたはおよそ前記％（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）の細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団は、高レベルのグランザイムＢを有する５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％未満、多くとも、少なくともまたはおよそ前記％（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）の細胞を含む。本明細書に記載される細胞マーカーについての用語「高」または「低」レベルまたは発現は、ｉＮＫＴ細胞でも、天然に存在するＴ細胞でも、天然に存在するｉＮＫＴでも、本明細書に記載される細胞型でもない、Ｔ細胞との比較におけるものであり得る。

一部の実施形態では、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的に結合する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的に結合する。一部の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｅの外因性発現をさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、自殺遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＡＲおよび／またはｉＮＫＴＴＣＲのすべてまたは断片を含むポリペプチドをコードする外来性核酸をさらに含む。一部の実施形態では、細胞のゲノムは、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された。一部の実施形態では、インバリアントＴＣＲ遺伝子産物は、アルファＴＣＲ遺伝子産物である。一部の実施形態では、インバリアントＴＣＲ遺伝子産物は、ベータＴＣＲ遺伝子産物である。一部の実施形態では、アルファＴＣＲ遺伝子産物とベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される。一部の実施形態では、外来性自殺遺伝子産物もしくはＨＬＡ－Ｅ遺伝子産物および／または外来性核酸は、細胞における発現のために最適化された１つまたは複数のコドンを有する。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、チトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９である。一部の実施形態では、自殺遺伝子は、酵素に基づいている。一部の実施形態では、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする。一部の実施形態では、ＴＫ遺伝子は、ウイルスＴＫ遺伝子である。一部の実施形態（som embodiments）では、ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物は、基質により活性化される。一部の実施形態では、基質は、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である。

一部の実施形態では、細胞を培養して細胞のｉＮＫＴ細胞への分化を誘導するステップは、フィーダーフリーである培養を含む。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲは、α－ＧＣに特異的に結合する。一部の実施形態では、方法は、細胞を、ｉＮＫＴＴＣＲに特異的に結合する抗原と接触させることにより、細胞を刺激および／または増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、細胞をα－ＧＣと接触させることにより細胞を刺激および／または増幅するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞をＩＬ－１５と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を、ヒト血清抗体、グルタマックス、緩衝剤、抗菌剤、およびＮ－アセチル－Ｌ－システインのうちの１つまたは複数と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、細胞を抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８コーティングビーズと接触させることにより、細胞を活性化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ＣＡＲ分子および／またはＨＬＡ－Ｅ遺伝子を含む核酸を細胞に移入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子および／またはＨＬＡ－Ｅ遺伝子を含む核酸は、レトロウイルス感染により細胞に移入される。一部の実施形態では、方法は、細胞をレトロネクチンと接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞は、健康な対象、および／またはがんを有さない対象から単離される。一部の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、または方法全体は、細胞をフィーダー細胞の集団と接触させるステップを含まない。一部の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、または方法全体は、細胞を間質細胞の集団と接触させるステップを含まない。一部の実施形態では、ａ、ｂ、ｃ、または方法全体は、細胞をノッチリガンドともその断片とも接触させるステップを含まない。

本開示のさらなる態様は、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、ａ）細胞外結合ドメイン、ｂ）単一の膜貫通ドメインおよびｃ）一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一の細胞質領域を含むキメラ細胞受容体（ＣＡＲ）とを発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、操作されたｉＮＫＴ細胞に関する。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＢＣＭＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＣＤ１９結合ドメインを含む。

さらなる態様は、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、ａ）複数の造血幹または始原細胞からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；ｂ）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；ｃ）単離されたヒトＣＤ３４^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるステップ；ｄ）ｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４^＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生するステップ；およびｅ）ＣＡＲをコードする核酸をｉＮＫＴ細胞に導入するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ－ＣＡＲである。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９－ＣＡＲである。

さらなる態様は、がんを有する患者におけるがんを処置する方法であって、患者に、本開示の操作されたｉＮＫＴ細胞または細胞の集団を投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、がんは、リンパ腫である。一部の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫である。他の実施形態では、がんは、本明細書に記載されるがんである。

一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサーをさらに含む。一部の実施形態では、スペーサーは、ＣＤ８ヒンジを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８からの膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞質領域は、共刺激ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、４－１ＢＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子は、配列番号７２を含む。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８３を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号８２を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号８４を含む。一部の実施形態では、共刺激ドメインは、配列番号８５を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８６を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子は、自己切断ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、配列番号８７を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ分子は、治療対照をさらに含む。一部の実施形態では、治療対照は、ＥＧＦＲを含む。一部の実施形態では、治療対照は、短縮型ＥＧＦＲを含む。一部の実施形態では、治療対照は、ＣＡＲ分子から切断される。

一部の実施形態では、ＣＡＲ分子をコードする核酸は、組換えベクターを使用して細胞に導入される。一部の実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを含む。

細胞に関連して論じられるいずれの実施形態も、そのような細胞の集団に適用することができる。特定の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、次のうちの１つ、２つ、および／または３つを含む核酸を含む：ｉ）インバリアントアルファＴ細胞受容体コード配列のすべてもしくは一部；ｉｉ）インバリアントベータＴ細胞受容体コード配列のすべてもしくは一部；またはｉｉｉ）自殺遺伝子。さらなる実施形態には、核酸を含む操作されたｉＮＫＴ細胞であって、核酸が、ｉ）インバリアントアルファＴ細胞受容体のすべてもしくは一部、ｉｉ）インバリアントベータＴ細胞受容体のすべてもしくは一部、および／またはｉｉｉ）自殺遺伝子産物をコードする配列を有する、操作されたｉＮＫＴ細胞がある。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、異種プロモーターの制御下にある核酸を含み、これは、このプロモーターが、核酸の転写を制御するゲノムプロモーターと同じゲノムプロモーターでないことを意味する。操作されたｉＮＫＴ細胞は、１つまたは複数のコード配列を含む外来性核酸を含み、これらの一部またはすべてが、本明細書に記載される多くの実施形態では異種プロモーターの制御下にあると、考えられる。

ＣＡＲ実施形態、特定の細胞実施形態、または細胞集団実施形態に関連して論じられる任意の実施形態を、任意の他のＣＡＲ、細胞または細胞集団実施形態について利用することができることに、特に留意されたい。さらに、特定の方法に関連して利用される任意の実施形態を、本明細書に記載される任意の他の方法に関連して実施することができる。さらに、本明細書に記載される異なる方法の態様を組み合わせて、他の方法を達成すること、および任意の細胞もしくは細胞集団を作出することまたは任意の細胞もしくは細胞集団の使用を説明することができる。特に、１つまたは複数の実施形態の態様を本明細書に記載される１つまたは複数の他の実施形態の態様と組み合わせることができると考えられる。さらに、本明細書に記載される任意の方法は、本明細書に記載される細胞または細胞集団についての１つまたは複数の使用を示すように表現されることがある。例えば、操作されたｉＮＫＴ細胞またはｉＮＫＴ細胞集団の使用が、本明細書に記載される任意の方法から示されることもある。

特定の実施形態には、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラーＴ細胞受容体（ｉＮＫＴＴＣＲ）を発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、操作されたｉＮＫＴ細胞がある。一部の実施形態では、細胞または細胞の集団は、外来性自殺遺伝子産物、または自殺遺伝子をコードする核酸をさらに含む。ｉＮＫＴＴＣＲは、「ＣＤ１ｄ分子により提示される脂質抗原を認識するＴＣＲ」を指す。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲは、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）に特異的に結合する。このｉＮＫＴＴＣＲは、アルファ－ＴＣＲ、ベータ－ＴＣＲ、または両方を含み得る。一部の場合には、利用されるＴＣＲは、ＨＳＣ操作ＭＡＩＴ細胞、ＧＥＭ細胞、またはガンマ／デルタＴ細胞をそれぞれもたらす、ＭＡＩＴ細胞ＴＣＲ、ＧＥＭ細胞ＴＣＲ、またはガンマ／デルタＴＣＲなどの、「インバリアントＴＣＲ」のより広い群に属し得る。

ある特定の実施形態には、操作されたｉＮＫＴ細胞およびＴ細胞集団がある。特定の実施形態には、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたｉＮＫＴまたは他のＴ細胞集団があり、これには、インバリアントＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする変更されたゲノムＴ細胞受容体配列または外来性核酸のどちらかを含み、１つまたは複数のＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現を欠いている、操作されたクローン細胞が含まれる。「変更されたゲノムＴ細胞受容体配列」は、組換えＤＮＡ技術により変更された配列を意味する。用語「クローン」細胞は、クローントランスジェニックＴＣＲを発現するように操作された細胞を指す。一部の実施形態では、クローン細胞は、同じ始原細胞からのものである。一部の実施形態には、混合クローン細胞の集団があると考えられ、混合クローン細胞の集団ということは、集団が、１セットの始原細胞からのものであるクローン細胞を含むことを意味し、このセットは、１０、２０、３０、４０、５０、６０７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個のまたはそれより多い始原細胞（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）であることもあり、少なくとも前記数の始原細胞であることもあり、または多くとも前記数の始原細胞であることもあり、集団が、そのようなクローン細胞を含むということは、集団内の細胞が、最初にトランスフェクトした／感染させた始原細胞のセットの子孫であることを意味する。外来性核酸または変更されたゲノムＤＮＡ配列を含む細胞の場合、クローン細胞は、外来性核酸が導入された原細胞から生じ得る。一部の実施形態は、クローン細胞の集団に関し、クローン細胞の集団ということは、集団が、同じ原細胞から生じた子孫細胞を含むことを意味する。細胞の一部の集団は、異なるクローン細胞の混合物を含有し得ると考えられ、異なるクローン細胞の混合物を含有し得るということは、外来性核酸を含有する、しかし外来性核酸の組込み部位などの識別可能な点で異なり得る、異なる原細胞から、この集団が生じたことを意味する。細胞に（単独で、またはより長い核酸配列の一部として）導入された核酸配列であって、組み込まれた核酸配列を子孫細胞が含有するように組み込まれることになる核酸配列は、外来性核酸と見なされる。染色体外に維持される導入された核酸配列もまた、外来性核酸と見なされる。

アルファＴ細胞受容体の一部またはベータＴ細胞受容体の一部が利用される実施形態では、実施形態は、アルファＴ細胞受容体の機能的な部分またはベータＴ細胞受容体の機能的な部分を含み、したがって、それらの両方を発現する細胞は、ＣＤ１ｄ分子により提示される脂質抗原を認識する能力を評価するアッセイに少なくとも基づいて、機能的なＴ細胞であると考えられる。

一部の実施形態では、核酸は、ｉＮＫＴＴＣＲ－アルファまたはｉＮＫＴＴＣＲ－ベータポリペプチドの５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００個（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）のアミノ酸または連続するアミノ酸残基をコードする配列と、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）同一である、少なくとも前記％同一である、または多くとも前記％同一である、配列を含む。

ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、酵素に基づいており、酵素に基づいているということは、自殺遺伝子の遺伝子産物が酵素であること、および自殺機能が酵素活性に依存することを意味する。１つまたは複数の自殺遺伝子を単一の細胞またはクローン集団で利用することができる。一部の実施形態では、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、チトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９をコードする。自殺遺伝子利用のための当技術分野における方法、例えば、米国特許第８６２８７６７号、米国特許出願公開第２０１４０３６９９７９号、同第２０１４０２４２０３３号および同第２００４００１４１９１号における方法を用いることができ、これらの参考特許文献のすべては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらなる実施形態では、ＴＫ遺伝子は、ウイルスＴＫ遺伝子、すなわち、ウイルスからのＴＫ遺伝子である。特定の実施形態では、ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物は、基質により活性化される。チミジンキナーゼは、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体により活性化される、自殺遺伝子産物である。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子産物を活性化する基質は、検出されるように標識される。一部の事例では、イメージングのために標識され得る基質。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＴＣＲ－アルファまたはＴＣＲ－ベータの一方または両方をコードする同じまたは異なる核酸分子によりコードされ得る。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である。代替実施形態では、細胞は、外来性自殺遺伝子を発現しない。

追加の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いているか、または表面発現が低下している。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現の欠如は、個々のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子をコードする遺伝子を破壊することにより、またはすべてのＨＬＡ－Ｉ複合体分子の共通成分であるＢ２Ｍ（ベータ２ミクログロブリン）をコードする遺伝子を破壊することにより、またはすべてのＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現を制御する必要不可欠な転写因子であるＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子）をコードする遺伝子を破壊することにより、達成される。特定の実施形態では、細胞は、１つもしくは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／もしくはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いているか、または５０、６０、７０、８０、９０、１００％（もしくは少なくとも前記％）（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）低下したレベルのそのような分子を発現する。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩは、ｉＮＫＴ細胞には、これらの細胞が遺伝子編集により操作されたため、発現されない。一部の実施形態では、関与した遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９である。Ｃａｓ９の代わりに、ＣａｓＸまたはＣａｓＹが関与することもある。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬＥＮ、ならびにＣｐｆ１は、他の遺伝子編集技術であり、これらのすべてを利用することができる。他の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子、Ｂ２Ｍおよび／またはＣＩＩＴＡの発現を低下させることを目的として、１つまたは複数の異なるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を含む。

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞に導入された組換えベクターまたは組換えベクターからの核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクターである、またはあった。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスもしくはアデノウイルスである、またはあった。ある特定のウイルスベクターの核酸が宿主ゲノム配列に組み込まれることは、理解されよう。

一部の実施形態では、細胞は、動物の血清を含む培地に曝露されなかった。さらなる実施形態では、細胞は、凍結されている、またはされた。一部の実施形態では、細胞は、事前に凍結されており、この場合、細胞は、少なくとも１時間、室温で安定している。一部の実施形態では、細胞は、事前に凍結されており、この場合、細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０時間（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）、室温で安定している。

ある特定の実施形態では、溶液中の細胞または細胞の集団は、デキストロース、１つもしくは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む。さらなる実施形態では、細胞は、無菌、非化膿性、および等張性である溶液中にある。

ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、活性化された、またはされる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ｉＮＫＴ細胞であり、この場合、ｉＮＫＴ細胞は、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化された。

複数の細胞を伴う実施形態では、細胞集団は、約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５個またはそれより多く（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）の細胞を含むことがあり、少なくとも前記数の細胞を含むことがあり、または多くとも前記数の細胞を含むことがあり、これらの細胞は、一部の実施形態では操作されたｉＮＫＴ細胞である。一部の場合には、細胞集団は、少なくとも約１０^６～１０^１２個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む。一部の実施形態では、これらの数を有する細胞の集団は、細胞の単一のバッチから産生され、別々に産生された細胞のバッチをプールした結果ではないと、考えられる。

特定の実施形態には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とチミジンキナーゼ自殺遺伝子産物とをコードする１つまたは複数の外来性核酸を含むクローン細胞を含み、クローン細胞が、機能的なベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、および／またはクラスＩＩ、主要組織適合遺伝子複合体、もしくはトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）を発現しないように操作されたものである、ｉＮＫＴ細胞などのＴ細胞集団であって、合計少なくとも約１０^６～１０^１２個の細胞であり、少なくとも約１０^２～１０^６個の操作された細胞を含む、Ｔ細胞集団がある。ある特定の事例では、細胞は、溶液中で凍結されている。

多数の実施形態は、Ｔ細胞または細胞の集団、特に、一部またはすべての細胞がクローンである集団を、調製する方法に関する。ある特定の実施形態では、細胞集団は、細胞の少なくともまたは多くとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）がクローンである、細胞、すなわち、集団内の別の細胞と同じ原細胞に由来した前記パーセンテージの細胞を含む。他の実施形態では、細胞の集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）の異なる親細胞から、少なくとも前記数の異なる親細胞から、または多くとも前記数の異なる親細胞から生じる、細胞から構成される、細胞集団を含む。

操作されたＴ細胞および細胞集団を調製、作製、製造および／または使用するための方法が提供される。方法は、実施形態では以下のステップのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くを含む：造血細胞を得るステップ；造血始原細胞を得るステップ；１つまたは複数の造血細胞になることができる始原細胞を得るステップ；ｉＮＫＴ細胞などの、Ｔ細胞になることができる始原細胞を得るステップ；１つまたは複数の細胞表面マーカーを使用して混合細胞の集団から細胞を選択するステップ；細胞の集団からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；細胞の集団からＣＤ３４^＋細胞を単離するステップ；ＣＤ３４^＋およびＣＤ３４^－細胞を互いに分離するステップ；ＣＤ３４以外のまたはＣＤ３４に加えて細胞表面マーカーに基づいて細胞を選択するステップ；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を細胞に導入するステップ；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするウイルスベクターに細胞を感染させるステップ；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を細胞にトランスフェクトするステップ；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする発現構築物を細胞にトランスフェクトするステップ；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外来性核酸を細胞のゲノムに組み込むステップ；自殺遺伝子産物をコードする１つまたは複数の核酸を細胞に導入するステップ；自殺遺伝子産物をコードするウイルスベクターに細胞を感染させるステップ；自殺遺伝子産物をコードする１つまたは複数の核酸を細胞にトランスフェクトするステップ；自殺遺伝子産物をコードする発現構築物を細胞にトランスフェクトするステップ；自殺遺伝子産物をコードする外来性核酸を細胞のゲノムに組み込むステップ；遺伝子編集のために１つもしくは複数のポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする１つまたは複数の核酸を細胞に導入するステップ；遺伝子編集のために１つもしくは複数のポリペプチドおよび／または核酸分子をコードするウイルスベクターに細胞を感染させるステップ；遺伝子編集のために１つもしくは複数のポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする１つまたは複数の核酸を細胞にトランスフェクトするステップ；遺伝子編集のために１つもしくは複数のポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする発現構築物を細胞にトランスフェクトするステップ；遺伝子編集のために１つもしくは複数のポリペプチドおよび／または核酸分子をコードする外来性核酸を組み込むステップ；細胞のゲノムを編集するステップ；細胞のプロモーター領域を編集するステップ；ＴＣＲ遺伝子のためのプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を編集するステップ；１つまたは複数の遺伝子の発現を消失させるステップ；単離されたヒトＣＤ３４^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の発現を消失させるステップ；遺伝子編集のために１つまたは複数の核酸を細胞にトランスフェクトするステップ；単離または選択された細胞を培養するステップ；単離または選択された細胞を増幅するステップ；１つまたは複数の細胞表面マーカーのために選択された細胞を培養するステップ；ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４^＋細胞を培養するステップ；単離されたＣＤ３４^＋細胞を増幅するステップ；ｉＮＫＴ細胞を産生または増幅する条件下で細胞を培養するステップ；フィーダーフリー系で細胞を培養するステップ；人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で細胞を培養してＴ細胞を産生するステップ；無血清培地中で細胞を培養するステップ；ＡＴＯ系で細胞を培養するステップであって、ＡＴＯ系が、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体と無血清培地とを含む、ステップ。ある実施形態では１つまたは複数のステップを含まないことがあると、特に考えられる。

一部の実施形態には、クローンまたは操作されたＢＣＭＡ－ＣＡＲｉＮＫＴ細胞の集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；ｂ）ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；ｃ）単離されたヒトＣＤ３４^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の表面発現を消失させるステップ；およびｄ）ｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４^＋細胞を人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養して、ｉＮＫＴ細胞を産生するステップ；およびｅ）ＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする核酸をｉＮＫＴ細胞に導入するステップを含み、ＡＴＯ系が、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体と無血清培地とを含む、方法がある。

一部の実施形態では、方法は、細胞を、細胞集団の増幅に十分な量のＩＬ－１５と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞を作製するために使用される幹もしくは始原細胞またはＣＤ３４^＋細胞は、５×１０^８個未満の細胞を含む。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞を作製するために使用される幹もしくは始原細胞またはＣＤ３４^＋細胞は、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、９×１０^１３、１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、９×１０^１４、１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、９×１０^１５、１×１０^１６、２×１０^１６、３×１０^１６、４×１０^１６、５×１０^１６、６×１０^１６、７×１０^１６、８×１０^１６、もしくは９×１０^１６個未満またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲の細胞を含む。

本開示の一部の実施形態では、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、または６００（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）の用量が、本開示の方法により産生される。一部の実施形態では、各用量は、１×１０^７～１×１０^９個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む。一部の実施形態では、各用量は、少なくとも、多くとも、または正確に１×１０^４、２×１０^４、３×１０^４、４×１０^４、５×１０^４、６×１０^４、７×１０^４、８×１０^４、９×１０^４、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、９×１０^１３、１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、９×１０^１４、１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、９×１０^１５、１×１０^１６、２×１０^１６、３×１０^１６、４×１０^１６、５×１０^１６、６×１０^１６、７×１０^１６、８×１０^１６、または９×１０^１６個（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）の細胞を含む。一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞を作出するために使用され得る細胞は、造血始原幹細胞である。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、またはこれらの組み合わせからのものであり得る。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、造血幹細胞に由来する。一部の実施形態では、細胞は、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋細胞に由来する。一部の実施形態では、細胞は、がんを有さないヒト患者からの細胞に由来する。一部の実施形態では、細胞は、内在性ＴＣＲを発現しない。

一部の実施形態では、方法は、ＣＤ３４^－細胞を単離するステップ、またはＣＤ３４^－細胞とＣＤ３４^＋細胞を分離するステップを含む。実施形態は、ＣＤ３４^＋細胞を操作するステップをさらに伴うが、ＣＤ３４^－細胞がｉＮＫＴ細胞の作出に使用され得る。したがって、一部の実施形態では、その後、ＣＤ３４^－細胞が使用され、この目的のために役立ち得る。

ある特定の実施形態は、選択されたＣＤ３４^＋細胞を培地中で培養するステップを、１つまたは複数の核酸を細胞に導入するステップの前に伴う。細胞を培養するステップは、選択されたＣＤ３４^＋細胞を、１つまたは複数の増殖因子を含む培地とともにインキュベートすることを含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の増殖因子は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む。さらなる実施形態では、培地は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、およびＴＰＯを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の増殖因子の濃度は、各増殖因子、またはこれらの特定の増殖因子のいずれかおよびすべての合計のどちらかについて、約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間である。培地中の成分の濃度または複数の成分の組合せの濃度は、約、少なくとも約、または多くとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００（または任意の導出可能な範囲）ｎｇ／ｍｌもしくはμｇ／ｍｌであることもあり、またはこれを超えることもある。

一部の実施形態では、核酸は、本明細書中で論じられるように、α－ＴＣＲおよび／またはβ－ＴＣＲをコードする核酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、１つの核酸は、α－ＴＣＲとβ－ＴＣＲの両方をコードする。追加の実施形態では、核酸は、自殺遺伝子産物をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、選択されたＣＤ３４^＋細胞に導入される核酸は、α－ＴＣＲ、β－ＴＣＲ、および自殺遺伝子産物をコードする。他の実施形態では、方法は、自殺遺伝子産物をコードする核酸を、選択されたＣＤ３４^＋細胞に導入するステップも伴い、この場合、ＴＣＲ遺伝子のうちの少なくとも１つをコードする核酸とは異なる核酸分子が、自殺遺伝子産物をコードする。

既述の通り、一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、細胞表面にＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩを発現せず、これを、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）またはＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより達成することができる。ある特定の実施形態では、方法は、単離されたヒトＣＤ３４^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を消失させるステップを伴う。特定の実施形態では、発現を消失させるステップを、細胞のゲノムＤＮＡの遺伝子編集によって遂行することができる。一部の方法は、ＣＲＩＳＰＲ、およびＢ２ＭまたはＣＩＩＴＡに対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、細胞に導入するステップを含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲまたは１つもしくは複数のｇＲＮＡは、電気穿孔または脂質媒介トランスフェクションにより細胞にトランスフェクトされる。その結果として、方法は、ＣＲＩＳＰＲと１つまたは複数のｇＲＮＡとをコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることにより、ＣＲＩＳＰＲおよび１つまたは複数のｇＲＮＡを細胞に導入するステップを伴い得る。一部の実施形態では、異なる遺伝子編集技術が利用され得る。

同様に、一部の実施形態では、ＴＣＲ受容体をコードする１つまたは複数の核酸が細胞に導入される。この導入は、細胞に組換えベクターをトランスフェクトすること、または細胞を組換えベクターに感染させることにより行なわれ、この組換えベクターは、本明細書中で論じられるようなウイルスベクターであってもよく、またはなくてもよい。一部の実施形態では、外来性核酸が細胞のゲノムに組み込まれ得る。

一部の実施形態では、細胞は、無血清培地中で培養される。ある特定の実施形態では、無血清培地は、外部から添加されたアスコルビン酸をさらに含む。特定の実施形態では、方法は、アスコルビン酸培地を添加するステップを伴う。さらなる実施形態では、無血清培地は、外部から添加された次の成分のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６すべて（またはこれらの中から導出可能な範囲）をさらに含む：ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン、またはミッドカイン。追加の実施形態では、無血清培地は、１つまたは複数のビタミンを含む。一部の場合には、無血清培地は、次のビタミンのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２（またはこれらの中から導出可能な範囲）を含む：ビオチン、酢酸ＤＬアルファ－トコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、またはこれらの塩。ある特定の実施形態では、培地は、ビオチン、酢酸ＤＬアルファ－トコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、またはこれらの組合せもしくは塩を含む、あるいは少なくともそれらを含む。追加の実施形態では、無血清培地は、１つまたは複数のタンパク質を含む。一部の実施形態では、無血清培地は、次のタンパク質のうちの１、２、４、５、６またはそれより多く（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）を含む：アルブミンもしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジムスターゼ、またはこれらの組合せ。他の実施形態では、無血清培地は、次の化合物のうちの１、２、３、４、５、、７、８、９、１０または１１を含む：コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレイン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、もしくはトリヨード（triodo）－Ｉ－チロニン、またはこれらの組合せ。さらなる実施形態では、無血清培地は、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ－２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはこれらの組合せを含む。追加の実施形態では、無血清培地は、アミノ酸、単糖類、および／もしくは無機イオンを含む、またはこれらをさらに含む。一部の態様では、無血清培地は、次のアミノ酸のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３を含む：アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、もしくはバリン、またはこれらの組合せ。他の態様では、無血清培地は、次の無機イオンのうちの１、２、３、４、５または６つを含む：ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、もしくはリン、またはこれらの組合せもしくは塩。追加の態様では、無血清培地は、次の元素のうちの１、２、３、４、５、６または７つを含む：モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、もしくはマンガン、またはこれらの組合せ。

一部の方法では、細胞は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養される。ＡＴＯ系は、細胞の凝集体である、三次元（３Ｄ）細胞凝集体を伴う。ある特定の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む。一部の実施形態では、３Ｄ細胞凝集体は、物理的マトリックスまたは足場上でＣＤ３４^＋形質導入細胞を間質細胞の選択された集団と混合することにより作出される。さらなる実施形態では、方法は、ＣＤ３４^＋形質導入細胞および間質細胞を遠心分離して、物理的マトリックスまたは足場上に置かれている細胞ペレットを形成するステップを含む。ある特定の実施形態では、間質細胞は、無傷、部分的もしくは改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、またはこれらの組合せである、ノッチリガンドを発現する。さらなる実施形態では、ノッチリガンドは、ヒトノッチリガンドである。他の実施形態では、ノッチリガンドは、ヒトＤＬＬ１である。一部の方法では、細胞は、ＡＴＯ系で培養されない。一部の実施形態では、細胞は、フィーダーフリー系で培養される。

さらなる態様では、間質細胞とＣＤ３４^＋細胞との比は、約、少なくとも約、または多くとも約５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）である。特定の実施形態では、間質細胞とＣＤ３４^＋細胞との比は、約１：５～１：２０である。特定の実施形態では、間質細胞は、マウス間質細胞系、ヒト間質細胞系、初代間質細胞の選択された集団、多能性幹細胞からｉｎｖｉｔｒｏで分化した間質細胞の選択された集団、またはこれらの組合せである。ある特定の実施形態では、間質細胞は、造血幹または始原細胞からｉｎｖｉｔｒｏで分化した間質細胞の選択された集団である。ＣＤ３４^＋細胞と間質細胞の共培養は、約、少なくとも約、または多くとも約１、２、３、４、５、６、７日および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４週間もしくはそれより多い週数（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）にわたって行なわれ得る。間質細胞は、一部の実施形態では共培養の前に照射される。

一部の実施形態では、方法で使用されるフィーダー細胞は、ＣＤ３４^－細胞を含む。これらのＣＤ３４^－細胞は、ＣＤ３４^＋細胞について選択された細胞の集団と同じ集団からのものであり得る。追加の実施形態では、細胞は、活性化され得る。ある特定の実施形態では、方法は、ｉＮＫＴ細胞を活性化するステップを含む。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化され、増幅された。細胞をα－ＧＣとともにインキュベートまたは培養して、それらの細胞を活性化および増幅することができる。一部の実施形態では、フィーダー細胞にα－ＧＣがパルス投与された。

一部の方法では、１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉまたは－ＩＩ分子の表面発現を欠いているｉＮＫＴ細胞が選択される。一部の態様では、ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いているｉＮＫＴ細胞の選択は、これらの細胞をレシピエント免疫細胞による枯渇から保護する。

細胞を直ちに使用することができ、または細胞を将来の使用のために保管することができる。ある特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞を作出するために使用される細胞は凍結され、さらに、一部の実施形態では、産生されたｉＮＫＴ細胞が凍結され得る。一部の態様では、細胞は、デキストロース、１つもしくは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中にある。他の実施形態では、細胞は、無菌、非発熱性、および等張性である溶液中にある。

産生サイクルにより産生される細胞の数は、細胞約、少なくとも約、または多くとも約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５またはそれより多数（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）であり得、これらの細胞は、一部の実施形態では操作されたｉＮＫＴ細胞である。一部の場合には、細胞集団は、少なくとも約１０^６～１０^１２個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む。一部の実施形態では、これらの数を有する細胞の集団は、細胞の単一のバッチから産生され、別々に産生された細胞のバッチをプールした結果ではない、すなわち、単一の産生サイクルからのものである。

一部の実施形態では、細胞集団は、凍結され、次いで解凍される。これらの細胞集団を使用して、操作されたｉＮＫＴ細胞を作出することができ、またはこれらの細胞集団は、操作されたｉＮＫＴ細胞を含むことができる。

操作されたｉＮＫＴ細胞を使用して、患者を処置することができる。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の追加の核酸を細胞集団に導入するステップを含み、これらの細胞集団は、事前に凍結されて解凍されたものであってもよく、またはそのようなものでなくてもよい。この使用は、オフザシェルフｉＮＫＴ細胞を作出することの利点の１つを提供する。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の核酸は、１つまたは複数の治療用遺伝子産物をコードする。治療用遺伝子産物の例には、少なくとも以下のものが含まれる：１．抗原認識分子、例えば、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）および／またはＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）；２．共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ；および／または３．サイトカイン、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ；４．転写因子、例えば、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、ＲＯＲγｔ、ＦＯＸＰ３、およびＢｃｌ－６。治療用抗体が含まれ、キメラ抗原受容体、単鎖抗体、モノボディ、ヒト化された抗体、二重特異性抗体、単鎖ＦＶ抗体またはこれらの組合せも含まれる。

一部の実施形態には、操作されたインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞を含む細胞集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；ｂ）ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンドおよびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む増殖因子を含む培地でＣＤ３４^＋細胞を培養するステップ；ｃ）選択されたＣＤ３４^＋細胞に、α－ＴＣＲと、β－ＴＣＲと、チミジンキナーゼと、ｓｒ３９ＴＫなどの自殺遺伝子とをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターで、形質導入するステップ；ｄ）選択されたＣＤ３４^＋細胞に、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはＣＴＩＩＡのためのＣａｓ９およびｇＲＮＡを導入して、Ｂ２Ｍおよび／またはＣＴＩＩＡの発現を妨害するステップ；ｅ）形質導入細胞を、外来性ノッチリガンドを発現する照射された間質細胞系とともに、２～１２（例えば、２～１０または６～１２）週間、３Ｄ凝集細胞培養で培養して、ｉＮＫＴ細胞を増幅するステップ；ｆ）ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いているｉＮＫＴ細胞を選択するステップ；およびｇ）選択されたｉＮＫＴ細胞を、α－ＧＣがロードされた照射されたフィーダー細胞とともに培養するステップを含む、方法がある。

一部の実施形態には、ａ）ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；ｂ）ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンドおよびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む増殖因子を含む培地でＣＤ３４^＋細胞を培養するステップ；ｃ）選択されたＣＤ３４^＋細胞に、α－ＴＣＲと、β－ＴＣＲと、チミジンキナーゼと、レポーター遺伝子産物とをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターで、形質導入するステップ；ｄ）選択されたＣＤ３４^＋細胞に、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）またはＣＴＩＩＡのためのＣａｓ９およびｇＲＮＡを導入して、Ｂ２Ｍおよび／またはＣＴＩＩＡの発現を消失させるステップ；ｅ）形質導入細胞を、外来性ノッチリガンドを発現する照射された間質細胞系とともに、２～１０週間、３Ｄ凝集細胞培養で培養して、ｉＮＫＴ細胞を増幅するステップ；ｆ）Ｂ２Ｍおよび／またはＣＴＩＩＡの発現を欠いているｉＮＫＴ細胞を選択するステップ；およびｇ）選択されたｉＮＫＴ細胞を、照射されたフィーダー細胞とともに培養するステップを含む方法により産生された、操作されたｉＮＫＴ細胞がある。

本開示の方法は、本明細書に記載されるような、マーカーを発現し得る、または高もしくは低レベルのある特定のマーカーを有し得る、少なくとも１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、１×１０^１８、１×１０^１９、１×１０^２０、または１×１０^２１個（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）の細胞を含む、細胞の集団を産生することができる。細胞集団数は、マーカー発現に基づく細胞選別なしに、ＮＫマーカー発現に基づく細胞選別なしに、またはＴ細胞マーカー発現に基づく細胞選別なしに、得られる数であり得る。さらに、得られる細胞の集団は、ある特定の期間、例えば、短くとも、長くとも、または正確に１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１日または７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０週間（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）である期間内に作製される、少なくとも１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、１×１０^１８、１×１０^１９、１×１０^２０、または１×１０^２１個（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）の細胞を含む集団であり得る。ＮＫ活性化因子、阻害剤、または細胞傷害性分子などの、マーカーの高いまたは低い発現レベルは、ＦＡＣＳ解析による決定時に高度な発現に関連することがある。一部の実施形態では、高レベルとは、非ＮＫ細胞もしくは非ｉＮＫＴ細胞、またはＴ細胞でない細胞に対して相対的なものである。一部の実施形態では、高レベルまたは低レベルは、ＦＡＣＳ解析から決定される。

ｉＮＫＴ細胞または細胞集団で患者を処置する方法も提供される。ある特定の実施形態では、患者は、がんを有する。一部の実施形態では、患者は、がんまたはがん処置に関連する炎症または自己免疫が関与する疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者は、がんまたはがん処置に関連しない炎症または自己免疫が関与する疾患または状態を有する。特定の態様では、細胞または細胞集団は、患者に対して同種異系である。追加の実施形態では、患者は、細胞または細胞集団の拒絶反応または枯渇の徴候を示さない。一部の治療方法は、ｉＮＫＴ細胞を活性化する刺激分子（例えば、単独での、もしくはＡＰＣ上にロードされた、α－ＧＣ）、または自殺遺伝子産物を起動させる化合物を、患者に投与するステップをさらに含む。

一部の実施形態では、処置されることになるがんは、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、処置されることになるがんは、白血病である。一部の実施形態では、細胞は、がんを有さない患者に由来する。一部の実施形態では、方法は、追加の薬剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、追加の薬剤は、ＩＬ－６Ｒ抗体またはＩＬ－１Ｒアンタゴニストを含む。一部の実施形態では、ＩＬ－６Ｒ抗体は、トシリズマブを含み、またはＩＬ－１Ｒアンタゴニストは、アナキンラを含む。一部の実施形態では、追加の薬剤は、サイトカイン放出症候群の処置のためのサイトカインアンタゴニストを含む。一部の実施形態では、追加の薬剤は、コルチコステロイド、またはＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１Ｒ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ１ＢおよびＴＮＦ－アルファのうちの１つもしくは複数についての阻害剤を含む。一部の実施形態では、追加の薬剤は、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブまたはエマパルマブを含む。

一部の実施形態では、追加の薬剤は、外来性ｉＮＫＴＴＣＲなどのｉＮＫＴＴＣＲが特異的に結合する抗原を含む。

一部の実施形態では、抗原は、α－ＧＣを含む。一部の実施形態では、患者は、過去にがんの治療を受けたことがある。一部の実施形態では、過去の治療は、毒性であった、および／または有効でなかった。一部の実施形態では、患者は、過去のがん治療に応答して免疫関連有害事象のうちの少なくとも１、２、３、４または５つの有害事象を経験する。一部の実施形態では、過去の治療は、プロテアソーム阻害剤、免疫調節剤、抗ＣＤ３８抗体またはＣＡＲ－Ｔ細胞療法のうちの１つまたは複数を含む。

一部の実施形態（som embodiments）では、がんは、ＢＣＭＡ^＋悪性細胞を含む。一部の実施形態では、がんは、ＢＣＭＡ^＋悪性Ｂ細胞を含む。一部の実施形態では、がんは、ＣＤ１９^＋悪性細胞を含む。

ｉＮＫＴ細胞でのがん患者の処置は、患者への細胞または細胞集団の投与後にがん患者の腫瘍細胞を死滅させる結果となり得る。ｉＮＫＴ細胞と標準的な治療レジメンまたは他の免疫療法レジメンでの併用処置を利用することもできる。方法および組成物は、本明細書に記載される実施形態のいずれかの除外を含むことが企図されている。

本願を通して、用語「約」は、細胞および分子生物学の分野でのその明白かつ通常の意味に従って、値が、その値を決定するために利用されることになるデバイスまたは方法のための誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」という語の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つまたは複数（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ）」、および「１つ（ｏｎｅ）または１つ（ｏｎｅ）より多く」の意味とも合致する。

本明細書で使用される場合、用語「または」および「および／または」は、組み合わせて複数の成分を記述するために、または互いに排他的な複数の成分を記述するために用いられる。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は、単独での「ｘ」、単独での「ｙ」、単独での「ｚ」、「ｘ、ｙ、およびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指すことができる。ｘ、ｙ、またはｚは、ある実施形態から特異的に除外される可能性があることが、特に企図されている。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙ）」（および「として特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄａｓ）」を含む任意の形）、または含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）（ならびに含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）という語は、包括的または非限定的であり、追加の、挙げられていない要素または方法ステップを除外しない。

組成物およびそれらを使用するための方法は、本明細書を通して開示される構成成分またはステップのいずれか「を含む」、「から本質的になる」または「からなる」ことができる。「からなる」という句は、明記されていない任意の要素、ステップまたは構成成分を除外する。「から本質的になる」という句は、記載されている対象事項の範囲を、明記されている材料もしくはステップ、ならびにその基本的および新規特徴に著しい影響を及ぼさないものに、限定する。用語「を含む」の文脈で記載される実施形態は、用語「からなる」または「から本質的になる」の文脈で実施される可能性があることが企図されている。

本発明の１つの実施形態について論じられるいずれかの制限が、本発明のいずれかの他の実施形態に適用される可能性があることが、特に企図されている。さらに、本発明のいずれの組成物を本発明のいずれの方法で使用してもよく、本発明のいずれの方法を使用して、本発明の任意の組成物を産生してもまたは利用してもよい。実施例で示される実施形態の態様は、異なる実施例における他の箇所または本願における他の箇所で論じられる実施形態に関連して実施される可能性がある実施形態でもある。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、本発明の趣旨および範囲内での様々は変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および特定の例は、本発明の特定の実施形態を示すとはいえ、例示として与えられるものにすぎないことを、理解されたい。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数に対する参照によって、より良く理解され得る。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数に対する参照によって、より良く理解され得る。

図１は、オフザシェルフ汎用造血幹細胞（ＨＳＣ）で操作されたｉＮＫＴ（^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞養子療法の製造および使用の例の概略図を図示する。

図２Ａ～２Ｄは、ＢＬＴ（ヒト骨髄－肝臓－胸腺が移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^－／－マウス）ヒト化マウスモデルにおけるヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞の作製に関する。（Ａ）実験設計の例。（Ｂ）脾臓細胞のＦＡＣＳプロット。ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ：ＢＬＴマウスにおいて作製されたヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞。ｈＴＣ：ヒト従来型Ｔ細胞。図２Ｃ～２Ｄは、ｉｎｖｉｔｒｏ培養系において、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）におけるヒトＨＳＣで操作されたＮＹ－ＥＳＯ－１特異的従来型Ｔ細胞の作製を示す。（Ｃ）実験設計の例。（Ｄ）細胞収率（ｎ＝３～６）。^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。

図３Ａ～３Ｄは、健常者におけるヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞、およびｉｎｖｉｔｒｏ培養系における高収率の２段階のＡＴＯ－αＧＣの作製が存在する、初期ＣＭＣ研究を実証する（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞を、治療薬代替物として研究した）。ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ：ＡＴＯ培養において作製されたヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞。（Ａ）２段階のＡＴＯ－αＧＣのｉｎｖｉｔｒｏ培養系。ＡＴＯ：人工胸腺オルガノイド；αＧＣ：アルファ－ガラクトシルセラミド、ｉＮＫＴ細胞を特異的に刺激する強力なアゴニストリガンド。（Ｂ）ＡＴＯ培養段階におけるＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞の作製。６Ｂ１１は、ｉＮＫＴＴＣＲに特異的に結合するモノクローナル抗体である。（Ｃ）ＰＢＭＣ／αＧＣ培養段階におけるＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞の増幅。（Ｄ）ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞のアウトプット。同上。

図４Ａ～４Ｂは、ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性の初期薬理学的研究を提供する（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞およびＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞を、治療薬代替物として研究した）。（Ａ）表面ＦＡＣＳ染色。（Ｂ）細胞内ＦＡＣＳ染色。ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ：健康なドナーのＰＢＭＣ由来のｉｎｖｉｔｒｏで増幅された内在性ｉＮＫＴ細胞；ＰＢＭＣ－Ｔｃ：健康なドナーのＰＢＭＣ由来の内在性従来型Ｔ細胞。

図５Ａ～５Ｋは、ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞の腫瘍死滅有効性の初期有効性研究を提供する（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞およびＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞を、治療薬代替物として研究した）。（Ａ～Ｆ）血液がんモデル。（Ａ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系。（Ｂ）ｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍死滅アッセイ。（Ｃ）ｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍死滅のルシフェラーゼ活性の分析（ｎ＝３）。（Ｄ）ＮＳＧマウスヒトＭＭ転移モデルを使用するｉｎｖｉｖｏ腫瘍死滅アッセイ。（Ｅ～Ｆ）ｉｎｖｉｖｏ腫瘍死滅の生きている動物の生物発光イメージング（ＢＬＩ）分析。１４日目の代表的なＢＬＩ画像（Ｅ）、および全身発光の経時的な測定（ＴＢＬ；Ｆ）を示す（ｎ＝３～４）。（５Ｇ～５Ｋ）固形腫瘍モデル。（Ｇ）Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト黒色腫細胞系。（Ｈ）ＮＳＧマウスヒト黒色腫固形腫瘍モデルを使用するｉｎｖｉｖｏ腫瘍死滅アッセイ。（Ｉ）腫瘍重量（２５日目）。（Ｊ）腫瘍部位へのＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞の浸潤を示すＦＡＣＳプロット（２５日目）。（Ｋ）Ｊの定量化（ｎ＝４）。^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。同上。

図６Ａ～６Ｃは、毒性学／腫瘍形成性の初期安全性研究を示す（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞を治療薬代替物として研究した）。（Ａ）マウスの体重（ｎ＝９～１０）。ｎｓ、有意ではない、スチューデントのｔ検定による。（Ｂ）マウスの生存率（ｎ＝９～１０）。（Ｃ）マウスの病理学。さまざまな組織を収集し、ＵＣＬＡ病理コアによって分析した（ｎ＝９～１０）。

図７Ａ～７Ｄは、ＰＥＴイメージングおよび安全管理のためのｓｒ３９ＴＫ遺伝子の初期安全性研究を提供する（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞を治療薬代替物として研究した）。（Ａ）実験設計。（Ｂ）ＧＣＶ処置前および後のＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスのＰＥＴ／ＣＴ画像（ｎ＝４～５）。（Ｃ）ＧＣＶ処置後のＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞の有効かつ特異的な枯渇を示すＦＡＣＳプロット（ｎ＝４～５）。（Ｄ）ＣにおけるＦＡＣＳプロットの定量化（ｎ＝４～５）。ｎｓ、有意ではない；^＊＊Ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ検定による。

図８Ａ～８Ｅは、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を産生するための製造プロセスの例を図示する。（Ａ）実験設計。（Ｂ）ＨＳＣにおけるレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクター媒介ｉＮＫＴＴＣＲ発現。（Ｃ）ＨＳＣにおけるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体媒介ノックアウト。（Ｄ）ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ^ｎｅｇ細胞の２Ｍ２／Ｔｕ３９ｍＡｂ媒介ＭＡＣＳ陰性選択。（Ｅ）ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞の６Ｂ１１ｍＡｂ媒介ＭＡＣＳ陽性選択。同上。

図９Ａ～９Ｅは、作用機構（ＭＯＡ）研究の例を提供する。（Ａ）腫瘍を標的とするためのｉＮＫＴ細胞によって使用される可能性がある機構。（Ｂ～Ｃ）腫瘍細胞のＣＤ１ｄ／ＴＣＲ媒介直接死滅の研究。（Ｂ）実験設計。（Ｃ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞の死滅（ｎ＝３）。（Ｄ～Ｅ）ＮＫ細胞の活性化による腫瘍細胞のＣＤ１ｄ非依存性標的化の研究。（Ｄ）実験設計。（Ｅ）Ｋ５６２腫瘍細胞の死滅（ｎ＝２）。αＧＣがロードされた照射されたＰＢＭＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

図１０Ａ～１０Ｇは、安全性の考察を実証する。（Ａ）可能性のあるＧｖＨＤおよびＨｖＧ応答、ならびに操作された安全管理戦略。（Ｂ）ＧｖＨＤ応答の研究のためのｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ。（Ｃ）ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞によって誘導されたＧｖＨＤ応答なしを示すＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ－γ産生（ｎ＝３）。３人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣをレスポンダーとして含めた。（Ｄ）ＨｖＧ応答の研究のためのｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ。（Ｅ）ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞に対するマイナーなＨｖＧ応答を示すＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ－γ産生（ｎ＝３）。２人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣを実験において使用した。（Ｆ）ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏ混合ＮＫ／ｉＮＫＴ培養において、不適合ドナーのＮＫ細胞による死滅に対して抵抗性であった。（Ｇ）ＧｖＨＤおよびＨｖＤ応答を研究するためのｉｎｖｉｖｏ混合リンパ球養子移入（ＭＬＴ）アッセイ。ｎｓ、有意ではない、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。同上。

図１１Ａ～１１Ｇは、併用療法の例を実証する。（Ａ）チェックポイント遮断療法と組み合わせた^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞療法を研究するための実験設計。（Ｂ）^ＵＨＳＣＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞。（Ｃ）Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ｈＣＤ１９－ＦＧヒト黒色腫細胞系。（Ｄ）^ＵＨＳＣＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性を研究するための実験設計。（Ｅ）^ＵＨＳＣＴＣＲ－ｉＮＫＴ細胞。（Ｆ）Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－Ａ２／ＥＳＯ－ＦＧヒト黒色腫細胞系。（Ｇ）^ＵＨＳＣＴＣＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性を研究するための実験設計。

図１２は、薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究の例を図示する。

図１３は、ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫレンチウイルスベクターの一例を示す。

図１４は、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の産生のための細胞製造プロセスの一例を図示する。

図１５は、ＭＭのためのＨＳＣで操作されたオフザシェルフ汎用ＢＣＭＡＣＡＲ－ｉＮＫＴ（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞療法を示す。

パイロットＣＭＣ研究。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を、治療薬候補として研究した。（Ａ）２段階のｉｎｖｉｔｒｏ培養系。ＡＴＯ：人工胸腺オルガノイド；αＧＣ：アルファ－ガラクトシルセラミド、ｉＮＫＴ細胞を特異的に刺激する強力なアゴニスト脂質抗原；ＢＣＭＡ－ＣＡＲ：Ｂ細胞成熟抗原－標的化キメラ抗原受容体。（Ｂ）ＨＳＣの遺伝子改変率。（Ｃ）ＡＴＯ培養におけるＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の作製。６Ｂ１１は、ヒトｉＮＫＴＴＣＲに特異的に結合するモノクローナル抗体である。（Ｄ）αＧＣによるＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の増幅。２Ｍ２は、Ｂ２Ｍを認識するモノクローナル抗体であり；Ｔｕ３９は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを認識するモノクローナル抗体である。（Ｅ）ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用ＨＳＣ－ｉＮＫＴ（^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞のＭＡＣＳ精製。（Ｆ）ＢＣＭＡ－ＣＡＲ操作およびＩＬ－１５増幅による^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の作製。ＢＣＭＡ－ＣＡＲで操作された末梢血従来型Ｔ（ＢＣＡＲ－Ｔ）細胞を、対照として並行して作製した。ＡＹ１３は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲと共発現したｔＥＧＦＲマーカーを認識するモノクローナル抗体である。（Ｇ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のアウトプット。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ産生を２人の異なるドナーのＧ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋ＨＳＣを使用して確認したことに留意されたい。同上。

パイロット薬理学研究。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を、治療薬候補として研究した。ＦＡＣＳプロットを提示し、ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ（ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陽性のＢＣＭＡ－ＣＡＲで操作されたＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞およびＢＣＡＲ－Ｔ（ＢＣＭＡ－ＣＡＲで操作された末梢血Ｔ）細胞のものと比較した、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を示す。

パイロットｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を、治療薬候補として研究した。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏ直接腫瘍細胞死滅アッセイ。（Ｂ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞系および腫瘍細胞死滅機構。（Ｃ）原発性ＭＭ腫瘍細胞を模倣する、ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系におけるＢＣＭＡおよびＣＤ１ｄの共発現。ＢＭ：骨髄。（Ｄ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝４）。（Ｅ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＣＡＲ／ＴＣＲ二重腫瘍死滅機構（ｎ＝４）。ＰＢＭＣ－Ｔ：末梢血Ｔ細胞（ＣＡＲなし）；^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ：ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用のＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞（ＣＡＲなし）。

パイロットｉｎｖｉｖｏ有効性および安全性研究。ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を治療薬代替物として研究した。（Ａ）実験設計。（Ｂ）４０日目に収集された代表的なＢＬＩ画像（ｎ＝４）。（Ｃ）経時的なＢＬＩ画像の定量化（ｎ＝４）。ＴＢＬ、全身発光。（Ｄ）生存曲線（ｎ＝４）。（Ｅ）６０日目の実験マウス由来の抗ヒトＣＤ３染色組織切片を示す代表的な免疫組織学的画像（ｎ＝４）。矢印は、組織浸潤性ＣＤ３^＋ヒトＴ細胞を示す。

パイロット免疫原性研究。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を、治療薬候補として研究した。（Ａ）可能性のあるＧｖＨＤおよびＨｖＧ応答、ならびに操作された安全管理戦略。（Ｂ）ＧｖＨＤ応答の研究のためのｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ。（Ｃ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞によって誘導されたＧｖＨＤ応答なしを示すＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ－γ産生（ｎ＝４）。３人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激剤として使用した。Ｎ、ＰＢＭＣ刺激剤なし。（Ｄ）ＨｖＧ応答の研究のためのｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイ。（Ｅ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞に対するＨｖＧ応答を示さないＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ－γ産生。３人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣをレスポンダーとして試験した。１人の代表的なドナーからのデータを示した（ｎ＝３）。

パイロット安全性研究－ＰＥＴイメージングおよび安全管理のためのｓｒ３９ＴＫ遺伝子。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を、治療薬候補として研究した。（Ａ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を使用するｉｎｖｉｔｒｏＧＣＶ死滅アッセイ。ＧＣＶ処置後４日目の細胞計数を示した（ｎ＝５）。ＧＣＶ：ガンシクロビル、ｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子を発現する細胞を選択的に死滅させる薬物。（Ｂ～Ｄ）ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウス（図２Ａに記載）を使用するｉｎｖｉｖｏＰＥＴイメージングおよびＧＣＶ死滅アッセイ。（Ｂ）実験設計。（Ｃ）ＧＣＶ処置前および後のＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスの代表的なＰＥＴ／ＣＴ画像（ｎ＝４～５）。（Ｄ）ＧＣＶ処置後のＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスにおけるＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の有効かつ特異的な枯渇を示すＦＡＣＳデータの定量化（ｎ＝４～５）。

提案されたＣＭＣ研究。（Ａ）ＣＭＣ設計の概要。（Ｂ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品を臨床につなげる３つの開発段階の予測。提案されたＴＲＡＮ１－１１５９７プロジェクトは、取り囲まれたプレＩＮＤ段階である。（Ｃ）提案されたプレＩＮＤ製造プロセスおよびプロセス内管理（ＩＰＣ）、ならびに製品リリースアッセイを示すフロー図。

同種異系のＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞のｉｎｖｉｔｒｏ作製。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏでＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための実験設計。ＨＳＣ、造血幹細胞；ＣＢ、臍帯血；ＰＢＳＣ、末梢血幹細胞；αＧＣ、α－ガラクトシルセラミド；レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫ、ｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子およびｓｒ３９ＴＫ自殺／ＰＥＴイメージング遺伝子をコードするレンチウイルスベクター。（Ｂ～Ｅ）ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞作製のＦＡＣＳモニタリング。（Ｂ）レンチベクター形質導入の７２時間後のＣＤ３４＋ＨＳＣ細胞におけるｉＮＫＴＴＣＲ（Ｖβ１１^＋として同定）の細胞内発現。（Ｃ）段階１のＡＴＯ分化培養の間のｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴＴＣＲ＋ＴＣＲαβ＋細胞として同定）の作製。６Ｂ１１モノクローナル抗体を使用してｉＮＫＴＴＣＲを染色した。（Ｄ）段階２のαＧＣ増幅培養の間のｉＮＫＴ細胞の増幅。（Ｅ）段階１および段階２の培養の間のＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８共受容体の発現。ＤＮ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブル陰性；ＣＤ４ＳＰ、ＣＤ４シングル陽性；ＤＰ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブル陽性；ＣＤ８ＳＰ、ＣＤ８シングル陽性。（Ｆ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の単一細胞ＴＣＲ配列決定分析。健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の従来型αβＴ（ＰＢＭＣ－Ｔｃ）細胞およびｉＮＫＴ（ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ）細胞を対照として含めた。個々の細胞について同定された総固有配列のうちのそれぞれの固有Ｔ細胞受容体配列の相対存在量を円グラフの扇形として表した。（Ｇ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞が成功裏に作製された実験を要約する表。１つ（Ｆ）および１０を超える実験（Ａ～Ｅ）の代表。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の特徴付けおよび遺伝子プロファイリング。（Ａ～Ｂ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＦＡＣＳ特徴付け。（Ａ）表面マーカー発現。（Ｂ）細胞内サイトカインおよび細胞傷害性分子の産生。ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞を対照として含めた。（Ｃ～Ｄ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の抗原応答。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、αＧＣの存在下または非存在下で７日間培養した（それぞれ、αＧＣまたは媒体として表す）。（Ｃ）細胞成長曲線（ｎ＝３）。（Ｄ）αＧＣ刺激後３日目のサイトカイン産生（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－１７）のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝３）。（Ｅ～Ｉ）ＣＢまたはＰＢＳＣ由来ＣＤ３４^＋ＨＳＣから作製した^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のディープＲＮＡｓｅｑ分析（それぞれについてｎ＝３）。健康なドナーのＰＢＭＣ由来の従来型ＣＤ８^＋αβＴ（ＰＢＭＣ－αβＴｃ；ｎ＝８）細胞、ＣＤ８^＋ｉＮＫＴ（ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ；ｎ＝３）細胞、γδＴ（ＰＢＭＣ－γδＴ；ｎ＝６）細胞およびＮＫ（ＰＢＭＣ－ＮＫ；ｎ＝２）細胞を対照として含めた。（Ｅ）６つの細胞型すべての順序づけを示す主成分分析（ＰＣＡ）プロット。（Ｆ～Ｉ）転写因子（Ｆ）、ＨＬＡ分子（Ｇ）、免疫チェックポイント分子（Ｈ）、ならびにＮＫ活性化受容体およびＮＫ阻害性受容体（Ｉ）、ならびに６つの細胞型すべてに関する選択された遺伝子の発現を示すヒートマップ。１つ（Ｅ～Ｉ）および３つ（Ａ～Ｄ）の実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による。

ＮＫ経路による^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍標的化。（Ａ～Ｂ）表面ＮＫマーカー発現および^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞による細胞内サイトカイン分子産生のＦＡＣＳ分析。ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞を対照として含めた。（Ｂ）ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞およびＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞と比較した、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞におけるキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）発現の定量化（ｎ＝７～９）。（Ｃ～Ｅ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞によるヒト腫瘍細胞のｉｎｖｉｔｒｏ直接死滅。ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞を対照として含めた。新鮮な細胞と凍結解凍された細胞の両方を研究した。５つのヒト腫瘍細胞系を研究した：Ａ３７５（黒色腫）、Ｋ５６２（骨髄性白血病）、Ｈ２９２（肺がん）、ＰＣ３（前立腺がん）およびＭＭ．１Ｓ（多発性骨髄腫）。すべての腫瘍細胞系を、ホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質のデュアルレポーター（ＦＧ）を発現するように操作した。（Ｃ）実験設計。（Ｄ）２４時間でのＡ３７５－ＦＧヒト黒色腫細胞の腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。（Ｅ）２４時間でのＫ５６２－ＦＧヒト骨髄性白血病細胞の腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。（Ｆ～Ｈ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍死滅機構。ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１が媒介する経路を研究した。（Ｆ）実験設計。（Ｇ）２４時間でのＡ３７５－ＦＧヒト黒色腫細胞の腫瘍死滅データ（腫瘍：ｉＮＫＴの比１：２）（ｎ＝４）。（Ｈ）２４時間でのＫ５６２－ＦＧヒト骨髄性白血病細胞の腫瘍死滅データ（腫瘍：ｉＮＫＴの比１：１）（ｎ＝４）。（Ｉ～Ｋ）Ａ３７５－ＦＧヒト黒色腫異種移植ＮＳＧマウスモデルにおける^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性。（Ｉ）実験設計。ＢＬＩ：生きている動物の生物発光イメージング。（Ｊ）経時的な実験マウスにおける腫瘍量を示すＢＬＩ画像。（Ｋ）経時的な腫瘍サイズ測定（ｎ＝４～５）。３つの実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。図３０も参照されたい。

ＣＡＲで操作された^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍標的化。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏでＢＣＭＡＣＡＲで操作された^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ（^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞を作製するための実験設計。ＢＣＭＡ、Ｂ細胞成熟抗原；ＣＡＲ、キメラ抗原受容体；ＢＣＡＲ、ＢＣＭＡＣＡＲ；レトロ／ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲ、ＢＣＭＡＣＡＲ遺伝子および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子をコードするレトロウイルスベクター。（Ｂ）レトロウイルス形質導入の７２時間後の^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴにおけるＢＣＡＲ発現（ＥＧＦＲ^＋として同定）のＦＡＣＳ検出。同じレトロ／ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲベクターで形質導入された健康なドナーのＰＢＭＣＴ細胞を染色対照として含めた（ＢＣＡＲ－Ｔ細胞として表す）。（Ｃ～Ｈ）^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞によるヒト多発性骨髄腫細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅。ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ、ヒトＣＤ１ｄならびにホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光のデュアルレポーターを過剰発現するように操作されたヒトＭＭ．１Ｓ細胞系。ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞、ＢＣＡＲ－Ｔ細胞および^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞をエフェクター細胞対照として含めた。（Ｃ）実験設計。（Ｄ）ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞におけるＢＣＭＡおよびＣＤ１ｄ発現のＦＡＣＳ分析。ＭＭ患者由来の一次骨髄（ＢＭ）試料を対照として含めた。（Ｅ）ＮＫ活性化受容体、ｉＮＫＴＴＣＲおよびＢＣＡＲによって媒介される、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の三重腫瘍死滅機構を示す図。（Ｆ）８時間での腫瘍死滅（エフェクター：腫瘍の比５：１）（ｎ＝４）。（Ｇ）２４時間でのＩＦＮ－γ産生のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝３）。（Ｈ）２４時間での用量設定されたエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）の比での腫瘍死滅（ｎ＝４）。（Ｉ～Ｌ）ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫異種移植ＮＳＧマウスモデルにおける^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞または細胞なし（媒体）を注射された腫瘍担持マウスを対照として含めた。（Ｉ）実験設計。（Ｊ）経時的な実験マウスにおける腫瘍量を示すＢＬＩ画像。（Ｋ）（Ｊ）の定量化（ｎ＝４）。（Ｌ）腫瘍負荷後４か月の期間にわたる実験マウスのカプランマイヤー生存曲線（ｎ＝４）。２つ（Ｉ～Ｌ）および３つ（Ａ～Ｈ）の実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による（Ｈ）、または一元配置分散分析による（Ｆ、Ｇ、Ｋ）、または多重比較のために調整されたログランク（マンテルコックス）検定による（Ｊ）。図３１も参照されたい。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の安全性研究。（Ａ～Ｂ）ｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＣＬ）アッセイを使用する^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の移植片対宿主（ＧｖＨ）応答の研究。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞をレスポンダー細胞対照として含めた。（Ａ）実験設計。４人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激細胞として使用した。（Ｂ）４日目でのＩＦＮ－γ産生のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝４）。Ｎ、刺激細胞なし。（Ｃ～Ｅ）図２６Ｉ～２６Ｌに記載の実験マウス由来の組織切片の免疫組織学的分析。（Ｃ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色。ブランクは、腫瘍なしＮＳＧマウスから収集された組織切片を示す。矢印は、単核細胞の浸潤を指し示す。バー：２００μｍ。（Ｄ）抗ヒトＣＤ３染色。ＣＤ３染色を茶色で示す。バー：１００μｍ。（Ｅ）（Ｄ）の定量化（ｎ＝４）。（Ｆ～Ｈ）ＧＣＶ処置を介した^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏの調節された枯渇。ＧＣＶ、ガンシクロビル。（Ｆ）実験設計。（Ｇ）５日目でのＮＳＧマウスの肝臓、脾臓および肺における^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＦＡＣＳ検出。（Ｈ）（Ｇ）の定量化（ｎ＝４）。２つの実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｂ）、またはスチューデントのｔ検定による（Ｅ、Ｈ）。図３２も参照されたい。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の免疫原性。（Ａ～Ｅ）ｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイを使用する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞に対する同種異系ＮＫ細胞応答の研究。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、ドナー不適合ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞を対照として含めた。（Ａ）実験設計。（Ｂ）経時的な生きている細胞組成のＦＡＣＳモニタリング。（Ｃ）（Ｂ）の定量化（ｎ＝３）。（Ｄ）ＵＬＢＰ発現のＦＡＣＳ検出。（Ｅ）（Ｄ）の定量化（ｎ＝５～６）。（Ｆ～Ｉ）ｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイを使用する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞に対する同種異系Ｔ細胞応答の研究。照射された^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞（刺激剤として）をドナー不適合ＰＢＭＣ細胞（レスポンダーとして）と共培養した。照射されたＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞を刺激細胞対照として含めた。（Ｆ）実験設計。３人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣをレスポンダーとして使用した。（Ｇ）４日目でのＩＦＮ－γ産生のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝３）。（Ｈ）ＨＬＡ－ＩおよびＩＩ発現のＦＡＣＳ検出。（Ｉ）（Ｈ）からのＨＬＡ－ＩＩ^＋細胞の定量化（ｎ＝５～６）。３つの実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用ｉＮＫＴ（^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞の作製および特徴付け。（Ａ）^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＢＣＭＡＣＡＲで操作された^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞を作製するための実験設計。ｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ。ＣＲＩＳＰＲ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート；Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９；Ｂ２Ｍ、ベータ－２－ミクログロブリン；ＣＩＩＴＡ、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子。（Ｂ～Ｅ）^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞および^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞作製のＦＡＣＳモニタリング。（Ｂ）５日目（レンチベクター形質導入の７２時間後およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の４８時間後）のＣＤ３４^＋ＨＳＣ細胞におけるｉＮＫＴＴＣＲ（Ｖβ１１^＋として同定）の細胞内発現およびＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ（ＢＭ２^－ＨＬＡ－ＤＲ^－として同定）の表面除去。（Ｃ）段階１のＡＴＯ分化培養の間のｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴＴＣＲ^＋ＴＣＲαβ^＋細胞として同定）の作製。（Ｄ）２ステップのＭＡＣＳ選別戦略を使用するＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の精製。（Ｅ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞におけるＢＣＡＲ発現（ＥＧＦＲ^＋として同定）。同じレトロ／ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲベクターで形質導入された健康なドナーのＰＢＭＣＴ細胞を染色対照として含めた（ＢＣＡＲ－Ｔ細胞として表す）。（Ｆ～Ｇ）ｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイを使用する^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞に対する同種異系Ｔ細胞応答の研究。照射された^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（刺激剤として）をドナー不適合ＰＢＭＣ細胞（レスポンダーとして）と共培養した。照射された^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞および従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を刺激細胞対照として含めた。（Ｆ）実験設計。３人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣをレスポンダーとして使用した。（Ｇ）４日目でのＩＦＮ－γ産生のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝３）。（Ｈ～Ｉ）ｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイを使用する^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞に対する同種異系ＮＫ細胞応答の研究。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、ドナー不適合ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞を対照として含めた。（Ｈ）実験設計。（Ｉ）生きている^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞のＦＡＣＳ定量化（ｎ＝３）。（Ｊ～Ｍ）ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫異種移植ＮＳＧマウスモデルにおける^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性。（Ｊ）実験設計。（Ｋ）経時的な実験マウスにおける腫瘍量を示すＢＬＩ画像。（Ｌ）（Ｋ）の定量化（ｎ＝５）。（Ｍ）腫瘍負荷後４か月の期間にわたる実験マウスのカプランマイヤー生存曲線（ｎ＝５）。１つ（Ｊ～Ｍ）および３つ（Ｂ～Ｉ）の実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｇ、Ｉ、Ｌ）、または多重比較のために調整されたログランク（マンテルコックス）検定による（Ｍ）。図２８および図３３も参照されたい。

ＮＫ経路による^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍標的化；図２５に関する。Ａ）操作されたＡ３７５－ＦＧ、Ｋ５６２－ＦＧ、Ｈ２９２－ＦＧ、ＰＣ３－ＦＧおよびＭＭ．１Ｓ－ＦＧ細胞系を示す概略図。Ｆｌｕｃ、ホタルルシフェラーゼ；ＥＧＦＰ、高感度緑色蛍光タンパク質。（Ｂ～Ｄ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞によるヒト腫瘍細胞のｉｎｖｉｔｒｏ直接死滅（図２５Ｃ～２５Ｅに関する）。ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞を対照として含めた。新鮮な細胞と凍結解凍された細胞の両方を研究した。Ｈ２９２－ＦＧヒト肺がん細胞（Ｂ）、ＰＣ３－ＦＧヒト前立腺がん細胞（Ｃ）およびＭＭ．１Ｓ－ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞（Ｄ）の腫瘍死滅データを２４時間で示した（それぞれについて、ｎ＝４）。（Ｅ～Ｇ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍死滅機構（主に図２５Ｆ～２５Ｈに関する）。ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１が媒介する経路を研究した。Ｈ２９２－ＦＧ（腫瘍：ｉＮＫＴの比１：２）、ＰＣ３－ＦＧ（腫瘍：ｉＮＫＴの比１：１０）およびＭＭ．１Ｓ－ＦＧ（腫瘍：ｉＮＫＴの比１：１５）の腫瘍死滅データを２４時間で示した（それぞれについて、ｎ＝４）。（Ｈ～Ｉ）Ａ３７５－ＦＧヒト黒色腫異種移植ＮＳＧマウスモデルにおける^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性（主に図２５Ｉ～２５Ｋに関する）。（Ｈ）経時的な腫瘍量のＢＬＩ測定（ｎ＝４または５）。（Ｉ）１８日目の最終回収における腫瘍重量の測定（ｎ＝４または５）。３つの実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｂ～Ｇ、Ｉ）、またはスチューデントのｔ検定による（Ｈ）。

ＣＡＲで操作された^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍標的化；図２６に関する。（Ａ）ＢＣＭＡ－ＣＡＲ設計を示す概略図。ＳＰ、スペーサー；ＴＭ、膜貫通。（Ｂ～Ｃ）^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＦＡＣＳ特徴付け。（Ｂ）表面マーカー発現。（Ｃ）細胞内サイトカインおよび細胞傷害性分子の産生。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。（Ｄ～Ｅ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍エフェクター機能。（Ｄ）ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞との共培養の２４時間後のｉＮＫＴ細胞のＣＤ６９、パーフォリンおよびグランザイムＢのＦＡＣＳ検出。（Ｅ）（Ｅ）の定量化（ｎ＝３）。３つの実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の安全性研究；図２７に関する。（Ａ）組織切片中の浸潤面積の定量化（図２７Ｃに関する）（ｎ＝４）。（Ｂ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を使用するｉｎｖｉｔｒｏＧＣＶ死滅アッセイ。ＧＣＶ処置後４日目の細胞計数（ｎ＝６）。（Ｃ～Ｄ）ｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＣＬ）アッセイを使用する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の移植片対宿主（ＧｖＨ）応答の研究。ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞をレスポンダー細胞対照として含めた。（Ｃ）実験設計。４人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激細胞として使用した。（Ｄ）４日目でのＩＦＮ－γ産生のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝４）。（Ｅ～Ｊ）ＮＳＧマウスモデルを使用する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＧｖＨ応答の研究。ドナー適合ＰＢＭＣを対照として含めた。（Ｅ）実験設計。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を試験した。（Ｆ）経時的な実験マウスのカプランマイヤー生存曲線（ｎ＝５）。（Ｇ）実験マウス由来の組織切片の抗ヒトＣＤ３染色。ＣＤ３を茶色で示す。バー：１００μｍ。（Ｈ）（Ｇ）の定量化（ｎ＝４）。（Ｉ）実験設計。ドナー適合Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣと混合された^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を試験した。（Ｊ）経時的な実験マウスのカプランマイヤー生存曲線（ｎ＝５）。２つの実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による（Ａ、Ｈ）、または一元配置分散分析による（Ｂ、Ｄ）、または多重比較のために調整されたログランク（マンテルコックス）検定による（Ｆ、Ｊ）。

^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の特徴付け；図２９に関する。（Ａ）表面マーカー発現、ならびに^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞による細胞内サイトカインおよび細胞傷害性分子の産生のＦＡＣＳ検出。^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞およびＢＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。（Ｂ～Ｃ）ｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＣＬ）アッセイを使用する^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のＧｖＨ応答の研究。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞をレスポンダー細胞対照として含めた。（Ｂ）実験設計。３人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激細胞として使用した。（Ｃ）４日目でのＩＦＮ－γ産生のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝４）。（Ｄ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を使用するｉｎｖｉｔｒｏＧＣＶ死滅アッセイ。ＧＣＶ処置後４日目の細胞計数（ｎ＝６）。（Ｅ）ｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイを使用する^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞に対する同種異系Ｔ細胞応答の研究。４日目でのＩＦＮ－γ産生のＥＬＩＳＡ分析（主に図２９Ｆおよび２９Ｇに関する）（ｎ＝３）。（Ｆ）ｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイを使用する^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞に対する同種異系ＮＫ細胞応答の研究。経時的な生きている細胞組成のＦＡＣＳモニタリング（主に図２９Ｈおよび２９Ｉに関する）。（Ｇ～Ｉ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞によるヒト多発性骨髄腫ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅。ＰＢＭＣ－Ｔ細胞、ＢＣＡＲ－Ｔ細胞および^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞をエフェクター細胞対照として含めた。（Ｇ）実験設計。（Ｈ）１６時間での腫瘍死滅（Ｅ：Ｔの比２：１）（ｎ＝４）。（Ｉ）２４時間での用量設定されたＥ：Ｔの比での腫瘍死滅（ｎ＝４）。３つの実験の代表。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｃ～Ｅ、Ｈ）、またはスチューデントのｔ検定による（Ｉ）。

ＢＣＡＲ－Ｔ細胞で処置された腫瘍担持マウスにおけるＭＭ再発；図２９に関する。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞注入の７０日後の脊椎、頭蓋、大腿骨、脾臓、肝臓および腸を含む複数の臓器でのＭＭ腫瘍再発を示すＢＬＩ画像。２つの実験の代表。

ＣＭＣ研究－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞、^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞。（Ａ～Ｂ）ＰＢＳＣ（Ａ）または臍帯血（ＣＢ）ＨＳＣ（Ｂ）からモノクローナルｉＴＡＲＧＥＴ細胞を作製するためのフィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法。ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子編集と組み合わせることによって、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞をＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性であるように操作することができ、汎用ｉＴＡＲＧＥＴ（^ＵｉＴＡＲＧＥＴ）細胞をもたらす。^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞を、^ＵＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞になるようにＣＡＲでさらに操作することができる。ＨＬＡ－Ｅ遺伝子を、ＣＡＲ遺伝子送達ベクターに含めて、^ＵＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現を達成することができる。最終の細胞製品である^ＵＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性のＨＬＡ－Ｅ陽性であり、したがって、同種異系養子移入に好適である。単一の無作為な健康なドナーのＰＢＭＣまたはＣＢＨＳＣから作製され得る、多数のｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびそれらの派生物に留意されたい。（Ｃ～Ｄ）ＰＢＳＣ（Ｃ）またはＣＢＨＳＣ（Ｄ）由来の、段階１におけるｉＴＡＲＧＥＴ細胞の発生、および段階２における分化したｉＴＡＲＧＥＴ細胞の増幅。（Ｅ）ｉＴＡＲＧＥＴ細胞培養をＣＲＩＳＰＲＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ遺伝子編集と組み合わせることによる^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞の作製。（Ｆ）ｉＴＡＲＧＥＴ細胞培養をＣＡＲ操作と組み合わせることによるＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の作製。健康なドナーの末梢血Ｔ（ＰＢＭＣ－Ｔ）細胞由来の従来型ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製を対照として含めた。ＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための類似のＣＡＲ操作率に留意されたい。

ｉＴＡＲＧＥＴ細胞および^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞の薬理学研究。代表的なＦＡＣＳプロットを提示し、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞および^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞の表現型（表面マーカー）および機能性（エフェクター分子の細胞内産生）の分析を示す。ネイティブのヒトｉＮＫＴ（ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ）細胞、従来型αβＴ（ＰＢＭＣ－Ｔ）細胞およびＮＫ（ＰＢＭＣ－ＮＫ）細胞を、健康なドナーの末梢血から単離および増幅させ、対照として含めた。

ＢＣＭＡＣＡＲで操作されたｉＴＡＲＧＥＴ（ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞の薬理学研究。代表的なＦＡＣＳプロットを提示し、ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の表現型（表面マーカー）および機能性（エフェクター分子の細胞内産生）の分析を示す。健康なドナーの末梢血Ｔ細胞のＢＣＭＡ－ＣＡＲ操作により作製されたＢＣＭＡ－ＣＡＲで操作された従来型αβＴ（ＢＣＡＲ－Ｔ）細胞を対照として含めた。

ｉＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死滅アッセイの実験設計。ヒト多発性骨髄腫細胞系ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ、ヒト黒色腫細胞系Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ、およびヒト慢性骨髄性白血病がん細胞系Ｋ５６２－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧを含む、３つの操作されたヒト腫瘍細胞系をこの研究において使用した。（Ｂ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞に対するｉＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝４）、（Ｃ）Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧおよびＫ５６２－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞に対するｉＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝３）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ＢＣＭＡＣＡＲで操作されたｉＴＡＲＧＥＴ（ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞のｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死滅アッセイの実験設計。（Ｂ）操作されたＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞系およびＡ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト黒色腫細胞系を示す概略図。（Ｃ）Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ黒色腫細胞に対するＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝３）。（Ｄ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ黒色腫細胞に対するＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。Ｎ＝４。（Ｅ）同族糖脂質抗原αＧＣの非存在下または存在下でＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ黒色腫細胞に対するＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲで操作されていないＰＢＭＣ－Ｔ細胞およびｉＴＡＲＧＥＴ細胞を対照として含めた。Ｎ＝４。（Ｆ）ＣＡＲ媒介パス、ｉＮＫＴＴＣＲ媒介パスおよびＮＫ受容体媒介パスを含むＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞標的化腫瘍細胞によって活用され得る三重機構を示す図。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

免疫原性研究。（Ａ）可能性のあるＧｖＨＤおよびＨｖＧ応答、ならびに操作された安全管理戦略。（Ｂ）ＧｖＨＤ応答の研究のためのｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ。（Ｃ）ｉＴＡＲＧＥＴ細胞と^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞の両方によって誘導されたＧｖＨＤ応答なしを示すＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ－γ産生（ｎ＝４）。２人の不適合の健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激剤として使用した。Ｎ、ＰＢＭＣ刺激剤なし。（Ｄ）ＨｖＧ応答の研究のためのｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイ。（Ｅ）^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞に対する有意に低減されたＨｖＧ応答を示すＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ－γ産生。２人の不適合の健康なドナー由来のＰＢＭＣをレスポンダーとして試験した。１人の代表的なドナーからのデータを示した（ｎ＝４）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

安全性研究－ＰＥＴイメージングおよび安全管理のためのｓｒ３９ＴＫ遺伝子。（Ａ）ｉＴＡＲＧＥＴ細胞を使用するｉｎｖｉｔｒｏＧＣＶ死滅アッセイ。ＧＣＶ処置後４日目の細胞計数を示した（ｎ＝５）。ＧＣＶ：ガンシクロビル、ｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子を発現する細胞を選択的に死滅させる薬物。（Ｂ～Ｄ）ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスを使用するｉｎｖｉｖｏＰＥＴイメージングおよびＧＣＶ死滅アッセイ。（Ｂ）実験設計。（Ｃ）ＧＣＶ処置前および後のＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスの代表的なＰＥＴ／ＣＴ画像（ｎ＝４～５）。（Ｄ）ＧＣＶ処置後のＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスにおけるＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の有効かつ特異的な枯渇を示すＦＡＣＳデータの定量化（ｎ＝４～５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ａ）、またはスチューデントのｔ検定による（Ｄ）。

さまざまな方法を使用して作製されたヒトｉＮＫＴ細胞製品の性質。代表的なＦＡＣＳプロットを提示し、ヒトＰＢＭＣ培養から、ＡＴＯ－ｉＮＫＴ細胞培養から、およびｉＴＡＲＧＥＴ細胞培養から作製されたヒトｉＮＫＴ細胞製品の性質を示す。

ＣＭＣ研究－ｅｓｏＴＡＲＧＥＴおよび^ＵｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞。（Ａ）臍帯血（ＣＢ）ＨＳＣからモノクローナルｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞を作製するためのフィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法。ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子編集と組み合わせることによって、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞をＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性であるように操作することができ、同種異系養子移入に好適である汎用ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ（^ＵｅｓｏＴＡＲＧＥＴ）細胞をもたらす。単一の無作為な健康なドナーのＣＢＨＳＣから作製され得る、多数の^ＵｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞に留意されたい。（Ｂ）段階１におけるｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の発生、および段階２における分化したｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の増幅。高純度で均質なｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞製品に留意されたい。（Ｃ）ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞培養をＣＲＩＳＰＲＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ遺伝子編集と組み合わせることによる^ＵｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の作製。

ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の薬理学研究。代表的なＦＡＣＳプロットを提示し、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の表現型（表面マーカー；ＡおよびＢ）および機能性（エフェクター分子の細胞内産生；Ｃ）の分析を示す。健康なドナーの末梢血から増幅されたネイティブ従来型αβＴ（ＰＢＭＣ－Ｔ）細胞を対照として含めた。（Ａ）ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞におけるエフェクターＴ細胞マーカーの表面発現を示すＦＡＣＳプロット。ネイティブＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞と比較して、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞が均質で、単一特異性（ｈＴＣＲαβ^＋ＨＬＡ－Ａ２ＥＳＯデキストラマー^＋）で、より活性であり（ＣＤ６９^ｈｉＣＤ６２Ｌ^ｌｏ）、興味深いことに「消耗」も少なかった（ＣＴＬＡ－４^ｌｏＰＤ－１^ｌｏ）ことに留意されたい。（Ｂ）ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞におけるＮＫマーカーの発現を示すＦＡＣＳプロット。ネイティブＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞と比較して、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞がより高いレベルのＮＫマーカー（ＣＤ５６^＋）、ＮＫ機能性受容体（ＣＤ１６^＋／－）およびＮＫ活性化受容体（ＮＫＧ２Ｄ^ｈｉＤＮＡＭ－１^ｈｉ）を発現したことに留意されたい。（Ｃ）ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞におけるサイトカインの細胞内産生を示すＦＡＣＳプロット。ネイティブＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞と比較して、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞が有意に高いレベルのエフェクターサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）および細胞傷害性分子（グランザイムＢおよびパーフォリン）を産生したことに留意されたい。

ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死滅アッセイの実験設計。（Ｂ）操作されたＡ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－ＦＧ細胞系を示す概略図。Ａ３７５はヒト黒色腫細胞系である。Ａ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－ＦＧは、ＨＬＡ－Ａ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ならびにホタルルシフェラーゼおよび高感度緑色蛍光タンパク質のデュアルレポーターを安定に過剰発現するように親Ａ３７５細胞系を操作することによって作製された。（Ｃ）ＮＹ－ＥＳＯ－１^＋Ａ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－ＦＧ腫瘍細胞に対するｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝４）。ｅｓｏＴ、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞によって発現されるものと同じトランスジェニックｅｓｏＴＣＲを発現するように操作されたヒト末梢血従来型αβＴ細胞。ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞が、ネイティブ従来型Ｔ（ｅｓｏＴ）細胞の同等またはそれよりも良好な有効性で、ＮＹ－ＥＳＯ－１^＋腫瘍細胞を有効に死滅させることに留意されたい。（Ｄ～Ｆ）ＮＹ－ＥＳＯ－１^－腫瘍細胞に対するｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝４）。Ａ３７５ヒト黒色腫細胞系、ＭＭ．１Ｓヒト多発性骨髄腫細胞系およびＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病がん細胞系の３つの腫瘍細胞系を研究した。３つの腫瘍細胞系すべてを、ホタルルシフェラーゼおよび高感度緑色蛍光タンパク質のデュアルレポーターを発現するように操作し、Ａ３７５－ＦＧ、ＭＭ．１Ｓ－ＦＧおよびＫ５６２－ＦＧとして表した。ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞が、確実な有効性で３つのＮＹ－ＥＳＯ－１^－腫瘍細胞系のすべてを死滅させたことに留意されたい。総合すれば、これらの結果は、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞が、ｅｓｏＴＣＲ／抗原が誘導するパスによる、およびｅｓｏＴＣＲ／抗原非依存性パス（ＮＫパスの可能性がある）による、デュアル腫瘍死滅機能を備えていることを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｃ）、またはスチューデントのｔ検定による（Ｄ、Ｅ、Ｆ）。

ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の安全性研究。ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞のＧｖＨＤ応答を、ｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＣＬ）アッセイを使用して評価した。（Ａ）実験設計。（Ｂ）ＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ－γ産生、ｅｓｏＴ細胞のものと対照的に、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の最小のアロ反応性を示す（ｎ＝３）。ｅｓｏＴ、ｅｓｏＴＣＲを発現するように操作された同種異系の末梢血従来型αβＴ細胞。これらの結果は、ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞が、低いアロ反応性を示し、オフザシェルフ細胞製品を開発するために好適であることを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ有効性研究。（Ａ）ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）異種移植ＮＳＧマウスモデルにおけるＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を研究するための実験設計。（Ｂ～Ｃ）腫瘍成長の生きている動物の生物発光イメージング（ＢＬＩ）分析。（Ｂ）腫瘍成長。ＴＢＬ、全身発光。（Ｃ）代表的なＢＬＩ画像。Ｎ＝２。データを平均±ＳＥＭとして表す。

ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ有効性研究。（Ａ）ヒト黒色腫異種移植ＮＳＧマウスモデルにおけるｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を研究するための実験設計。（Ｂ）対照のＡ３７５－ＦＧの腫瘍成長（ｎ＝５～６）。（Ｃ）標的のＡ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－ＦＧの腫瘍成長（ｎ＝５～６）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による。

ＣＭＣ研究－ｉＴＡＮＫおよびＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞。（Ａ～Ｂ）ＰＢＳＣ（Ａ）または臍帯血（ＣＢ）ＨＳＣ（Ｂ）からモノクローナルｉＮＫＴＴＣＲで武装したＮＫ（ｉＴＡＮＫ）細胞を作製するためのフィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法。ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子編集と組み合わせることによって、ｉＴＡＮＫ細胞をＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性であるように操作することができ、汎用ｉＴＡＮＫ（^ＵｉＴＡＮＫ）細胞をもたらす。^ＵｉＴＡＮＫ細胞を、^ＵＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞になるようにＣＡＲでさらに操作することができる。ＨＬＡ－Ｅ遺伝子を、ＣＡＲ遺伝子送達ベクターに含めて、^ＵＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現を達成することができる。最終の細胞製品である^ＵＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性のＨＬＡ－Ｅ陽性であり、したがって、同種異系養子移入に好適である。単一の無作為な健康なドナーのＰＢＭＣまたはＣＢＨＳＣから作製され得る、多数のｉＴＡＮＫ細胞およびそれらの派生物に留意されたい。（Ｃ）段階１におけるｉＴＡＮＫ細胞の発生、および段階２における分化したｉＴＡＮＫ細胞の増幅。ＰＢＳＣからのデータを示した。（Ｄ）ｉＴＡＮＫ細胞培養をＣＡＲ操作と組み合わせることによるＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞の作製。ＢＣＭＡＣＡＲを使用した。

さまざまな方法を使用して作製したヒトＮＫ細胞製品の性質。代表的なＦＡＣＳプロットを提示し、ヒトＰＢＭＣ培養から作製されたネイティブヒトＮＫ細胞製品と比較した、ｉＴＡＮＫ細胞製品の性質を示す。

ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞の薬理学研究。代表的なＦＡＣＳプロットを提示し、ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞の表現型（表面マーカー；ＡおよびＢ）および機能性（エフェクター分子の細胞内産生；Ｃ）の分析を示す。ＣＡＲで操作された末梢血従来型αβＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を、対照として含めた。ＣＡＲは、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを指す。（Ａ）ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞におけるエフェクターＴ細胞マーカーの表面発現を示すＦＡＣＳプロット。従来型ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞が、最低レベルのＨＬＡ－ＩＩを発現したことに留意されたい。ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞はまた、より活性で（ＣＤ６９^ｈｉＣＤ６２Ｌ^ｌｏ）、興味深いことに「消耗」も少なかった（ＰＤ－１^ｌｏ）。（Ｂ）ｉＴＡＮＫ細胞におけるＮＫマーカーの発現を示すＦＡＣＳプロット。従来型ＣＡＲ－Ｔと比較して、ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞がより高レベルのＮＫマーカー（ＣＤ５６^ｈｉ）およびＮＫ活性化受容体（ＮＫＧ２Ｄ^ｈｉ）を発現したことに留意されたい。（Ｃ）ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞におけるサイトカインの細胞内産生を示すＦＡＣＳプロット。従来型ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞が有意により高いレベルのエフェクターサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）および細胞傷害性分子（グランザイムＢおよびパーフォリン）を産生したことに留意されたい。

ｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究－ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死滅アッセイの実験設計。ＣＡＲは、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを指す。（Ｂ）操作されたＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系を示す概略図。ＭＭ．１Ｓはヒト多発性骨髄腫細胞系（ＢＣＭＡ^＋）である。ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧは、ヒトＣＤ１ｄならびにホタルルシフェラーゼおよび高感度緑色蛍光タンパク質のデュアルレポーターを安定に過剰発現するように親ＭＭ．１Ｓ細胞系を操作することによって作製された。（Ｃ）操作されたＡ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系を示す概略図。Ａ３７５はヒト黒色腫細胞系（ＢＣＭＡ^－）である。Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧは、ヒトＣＤ１ｄならびにホタルルシフェラーゼおよび高感度緑色蛍光タンパク質のデュアルレポーターを安定に過剰発現するように親Ａ３７５細胞系を操作することによって作製された。（Ｄ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞に対するｉＴＡＮＫ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝３）。ｉＴＡＮＫ細胞（ＣＡＲで操作されていない）による腫瘍細胞死滅の欠如に留意されたい。（Ｅ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞に対するＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝４）。ＣＡＲで操作された末梢血従来型αβＴ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞を、対照として含めた。ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞よりも効率的に腫瘍細胞を死滅させたことに留意されたい。（Ｆ）Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞に対するＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝４）。ＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。ＣＡＲ－Ｔ細胞とは違って、ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞がＢＣＭＡ^－腫瘍細胞を有効に死滅させたことに留意されたい。総合すれば、これらの結果は、ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞が、ＣＡＲ誘導性およびＣＡＲ非依存性（ＮＫパスによる可能性がある）機構の両方により、腫瘍を有効に死滅させることができることを示した。そして、ＣＡＲ誘導性死滅のために、ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ細胞は、従来型ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高い有効性である。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による（Ｄ）、または一元配置分散分析による。

ＣＭＣ研究－ｅｓｏＴＡＮＫ細胞。（Ａ）臍帯血（ＣＢ）ＨＳＣからモノクローナルｅｓｏＴＡＮＫ細胞を作製するためのフィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法。ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子編集と組み合わせることによって、ｅｓｏＴＡＮＫ細胞をＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性であるように操作することができ、同種異系養子移入に好適である汎用ｅｓｏＴＡＮＫ（^ＵｅｓｏＴＡＮＫ）細胞をもたらす。単一の無作為な健康なドナーのＣＢＨＳＣから作製され得る、多数の^ＵｅｓｏＴＡＮＫ細胞に留意されたい。（Ｂ）段階１におけるｅｓｏＴＡＮＫ細胞の発生、および段階２における分化したｅｓｏＴＡＮＫ細胞の増幅。高純度で均質なｅｓｏＴＡＮＫ細胞製品に留意されたい。

ｅｓｏＴＡＮＫ細胞の薬理学研究。代表的なＦＡＣＳプロットを提示し、ｅｓｏＴＡＮＫ細胞の表現型（表面マーカー；ＡおよびＢ）および機能性（エフェクター分子の細胞内産生；Ｃ）の分析を示す。健康なドナーの末梢血から増幅されたネイティブ従来型αβＴ（ＰＢＭＣ－Ｔ）細胞を対照として含めた。（Ａ）ｅｓｏＴＡＮＫ細胞におけるエフェクターＴ細胞マーカーの表面発現を示すＦＡＣＳプロット。ネイティブＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞と比較して、ｅｓｏＴＡＮＫ細胞が均質で、単一特異性（ｈＴＣＲαβ^＋ＨＬＡ－Ａ２ＥＳＯデキストラマー^＋）で、より活性であり（ＣＤ６９^ｈｉＣＤ６２Ｌ^ｌｏ）、興味深いことに「消耗」も少なかった（ＣＴＬＡ－４^ｌｏＰＤ－１^ｌｏ）ことに留意されたい。（Ｂ）ｅｓｏＴＡＮＫ細胞におけるＮＫマーカーの発現を示すＦＡＣＳプロット。ネイティブＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞と比較して、ｅｓｏＴＡＮＫ細胞がより高いレベルのＮＫマーカー（ＣＤ５６^＋）、ＮＫ機能性受容体（ＣＤ１６^＋／－）およびＮＫ活性化受容体（ＮＫＧ２Ｄ^ｈｉＤＮＡＭ－１^ｈｉ）を発現したことに留意されたい。（Ｃ）ｅｓｏＴＡＮＫ細胞におけるサイトカインの細胞内産生を示すＦＡＣＳプロット。ネイティブＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞と比較して、ｅｓｏＴＡＮＫ細胞が有意により高いレベルのエフェクターサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）および細胞傷害性分子（グランザイムＢおよびパーフォリン）を産生したことに留意されたい。

ｅｓｏＴＡＮＫ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死滅アッセイの実験設計。（Ｂ）操作されたＡ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－ＦＧ細胞系を示す概略図。Ａ３７５はヒト黒色腫細胞系である。Ａ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－ＦＧは、ＨＬＡ－Ａ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ならびにホタルルシフェラーゼおよび高感度緑色蛍光タンパク質のデュアルレポーターを安定に過剰発現するように親Ａ３７５細胞系を操作することによって作製された。（Ｃ）ＮＹ－ＥＳＯ－１^＋Ａ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－ＦＧ腫瘍細胞に対するｅｓｏＴＡＮＫ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝４）。ｅｓｏＴＡＮＫ細胞がＮＹ－ＥＳＯ－１^＋腫瘍細胞を有効に死滅させたことに留意されたい。（Ｄ～Ｆ）ＮＹ－ＥＳＯ－１^－腫瘍細胞に対するｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝４）。Ａ３７５ヒト黒色腫細胞系、ＭＭ．１Ｓヒト多発性骨髄腫細胞系およびＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病がん細胞系の３つの腫瘍細胞系を研究した。３つの腫瘍細胞系すべてを、ホタルルシフェラーゼおよび高感度緑色蛍光タンパク質のデュアルレポーターを発現するように操作し、Ａ３７５－ＦＧ、ＭＭ．１Ｓ－ＦＧおよびＫ５６２－ＦＧとして表した。ｅｓｏＴＡＮＫ細胞が、確実な有効性で３つのＮＹ－ＥＳＯ－１^－腫瘍細胞系のすべてを死滅させたことに留意されたい。総合すれば、これらの結果は、ｅｓｏＴＡＮＫ細胞が、ｅｓｏＴＣＲ／抗原誘導性パスによる、およびｅｓｏＴＣＲ／抗原非依存性パス（ＮＫパスの可能性がある）による、デュアル腫瘍死滅機能を備えていることを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による。

ｅｓｏＴＡＮＫ細胞の安全性研究。ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞のＧｖＨＤ応答を、ｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＣＬ）アッセイを使用して評価した。（Ａ）実験設計。（Ｂ）ＭＬＣアッセイにおけるＩＦＮ－γ産生、ｅｓｏＴ細胞のものと対照的に、ｅｓｏＴＡＮＫ細胞の最小のアロ反応性を示す（ｎ＝３）。ｅｓｏＴ、ｅｓｏＴＣＲを発現するように操作された同種異系の末梢血従来型αβＴ細胞。これらの結果は、ｅｓｏＴＡＮＫ細胞が、低いアロ反応性を示し、オフザシェルフ細胞製品を開発するために好適であることを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ＩＬ－１５で増強されたＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ（^{ＩＬ－１５}ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞の作製。（Ａ）ＩＬ１５ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞製品を作製するための実験設計。（Ｂ）レンチ／ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ－ＩＬ－１５およびレンチ／ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴレンチベクターの概略図。（Ｃ）経時的な細胞培養におけるＩＬ１５ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ（ｈＴＣＲβ＋６Ｂ１１＋）細胞の検出を示すＦＡＣＳプロット。６Ｂ１１は、ヒトｉＮＫＴＴＣＲを特異的に染色するモノクローナル抗体である。ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞を対照として含めた。

^ＩＬ１５ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍有効性。（Ａ）^ＩＬ１５ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞によるＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞の死滅を研究するための実験設計。（Ｂ）操作されたヒト多発性骨髄腫細胞系（ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ）の概略図。（Ｃ）^ＩＬ１５ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞によって行われるＮＫ／ＴＣＲ／ＣＡＲ媒介三重腫瘍死滅機構を示す図。（Ｄ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞に対する^ＩＬ１５ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅有効性（ｎ＝５）。（Ｅ）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞と共培養された^ＩＬ１５ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞における活性化マーカーならびに細胞傷害性分子の発現のＦＡＣＳ検出。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ＩＬ１５ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性。（Ａ）実験設計。（Ｂ）経時的な実験マウスにおけるＢＬＩによって測定された腫瘍量。（Ｃ）Ｂの定量化（ｎ＝３～４）。（Ｄ）３４日目における腫瘍量の定量化。（Ｅ）末梢血中の３４日目におけるｉＴＡＲＧＥＴ細胞の持続性を示すＦＡＣＳプロット。（Ｆ）（Ｅ）の定量化。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

遺伝子送達レンチベクターの構築。（Ａ）レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫレンチベクターの概略図。（Ｂ）レンチ／ｉＮＫＴ－ＣＡＲ１９およびレンチ／ｉＮＫＴ－ＢＣＡＲレンチベクターの概略図。（Ｃ）ＨＥＫ－２９３Ｔ－ＣＤ３細胞系に形質導入することによって測定される、示されたレンチベクターの力価。同等の力価に留意されたい。（Ｄ）示されたレンチベクターで形質導入されたＣＤ３４＋ＨＳＣのＦＡＣＳ分析。レンチ／ｉＮＫＴ－ＣＡＲ１９およびレンチ／ｉＮＫＴ－ＢＣＡＲベクターが、ｉＮＫＴＴＣＲおよびＣＡＲ遺伝子の効率的な共発現を媒介したことに留意されたい。Ｖβ１１はｉＮＫＴＴＣＲを染色したが、ＦａｂはＣＡＲを染色した。

ＨＳＣで操作された同種異系のｉＮＫＴ（^ＡｌｌｏｉＮＫＴ）、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ（^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ）および^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の作製。（Ａ）^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞製品を産生させるための実験設計の概略図。（Ｂ）経時的な細胞培養における^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋６Ｂ１１＋細胞としてゲート開閉する）の検出を示すＦＡＣＳプロット。（Ｃ）^ＡｌｌｏＣＡＲ１９－ｉＮＫＴ細胞製品を作製するための実験設計の概略図。（Ｄ）経時的な細胞培養における^ＡｌｌｏＣＡＲ１９－ｉＮＫＴ細胞（ＣＤ３^＋６Ｂ１１^＋細胞としてゲート開閉する）の検出を示すＦＡＣＳプロット。（Ｅ）^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品を作製するための実験設計の概略図。（Ｆ）経時的な細胞培養における^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（ＣＤ３^＋６Ｂ１１^＋細胞としてゲート開閉する）の検出を示すＦＡＣＳプロット。（Ｇ）細胞収率を示す表。

^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性。（Ａ）^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞におけるｉＮＫＴＴＣＲ（６Ｂ１１^＋）およびＣＡＲ（Ｆａｂ^＋）の共発現を示すＦＡＣＳプロット。（Ｂ）^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞、^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣ－Ｔ細胞のＴＣＲＶαおよびＶβ ＣＤＲ３ＶＤＪ配列の分析。試料について同定された総固有配列のうちのそれぞれの固有ＴＣＲ配列の相対存在量を円グラフの扇形として表す。^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞および^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞における無作為に組換えられた内在性ＴＣＲの欠如に留意されたい。（Ｃ）^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞における表面マーカーおよび細胞内エフェクター分子の発現を示すＦＡＣＳプロット。（Ｄ）抗原（αＧＣ）刺激に応答する^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の増幅（ｎ＝３）。（Ｅ）抗原（αＧＣ）刺激に応答する^ＡｌｌｏＣＡＲ１９－ｉＮＫＴ細胞の増幅（ｎ＝３）。データを平均±ＳＥＭとして表す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による。

ｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究－^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞。（Ａ）^Ａ ^ｌｌｏｉＮＫＴ細胞によるＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅（ｎ＝４）。（Ｂ）^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞によるＡ３７５－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒト黒色腫細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅（ｎ＝３）。（Ｃ）^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞によるＫ５６２－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒト白血病細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅（ｎ＝３）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究－^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞。（Ａ）^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞によって利用されるＮＫ／ＴＣＲ／ＣＡＲ媒介三重腫瘍死滅機構を示す図。（Ｂ）^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞によるＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅（ｎ＝３）。（Ｃ）（Ｂ）からのＩＦＮ産生（ｎ＝３）。（Ｄ）従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞のものと比較した、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞によるＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅（ｎ＝４）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｂ、Ｃ）、またはスチューデントのｔ検定による（Ｄ）。

ｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍有効性およびＭＯＡ研究－ＡｌｌｏＣＡＲ１９－ｉＮＫＴ細胞。（Ａ）^ＡｌｌｏＣＡＲ１９－ｉＮＫＴ細胞によるＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒトＢ細胞リンパ腫細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅（ｎ＝３）。（Ｂ）従来型ＣＡＲ１９－Ｔ細胞のものと比較した、^ＡｌｌｏＣＡＲ１９－ｉＮＫＴ細胞によるＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ－ＣＤ１ｄ－ＦＧヒトＢ細胞リンパ腫細胞のｉｎｖｉｔｒｏ死滅（ｎ＝３）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ａ）、またはスチューデントのｔ検定による（Ｂ）。

ｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性および安全性研究－^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞。（Ａ）実験設計。（Ｂ）経時的な実験マウスにおけるＢＬＩによって測定された腫瘍量。（Ｃ）（Ｂ）の定量化（ｎ＝５）。（Ｄ）マウス生存率のカプランマイヤー分析（ｎ＝５）。（Ｅ）^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞および実験マウスの肝臓から単離された対照ＢＣＡＲ－Ｔ細胞における、ＰＤ－１の表面発現ならびにグランザイムＢおよびＩＦＮ－γの細胞内産生のＦＡＣＳ分析（ｎ＝４）。（Ｆ～Ｇ）実験マウスにおける、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｇ）に対する^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（Ｆ）の生体内分布のＦＡＣＳ分析（ｎ＝４）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定による（Ｃ、Ｅ）、または多重比較のために調整されたログランク（マンテルコックス）検定による（Ｄ）。

免疫原性研究－^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞。（Ａ～Ｂ）移植片対宿主（ＧｖＨ）応答。（Ａ）実験設計。（Ｂ）ＩＦＮ－γ産生（ｎ＝３）。４人の無作為な健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激剤として含めた。（Ｃ～Ｄ）宿主対移植片（ＨｖＧ）応答。（Ｃ）実験設計。（Ｄ）ＩＦＮ－γ産生（ｎ＝３）。４人の無作為な健康なドナー由来のＰＢＭＣをレスポンダーとして含めた。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の開発を可能にする技術革新。

同種異系のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の「汎用」ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞の作製および特徴付け。（Ａ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための実験設計。（Ｂ）経時的な細胞培養における^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（ＣＤ３^＋６Ｂ１１^＋細胞としてゲート開閉する）の検出を示すＦＡＣＳプロット。（Ｃ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品におけるｉＮＫＴＴＣＲ、ＣＡＲおよびＨＬＡ－Ｅの共発現を示すＦＡＣＳプロット。（Ｄ）大部分の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（未選別）におけるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現の欠如を示すＦＡＣＳプロット。従来型ＰＢＭＣ由来ＢＣＡＲ－Ｔ細胞および非ＨＬＡ遺伝子編集^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を対照として含めた。（Ｅ）（Ｄ）の定量化。Ｎ＝４。（Ｆ～Ｇ）^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の免疫原性。（Ｆ）混合リンパ球培養（ＭＣＬ）アッセイを使用する^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の宿主対移植片（ＨｖＧ）応答を研究するための実験設計。（Ｇ）ＩＦＮ－γ産生（ｎ＝３）。４人の無作為な健康なドナー由来のＰＢＭＣをレスポンダーとして含めた。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

オフザシェルフ同種異系のＨＳＣで操作されたＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ（^Ａ ^ｌｌｏｅｓｏＴ）細胞のｉｎｖｉｔｒｏ作製および遺伝子プロファイリング。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏのオフザシェルフＨＳＣに基づくＴＣＲで操作されたＴ細胞作製系における^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞を作製するための概略設計。（Ｂ）レンチベクター形質導入の７２時間後のＣＤ３４^＋ＨＳＣ細胞におけるＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１－ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５}特異的ＴＣＲ（Ｖβ１３．１^＋として同定）の細胞内発現のＦＡＣＳ検出。（Ｃ）示された週でのＣＤ３４^＋ＨＳＣからの^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の発生および分化の代表的な動態。^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞は、Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋としてゲート開閉した。（Ｄ）８人の異なるＣＢドナー由来の^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の収率。（Ｅ）^ＡｌｌｏｅｓｏＴのＴＣＲＶαおよびＶβ ＣＤＲ３ＶＤＪ配列、ならびに従来型αβＴ（ＰＢＭＣ－Ｔ）細胞の分析。試料について同定された総固有配列のうちのそれぞれの固有Ｔ細胞受容体配列の相対存在量を円グラフの扇形として表す。１０を上回る実験の代表。図７３も参照されたい。

^ＡｌｌｏｅｓｏＴの特徴付けおよび抗腫瘍能。（Ａ）^ＡｌｌｏｅｓｏＴの特徴付け。ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞（Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋として同定）と比較した、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞（Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋として同定）からの表面マーカー、細胞内サイトカインおよび細胞傷害性分子の発現を示すＦＡＣＳプロット。（Ｂ）^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の抗原応答。^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞を、ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５}ペプチド（ＥＳＯｐ）の存在下または非存在下で７日間増幅させた。経時的な^ＡｌｌｏｅｓｏＴ増幅の成長曲線（ｎ＝３）。（Ｃ～Ｇ）ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞と比較した、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞による複数の腫瘍細胞系のＮＹ－ＥＳＯ－１特異的死滅の研究。（Ｃ）実験設計。（Ｄ～Ｅ）Ａ３７５－ＦｌｕｃおよびＡ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－Ｆｌｕｃのｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍死滅のルシフェラーゼ活性分析（ｎ＝４）。Ｅ：Ｔ、エフェクター／標的の比。（Ｆ～Ｇ）ＰＣ３－Ａ２－ＥＳＯ－Ｆｌｕｃの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。Ｅ：Ｔ、エフェクター／標的の比。（Ｈ～Ｏ）ヒト黒色腫（Ａ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－Ｆｌｕｃ）異種移植マウスモデルにおける固形腫瘍に対する^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性の研究。（Ｈ）実験設計。（Ｉ）経時的な腫瘍サイズの測定（ｎ＝４）。（Ｊ）マウス生存率のカプランマイヤー分析（ｎ＝７または８）。（Ｋ）最終ＦＡＣＳ分析によって定量化されたＰＢＭＣ－ｅｓｏＴの生体内分布。（Ｌ）最終ＦＡＣＳ分析によって定量化された^ＡｌｌｏｅｓｏＴの生体内分布。（Ｍ）腫瘍浸潤リンパ球のＰＤ－１発現の定量化（ｎ＝４）。（Ｎ）肝臓中のｉｎｖｉｖｏ持続性Ｔ細胞の細胞内細胞傷害性分子の発現（ｎ＝４）。（Ｏ）肝臓中のｉｎｖｉｖｏ持続性Ｔ細胞の細胞内サイトカインの発現（ｎ＝４）。３つの実験の代表。図７４～７６も参照されたい。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＮおよびＯ）、または多重比較のために調整されたログランク（マンテルコックス）検定による（Ｊ）。

遺伝子編集による^ＡｌｌｏｅｓｏＴおよび免疫原性の低減の安全性研究。（Ａ～Ｂ）従来型ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞と比較した、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞のＧｖＨ応答の研究のためのｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ。（Ａ）実験設計。（Ｂ）ＭＬＲアッセイの上清中のＩＦＮ－γのＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝３）、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞によって誘導されるＧｖＨ応答なしを示す。３人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激剤として含めた。（Ｃ～Ｄ）ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞と比較した、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の宿主対移植片（ＨｖＧ）応答のためのｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ。（Ｃ）実験設計。（Ｄ）ＭＬＲアッセイの上清中のＩＦＮ－γのＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝３）、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞によって誘導されるより低いＨｖＧ応答を示す。３人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣをレスポンダーとして含めた。（Ｅ～Ｇ）実験マウス由来の組織切片の免疫組織学的分析。（Ｅ）ヘマトキシリンおよびエオシン染色。白色破線は、単核細胞浸潤を有する領域を強調する。（Ｆ）抗ヒトＣＤ３染色。ＣＤ３を赤色で示す。（Ｅ）（Ｆ）の定量化（ｎ＝５）。（Ｈ）オフザシェルフＨＳＣに基づくＴＣＲで操作されたＴ細胞作製系におけるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩが低減された汎用のＨＳＣで操作されたＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ（^ＵｅｓｏＴ）細胞を作製するための概略設計。（Ｉ）示された週でのＣＤ３４^＋ＨＳＣからの^ＵｅｓｏＴ細胞の発生および分化の動態。^ＵｅｓｏＴ細胞は、Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋としてゲート開閉した。（Ｊ）^ＡｌｌｏｅｓｏＴと比較した、^ＵｅｓｏＴのＨＬＡ－ＩおよびＩＩ発現を示すＦＡＣＳプロット。（Ｋ）^ＵｅｓｏＴの特徴付け。ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞（Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋として同定）と比較した、^ＵｅｓｏＴ細胞（Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋として同定）からの表面マーカー、細胞内サイトカインおよび細胞傷害性分子の発現を示すＦＡＣＳプロット。（Ｌ）^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞およびＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞と比較した、^ＵｅｓｏＴ細胞によるＰＣ３－Ａ２－ＥＳＯ－ＦｌｕｃのＮＹ－ＥＳＯ－１特異的死滅の研究（ｎ＝４）。（Ｍ～Ｎ）^ＡｌｌｏｅｓｏＴおよびＰＢＭＣ－ｅｓｏＴと比較した、^ＵｅｓｏＴ細胞における低減されたＨＬＡ－Ｉ（Ｍ）およびＨＬＡ－ＩＩ（Ｎ）発現の定量化（ｎ＝５）。（Ｏ～Ｐ）ＭＬＲアッセイの上清中のＩＦＮ－γのＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝３）、^ＵｅｓｏＴ細胞によって誘導される低減されたＨｖＧ応答を示す。２人の異なる健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激剤として含めた。（Ｑ）^ＵｅｓｏＴ（ＨＬＡ－Ｅを発現する）は、ＮＫ細胞との共培養におけるＨＬＡ－ＩおよびＩＩの遺伝子編集を有する^ＡｌｌｏｅｓｏＴと比較して、ＮＫ死滅に抵抗する（ｎ＝３）。２つの実験の代表。図７７および７８も参照されたい。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｂ）、またはスチューデントのｔ検定による（Ｅ、Ｈ）。

オフザシェルフ同種異系のＨＳＣで操作されたＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ（^Ａ ^ｌｌｏｅｓｏＴ）細胞の作製；図７０に関する。（Ａ）ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲの２つのバージョンを運ぶレンチウイルスベクターの設計。ＨＬＡ－Ａ２^＊０１－ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５特異的クローンを、１Ｇ４として表し、ＨＬＡ－Ｂ７^＊０２－ＮＹ－ＥＳＯ－１６０－７２特異的クローンを１Ｅ４として表す。（Ｂ）示されたベクターでパッケージングされたレンチウイルスの代表的な力価。（Ｃ）示された週でのＣＤ３４^＋ＨＳＣからの^ＡｌｌｏｅｓｏＴ（Ｂ７）細胞の発生および分化の代表的な動態。^ＡｌｌｏｅｓｏＴ（Ｂ７）細胞は、ＥＳＯ６０－７２ＨＬＡ－Ｂ７デキストラマー^＋ＣＤ３^＋としてゲート開閉した。（Ｄ～Ｅ）オフザシェルフＨＳＣに基づく系におけるＴＣＲで操作されたＴ細胞の作製は、適合するＭＨＣ発現に非依存性である。（Ｄ）ＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＢＨＳＣドナーによる^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の作製。（Ｅ）ＨＬＡ－Ｂ７－ＣＢＨＳＣドナーによる^ＡｌｌｏｅｓｏＴ（Ｂ７）細胞の作製。３つ（ＣおよびＥ）および８つ（Ｄ）の実験の代表。

^ＡｌｌｏｅｓｏＴの特徴付け；図７１に関する。（Ａ～Ｂ）^ＡｌｌｏｅｓｏＴの特徴付け。ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞（Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋として同定）と比較した、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞（Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋として同定）からの表面マーカー（Ａ）、細胞内サイトカインおよび細胞傷害性分子（Ｂ）の発現を示すＦＡＣＳプロット。８つの実験の代表。

^ＡｌｌｏｅｓｏＴのｉｎｖｉｔｒｏ抗原応答および腫瘍死滅能；図７１に関する。（Ａ～Ｃ）^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の抗原応答。^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞を、ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ペプチド（ＥＳＯｐ）の存在下または非存在下で７日間増幅させた。３日目におけるサイトカイン：（Ａ）ＩＦＮ－γ、（Ｂ）ＴＮＦ－αおよび（Ｃ）ＩＬ－２の産生のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝３）。（Ｄ～Ｅ）ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞と比較した、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ（Ｂ７）細胞による複数の腫瘍細胞系のＨＬＡ－Ｂ７拘束性ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的死滅の研究。（Ｄ）Ａ３７５－ＦｌｕｃおよびＡ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－Ｆｌｕｃのｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍死滅のルシフェラーゼ活性分析（ｎ＝４）。（Ｅ）ＰＣ３－ＦｌｕｃおよびＰＣ３－Ａ２－ＥＳＯ－Ｆｌｕｃのｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍死滅（ｎ＝４）。（Ｆ）Ｋ５６２－Ｆｌｕｃのｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍死滅。（Ｇ）ＭＭ．１Ｓ－Ｆｌｕｃのｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍死滅。６つの実験の代表。

^ＡｌｌｏｅｓｏＴのｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍能；図７１に関する。（Ａ～Ｄ）ヒト黒色腫（Ａ３７５－Ａ２－ＥＳＯ－Ｆｌｕｃ）異種移植マウスモデルにおける固形腫瘍に対する^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性の研究。（Ａ）最終分析における腫瘍重量の定量化（ｎ＝４）。（Ｂ）肝臓中のｉｎｖｉｖｏ持続性Ｔ細胞の細胞内細胞傷害性分子の発現（ｎ＝４）。（Ｃ～Ｄ）肝臓中のｉｎｖｉｖｏ持続性Ｔ細胞の細胞内サイトカインの発現（ｎ＝４）。（Ｅ～Ｆ）ヒト黒色腫（ＰＣ３－Ａ２－ＥＳＯ－Ｆｌｕｃ）異種移植マウスモデルにおける固形腫瘍に対する^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性の研究。（Ｅ）実験設計。（Ｆ）経時的な腫瘍サイズの測定（ｎ＝４）。４つの実験の代表。

^ＡｌｌｏｅｓｏＴの安全性の特徴付け；図７２に関する。（Ａ）ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴと比較した、^ＡｌｌｏｅｓｏＴのＨＬＡ－Ｉ発現。（Ｂ）ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴと比較した、^ＡｌｌｏｅｓｏＴのＨＬＡ－ＩＩ発現。（Ｃ～Ｅ）実験マウス由来の組織切片の免疫組織学的分析。Ｈ＆Ｅ染色写真における単核細胞浸潤の定量化（ｎ＝５）。

^ＵｅｓｏＴの作製および特徴付け；図７２に関する。（Ａ）ｅｓｏＴＣＲ（クローン１Ｇ４）、ＨＬＡ－Ｅおよびｓｒ３９ＴＫを運ぶレンチウイルスベクターの設計。（Ｂ）示されたレンチベクターでパッケージングされたウイルスの代表的な力価。（Ｃ）レンチベクター形質導入の７２時間後のＣＤ３４^＋ＨＳＣ細胞におけるｅｓｏＴＣＲ（Ｖβ１３．１^＋として同定）およびＨＬＡ－Ｅの細胞内発現のＦＡＣＳ検出。（Ｄ）^ＵｅｓｏＴの特徴付け。ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞（Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋として同定）と比較した、^ＵｅｓｏＴ細胞（Ｖβ１３．１^＋ＣＤ３^＋として同定）からの表面マーカーおよび細胞内サイトカインの発現を示すＦＡＣＳプロット。３つの実験の代表。

ＢＬＴマウスにおけるＨＳＣ－ｉＮＫＴの作製。（Ａ）ＢＬＴヒト化マウスモデルにおいてＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための実験設計。（Ｂ）ＨＳＣ移入後のＢＬＴ－ｉＮＫＴマウスおよび対照ＢＬＴマウスの末梢血中のヒト免疫細胞（ｈＣＤ４５＋細胞としてゲート開閉）、ヒトａｂＴ細胞（ｈＣＤ４５＋ｈＴＣＲａｂ＋細胞としてゲート開閉）およびヒトｉＮＫＴ細胞（ｈＣＤ４５＋ｈＴＣＲａｂ＋６Ｂ１１＋細胞としてゲート開閉）の経時的なＦＡＣＳモニタリング（ｎ＝９～１０）。

ＡＴＯ培養系におけるオフザシェルフ^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の作製。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏでＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための実験設計。（Ｂ）段階１のＡＴＯ分化培養の間のｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴＴＣＲ^＋ＴＣＲαβ^＋細胞として同定）の作製。６Ｂ１１モノクローナル抗体を使用してｉＮＫＴＴＣＲを染色した。（Ｃ）段階２のαＧＣ増幅培養の間のｉＮＫＴ細胞の増幅。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴ細胞アロ反応を低減する。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏＭＬＲアッセイにおけるｉＮＫＴ細胞の機能の研究（ｉＮＫＴ：Ｒ：Ｓの比１：１：２５）。（Ｂ）ＩＦＮ－γ分泌は、ベースラインＭＬＲへのＣＤ４－ｉＮＫＴ細胞の添加において有意に減少した（ｎ＝３）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析による。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、同種異系骨髄性ＡＰＣを標的にする。（Ａ）実験設計。（Ｂ）ＭＬＲアッセイにおけるヒト樹状細胞（ＤＣ）（ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ１４^＋としてゲート開閉）のＦＡＣＳ検出。（Ｃ）Ａの定量化（ｎ＝３）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

ＮＳＧマウスにおけるＧｖＨＤの低減に対するＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の効果。（Ａ）ＧｖＨＤの低減に対するＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の効果を研究するための実験設計。１×１０^７個のＰＢＭＣ、または１×１０^７個のＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と混合された１×１０^７個のＰＢＭＣを、０日目に、ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。（Ｂ）毎週のＲ．Ｏ．出血。（Ｃ）生存曲線。（Ｄ）繰り返し生存曲線。データを平均±ＳＥＭとして表した。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。

主要な臓器における免疫細胞の浸潤の低減に対するＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の効果。（Ａ）肺、肝臓、心臓、腎臓および脾臓を含む主要な臓器における免疫細胞の浸潤の低減に対するＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の効果を研究するための実験設計。１×１０^７個のＰＢＭＣ、または１×１０^７個のＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と混合された１×１０^７個のＰＢＭＣを、０日目に、ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。（Ｂ）実験マウス由来の組織切片の免疫組織学的分析。ＣＤ３を茶色で示す。矢印は、ＣＤ３^＋細胞の浸潤を指し示す。（Ｃ）（Ｂ）の定量化（ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして表した。ｎｓ、有意ではない、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による。

ＮＳＧマウスにおけるＧｖＨＤの低減に対するＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の効果。（Ａ）ＧｖＨＤの低減に対するＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の効果を研究するための実験設計。１×１０^７個のＰＢＭＣ、または１×１０^７個のＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と混合された１×１０^７個のＤＣを、０日目に、ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。（Ｂ）ＧｖＨＤの低減に対するＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の効果を研究するための実験設計。１×１０^７個のＰＢＭＣ、または１×１０^７個のＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と混合された１×１０^７個のＤＣが枯渇したＰＢＭＣを、０日目に、ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。

ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞によるＡＭＬ腫瘍細胞死滅能。（Ａ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＵ９３７ヒトＡＭＬ死滅を研究するための実験設計。（Ｂ）２４時間での（Ａ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。（Ｃ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＨＬ６０ヒトＡＭＬ死滅を研究するための実験設計。（Ｄ）２４時間での（Ａ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。データを平均±ＳＥＭとして表した。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞によるＡＭＬ腫瘍細胞死滅能。（Ａ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＵ９３７ヒトＡＭＬのＣＤ１ｄ依存性死滅を研究するための実験設計。（Ｂ）２４時間での（Ａ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）（Ｅ：Ｔ＝１：５）。データを平均±ＳＥＭとして表した。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞によるＡＭＬ腫瘍細胞死滅能。（Ａ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＵ９３７ヒトＡＭＬ死滅を研究するための実験設計。（Ｂ）２４時間での（Ａ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。（Ｃ）ＰＢＭＣのＵ９３７ヒトＡＭＬ死滅を研究するための実験設計。（Ｄ）１２時間での（Ｃ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。（Ｅ）ＰＢＭＣおよび^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＵ９３７ヒトＡＭＬ死滅を研究するための実験設計。（Ｆ）２４時間での（Ｅ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。データを平均±ＳＥＭとして表した。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞によるＡＭＬ腫瘍細胞死滅能。（Ａ）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＨＬ６０ヒトＡＭＬ死滅を研究するための実験設計。（Ｂ）２４時間での（Ａ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。（Ｃ）ＰＢＭＣのＨＬ６０ヒトＡＭＬ死滅を研究するための実験設計。（Ｄ）１２時間での（Ｃ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。（Ｅ）ＰＢＭＣおよび^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＨＬ６０ヒトＡＭＬ死滅を研究するための実験設計。（Ｆ）２４時間での（Ｅ）からの腫瘍死滅データ（ｎ＝４）。データを平均±ＳＥＭとして表した。ｎｓ、有意ではない、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による。

ヒト異種移植マウスモデルにおけるＡＭＬに対するＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性。（Ａ）Ｕ９３７－ＦＧヒトＡＭＬ異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用してＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を研究するための実験設計。１×１０^６個のＵ９３７－ＦＧ細胞を、０日目に、ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射し、１×１０^７個のＰＢＭＣ、もしくは２×１０^７個のＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と混合された１×１０^７個のＰＢＭＣを、３日目に、ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。（Ｂ）経時的な実験マウスにおける腫瘍量を示すＢＬＩ画像。（Ｃ）（Ｂ）の定量化（ｎ＝５～８）。（Ｄ）マウス生存率のカプランマイヤー分析（ｎ＝５～８）。データを平均±ＳＥＭとして表した。ｎｓ、有意ではない、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析による（Ｃ）、または多重比較のために調整されたログランク（マンテルコックス）検定による（Ｄ）。

Ｔ細胞、例えば、従来型および非従来型のＴ細胞（すなわち、ｉＮＫＴまたはＮＫＴ細胞）は、がんに対する免疫応答の媒介および編成に一定の特定の役割を果たし、それ故、がんおよび他の疾患の処置の魅力的な治療標的である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、事前の感作なく、悪性細胞に対する一時的な迅速な免疫応答を媒介する自然免疫系の一部であり、より重要なこととして、これらの細胞は、腫瘍免疫監視に非常に重要役割を果たす。最近、ＮＫベースの免疫療法は、従来のＴ細胞ベースの治療の代替手段を提供する、有望な将来性を示している。ＮＫ細胞には、これらの細胞が次のようないくつかの特有の治療上の特徴を提示するので、同種異系オフザシェルフ細胞療法薬候補になる大きな可能性がある：１）これらの細胞は厳密なＨＬＡ適合性を必要とせず、それ故、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを低下させる；（２）これらの細胞には抗体およびＭＨＣを問わず悪性細胞を検出する能力があり、このことにより最前線の免疫応答が得られる；３）これらの細胞は、パーフォリンおよびグランザイムなどの細胞傷害性分子を放出することなどの、標的細胞死を誘導するための基本的メカニズムを有し、細胞死を招くがん細胞上のアポトーシス受容体を活性化し、細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用して細胞傷害性サイトカインを放出する。それらの治療可能性にもかかわらず、現行のＮＫ細胞療法法へのアプローチは、１つには、高度に精製されたＮＫ細胞の大規模産生に伴う難題により、制限されてきた。

現在、ヒトＮＫ細胞は、ヒト末梢血から新鮮に単離されている。加えて、ＮＫ細胞濃縮を、磁気ビーズに基づく方法を使用する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＮＫ細胞の負の選択、続いて、フローサイトメトリー細胞選別を使用するこれらの細胞の正の選択により、達成することができる。次いで、適切なサイトカインを補給することにより、ＮＫ細胞はさらに増幅される／ＮＫ細胞をさらに増幅することができる。この方法により増幅を達成することができるが、増幅倍数は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＮＫ細胞の少ない数により制限される。別の方法は、骨髄（ＢＭ）またはＵＣＢのどちらかに由来するＨＳＣからのＮＫ細胞の生成を含む。培養は、ＨＳＣからＮＫ細胞を生成するために「フィーダー層」としてマウス由来の間質細胞の使用を必要とする。しかし、マウスフィーダー細胞の使用は、異種夾雑のリスクがあり得、ＧＭＰ規制に従うことが困難である。

したがって、フィーダーフリー分化系を用いてＮＫ細胞の大量の均質集団を確実に生成することができる新規方法は、オフザシェルフＮＫ細胞療法の開発に極めて重要である。

Ｔ細胞は、それらの表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子によって抗原を認識する。Ｔ細胞により提示されるすべてのＴＣＲ分子は、単一のＴＣＲ遺伝子（ＴＣＲ分子の２つのサブユニットをコードする２つの遺伝子を含む；この文書中ではＴＣＲ遺伝子と称する）によりコードされる。Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞発生中にランダムゲノムＶ／Ｄ／Ｊ組換えプロセスによって生成され、したがって、各Ｔ細胞に特有のものである。それらのＴＣＲ遺伝子のゲノム成分に基づいて、Ｔ細胞を、アルファ－ベータＴ（αβＴ）細胞およびガンマ－デルタＴ（γδＴ）細胞という２つの大きいカテゴリーに分けることができる。アルファ－ベータＴ細胞を、サブタイプ：１）ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４Ｔ細胞；またはＴ_Ｈ細胞）とＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８Ｔ細胞；またはＣＴＬ）細胞とを含む従来型αβ Ｔ細胞；および２）１型インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞と２型ナチュラルキラーＴ（２型ＮＫＴ）細胞と粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞とを含む非従来型αβ Ｔ細胞、およびその他に、さらに分けることができる。

従来型αβ ＣＤ８Ｔ（ＣＤ８Ｔ）細胞：ＣＤ８Ｔ細胞は、多型性主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子により提示されるタンパク質ペプチド抗原を認識する。ＣＤ８Ｔ細胞は、標的病原性細胞を死滅させるための強力な細胞傷害性細胞である。ＣＤ８Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とも呼ばれる。

従来型αβ ＣＤ４Ｔ（ＣＤ４Ｔ）細胞：ＣＤ４Ｔ細胞は、多型性ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されるタンパク質ペプチド抗原を認識する。ＣＤ４Ｔ細胞は、免疫応答を編成するヘルパーＴ（Ｔ_Ｈ）細胞である。それらの特殊化した機能に基づいて、ＣＤ４Ｔ細胞を、さらなるサブタイプ：Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ１７、Ｔ_ＦＨ、Ｔ_Ｈ９、Ｔ_ＲＥＧなどに、分類することができる。

１型インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞：ｉＮＫＴ細胞は、非多型性非古典的ＭＨＣクラスＩ様分子ＣＤ１ｄにより提示される糖脂質抗原を認識する。それ故、ｉＮＫＴ細胞は、同種異系レシピエントに養子移入されたときに移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。ｉＮＫＴＴＣＲは、インバリアントアルファ鎖（マウスではＶα１４－Ｊα１８；ヒトではＶα２４－Ｊα１８）および選ばれた少数のベータ鎖（マウスでは主にＶβ８／Ｖβ７／Ｖβ２；ヒトでは主にＶβ１１）を含む。マウスｉＮＫＴ細胞とヒトｉＮＫＴ細胞の両方が、合成アゴニスト糖脂質リガンドであるアルファ－ガラクトシルセラミド（αＧＣ、またはα－ＧＣ、またはα－ＧａｌＣｅｒ）に応答する。

２型ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞：２型ＮＫＴ細胞もＣＤ１ｄに限定される。２型ＮＫＴ細胞は、より多様なＴＣＲレパートリーを有し、それらの抗原は、あまり明確に規定されていない。

フィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法は、オフザシェルフのモノクローナルＴＣＲで武装化された遺伝子操作Ｔ（ＴＡＲＧＥＴ）およびナチュラルキラー（ＴＡＮＫ）細胞を高純度かつ高収率で生成するために明らかにされる。

産生手順は、１）選択されたモノクローナルＴＣＲ遺伝子を発現するようにＨＳＣを遺伝子改変すること、２）フィーダー細胞を用いずに遺伝子改変ＨＳＣをモノクローナルＴＣＲで武装化されたＴまたはＮＫ細胞にｅｘｖｉｖｏで分化させること、および３）細胞をｉｎｖｉｔｒｏ／ｅｘｖｉｖｏで増幅することを含む。増幅方法は、ＴＣＲ刺激（例えば、ＴＣＲ同族抗原または抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗原で）も含む。本明細書に記載される細胞培養方法および組成物を、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子編集およびＨＬＡ－Ｅ遺伝子操作と組み合わせて、同種異系養子移入に好適であり、したがって、オフザシェルフ細胞製品として利用することができるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性ＨＬＡ－Ｅ陽性汎用細胞を産生することができる。

モノクローナルＴＣＲによりもたらされる抗原特異性に加えて、細胞を、追加の標的化分子を発現するようにさらに操作して、それらの疾患標的化能力を増強することができる。そのような標的化分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、他のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、天然もしくは合成受容体／リガンド、またはその他であり得る。結果として得られた^ＵＣＡＲ－細胞、^ＵＴＣＲ－細胞、または^ＵＸ－細胞を、その後、オフザシェルフ疾患標的化細胞療法に利用することができる。

細胞およびそれらの誘導体を、Ｔ細胞共刺激因子をコードする遺伝子を過剰発現するように、またはＴ細胞阻害因子をコードする遺伝子を破壊するように、さらに操作することによって、機能的に強化された細胞および誘導体を得ることができる。

ＨＳＣは、臍帯血もしくはＧ－ＣＳＦ動員末梢血（ＣＢＨＳＣもしくはＰＢＳＣ）から単離することができる、または胚性もしくは人工多能性幹細胞（ＥＳ－ＨＳＣもしくはｉＰＳ－ＨＳＣ）に由来し得る、ヒトＣＤ３４^＋造血始原および幹細胞を指す。選択されたモノクローナルＴＣＲ遺伝子は、従来型αβ ＴＣＲ（ＣＤ４ＴＣＲもしくはＣＤ８ＴＣＲ）、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）ＴＣＲ、非インバリアントＮＫＴＴＣＲ、ＭＡＩＴＴＣＲ、γδＴＣＲ、または他のＴＣＲをコードし得る。
Ｉ．定義

本開示は、一部の実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血始原細胞（ＨＰＣ）から操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞である、「ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞」、ならびにこれらの細胞を作製および使用する方法を包含する。本明細書で使用される場合、「ＨＳＣ」は、ＨＳＣ、ＨＰＣ、またはＨＳＣとＨＰＣの両方を指すために使用される。

用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、処置される疾患または状態の少なくとも１つの症状または徴候を緩和、改善または予防するために有効である量を指す。

用語「外来性ＴＣＲ」は、細胞に移入される（すなわち、遺伝子移入／形質導入／トランスフェクション技法により）、またはＴＣＲ遺伝子もしくは遺伝子誘導体の移入を受けた細胞の子孫である、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子誘導体を指す。外来性ＴＣＲ遺伝子は、レシピエント細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、挿入は、ランダム挿入である。ＴＣＲ遺伝子のランダム挿入は、当技術分野において公知の方法により容易に達成される。一部の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子は、内在性遺伝子座（例えば、内在性ＴＣＲ遺伝子座）に挿入される。一部の実施形態では、細胞は、内在性遺伝子座ではない遺伝子座に挿入されている１つまたは複数のＴＣＲ遺伝子を含む。一部の実施形態では、細胞は、マーカーまたは耐性遺伝子などの、異種配列をさらに含む。

用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性をグラフトする、操作された受容体を指す。これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞上にグラフトするために使用され、それらのコード配列の移入は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターにより助長される。これらの受容体は、異なる供給源からの部分で構成されているため、キメラと呼ばれる。これらの分子の最もよく見られる形態は、ＣＤ３－ゼータ膜貫通およびエンドドメイン；ＣＤ２８もしくは４１ＢＢ細胞内ドメイン、またはこれらの組合せに融合された、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。このような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してシグナルの伝達をもたらす。このような構築物の例は、ハイブリドーマ１４ｇ２ａに由来するｓｃＦｖ（これは、ジシアロガングリオシドＧＤ２を認識する）の融合体である１４ｇ２ａ－ゼータである。Ｔ細胞がこの分子を発現すると（オンコレトロウイルスベクター形質導入により達成される例として）、それらは、ＧＤ２を発現する標的細胞（例えば、神経芽細胞腫細胞）を認識し、死滅させる。悪性Ｂ細胞を標的とするように、研究者らは、Ｂ細胞系列分子であるＣＤ１９に対して特異的なキメラ免疫受容体を使用してＴ細胞の特異性の方向を変えた。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変部分が柔軟なリンカーにより融合されて、ｓｃＦｖが形成される。このｓｃＦｖにシグナルペプチドが先行して、新生タンパク質を小胞体およびその後の表面発現（これが切断される）に方向付ける。柔軟なスペーサーによって、ｓｃＦｖは、抗原結合できるように様々な方向に配向することが可能になる。膜貫通ドメインは、細胞内に突出しており所望のシグナルを伝達するシグナル伝達ドメインの元の分子に通常は由来する、典型的な疎水性アルファヘリックスである。

用語「抗原」は、自体に対する抗体を免疫系に産生させる、またはＴ細胞が応答する、任意の物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、長さ５～５０アミノ酸であるか、あるいは少なくとも、多くとも、もしくは正確に５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０もしくは３００アミノ酸、またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲である、ペプチドである。

用語「レシピエントに対して同種異系」は、レシピエントから単離されたものでない細胞を指すように意図されている。一部の実施形態では、細胞は、患者から単離されたものでない。一部の実施形態では、細胞は、遺伝的に適合する個体（例えば、適合性遺伝子型を有する血縁者）から単離されたものでない。

用語「不活性の」は、望ましくない臨床毒性をもたらさないものを指す。この臨床毒性は、狙い通り毒性であることもあり得、あるいはオフターゲット毒性であることもあり得る。「不活性」は、既知の臨床安全性データに基づくこともあり、または予測臨床安全性データに基づくこともある。

用語「ゼノフリー（ＸＦ）」または「動物性成分を含まない（ＡＣＦ）」または「動物質を含まない」は、培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して使用される場合、異種動物由来成分を本質的に含まない、培地、細胞外マトリックス、または培養条件を指す。ヒト細胞を培養する場合、マウスなどの非ヒト動物のいずれのタンパク質もゼノ成分となる。ある特定の態様では、ゼノフリーマトリックスは、いずれの非ヒト動物由来成分も本質的に含まないものであり得、したがって、マウスフィーダー細胞も、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）も含まないことになり得る。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、ラミニン（主成分）、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよびエンタクチン／ニドゲンを含むような細胞外マトリックスタンパク質が豊富な腫瘍である、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物である。

用語「規定された」は、培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して使用される場合、ほぼすべての成分の性質および量が既知である、培地、細胞外マトリックス、または培養条件を指す。

「既知組成培地」は、ほぼすべての構成成分の化学的性質およびそれらの量が既知である培地を指す。これらの培地（mediua）は、合成培地とも呼ばれる。既知組成培地の例としては、ＴｅＳＲ（商標）が挙げられる。

細胞は、本明細書で使用される場合、ある特定の試薬またはエレメント、例えば、血清、シグナル伝達阻害剤、動物性成分またはフィーダー細胞、外来性遺伝子エレメントまたはベクターエレメントを、細胞が有するこれらのエレメントが１０％未満であるとき、実質的に含まず、ある特定の試薬またはエレメントを、細胞が有するこれらのエレメントが１％未満であるとき、「本質的に含まない」。しかし、全細胞集団の０．５％未満または０．１％未満が外来性遺伝子エレメントまたはベクターエレメントを含む、細胞集団が、よりいっそう望ましい。

培養物、マトリックスまたは培地は、血清、シグナル伝達阻害剤、動物性成分またはフィーダー細胞などの、ある特定の試薬またはエレメントを、培養物、マトリックスもしくは培地が、当業者に公知の従来の検出方法を使用して検出可能なレベルより低レベルのこれらの試薬を有するか、またはこれらの試薬が、培養物にも、マトリックスにも、培地にも外部から添加されなかった場合、「本質的に含まない」。無血清培地は、血清を本質的に含まない。

「末梢血細胞」は、血液の循環プール内に見られる、赤血球、白血球および血小板を含む、血液の細胞成分を指す。

「造血幹および始原細胞」または「造血前駆細胞」は、造血系列にコミットされているが、さらなる造血分化能力がある細胞を指し、これらの細胞には、造血幹細胞、複能性造血幹細胞（血球母細胞）、骨髄始原細胞、巨核球始原細胞、赤血球始原細胞、およびリンパ系始原細が含まれる。「造血幹細胞（ＨＳＣ）」は、骨髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系列（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む、すべての血液細胞型を生じさせる複能性幹細胞である。本開示では、ＨＳＣは、「造血幹および始原細胞」と「造血前駆細胞」の両方を指す。

造血幹および始原細胞は、ＣＤ３４を発現することもあり、または発現しないこともある。造血幹細胞は、ＣＤ１３３を共発現することがあり、ＣＤ３８に対して陰性、ＣＤ９０に対して陽性、ＣＤ４５ＲＡに対して陰性、系列マーカーに対して陰性、またはこれらの組合せであることがある。造血始原細胞／前駆細胞は、ＣＤ３４（^＋）／ＣＤ３８（^＋）細胞およびＣＤ３４（^＋）／ＣＤ４５ＲＡ（^＋）／ｌｉｎ（^－）ＣＤ１０^＋（リンパ系共通始原細胞）、ＣＤ３４（^＋）ＣＤ４５ＲＡ（^＋）ｌｉｎ（^－）ＣＤ１０（^－）ＣＤ６２Ｌ（ｈｉ）（リンパ系優位型複能性始原細胞）、ＣＤ３４（^＋）ＣＤ４５ＲＡ（^＋）ｌｉｎ（^－）ＣＤ１０（^－）ＣＤ１２３^＋（顆粒球－単球始原細胞）、ＣＤ３４（^＋）ＣＤ４５ＲＡ（^－）ｌｉｎ（^－）ＣＤ１０（^－）ＣＤ１２３^＋（骨髄系共通始原細胞）、またはＣＤ３４（^＋）ＣＤ４５ＲＡ（^－）ｌｉｎ（^－）ＣＤ１０（^－）ＣＤ１２３^－（巨核球－赤血球始原細胞）を含む。

「ベクター」または「構築物」（遺伝子送達または遺伝子移入「媒体」と呼ばれることもある）は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏのどちらかで宿主細胞に送達すべきポリヌクレオチドを含む、高分子、分子の複合体、またはウイルス粒子を指す。ポリヌクレオチドは、直鎖状分子であってもよく、または環状分子であってもよい。

一般的なタイプのベクターである「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは無関係に複製することができる、染色体ＤＮＡとは別の染色体外ＤＮＡ分子である。ある特定の場合には、プラスミドは、環状および二本鎖状である。

「発現構築物」または「発現カセット」とは、転写を指示することができる核酸分子を意味する。発現構築物は、プロモーター、またはプロモーターと機能的に等価の構造を、少なくとも含む。追加のエレメント、例えば、エンハンサー、および／または転写終結シグナルも、含み得る。

用語「外来性」は、細胞内または生物体内のタンパク質、遺伝子、核酸またはポリヌクレオチドに関して使用される場合、細胞もしくは生物に人工的手段により導入されたタンパク質、遺伝子、核酸もしくはポリヌクレオチド指し、または細胞に関しては、単離され、その後、他の細胞にまたは生物に人工的手段により導入された細胞を指す。外来性核酸は、異なる生物もしくは細胞からのものであることもあり、または生物体内もしくは細胞内に天然に存在する核酸の１つもしくは複数の追加のコピーであることもある。外来性細胞は、異なる生物からのものであることもあり、または同じ生物からのものであることもある。非限定的な例として、外来性核酸は、天然の細胞のものとは異なる染色体位置にあるか、または天然に見られるものとは異なる核酸配列と別様に隣接している。

用語「に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部分と相同である（すなわち、同一であり、厳密に進化的に関連していない）こと、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するように、本明細書では使用される。対照的に、用語「に相補的」は、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部分と相同であることを意味するように、本明細書では使用される。説明のために、ヌクレオチオ配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。

特定のタンパク質「をコードする」、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「導入遺伝子」は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、転写され、必要に応じて遺伝子産物、例えばポリペプチド、に翻訳もされる、核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ形態のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖状（すなわち、センス鎖）であることもあり、または二本鎖状であることもある。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより決定される。遺伝子は、原核生物または真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含むことができるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常は、遺伝子配列の３’側に位置することになる。

用語「細胞」は、当技術分野におけるその最も広い意味で本明細書では使用され、多細胞生物の組織の構造単位である生体であって、外部からそれを単離する膜構造により包囲されており、自己複製能力を有し、遺伝情報およびそれを発現するためのメカニズムを有する、生体を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞であることもあり、または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であることもある。

本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、自己複製および多能性または複能性の能力がある細胞を指す。典型的に、幹細胞は、傷害組織を再生することができる。本明細書における幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞または組織幹細胞（組織特異的幹細胞、または体性幹細胞とも呼ばれる）であり得るが、これらに限定されない。

「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、１９８１年に最初に樹立され、１９８９年以降はノックアウトマウスの産生にも利用されている。１９９８年に、ヒトＥＳ細胞が樹立され、今やそれが再生医療に利用可能になりつつある。

ＥＳ細胞とは異なり、組織幹細胞は、限られた分化能を有する。組織幹細胞は、組織内の特定の位置に存在し、未分化細胞内構造を有する。したがって、組織幹細胞の多能性は、通常は低い。組織幹細胞は、より高い核／細胞質比を有し、細胞内小器官をほとんど有さない。大部分の組織幹細胞は、低い多能性、長い細胞周期、および個体の寿命を超える増殖能力を有する。組織幹細胞は、これらの細胞が由来した部位に基づいて、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系およびこれらに類するものなどのカテゴリーに分けられる。皮膚系における組織幹細胞は、表皮幹細胞、毛包幹細胞、およびこれらに類するものを含む。消化系における組織幹細胞は、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞、およびこれらに類するものを含む。骨髄系における組織幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、およびこれらに類するものを含む。神経系における組織幹細胞は、神経幹細胞、網膜幹細胞、およびこれらに類するものを含む。

ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと一般に略される「人工多能性幹細胞」は、非多能性細胞、通常は成熟体細胞、または最終分化した細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞、またはこれらに類するものから、リプログラミング因子と呼ばれるある特定の因子を導入することにより、人工的に調製されるタイプの多能性幹細胞を指す。

例えば細胞および／または核酸に関して、本明細書で使用される場合の「単離された」は、自然な状態から人間の介入によって変更されたまたは除去された、を意味する。

「多能性」は、１つもしくは複数の組織もしくは臓器、または特に、３つの胚葉：内胚葉（胃内部の内膜、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）もしくは外胚葉（表皮組織および神経系）のうちのいずれか、を構成するあらゆる細胞へ分化する能力がある幹細胞を指す。本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞、例えば、全能性細胞または誘導多能性細胞の直系の子孫、へ分化することができる細胞を指す。

核酸分子に関して、「作動可能に連結された」とは、２つもしくはそれより多くの核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーター、およびエンハンサーエレメント）が、核酸分子の転写を可能にするように接続されていることを意味する。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子に関して、「作動可能に連結された」とは、２つまたはそれより多くのペプチドおよび／またはポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖、すなわち融合ポリペプチドであって、その融合体の各ペプチドおよび／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有する単一のポリペプチド鎖、を生じさせるように接続されていることを意味する。融合ポリペプチドは、詳細にはキメラであり、すなわち、異種分子で構成されている。

本開示の実施形態は、ＮＫＴ細胞Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するｉＮＫＴ細胞として機能するように操作されたＨＳＣ細胞であって、イメージングおよび自殺標的化能力もあり、宿主免疫細胞を標的とした枯渇に対して耐性を示す、ＨＳＣ細胞に関する。一部の実施形態では、そのような細胞は、高効率かつ高収率でのＴＣＲ操作ＨＳＣのクローンＴ細胞への分化を支持する人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）ｉｎｖｉｔｒｏ培養系で生成される。一部の実施形態では、そのような細胞は、ＡＴＯ培養系で生成されない。一部の実施形態では、そのような細胞は、フィーダー細胞を含まない（すなわち、「フィーダーフリー」である）培養系を使用して生成される。
ＩＩ．汎用造血幹細胞（ＨＳＣ）操作インバリアントＮＫＴ細胞（^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞）
本開示の実施形態は、インバリアントＮＫＴ細胞として機能するように改変される細胞であって、細胞のレシピエントにおける有害な免疫反応なく細胞を汎用的使用（原細胞が得られた個体以外の個体への使用）に適したものにする１つまたは複数の特徴を有するように操作される細胞（例えば、ＨＳＣ）を利用する。本開示は、ｉ）ｉＮＫＴアルファＴ細胞受容体遺伝子のすべてまたは一部と、ｉｉ）ｉＮＫＴベータＴ細胞受容体遺伝子のすべてまたは一部と、ｉｉｉ）自殺遺伝子とを含む核酸を含む操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように変更された、操作されたｉＮＫＴ細胞を包含する。
ＩＩＩ．細胞培養方法の詳細な説明
Ａ．ＴＡＲＧＥＴ細胞培養方法実施形態
１．段階１：ＴＡＲＧＥＴ細胞分化

一部の実施形態では、新鮮なまたは凍結／解凍されたＣＤ３４^＋ＨＳＣを、レトロネクチンでコーティングされたフラスコ内で１２～７２時間、幹細胞培養培地（ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌおよびその他を含むサイトカインカクテルが補給された基本培地）中で培養し、その後、ＴＣＲ遺伝子送達ベクターを添加し、さらに１２～４８時間培養する。

一部の実施形態では、次いで、ＴＣＲ遺伝子改変ＨＳＣを、フィーダーを用いずに４～１０週間にわたって分化培地中でＴＡＲＧＥＴ細胞へと分化させる。非組織培養処理プレートをＴＡＲＧＥＴ培養コーティング（ＴＡＲＧＥＴｃ）材料（ＤＬＬ－１／４、ＶＣＡＭ－１／５、レトロネクチン、およびその他）でコーティングする。ＣＤ３４^＋ＨＳＣをＴＡＲＧＥＴ増幅（ＴＡＲＧＥＴｅ）培地（血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２－メルカプトエタノール、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、Ｆｌｔ３リガンド、ヒトＬＤＬ、ＵＭ１７１および添加剤を含有する、基本培地）に懸濁させ、プレート内のコーティングされたウェルに播種し、３～７日間培養する。ＴＡＲＧＥＴｅ培地を３～４日ごとに新しいものに交換する。次いで、細胞を収集し、ＴＡＲＧＥＴ成熟（ＴＡＲＧＥＴｍ）培地（血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２－メルカプトエタノール、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｆｌｔ３リガンド、アスコルビン酸および添加剤を含有する、基本培地）に懸濁させる。ＴＭＭを週に１～２回、新しいものに交換する。
２．段階２：ＴＡＲＧＥＴ細胞増幅

一部の実施形態では、分化したＴＡＲＧＥＴを、ＴＣＲ同族抗原（タンパク質、ペプチド、脂質、蛍光体－抗原、小分子、およびその他）または非特異的ＴＣＲ刺激試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体または抗体コーティングビーズ、コンカナバリンＡ、ＰＭＡ／イオノマイシン、およびその他）で刺激し、Ｔ細胞培養培地中で最大１か月間、増幅する。培養物に、Ｔ細胞支持サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびその他）を補給することができる。
３．ＴＡＲＧＥＴ細胞誘導体

一部の実施形態では、ＴＡＲＧＥＴ細胞を、追加の導入遺伝子を発現するようにさらに操作することができる。一実施形態では、そのような導入遺伝子は、疾患標的化分子、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および他の天然または合成受容体／リガンドをコードする。別の実施形態では、そのような導入遺伝子は、Ｔ細胞調節タンパク質、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３およびその他をコードすることができる。導入遺伝子を、ＴＡＲＧＥＴ細胞またはそれらの始原細胞（ＨＳＣ、新たに分化したＴＡＲＧＥＴ細胞、増幅中のＴＡＲＧＥＴ細胞）に、増幅後、様々な培養段階で導入することができる。

一部の実施形態では、遺伝子編集ツール（ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、およびその他）を使用して、選択された遺伝子を破壊するようにＴＡＲＧＥＴ細胞をさらに操作することができる。一実施形態では、破壊される遺伝子は、Ｔ細胞免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、およびその他）をコードする。これらの負の調節遺伝子の欠損は、ＴＡＲＧＥＴ細胞の疾患と闘う能力を増強することができ、その結果、ＴＡＲＧＥＴ細胞を、疾患により誘導されるアネルギーおよび寛容に対して耐性にする。

一部の実施形態では、ＴＡＲＧＥＴ細胞または増強されたＴＡＲＧＥＴ細胞を、同種異系養子移入に適したものにするようにさらに操作することによって、オフザシェルフ細胞製品として役立つことに適したものにすることができる。一実施形態では、ＭＨＣ分子またはＭＨＣ発現／提示調節分子［ＭＨＣ分子、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ（ＭＨＣクラスＩＩｍＲＮＡ発現のクラスＩＩ転写活性化因子制御誘導）、およびその他］をコードする遺伝子。ＴＡＲＧＥＴ細胞上のＭＨＣ分子発現の欠如は、ＴＡＲＧＥＴ細胞を同種異系宿主Ｔ細胞媒介枯渇に対して耐性にする。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ欠損ＴＡＲＧＥＴ細胞は、これらの細胞に宿主ＮＫ細胞媒介枯渇に対する耐性を付与することになるＨＬＡ－Ｅ遺伝子を過剰発現するように、さらに操作されることになる。

ＴＡＲＧＥＴ細胞および誘導体を新鮮な状態で使用することができ、またはさらなる利用のために凍結保存することができる。さらに、ＴＡＲＧＥＴ細胞培養中に生成される様々な中間細胞製品を、凍結保存のために休止させること、保管すること、および連続生産のために回復させることができる。
４．新規特徴および利点

本開示の態様は、異種フィーダー細胞を必要としないｉｎｖｉｔｒｏ分化方法を提供する。この新しい方法は、ヒトに適用するための治療用細胞の、規模拡大生産およびＧＭＰに準拠した製造のためのプロセスを、大幅に改善する。

細胞製品であるＴＡＲＧＥＴ細胞は、それらの天然の対応物であるＴ細胞のものと明確に異なり、他のｅｘｖｉｖｏ培養方法（例えば、ＡＴＯ培養方法）を使用して生成されたそれらの対応物であるＴ細胞のものとも明確に異なる表現型／機能性を提示し、このことが、ＴＡＲＧＥＴ細胞を独特な細胞製品にする。

ＴＡＲＧＥＴ細胞分化培養の特有の特徴としては、以下のものが挙げられる：１）それは、ｅｘｖｉｖｏかつフィーダーフリーである。２）それは、ＴＣＲＶ／Ｄ／Ｊ組換えを支持せず、そのためランダムに再構成された内在性ＴＣＲがなく、したがってＧｖＨＤリスクがない。３）それは、トランスジェニックＴＡＲＧＥＴ細胞の分化同調を支持することによって、バイスタンダー免疫細胞の未分化始原細胞および他の系列の存在を排除する。４）結果として、ＴＡＲＧＥＴ細胞製品は、モノクローナルＴＣＲで武装化されたＴ細胞の均質かつ純粋な集団を含む。逃れたランダムＴ細胞がなく、免疫細胞の他の系列がなく、未分化始原細胞がない。したがって、精製ステップの必要性がない。５）高収率。約１０^１２個のＴＡＲＧＥＴ細胞（１，０００～１０，０００用量）を健康なドナーのＰＢＳＣから生成することができ、約１０^１１個のＴＡＲＧＥＴ細胞（１００～１，０００用量）を健常なドナーのＣＢＨＳＣから生成することができる。６）ＴＡＲＧＥＴ細胞の特有の表現型－トランスジェニックＴＣＲ^＋内在性ＴＣＲ^－ＣＤ３^＋。（注記：ＴＡＲＧＥＴ細胞分化培養のこれらの特有の特徴により、それは、健康なドナーのＰＢＭＣに基づくＴ細胞培養、ＡＴＯ培養および他のものを含む、オフザシェルフＴ細胞製品を生成するための他の方法からのものとは明確に異なる。図８を参照されたい）。
５．例示的細胞培養培地

本開示の操作された免疫細胞を生成するために使用され得る細胞培養培地の例が提供される。
ａ．幹細胞培養段階（Ｄ０～Ｄ２）

基本培地：Ｘ－ＶＩＶＯ１５商標（Ｌｏｎｚａ）

サプリメント：ｈＦｌｔ３－Ｌ５０ｎｇ／ｍｌ、ｈＳＣＦ５０ｎｇ／ｍｌ、ｈＴＰＯ５０ｎｇ／ｍｌ、ｈＩＬ－３１０ｎｇ／ｍｌ
ｂ．リンパ系始原細胞増幅段階（Ｗ１～Ｗ２）

基本培地：ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。含有成分：イスコフＭＤＭ、ウシ血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン（鉄飽和型）、２－メルカプトエタノール、サプリメント

コーティング材料：ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＬｙｍｐｈｏｉｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＣｏａｔｉｎｇＭａｔｅｒｉａｌ（１００Ｘ）（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。含有成分：ｈＤＬＬ４（５０ｕｇ／ｍｌ）、ｈＶＣＡＭ１（１０ｕｇ／ｍｌ）、他のサプリメント

サプリメント：ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＬｙｍｐｈｏｉｄＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒＥｘｐａｎｓｉｏｎＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１０Ｘ）（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。含有成分：ｈＦｌｔ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－７（２５ｎｇ／ｍｌ）、ｈＭＣＰ－４（１ｎｇ／ｍｌ）、ｈＴＰＯ（５ｎｇ／ｍｌ）、ｈＳＣＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）、他のサプリメント
ｃ．Ｔ細胞始原細胞成熟段階（Ｗ３～Ｗ４）

サプリメント：ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＬｙｍｐｈｏｉｄＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒＥｘｐａｎｓｉｏｎＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１０Ｘ）（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。含有成分：ｈＦｌｔ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－７（２５ｎｇ／ｍｌ）、他のサプリメント
ｄ．Ｔ細胞活性化段階（Ｗ５）

サプリメント：

１）ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＬｙｍｐｈｏｉｄＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒＥｘｐａｎｓｉｏｎＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１０Ｘ）（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。含有成分：ｈＦｌｔ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－７（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、他のサプリメント

２）ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ＨｕｍａｎＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ＴＣｅｌｌＡｃｔｉｖａｔｏｒ（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。含有成分：ａｈＣＤ３Ａｂクローン：ＯＫＴ３（１ｕｇ／ｍｌ）、ａｈＣＤ２８Ａｂクローン：ＣＤ２８．２（１ｕｇ／ｍｌ）、ａｈＣＤ２Ａｂクローン：ＲＰＡ－２．１０（１ｕｇ／ｍｌ）
ｅ．Ｔ細胞増幅段階（Ｗ６）

基本培地：Ｔ細胞培地。含有成分：Ｘ－ｖｉｖｏ１５無血清培地（Ｌｏｎｚａ、ＡｌｌｅｎｄａｌｅＮＪ）、５％（体積／体積）ＧｅｍＣｅｌｌヒト血清抗体ＡＢ（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏＣＡ）、１％（体積／体積）グルタマックス－１００Ｘ（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝剤（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１％（体積／体積）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１２．２５ｍＭＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｓｉｇｍａ）

サプリメント：ｈＩＬ７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ１５（５０ｎｇ／ｍｌ）

他の肝要な材料：１００ｎｇ／ｍｌのα－ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ、ＳＫＵ＃８６７０００Ｐ－１ｍｇ）、ａｈＣＤ３Ａｂクローン：ＯＫＴ３（５ｕｇ／ｍｌ）、ａｈＣＤ２８Ａｂクローン：ＣＤ２８．２（５ｕｇ／ｍｌ）
Ｂ．ＴＡＮＫ細胞培養方法実施形態
１．段階１：ＴＡＮＫ細胞分化

一部の実施形態では、新鮮なまたは凍結／解凍されたＣＤ３４^＋ＨＳＣを、レトロネクチンでコーティングされたフラスコ内で１２～７２時間、幹細胞培養培地（ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌおよびその他を含む、サイトカインカクテルを補給が補給された基本培地）中で培養し、その後、ＴＣＲ遺伝子送達ベクターを添加し、さらに１２～４８時間培養する。

一部の実施形態では、次いで、ＴＣＲ遺伝子改変ＨＳＣを、フィーダーを用いずに２～４週間にわたって分化培地中でＴＡＮＫ細胞へと分化させる。非組織培養処理プレートをＴＡＮＫ培養コーティング（ＴＡＮＫｃ）材料（ＤＬＬ－１／４、ＶＣＡＭ－１／５、レトロネクチン、およびその他）でコーティングする。ＣＤ３４^＋ＨＳＣを、ＴＡＮＫ増幅（ＴＡＮＫｅ）培地（Ｂ２７サプリメント、アスコルビン酸、グルタマックス、ヒト血清ＡＢ／アルブミン、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯ、白血病抑制因子、ＧＭ－ＣＳＦおよびその他を含有する、基本培地）に懸濁させ、プレート内のコーティングされたウェルに播種し、７～１０日間培養する。ＴＡＮＫｅ培地を３～５日ごとに新しいものに交換する。次いで、細胞を収集し、ＴＡＮＫ成熟（ＴＡＮＫｍ）培地（Ｂ２７サプリメント、アスコルビン酸、グルタマックス、ヒト血清ＡＢ／アルブミン、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、ＴＰＯ、白血病抑制因子およびその他を含有する、基本培地）に懸濁させ、さらに７～１０日間培養する。ＴＡＮＫｍ培地を３～５日ごとに新しいものに交換する。
２．段階２：ＴＡＮＫ細胞増幅

一部の実施形態では、分化したＴＡＮＫを、ＴＣＲ同族抗原（タンパク質、ペプチド、脂質、蛍光体－抗原、小分子、およびその他）または非特異的ＴＣＲ刺激試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体または抗体コーティングビーズ、コンカナバリンＡ、ＰＭＡ／イオノマイシン、およびその他）で刺激し、Ｔ細胞培養培地中で最大１か月間、増幅する。培養物に、Ｔ細胞支持サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびその他）を補給することができる。
３．ＴＡＮＫ細胞誘導体

一部の実施形態では、ＴＡＮＫ細胞を、追加の導入遺伝子を発現するようにさらに操作することができる。一実施形態では、そのような導入遺伝子は、疾患標的化分子、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および他の天然または合成受容体／リガンドをコードする。別の実施形態では、そのような導入遺伝子は、Ｔ細胞調節タンパク質、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３およびその他をコードすることができる。導入遺伝子を、ＴＡＮＫ細胞またはそれらの始原細胞（ＨＳＣ、新たに分化したＴＡＮＫ細胞、増幅中のＴＡＮＫ細胞）に、増幅後、様々な培養段階で導入することができる。

一部の実施形態では、遺伝子編集ツール（ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、およびその他）を使用して、選択された遺伝子を破壊するようにＴＡＮＫ細胞をさらに操作することができる。一実施形態では、破壊される遺伝子は、Ｔ細胞免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、およびその他）をコードする。これらの負の調節遺伝子の欠損は、ＴＡＮＫ細胞の疾患と闘う能力を増強することができ、その結果、ＴＡＮＫ細胞を、疾患により誘導されるアネルギーおよび寛容に対して耐性にする。

一部の実施形態では、ＴＡＮＫ細胞または増強されたＴＡＮＫ細胞を、同種異系養子移入に適したものにするようにさらに操作することによって、オフザシェルフ細胞製品として役立つことに適したものにすることができる。一実施形態では、ＭＨＣ分子またはＭＨＣ発現／提示調節分子［ＭＨＣ分子、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ（ＭＨＣクラスＩＩｍＲＮＡ発現のクラスＩＩ転写活性化因子制御誘導）、およびその他］をコードする遺伝子。ＴＡＮＫ細胞上のＭＨＣ分子発現の欠如は、ＴＡＮＫ細胞を同種異系宿主Ｔ細胞媒介枯渇に対して耐性にする。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ欠損ＴＡＮＫ細胞は、これらの細胞に宿主ＮＫ細胞媒介枯渇に対する耐性を付与することになるＨＬＡ－Ｅ遺伝子を過剰発現するように、さらに操作されることになる。

ＴＡＮＫ細胞および誘導体を新鮮な状態で使用することができ、またはさらなる利用のために凍結保存することができる。さらに、ＴＡＮＫ細胞培養中に生成される様々な中間細胞製品を、凍結保存のために休止させること、保管すること、および連続生産のために回復させることができる。
４．新規特徴および利点

この新しい方法は、ヒトに適用するための治療用ナチュラルキラー細胞の、規模拡大生産およびＧＭＰに準拠した製造のためのプロセスに適している。

細胞製品であるＴＡＮＫ細胞は、末梢血から増幅された天然ヒトＮＫ細胞、または他のｅｘｖｉｖｏ培養方法を使用して生成されたＮＫ細胞（例えば、ｉＰＳ細胞由来のＮＫ細胞、もしくはＣＢ由来のＮＫ細胞）とは異なる、明確に異なる発生経路を辿り、明確に異なる表現型／機能性を提示する、新規タイプのＮＫ細胞の代表である。

ＴＡＮＫ細胞培養方法および＿＿の特有の特徴としては、以下のものが挙げられる：１）ＴＡＮＫ細胞の２～３週間での分化（ＴＡＲＧＥＴ細胞分化培養およびＡＴＯＴ細胞分化培養よりはるかに速い）を支持する、デザイナーＴＡＮＫ細胞分化培養培地。２）それは、ＴＣＲＶ／Ｄ／Ｊ組換えを支持せず、そのためランダムに再構成された内在性ＴＣＲがなく、したがってＧｖＨＤリスクがない。３）それは、トランスジェニックＴＡＮＫ細胞の分化同調を支持することによって、免疫細胞の未分化始原細胞および他の系列の存在を排除する。４）結果として、ＴＡＮＫ細胞製品は、モノクローナルＴＣＲで武装化されたＴ細胞の均質かつ純粋な集団を含む。逃れたランダムＴ細胞がなく、免疫細胞の他の系列がなく、未分化始原細胞がない。したがって、精製ステップの必要性がない。５）高収率。約１０^１２個のＴＡＮＫ細胞（１，０００～１０，０００用量）を健康なドナーのＰＢＳＣから生成することができ、約１０^１１個のＴＡＮＫ細胞（１００～１，０００用量）を健常なドナーのＣＢＨＳＣから生成することができる。（注記：ＴＡＮＫ細胞分化培養のこれらの特有の特徴により、それは、健康なドナーのＰＢＭＣに基づくＮＫ細胞培養、ＣＢ由来のＮＫ細胞培養、ｉＰＳ由来のＮＫ細胞培養および他のものを含む、ＮＫ細胞製品を生成するための他の方法からのものとは明確に異なる）。
５．例示的細胞培養培地

基本培地：Ｘ－ＶＩＶＯ１５商標（Ｌｏｎｚａ）

サプリメント：ｈＦｌｔ３－Ｌ５０ｎｇ／ｍｌ、ｈＳＣＦ５０ｎｇ／ｍｌ、ｈＴＰＯ５０ｎｇ／ｍｌ、ｈＩＬ－３１０ｎｇ／ｍｌ
ｂ．増幅段階（Ｗ１）

コーティング材料：ｈＤＬＬ４（５０ｕｇ／ｍｌ）、ｈＶＣＡＭ１（１０ｕｇ／ｍｌ）

サプリメント：１００ｕＭアスコルビン酸。５％ヒト血清ＡＢ（ＧｅｍｉｎｉＣＡＴ＃８００－１２０）。４％ＸｅｎｏＦｒｅｅＢ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１７５０４０４４）、１％グルタマックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３５０５０－０６１）、ｈＦｌｔ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－７（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＭＣＰ－４（１ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、他のサプリメント
ｃ．成熟段階（Ｗ２）

サプリメント：１００ｕＭアスコルビン酸。５％ヒト血清ＡＢ（ＧｅｍｉｎｉＣＡＴ＃８００－１２０）。４％ＸｅｎｏＦｒｅｅＢ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１７５０４０４４）、１％グルタマックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３５０５０－０６１）、ｈＦｌｔ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－７（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）、他のサプリメント
ｄ．活性化段階（Ｗ３）

サプリメント：１００ｕＭアスコルビン酸。５％ヒト血清ＡＢ（ＧｅｍｉｎｉＣＡＴ＃８００－１２０）。４％ＸｅｎｏＦｒｅｅＢ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１７５０４０４４）、１％グルタマックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３５０５０－０６１）、ｈＦｌｔ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－７（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｈＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）、他のサプリメント

抗体活性化因子：ａｈＣＤ３Ａｂクローン：ＯＫＴ３（１ｕｇ／ｍｌ）、ａｈＣＤ２８Ａｂクローン：ＣＤ２８．２（１ｕｇ／ｍｌ）、ａｈＣＤ２Ａｂクローン：ＲＰＡ－２．１０（１ｕｇ／ｍｌ）
ｅ．増幅段階（Ｗ４）

他の肝要な材料：１００ｎｇ／ｍｌのα－ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ、ＳＫＵ＃８６７０００Ｐ－１ｍｇ）、ａｈＣＤ３Ａｂクローン：ＯＫＴ３（５ｕｇ／ｍｌ）、ａｈＣＤ２８Ａｂクローン：ＣＤ２８．２（５ｕｇ／ｍｌ）
ＩＶ．ｉＮＫＴ細胞

特定の実施形態では、本開示の操作されたｉＮＫＴ細胞は、ｉＮＫＴ細胞としてのそれらの活性を助長するために他の型の細胞から産生される。ｉＮＫＴ細胞は、それらをオフザシェルフ細胞療法に有用なものにする（これは、少なくともがん治療に有用なものにすることを含む）いくつかの特徴を有する、αβ Ｔリンパ球の小さい亜集団である。非ｉＮＫＴ細胞は、ｉＮＫＴ細胞の以下の利点のため、ｉＮＫＴ細胞として機能するように操作される：

１）ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍抗原拘束性およびＭＨＣ拘束性に左右されずに複数のタイプのがんを標的にする顕著な能力を有する（Fujii et al., 2013）。ｉＮＫＴ細胞は、多型性のないＣＤ１ｄにより提示される糖脂質抗原を認識し、このことによりｉＮＫＴ細胞はＭＨＣ拘束性から解放される。ｉＮＫＴ細胞の天然リガンドは、まだ同定されていないが、ｉＮＫＴ細胞は、多くの腫瘍組織に由来する一定の保存糖脂質抗原を認識することができることが、示唆されている。ＣＤ１ｄ^＋腫瘍細胞により直接提示される、あるいはＣＤ１ｄ^－腫瘍の場合はマクロファージまたは樹状細胞（ＤＣ）のような腫瘍浸潤性抗原提示細胞（ＡＰＣ）により間接的に交差提示される、これらの糖脂質抗原を認識することによって、ｉＮＫＴ細胞は刺激され得る。したがって、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ^＋腫瘍とＣＤ１ｄ^－腫瘍の両方に応答することができる。

２）ｉＮＫＴ細胞は、複数のメカニズムを利用して腫瘍細胞を攻撃することができる（Vivieret al., 2012；Fujii et al., 2013）。ｉＮＫＴ細胞は、細胞傷害性によってＣＤ１ｄ^＋腫瘍細胞を直接死滅させることができるが、ｉＮＫＴ細胞の最も強力な抗腫瘍活性は、ｉＮＫＴ細胞の免疫アジュバント効果に起因する。ｉＮＫＴ細胞は、刺激前は静止状態のままであるが、刺激後、直ちに、大量のサイトカイン、主としてＩＦＮ－γを産生する。ＩＦＮ－γは、ＮＫ細胞を活性化して、ＭＨＣ陰性腫瘍標的細胞を死滅させる。その一方で、ｉＮＫＴ細胞はまた、ＤＣを活性化し、するとこれらのＤＣがＣＴＬを刺激して、ＭＨＣ陽性腫瘍標的細胞を死滅させる。それ故、ｉＮＫＴ細胞誘導抗腫瘍免疫は、腫瘍抗原拘束性およびＭＨＣ拘束性に左右されずに複数のタイプのがんを有効に標的とすることによって、腫瘍免疫回避を有効に阻止すること、および腫瘍再発の機会を最小限に抑えることができる。

３）ｉＮＫＴ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。ｉＮＫＴ細胞は、不適合のＭＨＣ分子およびタンパク質自己抗原を認識しないため、これらの細胞は、ＧｖＨＤを引き起こすはずがない。この見解は、同種異系骨髄または末梢血幹細胞移植を受けている血液がん患者におけるドナー由来のｉＮＫＴ細胞を解析する臨床データによって強く支持される。これらの臨床データは、患者における移植同種異系ｉＮＫＴ細胞のレベルと移植片対白血病効果との間に正の相関関係およびＧｖＨＤとの間に負の相関関係が認められることを示した（Haraguchi et al., 2004；de Lalla et al., 2011）。

４）ｉＮＫＴ細胞を、宿主対移植片（ＨｖＧ）枯渇を回避するように操作することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのような強力な遺伝子編集ツールを利用できることによって、宿主免疫細胞を標的とした枯渇に対してｉＮＫＴ細胞を耐性にするようにｉＮＫＴ細胞を遺伝子改変することが可能になる：ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子のノックアウトは、ｉＮＫＴ細胞上でのＨＬＡ－Ｉ分子の発現を除去して、宿主ＣＤ８^＋Ｔ細胞により媒介される死滅を回避することになり、ＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウトは、ｉＮＫＴ細胞上でのＨＬＡ－ＩＩ分子の発現を除去して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞により媒介される死滅を回避することになる。Ｂ２Ｍ遺伝子とＣＩＩＴＡ遺伝子は両方とも、ヒト初代細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの是認されている良好な標的である（Ren et al., 2017；Abrahimi et al., 2015）。ｉＮＫＴ細胞上でのＨＬＡ－Ｉ発現の除去することによって、ｉＮＫＴ細胞は、宿主ＮＫ細胞の標的となり得る。しかし、ｉＮＫＴ細胞は、同種異系ＮＫ細胞よる死滅に対して元々耐性であるようである。とはいえ、必要に応じて、ＨＬＡ－ＥのようなＮＫ阻害遺伝子をｉＮＫＴ細胞に送達することにより懸念に対処することができる。したがって、本開示の実施形態は、Ｂ２Ｍおよび／またはＣＩＩＴＡ遺伝子を欠いている細胞に関する。

５）ｉＮＫＴ細胞は、がんと強い関連性がある。ｉＮＫＴ細胞欠損が、マウスをがんにかかりやすくさせ、ｉＮＫＴ細胞の養子移入または刺激が、がんに対する防御をもたらし得る、マウスの腫瘍監視におけるｉＮＫＴ細胞の有意な役割を示唆する説得力のある証拠がある（Vivier et al., 2012；Berzins et al., 2011）。ヒトの場合、ｉＮＫＴ細胞は、多くの場合、固形腫瘍（黒色腫、結腸、肺、乳および頭頸部がんを含む）および血液がん（白血病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群を含む）を有する患者では減少しており、その一方で、ｉＮＫＴ細胞数の増加は、よりよい予後に関連する（Berzinset al., 2011）。α－ＧａｌＣｅｒをロードしたＤＣ、およびｅｘｖｉｖｏで増幅した同種異系ｉＮＫＴ細胞の投与が、肺がんおよび頭頸部がんを有する患者において有望な臨床的利益をもたらした事例もあるが、移入に使用されたｉＮＫＴ細胞の限られた数およびその後のこれらの細胞の枯渇に恐らく起因して、ｉＮＫＴ細胞の増加は、一時的であり、臨床的利益は、短期間であった（Fujiiet al., 2012；Yamasaki et al., 2011）。したがって、複数用量で十分なｉＮＫＴ細胞を患者に移入することを可能にする「オフザシェルフ」ｉＮＫＴ細胞製品が、患者に、彼らの疾患と闘うためにｉＮＫＴ細胞の可能性を完全に引き出す最高の機会を与えることができることを提案することは、妥当と思われる。

しかし、同種異系オフザシェルフｉＮＫＴ細胞製品の開発は、それらの入手可能性によって大きく妨げられる。これらの細胞は、ヒトの場合、極めて少数の、非常にばらつきのある細胞であり（ヒト血液中に約０．００１～１％）、このことが、同種異系ヒトドナーの血液細胞からｉＮＫＴ細胞の治療用の数を成長させることを非常に困難にしているのである。したがって、大量のｉＮＫＴ細胞の均質集団を確実に生成することができる新規方法は、オフザシェルフｉＮＫＴ細胞療法の開発に肝要である。

臨床応用に十分な量のｉＮＫＴ細胞のこの不足にかんがみて、本開示の実施形態は、結果として得られる操作された細胞がｉＮＫＴ細胞として機能するように非ｉＮＫＴ細胞を操作することを包含する。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞として機能する細胞は、１つまたは複数の所望の特性を有するようにさらに改変される。特定の実施形態では、非ｉＮＫＴ細胞は、非ｉＮＫＴ細胞に対する形質導入によって、ｉＮＫＴＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変される。

本開示の実施形態では、他の型の細胞から産生されたｉＮＫＴ細胞は、それらを汎用的使用に適したものにするための１つまたは複数の特性を有するように操作される。特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの外来性インバリアントナチュラルキラーＴ細胞受容体（ｉＮＫＴＴＣＲ）核酸分子を含有するように遺伝子改変される。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血始原細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４^＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒトＣＤ３４^＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、組換え細胞である。一部の実施形態では、細胞は、培養株のものである。

一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲ核酸分子は、ヒトインバリアントナチュラルキラーＴ細胞からのものである。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲ核酸分子は、ヒトｉＮＫＴＴＣＲから得られた１つまたは複数の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲ核酸配列は、ｉＮＫＴ細胞の任意のサブセット、例えば、ＣＤ４／ＤＮ／ＣＤ８サブセット、またはＴｈ１、Ｔｈ２もしくはＴｈ１７サイトカインを産生する、および二重陰性ｉＮＫＴ細胞を含む、サブセットから得ることができる。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲ核酸配列は、黒色腫、腎がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、リンパ腫、白血病、血液悪性腫瘍およびこれらに類するものなどの、がんを有していたまたは有するドナーからのｉＮＫＴ細胞から得られる。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲ核酸分子は、１つのｉＮＫＴ細胞からのＴＣＲ－アルファ配列、および異なるｉＮＫＴ細胞からのＴＣＲ－ベータ配列を有する。一部の実施形態では、ＴＣＲ－アルファ配列が得られるｉＮＫＴ細胞、およびＴＣＲ－ベータ配列が得られるｉＮＫＴ細胞は、同じドナーからのものである。一部の実施形態では、ＴＣＲ－アルファ配列が得られるｉＮＫＴ細胞のドナーは、ＴＣＲ－ベータ配列が得られるｉＮＫＴ細胞のドナーと異なる。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ配列および／またはＴＣＲ－ベータ配列は、発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、ＴＣＲ－アルファ配列および／またはＴＣＲ－ベータ配列は、未改変配列によりコードされるポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および／または短縮化を有するポリペプチドをコードするように改変される。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲ核酸分子は、ＣＤ１ｄ上に提示されたアルファ－ガラクトシルセラミド（アルファ－ＧａｌＣｅｒ）を認識するＴ細胞受容体をコードする。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲ核酸分子は、以下のものからなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む：
gtgggcgatagaggttcagccttagggaggctgcattttggagctgggactcagctgattgtcatacctgacatc（配列番号１）；gccagcggtgatgctcggggggggggaaataccctctattttggaaaaggaagccggctcattgttgtagaggat（配列番号２）；gccagcggggggacagtccattctggaaatacgctctattttggagaaggaagccggctcattgttgtagaggat（配列番号３）；gccagcggtgatacgggacaaacaaacacagaagtcttctttggtaaaggaaccagactcacagttgtagaggat（配列番号４）；gccagcggtgaggggacagcaaacacagaagtcttctttggtaaaggaaccagactcacagttgtagaggat（配列番号５）；gccagcggtgaggcagggaacacagaagtcttctttggtaaaggaaccagactcacagttgtagaggat（配列番号６）；gtgagcgacagaggctcaaccctggggaggctatactttggaagaggaactcagttgactgtctggcctgatatccag（配列番号７）；agcagtgacctccgaggacagaacacagatacgcagtattttggcccaggcacccggctgacagtgctcgaggac（配列番号８）；agcagtgaattaaaggaaacaggggttcaagagacccagtacttcgggccaggcacgcggctcctggtgctcgaggac（配列番号９）；agcagtgtatctcagggcggcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggac（配列番号１０）；agcagtgtatctcagggcggcactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggac（配列番号１１）；agcagtgaccggacaggcgtgaacactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggac（配列番号１２）；agcagtgaaccggacagggggggggctgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggac（配列番号１３）；atgaaaaagcatctgacgaccttcttggtgattttgtggctttatttttatagggggaatggcaaaaaccaagtggagcagagtcctcagtccctgatcatcctggagggaaagaactgcactcttcaatgcaattatacagtgagccccttcagcaacttaaggtggtataagcaagatactgggagaggtcctgtttccctgacaatcatgactttcagtgagaacacaaagtcgaacggaagatatacagcaactctggatgcagacacaaagcaaagctctctgcacatcacagcctcccagctcagcgattcagcctcctacatctgtgtggtgagcgacagaggctcaaccctggggaggctatactttggaagaggaactcagttgactgtctggcctgatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagctga（配列番号１４）；atgaaaaagcatctgacaacattcctggtcattctgtggctgtacttctaccgaggcaacggcaaaaatcaggtggagcagtccccacagtccctgatcattctggaggggaagaactgcactctgcagtgtaattacaccgtgtctccctttagtaacctgcgctggtataaacaggacaccggacgaggacccgtgagcctgacaatcatgactttctcagagaacacaaagagcaatggacggtacaccgctacactggacgcagataccaaacagagctccctgcacatcacagcatctcagctgtcagatagcgcctcctacatttgcgtggtctctgaccgagggagtaccctgggccgactgtattttggaagggggacccagctgacagtgtggcccgacatccagaacccagatcccgccgtctaccagctgcgcgacagcaagtctagtgataaaagcgtgtgcctgttcacagactttgattctcagactaatgtctctcagagtaaggacagtgacgtgtacattactgacaaaaccgtcctggatatgaggagcatggacttcaagtcaaacagcgccgtggcttggtcaaacaagagcgacttcgcatgcgccaatgcttttaacaattcaatcattccagaggataccttctttcctagcccagaatcaagctgtgacgtgaagctggtcgagaaaagtttcgaaactgataccaacctgaattttcagaacctgtctgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaggtcgccggctttaatctgctgatgacactgagactgtggtcctcttga（配列番号１５）；atgactatcaggctcctctgctacatgggcttttattttctgggggcaggcctcatggaagctgacatctaccagaccccaagataccttgttatagggacaggaaagaagatcactctggaatgttctcaaaccatgggccatgacaaaatgtactggtatcaacaagatccaggaatggaactacacctcatccactattcctatggagttaattccacagagaagggagatctttcctctgagtcaacagtctccagaataaggacggagcattttcccctgaccctggagtctgccaggccctcacatacctctcagtacctctgtgccagc（配列番号１６)、atgaccatccggctgctgtgctacatgggcttctattttctgggggcaggcctgatggaagccgacatctaccagactcccagatacctggtcatcggaaccgggaagaaaattacactggagtgttcccagacaatgggccacgataagatgtactggtatcagcaggaccctgggatggaactgcacctgatccattactcctatggcgtgaactctaccgagaagggcgacctgagcagcgaatccaccgtctctcgaattaggacagagcactttcctctgactctggaaagcgcccgaccaagtcatacatcacagtacctgtgcgctagc（配列番号１７）；gtagcggttgggccccaagagacccagtacttcgggccaggcacgcggctcctggtgctc（配列番号１８）；gtggcagtcggacctcaggagacccagtacttcggacccggcacccgcctgctggtgctg（配列番号１９）；agtgggccagggtacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcaca（配列番号２０）；tcaggacccggctacgagcagtatttcggccccggaactcggctgaccgtgacc（配列番号２１）；agtccccaattaaacactgaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgta（配列番号２２）；tctccacagctgaacaccgaggccttcttcgggcagggcacaaggcttaccgtggtg（配列番号２３）；agtgaattgcgggcgctcgggcccagctcctataattcacccctccactttgggaacgggaccaggctcactgtgaca（配列番号２４）；tccgaactccgagccctggggcctagctcctacaatagccccctgcactttggcaacggaaccaggctgacggtcacc（配列番号２５）；agtgaacaggggactactgcgggagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgta（配列番号２６）；tccgaacagggaaccacagcaggagccttcttcggtcagggaacaagactgacagtcgtg（配列番号２７）；agtgagtcacgacatgcgacaggaaacaccatatattttggagagggaagttggctcactgttgta（配列番号２８）；agcgagagcaggcacgcaaccgggaacaccatatactttggcgagggctcctggctgactgtggtg（配列番号２９）；agtgtacccgggaacgacaggggcaatgaaaaactgttttttggcagtggaacccagctctctgtcttg（配列番号３０)、tccgtgcctggcaacgatagaggtaacgagaagctgtttttcggatccggcacacagctgtctgtcctg（配列番号３１）；agtgaaggggggggccttaagctagccaaaaacattcagtacttcggcgccgggacccggctctcagtgctg（配列番号３２）；agtgagggagggggactgaagctggctaagaatattcagtacttcggcgccggcactagactgtctgtgctg（配列番号３３）；agtgaattcgcctcttcggtacgtggaaacaccatatattttggagagggaagttggctcactgttgta（配列番号３４）；tctgagttcgcgagcagcgtccggggtaataccatttacttcggggaaggcagctggctgaccgtggtg（配列番号３５）；agtgcggcattaggccgggagacccagtacttcgggccaggcacgcggctcctggtgctc（配列番号３６）；tctgcagcccttggccgagagactcagtacttcggccctggcacaagactgctcgtgctc（配列番号３７）；agtgcctccgggggtgaatcctacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcaca（配列番号３８）；agcgcctccggaggagagtcatacgaacagtatttcggccctggcacacgcctcactgtgacc（配列番号３９）；agcggtcgggtctcggggggcgattccctcatagcgtttctaggccaagagacccagtacttcgggccaggcacgcggctcctggtgctc（配列番号４０）；tcaggacgagtgtccggaggggatagcctcatcgcatttctggggcaggaaactcagtacttcggacccggaacacgcctcctggtgctg（配列番号４１）；agtgtacccgggaacgacaggggcaatgaaaaactgttttttggcagtggaacccagctctctgtcttg（配列番号４２）；tccgtgcctggcaacgatagaggtaacgagaagctgtttttcggatccggcacacagctgtctgtcctg配列番号４３）；gaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgccaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttctga（配列番号４４）；およびgaggacctgaataaggtgttcccccctgaggtggctgtctttgaaccaagtgaggcagaaatttcacatacacagaaagccaccctggtgtgcctggctaccggcttctttcccgatcacgtggagctgagctggtgggtcaacggcaaggaagtgcatagcggagtctccacagacccacagcccctgaaagagcagcctgctctgaatgattccagatactgcctgtctagtagactgcgggtgtctgccaccttctggcagaacccaaggaatcatttcagatgtcaggtgcagttttatggcctgagcgagaacgatgaatggactcaggacagggctaagccagtgacccagatcgtcagcgcagaggcctggggaagagcagactgcgggtttacaagcgtgagctatcagcagggcgtcctgagcgccacaatcctgtacgaaattctgctgggaaaggccactctgtatgctgtgctggtctccgctctggtgctgatggcaatggtcaagcggaaagatttctga（配列番号４５)。

一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲ核酸分子は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする：
MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSDRGSTLGRLYFGRGTQLTVWPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS（配列番号４６）；MTIRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCAS（配列番号４７）；VAVGPQETQYFGPGTRLLVL（配列番号４８）；SGPGYEQYFGPGTRLTVT（配列番号４９）；SPQLNTEAFFGQGTRLTVV（配列番号５０）；SELRALGPSSYNSPLHFGNGTRLTVT（配列番号５１）；SEQGTTAGAFFGQGTRLTVV（配列番号５２）；SESRHATGNTIYFGEGSWLTVV（配列番号５３）；SVPGNDRGNEKLFFGSGTQLSVL（配列番号５４）；SEGGGLKLAKNIQYFGAGTRLSVL（配列番号５５）；SEFASSVRGNTIYFGEGSWLTVV（配列番号５６）；SAALGRETQYFGPGTRLLVL（配列番号５７）；SASGGESYEQYFGPGTRLTVT（配列番号58）；SGRVSGGDSLIAFLGQETQYFGPGTRLLVL（配列番号５９）；SVPGNDRGNEKLFFGSGTQLSVL（配列番号６０）；およびEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF（配列番号６１)。一部の実施形態では、操作された細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ、ｃ－Ｍｙｃおよびこれらに類するものなどの、外来性がん遺伝子を欠いている。

一部の実施形態では、操作された細胞は、機能的なｉＮＫＴ細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は、１つまたは複数のサイトカインおよび／またはケモカイン、例えば、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、ＭＩＰ－１－アルファ、ＭＩＰ－１－ベータおよびこれらに類するものを産生することができる。一部の実施形態では、操作された細胞は、ＩＬ－１５を産生することができる。

ドナーＨＳＰＣをドナーの骨髄、末梢血、羊水または臍帯血から得ることができる。ドナーは、自家ドナー、すなわち、ＨＳＰＣ－ｉＮＫＴ細胞で処置される対象であることもあり、または同種異系ドナー、すなわち、ＨＳＰＣ－ｉＮＫＴ細胞で処置される対象とは異なるドナーであることもある。ドナーが同種異系ドナーである、一部の実施形態では、同種異系ドナーの組織（ＨＬＡ）型は、好ましくは、ドナーＨＳＰＣに由来するＨＳＰＣ－ｉＮＫＴ細胞で処置されることになる対象のものと適合する。

本開示によれば、ＨＳＰＣに１つまたは複数の外来性ｉＮＫＴＴＣＲ核酸分子で形質導入される。本明細書で使用される場合、「ｉＮＫＴＴＣＲ核酸分子」は、ｉＮＫＴＴ細胞受容体のアルファ鎖（ＴＣＲ－アルファ－）、ｉＮＫＴＴ細胞受容体のベータ鎖（ＴＣＲ－ベータ）、または両方をコードする、核酸分子を含む。本明細書で使用される場合、「ｉＮＫＴＴ細胞受容体」は、ｉＮＫＴ細胞に発現されるものであって、ＣＤ１ｄ上に提示されるアルファ－ＧａｌＣｅｒを認識するものである。当技術分野における方法を使用して、ｉＮＫＴＴＣＲのＴＣＲ－アルファおよびＴＣＲ－ベータ配列をクローニングすることおよび／または組換え操作することができる。例えば、本明細書で説明されるように、ｉＮＫＴ細胞をドナーから得ることができ、ｉＮＫＴ細胞のＴＣＲ－アルファ遺伝子およびＴＣＲ－ベータ遺伝子をクローニングすることができる。クローニングされるｉＮＫＴＴＣＲは、ヒト、非ヒト霊長類、例えばサル、マウス、ラット、ハムスター、モルモットおよび他の齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタならびにこれらに類するものを含む、任意の哺乳類の動物から得ることができる。一部の実施形態では、クローニングされるｉＮＫＴＴＣＲは、ヒトｉＮＫＴＴＣＲである。一部の実施形態では、ｉＮＫＴＴＣＲクローンは、ヒトｉＮＫＴＴＣＲ配列、および非ヒトｉＮＫＴＴＣＲ配列を含む。

一部の実施形態では、クローニングされたＴＣＲは、１つのｉＮＫＴ細胞からのＴＣＲ－アルファ鎖、および異なるｉＮＫＴ細胞からのＴＣＲ－ベータ鎖を有することができる。一部の実施形態では、ＴＣＲ－アルファ鎖が得られるｉＮＫＴ細胞、およびＴＣＲ－ベータ鎖が得られるｉＮＫＴ細胞は、同じドナーからのものである。一部の実施形態では、ＴＣＲ－アルファ鎖が得られるｉＮＫＴ細胞のドナーは、ＴＣＲ－ベータ鎖が得られるｉＮＫＴ細胞のドナーと異なる。一部の実施形態では、ＴＣＲクローンのＴＣＲ－アルファ鎖をコードする配列および／またはＴＣＲ－ベータ鎖をコードする配列は、改変される。一部の実施形態では、改変された配列は、未改変ＴＣＲクローンと同じポリペプチド配列をコードすることがあり、例えば、配列は、発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、改変された配列は、未改変ＴＣＲクローンとは異なる配列を有するポリペプチドをコードすることがあり、例えば、改変された配列は、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および／または短縮化を有するポリペプチド配列をコードする。

特定の実施形態では、ＨＳＰＣ細胞から産生されたｉＮＫＴ細胞は、細胞を同種異系使用に適したものにすること、または細胞が１つもしくは複数の特徴を有するようにさらに改変されなかった場合よりも同種異系に適したものにすることを含め、１つまたは複数の特徴を有するようにさらに改変される。本開示は、必要に応じて、同種異系使用に好適であるｉＮＫＴ細胞を包含する。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、非アロ反応性であり、外来性ｉＮＴＫＴＣＲを発現する。これらの細胞は、「オフザシェルフ」細胞療法に有用であり、患者自身のｉＮＫＴ細胞または他の細胞の使用を必要としない。したがって、この方法は、より対費用効果の高い、より労働集約度の低い細胞免疫療法を提供する。

一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こすことなく、宿主免疫細胞により拒絶（ＨｖＧ拒絶）されることなく、安全で上首尾の同種異系生着を達成するために、ＨＬＡ陰性になるように操作される。特定の実施形態では、同種異系ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、トランスジェニックｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子の発現が対立遺伝子排除によって内在性ＴＣＲの組換えを阻止するため、内在性ＴＣＲを発現せず、ＧｖＨＤを引き起こさない。特定の実施形態では、同種異系ｉＮＫＴ細胞は、細胞表面にＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子を発現せず、宿主ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞により媒介される同種移植片枯渇およびｓｒ３９ＴＫ免疫原を標的とする枯渇に対して耐性である。

したがって、ある特定の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞は、表面ＨＬＡ－Ｉ分子もＨＬＡ－ＩＩ分子も発現せず、これは、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、またはＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子を含むがこれらに限定されない、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現に関連するタンパク質をコードする遺伝子の破壊によって達成される。一部の実施場合には、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を伴うこともあり、または伴わないこともある、遺伝子編集により、操作されたため、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩは、ｉＮＫＴ細胞の表面に発現されない。

ｉＮＫＴ細胞が、任意の種類の１つまたは複数の特徴を示すように改変された場合、ｉＮＫＴ細胞は、これらの細胞に導入された組換えベクターからの核酸を含み得る。ベクターは、プラスミドなどの非ウイルスベクターであることもあり、またはレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスもしくはアデノウイルスなどの、ウイルスベクターであることもある。

本開示のｉＮＫＴ細胞は、それらの産生前、中または後に１つまたは複数のある特定の条件に曝露されたものであることもあり、またはされなかったものであることもある。特定の場合には、細胞は、動物の血清を含む培地に曝露されない、またはされなかった。細胞は、凍結されていることもある。細胞は、デキストロース、１つもしくは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む溶液中に存在することもある。細胞が存在するいずれの溶液も、無菌、非化膿性、および等張性である溶液であり得る。細胞は、例えばアルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化されたものなどの、いずれの方法により活性化および増幅されたものであってもよい。

本開示の態様は、操作されたｉＮＫＴ細胞に関する。一部の実施形態では、細胞は、ゲノム突然変異を含む。一部の実施形態では、ゲノム突然変異は、細胞のゲノム内の１つまたは複数の内在性遺伝子の突然変異を含み、この場合、１つまたは複数の内在性遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２遺伝子を含む。一部の実施形態では、突然変異は、機能喪失突然変異である。一部の実施形態では、阻害剤は、発現阻害剤である。一部の実施形態では、阻害剤は、阻害性核酸を含む。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンス分子のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、細胞は、活性阻害剤を含む。一部の実施形態では、改変後、細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２タンパク質のうちの１つまたは複数のいずれかの検出可能な発現が欠損している。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍの阻害剤またはゲノム突然変異を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡの阻害剤またはゲノム突然変異を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣの阻害剤またはゲノム突然変異を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＢＣ１の阻害剤またはゲノム突然変異を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＢＣ２の阻害剤またはゲノム突然変異を含む。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１および／またはＴＲＢＣ２をコードするゲノムＤＮＡの少なくとも９０％が欠失している。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１および／またはＴＲＢＣ２をコードするゲノムＤＮＡの少なくともまたは多くとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）が欠失している。他の実施形態では、欠失、挿入および／または置換がゲノムＤＮＡ内でなされる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト幹または始原細胞の子孫である。

ＨＬＡ陰性であるように改変されるｉＮＫＴ細胞は、任意の好適な方法により遺伝子改変され得る。ＣＩＩＴＡおよび／またはＢ２Ｍ遺伝子におけるものなどの本開示の遺伝的突然変異を、当技術分野において公知の方法により導入することができる。ある特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼを使用して、本明細書で言及される任意の細胞の遺伝子改変のために内在性核酸配列を導入することができる。ゲノム編集、または操作されたヌクレアーゼでのゲノム編集（ＧＥＥＮ）は、ＤＮＡが、挿入される、置き換えられる、または人工的に操作されたヌクレアーゼ、または「分子バサミ」を使用してゲノムから除去されるタイプの遺伝子操作である。ヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置で特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、細胞の内在性メカニズムを利用して、相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然のプロセスによってその誘導された切断を修復する。非限定的な操作されたヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、および操作されたメガヌクレアーゼにより再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。当技術分野において公知の操作されたヌクレアーゼのいずれかを、方法および組成物のある特定の態様で使用することができる。

操作されたｉＮＫＴ細胞を、ＲＮＡ干渉を利用する方法を使用して改変することができる。遺伝子解析では、遺伝子の機能またはタンパク質機能を理解するための、配列特異的な方法でのその遺伝子への干渉および生物に対するその効果のモニタリングが、一般に実施される。しかし、一部の生物では、部位特異的突然変異誘発を行なうことが困難または不可能であり、それ故、低分子ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）による目的の遺伝子のサイレンシングなどの、より間接的な方法を使用する必要がある。しかし、ｓｉＲＮＡによる遺伝子破壊は、可変的かつ不完全であり得る。ＺＦＮなどのヌクレアーゼでのゲノム編集は、操作されたヌクレアーゼが、ＤＮＡ結合特異性を改変することができ、したがって、原理上はゲノム内の任意の標的位置を切断することができ、従来のＲＮＡｉによって特異的に標的とすることが不可能である遺伝子の内在性配列の改変を導入することができるという点で、ｓｉＲＮＡとは異なる。さらに、２つのＺＦＮが、標的のそれらの位置の認識、およびその後、隣接配列への方向付けに必要とされるので、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性が増強される。

メガヌクレアーゼを利用して、操作されたｉＮＫＴ細胞を改変することができる。微生物種でよく見られるメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという特有の特性を有し、ひいては、この特性が必然的にメガヌクレアーゼを非常に特異的なものにする。これを活用して、ゲノム編集で部位特異的ＤＳＢを作製することができるが、可能性のあるすべての標的配列を取り扱うために十分なメガヌクレアーゼが公知ではなく、またいつまで経っても公知にならない可能性があることは、難題である。この難題を克服するために、突然変異誘発およびハイスループットスクリーニング方法が、特有の配列を認識するメガヌクレアーゼバリアントを作出するために使用されてきた。他の者は、様々なメガヌクレアーゼを融合し、新しい配列を認識するハイブリッド酵素を作出することができた。さらに他の者は、合理的に設計されたメガヌクレアーゼと呼ばれる方法で配列特異的なメガヌクレアーゼを設計するためにメガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸の変更を試みた（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０２１，８６７号）。メガヌクレアーゼには、恐らくより厳密にＤＮＡ配列を認識するため、ＺＦＮなどの方法と比較して細胞への毒性が少ないという利点があるが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなどの方法により用いられる組合せの可能性による恩恵を受けられるようにならなければ、すべての可能な配列に対する配列特異的酵素の構築には費用と時間がかかる。そのため、利点も欠点もある。

メガヌクレアーゼとは対照的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの背後にある概念は、非特異的ＤＮＡ切断酵素に基づくところがより大きく、この酵素は次に、ジンクフィンガーおよび転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などの特異的ＤＮＡ配列認識ペプチドに連結される。１つの方法は、ＤＮＡ認識部位および切断部位が互いに離れているという、制限酵素の中ではあまり見られない状況であるエンドヌクレアーゼを見つけることであった。この酵素が発見されると、認識能力がないため非常に非特異的となるその切断部分を分離することができた。次いで、この部分を、非常に高い特異性をもたらすことができる配列認識ペプチドに連結させることができた。そのような特性を有する制限酵素の例は、ＦｏｋＩである。加えて、ＦｏｋＩには、ヌクレアーゼ活性を有するために二量体化を必要とするという利点があり、これは、各ヌクレアーゼパートナーが特有のＤＮＡ配列を認識することになるので特異性が劇的に増大することを意味する。この効果を増強するために、ヘテロ二量体としてもっぱら機能することができ、かつ触媒活性が増大されたＦｏｋＩヌクレアーゼが設計された。ヘテロ二量体として機能するヌクレアーゼは、望ましくないホモ二量体活性の可能性を回避し、ひいてはＤＳＢの特異性を増大させることになった。

ＺＦＮとＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は同様の特性を有するが、これらの操作されたヌクレアーゼ間には、それらのＤＮＡ認識ペプチドに違いがある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに依存し、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥに依存する。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインは両方とも、それらが、それらのタンパク質中に組合せで自然に見られるという特性を有する。Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、典型的には、３ｂｐ離れている反復で生じ、転写因子などの様々な核酸相互作用タンパク質中に多様な組合せで見られる。その一方で、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されるヌクレオチドペアとの認識比が１対１である反復で見られる。ジンクフィンガーとＴＡＬＥの両方が反復パターンで生じるため、種々の組合せを試して、多種多様な配列特異性を生じさせることができる。ジンクフィンガーは、これらの点で、ならびに手法、例えば、部位特異的ヌクレアーゼを作製するために使用されている数ある方法の中でも特に、モジュラーアセンブリー（必要な配列をカバーするために、トリプレット配列と相関するジンクフィンガーが一列に結合される）、ＯＰＥＮ（細菌系における、トリプレットヌクレオチドに対するペプチドドメインの低ストリンジェンシー選択に続いて、最終標的に対するペプチド組合せのハイストリンジェンシー選択）、およびジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングにおいて、より確立されている。

したがって、本開示の実施形態は、１つまたは複数のある特定の内在性配列の発現を低減させるためのまたはノックアウトするための内在性配列の標的化を含むこともあり、または含まないこともある。特定の実施形態では、以下の遺伝子のうちの１つまたは複数の破壊により、内在性ＴＣＲの再構成が阻止され得る。ガイドＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを生成するために、例えば、下記の前述の遺伝子を標的とするために、それらの配列が下記に例として提供される：

Ｂ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）（別名ＩＭＤ４３）は、１５ｑ２１．１に位置し、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ヒトクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子は、１６ｑ１３．１３に位置し、以下のｍＲＮＡ配列を有する：

ヒトＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）ｍＲＮＡ配列は、以下の通りである：

ヒトＴ細胞受容体ベータ鎖（ＴＲＢＣ１）ｍＲＮＡ配列は、以下の通りである：

ヒトＴＲＢＣ２Ｔ細胞受容体ベータ定常２（ＴＣＲＢ２）配列は、以下の通りである：

当技術分野において公知のＣＩＩＴＡおよび／またはＢ２Ｍの遺伝子発現を阻害する、阻害性核酸または任意の方法が、ある特定の実施形態では企図される。阻害性核酸の例としては、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよびそれをコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。阻害性核酸は、細胞内での遺伝子の転写を阻害することまたは遺伝子転写物の翻訳を防止することができる。阻害性核酸は、１６～１０００ヌクレオチド長、ある特定の実施形態では１８～１００ヌクレオチド長であり得る。核酸は、少なくともまたは多くとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、５０、６０、７０、８０、９０またはこれらの数から導出可能な任意の範囲のヌクレオチドを有し得る。生きている動物に天然に存在するｓｉＲＮＡは、「単離され」ていないが、合成ｓｉＲＮＡ、またはその天然の状態の共存物質から部分的にもしくは完全に分離されたｓｉＲＮＡは、「単離され」ている。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在することもあり、または例えば、ｓｉＲＮＡが送達された細胞などの、非天然環境に存在することもある。

阻害性核酸は、当技術分野において周知である。例えば、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡは、米国特許第６，５０６，５５９号および同第６，５７３，０９９号、ならびに米国特許出願公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００４／０２６５８３９号、同第２００２／０１６８７０７号、同第２００３／０１５９１６１号および同第２００４／００６４８４２号に記載されており、これらの参考特許文献のすべては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

詳細には、阻害性核酸は、タンパク質またはｍＲＮＡの発現を少なくとも１０％、２０％、３０％または４０％、より詳細には、少なくとも５０％、６０％または７０％、最も詳細には、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％もしくはそれより大きく、または前述の％間の任意の範囲もしくは値、減少させる能力があり得る。

さらなる実施形態には、タンパク質阻害剤である合成核酸がある。阻害剤は、長さが１７～２５ヌクレオチドの間であり得、成熟ｍＲＮＡの５’→３’配列に少なくとも９０％相補的である、５’→３’の配列を含む。ある特定の実施形態では、阻害剤分子は、長さが１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５ヌクレオチド、またはこれらの中から導出可能な任意の範囲である。さらに、阻害剤分子は、成熟ｍＲＮＡ、詳細には、成熟した天然に存在するｍＲＮＡ、例えば、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に対するｍＲＮＡ、の５’→３’配列に、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９もしくは１００％、または少なくとも前記％、またはこれらの中から導出可能な任意の範囲、相補的である配列（５’→３’）を有する。当業者は、成熟ｍＲＮＡの配列に相補的であるプローブ配列の一部分をｍＲＮＡ阻害剤のための配列として使用することができるだろう。さらに、プローブ配列のその部分を、成熟ｍＲＮＡの配列になお９０％相補的であるように変更することができる。

一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞または始原もしくは幹細胞は、１つまたは複数の自殺遺伝子を含み得る。操作されたｉＮＫＴ細胞が、必要に応じて、その後の枯渇のために１つまたは複数の自殺遺伝子を含む場合、自殺遺伝子は、任意の好適な種類のものであり得る。本開示のｉＮＫＴ細胞は、例えば酵素に基づき得る、自殺遺伝子産物を発現し得る。自殺遺伝子産物の例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、チトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９が挙げられる。したがって、特定の場合には、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードし得る。特定の場合には、ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子などの、ウイルスＴＫ遺伝子である。特定の実施形態では、自殺遺伝子産物は、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体などの、基質により活性化される。

特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ｓｒ３９ＴＫであり、対応する配列の例は、以下の通りである：

ｓｒ３９ＴＫｃＤＮＡ配列（コトン最適化された）：

ｓｒ３９ＴＫアミノ酸配列：

一部の実施形態では、操作されたｉＮＫＴ細胞をイメージングまたは別様に検出することができる。特定の場合には、細胞は、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドをコードする外来性核酸を含み、イメージングは、蛍光イメージング、放射性イメージング、比色イメージングなどであり得る。特定の場合には、細胞は、陽電子放出断層撮影により検出される。少なくとも一部の場合には、細胞は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）レポーター／チミジンキナーゼ遺伝子であるｓｒ３９ＴＫ遺伝子を発現し、この発現により、これらの遺伝子改変された細胞を、ＰＥＴイメージング、およびｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子機能によるこれらの細胞の排除によって、追跡することが可能になる。

操作されたｉＮＫＴ細胞の集団は、本開示により包含される。特定の態様では、ｉＮＫＴクローン細胞は、ｉＮＫＴＴ細胞受容体（Ｔ細胞受容体）をコードする外来性核酸を含み、１つまたは複数のＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いている。ｉＮＫＴ細胞は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）などの酵素に基づく自殺遺伝子を含む、自殺遺伝子をコードする外来性核酸を含み得る。ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子などの、ウイルスＴＫ遺伝子であり得る。集団の細胞において、自殺遺伝子は、例えばガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体などの、基質により活性化され得る。細胞は、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドをコードする外来性核酸を含むことができ、一部の場合には、自殺遺伝子産物は、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである。特定の態様では、自殺遺伝子は、ｓｒ３９ＴＫである。

ｉＮＫＴ細胞集団のある特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、例えば、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、および／またはＨＬＡ－ＩもしくはＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現が妨害されるため、表面ＨＬＡ－Ｉ分子もＨＬＡ－ＩＩ分子も発現しない。特定の場合、ｉＮＫＴ細胞が遺伝子編集により操作されたため、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩは、ｉＮＫＴ細胞の細胞表面に発現されない。遺伝子編集に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が関与することもあり、またはしないこともある。

ｉＮＫＴ細胞集団について特定の場合、ｉＮＫＴ細胞は、細胞に導入された組換えベクター、例えばウイルスベクター（少なくともレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイスルまたはアデノウイルスを含む）からの核酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞集団の細胞は、１つもしくは複数のある特定の状態に、曝露されたもしくは曝露されることもあり、曝露されたことがないまたは曝露されないこともある。ある特定の場合には、例えば、集団の細胞は、動物の血清を含む培地に曝露されない、または曝露されなかった。集団の細胞は、凍結されていることもあり、またはされていないこともある。一部の場合には、集団の細胞は、デキストロース、１つもしくは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、および／またはＤＭＳＯを含む溶液中にある。溶液は、デキストロース、１つもしくは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含み得る。細胞は、無菌、非化膿性、および等張性である溶液中にあり得る。特定の場合には、ｉＮＫＴ細胞は、活性化された、例えば、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化された。特定の態様では、細胞集団は、少なくとも約１０^２～１０^６個のクローン細胞を含む。細胞集団は、一部の場合には、合計少なくとも約１０^６～１０^１２個の細胞を含み得る。

特定の実施形態には、ｉＮＫＴＴ細胞受容体（Ｔ細胞受容体）とチミジンキナーゼ自殺とをコードする１つまたは複数の外来性核酸を含むクローンｉＮＫＴ細胞を含み、クローンｉＮＫＴ細胞が、機能的なベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ならびに／またはＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を発現しないように操作された、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞集団であって、合計少なくとも約１０^６～１０^１２個の細胞であり、少なくとも約１０^２～１０^６個のクローン細胞を含む、ｉＮＫＴ細胞集団がある。一部の場合には、細胞は、溶液中で凍結されている。
Ｖ．ＣＡＲ実施形態
Ａ．抗原結合領域

抗原結合領域は、抗原特異的抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。一部の実施形態では、抗原結合領域は、ＢＣＭＡ結合領域である。一部の実施形態では、抗原結合領域は、ＣＤ１９結合領域である。一部の実施形態では、抗原結合領域は、ＮＹ－ＥＳＯ－１結合領域である。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖによる抗原結合に望ましい構造の形成を助長し得るペプチドリンカーをＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間にさらに含む。

本開示のポリペプチドの抗原結合ドメインの可変領域を、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸を突然変異させることにより改変して、抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することができる。用語「ＣＤＲ」は、Ｂ細胞およびＴ細胞によりそれぞれ生成される、免疫グロブリン（抗体）およびＴ細胞受容体における可変鎖の一部分に基づく、相補性決定領域を指し、これらの分子は、それらの特異的抗原に結合する。免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体に関連するほとんどの配列の変化はＣＤＲにおいて見られるため、これらの領域は、超可変領域と呼ばれることがある。突然変異を部位指定突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発により導入することができ、抗体結合に対する効果、または目的の他の機能特性を、適切なｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的改変が導入され、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個以下の残基が変更される。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得る。

フレームワークの改変を、例えば１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列へ「復帰突然変異させること」により、抗体に加えて免疫原性を減少させることができる。

抗原結合ドメインは、同じ抗原に結合する（多価）かまたは異なる抗原に結合する（多重特異性）どちらかのＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域対を有する抗原結合ドメインを多量体化することにより、多重特異性または多価になり得ることも、考えられる。

可変領域（重鎖および／もしくは軽鎖可変領域）などの抗原結合領域のまたはＣＤＲの結合親和性は、少なくとも１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、１０^－１２Ｍ、または１０^－１３Ｍであり得る。一部の実施形態では、可変領域（重鎖および／もしくは軽鎖可変領域）などの抗原結合領域のまたはＣＤＲのＫ_Ｄは、少なくとも１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、１０^－１２Ｍ、または１０^－１３Ｍ（またはこれらの中から任意の導出可能な範囲）であり得る。

結合親和性、Ｋ_Ａ、またはＫ_Ｄは、当技術分野において公知の方法により、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）に基づくバイオセンサーにより、結合平衡除外アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）により、偏光変調された斜め入射反射率の差（ＯＩ－ＲＤ）に基づくマイクロアレイ検出用の光学スキャナーにより、またはＥＬＩＳＡにより、決定することができる。

一部の実施形態では、抗原結合領域は、ヒト化される。一部の実施形態では、ヒト化結合領域を含むポリペプチドは、宿主細胞において、マウスからの結合領域などの非ヒト化結合領域を含むポリペプチドと比較して、同等の、良好な、または少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０４、１０６、１０６、１０８、１０９、１１０、１１５または１２０％の結合親和性または発現レベルを有する。
ＶＩ．細胞の製剤および培養

特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞および／もしくはそれらの前駆細胞を特異的に製剤化することができ、ならびに／またはそれらを、ｉＮＫＴ細胞を生成するプロセスの任意の段階で、特定の培地において（それらがｉｎｖｉｔｒｏ培養系に存在するか否かを問わず）培養することができる。有害効果を伴わないレシピエントへの送達に好適であるような方法で、細胞を製剤化することができる。

培地は、ある特定の態様では、動物細胞を培養するためにそれらの基礎培地として使用される培地、例えば、ＡＩＭＶ、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ、ＥＧＭ２、ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＥａｇｌｅＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ－１６４０、およびＦｉｓｃｈｅｒ培地のうちのいずれか、ならびにこれらの任意の組合せを使用して調製することができるが、培地は、動物細胞の培養に使用することができるのであれば特に限定されないだろう。特に、培地は、ゼノフリーまたは既知組成であり得る。

培地は、血清含有もしくは無血清培地、またはゼノフリー培地であり得る。異種動物由来成分による夾雑を防止する観点から、血清は、幹細胞のものと同じ動物に由来し得る。無血清培地は、未処理の血清も未精製の血清も有さない培地を指し、したがって、精製された血液由来成分または動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を有する培地を含み得る。

培地は、血清の任意の代替物を含有することもあり、または含有しないこともある。血清の代替物は、アルブミン（例えば、脂質を多く含むアルブミン、ウシアルブミン、アルブミン代用品、例えば組換えアルブミンもしくはヒト化アルブミン、植物デンプン、デキストラン、およびタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（もしくは他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール（thiolgiycerol）、またはこれらの等価物を、適切に含有する材料を含み得る。血清の代替物は、例えば国際公開第９８／３０６７９号（その全体が本明細書に組み込まれる）において開示されている方法により、調製することができる。あるいは、任意の市販の材料をより適便に使用することができる。市販の材料としては、ｋｎｏｃｋｏｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄＬｉｐｉｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）、およびグルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。

さらなる実施形態では、培地は、細胞発生に好適である無血清培地であり得る。例えば、培地は、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ－２７（登録商標）サプリメント（ワールドワイドウェブのｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍｅｄｉａ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．２５０．ｈｔｍｌで入手可能）、ＮＳ２１サプリメント（その全体が本明細書に組み込まれる、Chen et al., J Neurosci Methods, 2008 Jun 30; 171(2): 239-247）、ＧＳ２１（商標）サプリメント（ワールドワイドウェブのａｍｓｂｉｏ．ｃｏｍ／Ｂ－２７．ａｓｐｘで入手可能）、またはこれらの組合せを、３Ｄ細胞凝集体からＴ細胞を産生するために有効な濃度で含み得る。

ある特定の実施形態では、培地は、次のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くを含み得る：ビタミン、例えば、ビオチン；酢酸ＤＬアルファ－トコフェロール；ＤＬアルファ－トコフェロール；ビタミンＡ（酢酸エステル）；タンパク質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）もしくはヒトアルブミン、脂肪酸不含画分Ｖ；カタラーゼ；ヒト組換えインスリン；ヒトトランスフェリン；スーパーオキシドジムスターゼ；他の成分、例えば、コルチコステロン；Ｄ－ガラクトース；エタノールアミンＨＣｌ；グルタチオン（還元型）；Ｌ－カルニチンＨＣｌ；リノール酸；リノレイン酸；プロゲステロン；プトレシン・２ＨＣｌ；亜セレン酸ナトリウム；および／またはＴ３（トリヨード－Ｉ－チロニン）。

一部の実施形態では、培地は、ビタミンをさらに含む。一部の実施形態では、培地は、ビオチン、酢酸ＤＬアルファ－トコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３（およびこれらの中から導出可能な任意の範囲）含むか、または培地は、これらの組合せ、もしくはそれらの塩を含む。一部の実施形態では、培地は、ビオチン、酢酸ＤＬアルファ－トコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、およびビタミンＢ１２を含むか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ビタミンは、ビオチン、酢酸ＤＬアルファ－トコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、またはこれらの組合せもしくは塩を含むか、あるいはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、培地は、タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、タンパク質は、アルブミンもしくはウシ血清アルブミン、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジムスターゼ、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、培地は、次ののうちの１つまたは複数をさらに含む：コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレイン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、もしくはトリヨード－Ｉ－チロニン、またはこれらの組合せ。一部の実施形態では、培地は、次のうちの１つまたは複数を含む：Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ－２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはこれらの組合せ。一部の実施形態では、培地は、アミノ酸、単糖類、無機イオンを含む、またはこれらをさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸は、アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、もしくはバリン、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、無機イオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素もしくはリン、またはこれらの組合せもしくは塩を含む。一部の実施形態では、培地は、次のうちの１つまたは複数をさらに含む：モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅もしくはマンガン、またはこれらの組合せ。ある特定の実施形態では、培地は、本明細書中で論じられる１つもしくは複数のビタミン、および／または本明細書中で論じられる１つもしくは複数のタンパク質、および／または次のもののうちの１つもしくは複数：コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレイン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウムもしくはトリヨード－Ｉ－チロニン、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ－２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、アミノ酸（例えば、アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、もしくはバリン）、単糖類、無機イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素および／もしくはリン）もしくはこれらの塩、および／またはモリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅もしくはマンガンを含むか、あるいはこれらから本質的になる。

さらなる実施形態では、培地は、外部から添加されたアスコルビン酸を含み得る。培地は、１つまたは複数の外部から添加された脂肪酸もしくは脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および／または無機塩も含み得る。

培地成分のうちの１つまたは複数を、少なくとも、多くとも、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００、２５０ｎｇ／Ｌ、ｎｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、ｍｇ／ｍｌ、またはこれらの中から導出可能な任意の範囲の濃度で添加することができる。

使用される培地に、少なくとも１つの外部から添加されるサイトカインを約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、より詳細には１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも、多くとも、もしくは約０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００、２５０ｎｇ／Ｌ、ｎｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、ｍｇ／ｍｌ、もしくはこれらの中から導出可能な任意の範囲の濃度で補給することができる。好適なサイトカインとしては、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン、および／またはミッドカインが挙げられるが、これらに限定されない。特に、培養培地は、ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ－７の少なくとも一方を含み得る。より特に、培養物は、ＦＬＴ３ＬとＩＬ－７の両方を含み得る。

他の培養条件を適切に規定することができる。例えば、培養温度は、約２０～４０℃、例えば、最低でも、最高でも、または約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０℃（もしくはこれらの中から導出可能な任意の範囲）であり得るが、温度は、これらの値より高くてもよく、または低くてもよい。ＣＯ_２濃度は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）、例えば、約２％～１０％、例えば、約２～５％、またはこれらの中から導出可能な人の範囲であり得る。酸素分圧は、少なくとももしくは約１、５、８、１０、２０％、またはこれらの中から導出可能な任意の範囲であり得る。

特定の実施形態では、同種異系ＨＳＣ操作ＨＬＡ陰性ｉＮＫＴ細胞が特異的に製剤化される。それらの細胞は、細胞懸濁液として製剤化されることもあり、またはされないこともある。特定の場合には、それらの細胞は、単回投与形で製剤化される。それらの細胞は、全身または局所投与用に製剤化され得る。一部の場合には、細胞は、使用前の保管用に製剤化され、細胞製剤は、１つまたは複数の凍結保存剤、例えばＤＭＳＯ（例えば、５％ＤＭＳＯで）含み得る。細胞製剤は、ヒトアルブミンをはじめとするアルブミンを含むこともあり、特定の製剤は、２．５％ヒトアルブミンを含む。細胞は、特に静脈内投与用に、製剤化され得る；例えば、それらの細胞は、１時間未満にわたっての静脈内投与用に製剤化される。特定の実施形態では、細胞は、解凍時から１、２、３もしくは４時間、またはそれより長く、室温で安定している、製剤化された細胞懸濁液中にある。

一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞をプライミングするステップをさらに含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、抗原提示細胞でプライミングされる。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、腫瘍抗原を提示する。

特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞の外来性ＴＣＲは、任意の規定された抗原特異性のものであり得る。一部の実施形態では、このＴＣＲを、意図されたレシピエントに対するアロ反応性の非存在または低下に基づいて選択することができる（例としては、ある特定のウイルス特異的ＴＣＲ、ｘｅｎｏ特異的ＴＣＲ、またはがん精巣抗原特異的ＴＣＲが挙げられる）。外来性ＴＣＲが非アロ反応性である、例では、Ｔ細胞分化中に、外来性ＴＣＲは、対立遺伝子排除と呼ばれる発生過程によって、内在性ＴＣＲ遺伝子座の再構成および／または発現を抑制し、その結果、非アロ反応性外来性ＴＣＲのみを発現するＴ細胞が生じることになり、したがって、非アロ反応性になる。一部の実施形態では、外来性ＴＣＲの選択は、必ずしもアロ反応性の欠如に基づいて規定され得るとは限らない。一部の実施形態では、内在性ＴＣＲ遺伝子は、ゲノム編集により、それらの遺伝子がタンパク質を発現しないように改変された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する方法などの、遺伝子編集方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。

一部の実施形態では、単離されたｉＮＫＴ細胞またはその集団は、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。ＣＡＲが方向付けられる対象となり得る腫瘍細胞抗原の例としては、例えば、少なくとも５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、次のものを含むＥＧＦＲファミリー：ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、葉酸受容体－ａ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｈｅｒ２、ＩＬ－１３Ｒα２、ラムダ、ルイス－Ｙ、カッパ、ＫＤＲ、ＭＡＧＥ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、癌胎児抗原、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＡＦＰ、ＣＡ－１２５、ＥＴＡ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ラミニン受容体、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ－４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、サイクリン－Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、ＳＡＰ－１、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１、ＰＡＭＥ、ＳＳＸ－２、メラン－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＧＰ１００／ｐｍｅｌ１７、ＴＲＰ－１／－２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β－カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ－２、ＴＧＦ－βＲＩＩ、またはＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２）が、挙げられる。ＣＡＲは、第１世代、第２世代、第３世代、またはそれより後の世代のＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、任意の２つの同一でない抗原に対して二重特異的であることがあり、または２つより多くの同一でない抗原に対して特異的であることもある。
ＶＩＩ．追加の改変およびポリペプチド実施形態

加えて、本開示のポリペプチドを化学的に改変することができる。ポリペプチドのグリコシル化を、例えばポリペプチド配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより、抗原に対するポリペプチドの親和性を増大させるように、改変することができる（米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号）。

配列番号４６～６１もしくは８１～８８のいずれかに対して、または配列番号１～４５もしくは６２～６６のいずれかによりコードされるポリペプチドに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００もしくはそれより多くのアミノ酸置換、連続するアミノ酸付加または連続するアミノ酸欠失を有する、少なくとも有する、または多くとも有する、アミノ酸配列有し得る、本開示のポリペプチドの領域もしく断片は、またはポリペプチドをコードする本開示の核酸が、企図される。

あるいは、本開示のポリペプチドの領域または断片は、配列番号４６～６１もしくは８１～８８のいずれかと、または配列番号１～４５もしくは６２～６６のいずれかによりコードされるポリペプチドに対して、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）同一である、少なくとも前記％同一である、または多くとも前記％同一である、アミノ酸配列を含むかまたはそのようなアミノ酸配列からなる、アミノ酸配列を有し得る。さらに、一部の実施形態では、領域または断片は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００またはそれより多くの連続するアミノ酸のアミノ酸領域であって、配列番号４６～６１もしくは８１～８８のいずれかにおける、または配列番号１～４５もしくは６２～６６のいずれかによりコードされるポリペプチドについての、１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、７８位、７９位、８０位、８１位、８２位、８３位、８４位、８５位、８６位、８７位、８８位、８９位、９０位、９１位、９２位、９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、１１２位、１１３位、１１４位、１１５位、１１６位、１１７位、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１７３位、１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、１７８位、１７９位、１８０位、１８１位、１８２位、１８３位、１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１５位、２１６位、２１７位、２１８位、２１９位、２２０位、２２１位、２２２位、２２３位、２２４位、２２５位、２２６位、２２７位、２２８位、２２９位、２３０位、２３１位、２３２位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４０位、２４１位、２４２位、２４３位、２４４位、２４５位、２４６位、２４７位、２４８位、２４９位、２５０位、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、２５６位、２５７位、２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、２６２位、２６３位、２６４位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７１位、２７２位、２７３位、２７４位、２７５位、２７６位、２７７位、２７８位、２７９位、２８０位、２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位、２８９位、２９０位、２９１位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０２位、３０３位、３０４位、３０５位、３０６位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１３位、３１４位、３１５位、３１６位、３１７位、３１８位、３１９位、３２０位、３２１位、３２２位、３２３位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３６位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３４１位、３４２位、３４３位、３４４位、３４５位、３４６位、３４７位、３４８位、３４９位、３５０位、３５１位、３５２位、３５３位、３５４位、３５５位、３５６位、３５７位、３５８位、３５９位、３６０位、３６１位、３６２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６６位、３６７位、３６８位、３６９位、３７０位、３７１位、３７２位、３７３位、３７４位、３７５位、３７６位、３７７位、３７８位、３７９位、３８０位、３８１位、３８２位、３８３位、３８４位、３８５位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、３９３位、３９４位、３９５位、３９６位、３９７位、３９８位、３９９位、４００位、４０１位、４０２位、４０３位、４０４位、４０５位、４０６位、４０７位、４０８位、４０９位、４１０位、４１１位、４１２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４１７位、４１８位、４１９位、４２０位、４２１位、４２２位、４２３位、４２４位、４２５位、４２６位、４２７位、４２８位、４２９位、４３０位、４３１位、４３２位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位、４３８位、４３９位、４４０位、４４１位、４４２位、４４３位、４４４位、４４５位、４４６位、４４７位、４４８位、４４９位、４５０位、４５１位、４５２位、４５３位、４５４位、４５５位、４５６位、４５７位、４５８位、４５９位、４６０位、４６１位、４６２位、４６３位、４６４位、４６５位、４６６位、４６７位、４６８位、４６９位、４７０位、４７１位、４７２位、４７３位、４７４位、４７５位、４７６位、４７７位、４７８位、４７９位、４８０位、４８１位、４８２位、４８３位、４８４位、４８５位、４８６位、４８７位、４８８位、４８９位、４９０位、４９１位、４９２位、４９３位、４９４位、４９５位、４９６位、４９７位、４９８位、４９９位、５００位で始まるアミノ酸領域を含む（ここで、１位は、前記配列番号のＮ末端、または前記配列番号によりコードされるポリペプチドのＮ末端にある）。本開示のポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０もしくはそれより多くのバリアントアミノ酸または核酸置換を含むこともあり、あるいは配列番号４６～６１もしくは８１～８８のいずれかの、または配列番号１～４５もしくは６２～６６のいずれかによりコードされるポリペプチドについての、少なくともまたは多くとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、３００、４００、５００、５５０、１０００、１５００または２０００もしくはそれより多くの連続するアミノ酸もしく核酸またはこれらの中から導出可能な任意の範囲と、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％類似していること、同一であること、または相同であることもある。

本開示のポリペプチドは、少なくとも、多くとも、または正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４または６１５の置換（またはこれらの中から導出可能な任意の範囲）を含み得る。

置換は、配列番号４６～６１もしくは８１～８８のいずれかの、または配列番号１～４５もしくは６２～６６のいずれかによりコードされるポリペプチドについての、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００または２０００位アミノ酸（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）におけるものであり得る。

本明細書に記載されるポリペプチドは、配列番号４６～６１もしくは８１～８８の、または配列番号１～４５もしくは６２～６６のいずれかによりコードされるポリペプチドについての、少なくとも、多くともまたは正確にアミノ酸数５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、３００、４００、５００、５５０、１０００またはこれを超える（またはこれらの中からの任意の導出可能な範囲）の固定長のものであり得る。

置換バリアントは、通常は、あるアミノ酸の別のアミノ酸との交換をタンパク質中の１つまたは複数の部位に含有し、置換バリアントを、ポリペプチドの１つまたは複数の特性を、他の機能または特性を喪失してまたはせずにモジュレートするように、設計することができる。置換は、保存的置換であることがあり、すなわち、あるアミノ酸が、類似の形状および電荷のもので置き換えられる。保存的置換は、当技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの、アルギニンのリシンへの、アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの、アスパラギンのグルタミンへの、システインのセリンへの、グルタミンのアスパラギンへの、グルタメートのアスパルテートへの、グリシンのプロリンへの、ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの、イソロイシンのロイシンまたはバリンへの、ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの、リシンのアルギニンへの、メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの、フェニルアラニンのチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの、セリンのトレオニンへの、トレオニンのセリンへの、トリプトファンのチロシンへの、チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの、およびバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変化を含む。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるような非保存的置換であることもある。非保存的変化は、残基の化学的に類似していないものでの置換、例えば、極性または荷電アミノ酸での非極性または非荷電アミノ酸での置換、および逆に非極性または非荷電アミノ酸の極性または荷電アミノ酸での置換を、典型的に含む。

タンパク質は、組換えタンパク質、またはｉｎｖｉｔｒｏ合成されたタンパク質であることもある。あるいは、非組み換えまたは組換えタンパク質を細菌から単離することができる。そのようなバリアントを含有する細菌を組成物および方法に組み入れることができるとも考えられる。それ故、タンパク質を単離する必要がない。

用語「機能的に等価のコドン」は、アルギニンまたはセリンの６コドンなどの、同じアミノ酸をコードするコドンを指すために本明細書では使用され、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンも指す。

アミノ酸および核酸配列が、追加の残基、例えば、追加のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸、または５’もしくは３’配列をそれぞれ含むことがあり、それにもかかわらず、配列が、タンパク質発現に関係する生物学的タンパク質活性の維持をはじめとする上記の基準を満たすのであれば、やはり本明細書で開示される配列の１つで示されるものと本質的に同様であることも、理解されるであろう。末端配列の付加は、例えば、コード領域の５’または３’部分のどちらかに隣接している様々な非コード配列を含み得る、核酸配列に、特に適用される。

以下は、等価のまたはさらには改善された第二世代分子を作出するためにタンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく論述である。例えば、相互作用性結合能力の感知可能な喪失を伴うことなく、タンパク質構造内のある特定のアミノ酸で他のアミノ酸を置換することができる。例えば酵素的触媒ドメインまたは相互作用成分などの、構造は、そのような機能を維持するために置換されたアミノ酸を有し得る。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能力および性質であるので、ある特定のアミノ酸置換をタンパク質配列内でおよびその基礎となるＤＮＡコード配列内で行なうことができ、それでもやはり、同様の特性を有するタンパク質を産生することができる。したがって、本発明者らは、遺伝子のＤＮＡ配列に、それらの生物学的有用性または活性の感知可能な喪失を伴うことなく、様々な変化を加えることができると考える。

他の実施形態では、１つまたは複数の置換を導入することによりポリペプチドの機能を変更することが意図される。例えば、相互作用成分の相互作用性結合能力を改善することを目的として、タンパク質構造内のある特定のアミノ酸で他のアミノ酸を置換することができる。例えばタンパク質相互作用ドメイン、核酸相互作用ドメインおよび触媒部位などの、構造は、そのような機能を変更するために置換されたアミノ酸を有し得る。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能力および性質であるので、ある特定のアミノ酸置換をタンパク質配列内でおよびその基礎となるＤＮＡコード配列内で行なうことができ、それでもやはり、異なる特性を有するタンパク質を産生することができる。したがって、本発明者らは、遺伝子のＤＮＡ配列にそれらの生物学的有用性または活性の感知可能な変更を伴う様々な変化を加えることができると考える。

そのような変化を加える場合、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質に対する相互作用性生物学的機能の付与に関するハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般に理解されている（Kyte and Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー性が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、そしてまたその二次構造が、そのタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原および同様のものとの相互作用を規定するというのが、通説である。

同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効に行なうことができることも、当技術分野では理解されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の最大の局所平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって左右されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。アミノ酸で、類似の親水性値を有する別のものを置換することができ、それでもやはり生物学的に等価かつ免疫学的に等価のタンパク質を産生することができることは、理解されよう。

上記で概説したようなアミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズおよびこれらに類するものの、相対的類似性に基づく。上述の様々な特性を考慮する例示的な置換は周知であり、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質のすべてまたは一部を、従来の技法に従って溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールに従ってそれらを使用することができる。例えば、参照により本明細書に各々組み込まれる、Stewart and Young, (1984)；Tam et al., (1983)；Merrifield, (1986)；およびBaranyand Merrifield (1979)を参照されたい。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に好適な条件下で培養される、組換えＤＮＡ技術を利用することができる。

一実施形態は、タンパク質の産生および／または提示のための、微生物を含む、細胞への遺伝子移入の使用を含む。目的のタンパク質についての遺伝子を適切な宿主細胞に移入し、その後、適切な条件下で細胞を培養することができる。事実上任意のポリペプチドをコードする核酸を利用することができる。組換え発現ベクターの生成、およびその中に含まれるエレメントは、本明細書で論じられる。あるいは、産生されるタンパク質は、タンパク質産生に使用される細胞により通常は合成される内在性タンパク質であり得る。
ＶＩＩＩ．ｉＮＫＴ細胞を産生する方法

ｉＮＫＴ細胞を、任意の好適な方法により産生することができる。方法は、細胞に対する１つもしくは複数の改変のために１つもしくは複数の連続的なステップを利用することがあり、および／または細胞に対する１つもしくは複数の改変のために１つもしくは複数の同時に行なわれるステップを利用することもある。特定の実施形態では、開始細胞源が、ｉＮＫＴ細胞として機能するようになるように改変され、その後、イメージングされる能力、および／または選択的に死滅させられる能力、および／または同種異系的に使用され得る能力などの１つまたは複数の追加の特性を細胞に加えるための、１つまたは複数のステップが行なわれる。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞を生成するためのプロセスの少なくとも一部は、特定のｉｎｖｉｔｒｏ培養系で行なわれる。特異的ｉｎｖｉｔｒｏ培養系の例は、ある特定の細胞の高効率かつ高収率での分化を可能にするものである。特定の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ培養系は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系である。さらなる特定の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ培養系は、ＡＴＯ系、３次元培養系、間質細胞フィーダー層、およびノッチリガンドまたはその断片のうちの１つまたは複数を含まない。

特定の場合には、ｉＮＫＴ細胞は、以下の事項により生成される：１）ｉＮＫＴＴＣＲを発現させるための（例えば、レンチウイルスベクターによる）およびＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の発現を消失させるための（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集による）ドナーＨＳＣの遺伝子改変；２）ＡＴＯ培養によるｉＮＫＴ細胞へのｉｎｖｉｔｒｏでの分化；３）ｉｎｖｉｔｒｏでのｉＮＫＴ細胞の精製および増幅；および４）製剤化および凍結保存および／または使用。一部の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、ＡＴＯ培養を使用せずに（例えば、本明細書で開示される「フィーダーフリー」培養系によって）生成される。

本開示の一部の実施形態は、クローンインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；ｂ）ヒトｉＮＫＴＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；ｃ）単離されたヒトＣＤ３４^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の表面発現を消失させるステップ；およびｄ）ｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４^＋細胞を人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系で培養して、ｉＮＫＴ細胞を産生するステップを含み、ＡＴＯ系が、ノッチリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体と無血清培地とを含む、方法を提供する。方法は、ＣＤ３４^－細胞を単離するステップをさらに含み得る。代替実施形態では、ＡＴＯ系以外の培養系、例えば、＿＿が、利用される。方法は、ＣＤ３４^－細胞を単離するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、２－Ｄ培養系または他の形態の３－Ｄ培養系（例えば、ＦＴＯＣ様培養、Ｍａｔｒｉｇｅｌにより支援される培養）が適用される。

本開示の特定の態様は、２次元または３次元であり得る細胞培養系であって、分化度の低い細胞、例えば、胚性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹もしくは始原細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または幹もしくは始原細胞から、ｉＮＫＴ細胞を産生するための、細胞培養系に関する。例えば、少なくとも胎児肝臓、臍帯血、および末梢血ＣＤ３４^＋細胞（Ｇ－ＣＳＦ動員型または非Ｇ－ＣＳＦ動員型のどちらか）を含む様々な資源からの、任意の型の幹細胞を利用することができる。

一部の実施形態では、系は、無血清培地の使用を伴う。ある特定の態様では、系は、細胞発生に好適である無血清培地を三次元細胞凝集体の培養に使用する。そのような系は、十分な量のｉＮＫＴ細胞を産生する。本開示の一部の実施形態では、細胞または細胞凝集体は、インスリンを含む無血清培地中で、幹もしくは始原細胞のｉＮＫＴ細胞へのまたはｉＮＫＴ細胞の前駆細胞へのｉｎｖｉｔｒｏでの分化に十分な期間、培養される。

細胞培養組成物の実施形態は、高度に標準化された無血清成分および間質細胞系を使用してヒトＨＳＣからのロバストで高度に再現性のあるＴ細胞分化を助長する培養を含み得る。ある特定の実施形態では、この培養での細胞分化は、内因性胸腺細胞増殖に極めて似ており、単層共培養とは対照的に、機能的ｉＮＫＴの効率的な正の選択を支持した。培養組成物のある特定の態様は、無血清条件を使用し、ヒト胸腺組織または有標足場材料の使用を回避し、供給源細胞からの完全に機能的な成熟ヒトｉＮＫＴ細胞の正の選択およびロバストな生成を助長する。

一部の実施形態では、培養系は、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）とインターロイキン７（ＩＬ－７）とＢ２７とアスコルビン酸とを含有する最適化された培地の存在下での、ノッチリガンドを発現する間質細胞とヒトＨＳＣの共培養を含み得る。空気と流体の界面での培養を可能にする条件も存在し得る。造血細胞と間質細胞の間の３Ｄ細胞間相互作用とともに可溶性因子（サイトカイン、アスコルビン酸、Ｂ２７成分、および間質細胞由来因子）からのコンビナトリアルシグナ伝達が、ヒトＴ細胞系列コミットメント、正の選択、および機能的な成熟Ｔ細胞への効率的分化を助長すると、決定された。

一部の実施形態では、細胞培養物は、物理的マトリックスまたは足場上でＣＤ３４^＋形質導入細胞と間質細胞の選択された集団とを混合することにより作出される。方法は、ＣＤ３４^＋形質導入細胞および間質細胞を遠心分離して、物理的マトリックスまたは足場上に置かれている細胞ペレットを形成するステップをさらに含む。間質細胞により発現されるノッチリガンドは、無傷、部分的もしくは改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、またはこれらの組合せであり得る。特定の実施形態では、ノッチリガンドは、例えばヒトＤＬＬ１などのヒトノッチリガンドである。

ｉＮＫＴ細胞を産生するために利用される培養系は、間質細胞のＣＤ３４^＋細胞に対する一定の比を有し得る。特定の実施形態では、間質細胞とＣＤ３４^＋細胞との比は、約１：５～１：２０である。間質細胞は、マウス間質細胞系、ヒト間質細胞系、初代間質細胞の選択された集団、多能性幹細胞からｉｎｖｉｔｒｏで分化した間質細胞の選択された集団、またはこれらの組合せであり得る。間質細胞は、造血幹または始原細胞からｉｎｖｉｔｒｏで分化した間質細胞の選択された集団であり得る。

クローンｉＮＫＴ細胞の集団を調製する方法では、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠いているｉＮＫＴ細胞を選択するステップは、ｉＮＫＴ細胞を、ｉＮＫＴ細胞に結合してこれらの細胞についての正の選択を行ないかつＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性細胞に結合してこれらの細胞について負の選択を行なう磁気ビーズと接触させることを含み得る。特定の実施形態では、磁気ビーズは、ヒトｉＮＫＴＴＣＲ、ＨＬＡ－Ｉ分子またはＨＬＡ－ＩＩ分子を認識するモノクローナル抗体でコーティングされる。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、クローン６Ｂ１１（ヒトＴＣＲＶα２４－Ｊα１８を認識し、したがって、ヒトｉＮＫＴインバリアントＴＣＲアルファ鎖を認識する）、クローン２Ｍ２（ヒトＢ２Ｍを認識し、したがって、細胞表面に提示されたヒトＨＬＡ－Ｉ分子を認識する）、クローンＷ６／３２（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを認識し、したがって、ヒトＨＬＡ－Ｉ分子を認識する）、およびクローンＴｕ３９（ヒトＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを認識し、したがって、ヒトＨＬＡ－ＩＩ分子を認識する）である。

調製方法により産生された細胞を凍結させることができる。産生された細胞が、デキストロース、１つもしくは複数の電解質、アルブミン、デキストラン、およびＤＭＳＯを含む溶液中あることもある。この溶液は、無菌、非化膿性、および等張性であり得る。

特定の実施形態では、培養系は、ＣＤ３４^－細胞を含み得るフィーダー細胞を利用する。一部の実施形態では、培養系は、フィーダー細胞を使用しない。

調製方法は、選択されたｉＮＫＴ細胞を活性化および増幅するステップをさらに含むことがあり、例えば、選択されたｉＮＫＴ細胞は、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化された。フィーダー細胞は、α－ＧＣがパルス投与されたものであってもよい。

本開示の調製方法は、少なくとも約１０^２～１０^６個のクローンｉＮＫＴ細胞を含む、クローンｉＮＫＴ細胞の集団を産生することができる。方法は、合計少なくとも約１０^６～１０^１２個の細胞を含む細胞集団を産生し得る。産生された細胞集団を凍結させ、次いで解凍することができる。調製方法の一部の場合には、方法は、例えば１つまたは複数の治療用遺伝子産物をコードする１つまたは複数の追加の核酸などの、１つまたは複数の追加の核酸を、凍結されて解凍された細胞集団に導入するステップをさらに含む。

特定の実施形態では、３Ｄまたは２Ｄ培養組成物についての方法であって、発生時に、ヒトＤＬＬ１を形質導入したＭＳ－５マウス間質細胞（以降、ＭＳ５－ｈＤＬＬ１）と、ヒト臍帯血、骨髄、またはＧ－ＣＳＦ動員末梢血から単離されたＣＤ３４^＋ＨＳＰＣとの凝集を含む方法が、提供され得る。１×１０^６個以下のＨＳＰＣが、ＭＳ５－ｈＤＬＬ１細胞と、最適な比（通常は、１：１０のＨＳＰＣ対間質細胞）で混合される。

例えば、凝集は、混合細胞懸濁液の遠心分離（「圧縮凝集」）、続いての無細胞上清の吸引により達成することができる。特定の実施形態では、次いで、５～１０ｕｌの分化培地中のスラリーとして細胞ペレットを吸引し、分化培地のウェル内に、インサートの下側を培地と、上側を空気と接触させて浮かべられている、０．４ｕｍナイロン製ウェル間培養インサート上に、液滴として移入することができる。

例えば、分化培地は、ＲＰＭＩ－１６４０、５ｎｇ／ｍｌのヒトＦＬＴ３Ｌ、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７、４％無血清Ｂ２７サプリメント、および３０ｕＭのＬ－アスコルビン酸を含み得る。培養インサートの周囲から３～４日おきに培地を完全に交換することができる。培養の最初の２週間の間に、細胞凝集体は、ＡＴＯとして自己組織化することができ、初期Ｔ細胞系列へのコミットメントおよび分化が起こる。ある特定の態様では、細胞は、最適なＴ細胞分化を可能にするために少なくとも６週間、培養される。細胞培養物からの造血細胞の回収は、ピペッティングによる細胞の脱凝集により達成することができる。

プロトコールを変えることによって、有効性に対して様々な影響を及ぼす代替成分の使用が可能になり、具体的には以下の通りである：

基本培地ＲＰＭＩを、いくつかの市販の代替物（例えば、ＩＭＤＭ）の代わりに用いることができる。

使用される間質細胞系は、以前に記載されたマウス骨髄細胞系（Itoh et al,1989）である、ＭＳ－５であるが、ＭＳ－５を、類似のマウス間質細胞系（例えば、ＯＰ９、Ｓ１７）、ヒト間質細胞系（例えば、ＨＳ－５、ＨＳ－２７ａ）、初代ヒト間質細胞、またはヒト多能性幹細胞由来の間質細胞の代わりに用いることができる。

間質細胞系に、ヒトＤＬＬ１ｃＤＮＡをコードするレンチウイルスで形質導入されるが、遺伝子送達の方法、およびノッチリガンド遺伝子を変えることができる。代替ノッチリガンド遺伝子は、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２およびその他を含む。ノッチリガンドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７９５，４０４号および同第８，３７７，８８６号に記載されているものも含む。ノッチリガンドは、デルタ１、３および４、ならびにＪａｇｇｅｄ１、２をさらに含む。

ＨＳＣの型および供給源は、骨髄、臍帯血、末梢血、胸腺もしくは他の主要な供給源；またはヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）もしくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＨＳＣを含み得る。

サイトカイン条件を変えることができる：例えば、ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ－７のレベルを変化させてＴ細胞分化動態を変更することができ、他の造血サイトカイン、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ／ＫＩＴリガンド）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ－２、ＩＬ－１５を加えることができる。

遺伝子改変をある特定の成分に導入して、抗原特異的Ｔ細胞を生成することならびに正および負の選択をモデル化することができる。これらの改変の例としては、抗原特異的、対立遺伝子排除ナイーブＴ細胞の生成のための、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスベクターでのＨＳＣへの形質導入；特殊化したリンパ系細胞へ分化系列コミットメントを方向付けるための遺伝子でのＨＳＣへの形質導入が挙げられる。例えば、細胞培養もしくはＡＴＯで機能的なｉＮＫＴ細胞を生成するための、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ）関連ＴＣＲでのＨＳＣへの形質導入；細胞培養中のＴＣＲ操作Ｔ細胞もしくはＴＣＲ非操作Ｔ細胞の両方の正の選択および成熟を増進させるための、ヒトＭＨＣ遺伝子（例えば、ヒトＣＤ１ｄ遺伝子）での間質細胞系（例えば、ＭＳ５－ｈＤＬＬ１）への形質導入；ならびに／または培養中のＣＡＲＴ細胞の正の選択を増進するための、抗原と共刺激分子もしくはサイトカインでの間質細胞への形質導入。

操作されたｉＮＫＴ細胞を導入する際、ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からのＣＤ３４^＋細胞を、ある特定の外来性遺伝子を導入することにより、およびある特定の内在性遺伝子をノックアウトすることにより、改変することができる。方法は、選択されたＣＤ３４^＋細胞を培地中で培養するステップを、１つまたは複数の核酸を細胞に導入するステップの前にさらに含み得る。培養するステップは、一部の場合には、選択されたＣＤ３４^＋細胞を、１つまたは複数の増殖因子を含む培地とともにインキュベートすることを含み、１つまたは複数の増殖因子は、例えば、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含み得る。増殖因子は、約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ／の間などの、ある特定の濃度であってもよく、またはなくてもよい。

特定の方法では、細胞に導入される核酸は、α－ＴＣＲおよびβ－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む１つまたは複数の核酸である。方法は、選択されたＣＤ３４^＋細胞に、自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含み得る。特定の態様では、１つの核酸がα－ＴＣＲとβ－ＴＣＲの両方をコードするか、または１つの核酸が、α－ＴＣＲ、β－ＴＣＲおよび自殺遺伝子をコードする。自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子からのものなどのウイルスＴＫ遺伝子を含むチミジンキナーゼ（ＴＫ）などの、酵素に基づき得る。自殺遺伝子産物を、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体などの、基質により活性化することができる。細胞を、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドをコードする外来性核酸を含むように、改変することができる。一部の場合には、自殺遺伝子産物は、ｓｒ３９ＴＫなどの、イメージングのために標識され得る基質を有する、ポリペプチドである。

細胞を、例えば、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／またはＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の機能的な発現を妨害することによって、ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠くように操作することができる。これらの産生方法では、単離されたヒトＣＤ３４^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を消失させることは、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡまたは個々のＨＬＡ－ＩもしくはＨＬＡ－ＩＩ分子に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、細胞に導入することを含み得る。ＣＲＩＳＰＲまたは１つもしくは複数のｇＲＮＡは、一部の場合には電気穿孔または脂質媒介トランスフェクションにより細胞にトランスフェクトされる。特定の実施形態では、ＴＣＲ受容体をコードする核酸は、例えば、少なくともレンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスを含む、ウイルスベクターなどの組換えベクターを使用して、細胞に導入される。

操作されたｉＮＫＴ細胞を製造する場合、細胞は、外部から添加されたアスコルビン酸を含む無血清培地を含む、特定の無血清培地中に存在し得る。特定の態様では、無血清培地は、外部から添加されたＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン、ミッドカイン、またはこれらの組合せをさらに含む。無血清培地は、ビオチン、酢酸ＤＬアルファ－トコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、またはこれらの組合せもしくはこれらの塩を含む、ビタミンをさらに含み得る。無血清培地は、１つまたは複数の外部から添加された（またはされたものでない）タンパク質、例えば、アルブミンもしくはビオチン血清アルブミン、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジムスターゼ、またはこれらの組合せをさらに含み得る。無血清培地は、コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレイン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、もしくはトリヨード－Ｉ－チロニン、またはこれらの組合せをさらに含み得る。無血清培地は、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、ゼノフリーＢ－２７（登録商標）サプリメント、ＧＳ２１（商標）サプリメント、またはこれらの組合せを含み得る。アミノ酸（アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシンもしくはバリン、またはこれらの組合せを含む）、単糖類、および／または無機イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素もしくはリン、またはこれらの組合せもしくは塩を含む）が、無血清培地中に存在し得る。無血清培地は、モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅もしくはマンガン、またはこれらの組合せをさらに含み得る。

本明細書に記載される３Ｄ細胞凝集体のための、ならびにＴ細胞の産生および／またはそれらの正／負の選択のための、細胞培養条件が、提供され得る。ある特定の態様では、選択された集団の開始細胞は、少なくとももしくは約１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３個またはこれらの中から導出可能な任意の範囲の細胞を含み得る。開始細胞集団は、少なくとももしくは約１０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８細胞／ｍｌまたはこれらの中から導出可能な任意の範囲の播種密度を有し得る。

３Ｄ細胞凝集体またはそれらの子孫細胞を培養するために使用される培養容器としては、その中で幹細胞を培養することができるのであれば、特にこれらに限定されないが、フラスコ、組織培養用のフラスコ、皿、ペトリ皿、組織培養用の皿、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、管、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、およびローラーボトルを挙げることができる。幹細胞を、培養の必要性に依存して、少なくとももしくは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはこれらの中から導出可能な任意の範囲の体積で、培養することができる。ある特定の実施形態では、培養容器は、バイオリアクターであり得、バイオリアクターは、生物学的に活性な環境を支持する任意のデバイスまたはシステムを指すことができる。バイオリアクターは、少なくとももしくは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、またはこれらの中から導出可能な任意の範囲の体積を有し得る。

培養容器は、細胞接着性であることもあり、または細胞非接着性であることもあり、目的に依存して選択することができる。細胞接着性細胞容器を、容器表面の細胞への接着性を改善するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着用の基質のいずれかでコーティングすることができる。細胞接着用の基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用される場合）に接着することを目的とした任意の材料であり得る。細胞接着用の基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ラミニンおよびフィブロネクチンならびにこれらの混合物、例えば、Ｍａｒｉｇｅｌ（商標）、および溶解細胞膜調製物が挙げられる。

様々な規定されたマトリックス成分を培養方法または組成物において使用することができる。例えば、組み合わせて組換えコラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンを使用して、その全体が参照により本明細書に組み込まれるLudwig et al. (2006a;2006b)に記載されているように、多能性細胞成長用の固体支持体を提供する手段としての培養面をコーティングすることができる。

マトリックス組成物を表面に固定化して細胞を支持することができる。マトリックス組成物は、１つまたは複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質および水性溶媒を含み得る。用語「細胞外マトリックス」は、当技術分野において認知されている。その成分は、次のタンパク質のうちの１つまたは複数を含む：フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、ウンジュリン、エピリグリン、およびカリニン。他の細胞外マトリックスタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれるKleinman et al., (1993)に記載されている。用語「細胞外マトリックス」は、将来発見され得る現在は未知の細胞外マトリックスを包含することが、細胞外マトリックスとしてのその特徴を当業者が容易に決定できるようになると思われるので、意図されている。

一部の態様では、マトリックス組成物中の全タンパク質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、マトリックス組成物中の全タンパク質濃度は、約１μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬである。より好ましい実施形態にでは、マトリックス組成物中の全タンパク質濃度は、約５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬである。

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、天然起源のものであり得、ヒトまたは動物の組織から精製され得る。あるいは、ＥＣＭタンパク質は、遺伝子操作された組換えタンパク質であることもあり、または自然に合成されたものであることもある。ＥＣＭタンパク質は、天然のまたは操作された、タンパク質全体であることもあり、またはペプチド断片の形態であることもある。細胞培養用のマトリックスに有用であり得るＥＣＭタンパク質の例としては、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチンおよびビトロネクチンが挙げられる。一部の実施形態では、マトリックス組成物は、フィブロネクチンのまたは組換えフィブロネクチンの合成により生成されたペプチド断片を含む。

なおさらなる実施形態では、マトリックス組成物は、少なくともフィブロネクチンとビトロネクチンの混合物を含む。一部の他の実施形態では、マトリックス組成物は、好ましくはラミニンを含む。

マトリックス組成物は、好ましくは、単一のタイプの細胞外マトリックスタンパク質を含む。一部の実施形態では、マトリックス組成物は、特に始原細胞の培養で使用するために、フィブロネクチンを含む。例えば、好適なマトリックス組成物は、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．のＢｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．（ＢＤ）により販売されているヒトフィブロネクチン（カタログ番号３５４００８）などの、ヒトフィブロネクチンを、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈することにより、調製することができる。特定の例では、マトリックス組成物は、フィブロネクチン断片、例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）を含む。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）は、ヒトフィブロネクチンの、中央細胞結合ドメイン（ＩＩＩ型リピート、８、９、１０）と、高親和性ヘパリン結合ドメインＩＩ（ＩＩＩ型リピート、１２、１３、１４）と、選択的スプライシングを受けたＩＩＩＣＳ領域内のＣＳ１部位とを含有する、（５７４アミノ酸）の約６３ｋＤａタンパク質である。

一部の他の実施形態では、マトリックス組成物は、はラミニンを含み得る。例えば、好適なマトリックス組成物は、ラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）；カタログ番号Ｌ６２７４およびＬ２０２０）をダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で５μｇ／ｍｌ～約２００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈することにより、調製することができる。

一部の実施形態では、マトリックス組成物は、マトリックスが、またはそのタンパク質成分が、もっぱらヒト由来のものであることから、ゼノフリーである。これは、ある特定の研究応用に望ましいことがある。例えば、ヒト細胞を培養するためのゼノフリーマトリックスでは、ヒト由来のマトリックス成分が使用され得、この場合、いずれの非ヒト動物性成分も除外され得る。ある特定の態様では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、培養組成物から基質として除外され得る。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞により分泌されるゲル状タンパク質混合物であり、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から市販されている。この混合物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に似ており、細胞生物学者によって細胞培養用の基質として使用されることが多いが、望ましくない異種抗原または夾雑物を導入する可能性がある。

ある特定の実施形態では、外来性核酸を含有する細胞を、発現ベクターまたは外来性核酸にマーカーを含めることにより、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで同定することができる。このようなマーカーは、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を細胞にもたらすことになる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものであり得る。正の選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり得、その一方で負の選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。正の選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。

通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件のインプレメンテ－ションに基づいた形質質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基準が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーをはじめとする他のタイプのマーカーも、企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能な酵素を負の選択マーカーとして利用することもできる。当業者には、恐らくＦＡＣＳ解析とともに、免疫学的マーカーを利用する方法も、分かるであろう。使用されるマーカーは、それが、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能であれば、重要でないと考えられる。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。

選択可能なマーカーは、トランスフェクションの成功または外来ＤＮＡを細胞に導入することを意図した他の手順の成功を示すために、微生物検査学、分子生物学、および遺伝子工学で使用されるタイプのレポーター遺伝子を含み得る。選択可能なマーカーは、多くの場合、抗生物質耐性遺伝子であり、外来ＤＮＡを導入するための手順に付した細胞を、抗生物質を含有する培地で成長させ、成長することができる細胞は、導入された遺伝物質をうまく取り入れ、発現した。選択可能なマーカーの例としては、ジェネティシンに対する抗生物質耐性を付与する、Ｔｎ５からのＡｂｉｃｒ遺伝子またはＮｅｏ遺伝子が挙げられる。

スクリーニング可能なマーカーは、研究者が望ましい細胞と望ましくない細胞とを区別することを可能にする、レポーター遺伝子を含み得る。本発明のある特定の実施形態は、特定の細胞系列を示すためにレポーター遺伝子を利用する。例えば、レポーター遺伝子は、発現エレメント内に、および同時発現のために心室選択的または心房選択的遺伝子のコード領域と通常は会合している心室選択的または心房選択的調節エレメントの制御下に、位置し得る。レポーターによって、特定の系列の細胞を、それらを薬物または他の選択圧下に置くことも別様に細胞生存を危険にさらすこともなく、単離することが可能になる。

そのようなレポーターの例としては、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ４、ＨＡエピトープ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、抗原決定基をコードする遺伝子、および酵素（例えば、β－ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子が挙げられる。ベクターを含有する細胞を、例えば、ベクターによりコードされている酵素によって蛍光生成物に変換され得る、細胞表面タンパク質または基質に対する蛍光タグ付き抗体を使用して、ＦＡＣＳにより単離することができる。

特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質である。ほぼ全可視光スペクトルにわたる蛍光発光スペクトルプロファイルを特徴とする広範な蛍光タンパク質遺伝的変異体が、開発されている。最初のＡｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａクラゲ緑色蛍光タンパク質での突然変異誘発の取り組みは、色に青色から黄色までの幅がある新しい蛍光プローブをもたらす結果となり、これらのプローブは、生物学的研究においてｉｎｖｉｖｏで最も広く使用されているレポーター分子の一部である。橙色および赤色のスペクトル領域で発光する、より長い波長の蛍光タンパク質が、海洋アネモネ、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａｓｔｒｉａｔａ、およびＡｎｔｈｏｚｏａ綱に属する造礁サンゴから開発された。さらに他の種が、シアン、緑色、黄色、橙色および深紅色の蛍光発光を有する類似のタンパク質を産生するために探し当てられた。蛍光タンパク質の輝度および安定性を改善し、ひいてはそれらの全般的な有用性を改善するために、開発研究の取り組みは続いている。

ある特定の実施形態では、分化の前または後のどちらかに細胞を遺伝子操作することにより、細胞を、１つまたは複数の遺伝的変更を含むように作製することができる（米国特許出願公開第２００２／０１６８７６６号）。外来性核酸もしくはポリヌクレオチドが、好適な人工的操作手段により細胞に移入されたとき、または細胞が、そのポリヌクレオチドを遺伝した最初に変更された細胞の子孫である場合、細胞は、「遺伝的に変更された」、「遺伝子改変された」または「トランスジェニック」と言われる。例えば、細胞が、限定された発生系列の細胞または最終分化した細胞に進む前または進んだ後のどちらかに、テロメラーゼ逆転写酵素を発現するように細胞を遺伝的に変更することにより、細胞を、それらの複製能を増加させるようにプロセシングすることができる（米国特許出願公開第２００３／００２２３６７号）。

ある特定の実施形態では、外来性核酸構築物を含有する細胞を、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーなどのマーカーを発現ベクターに含めることにより、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで同定することができる。このようなマーカーは、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を細胞にもたらすことになり、または組織特異的プロモーターを使用することによる分化した心臓細胞の濃縮もしくは同定を助長することになる。例えば、心筋細胞分化の態様では、心臓特異的プロモーター、例えば、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、サルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ－カドヘリン、β１－アドレナリン受容体、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ－２ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ－ＭＢ）、ミオグロビンまたは心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）のプロモーターを、使用することができる。ニューロン分化の態様では、ＴｕＪ－１、Ｍａｐ－２、Ｄｃｘまたはシナプシンを含むがこれらに限定されない、ニューロン特異的プロモーターを使用することができる。肝細胞分化の態様では、ＡＴＴ、Ｃｙｐ３ａ４、ＡＳＧＰＲ、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ４ａまたはＡＦＰを含むがこれらに限定されない、胚体内胚葉特異的および／または肝細胞特異的プロモーターを使用することができる。

一般に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、その一方で負の選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。正の選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。

通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ブラストサイジン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択可能なマーカーである。条件のインプレメンテ－ションに基づいた形質質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基準が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーをはじめとする他のタイプのマーカーも、企図される。あるいは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの、スクリーニング可能な酵素を利用することができる。当業者には、恐らくＦＡＣＳ解析とともに、免疫学的マーカーを利用する方法も、分かるであろう。使用されるマーカーは、それが、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能であれば、重要でないと考えられる。選択可能なマーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。

細胞が、遺伝子改変される、例えば、１つまたは複数の特徴を加えるまたは低減させるように遺伝子改変される、実施形態では、遺伝子改変は、任意の好適な方法で行なわれ得る。例えば、任意の遺伝子改変組成物または方法、例えば、遺伝子編集、相同組換えもしくは非相同組換え、ＲＮＡ媒介遺伝子送達、または任意の従来の核酸送達方法を使用して、外来性核酸を細胞に導入することまたはゲノムＤＮＡを編集することができる。遺伝子改変方法の非限定的な例としては、遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ技術による遺伝子編集を挙げることができる。

遺伝子改変は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでの選択またはスクリーニングを助長する選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーの導入も含み得る。特に、ｉｎｖｉｖｏイメージング剤または自殺遺伝子を、外因的に発現させることができ、または開始細胞もしくは子孫細胞に加えることができる。さらなる態様では、方法は、画像誘導養子細胞療法を含み得る。

特定の実施形態

本開示の特定の実施形態では、クローンインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞を含む細胞集団を調製する方法であって、ａ）ヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；ｂ）ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンドおよびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む増殖因子を含む培地でＣＤ３４^＋細胞を培養するステップ；ｃ）選択されたＣＤ３４^＋細胞に、α－ＴＣＲとβ－ＴＣＲとチミジンキナーゼとをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターで、形質導入するステップ；ｄ）選択されたＣＤ３４^＋細胞に、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）および／またはＣＴＩＩＡのためのＣａｓ９およびｇＲＮＡを導入して、Ｂ２ＭまたはＣＴＩＩＡ遺伝子の発現を妨害し、ひいてはＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるステップ；ｅ）形質導入細胞を、外来性ノッチリガンドを発現する照射された間質細胞系とともに、２～１２（または２～１０または６～１２）週間、３Ｄ凝集細胞培養で培養して、ｉＮＫＴ細胞を増幅するステップ；ｆ）ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を欠いているｉＮＫＴ細胞を選択するステップ；およびｇ）選択されたｉＮＫＴ細胞を、照射されたフィーダー細胞とともに培養するステップを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、１０^８～１０^１３個のｉＮＫＴ細胞が、選択されたＣＤ３４^＋細胞から調製される。

したがって、本開示は、汎用およびオフザシェルフである、先進のＨＳＣベースのｉＮＫＴ細胞療法を包含する。具体的には、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋ＨＳＣを健康なドナーからまたは細胞レポジトリから得することができる。単一のドナーから、約１～５×１０^８個のＨＳＣを採取することができる。特定の場合には、これらのＨＳＣ細胞は、Ｌｅｎｔｉ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫレンチウイルスベクターおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡの複合体を用いてｉｎｖｉｔｒｏで操作され、次いで、８週間、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養でｉＮＫＴ細胞へと分化される。次いで、ｉＮＫＴ細胞は、精製され、さらに２～４週間、ｉｎｖｉｔｒｏで増幅され、その後、凍結保存およびロットのリリースが行なわれる。特定の態様では、約１０^１２個のｉＮＫＴ細胞が単一のドナーのＨＳＣから生成され、これらを１，０００～１０，０００用量に（例えば、１用量当り細胞約１０^８～１０^９個で）製剤化することができる。操作されたｉＮＫＴ細胞である、得られた凍結保存細胞製品を、その後、容易に保管し、オフザシェルフで、同種異系養子細胞移入によってがん患者を処置するために配給することができる。ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍抗原拘束性および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束性なしで複数のタイプのがんを標的とすることができるため、ｉＮＫＴ療法は、がん患者の複数のがんおよび大集団を処置するための、したがって、まだ満たされていない医療必要性に対処するための、汎用がん療法として有用である（Vivier et al., 2012；Berzins et al., 2011）。特に、本開示のｉＮＫＴ療法は、血液がん（白血病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群）および固形腫瘍（黒色腫、結腸、肺、乳および頭頸部がん）をはじめとする、臨床的にｉＮＫＴ細胞の調節を受ける対象とされている多くのタイプのがん（Berzinset al., 2011）の処置に有用である。

ｉＮＫＴ療法の基礎をなす科学的実施形態は、１）ヒトｉＮＫＴＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子のレンチウイルスベクター媒介発現が、ｉＮＫＴ細胞へと分化するようにＨＳＣをプラグラムする；２）ｓｒ３９ＴＫＰＥＴイメージング／自殺遺伝子を含めることにより、ＰＥＴイメージングを使用して患者のｉＮＫＴ細胞をモニターすることが可能になり、安全上必要な場合にはガンシクロビル（ＧＣＶ）投与によるこれらの細胞の枯渇も可能になる；３）ＨＳＣのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡに基づく遺伝子編集がＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトし、その結果、同種異系注入に好適なＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性細胞製品が得られる；４）ＡＴＯ培養系がヒトｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの効率的発生を支持する；５）製造プロセスが高収率かつ高純度であるという、実施形態である。本明細書中の実施例セクションは、これらの科学的実施形態を支持するデータを提供する。

特定の場合には、ｉＮＫＴの製造は、１）Ｇ－ＣＳＦ動員ロイコパックの収集、２）Ｇ－ＣＳＦロイコパックのＣＤ３４^＋ＨＳＣへの精製；３）レンチウイルスベクターＬｅｎｔｉ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫでのＨＳＣへの形質導入；４）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡの遺伝子編集；５）ＡＴＯによるｉＮＫＴ細胞へのｉｎｖｉｔｒｏでの分化；６）ｉＮＫＴ細胞の精製；７）ｉｎｖｉｔｒｏでの細胞増幅；８）細胞収集、製剤化および凍結保存を含む。ある特定の実施形態には、２つの製剤原料（Ｌｅｎｔｉ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターおよびｉＮＫＴ細胞）があり、特定の場合には、最終薬物製品は、輸液バッグ内の製剤化され凍結保存されたｉＮＫＴであり得る。

ｉＮＫＴ細胞を生成するための効率的なプロトコールの例が、本明細書で提供される。Ｂ２ＭのノックアウトによってクラスＩＨＬＡの細胞表面発現を除去するためのＨＳＣの効率的遺伝子編集が、本明細書で実証される。多重編集用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を活用して、ＨＬＡ－ＩＩ発現の肝要な調節因子である（Steimle et al., 1994）クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）の遺伝子のノックアウトによって、例えば、検証されたｇＲＮＡ配列（Abrahimiet al., 2015）を使用して、細胞表面クラスＩＩＨＬＡ発現を同時に妨害することもできる。したがって、細胞表面ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ発現を妨害するためのこの遺伝子編集ステップ、およびマイクロビーズ精製ステップを組み込んで、本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞を生成することになる。フローサイトメトリー解析を使用して、これらの操作されたｉＮＫＴ細胞の純度および表面表現型を測定することができる。この細胞純度は、ＴＣＲＶα２４^＋Ｊα１８^＋ＨＬＡ－Ｉ^－ＨＬＡ－ＩＩ^－を特徴とし得る。特定の実施形態では、このｉＮＫＴ細胞集団は、記憶表現型およびＮＫ表現型を示す、ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ１６１^＋であり、ＣＤ４^＋ＣＤ８^－（ＣＤ４単一陽性）、ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（ＣＤ８単一陽性）と、ＣＤ４^－ＣＤ８^－（二重陰性、ＤＮ）の両方を含有する（Kronenbergand Gapin, 2002）。ＣＤ６２Ｌ発現を解析することができる。最近の研究により、その発現が、ｉＮＫＴ細胞およびそれらの抗腫瘍活性のｉｎｖｉｖｏでの持続性に関連していることが示された（Tianet al., 2016）からである。ｉＮＫＴのこれらの表現型をＰＢＭＣからのｉＮＫＴのものと比較することができる。ＲＮＡｓｅｑを利用して、ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣｉＮＫＴ細胞に関する比較遺伝子発現解析を行なうことができる。

ＰＢＭＣｉＮＫＴをベンチマーク対照として使用してｉＮＫＴの機能特性を評定するために、ＩＦＮ－γ産生および細胞傷害性アッセイを使用することができる。αＧＣがパルス投与された照射されたＰＢＭＣでｉＮＫＴ細胞を刺激し、１日刺激から得られた上清をＩＦＮ－γＥＬＩＳＡに付すことができる（Smith et al., 2015）。６時間の刺激後にｉＮＫＴ細胞に対するＩＦＮ－γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）を行なうこともできる。細胞傷害性アッセイを、ルシフェラーゼおよびＧＦＰを発現するように操作されたαＧＣがロードされたＡ３７５．ＣＤ１ｄ標的細胞とともにエフェクターｉＮＫＴ細胞を４時間インキュベートすることにより行なうことができ、細胞傷害性をそのルシフェラーゼ強度についてプレートリーダーにより測定することができる。ｓｒ３９ＴＫは、ＰＥＴ／自殺遺伝子として導入されるため、その機能性を、ｉＮＫＴをガンシクロビル（ＧＣＶ）とともにインキュベートすることにより検証することができ、細胞生存率を、例えば、ＭＴＴアッセイ、およびアネキシンＶに基づくフローサイトメトリーアッセイにより、測定することができる。

薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究を行なうことができる。ＰＫ／ＰＤ研究は、動物モデルにおいてｉｎｖｉｖｏで次のことを決定することができる：１）注入されたｉＮＫＴの増幅動態および存続性、２）様々な組織／臓器におけるｉＮＫＴの生体内分布、３）ｉＮＫＴの、腫瘍に輸送される能力、およびこの濾過が腫瘍成長にどのように関係するのか。Ａ３７５．ＣＤ１ｄ（Ａ３７５．ＣＤ１ｄ）腫瘍を担持している免疫不全ＮＳＧマウスを固形腫瘍動物モデルとして利用することができる。２つの細胞用量群（１×１０^６および１０×１０^６；ｎ＝８）を調査することができる。腫瘍を－４日目に接種（ｓ．ｃ．）し、ベースラインＰＥＴイメージングおよび採血を０日目に行なうことができる。その後、ｉＮＫＴ細胞を静脈内注入（ｉ．ｖ．）し、１）生きている動物における７および２１日目のＰＥＴイメージング、２）７、１４および２１日目の定期的採血、３）２１日目の動物の死後のエンドポイント組織採取により、モニターすることができる。様々な採血から採取した細胞をフローサイトメトリーにより解析することができ、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ１６１^＋６Ｂ１１^＋であるはずである。ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４などの他のマーカーの発現を検査して、ｉＮＫＴサブセットが経時的にどのように変化するかを調べることができる。ｓｒ３９ＴＫによるＰＥＴイメージングによって、腫瘍および他の組織／臓器、例えば骨、肝臓、脾臓、胸腺などにおけるｉＮＫＴ細胞の存在を追跡することが可能になる。研究終了時に、腫瘍、および脾臓、肝臓、脳、心臓、腎臓、肺、胃、骨髄、卵巣、腸などを含む、マウス組織を、ｑＰＣＲ解析のために回収して、ｉＮＫＴ細胞の分布を検査することができる。

細胞の作用機序（ＭＯＡ）を特徴付けることができる。ｉＮＫＴ細胞が、直接死滅させることによって、あるいはＮＫおよびＣＤ８Ｔ細胞に腫瘍を根絶するように指示するＩＦＮ－γの大量放出によって、腫瘍を標的とすることは、公知である（Fujii et al., 2013）。ｉｎｖｉｔｒｏでの薬理学的研究により、直接的な細胞傷害性の証拠が得られる。この場合、ｉｎｖｉｖｏでの抗腫瘍反応性を支援するＮＫおよびＣＤ８Ｔ細胞の役割を調査することができる。腫瘍担持ＮＳＧマウス（Ａ３７５．ＣＤ１ｄまたはＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ）に、ｉＮＫＴを単独で（上記ｉｎｖｉｖｏ研究に基づいて選択された用量）、あるいはＰＢＭＣと組み合わせてのいずれかで注入することができる（不適合ドナー、５×１０^６）。ｉＮＫＴがＭＨＣ陰性であるため、ｉＮＫＴと無関係のＰＢＭＣとの間で同種異系免疫応答は起こらない場合がある。腫瘍成長をモニターし、ＰＢＭＣを伴う群と伴わない群とを比較することができる（１群当りｎ＝８）。より大きい抗腫瘍応答が組合せ群から観察された場合、それは、特定の実施形態（specificiembodiments）では、ＰＢＭＣ中の成分、例えば、ＮＫおよび／またはＣＤ８Ｔ細胞が、治療有効性をブーストする役割を果たすことを示し得る。それらの個々の役割をさらに決定するために、ＮＫ細胞が（ＣＤ５６ビーズによって）、ＣＤ８Ｔ細胞が（ＣＤ８ビーズによって）または骨髄系細胞が（ＣＤ１４ビーズによって）枯渇されたＰＢＭＣを、ｉＮＫＴ細胞と一緒に担腫瘍マウスに混注することができる。免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４は、ｉＮＫＴ細胞機能を調節することが示唆されている（Piloneset al., 2012；Durgan et al., 2011）。抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４処置をｉＮＫＴ療法に加えることによって、これらの分子がｉＮＫＴ療法をどのようにモジュレートするのかを決定することができ、併用がん療法の設計に関する情報を提供することができる。

特定のベクターをｉＮＫＴ細胞の産生および／またはそれらの使用に利用することができる。ＨＳＣを遺伝子操作してｉＮＫＴ細胞にするために、ヒトｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子をコードするＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクターＬｅｎｔｉ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫなどベクターを、ｓｒ３９ＴＫＰＥＴイメージング／自殺遺伝子と併せて利用することができる。この第三世代自己活性化（ＳＩＮ）ベクターの成分は、１）３’自己活性化ロングターミナルリピート（long-term repeats）（ΔＬＴＲ）；２）Ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナル；３）スプライシングされていないベクターＲＮＡの核外輸送を増進するためのＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）；４）ベクターゲノムの核内輸送を助長するためのセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）；５）ヒトｉＮＫＴＴＣＲのα鎖遺伝子（ＴＣＲα）およびβ鎖遺伝子（ＴＣＲβ）の発現カセット、ならびにマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）からの内部プロモーターにより駆動されるＰＥＴ／自殺遺伝子ｓｒ３９ＴＫ（Gschenget al., 2014）である。ｉＮＫＴＴＣＲαおよびＴＣＲβならびにｓｒ３９ＴＫ遺伝子は、それらの最適な共発現を達成するために、すべてコドン最適化され、２Ａ自己切断配列（Ｔ２ＡおよびＰ２Ａ）により連結されている（Gschenget al., 2014）。

ベクターの品質管理に関しては、一連のＱＣアッセイが、ベクター製品が高品質のものであることを保証するために行なわれ得る。ベクターの同一性、ベクターの物理的力価、およびベクターの純度（無菌性、マイコプラズマ、ウイルス夾雑物、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）の試験、エンドトキシン、残留ＤＮＡおよびベンゾナーゼ）などの標準的なアッセイが、ＩＵＶＰＦで実施され、試験成績書（ＣＯＡ）で提出され得る。行なわれ得る追加のＱＣアッセイは、１）形質導入／生物学的力価（段階希釈物を用いてＨＴ２９細胞に形質導入することおよびｄｄＰＣＲを行なうことによる、≧１×１０^６ＴＵ／ｍｌ）、２）ベクタープロウイルス完全性（元のベクタープラスミド配列と同じ、形質導入ＨＴ２９細胞のゲノムＤＮＡのベクターが組み込まれた部分を配列決定することにより）、３）ベクター機能を含む。ベクター機能は、ヒトＰＢＭＣＴ細胞に形質導入することにより測定することができる（Chodon et al., 2014）。ｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子の発現は、ｉＮＫＴＴＣＲに対して特異的な６Ｂ１１で染色することにより、検出することができる（Montoyaet al., 2007）。発現されたｉＮＫＴＴＣＲの機能性は、αＧａｌＣｅｒ刺激に応答してのＩＦＮ－γの産生により分析されることになる（Wataraiet al., 2008）。ｓｒ３９ＴＫ遺伝子の発現および機能性は、ペンシクロビルアップデートアッセイおよびＧＣＶ死滅アッセイにより分析することができる（Gschwenget al., 2014）。ベクターストック（－８０フリーザーで保管された）の安定性をその形質導入力価の測定により３か月ごとに試験することができる。
ＩＸ．細胞の製造および製品製剤化

ｉＮＫＴ細胞を製造するために本開示の実施形態と併用することができる例示的プロセスが、本明細書で提供される。特定の実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、哺乳動物において疾患を標的とし闘う（腫瘍細胞と闘う、を含む）ために「生きている薬物」として機能する肝要な製剤原料である。特定の実施形態では、それらは、遺伝子改変されたドナーＨＳＣのｉｎｖｉｔｒｏでの分化および増幅により生成される。データにより、研究室規模で細胞を産生するための新規の効率的なプロトコールが実証され、特定の実施形態では、細胞は、ＧＭＰ準拠の製造プロセスで「オフザシェルフ」細胞製品として作製される。特定の場合には、産生規模は、患者１０００～１０，０００名が処置されると推定される、バッチ当り１０^１２細胞である。

本開示の実施形態と併用され得るまたは代替法として使用され得る細胞製造プロセスの例が提供される。ステップ１は、血液採取施設でドナーＧ－ＣＳＦ動員ＰＢＳＣを採取するステップであり、この採取は、多くの病院で通例の手順となっている（Deotare et al., 2015）。このプロジェクトのためにＨｅｍａＣａｒｅからロイコパックで新鮮なＰＢＳＣを得ることができる。ＨｅｍａＣａｒｅは、ＩＲＢにより承認された採取プロトコールを有し、ドナーの同意を得ており、臨床試験および商品製造を支援することができる。ステップ２は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを使用してＰＢＳＣからＣＤ３４^＋ＨＳＣを濃縮するステップである。特定の態様では、ＵＣＬＡＧＭＰ施設に置かれたそのようなシステムを使用してこのステップを完了することができ、少なくとも１０^８個のＣＤ３４^＋細胞を得ることができる。ＣＤ３４^－細胞を収集し、保管することもできる（これらの細胞をステップ７でＰＢＭＣとして使用することができる）。

ステップ３は、ＨＳＣ培養およびベクター形質導入を含む。ＣＤ３４^＋細胞を、レトロネクチンをコーティングしたフラスコ内で、１％ＨＡＳ（ＵＳＰ）と増殖因子カクテル（ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンドおよびｔｐｏ；各々５０ｎｇ／ｍｌ）とを補給したＸ－ＶＩＶＯ１５培地中で１２時間、培養し、その後さらに８時間、Ｌｅｎｔｉ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを添加することができる（Gschweng et al., 2014）。形成された約５０コロニーの試料を採取することによりメチルセルロースアッセイで形質導入細胞についてベクター組込みコピー（ＶＣＮ）を測定することができ、ｄｄＰＣＲを使用して細胞当りの平均ベクターコピー数を決定することができる（Noltaet al., 1994）。特定の場合には、この手順が最適化され、＞５０％形質導入が細胞当りＶＣＮ＝１～３で日常的に達成される。

ステップ４は、強力なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多重遺伝子編集方法を用いて、ＨＳＣ内のＢ２ＭとＣＩＩＴＡの両方のゲノム遺伝子座を標的とし、それらの遺伝子発現を妨害するステップ（Ren et al., 2017；Liu et al., 2017）であり、編集されたＨＳＣに由来するｉＮＫＴ細胞は、ＭＨＣ／ＨＬＡ発現を欠くことになり、それによって宿主免疫系による拒絶反応が回避されることになる。初期データは、Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡの電子穿孔による高効率（フロー解析により約７５％）でのＣＤ３４^＋ＨＳＣについてのＢ２Ｍ破壊の成功を実証した。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡダブルノックアウトを、ＲＮＰの混合物（Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡおよびＣａｓ９／ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ（Abrahimiet al., 2015））の電子穿孔により達成することができる。電子穿孔パラメーター、２つのＲＮＰの比、電子穿孔の前の幹細胞培養時間（形質導入後２４、４８または７２時間）、などを変えることにより、このプロセスを最適化し、検証することができ（Gundryet al,. 2016）、ＩＤＴからの高忠実度Ｃａｓ９タンパク質（Slaymaker et al., 2016；Tsai and Joung, 2016）を使用して、「オフターゲット」効果を最小限に抑えることができる。例示的な評価パラメーターとしては、生存率；Ｔ７Ｅ１アッセイならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ部位を標的とする次世代配列決定（ＮＧＳ）により測定される欠失（インデル）頻度（狙い通りの効率）；フローサイトメトリーによるＭＨＣ発現；およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにより測定される編集されたＨＳＣの造血機能を挙げることができる。

ステップ５は、改変されたＣＤ３４^＋ＨＳＣをｉＮＫＴ細胞へとｉｎｖｉｔｒｏで（例えば、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養によって）分化させるステップである。初期研究は、ｉＮＫＴＴＣＲを発現するように操作されたＨＳＣから機能的なｉＮＫＴ細胞を効率的に生成することができることを示した。このデータを踏まえて、１０^８個の改変されたＣＤ３４^＋ＨＳＣから１０^１０個のｉＮＫＴ細胞を産生するための８週間のＧＭＰ準拠ＡＴＯ培養プロセスを試験し、検証することができる。ＡＴＯは、滴下形式の場合、ＨＳＣ（５×１０^４個）と照射された（８０Ｇｙ）ＭＳ５－ｈＤＬＬ１間質細胞（１０^６個）の混合物を含有する細胞スラリー（５μｌ）を０．４μｍＭｉｌｌｉｃｅｌｌウェル間インサート上にピペッティングし、その後、１ｍｌのＲＢ２７培地を含有する６ウェルプレートにインサートを配置することを含み、８週間、４日ごとに培地を交換することができる。１インサート当り３ＡＴＯと考えると、バッチ生産ごとにおおよそ１７０の６ウェルプレートを用いることができる。バイオセーフティーキャビネット内に配置された自動化されたプログラム可能なピペッティング／分注システム（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆからのｅｐＭｏｎｔｉｏｎ５０７０ｆ）をＡＴＯ液滴の播種および培地交換に使用することができ、ラウンドごとに１７０プレートを完了するために２時間の操作が必要とされ得る。ＡＴＯ培養の完了時に、ｉＮＫＴ細胞を回収し、特徴付けることができる。特定の実施形態（specifici embodiments）では、ＡＴＯの成分は、ヒトＤＬＬ１を発現するためのレンチウイルス形質導入に続いての細胞選別により構築される、ＭＳ５－ｈＤＬＬ１間質細胞系である。ある特定のＧＭＰプロセスのための調製では、このポリクローナル細胞集団を用いて単一細胞クローン選択プロセスを行なって、いくつかのクローンＭＳ５－ｈＤＬＬ１細胞系を樹立することができ、これらから効率的なもの（ＡＴＯ培養により評価して）を選択し、それを使用してマスターセルバンクを生成することができる。このようなバンクを使用して、将来の臨床グレードＡＴＯ培養のための照射された間質細胞を供給することができる。

ステップ６は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを使用してｉＮＫＴ細胞を精製するステップである。このステップの精製は、ＭＨＣＩ^＋およびＭＨＣＩＩ^＋細胞を枯渇させ、ｉＮＫＴ^＋細胞を濃縮するためのものである。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ビオチンビーズを、市販のビオチン化抗ＭＨＣＩ（クローンＷ６／３２、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）、抗Ｂ２Ｍ（クローン２Ｍ２）および抗ＭＨＣＩＩ（クローンＴｕ３９、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）、ならびに抗ＴＣＲＶα２４－Ｊα１８（クローン６Ｂ１１）とともにインキュベートすることにより、抗ＭＨＣＩおよび抗ＭＨＣＩＩビーズを調製することができる。６Ｂ１１が直接コーティングされたマイクロビーズもＭｉｌｔｅｎｙｉから入手可能であり、抗ｉＮＫＴビーズは、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃから入手可能である。回収されたｉＮＫＴ細胞に抗ＭＨＣビーズ混合物により標識し、それらを２回洗浄することができ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ枯渇プログラムを使用してＭＨＣＩ^＋および／またはＭＨＣＩＩ^＋細胞を枯渇させることができ、必要に応じて、この枯渇ステップを反復して、残留ＭＨＣ^＋細胞をさらに除去することができる。その後、標準的な抗ｉＮＫＴビーズおよびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ濃縮プログラムを使用して、ｉＮＫＴ細胞をさらに精製することができる。例えば、フローサイトメトリーにより細胞の純度を測定することができる。

ステップ７は、精製されたｉＮＫＴ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで増幅するステップである。既に検証された、ＰＢＭＣのフィーダーに基づくｉｎｖｉｔｒｏ増幅プロトコール（Yamasaki et al., 2011；Heczey et al., 2014）を使用して、１０^１０個の細胞から始めて１０^１２個のｉＮＫＴ細胞に増幅することができる。この細胞増幅についてのＧ－Ｒｅｘに基づくバイオプロセスを評価することができる。Ｇ－Ｒｅｘは、より効率的なガス交換を可能にするガス透過性膜を底部に備えている細胞成長フラスコであり、Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍフラスコには１０日で１００倍の細胞増幅を支持する能力がある（Veraet al., 2010；Bajgain et al., 2014；Jin et al., 2012）。ステップ１からの保管されたＣＤ３４^－細胞（フィーダー細胞として使用される）を解凍し、これらの細胞にαＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）をパルス投与し、照射する（４０Ｇｙ）ことができる。ｉＮＫＴ細胞を照射されたフィーダー細胞と混合し（比率１：４）、Ｇ－Ｒｅｘフラスコに播種し（各々１．２５×１０^８個のｉＮＫＴ、８０個のフラスコ）、２週間、増幅させることができる。ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ）が２～３日おきに添加されることになり、培地交換が７日目に行なわれることになる。すべての培地操作を蠕動ポンプにより達成することができる。この増幅プロセスは、同様のＰＢＭＣのフィーダーに基づく増幅手順（高速増幅プロセスと呼ばれる）が多くの臨床試験で治療用Ｔ細胞を産生するために既に利用されている（Dudleyet al., 2008；Rosenberg et al., 2008）ので、ＧＭＰ準拠プロセスである。

ステップ８は、ステップ７から回収されたｉＮＫＴ細胞（活性薬物成分）を直接注入用の細胞懸濁液に製剤化するステップである。少なくとも３ラウンドの徹底的な洗浄後、ステップ７からの細胞を計数し、プラズマライトＡ注射液（３１．２５％ｖ／ｖ）と、デキストロースと塩化ナトリウムの注射液（３１．２５％ｖ／ｖ）と、ヒトアルブミン（２０％ｖ／ｖ）と、デキストロース注射液でのデキストラン４０（１０％、ｖ／ｖ）と、ＣｒｙｏｓｅｒｖＤＭＳＯ（７．５％、ｖ／ｖ）とで構成されている注入／低温保管適合性溶液に懸濁させる（１０^７～１０^８細胞／ｍｌ）ことができ、この溶液は、Ｎｏｖａｒｔｉｓからの承認されたＴ細胞製品であるチサゲンレクルユーセルを製剤化するために使用されている（Grupp et al., 2013）。ＦＤＡ承認の凍結バッグ（例えば、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃからのＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグ）に充填し次第、製品を速度制御フリーザーで凍結し、液体窒素フリーザー内に保管することができる。生存率および回収率を測定することにより検証および／または最適化研究を行なって、この製剤化がｉＮＫＴ細胞製品に適切であることを保証することができる。

高品質生産を保証するために、様々なＩＰＣアッセイ（例えば、細胞計数、生存率、無菌性、マイコプラズマ、同一性、純度、ＶＣＮなど）を提案されたバイオプロセスに組み込むことができる。試験は、以下を含む：１）外観（色、不透明度）、２）細胞生存率および計数値、３）ｉＮＫＴＴＣＲについてのｑＰＣＲによる同一性およびＶＣＮ、４）ｉＮＫＴ陽性およびＢ２Ｍ陰性による純度、５）エンドトキシン、６）無菌性、７）マイコプラズマ、８）αＧａｌＣｅｒ刺激に応答してのＩＦＮ－γ放出により測定される力価、９）ＲＣＬ（複製可能なレンチウイルス）（Cornetta et al, 2011）。これらのアッセイの大部分は、標準的な生物学的アッセイ、またはこの製品に特有の特異的アッセイのどちらかである。製品安定性試験は、ＬＮ保管バッグを定期的に解凍し、それらの細胞生存率、純度、回収率、力価（ＩＦＮ－γ放出）および無菌性を測定することにより、行なうことができる。特定の実施形態では、製品は、少なくとも１年間、安定している。
Ｘ．開始細胞源

多能性幹細胞または造血幹もしくは始原細胞などの開始細胞は、選択されたＴ細胞系列に沿って分化させるために、ある特定の組成物または方法で使用され得る。間質細胞は、幹または始原細胞と共培養するために使用され得る。一部の実施形態では、間質細胞は、幹または始原細胞と共培養のために使用されない。
Ｂ．間質細胞

間質細胞は、任意の臓器の、例えば、骨髄、胸腺、子宮粘膜（子宮内膜）、前立腺および卵巣における、結合組織細胞である。間質細胞は、その臓器の実質細胞の機能を支持する細胞である。最もよく見られる型の間質細胞の中には、線維芽細胞（間葉系間質細胞／ＭＳＣとしても公知）および周皮細胞もある。

間質細胞と腫瘍細胞との相互作用が、がんの成長および進行において大きな役割を果すことは公知である。加えて、サイトカインネットワーク（例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＬＩＦ）を局所的に調節することにより、骨髄間質細胞は、ヒト造血および炎症プロセスに関与することが記載されている。

骨髄、胸腺および他の造血臓器における間質細胞は、細胞－細胞リガンド－受容体相互作用によって、ならびにサイトカインおよびケモカインを含む可溶性因子の放出によって、造血細胞および免疫細胞の発生を調節する。これらの組織からの間質細胞は、幹細胞維持、系列特異化およびコミットメントならびにエフェクター細胞型への分化を調節する、ニッチを形成する。

間質は、非悪性宿主細胞で構成されている。間質細胞は、細胞外マトリックスも提供し、この細胞外マトリックス上で組織特異的細胞型および一部の場合には腫瘍が成長し得る。
Ｃ．造血幹および始原細胞

造血幹および始原細胞の有意な医療的潜在能力のため、胚性幹細胞からの造血始原細胞の分化のための方法を改善しようとして相当な研究が行なわれている。ヒト成人では、骨髄に主として存在する造血幹細胞が、血液系のすべての細胞に分化する造血（ＣＤ３４^＋）始原細胞の異種集団を産生する。成人のヒトでは、造血始原細胞が増殖し、分化し、その結果、毎日、何千億もの成熟血液細胞が生成されることになる。造血始原細胞は、臍帯血中にも存在する。ｉｎｖｉｔｒｏで、ヒト胚性幹細胞を造血始原細胞に分化させることができる。造血始原細胞を下記で説明されるように末梢血の試料から増幅または濃縮することもできる。造血細胞は、ヒトに由来するものであることもあり、マウスに由来するものであることもあり、または任意の他の哺乳動物種のものであることもある。

造血始原細胞の単離は、セルソーター；抗体コーティング磁気ビーズが充填されたカラムを使用する磁気分離；親和性クロマトグラフィー；補体および細胞毒素を含むがこれらに限定されない、モノクローナル抗体に結合されたもしくはモノクローナル抗体と併用される細胞傷害剤；ならびに固体マトリックス、例えばプレート、に結合された抗体での「パニング」；または任意の他の従来の技法を含む、任意の選択方法を含む。

分離または単離技法の使用は、物理的特性の差に基づくもの（密度勾配遠心分離および向流遠心水簸）、細胞表面特性の差に基づくもの（レクチンおよび抗体親和性）、およびウイルス染色特性の差に基づくもの（ミトコンドリア結合色素ｒｈｏ１２３およびＤＮＡ結合色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を含むが、これらに限定されない。正確な分離をもたらす技法としては、様々な複雑度、例えば、複数のカラーチャネル、低角および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、を有することができる、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）またはＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別）が挙げられるが、これらに限定されない。

前述の技法または細胞型純度を利用可能にするために使用される技法（例えば、フローサイトメトリー）で利用される抗体を、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、薬物またはハプテンを含むがこれらに限定されない、同定可能な作用因子にコンジュゲートすることができる。抗体にコンジュゲートすることができる酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ－ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。抗体にコンジュゲートすることができる蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。抗体にコンジュゲートすることができるさらなる蛍光色素については、Haugland, Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals (1992-1994)を参照されたい。抗体にコンジュゲートすることができる金属化合物としては、フェリチン、コロイド金、および特にコロイド状超常磁性ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。抗体にコンジュゲートすることができるハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサゾロン（oxazalone）およびニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。抗体にコンジュゲートすることまたは組み込むことができる放射性化合物は、当技術分野において公知であり、そのような放射性化合物としては、テクネチウム９９ｍ（９９ＴＣ）、^１２５Ｉ、ならびに^１４Ｃ、^３Ｈおよび^３５Ｓを含むがこれらに限定されない任意の放射性核種を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。

正確な分離を可能にする、正の選択のための他の技法、例えば、親和性カラムおよびこれらに類するもが利用されることもある。この方法は、非標的細胞集団の残留量を、約２０％未満、好ましくは約５％未満にするように除去することを可能にするはずである。

細胞を光散乱特性に基づいて選択することができ、様々な細胞表面抗原のそれらの発現に基づいて選択することもできる。精製された幹細胞は、ＦＡＣＳ解析によって、低い側方散乱および低い乃至は中等度の前方散乱プロファイルを有する。サイトスピン分離は、成熟リンパ系細胞と成熟顆粒球の間のサイズを有する幹細胞の濃縮を示す。

培養の前に接種集団を、例えば、Sutherland et al. (1992)の方法および米国特許第４，７１４，６８０号に記載されている方法を使用して、ＣＤ３４^＋細胞について濃縮することも可能である。例えば、細胞は、系列特異的マーカーを発現する細胞を除去するために負の選択に付される。例示的な実施形態では、細胞集団は、非ＣＤ３４^＋造血細胞および／または特定の造血細胞サブセットの枯渇のために負の選択に付されることもある。負の選択は、Ｔ細胞マーカー、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４およびＣＤ８；Ｂ細胞マーカー、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９およびＣＤ２０；単球マーカーＣＤ１４；ＮＫ細胞マーカーＣＤ２、ＣＤ１６およびＣＤ５６；または任意の系列特異的マーカーを含む、様々な分子の細胞表面発現に基づいて行なうことができる。負の選択は、他の細胞型の分離に使用され得る、抗体（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５ａ）のカクテルなどの様々な分子の細胞表面発現に基づいて、例えば、ＭＡＣＳまたはカラム分離によって、行なうことができる。

本明細書で使用される場合、系列陰性（ＬＩＮ^－）は、系列がコミットされた細胞に関連する少なくとも１つのマーカー、例えば、Ｔ細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ２、３、４および８）、Ｂ細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ１０、１９および２０）、骨髄系細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ１４、１５、１６および３３）、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ２、１６および５６）、ＲＢＣに関連するマーカー（例えば、グリコホリンＡ）、巨核球に関連するマーカー（ＣＤ４１）、マスト細胞、好酸球もしくは好塩基球に関連するマーカー、または他のマーカー、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７１、およびＨＬＡ－ＤＲ、を欠いている細胞を指す。好ましくは、系列特異的マーカーは、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ７１のうちの少なくとも１つを含むが、これらに限定されない。より好ましくは、ＬＩＮ^－は、少なくともＣＤ１４およびＣＤ１５を含むことになる。例えばｃ－ｋｉｔ^＋またはＴｈｙ－１^＋についての、正の選択により、さらなる精製を達成することができる。当技術分野において公知の方法による、ミトコンドリア結合色素ローダミン１２３の使用、およびローダミン^＋細胞についての選択により、さらなる濃縮を達成することができる。ＣＤ３４^＋である、好ましくはＣＤ３４^＋ＬＩＮ^－である、最も好ましくはＣＤ３４^＋Ｔｈｙ－１^＋ＬＩＮ^－である細胞の選択的単離により、高度に濃縮された組成物を得ることができる。幹細胞が高度に濃縮された集団およびそれらを得るための方法は、当業者に周知であり、例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９７６０、同ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５７４および同ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０５０１に記載されている方法を参照されたい。

様々な技法を利用して、特化した系列の細胞を最初に除去することにより細胞を分離することができる。モノクローナル抗体は、特定の細胞系列および／または分化段階に関連するマーカーの同定に特に有用である。これらの抗体を固体支持体に結合させて粗分離を可能にすることができる。利用される分離技法は、収集される画分の生存率の保持を最大化するべきである。有効性が異なる様々な技法を利用して「相対的粗」分離を達成するこができる。そのような分離は、保持される細胞集団とともに残存する望ましくない細胞が、存在する全細胞の最大１０％、通常は約５％以下、好ましくは約１％以下となる、分離である。利用される特定の技法は、分離の効率、付随する細胞傷害性、実行の容易さおよび速度、ならびに高性能機器および／または高度な技術的スキルの必要性に依存することになる。

始原細胞の選択を細胞に対して特異的なマーカーだけで達成する必要はない。負の選択と正の選択の組合せを使用することにより、濃縮された細胞集団を得ることができる。
Ｄ．血液細胞源

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、通常は骨髄に存在するが、ＨＳＣを血液に強制的に送り込むことができ、これは、末梢血中の多数のＨＳＣを回収するために臨床的に使用される動員と呼ばれるプロセスである。一般に好まれる動員剤の一例は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）である。

末梢血中の循環しているＣＤ３４^＋造血幹細胞または始原細胞を、非摂動状態で、あるいはＧ－ＣＳＦのような造血成長因子の外部からの投与後の動員の後に、アフェレーシス法により収集することができる。動員後に収集される幹または始原細胞の数は、非摂動状態でアフェレーシス後に得られる数より多い。本発明の特定の態様では、細胞集団の供給源は、ｉｎｖｉｖｏで造血幹細胞を濃縮する必要も始原細胞を濃縮する必要もないので、細胞が外部から適用される因子による動員を受けていない対象である。

本明細書に記載される方法で使用するための細胞の集団は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、齧歯動物細胞（例えば、マウスまたはラット）、ウシ細胞、ヒツジ属の動物の細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、およびネコ細胞、またはこれらの混合物であり得る。非ヒト霊長類細胞は、アカゲザル細胞を含む。細胞を動物、例えばヒト患者から得てもよく、または細胞は、細胞系からのものであってもよい。細胞が動物から得られた場合、それらの細胞を、そのまま、例えば分離されていない細胞（すなわち、混合集団）として、使用することができ、それらの細胞は、最初に培養で、例えば形質転換により、樹立されたものであることがあり、またはそれらの細胞は、予備的な精製方法に付されたものであることもある。例えば、細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づいて正もしくは負の選択により操作されたもの、ｉｎｖｉｔｒｏもしくはｉｎｖｉｖｏで１つもしくは複数の抗原で刺激されたもの、ｉｎｖｉｔｒｏもしくはｉｎｖｉｖｏで１つもしくは複数の生物学的修飾物質で処理されたもの、またはこれらのいずれかもしくはすべての組合せであり得る。

細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、混合集団を含有する全血またはその画分、脾細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤リンパ球、白血球アフェレーシスにより得られた細胞、生検組織、リンパ節、例えば腫瘍から排出するリンパ節を含む。好適なドナーとしては、免疫されたドナー、免疫されていない（ナイーブ）ドナー、処置されたまたは未処置のドナーが挙げられる。「処置された」ドナーは、１つまたは複数の生物学的修飾物質に曝露されたドナーである。「未処置の」ドナーは、１つまたは複数の生物学的修飾物質に曝露されていないドナーである。

例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、当技術分野において公知の方法に従って記載の通りに得ることができる。そのような方法の例は、Kim et al. (1992)；Biswas et al. (1990)；Biswas et al. (1991)により論じられている。

細胞の集団から前駆細胞を得る方法も、当技術分野において周知である。ｈＳＣＦ、ｈＦＬＴ３および／もしくはＩＬ－３などの、様々なサイトカインを使用して、前駆細胞を増幅することができ（Akkina et al., 1996）、またはＭＡＣＳもしくはＦＡＣＳを使用してＣＤ３４^＋細胞を濃縮することができる。上述のように、負の選択技法を使用して、ＣＤ３４^＋細胞を濃縮することもできる。

対象から細胞試料を得ること、次いでそれを所望の細胞型について濃縮することも、可能である。例えば、ＰＢＭＣおよび／またはＣＤ３４^＋造血細胞を、本明細書中で説明されるように単離することができる。所望の細胞型の細胞表面のエピトープに結合する抗体を用いる単離および／または活性化などの、様々な技法を使用して、細胞を他の細胞から単離することもできる。使用することができる別の方法としては、受容体会合による細胞の活性化を用いずに、細胞表面マーカーに対する抗体を使用して特定の細胞型を選択的に濃縮する、負の選択が挙げられる。

骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、頸骨、脊椎、肋骨または他の髄腔から得ることができる。骨髄細胞を患者から採取し、様々な分離および洗浄手順によって単離することができる。骨髄細胞の単離のための例示的な手順は、以下のステップを含む：ａ）３回の分画で骨髄懸濁液を遠心分離し、中間画分、すなわちバフィーコートを収集するステップ、ｂ）ステップ（ａ）からのバフィーコート画分を分離液、通常はＦｉｃｏｌｌ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓＡＢの商標）中でもう１回、遠心分離し、骨髄細胞を含有する中間画分を回収するステップ、およびｃ）再輸注可能な骨髄細胞の回収のためにステップ（ｂ）からの収集画分を洗浄するステップ。
Ｅ．多能性幹細胞

造血幹および始原細胞であり得る、本明細書に記載される組成物および方法に好適な細胞を、ｉｎｖｉｔｒｏでの多能性幹細胞の分化から調製することもできる。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用される細胞は、ＡＴＯに直接播種される多能性幹細胞（胚性幹細胞または人工多能性幹細胞）である。さらなる実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物で使用される細胞は、これらに限定されないが中胚葉始原細胞、血液－内皮始原細胞、または造血始原細胞などの、ＰＳＣの誘導体または子孫である。

用語「多能性幹細胞」は、３つの胚葉、つまり、内胚葉、中胚葉および外胚葉、のすべての細胞を生じさせることができる細胞を指す。理論上は、多能性幹細胞は、体のいずれの細胞にも分化することができるが、多能性の実験的分化は、各胚葉のいくつかの細胞型への多能性細胞の分化に通常は基づく。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞である。他の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞のリプログラミングにより誘導された人工多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞核移植により誘導され胚性幹細胞である。

胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、次いで、非成長細胞のフィーダー層上で内部塊の細胞を培養することにより、単離することができる。適切な条件下で、増殖する未分化ＥＳ細胞のコロニーが産生される。これらのコロニーを除去し、個々の細胞に解離させ、次いで、新鮮なフィーダー層上に再播種することができる。再播種された細胞は、増殖し続けることができ、その結果、未分化ＥＳ細胞の新しいコロニーが生じる。次いで、これらの新しいコロニーを除去し、解離させ、再び再播種し、成長させることができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養する」または「継代する」このプロセスを何度も反復して、未分化ＥＳ細胞を含有する細胞系を産生することができる（米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号、同第７，０２９，９１３号）。「初代細胞培養物」は、胚盤胞の内部細胞塊などの組織から直接得られる細胞の培養物である。「継代培養物」は、初代細胞培養物に由来する任意の培養物である。

マウスＥＳ細胞を得るための方法は、周知である。１つの方法では、マウスの１２９株からの着床前の胚盤胞が、栄養外胚葉を除去するためにマウス抗血清で処理され、内部細胞塊が、ウシ胎仔血清を含有する培地中の化学的に不活化されたマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養される。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーが、ウシ胎仔血清の存在下、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上で継代培養されてＥＳ細胞の集団が産生される。一部の方法では、サイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を血清含有培養培地に添加することにより、フィーダー層の非存在下でマウスＥＳ細胞を成長させることができる（Smith, 2000）。他の方法では、マウスＥＳ細胞を、骨形成タンパク質およびＬＩＦの存在下、無血清培地中で成長させることができる（Yinget al., 2003）。

ヒトＥＳ細胞は、以前に記載された方法（Thomson et al., 1995；Thomsonet al., 1998；Thomson and Marshall, 1998；Reubinoff et al, 2000）を使用して、胚盤胞から得ることができる。１つの方法では、５日目のヒト胚盤胞がウサギ抗ヒト脾細胞抗血清に曝露され、次いで、モルモット補体の１：５希釈物に曝露されて、栄養外胚葉細胞が溶解される。溶解された栄養外胚葉細胞を無傷の内部細胞塊から除去した後、内部細胞塊が、ガンマ線で不活性化されたマウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上で、ウシ胎仔血清の存在下で培養される。９～１５日後、内部細胞塊に由来する細胞の凝集塊を、化学的に（すなわち、トリプシンに曝露して）または機械的に解離させ、ウシ胎仔血清とマウス胚性線維芽細胞のフィーダー層とを含有する新鮮な培地に再播種することができる。さらなる増殖時に、未分化形態を有するコロニーがマイクロピペットにより選択され、機械的に解離されて凝集塊になり、それらが再播種される（米国特許第６，８３３，２６９号を参照されたい）。ＥＳ様形態は、核の細胞質に対する比が見かけ上高い緻密なコロニー、および顕著な核小体として、特徴付けられる。結果として生じるＥＳ細胞を、短時間のトリプシン処理により、またはマイクロピペットによる個々のコロニーの選択により、日常的に継代させることができる。一部の方法では、血清を用いずに、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下、線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することにより、ヒトＥＳ細胞を成長させることができる（Amitet al., 2000）。他の方法では、フィーダー細胞層を用いずに、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「馴化」培地の存在下、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上で細胞を培養することにより、ヒトＥＳ細胞を成長させることができる（Xuet al., 2001）。この培地は、線維芽細胞との共培養により事前に順化されたものである。

アカゲザルおよびコモンマーモセットＥＳ細胞を単離するための方法も公知である（Thomson,and Marshall, 1998；Thomson et al., 1995；Thomson and Odorico, 2000）。

もう１つのＥＳ細胞源は、樹立ＥＳ細胞系である。様々なマウス細胞系およびヒトＥＳ細胞系が公知であり、それらの成長および繁殖のための条件も規定されている。例えば、マウスＣＧＲ８細胞系が、マウス株１２９の胚の内部細胞塊から樹立されており、ＣＧＲ８細胞の培養物を、フィーダー層を用いずに、ＬＩＦの存在下で成長させることができる。さらなる例として、ヒトＥＳ細胞系Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３およびＨ１４が、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらにより樹立された。加えて、Ｈ９系のサブクローンＨ９．１およびＨ９．２が開発された。

ＥＳ細胞源は、胚盤胞であることもあり、胚盤胞の内部細胞塊を培養することから得られる細胞であることもあり、または樹立された細胞株の培養から得られる細胞であることもある。したがって、本明細書で使用される場合、用語「ＥＳ細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊を指すこともあり、内部細胞塊の培養から得られるＥＳ細胞を指すこともあり、ＥＳ細胞系の培養から得られるＥＳ細胞を指すこともある。

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ＥＳ細胞の特徴を有する、しかし分化した体細胞のリプログラミングにより得られる、細胞である。人工多能性幹細胞は、様々な方法により得られている。１つの方法では、レトロウイルス形質導入を使用して、成人ヒト皮膚線維芽細胞に、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４がトランスフェクトされる（Takahashi et al., 2007）。トランスフェクトされた細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が補給された培地中のＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを産生するマウス細胞線維芽細胞系）上に播種される。おおよそ２５日後、ヒトＥＳ細胞コロニーに似ているコロニーが培養物中に出現する。これらのＥＳ細胞様コロニーが採取され、ｂＦＧＦの存在下、フィーダー細胞上で増幅される。

細胞の特徴に基づいて、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は、人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞と形態学的に類似しており、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、ヒトＥＳ細胞の分化をもたらすことが公知である条件下で成長すると、人工多能性幹細胞は、それ相応に分化する。例えば、人工多能性幹細胞は、ニューロン構造およびニューロンマーカーを有する細胞に分化することができる。

別の方法では、ヒト胎児または新生児線維芽細胞に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８という４つの遺伝子が、レンチウイルス形質導入を使用してトランスフェクトされる（Yu et al., 2007）。感染後１２～２０日目に、ヒトＥＳ細胞形態を有するコロニーが、目に見えるようになる。これらのコロニーが採取され、増幅される。コロニーを構成する人工多能性幹細胞は、形態学的にヒトＥＳ細胞に類似しており、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、マウスに注射されると神経組織、軟骨および腸上皮を有する奇形腫を形成する。

マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法もまた、公知である（Takahashiand Yamanaka, 2006）。ｉＰＳ細胞の誘導は、典型的には、Ｓｏｘファミリーからの少なくとも１メンバーおよびＯｃｔファミリーからの少なくとも１メンバーの発現、またはこれらのメンバーへの曝露を必要とする。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞同一性を指定する転写調節の階層の中核をなすと考えられる。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ－１、Ｓｏｘ－２、Ｓｏｘ－３、Ｓｏｘ－１５、またはＳｏｘ－１８であり得、Ｏｃｔは、Ｏｃｔ－４であり得る。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４もしくはｃ－Ｍｙｃのような、さらなる因子は、リプログラミング効率を上昇させることができ、リプログラミング因子の特定のセットは、Ｓｏｘ－２、Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇおよび必要に応じてＬｉｎ－２８を含むセット、またはＳｏｘ－２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆおよび必要に応じてｃ－Ｍｙｃを含むセットであり得る。

ＥＳ細胞のようなｉＰＳ細胞は、特徴的な抗原を有し、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４に対する抗体（ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａＢａｎｋ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｌｄＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＢｅｔｈｅｓｄａＭｄ．）、ならびにＴＲＡ－１－６０およびＴＲＡ－１－８１（Andrews et al., 1987）を使用して、免疫組織化学的検査またはフローサイトメトリーによりこれらの抗原を同定または確認することができる。胚性幹細胞の多能性は、おおよそ０．５～１０×１０^６個の細胞を８～１２週齢オスＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に注射することにより確認することができる。３つの胚葉の各々の少なくとも１つの細胞型を明示する奇形腫が発生する。
ＸＩ．細胞を使用する方法

本開示のｉＮＫＴ細胞は、産生後、直接利用されてもよく、または利用されなくてもよい。一部の場合では、それらは、後の目的のために保管される。任意の事象では、それらは、哺乳動物対象（ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど）、例えば、患者のための治療的または予防的適用において利用されてもよい。患者は、同種異系細胞療法を含む任意の種類の病状のための細胞療法を必要としていてもよい。

患者を本開示の治療有効量のｉＮＫＴ細胞で処置する方法は、細胞またはそのクローン集団を患者に投与するステップを含む。細胞または細胞集団は、患者に対して同種異系であってもよい。患者は、特定の実施形態では、細胞または細胞集団の枯渇の徴候を示さない。患者は、がん、および／または炎症を伴う疾患もしくは状態を有していてもよく、あるいは有していなくてもよい。患者ががんを有する具体的な実施形態では、がん患者の腫瘍細胞は、細胞または細胞集団の患者への投与後に死滅する。患者が炎症を有する具体的な場合では、炎症は、細胞または細胞集団の患者への投与後に軽減される。処置の方法の具体的な実施形態では、方法は、患者に、自殺遺伝子産物を起動させる化合物を投与するステップをさらに含む。

がんを有する患者のために、患者に注入されたら、この細胞製品が、腫瘍細胞を標的とし、根絶するための複数の機構を用い得ることが予想される。注入された細胞は、細胞傷害性によりＣＤ１ｄ^＋腫瘍細胞を直接認識および死滅させることができる。それらは、ＩＦＮ－γなどのサイトカインを分泌して、ＨＬＡ陰性の腫瘍細胞を死滅させるＮＫ細胞を活性化することができ、次に細胞傷害性Ｔ細胞を刺激してＨＬＡ陽性の腫瘍細胞を死滅させるＤＣを活性化することもできる。したがって、本発明者らは、がん療法のためのこの細胞製品の薬理学的有効性を実証するための一連のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究を計画する。

ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍抗原およびＭＨＣ拘束性なしの広い範囲のがんを標的にすることができるので、オフザシェルフｉＮＫＴ細胞製品は、任意のタイプのがんおよびがん患者の大集団を処置するための一般的ながん免疫療法として有用である。具体的な場合では、本療法は、例えば、複数のタイプの固形腫瘍（黒色腫、結腸がん、肺がん、乳がんおよび頭頸部がん）および血液がん（白血病、多発性骨髄腫および骨髄異形成症候群）を含む、ｉＮＫＴ細胞調節に対する対象であることが臨床的に示されているがんを有する患者のために有用である。

上記に開示された方法のいずれかの一部の実施形態では、対象は、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）もしくは移植片拒絶を有しているか、またはそれらを有するリスクがある。対象は、そのような疾患と診断されている対象、または遺伝もしくは家族歴の分析に基づいてそのような疾患に対する素因を有すると決定されている対象であってもよい。対象はまた、移植の準備中であるか、またはそれを受けた対象であってもよい。一部の実施形態では、方法は、自己免疫疾患、ＧＶＨＤまたは移植片拒絶を処置するためである。

本細胞療法で処置される個体は、ｉＮＫＴ細胞療法を受ける前に、特定の病状について処置されていてもよく、または処置されてなくてもよい。個体ががんを有する場合では、がんは、原発性、転移性、治療に対する抵抗性などであってもよい。患者は、従来の処置選択肢を尽くしている。

特定の実施形態では、細胞は、１用量あたり１０^７～１０^９個の細胞で患者に提供される。具体的な実施形態では、投薬レジメンは、リンパ球除去の前処置後の同種異系ｉＮＫＴ細胞の単一用量である。細胞は、例えば、フルダラビンおよびシクロホスファミドによるリンパ球枯渇の前処置後、静脈内投与されてもよい。

ｉｎｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性がその後のｉｎｖｉｖｏ治療の場合のために特徴付けられる場合では、ｉｎｖｉｖｏの薬理学的応答は、ｉＮＫＴ細胞の増大する用量（１×１０^６、５×１０^６、１０×１０^６個）で腫瘍担持ＮＳＧマウスを処置することによって測定されてもよく（群あたりｎ＝８）；ＰＢＳによる処置を対照として含めてもよい。２つの腫瘍モデルを例として利用し得る。Ａ３７５ＣＤ１ｄ（１×１０^６個ｓ．ｃ．）を固形腫瘍モデルとして使用し得、ＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ（５×１０^６個ｉ．ｖ．）を血液系悪性腫瘍モデルとして使用し得る。腫瘍成長は、サイズ（Ａ３７５．ＣＤ１ｄ）または生物発光イメージング（ＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ）のいずれかを測定することによってモニターすることができる。抗腫瘍免疫応答は、ＰＥＴイメージング、定期的な出血、およびエンドポイントでの腫瘍回収とそれに続くフローサイトメトリーおよびｑＰＣＲによって測定することができる。ｉＮＫＴ処置に応答した腫瘍成長の阻害は、ｉＮＫＴ細胞療法の治療有効性を示し得る。腫瘍阻害とｉＮＫＴ用量との相関は、ｉＮＫＴ細胞の治療的役割を確認することができ、ヒト療法のための有効な治療域を示すことができる。腫瘍に応答するｉＮＫＴ細胞の検出は、ｉｎｖｉｖｏでのこれらの細胞の薬理学的抗腫瘍活性を実証することができる。

方法は、病状について陽性と試験された個体、病状の１つもしくは複数の症状を有する個体、またはそのような状態を発生するリスクがあると考えられる個体に関して用いられ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、本明細書に列挙されるか、および／もしくは当技術分野において公知の障害の炎症または自己免疫要素を処置するために使用される。

一部の実施形態では、方法は、再発性／難治性の多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者のためである。一部の実施形態では、患者は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８またはそれよりも多くのＭＭのための過去の処置を受けている。過去の処置は、本明細書に記載の処置または治療を含み得る。一部の実施形態では、過去の処置は、プロテアソーム阻害剤、免疫調節剤および／または抗ＣＤ３８抗体のうちの１つもしくは複数を含む。プロテアソーム阻害剤としては、例えば、ボルテゾミブまたはカーフィルゾミブが挙げられる。免疫調節剤としては、例えば、レナリドマイドまたはポマリドマイドが挙げられる。一部の実施形態では、患者は、本開示の現在の組成物および細胞の投与の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０日以内、または１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０時間以内に過去の治療を受けている。一部の実施形態では、患者は、悪性細胞または悪性形質細胞の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３９もしくは３０％がＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を発現する患者である。一部の実施形態では、患者は、過去に自己ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲＴ細胞療法を受けており、過去の処置が有効でなかったか、または過去の処置が毒性が高すぎると考えられたかのいずれかの理由で、過去の処置が失敗している患者である。一部の実施形態では、患者は、ＢＣＭＡ＋悪性細胞を有すると決定されている患者である。一部の実施形態では、患者は、ＭＭの再発した難治性段階にあるＢＣＭＡ＋悪性細胞を有すると決定されている患者である。一部の実施形態では、方法は、白血病を有する患者のためである。一部の実施形態では、患者は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８またはそれよりも多くの白血病のための過去の処置を受けている。一部の実施形態では、患者は、悪性細胞の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３９もしくは３０％がＣＤ１９を発現する（すなわちＣＤ１９＋である）患者である。一部の実施形態では、患者は、過去に自己ＣＤ１９標的化ＣＡＲＴ細胞療法を受けており、過去の処置が有効でなかったか、または過去の処置が毒性が高すぎると考えられたかのいずれかの理由で、過去の処置が失敗している患者である。一部の実施形態では、患者は、ＣＤ１９＋悪性細胞を有すると決定されている患者である。

一部の実施形態では、方法は、がんの処置のため、もしくはがんを有する人々への投与のための本明細書に記載の細胞または組成物の投与に関する。一部の実施形態では、がんは多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんはＢ細胞がんである。一部の実施形態では、がんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織のリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（慢性リンパ球性白血病、ＣＬＬとしても公知）、マントル細胞リンパ腫、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、中枢神経系リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫または大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。一部の実施形態では、がんは血液がんを含む。一部の実施形態では、血液がんは、骨髄腫、白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性新生物、リンパ性新生物、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄性白血病、ＢＣＲ－ＡＢＬ１陽性の慢性好中球性白血病、真性多血症、原発性骨髄線維症、本態性血小板血症、慢性好酸球性白血病、ＮＯＳ、骨髄増幅性新生物、皮膚肥満細胞症、無痛性全身性肥満細胞症、血液学的新生物に関連する全身性肥満細胞症、侵襲性全身性肥満細胞症、肥満細胞性白血病、肥満細胞肉腫、ＰＤＧＦＲＡ再構成を伴う骨髄性／リンパ性新生物、ＰＤＧＦＲＢ再構成を伴う骨髄性／リンパ性新生物、ＦＧＦＲ１再構成を伴う骨髄性／リンパ性新生物、ＰＣＭ１－ＪＡＫ２を伴う骨髄性／リンパ性新生物、慢性骨髄単球性白血病、異型慢性骨髄性白血病、ＢＣＲ－ＡＢＬ１陰性の若年性骨髄単球性白血病、環状鉄芽球および血小板増加症を伴う骨髄異形成／骨髄増幅性新生物、骨髄異形成／骨髄増幅性新生物、単一系列異形成を伴う骨髄異形成症候群、環状鉄芽球および単一系列異形成を伴う骨髄異形成症候群、環状鉄芽球および多系列異形成を伴う骨髄異形成症候群、多系列異形成を伴う骨髄異形成症候群、過剰な芽球を伴う骨髄異形成症候群、孤立したデル（５ｑ）を伴う骨髄異形成症候群、骨髄異形成症候群、分類不能の小児期の難治性血球減少症、生殖細胞系列ＣＥＢＰＡ突然変異を伴う急性骨髄性白血病、生殖細胞系列ＤＤＸ４１突然変異を伴う骨髄性新生物、生殖細胞系列ＲＵＮＸ１突然変異を伴う骨髄性新生物、生殖細胞系列ＡＮＫＲＤ２６突然変異を伴う骨髄性新生物、生殖細胞系列ＥＴＶ６突然変異を伴う骨髄性新生物、生殖細胞系列ＧＡＴＡ２突然変異を伴う骨髄性新生物、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２．１）ＲＵＮＸ１－ＲＵＮＸ１Ｔ１を伴うＡＭＬ；ｉｎｖ（１６）（ｐ１３．１ｑ２２）またはｔ（１６；１６）（ｐ１３．１；ｑ２２）ＣＢＦＢ－ＭＹＨ１１を伴うＡＭＬ；ＰＭＬ－ＲＡＲＡを伴う急性前骨髄球性白血病、ｔ（９；１１）（ｐ２１．３；ｑ２３．３）ＫＭＴ２Ａ－ＭＬＬＴ３を伴うＡＭＬ；ｔ（６；９）（ｐ２３；ｑ３４．１）ＤＥＫ－ＮＵＰ２１４を伴うＡＭＬ；ｉｎｖ（３）（ｑ２１．３ｑ２６．２）またはｔ（３；３）（ｑ２１．３；ｑ２６．２）ＧＡＴＡ２、ＭＥＣＯＭを伴うＡＭＬ；ｔ（１；２２）（ｐ１３．３；ｑ１３．１）ＲＢＭ１５－ＭＫＬ１を伴うＡＭＬ（巨核芽球性）；ＢＣＲ－ＡＢＬ１を伴うＡＭＬ；突然変異ＮＰＭ１を伴うＡＭＬ；ＣＥＢＰＡの２対立遺伝子突然変異を伴うＡＭＬ；突然変異ＲＵＮＸ１を伴うＡＭＬ；骨髄異形成に関連する変化を伴うＡＭＬ；療法に関連する骨髄性新生物；最小限の分化を伴うＡＭＬ；成熟を伴わないＡＭＬ；成熟を伴うＡＭＬ；急性骨髄単球性白血病、急性単芽球性および単球性白血病、純粋赤白血病、急性巨核芽球性白血病、急性好塩基球性白血病、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症、骨髄性肉腫、ダウン症に関連する骨髄増殖、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、急性未分化白血病、ｔ（９；２２）（ｑ３４．１；ｑ１１．２）ＢＣＲ－ＡＢＬ１を伴う混合表現型急性白血病；再構成ｔ（ｖ；１１ｑ２３．３）ＫＭＴ２Ａを伴う混合表現型急性白血病；混合表現型急性白血病、Ｂ／骨髄性；混合表現型急性白血病、Ｔ／骨髄性；混合表現型急性白血病、まれなタイプ；不明瞭な系列の急性白血病、Ｂ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫、ｔ（９；２２）（ｑ３４．１；ｑ１１．２）ＢＣＲ－ＡＢＬ１を伴うＢ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；再構成ｔ（ｖ；１１ｑ２３．３）ＫＭＴ２Ａを伴うＢ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；ｔ（１２；２１）（ｐ１３．２；ｑ２２．１）ＥＴＶ６－ＲＵＮＸ１を伴うＢ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；高二倍性を伴うＢ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；低二倍性（低二倍体ＡＬＬ）を伴うＢ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；ｔ（５；１４）（ｑ３１．１；ｑ３２．１）ＩＧＨ／ＩＬ３を伴うＢ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３．３）ＴＣＦ３－ＰＢＸ１を伴うＢ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；Ｂ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫、ＢＣＲ－Ａ□Ｌ１様；ｉＡＭＰ２１を伴う□－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；Ｔ－リンパ芽球性白血病／リンパ腫；初期Ｔ細胞前駆体リンパ芽球性白血病；ＮＫリンパ芽球性白血病／リンパ腫；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫；モノクローナルＢ－細胞リンパ球増加症、ＣＬＬ型；モノクローナルＢ－細胞リンパ球増加症、非ＣＬＬ型；Ｂ－細胞前リンパ球性白血病；脾臓辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病バリアント、ワルデンストレーム（Waldentrom）マクログロブリン血症、ＩｇＭモノクローナル高ガンマグロブリン血症、ミュー重鎖病、ガンマ重鎖病、アルファ重鎖病、形質細胞新生物、粘膜関連リンパ組織の節外辺縁帯リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小児型濾胞性リンパ腫、ＩＲＦ４再配列を伴う大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚濾胞性中心リンパ腫、マンテル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｔ細胞／組織球が濃縮された大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＣＮＳの原発性ＤＬＢＣＬ、原発性皮膚ＤＬＢＣＬ、ＥＢＶ陽性のＤＬＢＣＬ、ＥＢＶ陽性の粘膜皮膚潰瘍、慢性炎症に関連するＤＬＢＣＬ、リンパ腫様肉芽腫症、グレード１、２のリンパ腫様肉芽腫症リンパ腫、グレード３の原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性の大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、多中心性キャッスルマン病、ＨＨＶ８陽性のＤＬＢＣＬ、ＨＨＶ８陽性の生殖細胞性リンパ増幅性障害、バーキットリンパ腫、１１ｑ異常を伴うバーキット様リンパ腫、高グレードのＢ細胞リンパ腫、ＤＬＢＣＬおよび伝統的ホジキンリンパ腫の間の中間の特性を伴う未分類のＢ細胞リンパ腫、ならびに組織球性および樹状細胞新生物を含む。

本開示のある特定の態様は、がんの処置、および／またはがんを処置するための本開示の細胞および組成物の使用に関する。処置されるがんまたは抗原は、当技術分野において公知の任意のがん、または例えば、上皮がん（例えば、乳房、消化管、肺）、前立腺がん、膀胱がん、肺（例えば、小細胞肺）がん、結腸がん、卵巣がん、脳がん、胃がん、腎細胞癌、膵臓がん、肝臓がん、食道がん、頭頸部がんもしくは結腸直腸がんに関連する抗原であってもよい。一部の実施形態では、処置されるがんまたは抗原は、以下のがんの１つ由来である：副腎皮質（adenocortical）癌、原発性骨髄線維症、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫（例えば、小脳および大脳）、基底細胞癌、胆管がん（例えば、肝外）、膀胱がん、骨がん（骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（例えば、神経膠腫、脳幹神経膠腫、小脳または大脳の星状細胞腫（例えば、毛様細胞性星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、未分化（悪性）星状細胞腫）、悪性神経膠腫、上衣腫、オリゴデングリオーマ（oligodenglioma）、髄膜腫、髄膜肉腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、テント神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫および膠芽細胞腫）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍（例えば、消化管カルチノイド腫瘍）、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、慢性骨髄増幅性疾患、子宮内膜がん（例えば、子宮がん）、上衣腫、食道がん、ユーイングファミリーの腫瘍、眼がん（例えば、眼球内黒色腫および網膜芽細胞腫）、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛性腫瘍、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん（例えば、肝癌およびヘプトーマ（heptoma））、下咽頭がん、島細胞癌（膵内分泌部）、喉頭がん、白血病、口唇がんおよび口腔がん、口腔がん、肝臓がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌）、リンパ性新生物（例えば、リンパ腫）、髄芽腫、卵巣がん、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増幅性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経内分泌がん、中咽頭がん、卵巣がん（例えば、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍）、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、腹膜のがん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント未分化神経外胚葉性腫瘍腫瘍、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫（小膠細胞腫）、肺リンパ管筋腫症、直腸がん、腎臓がん、腎盂および尿管がん（移行細胞がん）、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん（例えば、非黒色腫（例えば、扁平上皮癌）、黒色腫およびメルケル細胞癌）、小腸がん、扁平上皮がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、結節性硬化症、尿道がん、膣がん、外陰がん、ウィルムス腫瘍、および移植後リンパ増幅性疾患（ＰＴＬＤ）、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫など）、またはメーグス症候群。

本開示のある特定の態様は、自己免疫状態の処置、および／または自己免疫関連抗原の使用に関する。処置される自己免疫疾患または抗原は、当技術分野において公知の任意の自己免疫状態に関連する抗原、あるいは例えば、糖尿病、移植片拒絶、ＧＶＨＤ、関節炎（急性関節炎などの関節リウマチ、慢性関節リウマチ、痛風または痛風関節炎、急性痛風関節炎、急性免疫学的関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎、感染性関節炎、ライム病関節炎、増幅性関節炎、乾癬性関節炎、スチル病、脊椎関節炎、および若年発症関節リウマチ、骨関節炎、慢性進行性の関節炎、関節炎変形、慢性多発性関節炎、反応性関節炎および強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、例えば、尋常性乾癬、滴状乾癬（gutatte psoriasis）、膿疱性乾癬および爪の乾癬、花粉症およびヨブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー、接触性皮膚炎、慢性接触性皮膚炎、剥離性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、原発性刺激性接触性皮膚炎およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼球内炎症性疾患、慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症（全身性強皮症を含む）、全身性硬化症などの硬化症、脊椎－眼ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）および再発性寛解ＭＳ（ＲＲＭＳ）などの多発性硬化症（ＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、運動失調硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫性媒介性消化管疾患、潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン大腸炎、大腸炎ポリープ症（polyposa）、壊死性腸炎および貫壁性大腸炎などの大腸炎、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患）、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人または急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸促迫症候群、髄膜炎、ぶどう膜の全部または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ性脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎におけるような脳神経損傷、妊娠性疱疹、妊娠性類天疱瘡、陰嚢のそう痒症、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫状態に起因する突発性難聴、アナフィラキシーならびにアレルギー性鼻炎およびアトピー性鼻炎などのＩｇＥ媒介性疾患、ラスマッセン脳炎ならびに辺縁および／または脳幹脳炎などの脳炎、前部ぶどう膜炎、急性前ぶどう膜炎、肉芽腫性ぶどう膜炎、非肉芽腫性ぶどう膜炎、水晶体抗原性ぶどう膜炎、後部ぶどう膜炎または自己免疫性ぶどう膜炎などのぶどう膜炎、ネフローゼ症候群を伴うか、または伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば、慢性または急性糸球体腎炎、例えば、原発性ＧＮ、免疫媒介性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮまたは特発性膜性腎症、Ｉ型およびＩＩ型を含む膜性または膜質性増幅性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、および急速進行性ＧＮ、増幅性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、形質細胞限局性亀頭炎を含む亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形紅斑（eythemamultiform）、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角質増幅症、前がん性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー状態および応答、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹、乾皮性湿疹、発汗異常性湿疹および小水疱性掌蹠湿疹を含む湿疹、気管支の喘息、気管支喘息および自己免疫性喘息を含む喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症応答を含む状態、妊娠中の胎児Ａ－Ｂ－Ｏ血液型などの外来性抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着欠乏症、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、腎外性ループス、腎外ループス、円盤状ループスおよび円盤状エリテマトーデス、脱毛性ループス、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、例えば、皮膚ＳＬＥまたは亜急性皮膚性ＳＬＥ、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）および播種性エリテマトーデスを含むループス、小児インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年性発症（Ｉ型）真性糖尿病、および成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、ならびに自己免疫性糖尿病であってもよい。サイトカインおよびＴ－リンパ球によって媒介される急性および遅発性超過敏性に関連する免疫応答、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎を含む脈管炎、大血管炎（リウマチ性多発筋痛症および巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中間型血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、顕微鏡的多発動脈炎、免疫血管炎、ＣＮＳ血管炎、皮膚性血管炎、過敏性血管炎、全身性壊死性脈管炎などの壊死性血管炎、ならびにチャーグストラウス血管炎または症候群（ＣＳＳ）およびＡＮＣＡ関連小血管炎などのＡＮＣＡ関連血管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、溶血性貧血または自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫溶血性貧血、アジソン病、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外漏出を含む疾患、ＣＮＳ炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、敗血症、外傷または出血に続発するものなどの多臓器損傷症候群、抗原－抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡および皮膚類天疱瘡などの類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡および紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫性多腺性内分泌障害、ライター病または症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、多発性ニューロパチー、慢性ニューロパチー、例えば、ＩｇＭ多発性ニューロパチーもしくはＩｇＭ媒介性ニューロパチーなどの免疫複合体障害、慢性もしくは急性ＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの自己免疫性または免疫媒介性血小板減少症、特発性角膜強膜炎などの強膜炎、上強膜炎、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）または亜急性甲状腺炎などの甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、多腺性自己免疫症候群（または多腺性内分泌病症候群）などの多腺性症候群、ランバートイートン筋無力症候群またはイートンランバート症候群などの神経学的腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、スティフマンまたはスティフパーソン症候群、アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）またはアレルギー性脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓａｌｌｅｒｇｉｃａ）および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの脳脊髄炎、胸腺腫関連重症筋無力症などの重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌスまたは眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、および感覚性ニューロパチー、運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、ｇｉａｎＴ細胞肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球様間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギランバレー症候群、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、リニアＩｇＡ皮膚病、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変および肺硬変症などの硬変症、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック病、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（amylotrophiclateral sclerosis）（ＡＬＳ；ルーゲーリッグ病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）などの自己免疫性耳疾患、自己免疫性難聴、難治性または再発または再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群／非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、自己免疫性酒さ、帯状疱疹関連疼痛、アミロイド症、非癌性リンパ球増加症、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症（例えば、良性モノクローナル免疫グロブリン異常症および意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ）を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパチー、腫瘍随伴症候群、てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、聴覚喪失、失明、周期性四肢麻痺およびＣＮＳのチャネル病などのチャネル病、自閉症、炎症性筋疾患、巣状もしくは分節性または巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼疾患（opthalmopathy）、網膜ぶどう膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病学的障害、線維筋痛、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期認知症、自己免疫性脱髄疾患および慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチーなどの脱髄疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症（alopeciagreata）、完全脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、肢端硬化症および毛細血管拡張症）、例えば抗精子抗体に起因する男性および女性の自己免疫性不妊症、混合結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球性脈管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノシミアシス（kypanosomiasis）、住血吸虫症、回虫症などの寄生虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア（flariasis）、慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性または慢性）またはフック毛様体炎などの毛様体炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、ＳＣＩＤ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒血症、膵炎、甲状腺中毒症（thyroxicosis）、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタインバーウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エヴァンス症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、レンサ球菌感染後腎炎、閉塞性血栓血管炎（thromboangitisubiterans）、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、ｇｉａｎＴ細胞多発筋痛、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化腎症、良性家族性および虚血再灌流傷害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節の炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、精子形成欠如（asperniogenese）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、らい性結節性紅斑、特発顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感音性（sensoneural）難聴、血色素尿症発作、性腺機能低下症、地域性回腸炎、白血球減少症、単核球症感染症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎（thyreoiditis）、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑、毒素性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤に関与する状態、白血球接着欠乏症、サイトカインおよびＴ－リンパ球によって媒介される急性および遅発性超過敏性に関連する免疫
応答、白血球血管外漏出を含む疾患、多臓器損傷症候群、抗原－抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、腺性内分泌不全症、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、拡張型心筋症などの心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨、前頭骨、上顎骨または蝶形骨の副鼻腔炎、好酸球増加症などの好酸球関連疾患、肺浸潤性好酸球増加症、好酸球増加－筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増化性症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多腺性自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブルトン症候群、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、ウィスコットアルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症症候群、血管拡張症、コラーゲン病に関連する自己免疫障害、リウマチ、神経疾患、リンパ節炎、血圧応答の低減、血管機能不全、組織傷害、心臓血管虚血、痛覚過敏症、腎虚血、脳虚血、および血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏症障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流障害、リンパ腫の気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性要素を伴う皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連性症候群、サイトカイン誘導毒性、ナルコレプシー、急性の重度の炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、移植片対宿主病、接触過敏症、喘息気道過敏反応、ならびに子宮内膜症も企図される。

さらなる態様は、微生物感染症の処置もしくは予防、および／または微生物抗原の使用に関する。処置もしくは予防される微生物感染症または抗原は、当技術分野において公知の任意の微生物感染症に関連する抗原、または例えば、炭疽病、子宮頸がん（ヒトパピローマウイルス）、ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、日本脳炎（ＪＥ）、ライム病、麻疹、髄膜炎菌、サル痘、流行性耳下腺炎、百日咳、肺炎球菌、ポリオ、狂犬病、ロタウイルス、風疹、帯状疱疹（ヘルペス帯状疱疹）、天然痘、破傷風、腸チフス、結核（ＴＢ）、水痘（鶏痘）、および黄熱病であってもよい。

一部の実施形態では、方法および組成物は、がん、炎症、感染症などのような病状を予防するための個人へのワクチン接種のためであってもよい。
ＸＩＩ．付加療法
Ａ．免疫療法

一部の実施形態では、方法は、がん免疫療法の投与を含む。がん免疫療法（免疫腫瘍学、省略してＩＯと呼ぶ場合がある）は、がんを処置するための免疫系の使用である。免疫療法は、能動的、受動的またはハイブリッド（能動的および受動的）として分類することができる。これらの手法は、がん細胞が、多くの場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）として公知の免疫系によって検出され得るそれらの表面上に分子を有するという事実を活用し、それらは、多くの場合、タンパク質または他の高分子（例えば、炭水化物）である。能動免疫療法は、ＴＡＡを標的とすることによって、免疫系に腫瘍細胞を攻撃するように指示する。受動免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強し、モノクローナル抗体、リンパ球およびサイトカインの使用を含む。本開示の方法において有用な免疫療法を下記に記載する。
２．チェックポイント阻害剤および併用処置

本開示の実施形態は、下記にさらに記載する免疫チェックポイント阻害剤（チェックポイント阻害剤療法とも称する）の投与を含んでいてもよい。チェックポイント阻害剤療法は、１つの細胞チェックポイントタンパク質のみを標的にする単剤療法であってもよく、または少なくとも２つの細胞チェックポイントタンパク質を標的にする併用療法であってもよい。例えば、チェックポイント阻害剤単剤療法は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２阻害剤のうちの１つを含んでいてもよく、またはＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１もしくはＢ７－２阻害剤のうちの１つを含んでいてもよい。チェックポイント阻害剤併用療法は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２阻害剤のうちの１つを含んでいてもよく、かつ組み合わせて、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１もしくはＢ７－２阻害剤のうちの１つをさらに含んでいてもよい。併用療法における阻害剤の組合せは、同じ組成物中にある必要はないが、同時に、実質的に同時に、または両方の阻害剤の周期的な投与を含む投薬レジメンのいずれかで投与され得、期間は、本明細書に記載の期間であり得る。
ｂ．ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２阻害剤

ＰＤ－１は、Ｔ細胞が感染症または腫瘍と遭遇する腫瘍微小環境中で作用し得る。活性化されたＴ細胞は、ＰＤ－１を上方調節し、末梢組織においてそれを発現し続ける。ＩＦＮ－ガンマなどのサイトカインは、上皮細胞および腫瘍細胞上でＰＤ－Ｌ１の発現を誘導する。ＰＤ－Ｌ２は、マクロファージおよび樹状細胞上で発現する。ＰＤ－１の主な役割は、末梢においてエフェクターＴ細胞の活性を限定すること、および免疫応答の間に組織に対する過度の損傷を防止することである。本開示の阻害剤は、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１活性の１つもしくは複数の機能を遮断し得る。

「ＰＤ－１」についての代替名称としては、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２が挙げられる。「ＰＤ－Ｌ１」についての代替名称としては、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－４、ＣＤ２７４およびＢ７－Ｈが挙げられる。「ＰＤ－Ｌ２」についての代替名称としては、Ｂ７－ＤＣ、ＢｔｄｃおよびＣＤ２７３が挙げられる。一部の実施形態では、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、ヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２である。

一部の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２である。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＰＤ－Ｌ２のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。阻害剤は、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであってもよい。例示的な抗体は、参照によってすべて本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７３５，５５３号、同第８，３５４，５０９号および同第８，００８，４４９号に記載されている。本明細書に提供される方法および組成物における使用のための他のＰＤ－１阻害剤は、当技術分野において公知であり、例えば、参照によってすべて本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２９４８９８号、同第ＵＳ２０１４／０２２０２１号および同第ＵＳ２０１１／０００８３６９号に記載されている。

一部の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびピディリズマブからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２の細胞外またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＡＭＰ－２２４を含む。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても公知のニボルマブは、国際公開第２００６／１２１１６８号に記載の抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＳＣＨ－９００４７５としても公知のペムブロリズマブは、国際公開第２００９／１１４３３５号に記載の抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１、ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても公知のピディリズマブは、国際公開第２００９／１０１６１１号に記載の抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても公知のＡＭＰ－２２４は、国際公開第２０１０／０２７８２７号および国際公開第２０１１／０６６３４２号に記載のＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。さらなるＰＤ－１阻害剤としては、ＡＭＰ－５１４としても公知のＭＥＤＩ０６８０、およびＲＥＧＮ２８１０が挙げられる。

一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＥＤＩ４７３６としても公知のデュルバルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａとしても公知のアテゾリズマブ、ＭＳＢ０００１０１１８Ｃとしても公知のアベルマブ、ＭＤＸ－１１０５、ＢＭＳ－９３６５５９などのＰＤ－Ｌ１阻害剤、またはそれらの組合せである。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７などのＰＤ－Ｌ２阻害剤である。

一部の実施形態では、阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピディリズマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲもしくはＶＲを含む。したがって、一実施形態では、阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピディリズマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピディリズマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上記で言及した抗体のＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２上の同じエピトープとの結合と競合し、および／またはそれらに結合する。別の実施形態では、抗体は、上記で言及した抗体と少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７または９９％（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）の可変領域のアミノ酸配列同一性を有する。
ｃ．ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１およびＢ７－２阻害剤

本明細書に提供される方法において標的にされ得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても公知の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全ｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上で見出され、抗原提示細胞の表面上でＢ７－１（ＣＤ８０）またはＢ７－２（ＣＤ８６）に結合する場合に、スイッチを「切る」ように作用する。ＣＴＬＡ－４は、ヘルパーＴ細胞の表面上で発現し、Ｔ細胞への阻害性シグナルを伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質のＣＤ２８と類似しており、両方の分子は、抗原提示細胞上のＢ７－１およびＢ７－２に結合する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞に阻害性シグナルを伝達するが、ＣＤ２８は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ－４は、調節性Ｔ細胞中でも見出され、それらの機能に重要であり得る。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８によるＴ細胞活性化は、Ｂ７分子についての阻害性受容体であるＣＴＬＡ－４の増加した発現をもたらす。本開示の阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１および／またはＢ７－２活性の１つもしくは複数の機能を遮断し得る。一部の実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４およびＢ７－１の相互作用を遮断する。一部の実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４およびＢ７－２の相互作用を遮断する。

一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。

本方法における使用のために好適な抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（またはそれらに由来するＶＨおよび／またはＶＬドメイン）は、当技術分野において周知の方法を使用して作製することができる。あるいは、当技術分野が認識する抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、米国特許第８，１１９，１２９号、国際公開第０１／１４４２４号、国際公開第９８／４２７５２号；国際公開第００／３７５０４号（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブとしても公知；以前はチシリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号；Hurwitz et al., 1998；に開示されており、本明細書に開示される方法において使用することができる。前述の刊行物のそれぞれの教示は、参照によって本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ－４に結合するためのこれらの当技術分野が認識する抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、参照によってすべて本明細書に組み込まれる、国際特許出願の国際公開第２００１／０１４４２４号、国際公開第２０００／０３７５０４号および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されている。

本開示の方法および組成物におけるチェックポイント阻害剤として有用なさらなる抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても公知）、またはその抗原結合断片およびバリアント（例えば、国際公開第０１／１４４２４号を参照されたい）である。

一部の実施形態では、阻害剤は、トレメリムマブまたはイピリムマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲもしくはＶＲを含む。したがって、一実施形態では、阻害剤は、トレメリムマブまたはイピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにトレメリムマブまたはイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上記で言及した抗体のＰＤ－１、Ｂ７－１もしくはＢ７－２上の同じエピトープとの結合と競合し、および／またはそれらに結合する。別の実施形態では、抗体は、上記で言及した抗体と少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７または９９％（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）の可変領域のアミノ酸配列同一性を有する。
３．共刺激分子の阻害

一部の実施形態では、免疫療法は、共刺激分子の阻害剤を含む。一部の実施形態では、阻害剤は、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７；ＴＮＦＲＳＦ９）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０ＬＧ）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）の阻害剤、およびそれらの組合せを含む。阻害剤としては、阻害性の抗体、ポリペプチド、化合物および核酸が挙げられる。
４．樹状細胞療法

樹状細胞療法は、樹状細胞が腫瘍抗原をリンパ球に提示させることによって、抗腫瘍応答を引き起こし、これは、それらを活性化し、それらを刺激して、抗原を提示した他の細胞を死滅させる。樹状細胞は、哺乳動物の免疫系において抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。がん処置において、それらは、がん抗原の標的化を助ける。樹状細胞に基づく細胞がん療法の一例は、シプリューセル－Ｔである。

腫瘍抗原を提示する樹状細胞を誘導する一方法は、自己腫瘍溶解物または短ペプチド（がん細胞上のタンパク質抗原に対応するタンパク質の小部分）によるワクチン接種によってである。これらのペプチドは、多くの場合、アジュバント（高度に免疫原性の物質）と組み合わせて与えられて、免疫および抗腫瘍応答を増加させる。他のアジュバントとしては、樹状細胞を引き付けるおよび／もしくは活性化するタンパク質または化学物質、例えば、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられる。

樹状細胞はまた、腫瘍細胞にＧＭ－ＣＳＦを発現させることによって、ｉｎｖｉｖｏで活性化され得る。これは、ＧＭ－ＣＳＦを産生する遺伝子操作された腫瘍細胞によって、またはＧＭ－ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性ウイルスに腫瘍細胞を感染させることによってのいずれかで達成することができる。

別の戦略は、患者の血液から樹状細胞を除去すること、およびそれらを身体の外側から活性化することである。樹状細胞は、単一腫瘍特異的ペプチド／タンパク質または腫瘍細胞溶解物（破壊された腫瘍細胞の溶液）であり得る腫瘍抗原の存在下で活性化される。これらの細胞（必要に応じたアジュバントとともに）は、注入され、免疫応答を引き起こす。

樹状細胞療法は、樹状細胞の表面上で受容体に結合する抗体の使用を含む。抗原は、抗体に添加され得、樹状細胞が成熟するのを誘導し、腫瘍に対する免疫を提供することができる。
５．サイトカイン療法

サイトカインは、腫瘍内に存在する多くのタイプの細胞によって産生するタンパク質である。それらは、免疫応答をモジュレートすることができる。腫瘍は、多くの場合、それを成長させ、免疫応答を低減するために、それらを用いる。これらの免疫モジュレート効果は、それらを、免疫応答を引き起こす薬物として使用することを可能にする。２つの一般的に使用されるサイトカインは、インターフェロンおよびインターロイキンである。

インターフェロンは、免疫系によって産生される。それらは、通常、抗ウイルス応答に関与するが、がんのために使用されてもいる。それらは、３つの群：Ｉ型（ＩＦＮαおよびＩＦＮβ）、ＩＩ型（ＩＦＮγ）およびＩＩＩ型（ＩＦＮλ）に分けられる。

インターロイキンは、一連の免疫系の効果を有する。ＩＬ－２は、例示的なインターロイキンサイトカイン療法である。
６．養子Ｔ細胞療法

養子Ｔ細胞療法は、Ｔ細胞の輸血（養子細胞移入）による受動免疫の形態である。それらは、血液および組織中で見出され、通常、それらが外来性病原体を見出した場合に活性化する。具体的には、それらは、Ｔ細胞の表面受容体が、それらの表面抗原上の外来性タンパク質の一部を提示する細胞と遭遇した場合に活性化する。それらは、感染細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）のいずれかであり得る。それらは、正常な組織および腫瘍組織中で見出され、それらは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）として公知である。それらは、腫瘍抗原を提示する樹状細胞などのＡＰＣの存在によって活性化される。それらの細胞は腫瘍を攻撃することができるが、腫瘍内の環境は、非常に免疫抑制的であり、免疫媒介性腫瘍死を防止する。

腫瘍標的化Ｔ細胞の産生および入手の複数の方法が開発されている。腫瘍抗原に特異的なＴ細胞は、腫瘍試料（ＴＩＬ）から除去され得るか、または血液から濾過され得る。その後の活性化および培養をｅｘｖｉｖｏで行って、結果が再注入される。活性化は、遺伝子療法により、またはＴ細胞を腫瘍抗原に曝露することによって、行うことができる。

がん処置が本明細書に記載のがん処置のいずれかを除外してもよいことが企図される。さらにまた、本開示の実施形態は、本明細書に記載の療法で過去に処置された患者、本明細書に記載の療法で現在処置されている患者、または本明細書に記載の療法で処置されていない患者を含む。一部の実施形態では、患者は、本明細書に記載の療法に対して抵抗性であることが決定されている患者である。一部の実施形態では、患者は、本明細書に記載の療法に対して感受性であることが決定されている患者である。
Ｂ．溶解性ウイルス

一部の実施形態では、付加療法は、腫瘍溶解性ウイルスを含む。腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に優先的に感染し、それを死滅させるウイルスである。感染したがん細胞は腫瘍退縮によって破壊されるので、それらは、残った腫瘍を破壊するのを助ける新たな感染性ウイルス粒子またはビリオンを放出する。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接破壊を引き起こすだけでなく、長期にわたる免疫療法に対する宿主抗腫瘍免疫応答も刺激すると考えられる。
Ｃ．多糖類

一部の実施形態では、付加療法は、多糖類を含む。ある特定の化合物は、キノコ中で見出され、主に多糖類は、免疫系を上方調節することができ、抗がん性を有している場合がある。例えば、レンチナンなどのベータ－グルカンは、研究室での研究において、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｔ細胞および免疫系サイトカインを刺激することが示されており、免疫学的アジュバントとして臨床試験で検討されている。
Ｄ．ネオ抗原

一部の実施形態では、付加療法は、ネオ抗原投与を含む。多くの腫瘍が突然変異を発現する。これらの突然変異は、潜在的に、Ｔ細胞免疫療法における使用のための新たな標的化可能な抗原（ネオ抗原）を作り出す。がん病変中のＣＤ８^＋Ｔ細胞の存在は、ＲＮＡ配列決定データを使用して同定されているように、高突然変異負荷を有する腫瘍においてより高い。転写物のレベルは、ナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性と関連し、Ｔ細胞は、多くのヒト腫瘍中の突然変異量と正に相関する。
Ｅ．化学療法

一部の実施形態では、付加療法は、化学療法を含む。化学療法剤の好適なクラスとしては、（ａ）ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド（cylophosphamide）、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、クロロゾトシン（chlorozoticin）、ストレプトゾシン）およびトリアジン（例えば、ダカルバジン（dicarbazine））などのアルキル化剤、（ｂ）葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、アザウリジン）、ならびにプリンアナログおよび関連物質（例えば、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、ペントスタチン）などの代謝拮抗剤、（ｃ）ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、エピポドフィロトキシン（epipodophylotoxin）（例えば、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびミトキサントロン（mitoxanthrone））、酵素（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ）、ならびに生体応答修飾物質（例えば、インターフェロン－α）などの天然産物、ならびに（ｄ）白金配位複合体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、置換ウレア（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒジアジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質抑制剤（例えば、タキソールおよびミトタン）などの種々の薬剤が挙げられる。一部の実施形態では、シスプラチンは、特に好適な化学療法剤である。

シスプラチンは、例えば、転移性の精巣癌もしくは卵巣癌、進行性膀胱がん、頭頸部がん、子宮頚がん、肺がん、または他の腫瘍などのがんを処置するために幅広く使用されている。シスプラチンは、経口的に吸収されず、したがって、例えば、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内注射などの他の経路を経て送達されなければならない。シスプラチンは、ある特定の実施形態では、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、企図される３回の経過の合計で３週間ごとに５日間、約１５ｍｇ／ｍ^２～約２０ｍｇ／ｍ^２を含む臨床適用において使用される有効な用量で使用することができる。一部の実施形態では、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＥｇｒ－１プロモーターを含む構築物と併せた細胞および／または対象に送達されるシスプラチンの量は、シスプラチン単独を使用する場合に送達されるであろう量よりも少ない。

他の好適な化学療法剤としては、抗微小管剤、例えば、パクリタキセル（「タキソール」）およびドキソルビシン塩酸塩（「ドキソルビシン」）が挙げられる。アデノウイルスベクターを介して送達されるＥｇｒ－１プロモーター／ＴＮＦα構築物およびドキソルビシンの組合せは、化学療法および／またはＴＮＦ－αに対する抵抗性を克服するのに有効であることが決定されており、これは、構築物およびドキソルビシンによる併用処置がドキソルビシンとＴＮＦ－αの両方に対する抵抗性を克服することを示唆する。

ドキソルビシンは、吸収が劣り、好ましくは、静脈内投与される。ある特定の実施形態では、成人に対する適切な静脈内用量は、約２１日の間隔で約６０ｍｇ／ｍ^２～約７５ｍｇ／ｍ^２、約３週間～約４週間の間隔で繰り返される２日もしくは３日の連続した日のそれぞれにおいて約２５ｍｇ／ｍ^２～約３０ｍｇ／ｍ^２、または週に１回約２０ｍｇ／ｍ^２を含む。最低用量は、以前の化学療法もしく新生物の骨髄侵入によって引き起こされた以前の骨髄抑制が存在する場合、または薬物が他の骨髄造血抑制薬と組み合わされる場合に、高齢の患者に使用されるべきである。

ナイトロジェンマスタードは、本開示の方法において有用な別の好適な化学療法剤である。ナイトロジェンマスタードとしては、限定されるものではないが、メクロレタミン（ＨＮ_２）、シクロホスファミドおよび／またはイホスファミド、メルファラン（Ｌ－サルコシン）ならびにクロラムブシルが挙げられ得る。シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））は、ＭｅａｄＪｏｈｎｓｏｎから入手可能であり、ＮＥＯＳＴＡＲ（登録商標）は、Ａｄｒｉａから入手可能であり、これは別の好適な化学療法剤である。成人に対する好適な経口用量は、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約５ｍｇ／ｋｇ／日を含み、静脈内用量は、例えば、最初は、約２日～約５日の期間にわたる分割用量で約４０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、または約７日～約１０日ごとに約１０ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ、または週に２回、約３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、または約１．５ｍｇ／ｋｇ／日～約３ｍｇ／ｋｇ／日を含む。不都合な胃腸の効果のために、静脈内経路が好ましい。薬物は、筋肉内、浸透によって、または体腔に投与される場合もある。

追加の好適な化学療法剤としては、シタラビン（シトシンアラビノシド）、５－フルオロウラシル（フルオロウラシル；５－ＦＵ）およびフロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦｕｄＲ）などのピリミジンアナログが挙げられる。５－ＦＵは、対象に、約７．５～約１０００ｍｇ／ｍ２の間のどれかの投薬量で投与されてもよい。さらに、５－ＦＵの投薬スケジュールは、さまざまな期間、例えば、最長で６週間であってもよく、またはこの開示が関連する当業者によって決定されるものであってもよい。

別の好適な化学療法剤であるゲムシタビン二リン酸塩（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、ＥｌｉＬｉｌｌｙ＆Ｃｏ．「ゲムシタビン」）は、進行性および転移性前立腺がんの処置のために推奨されており、したがって、同様に、これらのがんのために本開示において有用である。

患者に送達される化学療法剤の量は、変動し得る。好適な一実施形態では、化学療法剤は、化学療法剤が構築物と投与される場合、宿主中のがんの抑止または退縮を引き起こすのに有効な量で投与され得る。他の実施形態では、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法的有効用量よりも２～１０，０００倍少ない量の間のどれかの量で投与されてもよい。例えば、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法的有効用量よりも約２０倍少ない、約５００倍少ない、またはさらに約５０００倍少ない量で投与されてもよい。本開示の化学療法薬は、構築物と組み合わせて所望の治療活性のために、および有効な投薬量を決定するために、ｉｎｖｉｖｏで試験することができる。例えば、そのような化合物は、ヒトにおいて試験する前に、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含む、好適な動物モデル系において試験することができる。ｉｎｖｉｔｒｏの試験は、実施例に記載されるように、好適な組合せおよび投薬量を決定するために使用することもできる。
Ｆ．放射線療法

一部の実施形態では、付加療法または過去の治療は、電離放射線などの放射線を含む。本明細書で使用される場合、「電離放射線」は、十分なエネルギーを有するか、もしくはイオン化（電子の獲得または喪失）を生じさせる核相互作用を介して十分なエネルギーを生じさせ得る、粒子または光子を含む放射線を意味する。例示的かつ好ましい電離放射線は、ｘ線照射である。標的組織または細胞にｘ線照射を送達するための手段は、当技術分野において周知である。

一部の実施形態では、電離放射線の量は、２０Ｇｙよりも高く、１用量で投与される。一部の実施形態では、電離放射線の量は、１８Ｇｙであり、３用量で投与される。一部の実施形態では、電離放射線の量は、少なくとも、最大で、または正確に、２、４、６、８、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、１８、１９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは４０Ｇｙ（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）である。一部の実施形態では、電離放射線は、少なくとも、最大で、または正確に、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０用量（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）で投与される。２以上の用量が投与される場合、用量は、約１、４、８、１２もしくは２４時間、または１、２、３、４、５、６、７もしくは８日、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４もしくは１６週間離して、またはそれらの任意に誘導可能な範囲であってもよい。

一部の実施形態では、ＩＲの量は、ＩＲの総用量として表され得、これは、その後、分割された用量で投与される。例えば、一部の実施形態では、総用量は、それぞれ５Ｇｙの１０の分割された用量で投与される５０Ｇｙである。一部の実施形態では、総用量は、それぞれ２～３Ｇｙの２０～６０の分割された用量で投与される５０～９０Ｇｙである。一部の実施形態では、ＩＲの総用量は、少なくとも、最大で、または約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０もしくは１５０（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）である。一部の実施形態では、総用量は、少なくとも、最大で、または正確に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０Ｇｙ（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）の分割された用量で投与される。一部の実施形態では、少なくとも、最大で、または正確に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００の分割された用量が投与される（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）。一部の実施形態では、１日あたり、少なくとも、最大で、または正確に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）の分割された用量が投与される。一部の実施形態では、１週間あたり、少なくとも、最大で、または正確に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０（またはそれらの任意の誘導可能な範囲）の分割された用量が投与される。
Ｇ．手術

がんを有する人々のおよそ６０％が、予防的、診断的もしくは進行度診断、治癒的および一時的緩和の手術を含む、何らかのタイプの手術を受けている。治癒的手術は、癌性組織の全部または一部が物理的に除去、切除および／または破壊される摘出を含み、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法などの他の療法と併せて使用されてもよい。腫瘍摘出は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍摘出に加えて、手術による処置としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡管理された手術（モース術）が挙げられる。

癌性の細胞、組織もしくは腫瘍の一部または全部の切除の際に、孔が身体に形成される場合がある。処置は、灌流、直接注射または追加の抗がん療法を伴う領域の局所適用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごと、または１、２、３、４および５週間ごと、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２か月ごとに、繰り返されてもよい。これらの処置は、同様に、異なる投薬量の処置であってもよい。
Ｈ．他の薬剤

他の薬剤を、処置の治療有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用してもよいことが企図される。これらの追加の薬剤としては、細胞表面受容体およびＧＡＰジャンクションの上方調節に影響を与える薬剤、細胞分裂阻害剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対して過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、または他の生物学的剤が挙げられる。ＧＡＰジャンクションの数を増大させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させるだろう。他の実施形態では、細胞分裂阻害剤または分化剤は、処置の抗過剰増殖有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤、例えば、抗体ｃ２２５は、処置の有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用することができることがさらに企図される。
ＸＩＩＩ．配列

ＸＩＶ．実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本開示の実施において良好に機能する本発明者によって発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、多くの変更を開示される具体的な実施形態において行うことができ、さらに、本開示の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
（実施例１）
オフザシェルフｉＮＫＴ細胞を操作するための造血幹細胞（ＨＳＣ）手法

本実施例は、１つもしくは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現の欠如あるいは下方調節を含むオフザシェルフｉＮＫＴ細胞の産生に関する。具体的な実施形態では、ｉＮＫＴ細胞は、健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から増幅させ、続いて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作を行って、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトする。ヒト集団におけるｉＮＫＴ細胞の高い可変性および低い頻度のため（血液中におよそ０．００１～０．１％）、ｉＮＫＴ細胞を得るための代替手段を可能にする方法を作製することは有益である。

本開示は、ｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子を有するＨＳＣの遺伝子操作、およびｉＮＫＴ細胞に発生するようにこれらのＨＳＣをプログラミングすることにより、造血幹細胞（ＨＳＣ）からｉＮＫＴ細胞を産生する強力な方法を提供する（Smith et al., 2015）。この方法は、ｉＮＫＴ細胞の発生を支配する以下の２つの分子機構の利点がある：１）トランスジェニックｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子の存在下で内在性ＴＣＲ遺伝子の再構成を遮断する対立遺伝子消失機構、および２）発生中のＴ細胞をｉＮＫＴ系列パスを減らすように導くＴＣＲ指示機構（Smithet al., 2015）。得られるＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞は、内在性ＴＣＲを発現しない均質な「クローンの」集団である。マウス骨髄移入および黒色腫肺転移モデルにおけるこれらのｉＮＫＴ細胞の強力な抗がん有効性を有するマウスＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を作製した（Smithet al., 2015）。

ＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞は、ヒトｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子によるヒトＣＤ３４＋末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）の遺伝子操作、続いて、操作されたＰＢＳＣのＢＬＴヒト化マウスモデルへの移入によって、産生する（図２Ａおよび２Ｂ）。しかしながら、そのようなｉｎｖｉｖｏの手法は、自己ＨＳＣ養子療法としてのみ変換され得る。特定の実施形態では、ＴＣＲで操作されたヒトＣＤ３４＋ＨＳＣのクローンＴ細胞への高効率および高収率での分化を支持する血清フリー「人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）」ｉｎｖｉｔｒｏ培養系（図２Ｃおよび２Ｄ）（Seet et al., 2017）が利用される。このＡＴＯ培養系は、ＨＳＣ－ｉＮＫＴ産生をｉｎｖｉｔｒｏ系に移すことを可能にし、これに基づいて、オフザシェルフ汎用のＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞の養子療法が利用され得る（図１）。ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍抗原および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束性なしで複数のタイプのがんを標的にすることができるので、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ療法は、複数のがんおよびがん患者の大集団を処置するための、したがって、満たされていない医学的必要性に対処するための汎用がん療法として有用である（図１）（Vivieret al., 2012；Berzins et al., 2011）。特に、開示されるＨＳＣ－ｉＮＫＴ療法は、血液がん（白血病、多発性骨髄腫および骨髄異形成症候群）および固形腫瘍（黒色腫、結腸がん、肺がん、乳がんおよび頭頸部がん）を含む、臨床的にｉＮＫＴ細胞調節を受ける対象とされている多くのタイプのがんを処置するために有用である（Berzinset al., 2011）。

遺伝子操作された健康なドナーのＨＳＣからｉｎｖｉｔｒｏで培養された同種異系のＨＬＡ陰性ヒトｉＮＫＴ細胞は、本明細書に包含される。それらの産生の例を下記に提供する。
Ａ．初期ＣＭＣ研究（図３）

特に断りのない限り、ヒトＧ－ＣＳＦ動員末梢血ＣＤ３４＋細胞は、造血幹および始原細胞の両方を含有する。本明細書において、これらのＣＤ３４＋細胞は、ＨＳＣと称する。

初期の化学、製造および管理（ＣＭＣ）研究を実施して、ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ製造を試験する。具体的な場合では、ＨＳＣ－ｉＮＫＴＡＴＯ細胞が産生し、これは、２段階のＡＴＯ－αＧＣ培養系でｉｎｖｉｔｒｏで作製された、ＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞である。

Ｇ－ＣＳＦ動員ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを、３人の異なる健康なドナーから収集し、アナログレンチウイルスベクターのレンチ／ｉＮＫＴ－ＥＧＦＰで形質導入し、続いて、２段階のＡＴＯ－αＧＣ培養系においてｉｎｖｉｔｒｏで培養した（図３Ａ）。遺伝子操作されたＨＳＣ（ＧＦＰ＋として標識する）は、８週間にわたる人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養段階においてヒトｉＮＫＴ細胞に効率的に分化し（図３Ｂ）、次いで、さらに２～３週間、ＰＢＭＣ／αＧＣ刺激段階においてさらに増幅させた（図３Ｃ）。この製造プロセスは、頑強であり、試験された３人のドナーすべてについて高収率および高純度であった（図３Ｄ）。結果に基づいて、１×１０^６個のインプットＨＳＣ（およそ３０～５０％のレンチベクター形質導入率）から、約３～９×１０^１０個のＨＳＣ－ｉＮＫＴＡＴＯ細胞（純度＞９５％）が産生し、単一の無作為なドナーから１０^１２個を超える治療用ｉＮＫＴ細胞の理論収率を与えると推測された（図３Ｄ）。
Ｂ．初期薬理学研究（図４）

初期薬理学研究を、ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を研究するために行った。ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を、フローサイトメトリーを使用して研究した。ＨＳＣ－ｉＮＫＴＡＴＯ細胞（ＡＴＯ培養系においてｉｎｖｉｔｒｏで作製されたＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞）とＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞（ＢＬＴにおいてｉｎｖｉｖｏで作製されたＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞（ヒト骨髄－肝臓－胸腺移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ－／－）ヒト化マウスモデルは両方とも、内在性ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞のものと類似する典型的なｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を表し、それらは、高レベルのメモリーＴ細胞マーカーであるＣＤ４５ＲＯおよびＮＫ細胞マーカーであるＣＤ１６１を発現し（図４Ａ）、それらは、混合パターン（ＣＤ４シングル陽性、ＣＤ８シングル陽性およびＣＤ４／ＣＤ８ダブル陰性）でＣＤ４およびＣＤ８共受容体を発現し（図４Ａ）、それらは、従来型ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞のものと比較して、極めて高レベルのＩＦＮ－γのようなエフェクターサイトカイン、ならびにパーフォリンおよびグランザイムＢのような細胞傷害性分子を産生した（図４Ｂ）。
Ｃ．初期有効性研究（図５）

初期有効性研究を、ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞の腫瘍死滅有効性を研究するために行った。ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系ＭＭ．１Ｓを、ヒトＣＤ１ｄ遺伝子ならびにホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーター遺伝子および高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター遺伝子を過剰発現するように操作した（図５Ａ）。次いで、得られたＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系を使用して、混合培養アッセイにおいてｉｎｖｉｔｒｏで（図５Ｂ）、およびＮＳＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^－／－）マウスヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）転移モデルにおいてｉｎｖｉｖｏで（図５Ｄ）、ｉＮＫＴ細胞標的化腫瘍死滅を研究した。ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞とＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞は両方とも、ｉｎｖｉｔｒｏで有効な同等の腫瘍死滅を示した（図５Ｃ）。ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞もｉｎｖｉｖｏで試験し、それらは、頑強な腫瘍死滅を媒介した（図５Ｅおよび５Ｆ）。固形腫瘍に対する腫瘍死滅有効性を研究するために、Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト黒色腫細胞系を作製した（図５Ｇ）。ＮＳＧマウスＡ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ異種移植固形腫瘍モデルにおいて試験した場合（図５Ｈ）、ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞は、固形黒色腫の腫瘍成長を効率的に抑制した（図５Ｉ）。重要なことには、ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞は、おそらくこれらの細胞の強力な腫瘍追跡能に起因して、腫瘍部位への標的化浸潤を示した（図５Ｊおよび５Ｋ）。
Ｄ．初期安全性研究－ＧｖＨＤ／毒性学／腫瘍形成性（図６）

ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏでの長期のＧｖＨＤ、毒性学および腫瘍形成性にアクセスするために、ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞を持つＢＬＴヒト化マウスを、ＨＳＣ移入後５か月の期間にわたってモニターし、続いて、組織収集および病理学的分析を行った（図６）。マウスの体重（図６Ａ）、生存（図６Ｂ）および組織病理学（図６Ｃ）のモニタリングは、対照ＢＬＴマウスと比較して、ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスにおいて、ＧｖＨＤなし、毒性なし、および腫瘍形成性なしを明らかにした（図２Ａ）。
Ｅ．初期安全性研究－ＰＥＴイメージングおよび安全管理のためのｓｒ３９ＴＫ遺伝子（図７）

ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ）細胞を持つＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫヒト化マウスを研究した（図７Ａ）。ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞を、レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫレンチウイルスベクターで形質導入されたヒトＨＳＣから操作した（図１３）。ＣＴスキャンと組み合わせたＰＥＴイメージングを使用して、本発明者らは、ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスのリンパ組織全体にわたる、特に、骨髄（ＢＭ）および脾臓における遺伝子操作されたヒト細胞の分布を検出した（図７Ｂ）。ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスをＧＣＶで処置すると、身体全体にわたって遺伝子操作されたヒト細胞が効率的に枯渇した（図７Ｂ）。重要なことには、ＧＣＶ誘導性枯渇は、特異的であり、フローサイトメトリーによって測定した場合の、ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスにおける、他のヒト免疫細胞ではなく、ＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞の選択的枯渇によって証明された（図７Ｃおよび７Ｄ）。
Ｆ．汎用のＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞の産生

具体的な実施形態では、同種異系のＨＳＣで操作されたＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性ヒトｉＮＫＴ細胞（汎用のＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ細胞、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞として表す）を含む幹細胞に基づく治療用組成物を産生した。

レンチ－ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを作製する。ある特定の実施形態では、臨床レンチウイルスベクターのレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫを利用する（図８Ａ）。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体を作製する。具体的な実施形態では、強力なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ遺伝子編集ツールを使用して、ヒトＨＳＣ中のＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する（Ren et al., 2017；Liu et al., 2017）。そのような遺伝子編集されたＨＳＣに由来するｉＮＫＴ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現を欠き、それにより宿主Ｔ細胞による拒絶を回避する。初期研究では、ＣＩＲＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体を、成功裏に作製し、試験した（ＵＣＢｅｒｋｅｌｅｙＭａｃｒｏＬａｂＦａｃｉｌｉｔｙからのＣａｓ９；ＳｙｎｔｈｅｇｏからのｇＲＮＡ；Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡ配列５’－ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＵＡＡＧＧＣＣＡ－３’（配列番号６８）（Renet al., 2017）；ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ配列５’－ＧＡＵＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＧＣＣＵＣＣＣ－３’（配列番号６９）（Abrahimi et al.,2015））。「オフターゲット」効果を最小化するために、ＩＤＴからの高忠実度のＣａｓ９タンパク質を利用することができる（Kohn et al., 2016；Slaymakeret al., 2016；Tsai and Joung, 2016）。事前に試験された単一の優性Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡおよびＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡから開始することができるが、具体的な実施形態では、複数のｇＲＮＡが、遺伝子編集効率をさらに改善するために組み込まれる。

Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋ＨＳＣの収集。商業的供給業者から少なくとも２人の異なる健康なドナーのＧ－ＣＳＦ動員ｌｅｕｋｏｐａｋを入手することができ、続いて、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを使用して、ＣＤ３４^＋ＨＳＣを単離する。単離後、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋ＨＳＣを、凍結保存し、後で使用され得る。

ＨＳＣの遺伝子操作。ＨＳＣを、レンチ－ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体の両方で操作し得る。凍結保存されたＣＤ３４^＋ＨＳＣを、解凍し、レトロネクチンでコーティングされたフラスコにおいて、１％のＨＡＳおよびＴＰＯ／ＦＬＴ３Ｌ／ＳＣＦを補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５血清フリー培地中で１２時間培養し、続いて、さらに８時間、レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを添加してもよい（Gschweng et al., 2014）。レンチベクター形質導入の２４時間後、細胞を、事前に形成したＣＩＲＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体と混合し、ＬｏｎｚａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して電気穿孔に付され得る。初期研究では、高いレンチベクター形質導入率（細胞あたりＶＣＮ＝１～３で＞５０％の形質導入率；図８Ｂ）および高いＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現の欠乏（１ラウンドの電気穿孔後におよそ６０％のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩダブル陰性細胞；図８Ｃ）を、無作為のドナー由来のＣＤ３４^＋ＨＳＣを使用して達成した。効率性を改善するために遺伝子編集手順をさらに最適化することができる。評価パラメーターは、細胞生存率、Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定される欠失（インデル）頻度（オンターゲット効率）、ならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ部位を標的とする次世代配列決定（ＮＧＳ）（Tsaiet al., 2015）、フローサイトメトリーによるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現、ならびにコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定される編集されたＨＳＣの造血機能を含み得る。ＨＳＣの３０～５０％の三重遺伝子編集効率を達成することができ、初期研究では、ＡＴＯ培養後に、インプットＨＳＣあたりおよそ１００個のｉＮＫＴ細胞を生じさせることができる（図３）。

^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の産生。２段階のＡＴＯ－αＧＣｉｎｖｉｔｒｏ系において、レンチベクターおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ｇＲＮＡで二重に操作されたＨＳＣを培養して、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を産生させることができる。段階１において、遺伝子操作されたＨＳＣを、標準プロトコールに従って、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養を経てｉＮＫＴ細胞に分化させる（図８Ａ）（Seet et al., 2017）。ＡＴＯは、ＨＳＣ（１×１０^４個）および照射された（８０Ｇｙ）ＭＳ５－ｈＤＬＬ１間質細胞（１．５×１０^５個）の混合物を０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌトランスウェルインサート上の液滴形態として含有する細胞スラリー（５μｌ）をピペッティングすること、続いて、インサートを１ｍｌのＲＢ２７培地を含有する６ウェルプレートに配置することを含み（Seetet al., 2017）、培地は、８週間、４日ごとに交換される（Seet et al., 2017）。段階１からの総回収物は、細胞の混合物を含有すると予想される。ＭＡＣＳ選別（２Ｍ２／Ｔｕ３９ｍＡｂ媒介陰性選択、続いて６Ｂ１１ｍＡｂ媒介陽性選択）により^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を精製する精製ステップを行うことができる（図８Ｄ）。このＭＡＣＳ選別戦略の有効性を示す初期研究（図８Ｅおよび８Ｆ）を終了する。次いで、精製された^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は段階２の培養に入り、照射された適合したドナーＣＤ３４^－ＰＢＭＣ（ＡＰＣとして）上にロードされたαＧＣ、ならびにＩＬ－７およびＩＬ－１５の補充により刺激された（図８Ａ）。初期研究（図３）に基づいて、およそ１０^１０個スケールの^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞（純度＞９９％）が、ＨＳＣから開始して１×１０^６個ごとから産生し得、単一の無作為なドナーのＨＳＣからおよそ１０^１２個の純粋で均質な^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞製品を与える（図８Ａ）。次いで、得られた^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を凍結保存して、前臨床特徴付けのために準備を整え得る。
Ｇ．^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の特徴付け

同一性／活性／純度。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞製品の純度、表現型および機能性を、事前に確立したフローサイトメトリーアッセイを使用して研究することができる（図４）。具体的な場合では、純度が＞９９％の^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞（ｈＴＣＲαβ^＋６Ｂ１１^＋ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ^ｎｅｇとしてゲート開閉）が達成される。具体的な実施形態では、これらの^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、典型的なｉＮＫＴ細胞表現型（ｈＣＤ４５ＲＯ^ｈｉｈＣＤ１６１^ｈｉｈＣＤ４^＋／－ｈＣＤ８^＋／－）を示し、対立遺伝子消失に起因して検出可能な内在性ＴＣＲを発現せず（Seet et al., 2017；Smith et al., 2015；Giannoni et al., 2013）、過剰量のエフェクターサイトカイン（ＩＦＮ－γ）および細胞傷害性分子（グランザイムＢ、パーフォリン）を産生することによってＰＢＭＣ／αＧＣ刺激に応答する（図４）（Wataraiet al., 2008）。

薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）。腫瘍担持ＮＳＧマウスにこれらの細胞を養子移入することによって、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の生体内分布およびｉｎｖｉｖｏ動態を研究することができる。例えば、事前に確立されたＡ３７５ヒト黒色腫固形腫瘍異種移植モデルを使用してもよい（図５Ｈ）。フローサイトメトリー分析を行って、組織中の^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の存在を研究し得る。確立されたプロトコールに従って、ＰＥＴイメージングを行って、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の全身分布を研究し得る（図７）。初期研究に基づいて、具体的な実施形態では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、養子移入後数時間にわたって腫瘍担持動物中で持続することができ、リンパ系臓器（脾臓および骨髄）に戻ることができ、最も重要なことには、固形腫瘍に輸送および浸潤し得る（図５Ｉ～５Ｋ）。

作用機構（ＭＯＡ）。ｉＮＫＴ細胞は、複数の機構により腫瘍を標的にすることができる：１）それらはｉＮＫＴＴＣＲ刺激によりＣＤ１ｄ^＋腫瘍細胞を直接死滅させることができる、ならびに２）それらは、腫瘍関連抗原提示細胞（ＣＤ１ｄを定常的に発現する）によって提示される腫瘍由来糖脂質を認識し、次いで、ＮＫ細胞およびＣＴＬのような下流のエフェクター細胞を活性化して、これらのＣＤ１ｄ^－腫瘍細胞を死滅させることにより、ＣＤ１ｄ^－腫瘍細胞を間接的に標的とすることができる（図９Ａ）（Vivier et al., 2012）。多くのがん細胞は、ｉＮＫＴ細胞を刺激することができる糖脂質を産生し、それにもかかわらず、そのような「変更された」糖脂質の性質は解明されないままである（Bendelacet al., 2007）。ｉｎｖｉｔｒｏ直接腫瘍死滅アッセイを使用して（図９Ｂ）、治療薬代替物であるＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞およびＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞は、ＣＤ１ｄ／ＴＣＲ依存性の様式で、腫瘍細胞を直接死滅させた（図９Ｃ）。ｉｎｖｉｔｒｏ混合培養アッセイを使用して（図９Ｃ）、ＡＰＣによって刺激されたＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞が、ＮＫ細胞を活性化して、ＣＤ１ｄ^－ＨＬＡ－Ｉ^－／－Ｋ５６２ヒト骨髄性白血病細胞を死滅させることができたことをさらに示した（図９Ｅ）。これらの事前に確立されたアッセイを利用して、腫瘍細胞の^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞標的化を研究し得る。特定の実施形態では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、直接死滅とアジュバント効果の両方により腫瘍を標的とすることができる。

有効性。事前に確立されたｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイを使用して、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍死滅有効性を研究することができる（図５）。例えば、ヒト血液がんモデル（ＭＭ１．Ｓ多発性骨髄腫）とヒト固形腫瘍モデル（Ａ３７５黒色腫）の両方を使用してもよい（図５）。ある特定の実施形態では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、治療薬代替物であるＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞およびＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞について観察されたものと同様に、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで、ＭＭ１．ＳとＡ３７５腫瘍細胞の両方を有効に死滅させることができる（図５）。

安全性。例として、３つの態様：ａ）一般毒性／腫瘍形成性、ｂ）免疫原性およびｃ）自殺遺伝子「死滅スイッチ」に対する^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ養子療法の安全性を研究することができる。１）^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の長期のＧｖＨＤ（レシピエント動物の組織に対する）、毒性学および腫瘍形成性を、確立されたプロトコールに従って、これらの細胞をＮＳＧマウスに養子移入すること、および最終病理学的分析によって終了する２０週間の期間にわたってレシピエントマウスをモニタリングすることにより研究し得る（図６）。ＧｖＨＤなし、毒性なし、および腫瘍形成性なしが予想される（図６）。２）免疫細胞に基づく養子療法について、常に２つの免疫原性の懸念：ａ）移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）応答、およびｂ）宿主対移植片（ＨｖＧ）応答が存在する。操作された安全管理戦略は、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞製品についての可能性があるＧｖＨＤおよびＨｖＧのリスクを軽減する（図１０Ａ）。可能性があるＧｖＨＤおよびＨｖＧ応答は、確立されたｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ（図１０Ｂおよび１０Ｄ）およびｉｎｖｉｖｏの混合リンパ球養子移入（ＭＬＴ）アッセイ（図１０Ｇ）を使用して研究される。ｉｎｖｉｔｒｏのＭＬＣアッセイの読み出し情報は、ＥＬＩＳＡによって分析されるＩＦＮ－γ産生であり得るが、ｉｎｖｉｖｏのＭＬＴアッセイの読み出し情報は、出血およびフローサイトメトリー（ＧｖＨＤ応答の測定としての不適合ドナーＰＢＭＣの死滅、またはＨｖＧ応答の測定としての^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の死滅のいずれか）によって分析される標的化細胞の消失であり得る。初期研究に基づいて、具体的な実施形態では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、宿主動物組織に対するＧｖＨＤ応答を誘導せず（図６）、不適合ドナーＰＢＭＣに対するＧｖＨＤ応答を誘導しない（図１０Ｃ）。具体的な実施形態では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ＨｖＧ誘導消失に対して抵抗性である。初期研究は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現と同等に、ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＡＴＯ細胞が、既に、不適合ドナーＰＢＭＣＴ細胞についての弱い標的であったことを示した（図１０Ｅ）。具体的な場合では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞に対するＴ細胞媒介ＨｖＧ応答の完全な欠如がある。興味深いことに、初期研究は、代替物であるＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞が、不適合ドナーＮＫ細胞による死滅に対して抵抗性であったことを示した（図１０Ｆ）。一部の場合では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞におけるＨＬＡ－Ｉ発現の欠如は、これらの細胞をＮＫ死滅に対してより感受性にし得る。したがって、最終^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞製品を試験し得る。３）確立されたプロトコールに従って、ＧＣＶ投与によるレシピエントＮＳＧマウスにおける^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の消失を研究することができる（図７）。初期研究に基づいて、ｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子は、安全性を必要とする場合において、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を消失させるための強力な「死滅スイッチ」として機能し得る。

併用療法。併用免疫療法について^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を調べることができる。特に、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ養子療法をチェックポイント遮断療法（例えば、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４遮断）と組み合わせる相乗的治療効果が存在する（Pilones et al., 2012；Durgan et al., 2011）。事前に確立されたヒト黒色腫固形腫瘍モデル（Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ）を使用し得る（図１１Ａ）。次世代の汎用ＣＡＲ－ｉＮＫＴ療法およびＴＣＲ－ｉＮＫＴ療法（^ＵＨＳＣＣＡＲ－ｉＮＫＴ療法および^ＵＨＳＣＴＣＲ－ｉＮＫＴ療法として表す）のために、がんを標的とするＣＡＲ（キメラ抗原受容体）またはＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を発現するように^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞をさらに操作することができる（Oberschmidtet al., 2017；Bollino and Webb, 2017；Heczey et al., 2014；Chodon et al., 2014）。^ＵＨＳＣＣＡＲ－ｉＮＫＴ療法の研究のために、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、ＣＤ１９－ＣＡＲ遺伝子をコードするレンチベクターで形質導入し得る（図１１Ｂ）。その一方で、ヒト黒色腫細胞系Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧは、例として、ヒトＣＤ１９抗原を過剰発現するようにさらに操作され得る（図１１Ｃ）。^ＵＨＳＣＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性は、Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ｈＣＤ１９－ＦＧ腫瘍異種移植モデルを使用して研究され得る（図１１Ｄ）。^ＵＨＳＣＴＣＲ－ｉＮＫＴ療法の研究のために、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ遺伝子をコードするレンチベクターで形質導入し得る（図１１Ｅ）。Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系は、ヒトＨＬＡ－Ａ２分子およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を過剰発現するようにさらに操作されてもよい（図１１Ｆ）。^ＵＨＳＣＴＣＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍有効性は、Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－Ａ２／ＥＳＯ－ＦＧ腫瘍異種移植モデルを使用して研究され得る（図１１Ｇ）。
Ｈ．薬理学の実施形態

^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ療法についての薬物機構。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴは、少なくとも一部の場合では、１）レンチウイルスベクターを介してｉＮＫＴＴＣＲを発現し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集を介してＨＬＡをノックアウトするドナーＨＳＣの遺伝子改変、２）ＡＴＯ培養を介したｉＮＫＴ細胞へのｉｎｖｉｔｒｏの分化、３）ｉｎｖｉｔｒｏのｉＮＫＴ細胞の増幅、ならびに４）製剤化および凍結保存によって作製される細胞製品である。患者に注入されたら、この細胞製品は、少なくとも一部の実施形態では、腫瘍細胞を標的とし、根絶する複数の機構を用いることができる。注入された細胞は、直接認識することができ、細胞傷害性によりＣＤ１ｄ^＋腫瘍細胞を死滅させることができる。それらは、ＩＦＮ－γなどのサイトカインを分泌して、ＨＬＡ陰性の腫瘍細胞を死滅させるＮＫ細胞を活性化することができ、次に細胞傷害性Ｔ細胞を刺激してＨＬＡ陽性の腫瘍細胞を死滅させるＤＣを活性化することもできる。したがって、一連のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究を、がん療法のためのこの細胞製品の薬理学的有効性を実証するために利用し得る。

ｉｎｖｉｔｒｏの表面および機能的特徴付け。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を作製するための効率的なプロトコールを本明細書に提供する。Ｂ２Ｍのノックアウトを介したクラスＩＨＬＡの発現を除去するためのＨＳＣの効率的な遺伝子編集も実証する。マルチプレックスな編集のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の利点を得て、検証されたｇＲＮＡ配列（Abrahimi et al., 2015）を使用して、ＨＬＡ－ＩＩ発現の重要な調節因子であるクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）（Steimleet al., 1994）についての遺伝子のノックアウトを介してクラスＩＩＨＬＡ発現を同時に妨害することもできる。したがって、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ発現を妨害するこの遺伝子編集ステップ、ならびにマイクロビーズ精製ステップを組み込むことで、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を作製することができる（詳細は、本明細書の他の箇所で提供する）。フローサイトメトリー分析を使用して、これらの操作されたｉＮＫＴ細胞の純度および表面表現型を測定し得る。細胞の純度は、ＴＣＲＶα２４－Ｊα１８（６Ｂ１１）^＋ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ^ｎｅｇによって特徴付けられ得る。少なくとも一部の場合では、このｉＮＫＴ細胞集団は、メモリーおよびＮＫ表現型を示すＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ１６１^＋であるはずであり、ＣＤ４^＋ＣＤ８^－（ＣＤ４シングル陽性）、ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（ＣＤ８シングル陽性）およびＣＤ４^－ＣＤ８^－（ダブル陰性、ＤＮ）を含有する（Kronenbergand Gapin, 2002）。ＣＤ６２Ｌ発現を分析することができる。最近の研究により、その発現がｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏの持続性およびそれらの抗腫瘍活性に関連することが示されたからである（Tianet al., 2016）。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴのこれらの表現型をＰＢＭＣ由来のｉＮＫＴの表現型と比較することができる。ＲＮＡｓｅｑを用いて、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣｉＮＫＴ細胞に関する比較遺伝子発現分析を行い得る。

ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴをベンチマーク対照として使用して^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴの機能的性質を評価するためにＩＦＮ－γ産生および細胞傷害性アッセイを使用することができる。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、αＧａｌＣｅｒがパルス投与された照射されたＰＢＭＣで刺激し得、１日の刺激から回収された上清は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡに付される（Smith et al,. 2015）。ＩＦＮ－γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）を、６時間の刺激後のｉＮＫＴ細胞において、同様に行い得る。細胞傷害性アッセイを、エフェクター^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、ルシフェラーゼおよびＧＦＰを発現するように操作されたαＧＣがロードされたＡ３７５．ＣＤ１ｄ標的細胞とともに４時間インキュベートすることによって実施してもよく、細胞傷害性を、その発光強度についてプレートリーダーによって測定し得る。ｓｒ３９ＴＫは、ＰＥＴ／自殺遺伝子として導入されるので、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴをガンシクロビル（ＧＣＶ）とともにインキュベートすることによってその機能を検証することができ、細胞生存率は、ＭＴＴアッセイおよびアネキシンＶに基づくフローサイトメトリーアッセイによって測定され得る。

薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究。ＰＫ／ＰＤ研究は、動物モデルにおいてｉｎｖｉｖｏで次のことを決定し得る：１）注入された^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴの増幅動態および持続性；２）さまざまな組織／臓器における^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴの生体内分布；３）^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴの、腫瘍に輸送される能力およびこの濾過がどのように腫瘍成長に関係するか。Ａ３７５．ＣＤ１ｄ（Ａ３７５．ＣＤ１ｄ）腫瘍を担持する免疫不全ＮＳＧマウスを、固形腫瘍動物モデルとして用い得る。研究設計を図１１において概要を述べる。細胞用量群の２つの例（１×１０^６個および１０×１０^６個；ｎ＝８）を検討し得る。腫瘍は、－４日目に接種（ｓ．ｃ．）され、ベースラインのＰＥＴイメージングおよび出血を０日目に実施する。その後、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注入し、１）７および２１日目に生きている動物におけるＰＥＴイメージング；２）７、１４および２１日目に定期的な出血；３）２１日目における動物の終止後のエンドポイントの組織回収によってモニターする。さまざまな出血から収集された細胞を、フローサイトメトリーによって分析してもよく、具体的な実施形態では、ｉＮＫＴ細胞はＴＣＲαβ^＋６Ｂ１１^＋である。ｉＮＫＴサブセットが経時的にどのように変化するかを調べるために、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１６１、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４／ＣＤ８などの他のマーカーの発現を調べることができる。ｓｒ３９ＴＫを介したＰＥＴイメージングは、腫瘍中、および骨、肝臓、脾臓、胸腺などのような他の組織／臓器中のｉＮＫＴ細胞の存在を追跡するのを可能にする。研究終了時に、腫瘍、および脾臓、肝臓、脳、心臓、腎臓、肺、胃、骨髄、卵巣、腸などを含むマウスの組織を、ｑＰＣＲ分析のために回収して、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の分布を調べる。

ｉｎｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性。ｉｎｖｉｖｏの薬理学的応答を、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の増大する用量（１×１０^６、５×１０^６、１０×１０^６個）で腫瘍担持ＮＳＧマウスを処置することによって測定し（群あたりｎ＝８）；ＰＢＳによる処置は、対照として含まれる。２つの腫瘍モデルを例として利用し得る。Ａ３７５．ＣＤ１ｄ（１×１０^６個ｓ．ｃ．）を固形腫瘍モデルとして使用し得、ＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ（５×１０^６個ｉ．ｖ．）を血液系悪性腫瘍モデルとして使用し得る。腫瘍成長は、サイズ（Ａ３７５．ＣＤ１ｄ）または生物発光イメージング（ＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ）のいずれかを測定することによってモニターされる。抗腫瘍免疫応答は、ＰＥＴイメージング、定期的な出血、およびエンドポイントでの腫瘍回収とそれに続くフローサイトメトリーおよびｑＰＣＲによって測定される。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ処置に応答した腫瘍成長の阻害は、提案された^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞療法の治療有効性を示す。腫瘍阻害とｉＮＫＴ用量との相関は、ｉＮＫＴ細胞の治療的役割を確認し、ヒト療法のための有効な治療域を示すことができる。腫瘍に応答するｉＮＫＴ細胞の検出は、ｉｎｖｉｖｏでのこれらの細胞の薬理学的抗腫瘍活性を実証する。

作用機構（ＭＯＡ）。ｉＮＫＴ細胞は、直接死滅させることによって、または腫瘍を消失させるようにＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞を指示するＩＦＮ－γの大量の放出によるかのいずれかで、腫瘍細胞を標的とすることが公知である（Fujii et al., 2013）。ｉｎｖｉｔｒｏの薬理学研究は、直接細胞傷害性の証拠を提供する。ここで、ｉｎｖｉｖｏでの抗腫瘍反応性の支援におけるＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の可能性がある役割を検討することができる。腫瘍担持ＮＳＧマウス（Ａ３７５．ＣＤ１ｄまたはＭＭ．１Ｓ．Ｌｕｃ）に、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴを単独で（上記のｉｎｖｉｖｏ研究に基づいて選択される用量）、またはＰＢＭＣ（不適合ドナー、５×１０^６個）と組み合わせてのいずれかで注入され得、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴがＭＨＣ陰性であるため、同種異系の免疫応答は、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴおよび無関係のＰＢＭＣの間で予想されない。腫瘍成長を、モニターし、ＰＢＭＣありの群およびＰＢＭＣなしの群の間で比較し得る（群あたりｎ＝８）。より高い抗腫瘍応答が併用群から観察される場合、少なくとも具体的な実施形態では、ＰＢＭＣ中の成分、おそらくＮＫ細胞および／またはＣＤ８Ｔ細胞が、治療有効性をブーストする役割を果たすことを示す。それらの個々の役割をさらに決定するために、ＮＫ（ＣＤ５６ビーズを介して）、ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８ビーズを介して）または骨髄（ＣＤ１４ビーズを介して）細胞が枯渇したＰＢＭＣを、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と一緒に、腫瘍担持マウスに同時注入する。ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント阻害剤は、ｉＮＫＴ細胞の機能を調節すると示唆されている（Piloneset al., 2012；Durgan et al., 2011）。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ療法への抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４処置を追加することにより、例えば、これらの分子がどのように^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ療法をモジュレートするかを理解することができ、併用がん療法の設計に対する有益な指針を提供することができる。
Ｉ．化学、製造および管理の実施形態

ＣＭＣの概要。ある特定の実施形態では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴの製造は、１）Ｇ－ＣＳＦ動員ｌｅｕｋｏｐａｋの収集；２）ＧＣＳＦ－ｌｅｕｋｏｐａｋのＣＤ３４^＋ＨＳＣへの精製；３）ＨＳＣのレンチウイルスベクターのレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫによる形質導入；４）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を介したＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡの遺伝子編集；５）ＡＴＯを介したｉＮＫＴ細胞へのｉｎｖｉｔｒｏ分化；６）ｉＮＫＴ細胞の精製；７）ｉｎｖｉｔｒｏ細胞増幅；８）細胞の収集、製剤化および凍結保存を含む（図１４）。例として、２つの製剤原料（レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターおよび^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞）が存在し、最終の薬物製品は、少なくとも一部の場合では、注入バッグ中の製剤化および凍結保存された^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴである。
１．ベクターの製造

ベクター構造。ＨＳＣのｉＮＫＴ細胞への遺伝子操作のためのあるベクターは、ヒトｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子をｓｒ３９ＴＫＰＥＴイメージング／自殺遺伝子と一緒にコードする、ＨＩＶ－１に由来するレンチウイルスベクターのレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫである（図１３）。この第３世代の自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターの重要な成分は、１）３’自己不活性化する長い末端反復（ΔＬＴＲ）；２）シグナルをパッケージングするΨ領域ベクターゲノム；３）スプライシングされていないベクターＲＮＡの核外輸送を増強するＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）；４）ベクターゲノムの核内輸送を促進するセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）；５）ヒトｉＮＫＴＴＣＲのα鎖遺伝子（ＴＣＲα）およびβ鎖遺伝子（ＴＣＲβ）、ならびにマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来の内部プロモーターによって駆動されるＰＥＴ／自殺遺伝子ｓｒ３９ＴＫ（Gschweng et al., 2014）の発現カセットである。ｉＮＫＴのＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ならびにｓｒ３９ＴＫ遺伝子はすべてコドン最適化し、２Ａ自己切断配列（Ｔ２ＡおよびＰ２Ａ）によって連結して、それらの最適な共発現を達成する（Gschwenget al., 2014）。

ベクターの品質管理。一連のＱＣアッセイを行って、ベクター製品が高品質であることを保証し得る。これらの標準アッセイ、例えば、ベクター同定、ベクターの物理的力価およびベクターの純度（無菌性、マイコプラズマ、ウイルス混入、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）試験、エンドトキシン、残留ＤＮＡおよびベンゾナーゼ）を、ＩＵＶＰＦで実施し、分析証明書（ＣＯＡ）で提供される。行うことができる追加のＱＣアッセイは、１）形質導入／生物学的力価（ＨＴ２９細胞を連続希釈で形質導入し、ｄｄＰＣＲを行うことによる、≧１×１０^６ＴＵ／ｍｌ）；２）ベクタープロウイルスの完全性（元のベクタープラスミド配列と同じ、形質導入されたＨＴ２９細胞のゲノムＤＮＡのベクター組込み部分を配列決定することによる）；３）ベクターの機能を含む。ベクターの機能は、ヒトＰＢＭＣＴ細胞を形質導入することによって測定され得る（Chodon et al., 2014）。ｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子の発現は、ｉＮＫＴＴＣＲに特異的な６Ｂ１１で染色することによって検出され得る（Montoyaet al., 2007）。発現したｉＮＫＴＴＣＲの機能性は、αＧａｌＣｅｒ刺激に応答するＩＦＮ－γ産生によって分析され得る（Watarai et al,.2008）。ｓｒ３９ＴＫ遺伝子の発現および機能性は、ペンシクロビルアップデートアッセイおよびＧＣＶ死滅アッセイによって分析され得る（Gschweng etal., 2014）。ベクターストック（－８０の冷凍庫中で保管）の安定性は、その形質導入力価を測定することによって、３か月ごとに試験され得る。これらのＱＣアッセイは検証され得る。
２．細胞の製造および製品の製剤化

^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の製造の概要。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞を標的とし、闘う「生きている薬物」として機能する製剤原料の一実施形態である。それらは、遺伝子改変されたドナーＨＳＣのｉｎｖｉｔｒｏ分化および増幅によって作製される。初期データは、研究室スケールでそれらを産生する新規で効率的なプロトコールを実証する。それらを「オフザシェルフ」細胞製品として作製するために、ＧＭＰに適合する製造プロセスを開発し、検証することができる。例として、製造スケールの目標は、バッチあたり１０^１２個の細胞であり、これは、１０００～１０，０００人の患者を処置すると推定される。

細胞製造プロセス。細胞製造プロセスの一実施形態を、規定されたタイムラインおよびそれぞれのプロセスのステップについて重要な「プロセス内管理（ＩＰＣ）」の測定とともに、図１３において概要を述べる。ステップ１は、血液収集設備においてドナーＧ－ＣＳＦ動員ＰＢＳＣを回収することであり、これは、多くの病院において通例の手順になっている（Deotare et al., 2015）。このプロジェクトのためにＨｅｍａＣａｒｅからＬｅｕｋｏｐａｋ中の新鮮なＰＢＳＣを入手することができ、ＨｅｍａＣａｒｅは、ＩＲＢに承認された収集プロトコールおよびドナーの承諾を有し、臨床試験および市販用製品の製造を支持することができる（ＨｅｍａＣａｒｅからのサポートレターが本出願に含まれる）。ステップ２は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを使用してＰＢＳＣからＣＤ３４^＋ＨＳＣを濃縮することであり、ＵＣＬＡのＧＭＰ施設に設置されたそのようなシステムを使用してこのステップを完了することができ、少なくとも１０^８個のＣＤ３４^＋細胞で得られると予想することができる。ＣＤ３４^－細胞は、同様に、収集され、保管される（ステップ７においてＰＢＭＣフィーダーとして使用され得る）。

ステップ３は、ＨＳＣ培養およびベクター形質導入を含む。ＣＤ３４^＋細胞は、レトロネクチンでコーティングされたフラスコにおいて、１％のＨＡＳ（ＵＳＰ）および成長因子カクテル（ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンドおよびｔｐｏ；それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）が補充されたＸ－ＶＩＶＯ１５培地中で１２時間培養され、続いて、さらに８時間、レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを添加する（Gschweng et al., 2014）。ベクター組込みコピー（ＶＣＮ）を、形質導入された細胞についてのメチルセルロースアッセイにおいて形成されたおよそ５０コロニーをサンプリングすることによって測定し、ｄｄＰＣＲを使用して、細胞あたりの平均ベクターコピー数を決定することができる（Noltaet al., 1994）。少なくとも一部の場合では、細胞あたりＶＣＮ＝１～３で＞５０％の形質導入を日常的に達成することができる。

ステップ４は、強力なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９マルチプレックス遺伝子編集方法を利用して、ＨＳＣ内のＢ２ＭとＣＩＩＴＡの両方のゲノム遺伝子座を標的とし、それらの遺伝子発現を妨害することであり（Ren et al., 2017；Liu et al., 2017）、編集されたＨＳＣに由来するｉＮＫＴ細胞は、ＭＨＣ／ＨＬＡ発現を欠くことになり、それにより宿主免疫系による拒絶を回避する。初期データは、Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡの電気穿孔を介した高効率（フロー分析により、およそ７５％）のＣＤ３４^＋ＨＳＣに対するＢ２Ｍの破壊の成功を実証している。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡダブルノックアウトは、ＲＮＰの混合物（Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡおよびＣａｓ９／ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ（Abrahimiet al., 2015））の電気穿孔によって達成され得る。２つのＲＮＰの比、電気穿孔の前の幹細胞の培養時間（形質導入後２４、４８または７２時間）などの電気穿孔のパラメーターを変えることによって、このプロセスを最適化および検証することができ（Gundryet al., 2016）、「オフターゲット」効果を最小化するために、ＩＤＴ由来の高忠実度のＣａｓ９タンパク質（Slaymaker et al., 2016；Tsaiand Joung, 2016）を使用することができる。評価パラメーターは、例えば、生存率、Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定される欠失（インデル）頻度（オンターゲット効率）、ならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ部位を標的とする次世代配列決定（ＮＧＳ）、フローサイトメトリーによるＭＨＣ発現、ならびにコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定される編集されたＨＳＣの造血機能であり得る。

ステップ５は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養を介して改変ＣＤ３４^＋ＨＳＣをｉＮＫＴ細胞にｉｎｖｉｔｒｏで分化することである（Seet et al., 2017）。初期研究は、機能性ｉＮＫＴ細胞が、ｉＮＫＴＴＣＲを発現するように操作されたＨＳＣから効率的に作製され得ることを示している。このデータを踏まえて、１０^８個の改変ＣＤ３４^＋ＨＳＣから１０^１０個のｉＮＫＴ細胞を産生するための８週間のＧＭＰ適合ＡＴＯ培養プロセスを試験および検証することができる。ＡＴＯは、ＨＳＣ（５×１０^４個）および照射された（８０Ｇｙ）ＭＳ５－ｈＤＬＬ１間質細胞（１０^６個）の混合物を０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌトランスウェルインサート上の液滴形態として含有する細胞スラリー（５μｌ）をピペッティングすること、続いて、インサートを１ｍｌのＲＢ２７培地を含有する６ウェルプレートに配置することを含み（Seetet al., 2017）、培地は、８週間、４日ごとに交換することができる。インサートあたり３つのＡＴＯを考慮すると、それぞれのバッチ産生についておよそ１７０の６ウェルプレートが必要であり得る。ＡＴＯ液滴のプレーティングおよび培地交換のためにバイオセーフティーキャビネットに設置された自動プログラム調節可能なピペッティング／分注システム（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆからのｅｐＭｏｎｔｉｏｎ５０７０ｆ）が使用され得、２時間の操作が、それぞれのラウンドの１７０プレートを終了するために必要であり得る。ＡＴＯ培養の最後に、ｉＮＫＴ細胞を回収し、特徴付ける。一例として、ＡＴＯの成分は、ヒトＤＬＬ１を発現するためのレンチウイルス形質導入によって構築され、続いて細胞選別されたＭＳ５－ｈＤＬＬ１間質細胞系である。ＧＭＰプロセスの一実施形態のための調製では、このポリクローナル細胞集団において単一細胞クローン選択プロセスを行って、いくつかのクローンＭＳ５－ｈＤＬＬ１細胞系を確立し、そこから効率的なものを選択することができ（ＡＴＯ培養によって評価される）、それを使用してマスター細胞バンクを作製することができる。認証されると、このバンクは、将来の臨床グレードのＡＴＯ培養のための照射された間質細胞を供給するために使用され得る。

ステップ６は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを使用して、ＡＴＯ由来ｉＮＫＴ細胞を精製することである。この精製ステップは、ＭＨＣＩ^＋およびＭＨＣＩＩ^＋細胞を枯渇させること、およびｉＮＫＴ^＋細胞を濃縮することである。抗ＭＨＣＩおよび抗ＭＨＣＩＩビーズは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ビオチンビーズを市販のビオチン化抗Ｂ２Ｍ（クローン２Ｍ２）、抗ＭＨＣＩ（クローンＷ６／３２、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）、抗ＭＨＣＩＩ（クローンＴｕ３９、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）、および抗ＴＣＲＶα２４－Ｊα１８（クローン６Ｂ１１）抗体とともにインキュベートすることによって調製され得、６Ｂ１１抗体で直接コーティングされたマイクロビーズは、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃからも入手可能である。回収したｉＮＫＴ細胞を、抗ＭＨＣビーズ混合物によって標識し、２回洗浄し、ＭＨＣＩ^＋および／またはＭＨＣＩＩ^＋細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ枯渇プログラムを使用して枯渇させ、必要により、この枯渇ステップを繰り返して、残ったＭＨＣ^＋細胞をさらに除去することができる。その後、ｉＮＫＴ細胞は、標準の抗ｉＮＫＴビーズおよびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ濃縮プログラムを使用して、さらに精製される。細胞の純度は、フローサイトメトリーによって測定され得る。

ステップ７は、精製されたｉＮＫＴ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで増幅させることである。１０^１０個の細胞から出発して、既に検証されたＰＢＭＣフィーダーに基づくｉｎｖｉｔｒｏ増幅プロトコールを使用して、１０^１２個のｉＮＫＴ細胞に増幅することができる（Yamasaki et al., 2011；Heczey et al., 2014）。この細胞増幅についてＧ－Ｒｅｘに基づくバイオプロセスを評価することができる。Ｇ－Ｒｅｘは、より効率的なガス交換を可能にする、底にガス透過性膜を有する細胞成長フラスコであり、Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍフラスコは、１０日で１００倍の細胞増幅を支持する能力を有する（Veraet al., 2010；Bajgain et al., 2014；Jin et al., 2012）。ステップ１からの保管されたＣＤ３４^－細胞（フィーダー細胞として使用される）を解凍し、αＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍｌ）をパルス投与し、照射した（４０Ｇｙ）。ｉＮＫＴ細胞を、照射されたフィーダー細胞と混合し（１：４の比）、Ｇ－Ｒｅｘフラスコに播種し（それぞれ１．２５×１０^８個のｉＮＫＴ、８０フラスコ）、２週間増幅させた。ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ）を２～３日ごとに添加し、１回の培地交換を７日目に行い、すべての培地操作は、蠕動ポンプによって達成され得る。この増幅プロセスは、類似のＰＢＭＣフィーダーに基づく増幅手順（迅速増幅プロトコールと称される）が既に多くの臨床試験のための治療用Ｔ細胞を産生するために利用されているので、ＧＭＰ適合であるはずである（Dudleyet al., 2008；Rosenberg et al., 2008）。

ステップ８は、ステップ７からの回収されたｉＮＫＴ細胞（活性薬物成分）を直接注入のための細胞懸濁液に製剤化することである。少なくとも３ラウンドの大規模な洗浄後、ステップ７からの細胞を計数し、血漿－ＬｙｔｅＡ注射（３１．２５％ｖ／ｖ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射（３１．２５％ｖ／ｖ）、ヒトアルブミン（２０％ｖ／ｖ）、デキストロース注射中のデキストラン４０（１０％、ｖ／ｖ）およびＣｒｙｏｓｅｒｖＤＭＳＯ（７．５％、ｖ／ｖ）で構成される注入／低温保管適合溶液（１０^７～１０^８個細胞／ｍｌ）に懸濁させ、この溶液は、Ｎｏｖａｒｔｉｓからの承認されたＴ細胞製品のチサゲンレクロイセルを製剤化するために使用されている（Grupp et al., 2013）。ＦＤＡで承認された凍結バッグ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃからのＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグなど）に充填したら、製品を、管理された速度のフリーザー中で凍結し、液体窒素フリーザー中で保管し得る。生存率および回収を測定することにより検証および／または最適化研究を行って、この製剤が^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞製品のために適切であることを保証することができる。

バイオプロセスおよび製品のための品質管理。細胞計数、生存率、無菌性、マイコプラズマ、同一性、純度、ＶＣＮなどのようなさまざまなＩＰＣアッセイを、提案されたバイオプロセスに組み込んで、高品質の製造を保証し得る。提案された製品リリース試験は、１）外観（色、乳白度）；２）細胞生存率および計数；３）ｉＮＫＴＴＣＲのためのｑＰＣＲによる同一性およびＶＣＮ；４）ｉＮＫＴ陽性およびＢ２Ｍ陰性による純度；５）エンドトキシン；６）無菌性；７）マイコプラズマ；８）αＧａｌＣｅｒ刺激に応答してのＩＦＮ－γ放出によって測定される効力；９）ＲＣＬ（複製可能なレンチウイルス）を含む（Cornetta et al., 2011）。これらのアッセイのほとんどは、検証され得るこの製品に固有の標準の生物学的アッセイまたは特異的アッセイのいずれかである。製品の安定性試験は、ＬＮ保管されたバッグを定期的に解凍し、それらの細胞生存率、純度、回収、効力（ＩＦＮ－γ放出）および無菌性を測定することによって行われ得る。特定の実施形態では、製品は、少なくとも１年間安定である。
３．安全性の実施形態

ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの腫瘍形成性およびｉｎｖｉｖｏの急性毒性。形質転換または自己増殖のための^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の潜在力を評価することができる。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、１）Ｇバンド核型分析、これは、正常な核型が維持されているかどうかを決定するために、αＧａｌＣｅｒ再刺激された活発に分裂している^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞において実施され得る；２）細胞製品の恒常的増殖（刺激なし）、これは、細胞標識ＰＫＨ色素（αＧａｌＣｅｒ刺激細胞群を増殖の陽性対照として使用する）の希釈物のフローサイトメトリー分析によって測定され得る（Hurton et al., 2016）；３）軟寒天コロニー形成アッセイ（Horibata et al., 2015）、これはｉＮＫＴ細胞製品の足場非依存性成長能を評価するために用いられ得る、を含む。１０^７個のｉＮＫＴ細胞を注入されたＮＳＧナイーブマウスを使用して、任意の異常についてさまざまな回収された組織／臓器を分析することによって、ならびに任意の異常な増殖について、血液、脾臓、骨髄および肝臓中のｉＮＫＴ細胞の存在を測定することによって、ｉｎｖｉｖｏの腫瘍形成性および長期毒性（４～６か月、ｎ＝６）を調べることができ（Hurtonet al., 2016）、対照群は、ＰＢＭＣ－精製ｉＮＫＴ細胞を移入されたマウスであり得る。パイロットのｉｎｖｉｖｏ急性毒性は、低用量（１０^６個）または高用量（１０^７個）のｉＮＫＴ細胞をナイーブＮＳＧマウスに注入することによって行われ得る。次いで、マウス（ｎ＝８）を、体重および飼料摂取における任意の変化、ならびに任意の異常な行動について２週間観察し得る。２週間後、マウスを安楽死させ得、血液を、血液の血液学および血液の血清化学分析（ＵＣＳＤｍｕｒｉｎｅｈｅｍａｔｏｌｏｇｙａｎｄｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｃｏｒｅｌａｂ）のために収集し得、さまざまなマウス組織を回収し、病理学的分析のためにＵＣＬＡｃｏｒｅに提出し得る。

ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの同種異系移植に関連する安全性試験。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ療法は、同種異系移植の性質のものであり、したがって、その関連する安全性を評価し得る。同種異系反応の可能性は、最初に、標準の２方向のｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイによって決定され得る（Bromelow et al., 2001）。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、不適合ドナーＰＢＭＣ（少なくとも３人の異なるドナーバッチ）と混合し得、Ｔ細胞増殖を、ＢｒｄＵ組み込みアッセイによって測定し得る。ＧｖＨＤの研究について、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴは、レスポンダー細胞であり得、ＰＢＭＣは、刺激細胞であり得、逆の設定を使用して、ＨｖＧ応答性が検討され得、刺激細胞は、インキュベーションの前に照射される。ｉｎｖｉｖｏのＧｖＨＤおよびＨｖＧ反応を評価するためにｉｎｖｉｖｏのＮＳＧマウスモデルを活用することもできる。マウスに、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ（５×１０^６個、群１）、ヒトＰＢＭＣ（５×１０^６個、群２）、または組合せ（それぞれ５×１０^６個、群３）を注入し得る。マウスは、毒性の任意の徴候（体重減少、行動など）について２か月間観察され得る。隔週のマウスの出血からの単核細胞を、ヒトＴ細胞活性化マーカー（ｈＣＤ６９およびｈＣＤ４４の上方調節、ｈＣＤ６２Ｌの下方調節）について分析し得、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、それぞれ、ｈＣＤ４５^＋６Ｂ１１^＋、ｈＣＤ４５^＋６Ｂ１１^－ＴＣＲαβ^＋ＣＤ８^＋およびｈＣＤ４５^＋６Ｂ１１^－ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４^＋によって同定され得る。群１および２を比較すると、群３のマウスにおけるｉＮＫＴ細胞の活性化の欠如およびＰＢＭＣの枯渇の欠如は、ＧｖＨＤ反応の欠如を示し得る一方、群３のマウスにおけるＰＢＭＣＣＤ８／ＣＤ４Ｔ細胞の活性化の欠如および^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の枯渇の欠如は、ＨｖＧ反応の欠如を示し得る。

レンチウイルスベクターの安全性および遺伝子編集に関連するオフターゲット分析。製品のリリース試験として、ＲＣＬアッセイを、患者が複製するウイルスに不注意で曝露されないことを保証するために測定し得る。^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、レンチウイルス組込み部位の配列決定（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌｓＩｎｃ．）のためにそれを提出して、公知のレンチウイルス組込みパターン以外の任意の異常な組込みを検出することもできる。遺伝子編集に関連するオフターゲット効果を分析するために、可能性があるオフターゲット部位を予測し、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のゲノムＤＮＡの標的化再配列決定によってそれらを評価／確認するためにＭＩＴからのＣＲＩＳＰＲ設計ツールを使用することができる。加えて、Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡおよびＣａｓ９／ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡのＲＮＰ、ならびにｄｓＯＤＮタグで電気穿孔されたＫ５６２細胞においてＧＵＩＬＤＥ－ｓｅｑを使用して、オフターゲット部位についての不偏性ゲノムワイドスキャンを行うことができ（Tsai et al., 2015）、次いで、これらのオフターゲット部位を、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞におけるＮＧＳによって分析して、オフターゲット活性の頻度を検出し得る。
（実施例２）
オフザシェルフＩＮＫＴ細胞を操作するための造血幹細胞（ＨＳＣ）手法

多発性骨髄腫（ＭＭ）は、溶骨性骨病変、貧血、高カルシウム血症および腎不全によって特徴付けられる、悪性のモノクローナル形質細胞障害である。これは、世界中の数百万人の人々に影響を与える、２番目に最も一般的な血液系腫瘍である。プロテアソーム阻害剤、免疫調節薬および自己造血幹細胞移植などの新規薬剤は処置を改善しているが、ＭＭは、高い再発率の不治の疾患のままである。２０１９年のみで、３０００人を超えるカリフォルニア州民がＭＭと診断され、１３２０人より多くのカリフォルニア州民がこの疾患で死亡すると推定される。したがって、治癒の可能性を有する新規療法が、この満たされていない医学的必要性に対処するために、緊急に望まれている。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするキメラ抗原受容体で操作されたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の自己移植は、進行中の臨床試験において、再発性／難治性ＭＭの処置について素晴らしい臨床応答を示しており、ＭＭのための４次処置として２０２０年に規制当局の承認が得られると予想される。しかしながら、そのような処置手順は、それぞれの個々の患者からのＴ細胞の収集および製造を必要とし、このタイプの自己療法を、費用がかかり、労働集約的なものにし、必要とするすべてのＭＭ患者に広く送り届けることを困難にする。したがって、幅広いＭＭ患者を処置するために大スケールで製造することができ、容易に流通させることができる同種異系細胞療法は、大きな需要がある。

インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、αβＴリンパ球の小さな下位集団である。これらの免疫細胞は、がんのためのオフザシェルフ細胞療法を開発するためにそれらを理想的な細胞キャリアにするいくつかの固有の特徴を有する：１）それらは、がんの免疫監視において役割を有する；２）それらは、腫瘍抗原および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束性とは独立して腫瘍を標的とする顕著な能力を有する；３）それらは、直接死滅効果およびアジュバント効果により腫瘍細胞を攻撃する複数の機構を活用し得る；４）最も魅力的には、それらは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。しかしながら、同種異系のオフザシェルフｉＮＫＴ細胞製品の開発は、それらの利用可能性によって大きく妨げられ、これらの細胞は、ヒト中で、極めて少数かつ高い可変性であり（ヒト血液中におよそ０．００１～１％）、同種異系ヒトドナーの血液細胞から治療用の数のｉＮＫＴ細胞を産生することを非常に困難にする。したがって、大量のｉＮＫＴ細胞の均質な集団を確実に作製することができる新規の方法は、オフザシェルフｉＮＫＴ細胞療法の開発に極めて重要である。

ｉＮＫＴ細胞数の重大な制限を克服するために、本発明者らは、ｉＮＫＴＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子操作により造血幹細胞（ＨＳＣ）からｉＮＫＴ細胞を作製するための強力な方法を以前に開発している。この革新的な技術は、本発明者らが、がんのための自己の遺伝子操作されたＨＳＣ養子療法を開発するのを可能にした。最近、研究者らは、高効率および高収率でのヒトＨＳＣのＴ細胞へのｉｎｖｉｔｒｏ分化を支持する人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養系を確立する際に別の技術を大発見した。本発明者らは、ＡＴＯのｉｎｖｉｔｒｏ培養系を、顕著な収率でＢＣＭＡＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞にさらに操作することができるヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞を産生するために使用できることを実証し、単一の無作為な健康なドナーから、本発明者らは、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋ＨＳＣを回収し、これらのＨＳＣを、１０^１２個スケールの強力な腫瘍死滅能の均質なＢＣＭＡＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を産生するために利用することができ、これは、１，０００～１０，０００用量の治療用細胞製品に製剤化することができる可能性がある。

治療薬候補の有効性。この実施例では、本発明者らは、治療薬候補として、ＨＳＣで操作された汎用のＢＣＭＡＣＡＲ－ｉＮＫＴ（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞を提案する（図１５）。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の組み込みにより、研究は、ｉｎｖｉｔｒｏでＭＭ腫瘍細胞の強力で直接の死滅（図１８）、および前臨床動物モデルにおいてｉｎｖｉｖｏで腫瘍細胞の完全な根絶（図１９）を実証する。本発明者らは、ＭＭ細胞のＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびｉＮＫＴＴＣＲ媒介死滅の両方の相乗効果も観察した（図１８Ｅ）。データは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ製品が、１）少なくとも、従来型ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に強力であること；２）腫瘍を標的とするための複数の機構を活用することができ、それにより腫瘍抗原回避を軽減すること；３）強い安全性プロファイルを有すること（ＧｖＨＤなし）；ならびに４）高収率で確実に製造することができることを示す。したがって、この同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品は、ＭＭを処置するために有用であり得る。

製造のための間質細胞系ＭＳ５－ｈＤＬＬ１の状態。本発明者らは、この細胞系について多くのｃＧＭＰ適合条件を試験した。この細胞系は、ＳＴＲ分析によって起源の種および系に関して既に認証されている。ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＡｎｉｍａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｅｒｖｉｃｅにより、細胞系は、ＭｏｕｓｅＥｓｓｅｎｔｉａｌＣＬＥＡＲパネルによって、マイコプラズマについて陰性、および感染性疾患について陰性であると試験されている。また、ラット、チャイニーズハムスター、ゴールデンシリアンハムスター、ヒトおよび非ヒト霊長類について種間のコンタミネーションについて陰性であると試験されている。これらの試験結果は、ＧＭＰ製造のための異種フィーダー細胞に関するＦＤＡの声明と一致している。

製造およびプロセス開発。本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞およびＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の増幅のためのＧ－Ｒｅｘバイオリアクターを試験し、現在のデータは、それらが、プロセスについて適合し、増幅の収率と細胞の品質の両方を増強し得ることを示唆する（図１６）。ＧａｔｈｅＲｅｘＬｉｑｕｉｄＨａｎｄｌｉｎｇシステムにより、Ｇ－Ｒｅｘバイオリアクターは、細胞製造のための閉鎖系として動作することができる（図２２）。本発明者らは、ＡＴＯ培養を簡素化するために自動ピペッティングシステム（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆからのｅｐＭｏｔｉｏｎ）も試験する。全体として、ほとんどのプロセスのステップは、商業的スケールの産生のために容易に自動化され得ることが企図される。

サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性のバイオセーフティ評価。最近の知見は、単球およびマクロファージがこれらの反応を誘発するための２つの主な細胞起源であること、ならびにヒトＣＤ３４^＋細胞で再構成された三重トランスジェニック（ヒトＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３）ＮＳＧマウスがＣＲＳおよびＣＡＲ－Ｔ処置によって誘導される神経毒性をモデルし得ることを示唆する。したがって、本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞療法によって処置されるＭＭの状況においてこれらの事象を検討するためにこの動物モデルを使用することを提案し、従来型ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ処置は対照として含まれる。これらの毒性が観察されると、本発明者らは、これらの副作用を軽減するために、トシリズマブ（抗ＩＬ－６Ｒ抗体）またはアナキンラ（ＩＬ－１Ｒアンタゴニスト）との併用療法の使用を企図する。
Ａ．患者集団

群１Ａ：最も最近のレジメンの６０日以内に疾患進行として定義された、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはカーフィルゾミブ）、免疫調節剤（ＩＭｉＤ；例えば、レナリドマイドまたはポマリドマイド）および抗ＣＤ３８抗体を含む３つまたはそれよりも多くの過去の処置を受けている再発性／難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する成人。患者の悪性形質細胞の１５％より多くは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を発現する。

群２Ａ：過去の自己ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞療法にも失敗し、その悪性細胞がＢＣＭＡ陽性のままである、上記の基準を満たす再発性／難治性ＭＭ患者。

群１Ｂ：最も最近のレジメンの６０日以内に疾患進行として定義された、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはカーフィルゾミブ）、免疫調節剤（ＩＭｉＤ；例えば、レナリドマイドまたはポマリドマイド）および抗ＣＤ３８抗体を含む治療の少なくとも３つの過去の治療経験を受けている再発性／難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する成人。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）の発現は、患者の悪性形質細胞において検出可能である。

群２Ｂ：過去の自己ＢＣＭＡ指向ＣＡＲ－Ｔ細胞療法にも失敗した、上記の基準を満たす再発性／難治性ＭＭ患者。
Ｂ．企図される生物活性の結果

^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の最適な生物活性は、ＧｖＨＤを引き起こすことなく安全な同種異系移植を達成すること、および強力な抗腫瘍免疫応答を媒介し、がん細胞を消失させるのに十分なレベルおよび期間で移植することである。

同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、内在性ＴＣＲを発現せず、ＧｖＨＤを引き起こさない。

同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩを発現せず、宿主のＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞媒介同種移植枯渇、ならびにｓｒ３９ＴＫ免疫原標的化枯渇に抵抗する。

同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞において発現したＢＣＭＡＣＡＲは、悪性形質細胞を認識および死滅させる強力な機能を示し得る。

同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞におけるｓｒ３９ＴＫ遺伝子の発現は、ＰＥＴイメージングでこれらの遺伝子改変細胞を高感度で追跡すること、および安全性が必要な場合では、ｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子機能によるこれらの細胞の消失を可能にする。

^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の最小限許容される生物活性は、ＧｖＨＤを引き起こすことなく安全な同種異系移植を達成すること、および測定可能な抗腫瘍免疫応答で検出可能なレベルおよびある特定の期間で移植することである。

同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、アロ反応性の内在性ＴＣＲを発現せず、ＧｖＨＤを引き起こさない。

同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、適切なＨＬＡ－Ｉ／ＩＩを発現せず、宿主のＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞媒介同種移植枯渇、ならびにｓｒ３９ＴＫ免疫原標的化枯渇に抵抗する。

同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞において発現したＢＣＭＡＣＡＲは、悪性形質細胞の認識および死滅を媒介する適切な機能を示し得る。

同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞におけるｓｒ３９ＴＫ遺伝子の発現は、ＰＥＴイメージングでこれらの遺伝子改変細胞を測定可能に追跡すること、および安全性が必要な場合では、ｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子機能によるこれらの細胞の消失を可能にする。
Ｃ．企図される有効性の結果

本開示の組成物は以下の結果のうちの１つまたは複数を達成することができることが企図される：すべての健康なドナーについてすべてのリリース基準を満たす最終細胞製品の製造に成功した；１人の健康なドナーから、最低限、同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の１，０００用量（１用量あたり１０^８～１０^９個の細胞）を産生する；リンパ球枯渇の前処理および注入後に治療有効レベルおよび期間で同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の有効な移植；群１の患者について現在の同種異系ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞療法と同様の臨床応答率、すなわち、≧７０％のＯＲＲと≧５０％のＣＲ；ＰＦＳの中央値が≧１０か月。群２の患者について観察される≧３０％のＯＲＲ；少なくとも５０％の健康なドナーについてすべてのリリース基準を満たす最終細胞製品の製造に成功した；１人の健康なドナーから、最低限、同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の１００用量（１用量あたり１０^８～１０^９個の細胞）を産生する；リンパ球枯渇の前処理および注入後に同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の検出可能な移植；群１の患者について、≧３０％のＯＲＲで観察される臨床応答率。目的の応答は、群２の患者について観察された。
Ｄ．安全性の実施形態

本開示の組成物は以下の結果のうちの１つまたは複数を達成することができることが企図される：細胞製品に関連する任意のグレードの非血液学的ＳＡＥの非存在（ＮＣＩＣＴＣＡＥｖ４）；複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）の非存在；ベクター挿入事象由来のモノクローナル増幅またはリンパ増殖性障害の非存在；ＧｖＨＤの非存在；グレード２よりも高いサイトカイン放出症候群の非存在；グレード２よりも高い神経毒性の非存在；すべてのＣＲＳおよび神経毒性事象が元に戻せる；細胞製品に関連するグレード３～４の非血液学的ＳＡＥの非存在（ＮＣＩＣＴＣＡＥｖ４）；グレード３またはそれよりも高いＧｖＨＤの非存在；グレード４またはそれよりも高いサイトカイン放出症候群の非存在；ならびにグレード４よりも高い神経毒性の非存在。
Ｅ．用量／レジメンの実施形態

以下の投薬およびレジメンの実施形態が、本開示の方法において使用され得ることが企図される。

投薬レジメンは、フルダラビンおよびシクロホスファミドによるリンパ球枯渇の前処置後、静脈内投与される同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の単一用量である。投薬レジメンは、フェーズＩ研究からの安全性および有効性のデータに基づいて再定義されてもよい。

自己ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞療法における過去の臨床経験に基づいて、用量範囲は、患者１人あたり、１注射あたり１０^７～１０^９個の細胞である。しかしながら、同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の投薬は、自己細胞のものと異なっていてもよい。

非盲検のフェーズＩ用量漸増研究を行って、同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の安全性および臨床活性を決定する。これは、３＋３の設計に従って、コホートあたり６人の患者で、３つの投薬コホート（患者１人あたり、１×１０^８、３×１０^８および６×１０^８個の細胞）に再発性／難治性ＭＭ患者を登録する。それぞれのコホート内で、患者は、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の２つの異なるロットのうちの１つを受けるように割り当てられる。主要な結果の測定は、用量制限毒性である。

非盲検のフェーズＩ用量漸増研究を行って、同種異系^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の安全性および臨床活性を決定する。これは、３＋３の設計に従って、コホートあたり３人の患者で、３つの投薬コホート（患者１人あたり、１×１０^８、３×１０^８および６×１０^８個の細胞）に再発性／難治性ＭＭ患者を登録する。患者は、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の単一ロット由来の細胞を受ける。主要な結果の測定は、用量制限毒性である。

用量漸増は、有効性を示す最低用量で停止する。

製品の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、単一用量形態の細胞懸濁液として製剤化され、５％のＤＭＳＯおよび２．５％のヒトアルブミン中での凍結保存に適合し、１時間未満にわたって静脈内投与されなければならない。

製剤化された細胞懸濁液は、解凍時から室温で４時間またはそれよりも長く安定でなければならない。

製剤化された細胞懸濁液は、解凍時から室温で１時間安定でなければならない。
Ｆ．提案された幹細胞に基づく治療用製品についての価値に関する陳述

標準処置で管理されている１人のがん患者のための処置の費用は、がんのタイプ／ステージ、および患者が受ける医療的ケアに応じて異なる。医療研究・品質調査機構（ＡＨＲＱ）は、米国におけるがんの直接医療費用（すべてのヘルスケア費用の合計）が２０２０年までに１５７７億ドルに増加すると推定している。新たに承認されたがんの薬物は、米国臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）によれば、１か月あたり最高で３万ドルの費用がかかる。

新たにＦＤＡで承認されたＫｙｍｒｉａｈおよびＹｅｓｃａｒｔａ（ＣＡＲ－Ｔ療法）のような自己遺伝子改変細胞療法は、処置ごとに患者１人あたりおよそ３０万ドル～５０万ドルの市場価格を有する。個別化細胞製品は、それぞれの患者のために製造される必要があり、その１人の患者を処置するためにのみ利用され得るので、非常に費用がかかる。本出願において提案される^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のようなオフザシェルフ製品は、大きく費用を低減し得るだろう。１バッチの^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を製造する費用は、１バッチの同種異系ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する費用よりも高くあり得るが、１０倍の増加を超える可能性はない。１０倍高い製造費用が仮定されたとしても、提案されたオフザシェルフ^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞療法は、依然として１用量あたりおよそ３～５千ドルしか費用がかからず、この療法をはるかに手頃なものにする。

ＭＭのための細胞に基づく免疫療法－自己、対、同種異系の手法：ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲで操作されたＴ細胞の自己移植は、進行中の臨床研究において再発性／難治性ＭＭの処置について顕著な有効性を示しており、ＭＭのための４次処置として２０２０年に規制当局の承認が得られる可能性がある。しかしながら、そのようなプロトコールは、患者から収集された起源のＴ細胞を１人の患者を処置するために製造および使用することを必要とし、このタイプの自己療法を、費用がかかり、労働集約的なものにし、必要とするすべてのＭＭ患者に効果的に送り届けることを困難にする。したがって、幅広いＭＭ患者を処置するために大スケールで製造することができ、容易に流通させることができる同種異系細胞療法は、大きな需要がある。
Ｇ．治療薬候補の説明：同種異系のＨＳＣで操作されたオフザシェルフ汎用のＢＣＭＡＣＡＲ－ｉＮＫＴ（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞

治療薬候補の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を；治療薬代替物のＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を使用して行われたｉｎｖｉｖｏの有効性および安全性研究を除き；すべてのパイロット研究のために使用し、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ（ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性）細胞およびＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ（ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陽性）細胞を同じ製造プロセス（＋／－ＣＲＩＳＰＲ）に従って作製し、同等のｉＮＫＴ表現型および機能性を示した；３。従来型ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＣＡＲ－Ｔ）細胞を、同じレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲレトロウイルス形質導入手法を使用して作製し、すべての関連するパイロット研究において対照として含めた；４。適用可能である場合、パイロット研究データを平均±ＳＥＭとして表した。Ｎ数を示した。統計解析を、スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析のいずれかを使用して必要に応じて行った。ｎｓ、有意ではない；^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
Ｈ．パイロットＣＭＣ研究（図１６）

Ｇ－ＣＳＦ動員ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣを、２人の異なる健康なドナーから収集し（ドナー１人あたりおよそ３～５×１０^８個のＨＳＣ）、レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターで形質導入し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体を用いて電気穿孔し、続いて、２段階の培養系においてｉｎｖｉｔｒｏで培養した（図１６Ａ）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体（ＵＣＢｅｒｋｅｌｅｙＭａｃｒｏＬａｂＦａｃｉｌｉｔｙからのＣａｓ９；ＳｙｎｔｈｅｇｏからのｇＲＮＡ；Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡ配列５’－ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＵＡＡＧＧＣＣＡ－３’（配列番号６８）；ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ配列５’－ＧＡＵＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＧＣＣＵＣＣＣ－３－配列番号６９’）を利用して、ヒトＨＳＣ中のＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊して、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性ｉＮＫＴ細胞を作製した（図１６Ａ、上中央）。レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡによるＨＳＣの同時操作は、非常に効率的であり、およそ３０～４０％のＴＣＲ遺伝子送達率およびおよそ５０～７０％のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ二重欠乏率をもたらす（図１６Ｂ）。段階１の培養では、遺伝子操作されたＨＳＣを、８週目の産生のピークで、３～８週間の期間にわたって、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養においてヒトｉＮＫＴ細胞に効率的に分化させた（図１６Ｃ）。８週目に、ＡＴＯｉＮＫＴ細胞を、収集し、αＧＣがロードされた照射されたＰＢＭＣ（抗原提示細胞として）とともに２週間増幅させ、続いて、２ステップのＭＡＣＳ精製戦略：１）表面のＨＬＡ－Ｉ／Ｂ２Ｍ（Ｂ２Ｍを認識する２Ｍ２ｍＡｂによる）およびＨＬＡ－ＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを認識するＴｕ３９ｍＡｂ）分子に対して選択するＭＡＣＳ陰性選択ステップ、ならびに２）表面のｉＮＫＴＴＣＲ分子（ヒトｉＮＫＴＴＣＲを認識する６Ｂ１１ｍＡｂによる）について選択するＭＡＣＳ陽性選択ステップにより、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用のＨＳＣ操作ヒトｉＮＫＴ細胞（^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞として表す）を単離した（図１６Ｅ）。ＭＡＣＳ精製後、段階１の培養は、インプットＨＳＣと比較しておよそ１００倍増幅した、９７％を上回る純度（＞９９％のｉＮＫＴ細胞、そのうち＞９７％がＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性である）の非常に均質なＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用のＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞製品を与えた（図１６Ｅ）。段階２の培養では、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、それらをレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲレトロウイルスベクターでの形質導入によってさらに操作し、続いて、２週間、ＩＬ－１５増幅させ、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現、および操作された細胞のさらにおよそ１００倍の増幅をもたらした（図１６Ａ、上右側）。レトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲレトロウイルスベクターを、成功裏に利用して、ＭＭを処置する進行中のフェーズＩ臨床試験のための自己ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔを製造した。この実験では、本発明者らは、操作された末梢血Ｔ細胞と同等の、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の＞３０％のＢＣＭＡ－ＣＡＲ操作率を日常的に得た（図１６Ｆ）。この製造プロセスは、頑強であり、試験される両方のドナーについて高収率および高純度であった。これらの結果に基づいて、１×１０^６個のインプットＨＳＣから、約１～２×１０^１０個のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用のＢＣＭＡ－ＣＡＲで操作されたｉＮＫＴ（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞を産生することができ、１人の健康なドナーから１０^１２個を上回る治療薬候補の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の理論収率を与えると推定された（図１６Ｇ）。
Ｉ．パイロット薬理学研究（図１７）

^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性（図１６Ｆ）を、フローサイトメトリーを使用して研究した。２つの対照は、１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ操作ステップなしであるが、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞と並行して製造されたＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、および２）健康なドナーの末梢血Ｔ細胞をレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲレトロウイルスベクターで形質導入することによって作製されたＢＣＡＲ－Ｔ細胞を含んでいた（図１６Ｆ）。予想通り、対照ＢＣＡＲ－Ｔ細胞は、高レベルのＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を発現したが、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ダブル陰性であり、同種異系療法に対するそれらの好適性を確認した（図１７、左パネル）。興味深いことに、ＣＲＩＳＰＲ操作なしでさえ、ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、低レベルのＨＬＡ－ＩＩ分子を既に発現しており、これらの細胞が、従来型Ｔ細胞と比較して、生来の低い免疫原性であることを示唆する（図１７、左パネル）。それにもかかわらず、ＨＬＡ－ＩＩ発現は、ＣＲＩＳＰＲ操作によってさらに低減された（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞において）。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は両方とも、典型的なｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を表した：それらは、混合パターン（ＣＤ４／ＣＤ８ダブル陰性、ＣＤ８シングル陽性）でＣＤ４およびＣＤ８共受容体を発現した；それらは、高レベルのメモリーＴ細胞マーカーのＣＤ４５ＲＯおよびＮＫ細胞マーカーのＣＤ１６１を発現した；ならびに、それらは、高レベルのＩＦＮ－γのようなエフェクターサイトカインならびにパーフォリンおよびグランザイムＢのような細胞傷害性分子を、それらの対応物の従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞の発生もしくは治療薬候補の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の表現型／機能性と同等またはそれらよりも良好に産生し、このオフザシェルフ細胞製品の製造を可能にした。
Ｊ．パイロットｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究（図１８）

本発明者らは、この研究のためにｉｎｖｉｔｒｏのＭＭ腫瘍細胞死滅アッセイを確立した（図１８Ａ）。ヒトＭＭ細胞系のＭＭ．１Ｓを、ヒトＣＤ１ｄ遺伝子ならびにホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）レポーター遺伝子および高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター遺伝子を過剰発現するように操作し、このアッセイのために使用したＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系をもたらした（図１８Ｂ）。注目すべきことには、大部分の原発性ＭＭ腫瘍細胞が、ＢＣＭＡとＣＤ１ｄの両方を発現し、これらの細胞を、ＢＣＭＡ－ＣＡＲとｉＮＫＴＴＣＲの両方が媒介する標的化の対象にする（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。親ＭＭ．１Ｓ細胞はＢＣＭＡを発現するが、それらは、ほとんどの既存のＭＭ細胞系のようにＣＤ１ｄ発現を喪失し、したがって、本発明者らは、原発性ＭＭ腫瘍細胞を模倣するＣＤ１ｄを発現するようにＭＭ．１Ｓ細胞を操作した（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、２人の異なるＣＤ３４^＋ＨＳＣドナーについて、ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞および従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞のものと同等の有効性で、ＭＭ腫瘍細胞を有効に死滅させた（図１８Ｄ）。重要なことには、同族脂質抗原（αＧＣ）の存在下、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞ではなく^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、おそらく^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞がＣＡＲ／ＴＣＲのデュアル腫瘍死滅機構を活用し得るので、増強された腫瘍死滅有効性を実証した（図１８Ｂおよび１８Ｅ）。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のこの固有のＣＡＲ／ＴＣＲ媒介デュアル標的化能は、それが、ＭＭ腫瘍細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞からの攻撃を回避するＢＣＭＡ抗原のそれらの発現を下方調節した同種異系ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ療法の臨床試験で報告された現象である抗原回避を潜在的に回避することができるので、魅力的である。
Ｋ．パイロットｉｎｖｉｖｏ有効性および安全性研究（図１９）

ＮＳＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^－／－）マウスＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍異種移植モデルをこの研究のために使用した（図１９Ａ）。ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、治療薬代替物として研究し、ｉｎｖｉｔｒｏ特徴付け（表現型／機能／有効性）に基づいて、ｉｎｖｉｖｏの有効性および安全性に関して^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞と似ていると予想され、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とＢＣＡＲ－Ｔ細胞は両方とも、事前に確立された転移性ＭＭ腫瘍細胞を有効に根絶した（図１９Ｂおよび１９Ｃ）。しかしながら、腫瘍なしであるにもかかわらず、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を受けているマウスは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が原因で最終的に死亡した（図１９Ｄおよび１９Ｅ）。それどころか、ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を受けているマウスは、腫瘍なしのままであり、ＧｖＨＤなしで長期間生存した（図１９Ｄおよび１９Ｅ）。これらの結果は、ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ療法の治療可能性を検証し、提案されたオフザシェルフ細胞療法の顕著な安全性プロファイルを強調した。
Ｌ．パイロット免疫原性研究（図２０）

同種異系細胞療法について、２つの免疫原性の懸念：ａ）ＧｖＨＤ応答、およびｂ）宿主対移植片（ＨｖＧ）応答が存在する。本発明者らは、提案された^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品についての可能性があるＧｖＨＤおよびＨｖＧのリスクを考慮し、操作された軽減戦略および安全管理戦略を評価した（図２０Ａ）。ＧｖＨＤは、主要な安全性の懸念である。しかしながら、ｉＮＫＴ細胞は、不適合ＨＬＡ分子およびタンパク質自己抗原と反応しないので、それらは、ＧｖＨＤを誘導するとは予想されない。この見解は、同種異系ＨＳＣ移入および自己ｉＮＫＴ移入のヒト臨床経験におけるＧｖＨＤの欠如によって証明され、パイロットｉｎｖｉｖｏ安全性研究（図１９Ｄおよび１９Ｅ）およびｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ（図２０Ｂおよび２０Ｃ）によって支持される。他方で、ＨｖＧのリスクは、大部分は有効性の懸念であり、宿主免疫細胞によって、主に、不適合ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を認識する従来型ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞による同種異系治療用細胞の消失によって媒介される。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子のそれらの表面提示を除去するようにＣＲＩＳＰＲで操作され、したがって、宿主Ｔ細胞媒介応答を誘導しないと予想される（図１７および図２０Ａ）。実際に、ｉｎｖｉｔｒｏのＭＬＣアッセイでは、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞およびＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陽性のＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とはかなり対照的に、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、複数の不適合ドナー由来のＰＢＭＣＴ細胞からの応答を引き起こさなかった（図２０Ｄおよび２０Ｅ）。これらの結果は、ＧｖＨＤがなく、ＨｖＧ抵抗性である、オフザシェルフ細胞療法のための理想的な候補として^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を強く支持する。
Ｍ．パイロット安全性研究－ＰＥＴイメージングおよび安全管理のためのｓｒ３９ＴＫ遺伝子（図２１）

^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の安全性プロファイルをさらに増強するために、本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞において、ｓｒ３９ＴＫＰＥＴイメージング／自殺遺伝子を操作し、これは、深刻な有害事象の場合において、ＰＥＴイメージングおよびＧＣＶ誘導性枯渇によるこれらの細胞の消失を使用して、これらの細胞のｉｎｖｉｖｏモニタリングを可能にする（図１６Ａ）。細胞培養では、ＧＣＶは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の有効な死滅を誘導した（図２１Ａ）。パイロットｉｎｖｉｖｏ研究を、ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ）細胞を保持するＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫヒト化マウスを使用して行った（図２Ａ～２Ｂおよび図２１Ｂ）。ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞を、レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫレンチウイルスベクターで形質導入されたヒトＨＳＣから操作し、同じベクターを、この提案における^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品を操作するために使用した（図１５および図２Ａ）。ＣＴスキャンと組み合わせたＰＥＴイメージングを使用して、本発明者らは、ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスのリンパ組織全体にわたる、特に、骨髄（ＢＭ）および脾臓における遺伝子操作されたヒト細胞の分布を検出した（図２１Ｃ）。ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスをＧＣＶで処置すると、身体全体にわたって遺伝子操作されたヒト細胞が効率的に枯渇した（図２１Ｃ）。重要なことには、ＧＣＶ誘導性枯渇は、フローサイトメトリーによって測定した場合の、ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスにおける、他のヒト免疫細胞ではなく、ＨＳＣ操作ヒトｉＮＫＴ細胞の選択的枯渇によって証明されたように、特異的であった（図２１Ｄ）。したがって、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品は、強力な「死滅スイッチ」を備えており、その安全性プロファイルをさらに増強する。

現在のデータは、プレＩＮＤ開発のすべての重要な態様を含めて、ＭＭのために提案されたオフザシェルフ^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞療法の実現可能性および将来性を実証する。ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイを、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ治療薬候補の包括的な特徴付けを支持するために確立した。腫瘍死滅活性を、２人の異なるドナーのＨＳＣから作製された^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞について実証し、提案された細胞療法の頑強性を示唆した。重要なことには、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、顕著な安全性プロファイル（ＧｖＨＤなし）に加えて、従来型ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞のものと同等またはそれよりも良好な腫瘍死滅有効性を示し、ＭＭのための次世代のオフザシェルフ療法としての^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞療法の有望さを強調する。
Ｎ．さらに企図される実施形態
１．薬理学、生体内分布、薬物動態

タスクＡ１：同一性／活性／純度。本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の純度、表現型および機能性を、事前に確立したフローサイトメトリーアッセイおよびＥＬＩＳＡを使用して研究する（図１７）。本発明者らは、＞９７％／３０％の純度の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を予想する（＞９７％の^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞、ｈＴＣＲαβ^＋６Ｂ１１^＋ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ^ｎｅｇとしてゲート開閉；および＞３０％のＢＣＭＡ－ＣＡＲ陽性細胞、ｔＥＧＦＲ^＋としてゲート開閉）。本発明者らは、これらの^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞が、典型的なヒトｉＮＫＴ細胞の表現型（ｈＣＤ４５ＲＯ^ｈｉｈＣＤ１６１^ｈｉｈＣＤ４^－ｈＣＤ８^＋／－）を示し、対立遺伝子消失に起因して検出可能な内在性ＴＣＲを発現せず、ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ標的細胞との共培養の際にＢＣＭＡ－ＣＡＲおよびαＧＣ－ＣＤ１ｄ／ＴＣＲ媒介刺激の両方に応答すると予想する（図１７および図１８）。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍活性は、それらの増殖、ならびにエフェクターサイトカイン（ＩＦＮ－γ）および細胞傷害性分子（グランザイムＢ、パーフォリン）の産生を測定することにより研究する（図１７）。

タスクＡ２：薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）。本発明者らは、腫瘍担持ＮＳＧマウスにこれらの細胞を養子移入することによって（マウス１頭あたり１０×１０^６個の細胞）、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の生体内分布およびｉｎｖｉｖｏ動態を研究することを計画する。事前に確立されたヒトＭＭ（ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ）異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用する（図１９Ａ）。フローサイトメトリー分析を行って、血液および組織中の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の存在を研究する。確立されたプロトコールに従って、ＰＥＴイメージングを行って、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の全身分布を研究する（図２１Ｃ）。予備研究に基づいて、本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、養子移入後数時間にわたって腫瘍担持動物中で持続し得、リンパ系臓器（脾臓および骨髄）に戻ることができ、最も重要なことには、転移性腫瘍部位に輸送および浸潤することができることを観察すると予想する。

タスクＡ３：用量／レジメン／投与の経路。本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／安全性を評価するための用量漸増研究を実施することを計画する。事前に確立されたヒトＭＭ（ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ）異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用する（図１９Ａ）。パイロット研究では、７×１０^６個の用量のＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ治療薬代替物細胞（ＨＬＡノックアウトなし）は、明らかな毒性を引き起こすことなく、有効に腫瘍成長を抑制した（図１９）。したがって、本発明者らは、表１に表す治療薬候補の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞についての用量漸増研究を提案する。このタスクからの結果は、将来のフェーズＩ臨床試験のための用量漸増研究の設計を助けるのに有益である。事前処置レジメンは、レシピエントのリンパ切除であり、ヒトについて、これは、フルダラビンとシクロホスファミド処置であり、マウスについて、これは、致死量以下の全身照射（ＮＳＧマウスについて１７５ｒａｄｓ）である（図１９Ａ）。投与の経路は、静脈内注射である。

タスクＡ４：有効性。本発明者らは、事前に確立されたｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死滅アッセイ（図１８Ａ）およびｉｎｖｉｖｏ腫瘍死滅動物モデル（図１９Ａ）を使用して、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍死滅有効性を研究することを計画する。ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧモデルに加えて、本発明者らは、Ｌ３６３に基づくＭＭモデルにおいても有効性を試験し、２つのモデルは、有効性評価の厳密さを増加させる。ｉｎｖｉｖｏ有効性研究のために、腫瘍担持マウスは、漸増用量の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を受ける（表１に示す通り）。本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞が、パイロット研究において観察されたものと同様に、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでＭＭ．１ＳおよびＬ３６３腫瘍細胞を有効に死滅させ得ることを観察すると予想する（図１８および図１９）。ｉｎｖｉｖｏ腫瘍死滅用量漸増研究から、本発明者らは、ＢＬＩイメージングおよびフローサイトメトリー、ならびに長期生存によって検出不能として規定される、ＭＭ腫瘍を根絶することができる^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の最低有効用量を特定すると予想する。

タスクＡ５：作用機構（ＭＯＡ）。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、パイロットＭＯＡ研究において実証されるように、ＣＡＲ／ＴＣＲデュアル死滅機構によりＭＭ腫瘍細胞を標的にすることができる（図１８Ｂおよび１８Ｅ）。本発明者らは、製造された^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品についてこれらの機構を評価および検証することを計画する。本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞が、これらの２つの機構の間の可能性のある相乗効果を伴って、ＣＡＲとＴＣＲの両方が媒介する機構により、ＭＭ腫瘍細胞を死滅させることができることを観察すると予想する。
２．化学、製造および管理

パイロットＣＭＣ研究は、２段階のｉｎｖｉｔｒｏ培養系を使用して、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の成功裏の産生を実証した（図１６）。本発明者らは、フェーズＩ臨床試験に入り、将来は、さらなる臨床および商業的開発に進む、治療薬候補の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を調製するために、以前の成功を足場として、製造プロセスをさらに最適化し、重要な品質管理アッセイを確立することを計画する（図２２Ａ～Ｃ）。本発明者らは、１）フェーズＩ臨床試験に供給するために、ＧＭＰ製造に容易に適合し、スケールアップすることができる製造プロセスを確立すること（図２２Ｂ）、２）意図される細胞製品の品質を保証するための重要なプロセス内管理（ＩＰＣ）アッセイおよび製品リリースアッセイを確立すること（図２２Ｃ）、ならびに３）３人の異なるドナーから、１０^１０個のスケールおよび高純度（＞９７％のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性ヒトｉＮＫＴ細胞、そのうち＞３０％がＢＣＭＡ－ＣＡＲ陽性細胞である）の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の３つのロットの製造およびリリースを終了することによるＣＭＣ設計の頑強性を実証すること（図２２Ｃ）を目標としている。それが研究所の設備に適しており、それが提案された前臨床研究に供給するのに適切であり、重要なことには、製造スケールが将来のフェーズＩ臨床試験のために十分であるので、１０^１０個の製品スケールが選択される（図２２Ｂ）。これらのゴールを達成するために、本発明者らは、以下の５つのタスクを提案した。

タスクＢ１：レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを作製する。本発明者らは、ヒトｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子をｓｒ３９ＴＫＰＥＴイメージング／自殺遺伝子と一緒に送達するための本発明者らの以前のＴＲＡＮ１－０８５３３プロジェクトによって開発された、臨床レンチウイルスベクターのレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫを利用することを提案する（図２２Ａ）。同じレンチベクターを、パイロットＣＭＣ研究において利用し（図１６Ａ）、同じレンチベクター骨格は、共同研究者であるＤｏｎａｌｄＫｏｈｎ博士およびＡｎｔｏｎｉＲｉｂａｓ博士に率いられた２つのＣＩＲＭが資金提供した臨床試験において既に使用されている（ＩＮＤ番号１６０２８；ＩＮＤ番号１７４７１）。ＴＲＡＮ１－０８５３３プロジェクトでは、本発明者らは、ＵＣＬＡＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅにおいて、研究グレードのレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを成功裏に産生した（１０Ｌ、１×１０^６ＴＵ／ｍｌ）。現在のトランスレーショナルプロジェクト（ＴＲＡＮ１－１１５９７）のために、本発明者らは、提案された前臨床研究を支持するために、ＵＣＬＡＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅにおいて別の中規模スケール（４～１０Ｌ）のレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを産生することを計画する。とりわけ、ＩｎｄｉａｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶｅｃｔｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＦａｃｉｌｉｔｙ（ＩＵＶＰＦ）は、本発明者らのために、類似の高力価のＧＭＰ適合試験ロットのレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを産生し、プロジェクトが臨床開発およびＧＭＰ製造段階に移った場合に、本発明者らのために臨床グレードのベクターを産生することに同意した（サポートレターを参照されたい）。

タスクＢ２：レトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲベクターを作製する。本発明者らは、ＣＡＲ操作のために、ガンマレトロウイルスベクターのレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲを使用することを計画する。ベクター骨格は、以前に記載の改変モロニーマウス白血病ウイルスに基づく。ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ一本鎖可変断片、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞質領域からなる第二世代の設計である。Ｐ２Ａリンカーを通して、ベクターは、安全スイッチとして切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）もコードする。このＣＡＲをコードするｃＤＮＡ配列は、コドン最適化され、合成され、レトロウイルスベクター骨格にクローニングされる。本発明者らは、ＰＧ１３テナガザル白血病ウイルスのパッケージング細胞系の使用によりレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲを作製するためのレトロウイルス産生系を作製した。最も高い力価を有する１つのクローンを選択し、記載のパイロット研究のためのベクターを産生するために使用した（図１６～１９および図２１）。このプロジェクトでは、本発明者らは、提案された前臨床研究を支持するために、研究室において中規模スケール（５Ｌ）のレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲベクターを作製するこのクローン産生系を使用することを計画する。本発明者らは、ｃＧＭＰ適合マスターおよびベクター産生系のための機能する細胞バンクを作製するために、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒと契約サービスを確立することも計画する。本発明者らは、プロジェクトが臨床開発およびＧＭＰ製造段階に移った場合に、臨床グレードのベクターを産生するためにこれらの細胞バンクを使用することをＩＵＶＰＦに求めることを計画する。

タスクＢ３：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体を作製する。本発明者らは、ヒトＨＳＣにおいてＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する強力なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ遺伝子編集ツールを利用することを提案する（図２２Ａ）。そのような遺伝子編集されたＨＳＣに由来するＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現を欠き、それにより宿主Ｔ細胞による拒絶を回避する。パイロットＣＭＣ研究では、本発明者らは、ＨＳＣから出発してＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ二重欠乏を誘導し、高効率（およそ４０～６０％）で^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞をもたらす、ＣＩＲＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体（ＵＣＢｅｒｋｅｌｅｙＭａｃｒｏＬａｂＦａｃｉｌｉｔｙからのＣａｓ９；ＳｙｎｔｈｅｇｏからのｇＲＮＡ；Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡ配列５’－ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＵＡＡＧＧＣＣＡ－３’（配列番号６８）；ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ配列５’－ＧＡＵＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＧＣＣＵＣＣＣ－３’ －配列番号６９）を成功裏に作製し、検証した（図１６）。本発明者らは、提案されたＴＲＡＮ１－１１５９７プロジェクトにおいて使用するために、検証されたベクターからＣａｓ組換えタンパク質および合成ｇＲＮＡを得ることを計画する。特に、「オフターゲット」効果を最小化するために、本発明者らは、ＩＤＴ由来の高忠実度のＣａｓ９タンパク質を利用する。本発明者らは、事前に試験された単一の優性Ｂ２Ｍ－ｇＲＮＡおよびＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡで開始するが、必要により、遺伝子編集効率をさらに改善するために、複数のｇＲＮＡを組み込むことを考慮する。

タスクＢ４：^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製する。提案された製造プロセスおよびＩＰＣ／製品リリースアッセイを、フロー図に示す（図２２Ｃ）。８ステップが含まれ、下記に詳述する。

ＨＳＣを収集する（ステップ１および２）。本発明者らは、商業的供給業者のＨｅｍａＣａｒｅからの３人の異なる健康なドナーのＧ－ＣＳＦ動員ＬｅｕｋｏＰａｋを入手し、続いてＵＣＬＡＣＭＰ施設に設置されたＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを使用してＣＤ３４^＋ＨＳＣを単離することを計画する。ＨｅｍａＣａｒｅは、ＩＲＢに承認された収集プロトコールおよびドナーの承諾を有し、前臨床研究およびさらなる臨床試験と市販製品の製造の両方を支持することができる（サポートレターを参照されたい）。本発明者らの以前のＣＩＲＭＴＲＡＮ１－０８５３３プロジェクトでは、本発明者らは、ＨｅｍａＣａｒｅから複数のドナーのＧ－ＣＳＦＬｅｕｋｏＰａｋを成功裏に入手し、高収率および高純度のＣＤ３４^＋ＨＳＣを単離した（ドナー１人あたり１～５×１０^８個のＨＳＣ；純度＞９９％）。本発明者らは、新たな収集物について、類似の収率および純度を予想する。単離後、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋ＨＳＣを、凍結保存し、提案されたＴＲＡＮ１－１１５９７プロジェクトのために使用する。

ＨＳＣを遺伝子操作する（ステップ３および４）。本発明者らは、ＰＩの研究室において、共同研究者であるＤｏｎａｌｄＫｏｈｎ博士が十分に確立したプロトコールに従って、レンチ－ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体の両方でＨＳＣを操作することを計画する。凍結保存されたＣＤ３４^＋ＨＳＣを、解凍し、レトロネクチンでコーティングされたフラスコにおいて、１％のＨＡＳおよびＴＰＯ／ＦＬＴ３Ｌ／ＳＣＦを補充されたＸ－Ｖｉｖｏ－１５血清フリー培地中で１２時間培養し、続いて、さらに８時間、レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターを添加する。レンチベクター形質導入の２４時間後、細胞を、事前に形成したＣＩＲＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体と混合し、ＬｏｎｚａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用して電気穿孔に付す。パイロット研究では、本発明者らは、２人の無作為の健康なドナーのＣＤ３４^＋ＨＳＣを使用して、高いレンチベクター形質導入率（細胞あたりＶＣＮ＝１～３で＞およそ３０～４０％の形質導入率；図１６Ｂ）および高いＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ二重欠乏（１ラウンドの電気穿孔後に培養されたＨＳＣのおよそ５０～７０％のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩダブル陰性細胞；図１６Ｂ）を達成した。本発明者らは、効率性を改善するために遺伝子編集手順をさらに最適化することを計画する。評価パラメーターは、細胞生存率、Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定される欠失（インデル）頻度（オンターゲット効率）、ならびにＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ部位を標的とする次世代配列決定、フローサイトメトリーによるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ発現、ならびにコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイによって測定される編集されたＨＳＣの造血機能である。本発明者らは、ＨＳＣの２０～５０％の三重遺伝子編集効率を達成することを目標としており、予備研究では、段階１の培養後に、インプットＨＳＣあたりおよそ１００個の^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を生じさせることができた（図１６Ｇ）。

^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製する（ステップ５～８）。本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を産生するために、段階２のｉｎｖｉｔｒｏ系においてレンチベクターおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ｇＲＮＡで二重操作されたＨＳＣを培養することを提案する。段階１では、遺伝子操作されたＨＳＣを、共同研究者であるＧａｙＣｒｏｏｋｓ博士の研究室において開発された標準プロトコールに従って、ＡＴＯ培養を介してｉＮＫＴ細胞に分化させる（図２Ｃ）。ＡＴＯは、ＨＳＣ（１×１０^４個）および照射された（８０Ｇｙ）ＭＳ５－ｈＤＬＬ１間質細胞（１．５×１０^５個）の混合物を０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌトランスウェルインサート上の液滴形態として含有する細胞スラリー（５μｌ）をピペッティングすること、続いて、インサートを１ｍｌのＲＢ２７培地を含有する６ウェルプレートに配置することを含み、培地は、８週間、４日ごとに交換される。本発明者らは、ＡＴＯ培養手順を簡素化および最適化するために自動ピペッティングシステム（ｅｐＭｏｔｉｏｎ）を使用する。回収された細胞を、Ｇ－Ｒｅｘバイオリアクターを使用して、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を補充された照射されたドナー適合ＣＤ３４^－ＰＢＭＣ（ＡＰＣとして）にロードされたαＧＣとともに２週間、成熟および増幅させる（図２２Ｃ）。得られた細胞を、ＭＡＣＳ選別（２Ｍ２／Ｔｕ３９ｍＡｂ媒介陰性選択、続いて６Ｂ１１ｍＡｂ媒介陽性選択）により精製して、純粋な^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を作製する（図１６Ｅ）。段階２において、ｉＮＫＴ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって活性化し、レトロネクチン条件下でレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲベクターで形質導入し、Ｇ－Ｒｅｘバイオリアクター中で、ＩＬ－１５を補充されたＴ細胞培養培地で増幅して、最終^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品を得、段階２の全期間は２週間である（図２２Ｃ）。パイロットＣＭＣ研究に基づいて（図１６）、本発明者らは、３人のドナーのそれぞれから、およそ１０^１０個のスケールの^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を産生すると予想し（１×１０^６個の開始ＨＳＣ）、それは高純度のものであった（＞９７％のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性ヒトｉＮＫＴ細胞、そのうち＞３０％がＢＣＭＡ－ＣＡＲ陽性細胞である）。次いで、得られた^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を凍結保存して、前臨床特徴付けのために使用する。本発明者らは、Ｇ－Ｒｅｘバイオリアクターを操作するのにＧａｔｈｅＲｅｘｌｉｑｕｉｄｈａｎｄｌｉｎｇを使用して、細胞増幅のための閉鎖系を保証する。全体として、本発明者らは、ほとんどのプロセスのステップが、商業的スケールの産生のために容易に自動化され得ると考える。

バイオプロセスおよび製品のための品質管理（ステップ１～８）。図２２Ｃにおいて概要を述べるように、さまざまなＩＰＣアッセイを提案されたバイオプロセスに組み込んで、高品質の製造を保証する。提案された製品リリース試験は、１）外観（色、乳白度）；２）細胞生存率および計数；３）ｉＮＫＴＴＣＲおよびＢＣＭＡＣＡＲのためのｑＰＣＲによる同一性およびＶＣＮ；４）ｉＮＫＴ陽性、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性およびＣＡＲ陽性による純度；５）エンドトキシン；６）無菌性；７）マイコプラズマ；８）ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ刺激に応答するＩＦＮ－γ放出によって測定される効力；９）ＲＣＬ（複製可能なレンチウイルス）を含む。これらのアッセイのほとんどは、ＰＩ研究室において検証されるこの製品に固有の標準の生物学的アッセイまたは特異的アッセイのいずれかである。製品の安定性試験は、ＬＮ保管された^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を定期的に解凍し、それらの細胞生存率、純度、回収、効力（ＩＦＮ－γ放出）および無菌性を測定することによって行われる。達成可能な有効期間を決定することが残されているが、本発明者らは、製品が少なくとも１年間安定であるはずであると予想する。

タスクＢ５：ｃＧＭＰ適合ＭＳ５－ｈＤＬＬ１細胞バンクを作製する。ＡＴＯ培養のための間質細胞系であるＭＳ５－ｈＤＬＬ１は、ＳＴＲ分析によって元の種および系に関して既に認証されており、マイコプラズマ混入について陰性と試験されている。これは、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒによっても試験されており、ＭｏｕｓｅＥｓｓｅｎｔｉａｌＣＬＥＡＲパネルによって感染性疾患は陰性、ならびにラット、チャイニーズハムスター、ゴールデンシリアンハムスターおよび非ヒト霊長類についての種間のコンタミネーションについて陰性である。これらの試験結果は、異種フィーダー細胞に関するＦＤＡの見解と一致し、したがって、本発明者らに、この細胞がＧＭＰ製造のための要件に適合するはずであるという信頼を与える。本発明者らは、この前臨床研究のための十分な細胞を預けている。将来のＧＭＰ製造のための調製では、本発明者らは、ｃＧＭＰ適合ＭＳ５－ｈＤＬＬ１マスターおよび機能する細胞バンクを作製するために、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒと契約サービスを確立する。
３．安全性の実施形態

本発明者らは、４つの基準：１）一般的な移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、毒性および腫瘍形成性；２）サイトカイン放出症候群および神経毒性；３）免疫原性；ならびに４）自殺遺伝子「死滅スイッチ」に対する^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品の安全性を研究することを計画する。

タスクＣ１：一般的なＧｖＨＤ／毒性／腫瘍形成性。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の長期のＧｖＨＤ（レシピエント動物の組織に対する）、毒性学および腫瘍形成性を、確立されたプロトコールに従って、これらの細胞を腫瘍なしのＮＳＧマウスに養子移入すること、および最終病理学的分析で終了する２０週間の期間にわたってレシピエントマウスをモニタリングすることにより研究する（図１９）。本発明者らは、治療薬代替物であるＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞について観察されたように、ＧｖＨＤなし、毒性なし、および腫瘍形成性なしと予想する（図１９）。

タスクＣ２：サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性。ＣＡＲ－Ｔ療法の主な有害な副作用は、ＣＲＳおよび神経毒性である。蓄積した証拠は、単球およびマクロファージが、これらの毒性を媒介する主な細胞源であることを示唆する。本発明者らは、ヒト化マウスを使用して^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴによるＭＭ処置後のＣＲＳおよび神経毒性の可能性を評価し、チームは、このタイプのマウスモデルにおいて広範囲の経験を有する。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（ヒトタンパク質のＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－３の三重トランスジェニックを有するＮＳＧマウス、ＪＡＸから入手可能）を、亜致死的に照射し（１７０ｃＧｙ）、ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣ（１０^５個、単球、マクロファージ、Ｂ細胞などのヒト免疫細胞の再構成のため）およびＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞（０．５×１０^６個、ＭＭ腫瘍細胞）を移植する。高いＭＭ腫瘍量が確立されると（４週間以内、ＢＬＩイメージングによって確認）、２用量の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（２×１０^６個および１０×１０^６個）を注入し、２つの同じ用量の従来型ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含める。マウスを、体重減少および体温（直腸温度による）を毎日、ならびにマウス血清アミドイドＡ（ヒトＣ反応性タンパク質と相同）およびヒトサイトカイン（ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γなど）についてマルチプレックスサイトカインアッセイを介して毎週、測定することによってＣＲＳの発生についてモニターする。本発明者らは、＞１５％の体重減少、ΔＴ＞２℃、および血清ＩＬ－６＞１，０００ｐｇ／ｍｌが先行する死亡として定義されるＣＲＳの死亡、ならびにＣＲＳの観察の非存在であるが、麻痺もしくは発作のいずれかが先行する死亡として定義される致死的な神経毒性を報告する。本発明者らは、ＢＣＭＡＣＡＲＴと比較して、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴによって生じるより深刻なＣＲＳおよび神経毒性がないと見込む。これらの毒性が観察されると、本発明者らは、トシリズマブ（抗ＩＬ－６Ｒ抗体）またはアナキンラ（ＩＬ－１Ｒアンタゴニスト）の投与がこれらの副作用を軽減し得るかどうかも検討する。

タスクＣ３：免疫原性。免疫細胞に基づく養子療法について、常に２つの免疫原性の懸念：ａ）ＧｖＨＤ、およびｂ）宿主対移植片（ＨｖＧ）応答が存在する。本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品についての可能性があるＧｖＨＤおよびＨｖＧのリスクを考慮し、操作された安全管理戦略を操作した（図２０Ａ）。ＨｖＧの懸念は、実際には有効性の懸念であるが、議論の便宜のために、本発明者らは、それを「安全性」の項に含める。本発明者らは、可能性があるＧｖＨＤおよびＨｖＧ応答を、確立されたｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ（図２０Ｂおよび２０Ｄ）およびｉｎｖｉｖｏ混合リンパ球養子移入（ＭＬＴ）アッセイを使用して研究する。ｉｎｖｉｔｒｏのＭＬＣアッセイの読み出し情報は、ＥＬＩＳＡによって分析されるＩＦＮ－γ産生であるが、ｉｎｖｉｖｏのＭＬＴアッセイの読み出し情報は、出血およびフローサイトメトリー（ＧｖＨＤ応答の測定としての不適合ドナーＰＢＭＣの死滅、またはＨｖＧ応答の測定としての^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の死滅のいずれか）によって分析される標的細胞の消失である。パイロット研究に基づいて、本発明者らは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞が、宿主動物組織に対してＧｖＨＤ応答を誘導しない（図１９Ｅ）、不適合ドナーＰＢＭＣに対してＧｖＨＤ応答を誘導しない（図２０Ｂ）、および不適合ドナーＰＢＭＣＴ細胞からのＨｖＧ応答を受けない（図２０Ｅ）ことを観察すると予想する。

タスクＣ４：自殺遺伝子「死滅スイッチ」。本発明者らは、確立されたプロトコールに従って、ＧＣＶ投与によるレシピエントＮＳＧマウスにおける^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の消失を研究することを計画する（図２１Ｂ）。パイロット研究に基づいて、本発明者らは、ｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子が、安全性を必要とする場合において、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を消失させるための強力な「死滅スイッチ」として機能し得ることが見出されると予想する。
４．リスク、軽減戦略

ｓｒ３９ＴＫＰＥＴイメージング／自殺遺伝子。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品に遺伝子操作されたイメージング／安全管理ｓｒ３９ＴＫは、そのウイルス起源（ＨＳＶ１）のために、潜在的に免疫原性である。しかしながら、この免疫原性の懸念は、１）細胞製品が、Ｔ細胞関連免疫原性の可能性を低減するように、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の発現を欠く；２）ＭＭ患者が、薬物注入の前にリンパ枯渇化学療法で事前処置されるので、大きく軽減されている。重要なことには、これは、同種異系ｉＮＫＴ細胞の注入のための最初のヒト研究である可能性があり、したがって、安全性は、最優先の考慮事項である。

細胞製品の純度。製造プロセスは、高純度の^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品を保証するために精製ステップ（ＭＡＣＳを使用する陰性／陽性選択）を含む。６Ｂ１１抗体が、ヒトｉＮＫＴＴＣＲに対して（伝統的な四量体と比較して）優れた特異性、安定性および親和性を有し、したがって、ｉＮＫＴ細胞の精製のための頑強な試薬であることを指し示すはずである。パイロット研究において示すように、本発明者らは、＞９８％／９５％の純度（＞９８％のｉＮＫＴ細胞；そのうち＞９５％がＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性である）を達成すると予想する（図１６Ｅ）。しかしながら、製品が、ＧｖＨＤのリスクを持つ痕跡量の従来型αβＴ細胞を含有する理論的な可能性が残されている。したがって、本発明者らは、ＭＡＣＳ精製のラウンドを増加させることによって、製品の純度をさらに改善するための選択肢を受け入れ続ける。保護されたｓｒ３９ＴＫ遺伝子のために、ＧｖＨＤの臨床リスクは、同様に管理することができる。

宿主ＮＫ細胞による拒絶のリスク。細胞製品におけるＨＬＡ発現の欠如は、宿主ＮＫ細胞による拒絶／死滅のリスクを引き起こし得る。予備研究は、ｉＮＫＴと不適合ドナーＮＫ細胞との共培養の間にそのような死滅／拒絶を検出しなかった。それにもかかわらず、さらなる研究が、ＮＫの反応性が生じるだけでなく、生着効率を低減することによって療法に影響も与えることを示す場合、本発明者らは、この効果を軽減するために、ＨＬＡ－ＥなどのＮＫ阻害剤を発現するように^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を操作することができる。
（実施例３）
オフザシェルフ免疫療法のための同種異系の造血幹細胞で操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ細胞の作製
Ａ．同種異系のＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞の作製（図２３）

本発明者らは、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系を使用して、同種異系のＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞を作製した。この系は、効率的で再現可能な、造血幹細胞（ＨＳＣ）からのヒトＴ細胞の分化および陽性選択を支持した（Montel-Hagen et al., 2019；Seet et al., 2017）。ヒトＨＳＣを、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）固定化ヒトＰＢＭＣまたは臍帯血（ＣＢ）細胞のいずれかから収集した。これらのＨＳＣを、レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターで形質導入し、次いで、２段階のＡＴＯ／α－ガラクトシルセラミド（αＧＣ、ｉＮＫＴ細胞に特異的な合成糖脂質糖脂質リガンド）培養系においてｉｎｖｉｔｒｏで培養した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターからの遺伝子改変は、ＡＴＯ培養系において、８週間にわたって、１００倍の増幅で、ＨＳＣをヒトｉＮＫＴ細胞に効率的に分化させた（図２３Ｃ）。次いで、これらの細胞を、さらに２～３週間、さらに１００～１０００倍の増幅で、ＡＰＣ／αＧＣ刺激段階においてさらに増幅させた（図２３Ｄ）。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ４／ＣＤ８共受容体発現によって定義される典型的なｉＮＫＴ細胞発生パスを進み、４週目までＤＮ（ダブル陰性）前駆細胞から出発し、続いて、６週目まで優性ＤＰ（ダブル陽性）、次いで８週目までＣＤ８ＳＰ（シングル陽性）になるか、またはＤＮ細胞に戻る（図２３Ｅ）（Godfreyand Berzins, 2007）。ＡＰＣ／αＧＣ刺激後、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ８ＳＰおよびＤＰの混合パターンで発現した（図２３Ｅ）。作製プロセス後、細胞を、１２人のドナーで試験し（ＣＢ細胞について４人のドナー、ＰＢＭＣについて８人のドナー）、これは、その収率および純度のレベルに関してこのプロセスがどの程度頑強であったかを実証した（図２３Ｆ）。１×１０^６個のインプットＣＢ細胞（およそ３０％～５０％のレンチベクター形質導入率）から、約５～１５×１０^１０個の^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞（純度９５％～９８％）が作製され、１×１０^６個のインプットＰＢＳＣから約３～９×１０^１０個の^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞（純度９５％～９８％）が作製され得ると推定された（図２３Ｆ）。
Ｂ．^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞におけるＴＣＲＶαおよびＶβ配列の分析（図２３）

次に、本発明者らは、健康なヒトドナーの末梢血から単離された従来型αβＴ細胞および内在性ヒトｉＮＫＴ細胞（それぞれ、ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞およびＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞として表す）のものと比較して、ＴＣＲレパートリーの^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を研究した。ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞は、ＴＣＲＶαおよびＶβ遺伝子の使用の非常に多様な分布を表した（図２３Ｆ）。ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞は、遍在性で、かつ非常に保存されたＴＣＲＶα配列ＴＲＡＶ１０／ＴＲＡＪ１８（Ｖα２４－Ｊα１８）、および主にＴＲＢＶ２５－１^＋（Ｖβ１１）であるがより多様なＴＣＲＶβ配列を示した（図２３Ｆ）。かなり対照的に、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、対立遺伝子の消失に起因する、ほとんど検出されない内在性ＴＣＲＶαおよびＶβ配列（図２３Ｆ）を伴う著しく低減された配列多様性を示した（Giannoni et al., 2013；Vatakis et al., 2013）。
Ｃ．^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性（図２４）

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞とは異なるが、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞のものと類似の典型的なｉＮＫＴ細胞表現型を表した。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８共受容体を混合パターン（ＣＤ４／ＣＤ８ＤＮおよびＣＤ８ＳＰ）で発現し、それらは、高レベルのメモリーＴ細胞マーカーのＣＤ４５ＲＯおよびＮＫ細胞マーカーのＣＤ１６１を発現した。加えて、それらは、末梢組織および炎症部位のホーミングマーカー（ＣＣＲ４、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３）も上方調節し（図２４Ａ）、ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞のものと比較して、極めて高レベルのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２などのエフェクターサイトカインならびにパーフォリンおよびグランザイムＢのような細胞傷害性分子を産生した（図２４Ｂ）。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の機能性を試験するために、本発明者らは、最初に、それらをαＧＣで刺激した。この抗原は、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、非常に高い割合で増殖させ（図２４Ｃ）、より高いレベルのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２を含むＴｈ０／Ｔｈ１サイトカインを分泌した（図２４Ｄ）。刺激の際に、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、無視できる量のＩＬ－４などのＴｈ２サイトカイン、およびＩＬ－１７などのＴｈ１７サイトカインを分泌し（図２４Ｄ）、これらのｉＮＫＴ細胞が、Ｔｈ０／Ｔｈ１に偏ったプロファイルを有していたことを示す。
Ｄ．^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の転写分析（図２４）

本発明者らは、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞、ならびに健康なドナーのＰＢＭＣ由来の従来型ＣＤ８^＋αβＴ（ＰＢＭＣ－αβＴｃ）細胞、γδＴ（ＰＢＭＣ－γδＴ）細胞、ＮＫ（ＰＢＭＣ－ＮＫ）細胞およびＣＤ８^＋ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞を含む他のリンパ細胞サブセットの全体的な遺伝子発現プロファイルを分析した。ＰＢＭＣ－αβＴｃ細胞、－ｉＮＫＴ細胞および－γδＴ細胞は、すべて、抗原／ＴＣＲ刺激によってｉｎｖｉｔｒｏで増幅され、ＰＢＭＣ－ＴＣ細胞および－ｉＮＫＴ細胞は、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と一致させるために、ＣＤ８^＋集団をフロー選別した。すべての集団についての全体的な発現プロファイルを使用する主成分分析は、ＣＢ由来とＰＢＳＣ由来の^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の両方が、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞に最も近く、ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞およびＰＢＭＣ－γδＴ細胞に次に最も近かったが、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞とは最も離れていたことを実証した（図２４Ｅ）。

自然型Ｔ細胞のＺＢＴＢ１６（ＰＬＺＦ）、Ｔｈ１型Ｔ細胞のＴＢＸ２１（Ｔ－ｂｅｔ）、ならびにＴＣＲシグナル伝達するＮＦＫＢ１およびＪＵＮの特徴的な転写因子は、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞において高く発現した。これらの転写因子は、ｉＮＫＴ細胞の作製およびエフェクター機能のために必要であった（Kovalovsky et al., 2008；Matsuda et al., 2006；Park et al., 2019）。しかしながら、これらの細胞は、低いＴｈ２およびＴＨ１７型の転写因子を表し（図２４Ｆ）、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＴｈ１傾向のエフェクター機能を示し、これは、サイトカインプロファイリングの結果と一致した（図２４Ｄ）。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の免疫原性を調べるために、本発明者らは、６つの細胞型においてＨＬＡ遺伝子発現を比較した。ＨＬＡ適合性は、幹細胞移植におけるドナー選択のための主な基準であり、ＨＬＡ不適合は、アロ反応性によって引き起こされる死亡のリスクを増加させる（Furst et al., 2019）。興味深いことに、ＣＢとＰＢＳＣに由来する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は両方とも、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－ＩＩトランス活性化因子を含むＨＬＡ分子の普遍的な低発現を表し（図２４Ｇ）、ＨＳＣで操作された細胞が、従来型ＰＢＭＣ細胞と比較して、生来の低い免疫原性であったことを示唆する。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞における低いＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子は、宿主のＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞の認識を良くする可能性があり、したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）応答を大きく低減する。これらの結果が強く支持する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、低い免疫原性を有する同種異系細胞療法のための理想的な候補である。

免疫チェックポイント阻害剤に関して、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞、ＰＢＭＣ－αβＴｃ細胞およびＰＢＭＣ－γδＴ細胞と比較して、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２のより低い発現を表した（図２４Ｈ）。エフェクター細胞において発現するこれらの免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞または抗原提示細胞において、それらのリガンドへの結合の際に細胞の活性化の阻害をもたらす（Darvin et al., 2018）。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞における免疫チェックポイント阻害剤の低い発現は、それらが腫瘍細胞を標的とする場合に、ｉＮＫＴ細胞の活性化を持続する可能性がある。注目すべきことには、最近の臨床データは、Ｔ細胞において低いＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１発現を有するがん患者が、チェックポイント遮断療法による処置の利益を経験し、延長された無進行生存を示す可能性がより高いことを示し（Brodyet al., 2017；Mazzaschi et al., 2018）、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞に基づくチェックポイント遮断併用療法の潜在的な臨床利益を示した。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＮＫ様細胞傷害性を反映して、ＮＣＡＭ１、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＫＬＲ２、ＫＬＲ３などを含むＮＫ活性化受容体遺伝子は、他の細胞型と比較して、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞において高く発現した（図２４Ｉ）。興味深いことに、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２などを含むＮＫ阻害性受容体遺伝子は、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と比較して、より低い発現を有していた（図２４Ｉ）。総合すれば、これらの観察は、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞が、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ経路により、腫瘍細胞へのより強い死滅能を示す可能性があることを示した。
Ｅ．ＮＫ経路による^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍標的化（図２５）

ｉＮＫＴ細胞は、狭義には、ＮＫ系列受容体を発現するＴ細胞系列として定義され（Bendelacet al., 2007）、したがって、本発明者らは、内在性ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と比較した、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＮＫ表現型および機能性を研究した。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と比較して、より高いレベルのＮＫ活性化受容体のＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１を発現し、より高いレベルの細胞傷害性分子のパーフォリンおよびグランザイムＢを産生した（図２５Ａ）。興味深いことに、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞活性化のための阻害性受容体として作用し、ＮＫ死滅からＭＨＣ適合「自己細胞」を防止する、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を発現しなかった（図２５Ａおよび２５Ｂ）（Ewenet al., 2018；Del Zotto et al., 2017）。

ＮＫ経路によるｉＮＫＴ細胞の直接死滅能を試験するために（Fujii et al.,2013；Vivier et al., 2012）、本発明者らは、ＣＤ１ｄ陰性腫瘍細胞を用いるｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍細胞死滅アッセイを利用した。本発明者らは、ヒト黒色腫細胞系Ａ３７５、ヒト骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２、ヒト粘膜表皮肺癌細胞系Ｈ２９２、ヒト腺癌細胞系ＰＣ３およびヒト多発性骨髄腫細胞系ＭＭ．１Ｓを含む５つのＣＤ１ｄ陰性腫瘍細胞系を試験した。５つの腫瘍細胞系はすべて、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）およびＥＧＦＰレポーターを過剰発現するように操作された（図３０Ａ）。腫瘍細胞におけるＣＤ１ｄ発現およびαＧＣ補充の非存在下で、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴは、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と比較して、５つの腫瘍細胞系すべてにわたって、より強く、より攻撃的な死滅能を示した（図２５Ｃ～２５Ｅおよび図３０Ｂ～３０Ｄ）。加えて、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、凍結保存後に強い抗腫瘍死滅を表したが、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞は、凍結－解凍サイクルに感受性であり、凍結保存後に減少した抗腫瘍能を有していた（図２５Ｃ～２５Ｅおよび図３０Ｂ～３０Ｄ）。抗ＮＫＧ２Ｄおよび抗ＤＮＡＭ－１遮断抗体を使用して、本発明者らは、Ａ３７５、Ｋ５６２、ＰＣ３およびＨ２９２細胞における^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞媒介細胞溶解が、ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１依存性であったが（図２５Ｆ～２５Ｈおよび図３０Ｅ～３０Ｆ）、ＭＭ．１Ｓ細胞における細胞溶解は、ＤＮＡＭ－１によって主に媒介された（図３０Ｇ）ことを明らかにした。これは、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞が、ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１依存性機構を介してＣＤ１ｄ陰性腫瘍細胞を死滅させ得ることを示唆した。
Ｆ．ヒト黒色腫異種移植マウスモデルにおけるＮＫ経路による固形腫瘍に対する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性（図２５）

ＮＫ経路による固形腫瘍に対する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を、ヒト黒色腫異種移植ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ）マウスモデルを使用して研究した。Ａ３７５－ＩＬ－１５－ＦＧ腫瘍細胞を、ＮＳＧマウスに皮下接種して、固形腫瘍を形成し、続いて、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣ－ＮＫ細胞の傍腫瘍注射を行った（図２５Ｉ）。ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と比較して、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞で処置されたマウスは、経時的な生物発光（ＢＬＩ）イメージング（図２５Ｊおよび図３０Ｈ）、腫瘍サイズ測定（図２５Ｋ）および最終腫瘍重量評価（図３０Ｉ）によって検出される腫瘍成長のより有意な抑制を表した。ｉｎｖｉｖｏからの^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の抗腫瘍効果のＮＫ経路依存性の劇的な増強は、固形腫瘍を処置するために^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の見込みのある治療可能性を実証した。
Ｇ．^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞におけるＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＢＣＡＲ）の操作（図２６）

本発明者らは、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞においてＢＣＡＲをさらに操作し、これは、ＢＣＭＡと４－１ＢＢエンドドメインに特異的な一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で武装していた。切断型ＥＧＦＲも、形質導入細胞を追跡するための表面マーカータグとして、含め、利用した（図３１Ａ）。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、レトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲレトロウイルスベクターで形質導入し、続いて、１～２週間、ＩＬ－７／ＩＬ－１５増幅させ、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現をもたらした（^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞として表す）（図２６Ａ）。レトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲレトロウイルスベクターを、成功裏に利用して、ＭＭを処置する進行中のフェーズＩ臨床試験のための自己ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＣＡＲ－Ｔ細胞として表す）を製造した（Timmers et al., 2019）。本発明者らは、操作されている従来型Ｔ細胞と同等の、生存可能で高く形質導入された（およそ３０％～８０％のＢＣＡＲ操作率）^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を成功裏に作製した（図２６Ｂ）。

^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を、２つの対照：１）健康なドナーの末梢Ｔ細胞由来のＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞、および２）健康なドナーの末梢Ｔ細胞をレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲレトロウイルスベクターを形質導入することによって作製されたＢＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、フローサイトメトリーを使用して研究した。^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、別個の表面表現型および機能性を表した。それらは、ＣＤ４およびＣＤ８共受容体を混合パターン（ＣＤ４／ＣＤ８ダブル陰性およびＣＤ８シングル陽性）で発現し、高レベルのメモリーＴ細胞マーカーのＣＤ４５ＲＯおよびＮＫ細胞マーカーのＣＤ１６１を発現した。加えて、それらは、末梢組織および炎症部位のホーミングマーカー（ＣＣＲ４、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３）も上方調節し（図３１Ｂ）、高レベルのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２などのエフェクターサイトカイン、ならびにＢＣＡＲ－ＴおよびＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞のものと同等のレベルまたはそれらよりも良好なレベルでパーフォリンおよびグランザイムＢのような細胞傷害性分子を産生した（図３１Ｃ）。
Ｈ．^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍攻撃機構（図２６）

本発明者らは、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍攻撃能を研究するためにｉｎｖｉｔｒｏ多発性骨髄腫（ＭＭ）腫瘍細胞死滅アッセイを確立した。ヒトＭＭ細胞系のＭＭ．１Ｓを、ヒトＣＤ１ｄ、ＦｌｕｃおよびＥＧＦＰレポーター遺伝子を過剰発現するように操作し、このアッセイのために使用したＭＭ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系をもたらした（図２６Ｃ）。重要なことには、大部分の原発性ＭＭ腫瘍細胞が、ＢＣＭＡとＣＤ１ｄの両方を発現し、これらの細胞を、ＢＣＡＲとｉＮＫＴＴＣＲの両方が媒介する標的化の対象にする（図２６Ｄ）。しかしながら、親ＭＭ．１Ｓ細胞は、ＢＣＭＡを発現するが、それらは、ＣＤ１ｄ発現を欠く。したがって、本発明者らは、原発性ＭＭ腫瘍細胞を模倣するために、ＭＭ．１Ｓ細胞においてＣＤ１ｄを過剰発現させた。結果として、三重腫瘍死滅機構が、ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴによって活用された（図２６Ｅ）。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、それら自身において、ＮＫ経路によりＭＭ腫瘍細胞を死滅させることが可能であり（図２６Ｆ）、αＧＣの存在下、細胞は、腫瘍死滅を促進するＴＣＲ媒介性死滅経路を活性化することが可能であった。加えて、操作されたＢＣＭＡ－ＣＡＲは、それらの有効性がＩＦＮ－γレベルと相関することが示されているので、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の腫瘍死滅有効性をさらに増強した（図２６Ｆ～２６Ｈ）。重要なことには、腫瘍抗原によって刺激される際に、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ６９、パーフォリンおよびグランザイムＢの上方調節によって証明されるように、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞よりも活性な表現型を表した（図３１Ｄおよび３１Ｅ）。固有のＣＡＲ／ＴＣＲ／ＮＫ媒介性三重腫瘍死滅機構は、本発明者らの^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を、ＭＭがん細胞を標的とするための強力で説得力のあるリソースにした。１つの追加の利益は、これらの細胞が、ＭＭ細胞がＢＣＡＲ標的化から回避することが可能であった自己ＢＣＡＲ－Ｔ療法の臨床試験における現象である抗原回避を潜在的に回避することができることである。さらにまた、プラットフォームとして^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を使用することによって、製品を、ＢＣＭＡの特異性を置き換えることによって他のタイプのがん処置に有益な他のＣＡＲで容易に武装させることができる。
Ｉ．ヒトＭＭ異種移植マウスモデルにおける血液系悪性腫瘍に対する^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性（図２６）

^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を、ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系を有するヒトＭＭ異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用して研究した。実験マウスを、１７５ｒａｄの全身照射で事前処置し、続いて、ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧの静脈内（ｉ．ｖ．）接種を行った。３日後、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴおよびＢＣＡＲ－Ｔを含むエフェクター細胞を、マウスにｉ．ｖ．注射した（図２６Ｉ）。^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とＢＣＡＲ－Ｔ細胞は両方とも、事前に確立された転移性ＭＭ腫瘍細胞を有効的に根絶した（図２６Ｊおよび２６Ｋ）。しかしながら、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を受けているマウスは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が原因で最終的に死亡した（図２６Ｌ）。対照的に、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を受けているマウスは、腫瘍なしであるのに加えて、ＧｖＨＤなしで長期生存した（図２６Ｌ）。これらの結果は、オフザシェルフ^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴに基づく免疫療法の安全性プロファイルおよび治療可能性を検証した。
Ｊ．^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のＧｖＨ応答の欠如（図２７）

ｉＮＫＴ細胞は不適合ＨＬＡ分子と反応しないので、それらは、ＧｖＨＤを引き起こさないと予想される（Haraguchi et al., 2004；de Lalla et al., 2011）。本発明者らは、確立されたｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイを使用して、ＧｖＨ応答を研究し、これは、ＩＦＮ－γ産生を読み取ることができる（図２７Ａおよび図３２Ｃ）。結果として、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は両方とも、それぞれ、従来型ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞およびＢＣＡＲ－Ｔ細胞とは対照的に、複数の不適合ドナーＰＢＭＣに対してＧｖＨ応答を誘導しなかった（図２７Ｂおよび図３２Ｄ）。

ヒトＭＭ異種移植ＮＳＧマウスにおいて、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とＢＣＡＲ－Ｔ細胞は両方とも有効に腫瘍を根絶したが、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴで処置されたマウスのみが、長期生存を示した（図２６Ｋおよび２６Ｌ）。^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を受けている腫瘍担持マウスからの組織分析は、ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を受けているものと比較して、肝臓、心臓、腎臓、肺および脾臓を含む組織への単核細胞の有意に少ない浸潤を示した（図２７Ｃおよび２７Ｅ）。浸潤は、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞（図２７Ｄおよび図３２Ａ）から主になり、ＧｖＨＤの発生を示した。

事前処置されたＮＳＧマウスに、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞またはドナー適合ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞を移植した（図３２Ｅ）。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の投与は、ヒトＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞が移植されたマウスと比較して、長期生存（図３２Ｆ）およびＧｖＨＤの欠如（図３２Ｇおよび３２Ｈ）を達成した。ＣＡＲ１９－ｉＮＫＴの抗リンパ腫活性を含む以前の研究では、ｉＮＫＴ処置マウスにおけるＧｖＨＤの欠如は、ヒト骨髄系細胞、および高度に精製されたｉＮＫＴ細胞の非存在に起因する可能性がある（Rotolo et al., 2018；Schroeder and DiPersio, 2011）。したがって、本発明者らは、Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣまたはドナー適合ＰＢＭＣと混合された^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を事前処理されたＮＳＧマウスに移植することによって、ＧｖＨＤをさらに試験した（図３２Ｉ）。述べたように、骨髄系細胞と混合された^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴを注射されたマウスにおいて起こるＧｖＨＤは、依然として存在しなかった（図３２Ｊ）。これらの結果は、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ療法の治療可能性を検証し、提案されたオフザシェルフ細胞療法の顕著な安全性プロファイルを強調した。
Ｋ．ガンシクロビル（ＧＣＶ）処置を介した^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の管理された枯渇（図２７）

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞製品の安全性プロファイルをさらに増強するために、本発明者らは、ヒトｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子送達ベクターにｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子を組み込み、これは、ＧＣＶ誘導性枯渇により、これらの細胞の消失を可能にした。グアノシンアナログであるＧＣＶを、プロドラッグとして臨床で使用して、免疫療法における安全管理として細胞製品における自殺効果を得た（Candolfi et al., 2009）。細胞培養では、ＧＣＶは、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の有効な死滅を誘導した（図３２Ｂ）。加えて、ｉｎｖｉｖｏ研究を、５日の連続した日の間、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴのｉ．ｖ．注射およびＧＣＶの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を用いてＮＳＧマウスにおいて行った（図２７Ｆ）。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、フローサイトメトリーによって測定して、肝臓、脾臓および肺においてＧＣＶ処置によって完全に枯渇させた（図２７Ｇおよび２７Ｈ）。したがって、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞製品は、強力な「死滅スイッチ」を備えており、その安全性プロファイルをさらに上昇させる。
Ｌ．^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の生来の低い免疫原性（図２８）

同種異系細胞療法について、１つの免疫原性の懸念は、宿主ＮＫ細胞媒介細胞傷害性である（Braudet al., 1998；Torikai et al., 2013）。本発明者らは、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞に対するＮＫ細胞死滅を研究するために、ｉｎｖｉｔｒｏＭＬＣアッセイを利用した（図２８Ａ）。興味深いことに、ＮＫ細胞は、同種異系ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞およびＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞に対する強い抵抗性を示したが、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞に対してより低い死滅を示し（図２８Ｂおよび２８Ｃ）、これは、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞におけるＮＫ活性化受容体のＮＫＧ２Ｄ（Cosmanet al., 2001）のためのリガンドであるＵＬＢＰの低い発現に起因する可能性があった（図２８Ｄおよび２８Ｅ）。

ＨｖＧ応答は、主に、対応する不適合ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を認識する従来型ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞による、宿主免疫細胞からの同種異系細胞の消失により媒介される同種異系細胞療法についての別の巨大な免疫原性の懸念である（Ren et al., 2017；Steimle et al., 1994）。ｉｎｖｉｔｒｏのＭＬＣアッセイでは、ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞およびＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞とは対照的に、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、複数の不適合ドナー由来のＰＢＭＣから低い応答を引き起こした（図２８Ｆ、２８Ｇ、２８Ｉ）。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の低いＨｖＧ応答は、それらの低いＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩ分子の発現によって引き起こされる可能性があり（図２８Ｈ～２８Ｊ）、これは、それらのＲＮＡｓｅｑの結果に一致する（図２４Ｇ）。
Ｍ．ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用のＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ）細胞の作製（図２９）

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ系のような強力な遺伝子編集ツールの利用可能性は、枯渇を標的にする宿主の免疫細胞に対してそれらを抵抗性にするｉＮＫＴ細胞の遺伝子操作を可能にした。本発明者らは、宿主ＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介死滅を回避するためにｉＮＫＴ細胞においてＨＬＡ－Ｉ分子の発現を除去するベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子をノックアウトし（Ren et al., 2017）、本発明者らは、宿主ＣＤ４^＋Ｔ細胞媒介死滅を回避するためにＨＬＡ－ＩＩ分子を除去するＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトした（Steimleet al., 1994）。Ｂ２ＭとＣＩＩＴＡ遺伝子は両方とも、ヒト初代細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のための効率的で実現可能な標的として実証されている（Abrahimiet al., 2015）。

レンチウイルスベクターのレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒＴＫで形質導入されたＣＤ３４^＋ＣＢ細胞またはＧ－ＣＳＦ動員ヒトＰＢＳＣを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体でさらに操作し、およそ５０～７０％のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ二重欠乏率を達成した（図２９Ａ）。段階１の培養では、遺伝子操作されたＨＳＣは、８週間にわたって、１００倍の増幅で、ＡＴＯ培養においてヒトｉＮＫＴ細胞に効率的に分化した（図２９Ｂおよび２９Ｃ）。段階２では、ｉＮＫＴ細胞を収集し、αＧＣでロードされた照射されたＰＢＭＣ（ＡＰＣとして）により、１週間、１０倍の増幅で、増幅させた。２ステップのＭＡＣＳ精製戦略をこれらに適用して、９７％を上回る純度で（＞９９％のｉＮＫＴ細胞、そのうち＞９７％がＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性細胞である）、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用のＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞（^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞として表す）を単離した（図２９Ｄ）。第１ステップは、表面のＨＬＡ－Ｉ／Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－ＩＩ分子に対して選択するＭＡＣＳ陰性選択を使用し、第２ステップは、表面のｉＮＫＴＴＣＲ分子について選択するＭＡＣＳ陽性選択であった。加えて、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、それらをレトロ／ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ｔＥＧＦＲレトロウイルスベクターで形質導入することによってさらに操作され、続いて、１週間、１０倍の増幅で、ＩＬ－１５増幅させ、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の汎用のＢＣＭＡＣＡＲで操作されたｉＮＫＴ（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞として表す）をもたらした（図２９Ａおよび２９Ｅ）。
Ｎ．^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞および^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の表現型、機能性および腫瘍死滅有効性

フローサイトメトリー分析は、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴが、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴおよび^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴとは類似するが、ＢＣＡＲ－Ｔ細胞とは異なる典型的なｉＮＫＴ細胞表現型を表した。予想通り、対照ＢＣＡＲ－Ｔ細胞は、高レベルのＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を発現したが、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ダブル陰性であり、同種異系療法に対するそれらの好適性を確認した（図３３Ａ）。ＣＤ４およびＣＤ８共受容体の混合パターン（ＣＤ４－ＣＤ８－およびＣＤ４－ＣＤ８^＋）を発現する^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴと^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴは両方とも、高レベルのメモリーＴ細胞マーカーのＣＤ４５ＲＯおよびＮＫ細胞マーカーのＣＤ１６１を発現し、高レベルの、ＩＦＮ－γなどのサイトカインならびにパーフォリンおよびグランザイムＢのような細胞傷害性分子を産生した（図３３Ａ）。ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧのｉｎｖｉｔｒｏの腫瘍死滅モデルでは、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の有効性で、ＭＭ腫瘍細胞を有効に死滅させた（図３３Ｇ～３３Ｉ）。重要なことには、αＧＣの存在下、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ＣＡＲとＴＣＲの両方が媒介する標的化能によるより強い腫瘍死滅を活用することができた（図３３Ｈ）。したがって、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ枯渇は、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴおよび^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴの発生、表現型および機能性に影響を与えず、オフザシェルフ細胞製品の製造を可能にする。その一方で、ｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子送達ベクター中のｓｒ３９ＴＫ自殺遺伝子は、ＧＣＶ誘導性枯渇により^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の消失を可能にし（図３３Ｄ）、細胞製品の安全性プロファイルを保証する。
Ｏ．^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の免疫原性（図２９）

次に、本発明者らは、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の免疫原性を試験した。ＧｖＨ応答について、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と同じように、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏのＭＬＣアッセイによって支持されるように、ＧｖＨ応答を誘導しなかった（図３３Ｂ～３３Ｄ）。ＨｖＧ応答について、表面のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子を欠くＣＲＩＳＰＲで操作された^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のように、それらはＨｖＧ応答を引き起こすと予想されず、これを、本発明者らは、ｉｎｖｉｔｒｏのＭＬＣアッセイにおいて検証した（図２９Ｆ）。従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞および^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とは対照的に、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、複数の不適合ドナー由来のレスポンダーＰＢＭＣＴ細胞からの応答を引き起こさなかった（図２９Ｇおよび図３３Ｅ）。これらの結果は、ＨｖＧ応答に抵抗性である、オフザシェルフ細胞療法のための理想的な候補である^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を強く支持する。同種異系ＮＫ応答について、細胞製品におけるＨＬＡ発現の欠如は、宿主ＮＫ細胞による拒絶のリスクを引き起こし得る（Braud et al., 1998；Torikai et al., 2013）。しかしながら、本発明者らは、^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と不適合ドナーのＮＫ細胞との共培養の間に、そのような拒絶を検出せず（図２９Ｈ、２９Ｉおよび図３３Ｆ）、本発明者らの細胞製品のＮＫ死滅抵抗性を示した。
Ｐ．ヒトＭＭ異種移植マウスモデルにおける血液系悪性腫瘍に対する^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性

^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を、ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系を有するヒトＭＭ異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用して研究した。事前処置されたマウスに、ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞をｉ．ｖ．接種した。３日後、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴおよびＢＣＡＲ－Ｔを含むエフェクター細胞を、マウスにｉ．ｖ．注射した（図２９Ｊ）。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とＢＣＡＲ－Ｔ細胞は両方とも、最初の６週間で、事前に確立された転移性ＭＭ腫瘍細胞を有効に根絶した（図２９Ｌおよび２９Ｋ）。しかしながら、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を受けているマウスは、ＧｖＨＤまたは腫瘍の再発のいずれかが原因で、最終的に死亡した（図２９Ｋおよび２９Ｍ）。ＭＭ腫瘍の再発は、脾臓、頭蓋、大腿骨、脾臓、肝臓および腸を含む複数の臓器で起こった（図３４）。対照的に、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を受けているマウスは、腫瘍なしであるのに加えて、ＧｖＨＤおよび腫瘍の再発なしで長期生存した（図２９Ｋ～２９Ｍ）。これらの結果は、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴに基づくがん療法の安全性プロファイルおよび治療可能性を実証した。
Ｑ．実験モデルおよび対象の詳細
１．マウス

ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ＳＣＩＤＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγ－／－、ＮＳＧ）マウスを、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ（ＵＣＬＡ）の動物施設において維持した。６～１０週齢のマウスを、他に指示されない限り、すべての実験のために使用した。すべての動物実験は、ＵＣＬＡのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
２．細胞系

ＭＳ５－ＤＬＬ４マウス骨髄に由来する間質細胞系を、ＵＣＬＡのＧａｙＣｒｏｏｋｓ博士の研究室から入手した。ヒト多発性骨髄腫癌細胞系ＭＭ．１Ｓ、慢性骨髄性白血病がん細胞系Ｋ５６２、黒色腫細胞系Ａ３７５、肺癌細胞系Ｈ２９２および前立腺がん細胞系ＰＣ３は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入した。ＭＭ．１Ｓ細胞は、１０％（体積／体積）のＦＢＳおよび１％（体積／体積）のペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｒ１０培地）中で培養した。Ｋ５６２細胞は、１０％（体積／体積）のＦＢＳ、１％（体積／体積）のペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％（体積／体積）のＭＥＭＮＥＡＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび５０ｕＭのβ－ＭＥを補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｃ１０培地）中で培養した。Ａ３７５、Ｈ２９２およびＰＣ３は、１０％（体積／体積）のＦＢＳおよび１％（体積／体積）のペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを補充されたＤＭＥＭ（Ｄ１０培地）中で培養した。ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ分析のための安定な腫瘍細胞系を、ヒトＣＤ１ｄ、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ならびに／またはホタルルシフェラーゼおよび高感度緑色蛍光タンパク質を過剰発現するレンチウイルスベクターで親細胞系を形質導入することによって作製した（Ｓｔａｒ方法を参照されたい）。
３．ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣおよびＰＢＭＣ細胞

臍帯血細胞を、ＨｅｍａＣａｒｅ（ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、米国）から購入した。Ｇ－ＣＳＦ動員された健康なドナーの末梢血細胞を、ＨｅｍａＣａｒｅまたはＣｉｎｃｉｎｎａｔｉＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ（ＣＣＨＭＣ）（ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、米国）から購入した。ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣを、ＣｌｉｎＭＡＣｓＣＤ３４^＋マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ、米国）を使用して、磁気活性化細胞選別により単離した。細胞を、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ＣｒｙｏｓｔｏｒＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅＳｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）中で凍結保存し、すべての実験および長期保管のために、液体窒素中で凍結した。健康なドナーのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＵＣＬＡ／ＣＦＡＲＶｉｒｏｌｏｇｙＣｏｒｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。
４．レンチウイルス／レトロウイルスベクターおよび形質導入

レンチ／ｉＮＫＴベクターおよびレンチウイルスを、以前に記載されたようにして（Zhuet al, 2019）、構築およびパッケージングした。

レトロ／ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲベクターを、親ＭＰ７１ベクターに、ヒトＢＣＭＡｓｃＦＶ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ｔＥＧＦＲをコードする合成遺伝子を挿入することによって構築した。合成遺伝子断片は、ＩＤＴから入手した。Ｖｓｖ－ｇ偽型のレトロ／ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲレトロウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を標準的なカルシウム沈殿プロトコールおよび超遠心分離濃縮プロトコール（Smith et al., 2016）に従ってトランスフェクトすることによって作製し、次いで、ウイルスを使用して、ＰＧ１３細胞を形質導入して、レトロ／ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲレトロウイルスを産生する安定なレトロウイルスパッケージング細胞系（ＰＧ１３－ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲ細胞系として表す）を作製した。レトロウイルス産生のために、ＰＧ１３－ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲ細胞を、１ｍｌあたり０．８×１０^６個細胞の密度でＤ１０培地に播種し、２日間、１５ｃｍディッシュ（ディッシュあたり３０ｍｌ）中で培養し、次いで、ウイルス上清を、回収し、将来の使用のために－８０℃で保管した。

健康なドナーのＰＢＭＣまたは^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、組換えヒトＩＬ－２（３００Ｕ／ｍＬ）の存在下、指示通りに、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ活性化因子ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で刺激した。２日目に、細胞を、確立されたプロトコールに従って（Zhu et al., 2019）、ポリブレン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充された凍結－解凍されたレトロ／ＢＣＡＲ－ＥＧＦＲレトロウイルス上清で、３０℃、６００ｇで、９０分間スピン感染させた。レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ）を、形質導入の効率を促進するために、形質導入の１日前にプレート上にコーティングすることができる。形質導入されたヒトＴ細胞または^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、さらに７～１０日間増幅させ、次いで、将来の使用のために凍結保存した。偽形質導入ヒトＴ細胞または^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を対照として作製した。形質導入率を、ＥＧＦＲ^＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって決定した。
５．抗体およびフローサイトメトリー

すべてのフローサイトメトリー染色を、ＰＢＳ中、４℃で１５分間行った。試料を、抗体染色の前に、マウスＦｃＢｌｏｃｋ（抗マウスＣＤ１６／３２）またはヒトＦｃ受容体ブロッキング溶液（ＴｒｕｅＳｔａｉｎＦｃＸ）と混合された固定可能な生存色素ｅＦｌｕｏｒ５０６（ｅ５０６）で染色した。抗体染色を、製造者の使用説明書に従って、希釈物で行った。ヒトＣＤ４５（クローンＨ１３０）、ＴＣＲαβ（クローンＩ２６）、ＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＣＤ４５ＲＯ（クローンＵＣＨＬ１）、ＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００）、ＣＤ１６１（クローンＨＰ－３Ｇ１０）、ＣＤ６９（クローンＦＮ５０）、ＣＤ５６（クローンＨＣＤ５６）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＤＲＥＧ－５６）、ＣＤ１４（クローンＨＣＤ１４）、ＣＤ１１ｂ（クローンＩＣＲＦ４４）、ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）、ＣＤ１ｄ（クローン５１．１）、ＣＣＲ４（クローンＬ２９１Ｈ４）、ＣＣＲ５（クローンＨＥＫ／１／８５ａ）、ＣＸＣＲ３（クローンＧ０２５Ｈ７）、ＮＫＧ２Ｄ（クローン１Ｄ１１）、ＤＮＡＭ－１（クローン１１Ａ８）、ＣＤ１５８（ＫＩＲ２ＤＬ１／Ｓ１／Ｓ３／Ｓ５）（クローンＨＰ－ＭＡ４）、ＩＦＮ－γ（クローンＢ２７）、グランザイムＢ（クローンＱＡ１６Ａ０２）、パーフォリン（クローンｄＧ９）、ＴＮＦ－α（クローンＭａｂ１１）、ＩＬ－２（クローンＭＱ１－１７Ｈ１２）、ＨＬＡＥ（クローン３Ｄ１２）、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）（クローン２Ｍ２）、ＨＬＡ－ＤＲ（クローンＬ２４３）に特異的な蛍光色素コンジュゲート化抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入し；ヒトＣＤ３４（クローン５８１）およびＴＣＲＶα２４－Ｊβ１８（クローン６Ｂ１１）に特異的な蛍光色素コンジュゲート化抗体は、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し；ヒトＶβ１１に特異的な蛍光色素コンジュゲート化抗体は、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。ヒトＦｃ受容体ブロッキング溶液（ＴｒｕｅＳｔａｉｎＦｃＸ）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入し、マウスＦｃＢｌｏｃｋ（抗マウスＣＤ１６／３２）は、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。固定可能な生存色素ｅ５０６は、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。細胞内サイトカインは、ＣｅｌｌＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して染色した。フローサイトメトリーは、ＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｚｅｒ１０フローサイトメーター（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して行い、データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアのバージョン９で分析した。
６．人工胸腺オルガノイドにおける^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞培養

ＣＤ３４^＋ＨＳＣ細胞を、以前に記載されたようにして（Zhuet al., 2019）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ３－Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充されたＸ－ＶＩＶＯ１５血清フリー造血細胞培地中、ｉＮＫＴＴＣＲベクターを運ぶレンチウイルスで形質導入した。人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）を、以前に確立されたプロトコール（Montel-Hagenet al., 2019；Seet et al., 2017）に従って作製した。ＭＳ５－ＤＬＬ４細胞を回収し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１％のグルタマックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４％のＢ２７サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＰＢＳ中で再構成された３０μＭのＬ－アスコルビン酸２－ホスフェートセスキマグネシウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で構成された、血清フリーＡＴＯ培養培地に再懸濁させた。１．５×１０^５～６×１０^５個のＭＳ５－ＤＬＬ４細胞を、１．５ｍｌの微小遠心管中でＡＴＯ凝集物ごとに３×１０^３～１×１０^５個の形質導入されたＨＳＣと混合し、３００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、細胞ペレットを、６μｌのＡＴＯ培地に再懸濁させ、０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌトランスウェルインサート（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に蒔いた。ＡＴＯ培養培地に、最終濃度が５ｎｇ／ｍｌで、ＦＬＴ３－Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）およびＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充し、週に２回交換した。ＡＴＯ凝集物を、回収し、さらなる染色または増幅のために、５０μｍのナイロンストレーナー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通過させることによって均質化した。
７．^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増幅

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、ＡＴＯ凝集物から回収し、単一の単核細胞に処理し、ｉｎｖｉｔｒｏ培養のために一緒にプールした。健康なドナー由来ＰＢＭＣを、５μｇ／ｍｌのαＧＣを含有する５ｍｌのＣ１０培地中で１時間、１×１０^７～１×１０^８個のＰＢＭＣを培養することによって、αＧＣでロードした。αＧＣがロードされたＰＢＭＣを、６，０００ｒａｄで照射し、次いで、１：１の比で^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞と混合した。これらの細胞を、ヒトＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充されたＣ１０培地中で１０～１４日間培養した。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、αＧＣがロードされたＰＢＭＣおよびＩＬ－７／ＩＬ－１５とともに、さらに１０～１４日間さらに増幅させ、次いで、将来の使用のために凍結保存した。
８．ＰＢＭＣ由来リンパ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増幅

健康なドナーのＰＢＭＣは、ＵＣＬＡ／ＣＦＡＲＶｉｒｏｌｏｇｙＣｏｒｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞およびＰＢＭＣ－γδＴ細胞を増幅するために使用した。ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞について、ＰＢＭＣを、指示通りにＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ活性化因子ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で刺激し、ヒトＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充されたＣ１０培地中で２～３週間培養した。ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞について、ｉＮＫＴ細胞を、抗ｉＮＫＴマイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ＰＢＭＣからＭＡＣＳ選別し、次いで、ヒトＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充されたＣ１０培地中、１：１の比で、ドナー適合の照射されたαＧＣがロードされたＰＢＭＣとともに２週間共培養した。ＰＢＭＣ－γδＴ細胞について、ＰＢＭＣを、ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）およびゾレドロネート（５ｕＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充されたＣ１０培地中で２週間培養し、次いで、ヒトＴＣＲγ／δ Ｔ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用してＭＡＣＳ選別した。
９．ＴＣＲレパートリーのディープシークエンシング

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞（６Ｂ１１^＋ＴＣＲαβ^＋）、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞（６Ｂ１１^＋ＴＣＲαβ^＋）およびＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞（６Ｂ１１^－ＴＣＲαβ^＋）をＦＡＣＳ選別した。ＲＮＡを、選別された細胞から直接抽出した。ｃＤＮＡライブラリーおよびディープシークエンシングを、ＵＣＬＡＴＣＧＢ（ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃｓａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）によって行った。ＴＣＲαおよびβ ＣＤＲ３領域の分析を、１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓＣｈｒｏｍｉｕｍ（商標）ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステム（１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ）によって、５０００リード／細胞で、２×１５０サイクルの設定を使用して行った。
１０．細胞の表現型および機能性研究

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞および^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を含む、複数のタイプの細胞の表現型および機能性を分析した。これらの細胞の表現型を、フローサイトメトリーを使用して、共受容体（ＣＤ４およびＣＤ８）を含む細胞表面マーカー、ＮＫ細胞マーカー（ＣＤ１６１、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ－１およびＫＩＲ）、メモリーＴ細胞マーカー（ＣＤ４５ＲＯ）およびホーミングマーカー（ＣＣＲ４、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３）を分析することによって研究した。サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２）および細胞傷害性因子（パーフォリンおよびグランザイムＢ）を産生する細胞の能力を、細胞固定化／透過処理キット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して研究した。ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞またはＢＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ分析対照として含めた。

抗原刺激に対する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の応答を、αＧＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、Ｃ１０培地中で^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで７日間培養することによって研究した。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の増殖を、経時的な細胞計数およびフローサイトメトリー（６Ｂ１１^＋ＴＣＲαβ^＋として同定）によって測定した。サイトカイン産生を、３日目に収集された細胞培養上清のＥＬＩＳＡ分析によって評価した（ヒトＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１７について）。
１１．酵素結合免疫吸着サイトカインアッセイ（ＥＬＩＳＡ）

ヒトサイトカインを検出するためのＥＬＩＳＡを、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの標準プロトコールに従って行った。共培養アッセイからの上清を、収集し、アッセイして、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＩＬ－１７を定量化した。サイトカインを検出するための捕捉およびビオチン化ペアは、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲートは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ヒトサイトカイン標準は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質は、ＫＰＬから購入した。試料を、ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度について分析した。
１２．ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）およびデータ分析

ＰＢＳＣ由来^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞、ＣＢ由来^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ（ＣＤ８^＋）細胞、ＰＢＭＣ－αβＴｃ（ＣＤ８^＋）細胞、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞およびＰＢＭＣ－Ｔγδ細胞をＦＡＣＳ選別した。すべての試料を、異なるドナーからの２～８回の独立した実験から選択した。総ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、これらの細胞から単離した。ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍａｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。

ｃＤＮＡライブラリー構築物およびディープシークエンシングを、ＵＣＬＡＴＣＧＢ（ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃｓａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）によって行った。シングルリードの５０ｂｐの配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ３０００において行った。総計で２５のライブラリーをマルチプレックス化し、３レーンで配列決定した。未加工の配列ファイルを得て、品質をＩｌｌｕｍｉｎａ所有のソフトウェアを使用してチェックし、ＮＣＢＩの遺伝子発現オムニバスで利用可能にした。
１３．ｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍死滅アッセイ

Ａ３７５－ＦＧ、Ｋ５６２－ＦＧ、ＰＣ３－ＦＧ、ＭＭ．１Ｓ－ＦＧまたはＨ２９２－ＦＧ腫瘍細胞（ウェルあたり１×１０^４個の細胞）を、Ｃｏｒｎｉｎｇの９６ウェルの透明な底の黒色プレートにおいて、ある特定の比で（図の凡例に示す）^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞とともにＣ１０培地中で２４時間共培養した。新たに選別されたか、または凍結保存されたＰＢＭＣ－ＮＫ細胞を対照として含めた。ＭＭ．１Ｓ－ＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞（ウェルあたり１×１０^４個の細胞）を、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルプレートの透明な底の黒色プレートにおいて、αＧＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）ありまたはなしで、ある特定の比で（図の凡例に示す）^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞または^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とともにＣ１０培地中で８～２４時間共培養した。ＰＢＭＣ－Ｔ細胞およびＢＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。培養の最後に、生きている腫瘍細胞を、Ｄ－ルシフェリン（１５０μｇ／ｍｌ）（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を細胞培養物に添加することによって検出し、ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用してルシフェラーゼ活性を読み取った。抗体ブロッキングアッセイでは、１０ｕｇ／ｍｌのＬＥＡＦＴＭ精製抗ヒトＮＫＧ２Ｄ（クローン１Ｄ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体（クローン１１Ａ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＬＥＡＦ（商標）精製マウスｌｇＧ２ｂｋアイソタイプ対照抗体（クローンＭＧ２Ｂ－５７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、エフェクター細胞を添加する１時間前に、腫瘍細胞培養物に添加した。
１４．ヒト黒色腫異種移植ＮＳＧマウスモデルにおける^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性研究

ＮＳＧマウス（６～１０週齢）を、１００ｒａｄの全身照射で事前処理し（－１日目）、次いで、１×１０^６個のＡ３７５－ＦＧ細胞を皮下に接種した（０日目）。２日目に、マウスを、ＢＬＩによって画像化し、異なる群に無作為化した。腫瘍接種の３日後（３日目）、マウスに、媒体（ＰＢＳ）、１．２×１０^７個の^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞または１．２×１０^７個のＰＢＭＣ－ＮＫ細胞をｉ．ｖ．注射した。経時的に、腫瘍量を、ＢＬＩを使用する全身発光、およびＦｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）Ｔｒａｃｅａｂｌｅ（商標）デジタルキャリパー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する腫瘍サイズ測定によってモニターした。腫瘍サイズを、Ｗ×Ｌｍｍ^２として計算した。およそ３週目で、マウスは、分析のために終了させ、固形腫瘍を回収し、ＰＡ８４精密測定用はかり（Ｏｈａｕｓ）を使用して秤量した。
１５．生きている動物の生物発光イメージング（ＢＬＩ）

イメージングの前に、マウスを２％のイソフルレン（ＺｏｅｔｉｓＵＫ）／医療用酸素で麻酔した。すべてのマウスは、スキャニング前に５分間、ＰＢＳ中のＤ－ルシフェリン（マウス１頭あたり１ｍｇ）の単回腹腔内注射を受けた。ＢＬＩを、ＩＶＩＳ１００イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して行った。イメージングの結果を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｉｎｇ２．５０ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ）を使用して分析した。
１６．ヒトＭＭ異種移植ＮＳＧマウスモデルにおける^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性研究

ＮＳＧマウスを、１７５ｒａｄの全身照射で事前処理し（－１日目）、次いで、１×１０^６個のＭＭ－ＣＤ１ｄ－ＦＧＦＰ細胞を皮下に接種した（０日目）。２日目に、マウスを、ＢＬＩによって画像化し、異なる群に無作為化した。腫瘍接種の３日後（３日目）、マウスは、媒体（ＰＢＳ）、７×１０^６個の^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞または７×１０^６個の従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞のｉ．ｖ．注射を受けた。腫瘍を、ＢＬＩによってモニターした。生存曲線を、マウスが腫瘍またはＧｖＨＤで死亡した場合に記録した。
１７．ガンシクロビル（ＧＣＶ）のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ死滅アッセイ

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、Ｃ１０培地中で培養した。用量設定された量のＧＣＶ（０～５０μＭ）を細胞培養物に添加した。４日後、生きている^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を計数した。ＧＣＶのｉｎｖｉｖｏ死滅アッセイを、ＮＳＧマウスにおいて行った。実験マウスに、１０×１０^６個の^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞をｉ．ｖ．注射し、人道的な安楽死の前に、５日の連続した日に、ＧＣＶのｉ．ｐ．注射をした（１日あたり注射あたり５０ｍｇ／ｋｇ）。脾臓、肝臓および肺を、収集し、均質化し、７０ｕＭの細胞ストレーナー（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通す濾過によって単一の単核細胞懸濁液に処理した。肝臓および肺由来の細胞を、室温（ＲＴ）でＰＢＳ中の３３％のＰｅｒｃｏｌｌに再懸濁させ、ＲＴで、破壊なしで８００ｇで３０分間回転させた。次いで、ペレット細胞を、ＲＴで１５～２０分間、ＴＡＣ緩衝液に再懸濁させて、赤血球を溶解させた。脾臓由来の細胞を、ＴＡＣ緩衝液に直接再懸濁させた。その後、細胞を、回転させ、Ｃ１０に再懸濁させ、染色のために準備した。^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、フローサイトメトリーによって検出した（ＣＤ４５^＋６Ｂ１１^＋細胞として同定）。
１８．組織学的分析

実験マウスから収集された心臓、肝臓、腎臓、肺および脾臓の組織を、最長で３６時間、１０％の中性緩衝化ホルマリン中で固定し、切片化（５μｍ厚さ）のためにパラフィン包埋した。組織切片を、ＵＣＬＡＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙＣｏｒｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙによる標準手順に従って、ヘマトキシリンおよびエオシン、または抗ヒトＣＤ３一次抗体のいずれかで染色した。染色された切片を、ＯｐｔｒｏｎｉｃｓＭａｃｒｏｆｉｒｅＣＣＤカメラ（ＡＵＯｐｔｒｏｎｉｃｓ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１正立顕微鏡を使用して、２０倍および４０倍の倍率で、画像化した。画像を、ＯｐｔｒｏｎｉｃｓＰｉｃｔｕｒｅＦｒａｍｅソフトウェア（ＡＵＯｐｔｒｏｎｉｃｓ）を使用して分析した。
１９．電気穿孔

ＣＤ３４^＋ＨＳＣを、９０×ｇで１０分間回転させ、次いで、２０μｌのＰ３溶液（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、スイス）に再懸濁させた。１μｌのｇＲＮＡ（１００μＭ）および４μｌのＣａｓ９（６．５ｍｇ／ｍｌ）を、反応毎にそれぞれの試料に添加した。細胞を、キュベットに添加し、ＥＲ－１００プログラムの下、Ａｍａｘａ４ＤＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸＵｎｉｔ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を使用して電気穿孔した。細胞を、電気穿孔後１０分間ＲＭで休ませ、次いで、ＡＴＯ培養前に終夜２４ウェルの組織培養処理プレートに移した
２０．ｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイ

ＧｖＨ応答を試験するために、異なるドナー由来のＰＢＭＣ（刺激剤として）を、２５００ｒａｄで照射し、Ｃ１０培地中９６ウェルプレートに播種し（５×１０^５個細胞／ウェル）、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞または^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（２×１０^４個細胞／ウェル）（レスポンダーとして）とともに共培養した。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞をレスポンダー対照として含めた。４日後、細胞培養の上清を、収集し、ＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。

ＨｖＧ応答を試験するために、異なるドナー由来のＰＢＭＣ（レスポンダーとして）を、Ｃ１０培地中９６ウェルプレートに播種し（２×１０^４個細胞／ウェル）、２５００ｒａｄで照射された^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞または^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞（５×１０^５個細胞／ウェル）（刺激剤として）とともに共培養した。ＰＢＭＣ－Ｔｃ、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴおよびＢＣＡＲ－Ｔを刺激剤対照として含めた。４日後、細胞培養の上清を、収集し、ＩＦＮ－γを、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。

同種異系ＮＫ細胞傷害性を試験するために、ドナー不適合ＰＢＭＣ－ＮＫを、収集し、Ｃ１０培地中９６ウェルプレートに播種し（２×１０^４個細胞／ウェル）、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴまたは^ＵＨＳＣ－ｉＮＫＴ（２×１０^４個細胞／ウェル）細胞とともに共培養した。ＰＢＭＣ－Ｔｃ細胞およびＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞を対照として含めた。フローサイトメトリーを使用して、示された日における細胞数を検出した。
２１．統計分析

ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈｐａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）を、統計学的データ分析のために使用した。スチューデントの両側ｔ検定を、ペアワイズ比較のために使用した。通常の一元配置分散分析とそれに続くチューキー多重比較検定を、多重比較のために使用した。多重比較のために調整されたログランク（マンテルコックス）検定を、マイヤーの生存曲線分析のために使用した。データは、他に指示されない限り、平均±ＳＥＭとして表す。すべての図および図の凡例において、「ｎ」は、示された実験において利用された試料または動物の数を表す。０．０５未満のＰ値を、有意と見なした。ｎｓ、有意ではない；^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
（実施例４）
オフザシェルフモノクローナルｉＮＫＴＴＣＲで武装した遺伝子操作されたＴ（ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞を作製するためのフィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法

インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、自然免疫および適応免疫をつなぐ能力を有するαβＴリンパ球の小さな下位集団である。従来型αβＴ細胞とは違って、ｉＮＫＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）それ自身の代わりに、ＭＨＣ様分子であるＣＤ１ｄによって提示された脂質抗原を認識する。この固有の性質のために、ｉＮＫＴ細胞は、同種異系移植された場合に、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。加えて、ｉＮＫＴ細胞は、がんのためのオフザシェルフ細胞療法を開発するためにそれらを理想的な細胞キャリアにするいくつかの他の固有の特徴を有する：１）それらは、がんの免疫監視において役割を有する；２）それらは、腫瘍抗原および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束性とは独立して腫瘍を標的とする顕著な能力を有する；３）それらは、直接死滅効果およびアジュバント効果により腫瘍細胞を攻撃する複数の機構を用い得る。しかしながら、同種異系のオフザシェルフｉＮＫＴ細胞製品の開発は、それらの利用可能性によって大きく妨げられ、これらの細胞は、ヒト中で、極めて少数かつ高い可変性であり（ヒト血液中におよそ０．００１～１％）、同種異系ヒトドナーの血液細胞から治療用の数のｉＮＫＴ細胞を産生することを非常に困難にする。

２つの以前の方法を使用して、治療的使用のために十分なｉＮＫＴ細胞が作製されている。１つの方法は、多数のドナーをスクリーニングすること、および末梢血中の高いパーセンテージのｉＮＫＴ細胞を生来有する「スーパードナー」を見出すことである。ｉＮＫＴ細胞は、磁気ビーズに基づく精製手順によって濃縮され、次いで、抗ＣＤ３／ＣＤ８ビーズ刺激またはアルファ－ガラクトシルセラミド（αＧＣ）がロードされた抗原提示細胞との共培養のいずれかによって、増幅される。増幅はこの方法によって達成することができるが、増幅倍率は限定されており、増幅倍数は信頼できない。別の方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）のｉＮＫＴＴＣＲによる遺伝子改変、それに続くヒトＨＳＣのｉＮＫＴ細胞へのｉｎｖｉｔｒｏ分化を支持する人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養系に基づく。この方法は、高収率でｉＮＫＴ細胞を作製することができるが、産生は、マウス起源のフィーダー細胞の使用を必要とし、これは、ＧＭＰ適合製造のための信頼できるプロセスを開発するための重大な課題をもたらす。

したがって、フィーダーフリー分化系を用いて大量のｉＮＫＴ細胞の均質なモノクローナル集団を確実に作製することができる新規の方法は、オフザシェルフｉＮＫＴ細胞療法の開発に極めて重要である。
Ａ．ＣＭＣ研究－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞、ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞（図３５）

Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血ＨＳＣ（ＰＢＳＣ）または臍帯血（ＣＢＨＳＣ）由来のＨＳＣを、ヒトｉＮＫＴＴＣＲ遺伝子および自殺／ＰＥＴイメージング遺伝子をコードするレンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫベクターで形質導入し、次いで、フィーダーフリーｅｘｖｉｖｏＴＡＲＧＥＴ細胞培養に入れて、ｉＮＫＴＴＣＲで武装した遺伝子操作されたＴ（ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞を作製した（図３５Ａおよび３５Ｂ）。ＰＢＳＣとＣＢＨＳＣは両方とも、効率的に、モノクローナルｉＴＡＲＧＥＴ細胞に分化および増幅し（図３５Ｃおよび３５Ｄ）、これを、両方のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩを欠乏するようにさらに操作して、汎用のｉＴＡＲＧＥＴ（ＵｉＴＡＲＧＥＴ）細胞をもたらすことができ（図３５Ｅ）、ＣＡＲを発現するようにさらに操作して、ＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞をもたらすことができる（図３５Ｆ）。およそ１０^１２個スケールのＵＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞を、健康なドナーのＰＢＳＣから産生することができ、これは１，０００～１０，０００用量（１用量あたりおよそ１０^８～１０^９個の細胞）に製剤化することができ、およそ１０^１１個スケールのＵＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞を、ＣＢ試料のＨＳＣから産生することができ、これは１００～１，０００用量に製剤化することができると推測される（図３５Ａおよび３５Ｂ）。細胞収率の相違にもかかわらず、ＰＢＳＣおよびＣＢＨＳＣから作製されたｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびそれらの派生物は、類似の表現型および機能性を表した。他に指示されない限り、ＣＢＨＳＣ由来ｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびそれらの派生物を、下記に記載の原理証明研究のために利用した。
Ｂ．薬理学研究－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞および^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞（図３６）

ｉＴＡＲＧＥＴ細胞および^ＵｉＴＡＲＧＥＴ（ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞の表現型および機能性を、フローサイトメトリーを使用して研究した（図３６）。３つの対照を含めた：１）健康なドナーの末梢血から単離され、αＧＣ刺激によりｉｎｖｉｔｒｏで増幅されたネイティブヒトｉＮＫＴ細胞、ｈＴＣＲαβ^＋６Ｂ１１^＋として同定され、ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞として表される；２）健康なドナーの末梢血から単離され、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によりｉｎｖｉｔｒｏで増幅されたネイティブヒト従来型αβＴ細胞、ｈＴＣＲαβ^＋６Ｂ１１^－として同定され、ＰＢＭＣ－Ｔ細胞として表される；および３）健康なドナーの末梢血から単離されたネイティブヒトＮＫ細胞、ｈＴＣＲαβ^－ｈＣＤ５６^＋として同定され、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞として表される。

予想通り、３つのタイプのネイティブヒト免疫細胞（ＰＢＭＣ－ｉＮＫＴ細胞、ＰＢＭＣ－Ｔ細胞およびＰＢＭＣ－ＮＫ細胞）はすべて、均質に、高レベルのＨＬＡ－Ｉ分子および混合の高／低レベルのＨＬＡ－ＩＩ分子を発現したが、^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、優性にダブル陰性（＞７０％）であり、同種異系療法に対するそれらの好適性を確認した（図３６、左パネル）。興味深いことに、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ遺伝子編集なしでさえ、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、低レベルのＨＬＡ－ＩＩ分子を既に発現しており、これらの細胞がネイティブヒトｉＮＫＴ／Ｔ／ＮＫ細胞と比較して、生来の低い免疫原性であることを示唆する（図３６、左パネル）。それにもかかわらず、ＨＬＡ－ＩＩ発現は、ＣＩＩＴＡ遺伝子編集によってさらに低減され得る（^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞において）。

^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞とｉＴＡＲＧＥＴ細胞は両方とも、典型的なヒトｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を表した：それらは、混合パターン（ＣＤ４／ＣＤ８ダブル陰性およびＣＤ８シングル陽性）でＣＤ４およびＣＤ８共受容体を発現した；それらは、高レベルのメモリーＴ細胞マーカーのＣＤ４５ＲＯおよびＮＫ細胞マーカーのＣＤ１６１を発現した；ならびに、それらは、極めて高レベルの複数のエフェクターサイトカイン（ＩＦＮ－γなど）および細胞傷害性分子（パーフォリンおよびグランザイムＢなど）を産生し、ネイティブｉＮＫＴ細胞と似ていた（図３６）。興味深いことに、^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、ネイティブｉＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞のものよりも高いレベルで一部のＮＫ活性化受容体（ＮＫＧ２Ｄ）を発現したが、その一方で、これらの細胞は、阻害性ＮＫ受容体（ＫＩＲ）を発現せず、ネイティブｉＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞とは非常に異なった（図３６）。これらの結果は、^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞およびｉＴＡＲＧＥＴ細胞が、ネイティブｉＮＫＴ細胞、およびさらにネイティブＮＫ細胞のものよりも強い増強されたＮＫパスの腫瘍死滅能を有し得ることを示唆する。重要なことには、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ欠乏は、^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞の開発または表現型／機能性のいずれも妨げず、このオフザシェルフ細胞製品の製造を可能にする。
Ｃ．薬理学研究－ＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞（図３７）

ＢＣＭＡＣＡＲで操作されたｉＴＡＲＧＥＴ（ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞の表現型および機能性を、フローサイトメトリーを使用して研究した（図３７）。健康なドナーの末梢血Ｔ細胞のＢＣＭＡ－ＣＡＲ操作により作製されたＢＣＭＡ－ＣＡＲで操作された従来型αβＴ（ＢＣＡＲ－Ｔ）細胞を対照として含めた。

予想通り、対照のＢＣＡＲ－Ｔ細胞は、高レベルのＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を発現した。興味深いことに、ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、低レベルのＨＬＡ－ＩＩ分子を発現し、これらの細胞が、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、生来の低い免疫原性であることを示唆する（図３７、左パネル）。ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、典型的なヒトｉＮＫＴ細胞の表現型および機能性を表した：それらは、混合パターン（ＣＤ４／ＣＤ８ダブル陰性、ＣＤ８シングル陽性）でＣＤ４およびＣＤ８共受容体を発現した；それらは、高レベルのメモリーＴ細胞マーカーのＣＤ４５ＲＯおよびＮＫ細胞マーカーのＣＤ１６１を発現した；ならびに、それらは、高レベルのＩＦＮ－γのようなエフェクターサイトカインおよびグランザイムＢのような細胞傷害性分子を、それらの対応物の従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と同等またはそれらよりも良好に産生した。

興味深いことに、ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、極めて高レベルのＮＫＧ２Ｄのようなある特定のＮＫ活性化受容体を発現し、ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞が、ＣＡＲ媒介経路およびＮＫ受容体媒介経路の両方により腫瘍細胞を死滅させ得ることを示唆した。
Ｄ．ｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞（図３８）

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような追加の腫瘍標的化分子を発現するように操作されなくても、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、ｉＮＫＴＴＣＲ媒介経路およびＮＫ受容体媒介経路により腫瘍細胞を標的とすることが可能であるはずである。本発明者らは、そのような腫瘍死滅能を研究するためにｉｎｖｉｔｒｏの腫瘍細胞死滅アッセイを確立した（図３８Ａ）。さまざまなヒト腫瘍細胞系を、ヒトＣＤ１ｄ、ならびにホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）および高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のデュアルレポーターを過剰発現するように操作した。ヒトＣＤ１ｄの発現は、腫瘍細胞が、内在性腫瘍脂質抗原またはαＧＣのような合成脂質抗原などのｉＮＫＴＴＣＲ同族糖脂質抗原を提示することを可能にするためである。ＦｌｕｃおよびＥＧＦＰの発現は、鋭敏なルシフェラーゼ活性アッセイおよびフローサイトメトリーアッセイを使用して、腫瘍細胞死滅の検出を容易にする。ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ、ヒト黒色腫細胞系Ａ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ、およびヒト慢性骨髄性白血病がん細胞系Ｋ５６２－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧを含む、３つの操作されたヒト腫瘍細胞系をこの研究において使用した（図３８Ａ）。ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、αＧＣ刺激の非存在下でＭＭ、Ａ３７５およびＫ５６２腫瘍細胞を有効に死滅させ、腫瘍死滅有効性は、αＧＣ刺激の存在下でさらに増強された（図３８Ｂおよび３８Ｃ）。

これらの結果は、ｉＮＫＴＴＣＲ／ＣＤ１ｄ／脂質抗原依存性機構によるか、または抗原非依存性ＮＫパス媒介機構による、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の腫瘍死滅能を証明した。
Ｅ．ｉｎｖｉｔｒｏ有効性およびＭＯＡ研究－ＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞（図３９）

本発明者らは、この研究のためにｉｎｖｉｔｒｏの腫瘍細胞死滅アッセイを確立した（図３９Ａ）。ＢＣＭＡ－ＣＡＲで操作されたｉＴＡＲＧＥＴ（ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞をエフェクター細胞として研究した。２つのヒト腫瘍細胞系をこの研究に含めた：１）ＢＣＭＡ^＋であり、ＣＡＲ媒介死滅の標的としての機能を果たす、ヒトＭＭ細胞系のＭＭ．１Ｓ；および２）ＢＣＭＡ－であり、ＣＡＲ媒介死滅の陰性対照標的としての機能を果たす、ヒト黒色腫細胞系のＡ３７５。両方のヒト腫瘍細胞系を、ヒトＣＤ１ｄ、ならびにホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）および高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のデュアルレポーターを過剰発現するように操作した（図３９Ｂ）。ヒトＣＤ１ｄの発現は、腫瘍細胞が、内在性腫瘍脂質抗原またはαＧＣのような合成脂質抗原などのｉＮＫＴＴＣＲ同族糖脂質抗原を提示することを可能にし、ＣＤ１ｄ＋腫瘍細胞を、ｉＮＫＴＴＣＲ／ＣＤ１ｄ／糖抗原媒介腫瘍死滅経路に対して感受性にする。ＦｌｕｃおよびＥＧＦＰの発現は、鋭敏なルシフェラーゼ活性アッセイおよびフローサイトメトリーアッセイを使用して、腫瘍細胞死滅の検出を容易にする。次いで、得られたＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系およびＡ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ細胞系を利用した。

ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、推定ではＮＫ死滅パスにより、ある特定の有効性でＡ３７５－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞を死滅させ、腫瘍死滅有効性は、おそらくＴＣＲ／ＣＤ１ｄ／αＧＣ死滅パスの追加により、αＧＣの存在下でさらに増強された（図３９Ｃ）。したがって、ＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、ＣＡＲ非依存性機構により、腫瘍を標的にすることができる。

ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と同等またはそれよりも良好な有効性で、ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧ腫瘍細胞を有効に死滅させた（図３９Ｄ）。重要なことには、同族脂質抗原（αＧＣ）の存在下、従来型ＰＢＭＣ－Ｔ細胞ではないが、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、おそらくＴＣＲ／ＣＤ１ｄ／αＧＣ腫瘍死滅パスの活性化のせいで、増強された腫瘍死滅有効性を実証した（図３９Ｅ）。この研究では、ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞が、αＧＣの非存在下で最大の腫瘍死滅を既に示し、これが、αＧＣ添加後の可能性がある腫瘍死滅増強を研究することを困難にすることに留意されたい（図３９Ｅ）。相乗的な腫瘍死滅効果は、ＣＡＲ媒介腫瘍死滅が準最適である条件下で研究することができる。

総合すれば、これらの結果は、ＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞が、３つの機構：１）ＣＡＲ依存性パス、２）ｉＮＫＴＴＣＲ依存性パス、および３）ＮＫパスを使用して、腫瘍を標的にすることができることを示す（図３９Ｆ）。ＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞のこの固有の三重標的化能は、それが、腫瘍細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞からの攻撃を回避するために自身によるＣＡＲ標的化抗原の発現を下方調節した同種異系ＣＡＲ－Ｔ療法の臨床試験で報告された現象である抗原回避を潜在的に回避することができるので、魅力的である。
Ｆ．免疫原性研究－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞および^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞（図４０）

同種異系細胞療法について、２つの免疫原性の懸念：ａ）ＧｖＨＤ応答、およびｂ）宿主対移植片（ＨｖＧ）応答が存在する。本発明者らは、意図される^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞製品についての可能性があるＧｖＨＤおよびＨｖＧのリスクを考慮し、操作された軽減戦略および安全管理戦略を評価した（図４０Ａ）。ｉＴＡＲＧＥＴ細胞も研究に含めた。

ＧｖＨＤは、主要な安全性の懸念である。しかしながら、ｉＮＫＴ細胞は、不適合ＨＬＡ分子およびタンパク質自己抗原と反応しないので、それらは、ＧｖＨＤ^１２を誘導するとは予想されない。この見解は、同種異系ＨＳＣ移入および自己ｉＮＫＴ移入^{１０、１１}のヒト臨床経験におけるＧｖＨＤの欠如によって証明され、本発明者らのｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）アッセイによって支持される（図４０Ｂおよび４０Ｃ）。従来型ＰＢＭＣ－Ｔ細胞のものとはかなり対照的に、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞も^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞も同種異系ＰＢＭＣに応答しなかったことに留意されたい（図４０Ｂおよび４０Ｃ）。

他方で、ＨｖＧのリスクは、大部分は有効性の懸念であり、宿主免疫細胞によって、主に、不適合ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子を認識する従来型ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞による同種異系治療用細胞の消失によって媒介される。^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子のそれらの表面提示を除去するようにＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ遺伝子編集で操作され、したがって、宿主Ｔ細胞媒介応答を誘導しないと予想される（図３６および図４０Ａ）。実際に、ｉｎｖｉｔｒｏのＭＬＣアッセイでは、従来型ＰＢＭＣ－Ｔ細胞およびｉＴＡＲＧＥＴ細胞とは対照的に、^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、複数の不適合ドナー由来のＰＢＭＣＴ細胞から有意に低減された応答を引き起こした（図４０Ｄおよび４０Ｅ）。従来型ＰＢＭＣ－Ｔ細胞と比較して、おそらくそれらの非常に低レベルのＨＬＡ－ＩＩ分子の発現のせいで、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞が、低減された免疫原性を既に示したことに留意されたい（図３６）。この研究において使用された^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞製品が、精製ステップを通っておらず、したがって、およそ２０％のＨＬＡ－Ｉ^＋ＨＬＡ－ＩＩ^ｌｏ細胞集団を依然として含有していたことにも留意されたい（図３６）。ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞の純度は、細胞表面のＨＬＡ－Ｉ／Ｂ２Ｍに対する（Ｂ２Ｍを認識する２Ｍ２モノクローナル抗体による）およびＨＬＡ－ＩＩ分子に対する（ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを認識するＴｕ３９モノクローナル抗体による）ＭＡＣＳ陰性選択により好都合に濃縮することができ、高純度で均質な細胞製品をもたらす（＞９５％のｈＴＣＲαβ^＋６Ｂ１１^＋ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ^－細胞）。精製された^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞製品は、同種異系レシピエントにおける宿主のＴ細胞（ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋従来型Ｔ細胞の両方）媒介枯渇に対して完全に抵抗性であると予想される。表面ＨＬＡ－Ｉ発現の欠如は、^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞を宿主のＮＫ細胞媒介枯渇に対して感受性にし得、これは、^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞をＨＬＡ－Ｅを過剰発現するようにさらに操作することによって軽減することができる（図３５Ａおよび３５Ｂ）。

総合すれば、これらの結果は、ＧｖＨＤがなく、ＨｖＧ抵抗性である、オフザシェルフ細胞療法のための理想的な候補として^ＵｉＴＡＲＧＥＴ細胞を強く支持する。
Ｇ．安全性研究－ＰＥＴイメージングおよび安全管理のためのｓｒ３９ＴＫ遺伝子（ｉＴＡＲＧＥＴ細胞）（図４１）

ｉＴＡＲＧＥＴ細胞製品の安全性プロファイルをさらに増強するために、本発明者らは、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞において、ｓｒ３９ＴＫＰＥＴイメージング／自殺遺伝子を操作し、これは、深刻な有害事象の場合において、ＰＥＴイメージングおよびＧＣＶ誘導性枯渇によるこれらの細胞の消失を使用して、これらの細胞のｉｎｖｉｖｏモニタリングを可能にする（図３５Ａおよび３５Ｂ）。細胞培養では、ＧＣＶは、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の有効な死滅を誘導した（図４１Ａ）。パイロットｉｎｖｉｖｏ研究を、ヒトＨＳＣで操作されたｉＮＫＴ（ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ）細胞を保持するＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫヒト化マウスを使用して行った（図４１Ｂ）。ＨＳＣ－ｉＮＫＴ^ＢＬＴ細胞を、レンチ／ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫレンチウイルスベクターで形質導入されたヒトＨＳＣから操作し、同じベクターを、原理証明研究においてｉＴＡＲＧＥＴ細胞製品を操作するために使用した。ＣＴスキャンと組み合わせたＰＥＴイメージングを使用して、本発明者らは、ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスのリンパ組織全体にわたる、特に、骨髄（ＢＭ）および脾臓における遺伝子操作されたヒト細胞の分布を検出した（図４１Ｃ）。ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスをＧＣＶで処置すると、身体全体にわたって遺伝子操作されたヒト細胞が効率的に枯渇した（図４１Ｃ）。重要なことには、ＧＣＶ誘導性枯渇は、フローサイトメトリーによって測定した場合の、ＢＬＴ－ｉＮＫＴ^ＴＫマウスにおける、他のヒト免疫細胞ではなく、ＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞の選択的枯渇によって証明されたように、特異的であった（図４１Ｄ）。したがって、ｉＴＡＲＧＥＴ細胞製品は、強力な「死滅スイッチ」を備えており、それらの安全性プロファイルをさらに増強する。
Ｈ．比較研究－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞製品の固有の性質（図４２）

ヒトｉＮＫＴ細胞製品を作製する既存の方法は、ヒトＰＢＭＣ細胞培養物から、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）培養物から、および他の起源から、ヒトｉＮＫＴ細胞を増幅させることを含む（図４２）。これらの培養方法はすべて、ヒトｉＮＫＴ細胞および他の細胞、特に、同種異系レシピエントに移入された場合にＧｖＨＤを引き起こし得る異種の従来型αβＴ（Ｔｃ）細胞を含有する混合細胞集団から出発する（図４２）。結果として、これらの既存の方法は、ＧｖＨＤを回避するために、「オフザシェルフ」ｉＮＫＴ細胞製品を作製するための精製ステップを必要とする。ｉＴＡＲＧＥＴ細胞培養は、２つの態様において固有である：１）これは、無作為に再構成された内在性ＴＣＲを産生するためのＴＣＲＶ／Ｄ／Ｊ組換えを支持せず、それによりＧｖＨＤのリスクなしである；２）トランスジェニックＴＡＲＧＥＴ細胞の分化同調を支持し、それにより未分化の始原細胞および他の系列の免疫細胞の存在を排除する。結果として、ＴＡＲＧＥＴ細胞製品は、純粋で、均質で、ＧｖＨＤのリスクがなく、したがって、精製ステップの必要性はない。
Ｉ．ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ有効性研究

図４７は、ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞によるｉｎｖｉｖｏのヒトＭＭ成長の有効な抑制を実証する。
（実施例５）
オフザシェルフモノクローナルＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍抗原特異的ＴＣＲで武装した遺伝子操作されたＴ（ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ）細胞を作製するためのフィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法

αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、それぞれの発生期Ｔ細胞の固有の特異性を決定する。Ｔ細胞表面上でのＣＤ３シグナル伝達タンパク質とのアセンブリーの際に、ＴＣＲは、有核細胞の表面上のＭＨＣ分子によって提示されるペプチドリガンドを監視する。ペプチド－ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの特異性は、ＭＨＣ分子の提示と提示されるペプチドの両方によって決定される。ＭＨＣ遺伝子座（ヒトにおいてＨＬＡ遺伝子座としても公知）は、民族の下位群全体にわたって頻度が大きく変わる＞１８，０００のＭＨＣクラスＩおよびＩＩ対立遺伝子を含むヒトゲノム中の最も多い複対立遺伝子座である。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるリガンドは、内因的に発現する抗原のプロテアソーム切断に主に由来する。感染細胞およびがん細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって外来性または異常として認識されるペプチドを提示し、提示する細胞のＴ細胞媒介死滅をもたらす。

ＣＴＡＧ１Ｂ遺伝子の産物のＮＹ－ＥＳＯ－１は、オフザシェルフＴＣＲ細胞療法のための魅力的な標的である。プロトタイプのがん精巣抗原として、ＮＹ－ＥＳＯ－１は、正常な非生殖系列組織において発現しないが、これは、多くの腫瘍において異常に発現している。異常な発現の頻度は、より高グレードの転移性腫瘍組織において観察される増加した発現を伴って、固形腫瘍の中で１０～５０％、黒色腫の２５～５０％、滑膜肉腫の最高で８０％の範囲である。また、ＮＹ－ＥＳＯ－１は、非常に免疫原性であり、さまざまなＭＨＣ対立遺伝子によって提示される複数のエピトープに対する自然発生およびワクチン誘導性のＴ細胞免疫応答を引き起こす。結果として、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によって提示されるエピトープＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）は、遺伝子療法の治験において同族１Ｇ４ＴＣＲで標的とされ、それぞれ、転移性黒色腫および滑膜肉腫を有する患者の５５％および６１％で目的の応答を生じ、標的化に関する有害事象を生じなかった。多発性骨髄腫を有する患者におけるレンチウイルス媒介ＴＣＲ遺伝子療法によるこの同じＡ２拘束性エピトープの標的化は、顕著な安全性の懸念なく、７０％の完全またはほぼ完全な応答を同様にもたらした。療法に応答する大部分の患者は、数か月以内に再発し、ＭＨＣＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失は、腫瘍がＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１／ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５を標的とする養子Ｔ細胞療法を回避する機構として報告されている。したがって、ＮＹ－ＥＳＯ－１は、さまざまな腫瘍のタイプにわたって発現し、診療所において安全に標的とされる、腫瘍特異的で免疫原性のパブリックな抗原である。

したがって、オフザシェルフＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲで武装したＴＡＲＧＥＴ（ｅｓｏＴＡＲＧＥＴ）細胞製品は、高い治療可能性および必要性のものである。

この実施例に関するある特定の実施形態は、図４３～４６において実証される。

図４８に示すのは、本開示の方法によって産生した細胞のｉｎｖｉｖｏ有効性である。ｅｓｏＴ細胞（ＥＳＯＴＣＲで操作された末梢血ヒトＣＤ８Ｔ細胞）と同等またはそれよりも良好な有効性でのｅｓｏＴＡＲＧＥＴ細胞によるｉｎｖｉｖｏのヒト黒色腫固形腫瘍成長の腫瘍抗原特異的抑制に留意されたい。
（実施例６）
オフザシェルフモノクローナルｉＮＫＴＴＣＲで武装したナチュラルキラー（ｉＴＡＮＫ）細胞を作製するためのフィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法

１型インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、非多型性非古典的ＭＨＣクラスＩ様分子のＣＤ１ｄによって提示される糖脂質抗原を認識する。そのため、ｉＮＫＴ細胞は、同種異系レシピエントに養子移入された場合に、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。ｉＮＫＴＴＣＲは、インバリアントアルファ鎖（マウスにおけるＶα１４－Ｊα１８；ヒトにおけるＶα２４－Ｊα１８）、および選ばれた少数のベータ鎖の（マウスにおいて、主にＶβ８／Ｖβ７／Ｖβ２；ヒトにおいて主にＶβ１１）を含む。マウスおよびヒトのｉＮＫＴ細胞は両方とも、合成アゴニスト糖脂質リガンドのアルファ－ガラクトシルセラミド（αＧＣ、またはα－ＧＣ、またはα－ＧａｌＣｅｒ）に応答する。

オフザシェルフｉＮＫＴＴＣＲで武装したＴＡＮＫ（ｉＴＡＮＫ）細胞製品およびその派生物のＣＡＲで操作されたｉＴＡＮＫ（ＣＡＲ－ｉＴＡＮＫ）は、治療可能性があり得る新規の細胞製品である。

この実施例に関するある特定の実施形態は、図４９～５２において実証される。
（実施例７）
オフザシェルフモノクローナルＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍抗原特異的ＴＣＲで武装したナチュラルキラー（ｅｓｏＴＡＮＫ）細胞を作製するためのフィーダーフリーｅｘｖｉｖｏ分化培養方法

αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、それぞれの発生期Ｔ細胞の固有の特異性を決定する。Ｔ細胞表面上でのＣＤ３シグナル伝達タンパク質とのアセンブリーの際に、ＴＣＲは、有核細胞の表面上のＭＨＣ分子によって提示されるペプチドリガンドを監視する。ペプチド－ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの特異性は、ＭＨＣ分子の提示と提示されるペプチドの両方によって決定される。ＭＨＣ遺伝子座（ヒトにおいてＨＬＡ遺伝子座としても公知）は、民族の下位群全体にわたって頻度が大きく変わる＞１８，０００のＭＨＣクラスＩおよびＩＩ対立遺伝子を含むヒトゲノム中の最も多い複対立遺伝子座である。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるリガンドは、内因的に発現する抗原のプロテアソーム切断に主に由来する。感染細胞およびがん細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって外来性または異常として認識されるペプチドを提示し、提示する細胞のＴ細胞媒介死滅をもたらす。

ＣＴＡＧ１Ｂ遺伝子の産物のＮＹ－ＥＳＯ－１は、オフザシェルフＴＣＲ細胞療法のための魅力的な標的である。プロトタイプのがん精巣抗原として、ＮＹ－ＥＳＯ－１は、正常な非生殖系列組織において発現しないが、これは、多くの腫瘍において異常に発現している。異常な発現の頻度は、より高グレードの転移性腫瘍組織において観察される増加した発現を伴って、固形腫瘍の中で１０～５０％、黒色腫の２５～５０％、滑膜肉腫の最高で８０％の範囲である。また、ＮＹ－ＥＳＯ－１は、非常に免疫原性であり、さまざまなＭＨＣ対立遺伝子によって提示される複数のエピトープに対する自然発生およびワクチン誘導性のＴ細胞免疫応答を引き起こす。結果として、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によって提示されるエピトープＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５}（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）は、遺伝子療法の治験において同族１Ｇ４ＴＣＲで標的とされ、それぞれ、転移性黒色腫および滑膜肉腫を有する患者の５５％および６１％で目的の応答を生じ、標的化に関する有害事象を生じなかった。多発性骨髄腫を有する患者におけるレンチウイルス媒介ＴＣＲ遺伝子療法によるこの同じＡ２拘束性エピトープの標的化は、顕著な安全性の懸念なく、７０％の完全またはほぼ完全な応答を同様にもたらした。療法に応答する大部分の患者は、数か月以内に再発し、ＭＨＣＩ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失は、腫瘍がＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１／ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５}を標的とする養子Ｔ細胞療法を回避する機構として報告されている。したがって、ＮＹ－ＥＳＯ－１は、さまざまな腫瘍のタイプにわたって発現し、診療所において安全に標的とされる、腫瘍特異的で免疫原性のパブリックな抗原である。

したがって、オフザシェルフＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲで武装したＮＫ（ｅｓｏＴＡＮＫ）細胞製品は、高い治療可能性および必要性のものである。

この実施例に関するある特定の実施形態は、図５３～５６において実証される。
（実施例８）
がん免疫療法のための造血幹細胞で操作されたＩＬ－１５で増強されたオフザシェルフＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞

ＩＬ－１５で増強されたＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ（^{ＩＬ－１５}ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ）細胞を、造血幹細胞をレンチ／ｉＮＫＴ－ＢＣＡＲ－ＩＬ－１５レンチウイルスベクターで形質導入することによって操作した。ＩＬ－１５増強は、ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞の発生を妨げなかった。図５７Ａ～５７Ｃは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、ＩＬ－１５－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗がん有効性を研究した。ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞と比較して、^{ＩＬ－１５}ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は同等のｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍有効性を示した。図５８Ａ～５８Ｅは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｖｏ研究を行って、ＩＬ－１５－ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗がん有効性を研究した。ＭＭ．１Ｓ－ｈＣＤ１ｄ－ＦＧヒト多発性骨髄腫異種移植ＮＳＧマウスモデルを使用した。ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞と比較して、^{ＩＬ－１５}ＢＣＡＲ－ｉＴＡＲＧＥＴ細胞は、有意に改善されたｉｎｖｉｖｏ持続性に関連する有意に増強されたｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を示した。図５９Ａ～５９Ｆは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。
（実施例９）
がん免疫療法のための造血幹細胞で操作されたオフザシェルフＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製するためのｅｘｖｉｖｏのフィーダーフリー培養方法

がん免疫療法は、がんと闘うヒト免疫系の本来の力を役立て、増強することを目標にしている。１世紀を超える探求の後、重大なブレイクスルーが、過去数年間に達成された１。特に、キメラ抗原受容体で操作されたＴ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞療法は、前例のない臨床有効性を示し、Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって最近承認され、多発性骨髄腫（ＭＭ）を処置するためのＦＤＡ承認は、２０２０年中と予想される２。これらのブレイクスルーは、新たな時代の始まりを表し、がん医薬を一変させる。

ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および機能を再指示する合成受容体である。対応する抗原を認識するようにＣＡＲを設計することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、広範囲のがん、および多くの他の疾患を標的にすることができる。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の可能性がある臨床適用は莫大であり、さまざまなＣＡＲ－Ｔ細胞療法が、現在、活発に開発中である。

最初の２つのＦＤＡで承認されたＣＡＲ－Ｔ療法であるＫｙｍｒｉａｈおよびＹｅｓｃａｒｔａは、それぞれ、４７５，０００ドルおよび３７３，０００ドルの価格が付けられている。それらは、個別化された自己ＣＡＲ－Ｔ細胞製品がそれぞれの患者のために製造される必要があり、その１人の患者を処置するためにのみ使用され得るので、非常に高価である。また、自己ＣＡＲ－Ｔ細胞製品の製造は、部位ごとに大きく変わり、常に成功するわけではない。法外な価格および製造の矛盾は、必要とする数百万人の患者に強力なＣＡＲ－Ｔ細胞療法を届けることを困難にする。したがって、一元化された場所で劇的に低減された費用で大スケールで製造することができ、必要とするすべての患者に迅速に流通させるために事前に保管することができる、汎用の標準化されたオフザシェルフＣＡＲ－Ｔ細胞製品を開発することは最重要である。

同種異系の従来型ａｂＴ細胞は、オフザシェルフＣＡＲ－Ｔ細胞製品を開発するために利用されている。しかしながら、これらのＴ細胞は、それらが、同種異系の宿主に移入された場合に移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を誘導するリスクがあるという点で重大な制限を有する。遺伝子編集ツールは、ＧｖＨＤのリスクを軽減することを目標として、そのようなＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を妨害させるために適用されている。しかしながら、細胞におけるＴＣＲ発現の完全な消失を達成することが重要な製造課題であり、ＧｖＨＤは、これらの同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞製品の臨床試験の試験において観察されている。したがって、ＧｖＨＤのリスクを有さない代替の同種異系細胞の利用は、安全で汎用のオフザシェルフＣＡＲ－Ｔ細胞製品を開発するための魅力的な選択肢である。

本明細書において、がんを標的とする同種異系および／または汎用のＣＡＲで操作されたｉＮＫＴを作製することによって開発されたがんのためのオフザシェルフ細胞療法を開示する。

遺伝子送達レンチウイルスベクターを、これらの研究における使用のために構築した。図６０Ａ～５７Ｄは、これらのベクターの構築に関する実施形態および結果を示す。

同種異系のｉＮＫＴ（^ＡｌｌｏｉＮＫＴ）細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ（^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞および^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を、造血幹細胞をレンチ－ｉＮＫＴ－ｓｒ３９ＴＫ、レンチ－ｉＮＫＴ－ＣＡＲ１９およびレンチ－ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴレンチウイルスベクターで形質導入することによって操作した。図６１Ａ～６１Ｇは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ＦＡＣＳ分析を実施して、^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の表現型を特徴付けた。抗原刺激に応答する^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の増幅を評価するｉｎｖｉｔｒｏ研究を実施して、^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の機能性を特徴付けた。図６２Ａ～６２Ｅは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞の抗がん有効性および作用機構を研究した。^ＡｌｌｏｉＮＫＴ細胞は、ＴＣＲ依存性とＴＣＲ非依存性（すなわち、ＮＫパスを介して）の機構の両方を使用して、複数のタイプのヒトがん細胞を有効に死滅させた。図６３Ａ～６３Ｃは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗がん有効性および作用機構を研究した。^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と同等またはそれよりも良好な有効性で、ＮＫ／ＴＣＲ／ＣＡＲ三重機構を使用して、ヒト多発性骨髄腫の腫瘍細胞を有効に死滅させた。図６４Ａ～６４Ｄは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗がん有効性および作用機構を研究した。^ＡｌｌｏＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、従来型ＣＡＲ１９－Ｔ細胞と同等またはそれよりも良好な有効性で、ＮＫ／ＴＣＲ／ＣＡＲ三重機構を使用して、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞を有効に死滅させた。図６５Ａ～６５Ｂは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｖｏ研究を行って、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の抗がん有効性を研究した。ＭＭ．１Ｓ－ＦＧヒト多発性骨髄腫異種移植ＮＳＧマウスモデルを利用した。従来型ＰＢＭＣ由来ＢＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞とＢＣＡＲ－Ｔ細胞は両方とも、ＭＭ細胞を有効に消失させた。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＭ細胞を消失させただけでなく、ＧｖＨＤに起因してレシピエントマウスも死滅させた。対照的に、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ＭＭ細胞を消失させ、ＧｖＨＤを引き起こさず、長寿命の腫瘍なしのレシピエントマウスをもたらした。従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、有意により低いレベルの表面ＰＤ－１を発現し、有意により高いレベルのグランザイムＢを産生した。ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、増強された腫瘍ホーミングを示した。図６６Ａ～６６Ｇは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ混合リンパ球（ＭＬＣ）アッセイを使用して、従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と比較する^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の免疫原性を研究した。従来型ＢＣＡＲ－Ｔ細胞と異なって、^ＡｌｌｏＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、ＧｖＨ応答を示さず、ＨｖＧ応答を有意に低減した。図６７Ａ～６７Ｄは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

同種異系のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性の「汎用」ＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ（^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ）細胞も作製および特徴付けた。「理想的な」ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、以下の基準を満たさなければならない：１）ｉＮＫＴＴＣＲを発現して、ＧｖＨＤを回避し、アルファ－ガラクトシルセラミド（αＧＣ）刺激に応答し、ＣＤ１ｄの認識を介してＭＭを標的にする；２）ＢＣＭＡＣＡＲを発現して、ＢＣＭＡの認識を介してＭＭを標的にする；３）同種異系の宿主ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞による枯渇に抵抗するように、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を欠く；４）ＨＬＡ－Ｅ分子を発現して、同種異系の宿主ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による枯渇に抵抗する；ならびに５）自殺遺伝子を発現して、追加の安全管理を提供する（図６８Ｂ）。巧みな２本柱の戦略は、これらのＨＳＣ遺伝子操作の目標を達成する：第１に、ｉＮＫＴＴＣＲのａおよびｂ鎖の対（ｉＮＫＴ）、ＢＣＭＡＣＡＲ（ＢＣＡＲ）、ＨＬＡ－Ｅ分子（ＨＬＡＥ）およびチミジンキナーゼ自殺遺伝子（ＳＧ）をコードする、レンチ／ｉＮＫＴ－ＢＣＡＲ－ＨＬＡＥ－ＳＧレンチウイルスベクターを、成功裏に構築して、ＣＤ３４＋ＨＳＣに５つすべての導入遺伝子を効率的に共送達した；第２に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｂ２Ｍ－ＣＩＩＴＡ－ｇＲＮＡ複合体を、成功裏に作製して、ＣＤ３４＋ＨＳＣにおいてベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）およびクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子を効率的に破壊し、表面ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子の非存在下、操作されたＨＳＧおよびそれらの子孫のｉＮＫＴ細胞をもたらした（図６８Ｃ）。他のＳＧおよび遺伝子編集ツールを使用してもよいが、一部の実施形態では、チミジンキナーゼＳＧおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ツールが使用される（図６８Ｃ）。

これらの技術革新を使用して、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞を作製した。臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＣを遺伝子操作し、次いで、ｅｘｖｉｖｏのＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞培養に置いた（図６８Ａおよび６８Ｄ）。細胞収率は素晴らしかった：１人のＣＢドナーから、およそ１０^１１個の^ＵＢＣＡＲｉＮＫＴ細胞（ＦＤＡで承認されたＣＡＲ－Ｔ療法の標準に基づいて１用量あたり１０^８～１０^９個の細胞と仮定して、１００～１，０００用量のオフザシェルフ細胞製品に潜在的に製剤化され得る細胞）が作製された（図６８Ｄ）。^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品は、高い表面ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ除去率で、純粋かつ均質であった（図６８Ｄ）。機能的には、これらの^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞は、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ（ＢＣＡＲ－Ｔ）細胞と同等またはそれよりも良好に、ＭＭ腫瘍細胞を有効に死滅させた（図６８Ｄ）。免疫原性研究は、これらの^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞が、移植片対宿主（ＧｖＨ）応答を誘導せず、宿主対移植片（ＨｖＧ）応答に抵抗性であったことを示した（図６８Ｄ）。総合すれば、これらのパイロット研究は、^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞製品を開発するための明確な進路を指し示す。

^ＵＢＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞の表現型および免疫原性も特徴づけた。図６９Ａ～６９Ｇは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。
（実施例１０）
がん免疫療法のための造血幹細胞で操作されたオフザシェルフ細胞傷害性ＣＤ８細胞を作製するためのｅｘｖｉｖｏフィーダーフリー培養方法

ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ（^ＡｌｌｏｅｓｏＴ）細胞を、造血幹細胞をレンチウイルスベクターで形質導入することによって操作した。表現型を、ＦＡＣＳを使用して特徴付けた。図７０Ａ～７０Ｅおよび図７３Ａ～７３Ｅは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の抗がん能および有効性を研究した。図７１Ａ～７１Ｏは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の安全性を評価し、遺伝子編集を使用して細胞の免疫原性を低減した。^ＵｅｓｏＴ細胞も操作し、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の安全性および免疫原性と比較した。図７２Ａ～７２Ｏは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。ＰＢＭＣ－ｅｓｏＴ細胞も得、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の安全性および免疫原性と比較した。図７２Ａ～７２Ｏおよび図７７Ａ～７７Ｅは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏＦＡＣＳ分析を行って、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の表現型および機能性を特徴付けた。図７４Ａ～７４Ｂは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の抗原応答および腫瘍死滅能を評価した。図７５Ａ～７５Ｇは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｖｏ研究を行って、^ＡｌｌｏｅｓｏＴ細胞の抗がん有効性を研究した。図７６Ａ～７６Ｆは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

^ＵｅｓｏＴ細胞を、造血幹細胞をレンチウイルスベクターで形質導入することによって操作した。表現型および機能性を、ＦＡＣＳを使用して特徴付けた。図７８Ａ～７８Ｄは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。
（実施例１１）
同種異系のＨＣＴに関連する移植片対宿主病の予防のためのＨＳＣで操作されたオフザシェルフｉＮＫＴ細胞

ＨＳＣで操作されたヒトｉＮＫＴ細胞を、造血細胞をレンチウイルスベクターで形質導入すること、およびＢＬＴマウスへの養子移入を行うことによって操作した。図７９Ａ～７９Ｂは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞を、造血幹細胞をレンチウイルスベクターで形質導入すること、ＡＴＯ系中で培養して、細胞を分化させること、および増幅培養においてαＧＣで刺激することによって、操作した。図８０Ａ～８０Ｃは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

混合リンパ球反応アッセイを含むｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞がＴ細胞のアロ反応性を低減することを実証した。図８１Ａ～８１Ｂは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞が、同種異系の骨髄性ＡＰＣを標的にすることを決定した。図８２Ａ～８２Ｃは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｖｏ研究を行って、ｉＮＫＴ細胞が、ＮＳＧマウスにおける同種異系Ｔ細胞増殖およびＧｖＨＤを防止することを示した。図８３Ａ～８３Ｄ、８４Ａ～８４Ｃおよび８５Ａ～８５Ｂは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ｉｎｖｉｔｒｏ研究を行って、^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞が、Ｕ９３７およびＨＬ６０ＡＭＬ腫瘍細胞に対して抗がん有効性および抗がん能を示すことを実証した。図８６Ａ～８６Ｄ、８７Ａ～８７Ｂ、および８８Ａ～８８Ｆ、および８９Ａ～８９Ｆは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

ヒトマウス異種移植モデルを、ｉｎｖｉｖｏ研究において使用して、ＡＭＬに対する^ＡｌｌｏＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞の有効性を実証した。図９０Ａ～９０Ｄは、これらの研究に関する実施形態および結果を示す。

本開示およびその利点を詳細に記載してきたが、さまざまな変更、置換および代替を、添付の特許請求の範囲によって定義される精神および設計の範囲から逸脱することなく、本明細書において行うことができることが理解されるべきである。また、本出願の範囲は、本明細書に記載の、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図しない。当業者は、本開示から、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを容易に理解するので、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を行うか、もしくは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するもの、または後に開発されるものを、本開示に従って利用してもよい。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップをそれらの範囲内に含むことが意図される。

本開示およびその利点を詳細に記載してきたが、さまざまな変更、置換および代替を、添付の特許請求の範囲によって定義される精神および設計の範囲から逸脱することなく、本明細書において行うことができることが理解されるべきである。また、本出願の範囲は、本明細書に記載の、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図しない。当業者は、本開示から、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを容易に理解するので、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を行うか、もしくは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するもの、または後に開発されるものを、本開示に従って利用してもよい。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップをそれらの範囲内に含むことが意図される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）幹または始原細胞を選択するステップ；
ｂ）少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；および
ｃ）前記細胞を培養して前記細胞のＴ細胞への分化を誘導するステップ
を含み、ａ）、ｂ）および／またはｃ）が、前記細胞を、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞の集団と接触させるステップを含まない、方法。
(項目２)
ｃ）が、フィーダーフリーである培養を含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記幹または始原細胞がＣＤ３４ ^＋細胞を含む、項目１または２に記載の方法。
(項目４)
ａ）の前記細胞が、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＭＣＰ－４、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
前記細胞が、レトロネクチン、ＤＬＬ４、ＤＬＬ１、および／またはＶＣＡＭ１でコーティングされた表面で培養された、項目４の記載の方法。
(項目６)
ａ）の前記細胞が、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－３、５～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．５～５ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、ＩＬ－６、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、ＥＰＯ、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、および／または１０～１００ｎｇ／ｍｌのｈＦＬＴ３Ｌのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された、項目５に記載の方法。
(項目７)
ａ）の前記細胞が、１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－３、２０～２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、ＩＬ－６、１５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、ＥＰＯ、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、および／または５０ｎｇ／ｍｌのｈＦＬＴ３Ｌのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された、項目６に記載の方法。
(項目８)
ａ）の前記細胞が、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数とともに１２～７２時間、培養された、項目４または５に記載の方法。
(項目９)
前記ＴＣＲが、ｉＮＫＴＴＣＲを含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記ｉＮＫＴＴＣＲが、α－ＧＣに特異的に結合する、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記ＴＣＲが、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を特異的に認識するＴＣＲを含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原が、ＮＹ－ＥＳＯ－１ _{１５７－１６５} を含む、項目１１に記載の方法 _。
(項目１３)
ｃ）が、分化および／または増幅培地中で前記細胞を培養することを含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
ｃ）が、前記細胞を、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数と接触させることを含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの前記１つまたは複数が、組織培養プレートまたはマイクロビーズ表面にコーティングされる、項目１４に記載の方法。
(項目１６)
ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの前記１つまたは複数が、０．１～１０μｇ／ｍｌのＤＬＬ４と０．０１～１μｇ／ｍｌのＶＣＡＭ１とを含むコーティング組成物を使用して前記組織培養プレートにコーティングされる、項目１５に記載の方法。
(項目１７)
ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの前記１つまたは複数が、０．５μｇ／ｍｌのＤＬＬ４と０．１μｇ／ｍｌのＶＣＡＭ１とを含むコーティング組成物を使用してコーティングされる、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記増幅または分化培地が、イスコフＭＤＭ、血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン、および／または２－メルカプトエタノールのうちの１つまたは複数を含む、項目１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９)
前記増幅または分化培地が、アスコルビン酸、ヒト血清、Ｂ２７サプリメント、グルタマックス、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－７、ＭＣＰ－４、ＩＬ－６、ＴＰＯ、およびＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む、項目１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記増幅または分化培地が、５０～５００μＭアスコルビン酸、ヒト血清、１～１０％Ｂ２７サプリメント、０．１～１０％グルタマックス、２～５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ、２～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．１～１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、０～１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、および１．５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
前記増幅または分化培地が、１００μＭアスコルビン酸、ヒト血清、４％Ｂ２７サプリメント、１％グルタマックス、２～５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ、２～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．１～１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、０～１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、および１．５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
前記細胞を刺激および／または増幅するステップをさらに含む、項目１から２１のいずれかに記載の方法。
(項目２３)
前記細胞を刺激または増幅するステップが、前記細胞を、前記ＴＣＲに特異的に結合する抗原と接触させることを含む、項目２２の記載の方法。
(項目２４)
前記細胞を刺激または増幅するステップが、前記細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２および／もしくは抗ＣＤ２８抗体、またはその／それらの抗原結合断片と接触させることを含む、項目２２または２３に記載の方法。
(項目２５)
前記細胞を刺激または増幅するステップが、増幅培地中で前記細胞を培養することを含む、項目２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６)
前記細胞をα－ＧＣと接触させることにより前記細胞を刺激および／または増幅するステップを含む、項目２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２７)
前記細胞をＩＬ－１５およびＩＬ－７の一方または両方と接触させるステップをさらに含む、および／または前記増幅培地がＩＬ－１５またはＩＬ－７の一方または両方を含む、項目１から２６のいずれかに記載の方法。
(項目２８)
前記増幅培地が、５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および／または５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含む、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
前記増幅培地が、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および／または５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含む、項目２８に記載の方法。
(項目３０)
前記細胞を、ヒト血清抗体、グルタマックス、緩衝剤、抗菌剤、およびＮ－アセチル－Ｌ－システインのうちの１つまたは複数と接触させるステップをさらに含む、および／または前記増幅培地が、ヒト血清抗体、グルタマックス、緩衝剤、抗菌剤、およびＮ－アセチル－Ｌ－システインのうちの１つまたは複数を含む、項目１から２９のいずれか一項に記載の方法。
(項目３１)
前記細胞を抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８コーティングビーズと接触させることにより、前記細胞を活性化するステップをさらに含む、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法。
(項目３２)
ＣＡＲ分子および／またはＨＬＡ－Ｅ遺伝子を含む核酸を、前記細胞に移入するステップをさらに含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
(項目３３)
前記ＣＡＲ分子および／またはＨＬＡ－Ｅ遺伝子を含む核酸が、レトロウイルス感染により前記細胞に移入される、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記細胞をレトロネクチンと接触させるステップをさらに含む、項目１から３３のいずれか一項に記載の方法。
(項目３５)
前記細胞が、健康な対象、および／またはがんを有さない対象から単離される、項目１から３４のいずれか一項に記載の方法。
(項目３６)
ａ、ｂ、ｃ、または前記方法全体が、前記細胞をフィーダー細胞の集団と接触させるステップ方法を含まない、項目１から３５のいずれか一項に記載の方法。
(項目３７)
ａ、ｂ、ｃ、または前記方法全体が、前記細胞を間質細胞の集団と接触させるステップ方法を含まない、項目１から３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
ａ、ｂ、ｃ、または前記方法全体が、前記細胞をノッチリガンドともその断片とも接触させるステップ方法を含まない、項目１から３７のいずれか一項に記載の方法。
(項目３９)
前記細胞が、分化した造血細胞を含む集団からのＣＤ３４ ^＋細胞である、項目１から３８のいずれか一項に記載の方法。
(項目４０)
前記分化した造血細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、項目３９に記載の方法。
(項目４１)
前記幹または始原細胞が、臍帯血細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または骨髄細胞を含む、項目１から３８のいずれか一項に記載の方法。
(項目４２)
ＣＤ３４ ^＋細胞を単離するステップをさらに含む、項目３から４１のいずれかに記載の方法。
(項目４３)
選択されたＣＤ３４ ^＋細胞を培地中で培養するステップを、１つまたは複数の核酸を前記細胞に導入するステップの前にさらに含む、項目３から４２のいずれかに記載の方法。
(項目４４)
培養するステップが、前記選択されたＣＤ３４ ^＋細胞を、１つまたは複数の増殖因子を含む培地とともにインキュベートすることを含む、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
前記１つまたは複数の増殖因子が、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む、項目４４に記載の方法。
(項目４６)
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、α－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目１から４５のいずれかに記載の方法。
(項目４７)
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、β－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目１から４６のいずれか一項に記載の方法。
(項目４８)
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、α－ＴＣＲとβ－ＴＣＲの両方をコードする核酸を含む、項目１から４７のいずれかに記載の方法。
(項目４９)
前記１つまたは複数の核酸のうちの第１の核酸が、α－ＴＣＲをコードする核酸配列を含み、前記１つまたは複数の核酸のうちの第２の核酸が、β－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目１から４８のいずれかに記載の方法。
(項目５０)
前記選択されたＣＤ３４ ^＋細胞に、自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目５１)
１つの核酸が、前記α－ＴＣＲと前記β－ＴＣＲの両方をコードする、項目５０に記載の方法。
(項目５２)
１つの核酸が、前記α－ＴＣＲ、前記β－ＴＣＲ、および前記自殺遺伝子をコードする、項目５１に記載の方法。
(項目５３)
前記自殺遺伝子が、酵素に基づいている、項目５０から５２のいずれかに記載の方法。
(項目５４)
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、項目５３に記載の方法。
(項目５５)
ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、項目５４に記載の方法。
(項目５６)
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、項目５４に記載の方法。
(項目５７)
自殺遺伝子産物が、基質により活性化される、項目５０から５６のいずれかに記載の方法。
(項目５８)
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、項目５７に記載の方法。
(項目５９)
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである、項目５８に記載の方法。
(項目６０)
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫである、項目５６から５９のいずれかに記載の方法。
(項目６１)
前記Ｔ細胞のゲノムが、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することによって少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように変更された、項目１から６０のいずれかに記載の方法。
(項目６２)
単離されたヒトＣＤ３４ ^＋細胞における細胞表面ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の発現を消失させることが、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記細胞に導入することを含む、項目６１に記載の方法。
(項目６３)
ＣＲＩＳＰＲまたは前記１つもしくは複数のｇＲＮＡが、電気穿孔または脂質媒介トランスフェクションにより前記細胞にトランスフェクトされる、項目６２に記載の方法。
(項目６４)
前記ＴＣＲ受容体をコードする前記核酸が、組換えベクターを使用して前記細胞に導入される、項目１から６３のいずれかに記載の方法。
(項目６５)
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、項目６４に記載の方法集団。
(項目６６)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、項目６５に記載の方法。
(項目６７)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目６６に記載の方法。
(項目６８)
ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を欠いているＴ細胞を選択することが、マイクロビーズまたはフローサイトメトリーを使用する、Ｔ細胞の正の選択およびＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性細胞の負の選択を含む、項目１から６７のいずれかに記載の方法。
(項目６９)
前記Ｔ細胞が凍結される、項目１から６８のいずれかに記載の方法。
(項目７０)
前記Ｔ細胞が、内在性ＴＣＲを発現しない、項目１から６９のいずれか一項に記載の方法。
(項目７１)
少なくとも約１０ ^２～１０ ^６個の操作されたＴ細胞を含む操作されたＴ細胞の集団を産生する、項目１から７０のいずれかに記載の方法。
(項目７２)
少なくとも約１０ ^６～１０ ^１２個の操作されたＴ細胞を含む細胞集団を産生する、項目１から７１のいずれかに記載の方法。
(項目７３)
Ｔ細胞の前記集団が凍結され、次いで解凍される、項目１から７２のいずれかに記載の方法。
(項目７４)
前記凍結されて解凍された細胞集団に１つまたは複数の追加の核酸を導入するステップをさらに含む、項目７３に記載の方法。
(項目７５)
前記１つまたは複数の追加の核酸が、ＴＣＲまたはＣＡＲの一方または両方をコードする、項目７４に記載の方法。
(項目７６)
前記ＴＣＲまたはＣＡＲが、腫瘍抗原特異的ＴＣＲまたはＣＡＲを含む、項目７５に記載の方法。
(項目７７)
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＮＹ－ＥＳＯに対して特異的である、項目７６に記載の方法。
(項目７８)
前記１つまたは複数の核酸が、少なくとも１つのＴＣＲおよびＩＬ－１５をコードする、項目１から７７のいずれかに記載の方法。
(項目７９)
前記１つまたは複数の核酸が、ＣＡＲをさらにコードする、項目７８に記載の方法。
(項目８０)
項目１から７９のいずれか一項に記載の方法により産生される、細胞または細胞の集団。
(項目８１)
少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、
高レベルのＮＫＧ２Ｄ；
ＫＩＲの低発現または検出不可能な発現；および
高レベルのグランザイムＢ
のうちの１つまたは複数を含む、操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目８２)
少なくとも１つの外来性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、操作されたＴ細胞であって、
高レベルのＮＫＧ２Ｄ；
ＫＩＲの低発現または検出不可能な発現；および
高レベルのグランザイムＢ
のうちの１つまたは複数を含む、操作されたＴ細胞。
(項目８３)
少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲを発現する、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団であって、
高レベルのＮＫＧ２Ｄを有する少なくとも５０％の細胞、
高レベルのＫＩＲを有する２０％未満の細胞、および
高レベルのグランザイムＢを有する少なくとも５０％の細胞
のうちの１つまたは複数を含む、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団。
(項目８４)
少なくとも１つの外来性ＴＣＲを発現する、操作されたＴ細胞の集団であって、
高レベルのＮＫＧ２Ｄを有する少なくとも５０％の細胞、
高レベルのＫＩＲを有する２０％未満の細胞、および
高レベルのグランザイムＢを有する少なくとも５０％の細胞
のうちの１つまたは複数を含む、操作されたＴ細胞の集団。
(項目８５)
少なくとも１つのインバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、外来性核酸から発現される、項目８１から８４のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目８６)
細胞選別を受けていない、項目８１から８５のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目８７)
前記細胞の少なくとも１０％が、ＩＦＮ－ガンマの高発現を含む、項目８２から８６のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目８８)
（１）前記細胞が、外来性自殺遺伝子を含み、または（２）前記細胞の前記ゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩもしくはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように変更されており、前記少なくとも１つのＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、項目８１から８７のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目８９)
健康な対象からの造血幹細胞に由来する、項目８１から８８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９０)
がんにかかっていない対象からの造血幹細胞に由来する、項目８１から８９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９１)
前記ＴＣＲのアミノ酸配列が、前記細胞の少なくとも９５％において同一である、項目８２から９０のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９２)
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、項目８１から９１のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９３)
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡに特異的に結合する、項目９２に記載の操作された細胞。
(項目９４)
ＨＬＡ－Ｅの外因性発現をさらに含む、項目８１から９３のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９５)
自殺遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲのすべてまたは断片を含むポリペプチドをコードする外来性核酸をさらに含む、項目８１から９４のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９６)
前記細胞の前記ゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、項目８８から９５のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９７)
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、アルファＴＣＲ遺伝子産物である、項目８１から９６のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９８)
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、ベータＴＣＲ遺伝子産物である、項目８１から９７のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目９９)
アルファＴＣＲ遺伝子産物とベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される、項目８１から９８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目１００)
前記外来性自殺遺伝子もしくはＨＬＡ－Ｅ遺伝子および／または外来性核酸が、前記細胞における発現のために最適化された１つまたは複数のコドンを有する、項目８８から９９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目１０１)
前記自殺遺伝子産物が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、チトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９である、項目８８から９９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目１０２)
前記自殺遺伝子が、酵素に基づいている、項目８８から１０１のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目１０３)
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、項目１０２に記載の操作された細胞。
(項目１０４)
前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、項目１０３に記載の操作された細胞。
(項目１０５)
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、項目１０４に記載の操作された細胞。
(項目１０６)
前記自殺遺伝子が、基質により活性化される、項目８１から１０５のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１０７)
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、項目１０６に記載の操作された細胞。
(項目１０８)
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである、項目１０７に記載の操作された細胞。
(項目１０９)
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である、項目８１から１０８のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１１０)
前記ＴＣＲが、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）に特異的に結合する、項目８１から１０９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目１１１)
前記の細胞の前記ゲノムが、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、項目８１から１１０のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１１２)
前記ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩが、遺伝子編集の結果として前記細胞の表面に発現されない、項目１１１に記載の操作された細胞。
(項目１１３)
前記遺伝子編集に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が関与した、項目１１２に記載の操作された細胞。
(項目１１４)
前記細胞が、前記細胞に導入された組換えベクターからの核酸を含む、項目８１から１１３のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１１５)
前記核酸が、前記細胞のゲノムに組み込まれている、項目１１４に記載の操作された細胞。
(項目１１６)
前記組換えベクターが、ウイルスベクターであった、項目１１４または１１５に記載の操作された細胞。
(項目１１７)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスを含む、項目１１６に記載の操作された細胞。
(項目１１８)
非ヒト血清を含む培地に曝露されなかった、または非ヒト血清で夾雑されていない、項目８１から１１７のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１１９)
凍結されている、項目８１から１１８のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１２０)
事前に凍結されており、少なくとも１時間、室温で安定している、項目８１から１１８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目１２１)
造血幹細胞に由来する、項目８１から１２０のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１２２)
Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４ ^＋細胞に由来する、項目１２１に記載の操作された細胞。
(項目１２３)
内在性ＴＣＲを発現しない、項目８１から１２２のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１２４)
前記細胞の７０％より多くが操作された細胞である、項目８３から１２３のいずれかに記載の操作された細胞。
(項目１２５)
前記細胞の８０％より多くが、操作された細胞である、項目１２４に記載の操作された細胞。
(項目１２６)
前記細胞の９０％より多くが、操作された細胞である、項目１２５に記載の操作された細胞。
(項目１２７)
前記細胞の９５％より多くが、操作された細胞である、項目１２６に記載の操作された細胞。
(項目１２８)
前記細胞の９９％より多くが、操作された細胞である、項目１２７に記載の操作された細胞。
(項目１２９)
前記細胞集団が、少なくとも約１０ ^６～１０ ^１２個の操作された細胞である、項目８３から１２８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
(項目１３０)
凍結されている、項目１２９に記載の操作された細胞。
(項目１３１)
Ｔ細胞で患者を処置する方法であって、項目８０から１３０のいずれかに記載の細胞を前記患者に投与するステップを含む方法。
(項目１３２)
前記患者が、がんを有する、項目１３１に記載の方法。
(項目１３３)
前記がんが、多発性骨髄腫を含む、項目１３２に記載の方法。
(項目１３４)
前記がんが、白血病を含む、項目１３２に記載の方法。
(項目１３５)
前記患者が、炎症を伴う疾患または状態を有する、項目１３１に記載の方法。
(項目１３６)
前記疾患または状態が、自己免疫疾患である、項目１３５に記載の方法。
(項目１３７)
前記疾患または状態が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、項目１３５に記載の方法。
(項目１３８)
前記細胞または細胞集団が、前記患者に対して同種異系である、項目１３１から１３７のいずれかに記載の方法。
(項目１３９)
前記患者が、前記細胞または細胞集団の完全枯渇の徴候を示さない、項目１３１から１３８のいずれかに記載の方法。
(項目１４０)
前記自殺遺伝子産物を起動させる化合物を前記患者に投与するステップをさらに含む、項目１３１から１３９のいずかに記載の方法。
(項目１４１)
前記患者における腫瘍進行が、前記患者への前記細胞または細胞集団の投与後に制御または抑制される、項目１４０に記載の方法。
(項目１４２)
炎症が軽減される、項目１４０または１４１のいずれかに記載の方法。
(項目１４３)
患者におけるがんを処置する方法であって、項目８０から１３０のいずれか一項に記載の細胞を投与するステップを含む方法。
(項目１４４)
少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
１．ａ）細胞外結合ドメイン、
２．ｂ）単一の膜貫通ドメイン、および
３．ｃ）一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一の細胞質領域
を含むキメラ細胞受容体（ＣＡＲ）とを発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、
４．前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、
操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１４５)
前記細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、項目１４４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１４６)
前記細胞外結合ドメインが、ＢＣＭＡ結合領域を含む、項目１４４または１４５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１４７)
前記ＢＣＭＡ結合領域が、ＢＣＭＡに特異的に結合するｓｃＦｖを含む、項目１４６に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１４８)
前記細胞外結合ドメインが、ＣＤ１９結合領域を含む、項目１４４または１４５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１４９)
前記ＣＤ１９結合領域が、ＣＤ１９に特異的に結合するｓｃＦｖを含む、項目１４８に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５０)
前記ＣＡＲが、細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサーをさらに含む、項目１４４から１４７のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５１)
前記スペーサーが、ＣＤ８ヒンジを含む、項目１５０に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５２)
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８からの膜貫通ドメインを含む、項目１４４から１５１のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５３)
前記細胞質領域が、共刺激ドメインをさらに含む、項目１４４から１５２のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５４)
前記共刺激ドメインが、４－１ＢＢポリペプチドを含む、項目１５３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５５)
前記一次細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３－ゼータポリペプチドを含む、項目１４４から１５４のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５６)
インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、アルファＴＣＲ遺伝子産物である、項目１４４から１５５のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５７)
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、ベータＴＣＲ遺伝子産物である、項目１４４から１５６のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５８)
アルファＴＣＲ遺伝子産物とベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される、項目１４４から１５７のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１５９)
少なくとも１つのインバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、外来性核酸から発現される、項目１４４から１５８のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６０)
前記外来性核酸が、前記細胞における発現のために最適化された１つまたは複数のコドンを含む、項目１４４から１５９のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６１)
外来性自殺遺伝子を含む、項目１４４から１６０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６２)
前記外来性自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、チトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９である、項目１６１に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６３)
前記自殺遺伝子が、酵素に基づいている、項目１６１または１６２に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６４)
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする、項目１６３の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６５)
前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、項目１６４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６６)
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、項目１６５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６７)
前記自殺遺伝子が、基質により活性化される、項目１６１から１６６のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６８)
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、項目１６７に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１６９)
イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドをコードする外来性核酸を含む、項目１６１から１６８のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７０)
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである、項目１６９に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７１)
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である、項目１６１から１７０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７２)
前記ｉＮＫＴＴＣＲが、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）に特異的に結合する、項目１４４から１７１のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７３)
ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、項目１４４から１７１のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７４)
遺伝子編集によって少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、項目１７３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７５)
前記遺伝子編集に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が関与した、項目１７４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７６)
前記ｉＮＫＴ細胞が、前記細胞に導入された組換えベクターからの核酸を含む、項目１４４から１７５のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７７)
前記核酸が、前記細胞のゲノムに組み込まれている、項目１７６に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７８)
前記組換えベクターが、ウイルスベクターであった、項目１７６または１７７に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１７９)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスであった、項目１７８に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８０)
動物の血清を含む培地に以前に曝露されなかった、項目１４４から１７９のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８１)
凍結されている、項目１４４から１８０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８２)
事前に凍結されており、少なくとも１時間、室温で安定している、項目１４４から１８０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８３)
デキストロース、電解質、アルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯのうちの１つまたは複数を含む溶液中にある、項目１４４から１８２のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８４)
無菌、非化膿性、および等張性である、項目１４４から１８３のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８５)
造血幹細胞に由来する、項目１４４から１８４のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８６)
Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４ ^＋の細胞に由来する、項目１８５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８７)
がんを有さないヒト患者からの細胞に由来する、項目１４４から１８６のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８８)
内在性ＴＣＲを発現しない、項目１４４から１８７のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目１８９)
項目１４４から１８８のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む細胞集団。
(項目１９０)
前記細胞集団の前記細胞が活性化された、いずれかの項目１８９に記載の細胞集団。
(項目１９１)
前記細胞集団の前記細胞が、α－ＧＣで活性化され、増幅された、項目１９０に記載の細胞集団。
(項目１９２)
少なくとも約１０ ^２～１０ ^６個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む、項目１８９から１９１のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目１９３)
少なくとも約１０ ^６～１０ ^１２個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む、項目１８９から１９２のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目１９４)
前記細胞集団の前記細胞の７０％より多くが操作されたｉＮＫＴ細胞である、項目１８９から１９３のいずれか一項に記載の細胞集団。
(項目１９５)
操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）複数の造血幹または始原細胞からＣＤ３４ ^＋細胞を選択するステップ；
ｂ）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；
ｃ）単離されたヒトＣＤ３４ ^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるステップ；および
ｄ）ｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４ ^＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生するステップ；
ｅ）ＣＡＲをコードする核酸を前記ｉＮＫＴ細胞に導入するステップ
を含む方法。
(項目１９６)
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ－ＣＡＲである、項目１９５に記載の方法。
(項目１９７)
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９－ＣＡＲである、項目１９５に記載の方法。
(項目１９８)
前記ＣＤ３４ ^＋細胞が、分化した造血細胞を含む集団からのものである、項目１９５から１９７のいずれかに記載の方法。
(項目１９９)
前記細胞が、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４ ^＋細胞に由来する、項目１９５か１９８のいずれかに記載の方法。
(項目２００)
前記分化した造血細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、項目１９８に記載の方法。
(項目２０１)
前記造血幹または始原細胞が、臍帯血細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または骨髄細胞を含む、項目１９５から１９７のいずれかに記載の方法。
(項目２０２)
ＣＤ３４ ^－細胞を単離するステップをさらに含む、項目１９５から２０１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０３)
前記ＣＤ３４ ^＋細胞を培地中で培養するステップを、１つまたは複数の核酸を前記細胞に導入するステップの前にさらに含む、項目１９５から２０２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０４)
前記ＣＤ３４ ^＋細胞を培養するステップが、選択されたＣＤ３４ ^＋細胞を、１つまたは複数の増殖因子を含む培地とともにインキュベートすることを含む、項目２０３に記載の方法。
(項目２０５)
前記１つまたは複数の増殖因子が、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む、項目２０４に記載の方法。
(項目２０６)
前記１つまたは複数の増殖因子の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間である、項目２０５に記載の方法。
(項目２０７)
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、α－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目１９５から２０６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０８)
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、β－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目１９５から２０７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０９)
前記１または複数の核酸が、α－ＴＣＲとβ－ＴＣＲの両方をコードする核酸を含む、項目１９５から２０８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１０)
前記１つまたは複数の核酸のうちの第１の核酸が、α－ＴＣＲをコードする核酸配列を含み、前記１つまたは複数の核酸のうちの第２の核酸が、β－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、項目１９５から２０９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１１)
前記ＣＤ３４ ^＋細胞に、自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含む、項目１９５に記載の方法。
(項目２１２)
前記自殺遺伝子をコードする前記核酸が、α－ＴＣＲとβ－ＴＣＲの両方をさらにコードする、項目２１１に記載の方法。
(項目２１３)
前記自殺遺伝子が、酵素に基づいている、項目２１１または２１２に記載の方法。
(項目２１４)
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、項目２１３に記載の方法。
(項目２１５)
ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、項目２１４に記載の方法。
(項目２１６)
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、項目２１４に記載の方法。
(項目２１７)
自殺遺伝子産物が、基質により活性化される、項目２１１から２１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１８)
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、項目２１７に記載の方法。
(項目２１９)
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである、項目２１８に記載の方法。
(項目２２０)
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫである、項目２１６から２１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２１)
前記ｉＮＫＴ細胞が、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することによって、１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変される、項目１９５から２２０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２２)
前記１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させることが、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記ｉＮＫＴ細胞に導入することを含む、項目２２１に記載の方法。
(項目２２３)
前記ＣＲＩＳＰＲまたは前記１つもしくは複数のｇＲＮＡが、電気穿孔または脂質媒介トランスフェクションにより前記細胞にトランスフェクトされる、項目２２２に記載の方法。
(項目２２４)
前記ＴＣＲをコードする前記核酸が、組換えベクターを使用して導入される、項目１９５から２２３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２５)
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、項目２２４に記載の方法集団。
(項目２２６)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、項目２２５に記載の方法。
(項目２２７)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目２２６に記載の方法。
(項目２２８)
前記ＣＡＲをコードする前記核酸が、組換えベクターを使用して導入される、項目１９５から２２７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２９)
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、項目２２８に記載の方法。
(項目２３０)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、項目２２９に記載の方法。
(項目２３１)
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターを含む、項目２２９に記載の方法。
(項目２３２)
前記ｉＮＫＴ細胞を、前記細胞集団の前記増幅に十分な量のＩＬ－１５と接触させるステップをさらに含む、項目１９５から２３１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３３)
前記ｉＮＫＴ細胞が凍結される、項目１９５から２３２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３４)
前記ｉＮＫＴ細胞が、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯを含む溶液中にある、項目１９５から２３３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３５)
前記ｉＮＫＴ細胞が、無菌、非化膿性、および等張性である、項目１９５から２３４のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３６)
前記ＣＤ３４ ^＋細胞が、がんを有さないヒト患者からの細胞に由来する、項目１９５から２３５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３７)
前記ｉＮＫＴ細胞が、内在性ＴＣＲを発現しない、項目１９５から２３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３８)
前記ｉＮＫＴ細胞を活性化するステップをさらに含む、項目１９５から２３７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３９)
前記ｉＮＫＴ細胞が、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化され、増幅された、項目２３８に記載の方法。
(項目２４０)
フィーダー細胞にα－ＧＣがパルス投与された、項目２３９に記載の方法。
(項目２４１)
少なくとも約１０ ^２～１０ ^６個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む操作されたｉＮＫＴ細胞の集団を産生する、項目１９５から２４０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４２)
少なくとも約１０ ^６～１０ ^１２個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む細胞集団を産生する、項目１９５から２４１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４３)
前記複数の造血幹または始原細胞が、５×１０ ^８個未満の細胞（cels）を含む、項目２４２に記載の方法。
(項目２４４)
少なくとも１００用量が産生される、項目２４２に記載の方法。
(項目２４５)
各用量が、１０ ^７～１０ ^９個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む、項目２４４に記載の方法。
(項目２４６)
ｉＮＫＴ細胞の前記集団が凍結され、次いで解凍される、項目１９５から２４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４７)
ｉＮＫＴ細胞の前記凍結されて解凍された集団に１つまたは複数の追加の核酸を導入するステップをさらに含む、項目２４６に記載の方法。
(項目２４８)
前記１つまたは複数の追加の核酸が、１つまたは複数の治療用遺伝子産物をコードする、項目２４７に記載の方法。
(項目２４９)
ｉＮＫＴ細胞で患者を処置する方法であって、項目１４４から１８８のいずれかに記載の細胞または項目１８９から１９４のいずれかに記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法。
(項目２５０)
がんを有する患者におけるがんを処置する方法であって、項目１４４から１８８のいずれかに記載の細胞または項目１８９から１９４のいずれかに記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法。
(項目２５１)
前記患者が、がんを有する、項目２５０に記載の方法。
(項目２５２)
前記がんが、多発性骨髄腫である、項目２５０または２５１に記載の方法。
(項目２５３)
前記がんが、白血病である、項目２５１に記載の方法。
(項目２５４)
前記がんが、急性骨髄性白血病である、項目２５３に記載の方法。
(項目２５５)
前記細胞または細胞集団が、前記患者に対して同種異系である、項目２５０から２５４のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５６)
前記細胞または細胞集団が、がんを有さない患者に由来する、項目２５０から２５５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５７)
追加の薬剤を投与するステップをさらに含む、項目２５０から２５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５８)
前記追加の薬剤が、ＩＬ－６Ｒ抗体またはＩＬ－１Ｒアンタゴニストを含む、項目２５７に記載の方法。
(項目２５９)
前記追加の薬剤が、ｉＮＫＴＴＣＲが特異的に結合する抗原を含む、項目２５７または２５８に記載の方法。
(項目２６０)
前記抗原が、α－ＧＣを含む、項目２５９に記載の方法。
(項目２６１)
前記患者が、過去にがんの治療を受けたことがある、項目２５０から２５８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６２)
前記過去の治療が、毒性であった、および／または有効でなかった、項目２６１に記載の方法。
(項目２６３)
前記過去の治療が、プロテアソーム阻害剤、免疫調節剤、抗ＣＤ３８抗体またはＣＡＲ－Ｔ細胞療法のうちの１つまたは複数を含む、項目２６１または２６２に記載の方法。
(項目２６４)
前記がんが、ＢＣＭＡ ^＋悪性細胞を含む、項目２４９から２６３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６５)
前記がんが、ＢＣＭＡ ^＋悪性Ｂ細胞を含む、項目２６４に記載の方法。
(項目２６６)
前記がんが、ＣＤ１９ ^＋悪性細胞を含む、項目２５０から２６３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６７)
前記がんが、ＣＤ１９ ^＋悪性造血細胞を含む、項目２６６に記載の方法。
(項目２６８)
前記患者が、前記細胞または細胞集団の完全枯渇の徴候を示さない、項目２５０から２６７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６９)
自殺遺伝子産物を起動させる化合物を前記患者に投与するステップをさらに含む、項目２５０から２６８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２７０)
前記患者における腫瘍進行が、前記患者への前記細胞または細胞集団の投与後に制御または抑制される、項目２５０に記載の方法。
(項目２７１)
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患している患者を処置する方法であって、項目１４４から１８８のいずれかに記載の細胞または項目１８９から１９４のいずれかに記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法。
(項目２７２)
前記ＧＶＨＤが、骨髄移植に関連している、項目２７１に記載の方法。
(項目２７３)
（１）少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（３）ＩＬ－１５と
を発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、
前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２７４)
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ結合領域を含む細胞外結合ドメインを含む、項目２７３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２７５)
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９結合領域を含む細胞外結合ドメインを含む、項目２７３または２７４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２７６)
前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、項目２７３から２７５のいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２７７)
外来性自殺遺伝子産物を含む、項目２７３から２７６のいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２７８)
前記細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、項目２７３から２７７のいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２７９)
インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、アルファＴＣＲ遺伝子産物である、項目２７３から２７８のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２８０)
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、ベータＴＣＲ遺伝子産物である、項目２７３から２７９のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２８１)
アルファＴＣＲ遺伝子産物とベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される、項目２７３から２８０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２８２)
前記ｉＮＫＴ細胞が、前記細胞に導入された組換えベクターからの核酸を含む、項目２７３から２８１のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２８３)
動物の血清を含む培地に曝露されなかった、項目２７３から２８２のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２８４)
Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４ ^＋の細胞に由来する、項目２７３から２８３のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
(項目２８５)
項目２７３から２８４のいずれか一項に記載の操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を含む細胞集団。
(項目２８６)
がんを有する患者におけるがんを処置する方法であって、項目２７３から２８４のいずれかに記載の細胞または項目２８５に記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法。
(項目２８７)
自殺遺伝子産物を起動させる化合物を前記患者に投与するステップをさらに含む、項目２８６に記載の方法。
(項目２８８)
操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）複数の造血幹または始原細胞からＣＤ３４ ^＋細胞を選択するステップ；
ｂ）（１）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（２）ＣＡＲと、（３）ＩＬ－１５とをコードする１つまたは複数の核酸を、前記ＣＤ３４ ^＋細胞に導入するステップ；および
ｃ）前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４ ^＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生するステップ
を含む、方法。
(項目２８９)
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ－ＣＡＲである、項目２８８に記載の方法。
(項目２９０)
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９－ＣＡＲである、項目２８８に記載の方法。
(項目２９１)
ＣＤ３４ ^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるステップをさらに含む、項目２８８から２９０のいずれかに記載の方法。
(項目２９２)
選択されたＣＤ３４ ^＋細胞を培地中で培養するステップを、１つまたは複数の核酸を前記細胞に導入するステップの前にさらに含む、項目２８８から２９１のいずれかに記載の方法。
(項目２９３)
培養するステップが、前記選択されたＣＤ３４ ^＋細胞を、１つまたは複数の増殖因子を含む培地とともにインキュベートすることを含む、項目２９２に記載の方法。
(項目２９４)
前記１つまたは複数の増殖因子が、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む、項目２９３に記載の方法。
(項目２９５)
前記１つまたは複数の増殖因子の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間である、項目２９４に記載の方法。
(項目２９６)
前記１つまたは複数の核酸が、単一の核酸分子である、項目２８８から２９５のいずれかに記載の方法。
(項目２９７)
前記選択されたＣＤ３４ ^＋細胞に、自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含む、項目２８８から２９６のいずれかに記載の方法。
(項目２９８)
選択されたｉＮＫＴ細胞が、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化され、増幅された、項目２８８から２９７のいずれかに記載の方法。
(項目２９９)
フィーダー細胞にα－ＧＣがパルス投与された、項目２８８から２９８のいずれかに記載の方法。
(項目３００)
少なくとも約１０ ^２～１０ ^６個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む操作されたｉＮＫＴ細胞の集団を産生する、項目２８８から２９９のいずれかに記載の方法。
(項目３０１)
１．ｉＮＫＴ細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）ＣＤ３４ ^＋幹または始原細胞の集団を選択するステップ；
ｂ）少なくとも１つのｉＮＫＴ細胞ＴＣＲをコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；および
ｃ）前記細胞を培養して前記細胞のＴ細胞への分化を誘導するステップ
を含み、
ａ）、ｂ）および／またはｃ）が、前記細胞を、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞の集団と接触させるステップを含まない、方法。
(項目３０２)
操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）複数の造血幹または始原細胞からＣＤ３４ ^＋細胞を選択するステップ；
ｂ）（１）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（２）ＢＣＭＡ－ＣＡＲと、（３）ＩＬ－１５とをコードする１つまたは複数の核酸を、前記ＣＤ３４ ^＋細胞に導入するステップ；および
ｃ）前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４ ^＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生するステップ
を含む、方法。
(項目３０３)
対象におけるＢ細胞リンパ腫を処置するための方法であって、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する細胞外結合ドメイン、
ｂ）単一の膜貫通ドメイン、および
ｃ）一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一の細胞質領域
を含むキメラ細胞受容体（ＣＡＲ）とを発現する操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を投与するステップを含み、
前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、方法。

Claims

Ｔ細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）幹または始原細胞を選択するステップ；
ｂ）少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；および
ｃ）前記細胞を培養して前記細胞のＴ細胞への分化を誘導するステップ
を含み、ａ）、ｂ）および／またはｃ）が、前記細胞を、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞の集団と接触させるステップを含まない、方法。
ｃ）が、フィーダーフリーである培養を含む、請求項１に記載の方法。
前記幹または始原細胞がＣＤ３４^＋細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
ａ）の前記細胞が、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＭＣＰ－４、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、レトロネクチン、ＤＬＬ４、ＤＬＬ１、および／またはＶＣＡＭ１でコーティングされた表面で培養された、請求項４の記載の方法。
ａ）の前記細胞が、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－３、５～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．５～５ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、ＩＬ－６、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、ＥＰＯ、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、および／または１０～１００ｎｇ／ｍｌのｈＦＬＴ３Ｌのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された、請求項５に記載の方法。
ａ）の前記細胞が、１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ－３、２０～２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、ＩＬ－６、１５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ、ＥＰＯ、５～５０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、および／または５０ｎｇ／ｍｌのｈＦＬＴ３Ｌのうちの１つまたは複数を含む培地中で培養された、請求項６に記載の方法。
ａ）の前記細胞が、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数とともに１２～７２時間、培養された、請求項４または５に記載の方法。
前記ＴＣＲが、ｉＮＫＴＴＣＲを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＮＫＴＴＣＲが、α－ＧＣに特異的に結合する、請求項９に記載の方法。
前記ＴＣＲが、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を特異的に認識するＴＣＲを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原が、ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５}を含む、請求項１１に記載の方法_。
ｃ）が、分化および／または増幅培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
ｃ）が、前記細胞を、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの１つまたは複数と接触させることを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの前記１つまたは複数が、組織培養プレートまたはマイクロビーズ表面にコーティングされる、請求項１４に記載の方法。
ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの前記１つまたは複数が、０．１～１０μｇ／ｍｌのＤＬＬ４と０．０１～１μｇ／ｍｌのＶＣＡＭ１とを含むコーティング組成物を使用して前記組織培養プレートにコーティングされる、請求項１５に記載の方法。
ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＶＣＡＭ１、ＶＣＡＭ５、および／またはレトロネクチンのうちの前記１つまたは複数が、０．５μｇ／ｍｌのＤＬＬ４と０．１μｇ／ｍｌのＶＣＡＭ１とを含むコーティング組成物を使用してコーティングされる、請求項１６に記載の方法。
前記増幅または分化培地が、イスコフＭＤＭ、血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン、および／または２－メルカプトエタノールのうちの１つまたは複数を含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
前記増幅または分化培地が、アスコルビン酸、ヒト血清、Ｂ２７サプリメント、グルタマックス、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－７、ＭＣＰ－４、ＩＬ－６、ＴＰＯ、およびＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
前記増幅または分化培地が、５０～５００μＭアスコルビン酸、ヒト血清、１～１０％Ｂ２７サプリメント、０．１～１０％グルタマックス、２～５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ、２～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．１～１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、０～１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、および１．５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む、請求項１９に記載の方法。
前記増幅または分化培地が、１００μＭアスコルビン酸、ヒト血清、４％Ｂ２７サプリメント、１％グルタマックス、２～５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ、２～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、０．１～１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ－４、０～１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、および１．５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦのうちの１つまたは複数を含む、請求項２０に記載の方法。
前記細胞を刺激および／または増幅するステップをさらに含む、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
前記細胞を刺激または増幅するステップが、前記細胞を、前記ＴＣＲに特異的に結合する抗原と接触させることを含む、請求項２２の記載の方法。
前記細胞を刺激または増幅するステップが、前記細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２および／もしくは抗ＣＤ２８抗体、またはその／それらの抗原結合断片と接触させることを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
前記細胞を刺激または増幅するステップが、増幅培地中で前記細胞を培養することを含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞をα－ＧＣと接触させることにより前記細胞を刺激および／または増幅するステップを含む、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞をＩＬ－１５およびＩＬ－７の一方または両方と接触させるステップをさらに含む、および／または前記増幅培地がＩＬ－１５またはＩＬ－７の一方または両方を含む、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
前記増幅培地が、５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および／または５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含む、請求項２７に記載の方法。
前記増幅培地が、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７および／または５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含む、請求項２８に記載の方法。
前記細胞を、ヒト血清抗体、グルタマックス、緩衝剤、抗菌剤、およびＮ－アセチル－Ｌ－システインのうちの１つまたは複数と接触させるステップをさらに含む、および／または前記増幅培地が、ヒト血清抗体、グルタマックス、緩衝剤、抗菌剤、およびＮ－アセチル－Ｌ－システインのうちの１つまたは複数を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞を抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８コーティングビーズと接触させることにより、前記細胞を活性化するステップをさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
ＣＡＲ分子および／またはＨＬＡ－Ｅ遺伝子を含む核酸を、前記細胞に移入するステップをさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＡＲ分子および／またはＨＬＡ－Ｅ遺伝子を含む核酸が、レトロウイルス感染により前記細胞に移入される、請求項３２に記載の方法。
前記細胞をレトロネクチンと接触させるステップをさらに含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、健康な対象、および／またはがんを有さない対象から単離される、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
ａ、ｂ、ｃ、または前記方法全体が、前記細胞をフィーダー細胞の集団と接触させるステップ方法を含まない、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
ａ、ｂ、ｃ、または前記方法全体が、前記細胞を間質細胞の集団と接触させるステップ方法を含まない、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
ａ、ｂ、ｃ、または前記方法全体が、前記細胞をノッチリガンドともその断片とも接触させるステップ方法を含まない、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、分化した造血細胞を含む集団からのＣＤ３４^＋細胞である、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
前記分化した造血細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３９に記載の方法。
前記幹または始原細胞が、臍帯血細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または骨髄細胞を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
ＣＤ３４^＋細胞を単離するステップをさらに含む、請求項３から４１のいずれかに記載の方法。
選択されたＣＤ３４^＋細胞を培地中で培養するステップを、１つまたは複数の核酸を前記細胞に導入するステップの前にさらに含む、請求項３から４２のいずれかに記載の方法。
培養するステップが、前記選択されたＣＤ３４^＋細胞を、１つまたは複数の増殖因子を含む培地とともにインキュベートすることを含む、請求項４３に記載の方法。
前記１つまたは複数の増殖因子が、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む、請求項４４に記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、α－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項１から４５のいずれかに記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、β－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、α－ＴＣＲとβ－ＴＣＲの両方をコードする核酸を含む、請求項１から４７のいずれかに記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸のうちの第１の核酸が、α－ＴＣＲをコードする核酸配列を含み、前記１つまたは複数の核酸のうちの第２の核酸が、β－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項１から４８のいずれかに記載の方法。
前記選択されたＣＤ３４^＋細胞に、自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
１つの核酸が、前記α－ＴＣＲと前記β－ＴＣＲの両方をコードする、請求項５０に記載の方法。
１つの核酸が、前記α－ＴＣＲ、前記β－ＴＣＲ、および前記自殺遺伝子をコードする、請求項５１に記載の方法。
前記自殺遺伝子が、酵素に基づいている、請求項５０から５２のいずれかに記載の方法。
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、請求項５３に記載の方法。
ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、請求項５４に記載の方法。
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、請求項５４に記載の方法。
自殺遺伝子産物が、基質により活性化される、請求項５０から５６のいずれかに記載の方法。
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、請求項５７に記載の方法。
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである、請求項５８に記載の方法。
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫである、請求項５６から５９のいずれかに記載の方法。
前記Ｔ細胞のゲノムが、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することによって少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように変更された、請求項１から６０のいずれかに記載の方法。
単離されたヒトＣＤ３４^＋細胞における細胞表面ＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の発現を消失させることが、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記細胞に導入することを含む、請求項６１に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲまたは前記１つもしくは複数のｇＲＮＡが、電気穿孔または脂質媒介トランスフェクションにより前記細胞にトランスフェクトされる、請求項６２に記載の方法。
前記ＴＣＲ受容体をコードする前記核酸が、組換えベクターを使用して前記細胞に導入される、請求項１から６３のいずれかに記載の方法。
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、請求項６４に記載の方法集団。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、請求項６５に記載の方法。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、請求項６６に記載の方法。
ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子の表面発現を欠いているＴ細胞を選択することが、マイクロビーズまたはフローサイトメトリーを使用する、Ｔ細胞の正の選択およびＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ陰性細胞の負の選択を含む、請求項１から６７のいずれかに記載の方法。
前記Ｔ細胞が凍結される、請求項１から６８のいずれかに記載の方法。
前記Ｔ細胞が、内在性ＴＣＲを発現しない、請求項１から６９のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも約１０^２～１０^６個の操作されたＴ細胞を含む操作されたＴ細胞の集団を産生する、請求項１から７０のいずれかに記載の方法。
少なくとも約１０^６～１０^１２個の操作されたＴ細胞を含む細胞集団を産生する、請求項１から７１のいずれかに記載の方法。
Ｔ細胞の前記集団が凍結され、次いで解凍される、請求項１から７２のいずれかに記載の方法。
前記凍結されて解凍された細胞集団に１つまたは複数の追加の核酸を導入するステップをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
前記１つまたは複数の追加の核酸が、ＴＣＲまたはＣＡＲの一方または両方をコードする、請求項７４に記載の方法。
前記ＴＣＲまたはＣＡＲが、腫瘍抗原特異的ＴＣＲまたはＣＡＲを含む、請求項７５に記載の方法。
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＮＹ－ＥＳＯに対して特異的である、請求項７６に記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸が、少なくとも１つのＴＣＲおよびＩＬ－１５をコードする、請求項１から７７のいずれかに記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸が、ＣＡＲをさらにコードする、請求項７８に記載の方法。
請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法により産生される、細胞または細胞の集団。
少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、
高レベルのＮＫＧ２Ｄ；
ＫＩＲの低発現または検出不可能な発現；および
高レベルのグランザイムＢ
のうちの１つまたは複数を含む、操作されたｉＮＫＴ細胞。
少なくとも１つの外来性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、操作されたＴ細胞であって、
高レベルのＮＫＧ２Ｄ；
ＫＩＲの低発現または検出不可能な発現；および
高レベルのグランザイムＢ
のうちの１つまたは複数を含む、操作されたＴ細胞。
少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲを発現する、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団であって、
高レベルのＮＫＧ２Ｄを有する少なくとも５０％の細胞、
高レベルのＫＩＲを有する２０％未満の細胞、および
高レベルのグランザイムＢを有する少なくとも５０％の細胞
のうちの１つまたは複数を含む、操作されたｉＮＫＴ細胞の集団。
少なくとも１つの外来性ＴＣＲを発現する、操作されたＴ細胞の集団であって、
高レベルのＮＫＧ２Ｄを有する少なくとも５０％の細胞、
高レベルのＫＩＲを有する２０％未満の細胞、および
高レベルのグランザイムＢを有する少なくとも５０％の細胞
のうちの１つまたは複数を含む、操作されたＴ細胞の集団。
少なくとも１つのインバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、外来性核酸から発現される、請求項８１から８４のいずれか一項に記載の操作された細胞。
細胞選別を受けていない、請求項８１から８５のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞の少なくとも１０％が、ＩＦＮ－ガンマの高発現を含む、請求項８２から８６のいずれかに記載の操作された細胞。
（１）前記細胞が、外来性自殺遺伝子を含み、または（２）前記細胞の前記ゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩもしくはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように変更されており、前記少なくとも１つのＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、請求項８１から８７のいずれかに記載の操作された細胞。
健康な対象からの造血幹細胞に由来する、請求項８１から８８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
がんにかかっていない対象からの造血幹細胞に由来する、請求項８１から８９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記ＴＣＲのアミノ酸配列が、前記細胞の少なくとも９５％において同一である、請求項８２から９０のいずれか一項に記載の操作された細胞。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項８１から９１のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡに特異的に結合する、請求項９２に記載の操作された細胞。
ＨＬＡ－Ｅの外因性発現をさらに含む、請求項８１から９３のいずれか一項に記載の操作された細胞。
自殺遺伝子、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲのすべてまたは断片を含むポリペプチドをコードする外来性核酸をさらに含む、請求項８１から９４のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記細胞の前記ゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、請求項８８から９５のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、アルファＴＣＲ遺伝子産物である、請求項８１から９６のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、ベータＴＣＲ遺伝子産物である、請求項８１から９７のいずれか一項に記載の操作された細胞。
アルファＴＣＲ遺伝子産物とベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される、請求項８１から９８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記外来性自殺遺伝子もしくはＨＬＡ－Ｅ遺伝子および／または外来性核酸が、前記細胞における発現のために最適化された１つまたは複数のコドンを有する、請求項８８から９９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記自殺遺伝子産物が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、チトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９である、請求項８８から９９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記自殺遺伝子が、酵素に基づいている、請求項８８から１０１のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、請求項１０２に記載の操作された細胞。
前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、請求項１０３に記載の操作された細胞。
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、請求項１０４に記載の操作された細胞。
前記自殺遺伝子が、基質により活性化される、請求項８１から１０５のいずれかに記載の操作された細胞。
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、請求項１０６に記載の操作された細胞。
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである、請求項１０７に記載の操作された細胞。
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である、請求項８１から１０８のいずれかに記載の操作された細胞。
前記ＴＣＲが、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）に特異的に結合する、請求項８１から１０９のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記の細胞の前記ゲノムが、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、請求項８１から１１０のいずれかに記載の操作された細胞。
前記ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩが、遺伝子編集の結果として前記細胞の表面に発現されない、請求項１１１に記載の操作された細胞。
前記遺伝子編集に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が関与した、請求項１１２に記載の操作された細胞。
前記細胞が、前記細胞に導入された組換えベクターからの核酸を含む、請求項８１から１１３のいずれかに記載の操作された細胞。
前記核酸が、前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１１４に記載の操作された細胞。
前記組換えベクターが、ウイルスベクターであった、請求項１１４または１１５に記載の操作された細胞。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスを含む、請求項１１６に記載の操作された細胞。
非ヒト血清を含む培地に曝露されなかった、または非ヒト血清で夾雑されていない、請求項８１から１１７のいずれかに記載の操作された細胞。
凍結されている、請求項８１から１１８のいずれかに記載の操作された細胞。
事前に凍結されており、少なくとも１時間、室温で安定している、請求項８１から１１８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
造血幹細胞に由来する、請求項８１から１２０のいずれかに記載の操作された細胞。
Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋細胞に由来する、請求項１２１に記載の操作された細胞。
内在性ＴＣＲを発現しない、請求項８１から１２２のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞の７０％より多くが操作された細胞である、請求項８３から１２３のいずれかに記載の操作された細胞。
前記細胞の８０％より多くが、操作された細胞である、請求項１２４に記載の操作された細胞。
前記細胞の９０％より多くが、操作された細胞である、請求項１２５に記載の操作された細胞。
前記細胞の９５％より多くが、操作された細胞である、請求項１２６に記載の操作された細胞。
前記細胞の９９％より多くが、操作された細胞である、請求項１２７に記載の操作された細胞。
前記細胞集団が、少なくとも約１０^６～１０^１２個の操作された細胞である、請求項８３から１２８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
凍結されている、請求項１２９に記載の操作された細胞。
Ｔ細胞で患者を処置する方法であって、請求項８０から１３０のいずれかに記載の細胞を前記患者に投与するステップを含む方法。
前記患者が、がんを有する、請求項１３１に記載の方法。
前記がんが、多発性骨髄腫を含む、請求項１３２に記載の方法。
前記がんが、白血病を含む、請求項１３２に記載の方法。
前記患者が、炎症を伴う疾患または状態を有する、請求項１３１に記載の方法。
前記疾患または状態が、自己免疫疾患である、請求項１３５に記載の方法。
前記疾患または状態が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項１３５に記載の方法。
前記細胞または細胞集団が、前記患者に対して同種異系である、請求項１３１から１３７のいずれかに記載の方法。
前記患者が、前記細胞または細胞集団の完全枯渇の徴候を示さない、請求項１３１から１３８のいずれかに記載の方法。
前記自殺遺伝子産物を起動させる化合物を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項１３１から１３９のいずかに記載の方法。
前記患者における腫瘍進行が、前記患者への前記細胞または細胞集団の投与後に制御または抑制される、請求項１４０に記載の方法。
炎症が軽減される、請求項１４０または１４１のいずれかに記載の方法。
患者におけるがんを処置する方法であって、請求項８０から１３０のいずれか一項に記載の細胞を投与するステップを含む方法。
少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
１．ａ）細胞外結合ドメイン、
２．ｂ）単一の膜貫通ドメイン、および
３．ｃ）一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一の細胞質領域
を含むキメラ細胞受容体（ＣＡＲ）とを発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、
４．前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、
操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、請求項１４４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記細胞外結合ドメインが、ＢＣＭＡ結合領域を含む、請求項１４４または１４５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ＢＣＭＡ結合領域が、ＢＣＭＡに特異的に結合するｓｃＦｖを含む、請求項１４６に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記細胞外結合ドメインが、ＣＤ１９結合領域を含む、請求項１４４または１４５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ＣＤ１９結合領域が、ＣＤ１９に特異的に結合するｓｃＦｖを含む、請求項１４８に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ＣＡＲが、細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサーをさらに含む、請求項１４４から１４７のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記スペーサーが、ＣＤ８ヒンジを含む、請求項１５０に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８からの膜貫通ドメインを含む、請求項１４４から１５１のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記細胞質領域が、共刺激ドメインをさらに含む、請求項１４４から１５２のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記共刺激ドメインが、４－１ＢＢポリペプチドを含む、請求項１５３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記一次細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３－ゼータポリペプチドを含む、請求項１４４から１５４のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、アルファＴＣＲ遺伝子産物である、請求項１４４から１５５のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、ベータＴＣＲ遺伝子産物である、請求項１４４から１５６のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
アルファＴＣＲ遺伝子産物とベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される、請求項１４４から１５７のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
少なくとも１つのインバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、外来性核酸から発現される、請求項１４４から１５８のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記外来性核酸が、前記細胞における発現のために最適化された１つまたは複数のコドンを含む、請求項１４４から１５９のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
外来性自殺遺伝子を含む、請求項１４４から１６０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記外来性自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、チトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、または誘導性カスパーゼ９である、請求項１６１に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記自殺遺伝子が、酵素に基づいている、請求項１６１または１６２に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする、請求項１６３の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、請求項１６４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、請求項１６５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記自殺遺伝子が、基質により活性化される、請求項１６１から１６６のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、請求項１６７に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドをコードする外来性核酸を含む、請求項１６１から１６８のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである、請求項１６９に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫまたは誘導性カスパーゼ９である、請求項１６１から１７０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ｉＮＫＴＴＣＲが、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）に特異的に結合する、請求項１４４から１７１のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することにより、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、請求項１４４から１７１のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
遺伝子編集によって少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、請求項１７３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記遺伝子編集に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が関与した、請求項１７４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ｉＮＫＴ細胞が、前記細胞に導入された組換えベクターからの核酸を含む、請求項１４４から１７５のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記核酸が、前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１７６に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記組換えベクターが、ウイルスベクターであった、請求項１７６または１７７に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスであった、請求項１７８に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
動物の血清を含む培地に以前に曝露されなかった、請求項１４４から１７９のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
凍結されている、請求項１４４から１８０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
事前に凍結されており、少なくとも１時間、室温で安定している、請求項１４４から１８０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
デキストロース、電解質、アルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯのうちの１つまたは複数を含む溶液中にある、請求項１４４から１８２のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
無菌、非化膿性、および等張性である、請求項１４４から１８３のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
造血幹細胞に由来する、請求項１４４から１８４のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋の細胞に由来する、請求項１８５に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
がんを有さないヒト患者からの細胞に由来する、請求項１４４から１８６のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
内在性ＴＣＲを発現しない、請求項１４４から１８７のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
請求項１４４から１８８のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む細胞集団。
前記細胞集団の前記細胞が活性化された、いずれかの請求項１８９に記載の細胞集団。
前記細胞集団の前記細胞が、α－ＧＣで活性化され、増幅された、請求項１９０に記載の細胞集団。
少なくとも約１０^２～１０^６個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む、請求項１８９から１９１のいずれか一項に記載の細胞集団。
少なくとも約１０^６～１０^１２個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む、請求項１８９から１９２のいずれか一項に記載の細胞集団。
前記細胞集団の前記細胞の７０％より多くが操作されたｉＮＫＴ細胞である、請求項１８９から１９３のいずれか一項に記載の細胞集団。
操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）複数の造血幹または始原細胞からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；
ｂ）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；
ｃ）単離されたヒトＣＤ３４^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるステップ；および
ｄ）ｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４^＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生するステップ；
ｅ）ＣＡＲをコードする核酸を前記ｉＮＫＴ細胞に導入するステップ
を含む方法。
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ－ＣＡＲである、請求項１９５に記載の方法。
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９－ＣＡＲである、請求項１９５に記載の方法。
前記ＣＤ３４^＋細胞が、分化した造血細胞を含む集団からのものである、請求項１９５から１９７のいずれかに記載の方法。
前記細胞が、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋細胞に由来する、請求項１９５か１９８のいずれかに記載の方法。
前記分化した造血細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１９８に記載の方法。
前記造血幹または始原細胞が、臍帯血細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、または骨髄細胞を含む、請求項１９５から１９７のいずれかに記載の方法。
ＣＤ３４^－細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１９５から２０１のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ３４^＋細胞を培地中で培養するステップを、１つまたは複数の核酸を前記細胞に導入するステップの前にさらに含む、請求項１９５から２０２のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ３４^＋細胞を培養するステップが、選択されたＣＤ３４^＋細胞を、１つまたは複数の増殖因子を含む培地とともにインキュベートすることを含む、請求項２０３に記載の方法。
前記１つまたは複数の増殖因子が、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む、請求項２０４に記載の方法。
前記１つまたは複数の増殖因子の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間である、請求項２０５に記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、α－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項１９５から２０６のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸のうちの核酸が、β－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項１９５から２０７のいずれか一項に記載の方法。
前記１または複数の核酸が、α－ＴＣＲとβ－ＴＣＲの両方をコードする核酸を含む、請求項１９５から２０８のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸のうちの第１の核酸が、α－ＴＣＲをコードする核酸配列を含み、前記１つまたは複数の核酸のうちの第２の核酸が、β－ＴＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項１９５から２０９のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ３４^＋細胞に、自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含む、請求項１９５に記載の方法。
前記自殺遺伝子をコードする前記核酸が、α－ＴＣＲとβ－ＴＣＲの両方をさらにコードする、請求項２１１に記載の方法。
前記自殺遺伝子が、酵素に基づいている、請求項２１１または２１２に記載の方法。
前記自殺遺伝子が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）または誘導性カスパーゼ９をコードする、請求項２１３に記載の方法。
ＴＫ遺伝子が、ウイルスＴＫ遺伝子である、請求項２１４に記載の方法。
前記ＴＫ遺伝子が、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である、請求項２１４に記載の方法。
自殺遺伝子産物が、基質により活性化される、請求項２１１から２１６のいずれか一項に記載の方法。
前記基質が、ガンシクロビル、ペンシクロビル、またはその誘導体である、請求項２１７に記載の方法。
前記自殺遺伝子産物が、イメージングのために標識され得る基質を有するポリペプチドである、請求項２１８に記載の方法。
前記自殺遺伝子が、ｓｒ３９ＴＫである、請求項２１６から２１９のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＮＫＴ細胞が、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）ならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子をコードする遺伝子の発現を妨害することによって、１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変される、請求項１９５から２２０のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させることが、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡならびに／または個々のＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩ分子に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記ｉＮＫＴ細胞に導入することを含む、請求項２２１に記載の方法。
前記ＣＲＩＳＰＲまたは前記１つもしくは複数のｇＲＮＡが、電気穿孔または脂質媒介トランスフェクションにより前記細胞にトランスフェクトされる、請求項２２２に記載の方法。
前記ＴＣＲをコードする前記核酸が、組換えベクターを使用して導入される、請求項１９５から２２３のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、請求項２２４に記載の方法集団。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、請求項２２５に記載の方法。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、請求項２２６に記載の方法。
前記ＣＡＲをコードする前記核酸が、組換えベクターを使用して導入される、請求項１９５から２２７のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、請求項２２８に記載の方法。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスである、請求項２２９に記載の方法。
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターを含む、請求項２２９に記載の方法。
前記ｉＮＫＴ細胞を、前記細胞集団の前記増幅に十分な量のＩＬ－１５と接触させるステップをさらに含む、請求項１９５から２３１のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＮＫＴ細胞が凍結される、請求項１９５から２３２のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＮＫＴ細胞が、デキストロース、１つまたは複数の電解質、アルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯを含む溶液中にある、請求項１９５から２３３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＮＫＴ細胞が、無菌、非化膿性、および等張性である、請求項１９５から２３４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ３４^＋細胞が、がんを有さないヒト患者からの細胞に由来する、請求項１９５から２３５のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＮＫＴ細胞が、内在性ＴＣＲを発現しない、請求項１９５から２３６のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＮＫＴ細胞を活性化するステップをさらに含む、請求項１９５から２３７のいずれか一項に記載の方法。
前記ｉＮＫＴ細胞が、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化され、増幅された、請求項２３８に記載の方法。
フィーダー細胞にα－ＧＣがパルス投与された、請求項２３９に記載の方法。
少なくとも約１０^２～１０^６個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む操作されたｉＮＫＴ細胞の集団を産生する、請求項１９５から２４０のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも約１０^６～１０^１２個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む細胞集団を産生する、請求項１９５から２４１のいずれか一項に記載の方法。
前記複数の造血幹または始原細胞が、５×１０^８個未満の細胞（cels）を含む、請求項２４２に記載の方法。
少なくとも１００用量が産生される、請求項２４２に記載の方法。
各用量が、１０^７～１０^９個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む、請求項２４４に記載の方法。
ｉＮＫＴ細胞の前記集団が凍結され、次いで解凍される、請求項１９５から２４２のいずれか一項に記載の方法。
ｉＮＫＴ細胞の前記凍結されて解凍された集団に１つまたは複数の追加の核酸を導入するステップをさらに含む、請求項２４６に記載の方法。
前記１つまたは複数の追加の核酸が、１つまたは複数の治療用遺伝子産物をコードする、請求項２４７に記載の方法。
ｉＮＫＴ細胞で患者を処置する方法であって、請求項１４４から１８８のいずれかに記載の細胞または請求項１８９から１９４のいずれかに記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法。
がんを有する患者におけるがんを処置する方法であって、請求項１４４から１８８のいずれかに記載の細胞または請求項１８９から１９４のいずれかに記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法。
前記患者が、がんを有する、請求項２５０に記載の方法。
前記がんが、多発性骨髄腫である、請求項２５０または２５１に記載の方法。
前記がんが、白血病である、請求項２５１に記載の方法。
前記がんが、急性骨髄性白血病である、請求項２５３に記載の方法。
前記細胞または細胞集団が、前記患者に対して同種異系である、請求項２５０から２５４のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞または細胞集団が、がんを有さない患者に由来する、請求項２５０から２５５のいずれか一項に記載の方法。
追加の薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項２５０から２５６のいずれか一項に記載の方法。
前記追加の薬剤が、ＩＬ－６Ｒ抗体またはＩＬ－１Ｒアンタゴニストを含む、請求項２５７に記載の方法。
前記追加の薬剤が、ｉＮＫＴＴＣＲが特異的に結合する抗原を含む、請求項２５７または２５８に記載の方法。
前記抗原が、α－ＧＣを含む、請求項２５９に記載の方法。
前記患者が、過去にがんの治療を受けたことがある、請求項２５０から２５８のいずれか一項に記載の方法。
前記過去の治療が、毒性であった、および／または有効でなかった、請求項２６１に記載の方法。
前記過去の治療が、プロテアソーム阻害剤、免疫調節剤、抗ＣＤ３８抗体またはＣＡＲ－Ｔ細胞療法のうちの１つまたは複数を含む、請求項２６１または２６２に記載の方法。
前記がんが、ＢＣＭＡ^＋悪性細胞を含む、請求項２４９から２６３のいずれか一項に記載の方法。
前記がんが、ＢＣＭＡ^＋悪性Ｂ細胞を含む、請求項２６４に記載の方法。
前記がんが、ＣＤ１９^＋悪性細胞を含む、請求項２５０から２６３のいずれか一項に記載の方法。
前記がんが、ＣＤ１９^＋悪性造血細胞を含む、請求項２６６に記載の方法。
前記患者が、前記細胞または細胞集団の完全枯渇の徴候を示さない、請求項２５０から２６７のいずれか一項に記載の方法。
自殺遺伝子産物を起動させる化合物を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項２５０から２６８のいずれか一項に記載の方法。
前記患者における腫瘍進行が、前記患者への前記細胞または細胞集団の投与後に制御または抑制される、請求項２５０に記載の方法。
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患している患者を処置する方法であって、請求項１４４から１８８のいずれかに記載の細胞または請求項１８９から１９４のいずれかに記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法。
前記ＧＶＨＤが、骨髄移植に関連している、請求項２７１に記載の方法。
（１）少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（３）ＩＬ－１５と
を発現する、操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞であって、
前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ結合領域を含む細胞外結合ドメインを含む、請求項２７３に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９結合領域を含む細胞外結合ドメインを含む、請求項２７３または２７４に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、請求項２７３から２７５のいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
外来性自殺遺伝子産物を含む、請求項２７３から２７６のいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記細胞のゲノムが、少なくとも１つのＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるように改変された、請求項２７３から２７７のいずれかに記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、アルファＴＣＲ遺伝子産物である、請求項２７３から２７８のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記インバリアントＴＣＲ遺伝子産物が、ベータＴＣＲ遺伝子産物である、請求項２７３から２７９のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
アルファＴＣＲ遺伝子産物とベータＴＣＲ遺伝子産物の両方が発現される、請求項２７３から２８０のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
前記ｉＮＫＴ細胞が、前記細胞に導入された組換えベクターからの核酸を含む、請求項２７３から２８１のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
動物の血清を含む培地に曝露されなかった、請求項２７３から２８２のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４^＋の細胞に由来する、請求項２７３から２８３のいずれか一項に記載の操作されたｉＮＫＴ細胞。
請求項２７３から２８４のいずれか一項に記載の操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を含む細胞集団。
がんを有する患者におけるがんを処置する方法であって、請求項２７３から２８４のいずれかに記載の細胞または請求項２８５に記載の細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法。
自殺遺伝子産物を起動させる化合物を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項２８６に記載の方法。
操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）複数の造血幹または始原細胞からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；
ｂ）（１）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（２）ＣＡＲと、（３）ＩＬ－１５とをコードする１つまたは複数の核酸を、前記ＣＤ３４^＋細胞に導入するステップ；および
ｃ）前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４^＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生するステップ
を含む、方法。
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ－ＣＡＲである、請求項２８８に記載の方法。
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９－ＣＡＲである、請求項２８８に記載の方法。
ＣＤ３４^＋細胞における１つまたは複数のＨＬＡ－Ｉおよび／またはＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現を消失させるステップをさらに含む、請求項２８８から２９０のいずれかに記載の方法。
選択されたＣＤ３４^＋細胞を培地中で培養するステップを、１つまたは複数の核酸を前記細胞に導入するステップの前にさらに含む、請求項２８８から２９１のいずれかに記載の方法。
培養するステップが、前記選択されたＣＤ３４^＋細胞を、１つまたは複数の増殖因子を含む培地とともにインキュベートすることを含む、請求項２９２に記載の方法。
前記１つまたは複数の増殖因子が、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、および／またはヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む、請求項２９３に記載の方法。
前記１つまたは複数の増殖因子の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間である、請求項２９４に記載の方法。
前記１つまたは複数の核酸が、単一の核酸分子である、請求項２８８から２９５のいずれかに記載の方法。
前記選択されたＣＤ３４^＋細胞に、自殺遺伝子をコードする核酸を導入するステップをさらに含む、請求項２８８から２９６のいずれかに記載の方法。
選択されたｉＮＫＴ細胞が、アルファ－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）で活性化され、増幅された、請求項２８８から２９７のいずれかに記載の方法。
フィーダー細胞にα－ＧＣがパルス投与された、請求項２８８から２９８のいずれかに記載の方法。
少なくとも約１０^２～１０^６個の操作されたｉＮＫＴ細胞を含む操作されたｉＮＫＴ細胞の集団を産生する、請求項２８８から２９９のいずれかに記載の方法。
１．ｉＮＫＴ細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）ＣＤ３４^＋幹または始原細胞の集団を選択するステップ；
ｂ）少なくとも１つのｉＮＫＴ細胞ＴＣＲをコードする１つまたは複数の核酸を導入するステップ；および
ｃ）前記細胞を培養して前記細胞のＴ細胞への分化を誘導するステップ
を含み、
ａ）、ｂ）および／またはｃ）が、前記細胞を、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞の集団と接触させるステップを含まない、方法。
操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の集団を調製する方法であって、
ａ）複数の造血幹または始原細胞からＣＤ３４^＋細胞を選択するステップ；
ｂ）（１）少なくとも１つのヒトインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、（２）ＢＣＭＡ－ＣＡＲと、（３）ＩＬ－１５とをコードする１つまたは複数の核酸を、前記ＣＤ３４^＋細胞に導入するステップ；および
ｃ）前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４^＋細胞を培養してｉＮＫＴ細胞を産生するステップ
を含む、方法。
対象におけるＢ細胞リンパ腫を処置するための方法であって、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラー（ｉＮＫＴ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する細胞外結合ドメイン、
ｂ）単一の膜貫通ドメイン、および
ｃ）一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一の細胞質領域
を含むキメラ細胞受容体（ＣＡＲ）とを発現する操作されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を投与するステップを含み、
前記少なくとも１つのｉＮＫＴＴＣＲが、外来性核酸から、および／または組換えにより改変されたプロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から、発現される、方法。