KR20220152553A - 스테로이드의 히드록실화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적어도 하나 이상의 산화환원 파트너 시스템 및 산화환원 파트너 시스템을 재생하기 위한 시스템의 존재 하에 7-데옥시스테로이드를 시토크롬 P450 효소 또는 그의 기능적 변이체로 전환시키는 단계를 포함하는 스테로이드 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 스테로이드의 히드록실화를 위한 수단 및 방법에 관한 것이다.
3,7,12-트리히드록실화된 담즙산, 예를 들어, 콜산(3α,7α,12α-트리하이드록시-5β-콜란산 (3α,7α,12α-trihydroxy-5β-cholanic acid)) 또는 우르소콜산(3α,7β,12α-트리하이드록시-5β-콜란산(3α,7β,12α-trihydroxy-5β-cholanic acid))은 산업적으로 중요한 화학 물질이며 무엇보다도 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid) (UDCA) 제조를 위한 출발 물질이다. 우르소데옥시콜산은 무엇보다도 경미한 X선 음성 담석을 용해하는 약제로 사용되며, 간 질환 원발성 모양체 간경변증 및 원발성 경화성 담관염 치료에도 사용된다.
3,7,12-트리히드록실화 담즙산의 산업적으로 가장 중요한 공급원은 담낭의 담즙액이며, 육류 생산 시 도축장 폐기물로 축적된다. 다른 동물 종 외에도 소의 담즙이 자주 사용된다. 3,7,12-트리히드록실화 담즙산에 대한 산업적으로 관련된 총 합성은 없다. 담즙산의 생산은 다른 제품(육류)과 연결되어 있기 때문에 증가하는 수요에 대한 대응은 매우 제한적일 수 있다. 이러한 이유로 원료 담즙을 가능한 한 효율적으로 사용하는 것이 큰 관심이다.
담즙은 담즙산, 지질, 콜레스테롤 및 기타 물질의 수성 혼합물이기 때문에, 담즙산 추출 중 성분의 분리는 특히 중요하다. 상기 담즙산은 또한 히드록실 그룹의 수와 위치가 다른 성분을 포함하는 혼합물을 구성한다. 콜산 외에도 소 담즙에는 상당한 비율의 데옥시콜산이 포함되어 있는데, 이는 7번 위치(3α,12α-디히드록시-5β-콜란산)에 OH기가 없다는 점에서 콜산과 상이하다 데옥시콜산은 3,7,12-트리히드록실화 담즙산(3,7,12-trihydroxylated bile acid)보다 훨씬 낮은 상업적 가치를 가지고 있다. 따라서 7번 위치에 히드록실기를 선택적으로 도입하여 데옥시콜산을 3,7,12-트리히드록실화 담즙산으로 전환시키는 데 산업적 관심이 있다.
히드록실화 동안, 산소 원자는 산화 반응에서 (비-활성화된) C-H 결합으로 공식적으로 도입된다. 유기 화학에서, 이들은 수행하기 매우 어려운 반응이다. OH 기는 예를 들어 C=C 이중 결합에서 물을 추가함으로써 우회를 통해 자주 도입된다. 복잡한 분자(예컨대, 담즙산)의 특정 위치에서 선택적인 히드록실화는 여러 화학적(거의) 동등한 C-H 결합이 존재하기 때문에 문제가 된다.
7β-히드록실라제(7β-hydroxylase)를 사용하여 리토콜산(lithocholic acid)을 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid)으로 효소적 전환시키는 방법이 WO 2018/227940 A1에 기재되어 있다.
Schmitz et al. (Microbial Cell Factories 13 (1): 1-13 (2014))는 시토크롬 P450 모노옥시게나제(cytochrome P450 monooxygenase)를 사용한 전환에 의한 디히드로에피안드로스테론 (dehydroepiandrosterone) (DHEA) 또는 프레그네놀론 (pregnenolone) (PREG)의 7-히드록실 유도체의 생산을 설명한다.
CN 102 002 518 B는 히드록실라제에 의한 3-β-콜레스테롤 아세테이트(3-β-cholesterol acetate)에서 7-β-히드록실-3-β-콜레스테롤 아세테이트(7-β-hydroxyl-3-β-cholesterol acetate)로의 전환을 기재하고 있다.
WO 2020/109776 A2에서, 시토크롬 P450을 사용하여 스테로이드 프레그네놀론으로부터 다양한 유기 화합물의 히드록실화 또는 탈알킬화 방법이 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 특히 이 시점에서 위치 7에 수소를 갖고 히드록실기를 갖지 않는 담즙산 및 이의 유도체와 같은 스테로이드를 히드록실화하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 목적은 적어도 하나 이상의 산화환원 파트너 시스템(redox partner system) 및 산화환원 파트너 시스템을 재생하기 위한 시스템의 존재 하에 시토크롬 P450 히드록실라제 또는 이의 기능적 변이체로, 일반 화학식 II를 갖는 7-데옥시스테로이드(7-deoxysteroid)를 전환하는 단계를 포함하는, 일반 화학식 I을 갖는 스테로이드의 제조방법으로서, 시토크롬 P450 히드록실라제는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 스테로이드의 제조방법에 의해 달성된다:
<화학식 I>
<화학식 II>
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 H, Cl, F, Br, I, CF3, C1 내지 C6 알킬 라디칼(alkyl radical), OH, C1 내지 C6 알콕시 라디칼(alkoxy radical), CN, NO2, N(R6)2, 에폭시 기(epoxy group), CHO 또는 CO2R6 라디칼(radical),이며, 여기서,
R6는 C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph, -C(O)CH2Ph,이고,
R1 및 R2는 독립적으로 H, OH, OR7 또는 O이며, 여기서,
R7은 -C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph, -C(O)CH2Ph이며,
R3는 H, OH, OR8, C1 내지 C10 알킬 라디칼, C1 내지 C10 알케닐 라디칼, -CHO, -C(O)(CH3), -C(O)(CH2OH), -CH(CH3)C(O)CH3, -CH(CH3)((CH2)2CO2R9) 또는 -CH(CH3)((CH2)2CONHR9) 이며, 여기서,
R8은 -C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph 또는 -C(O)CH2Ph이고,
R9는 -CH3,-CH2COOH, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)2CH3, -(CH2)2SO3H, C(CH3)3, -(CH2)3CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH2(CH3)2, 아릴기(aryl group) 또는 알킬아릴기(alkylaryl group)이고,
R4는 H, OH, 또는 -OR10이며, 여기서,
R10은 -C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph 또는 -C(O)CH2Ph,이고
R5는 is H, CF3, C1 내지 C6 알킬 라디칼, C1 내지C6 알케닐 라디칼, OH, O, 또는 C1 내지 C6 알콕시 라디칼이며, 여기서 점선은 임의의 이중 결합을 나타내고, 단 A 고리가 C4-C5 이중 결합을 갖는 경우 B 고리는 이중 결합을 갖지 않고, X1 및 X2가 에폭시 기를 형성하는 경우 C 고리는 이중 결합을 갖지 않는다.
놀랍게도, 시토크롬 P450 및 이의 기능적 단편은 위치 7에서 콜산 및 각각 화학식 I을 갖는 유도체와 같은 스테로이드를 하이드록실화할 수 있는 것으로 나타났다. 이 반응을 적어도 하나 이상의 산화환원 파트너 시스템 및 산화환원 파트너 시스템을 재생하기 위한 시스템과 결합함으로써, 상기 반응의 평형이 최종 생성물을 향해 이동될 수 있고 따라서 이의 수율이 상당히 증가될 수 있다. 이 경우, 상기 산화환원 파트너 시스템의 재생은 바람직하게는 적어도 하나 이상의 산화환원효소 및 적어도 하나 이상의 산화환원효소의 적어도 하나 이상의 기질을 포함하는 제2 시스템(재생 시스템)의 존재 하에 일어날 수 있다.
환원 당량 NAD(P)H의 산화를 필요로 하는 시토크롬 P450 및 이의 기능적 변이체는 놀랍게도 위치 7에서 7-데옥시콜산과 같은 7-데옥시스테로이드 및 이의 유도체를 선택적으로 하이드록실화할 수 있다.
본 발명에 따르면, 시토크롬 P450 효소는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
시토크롬 P450은 많은 수의 내인성 및 외인성 기질의 모노옥시게나제(monooxygenase) 반응을 촉매한다. 그들은 무엇보다도 스테로이드(steroids), 에이코사노이드(eicosanoids), 지방산 및 담즙산의 대사뿐만 아니라 약물, 살충제 및 화학 발암 물질과 같은 외인성 기질의 대사에 관여한다.
본 발명에 따른 시토크롬 P450은 예를 들어, 악티노박테리아(actinobacteria)와 같은 박테리아, 특히 예를 들어 스트렙토마이세스 속으로부터의 박테리아로부터 사용될 수 있다. 이 경우, 상기 서열은 예를 들어 공지된 기술을 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 발명에 따른 시토크롬 P450 및 각각의 기능적 변이체는 임의로 원래 유기체에 존재하거나 이로부터 단리될 수 있거나, 재조합으로 발현되거나 합성적으로 생성될 수 있다. 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 바람직하게는 본 발명에 따라 사용된다.
다양한 확립된 미생물, 예를 들어 대장균(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 본 발명에 따른 효소의 재조합 발현을 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여 적절한 프로토콜은 관련 전문 문헌에 자세히 설명되어 있거나 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 효소/폴리펩티드는 바람직하게는 E. coli에서 재조합적으로 과발현된 단백질로서 사용되며, 상응하는 세포 용해물은 바람직하게는 추가 처리/정제 없이 또는 비교적 간단한 처리 단계(예를 들어, 원심분리, 침전, 농축 또는 동결 건조)후에 사용된다. 상기 사용된 효소의 재조합 과발현 후, E. coli 세포는 대안적으로 세포 분해 없이 직접 또는 예를 들어 동결/해동 주기 후에 반응에 사용될 수도 있다. 적합한 발현 플라스미드는 당업자에게 공지되어 있고 종종 상업적으로 구입할 수 있다.
시토크롬 P450의 "기능적 변이체(Functional variants)"는 시토크롬 P450의 단편 또는 돌연변이 변이체일 수 있으며, 여기서 시토크롬 P450의 단편은 "기능적 단편(functional fragments)"으로도 지칭될 수 있다. 시토크롬 P450의 "기능적 변이체(Functional variants)"는 이들이 유래된 단백질과 동일한 반응을 촉매할 수 있다. 변이체가 기능적인지 여부, 즉 그것이 유래된 단백질과 동일한 반응을 촉매하는지 여부는 변이체가 동일한 반응을 촉매한다는 것을 확립함으로써 결정할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 종래 기술에 확립된 방법 또는 각각 본원에 기재된 방법이 있다. 본 발명에 따른 기능적 변이체에 의한 기질의 전환율은 이들이 유래된 시토크롬 P450의 전환율과 다를 수 있다.
"7-데옥시스테로이드의 유도체(Derivatives of 7-deoxysteroids)"는 7-데옥시스테로이드로부터 유도되고 상기 정의된 바와 같은 다양한 변형을 갖는 화합물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, X1, X2, R4 및 R5는 H이고,
R1 및 R2는 독립적으로 H, OH, OR8 또는 O이며,
R8은 -C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph 또는 -C(O)CH2Ph이고,
R3는 H, OH, OR8, C1 내지 C10 알킬 라디칼, C1 내지 C10 알케닐 라디칼, -CH(CH3)((CH2)2CO2R9) 또는 -CH(CH3)((CH2)2CONHR9)이며,
R9는 -CH3, -CH2COOH, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)2CH3, -(CH2)2SO3H, C(CH3)3, -(CH2)3CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH2(CH3)2, 아릴기(aryl group) 또는 알킬아릴기(alkylaryl group)이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 아릴기는 페닐 라디칼, F, Cl, Br, NO2 또는 CH3로 치환된 페닐 라디칼 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 알킬아릴기는 벤질기, 할로겐화 벤질기(여기서 할로겐은 F, Cl 또는 Br임), 및 NO2로 치환된 벤질기로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, R1은 OH이고, R2는 O 또는 OH이고, R3은 CH(CH3)((CH2)2CO2R5)이고, R4는 H이고, R5는 H이다
본 발명의 다른 바람직한 실시예에 따르면, 화학식 II를 갖는 7-데옥시스테로이드는 3α,12α-디히드록시-5β-콜란-24-산(3α,12α-dihydroxy-5β-cholane-24-acid), 3α,12β-디히드록시-5β-콜란-24-산(3α,12β-dihydroxy-5β-cholane-24-acid), 3β,12α-디히드록시-5β-콜란-24-산(3β,12α-dihydroxy-5β-cholane-24-acid), 3ß,12ß-디히드록시-5ß-콜란-24산(3ß,12ß-dihydroxy-5ß-cholane-24-acid), 3β-히드록시-12-케토-5β-콜란-24-산(3ß-hydroxy-12-keto-5ß-cholane-24-acid), 3-케토, 12ß-하이드록시-5ß-콜란-24-산(3-keto,12ß-hydroxy-5ß-cholane-24-acid), 3-케토, 12α-히드록시-5β-콜란-24-산(3-keto,12α-hydroxy-5β-cholane-24-acid), 3α-히드록시-5β-콜란-24-산(3α-hydroxy-5β-cholane-24-acid), 3-케토-5β-콜란-24-산(3-keto-5β-cholane-24-acid), 3β-히드록시-5β-콜란-24-산(3β-hydroxy-5β-cholane-24-acid) 및 각 산의 에스테르(esters)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 따라 화학식 II을 갖는 7-데옥시스테로이드 및 이의 유도체를 화학식 I을 갖는 스테로이드 또는 이의 유도체로 하이드록실화하기 위해 사용되는 시토크롬 P450 효소는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 95% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 96% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 97% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 98% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 99% 이상, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 1
서열번호 2
서열번호 1 및 2의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 3 및 4의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 핵산 서열 서열번호 5 및 6은 E. coli에서의 발현을 위해 최적화된다.
서열번호 3
서열번호 4
서열번호 5
서열번호 6
본원에 사용된 "동일한(Identical)"은 2개 이상의 아미노산 서열이 서로 중첩될 때 서로에 대해 특정 "동일성(identity)"(동일한 위치에서 아미노산 잔기와 일치함)을 가질 수 있음을 의미한다. "동일성(Identity)"은 본 발명에서 시작 서열의 아미노산과 동일한 적격한 아미노산 서열의 아미노산의 백분율로 정의되며, 즉, "단백질 BLAST" 프로그램(blastp; Altschul et al., J. Mol. Biol. (1997) 215:403-410; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; 일반적으로 본원에서“로 언급됨) 에 의해 생성된 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 두 서열의 정렬 및 간격의 도입 후 모든 가변 매개변수가 기본값으로 설정된다. 본원에서, 알고리즘 "blastp(단백질-단백질-BLAST)"는 다음 매개변수와 함께 사용된다: "예상 임계값(expect threshold)": 0.05; "단어 크기(word size)": 6; 매트릭스(matrix): BLOSUM62; "갭 비용(gap costs)": "존재(Existence)" 11, "확장(Extension)" 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정; 필터 없음 및 마스크 없음. 이 전환은 산화 환원 파트너(redox partners) 또는 하이드록실화 반응에 전자를 제공할 수 있는 산화 환원 파트너 시스템의 존재 하에 발생한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 적어도 하나 이상의 산화환원 파트너 시스템은,
(i) 페레독신, 페레독신 환원효소 및 NAD(P)H;
(ii) 시토크롬 P450 환원효소 및 NAD(P)H; 또는
(iii) NAD(P)H를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 산화환원 파트너 시스템은 페레독신(ferredoxin), 페레독신 환원효소(ferredoxin reductase) 및 NAD(P)H를 포함할 수 있고; 시토크롬 P450 환원효소 및 NAD(P)H; 또는 NAD(P)H 단독, 페레독신, 페레독신 환원효소 및 NAD(P)H를 포함하는 산화환원 파트너 시스템이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 사이토크롬 P450 또는 각각의 기능적 변이체의 산화환원 반응을 수행하기 위해, 본 발명에 따른 방법에서 적어도 산화환원 보조인자 NAD+/NADH 및/또는 NADP+/NADPH를 사용하는 것이 유리하다. 이 맥락에서 NAD+는 산화된 형태를 나타내고 NADH는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 환원된 형태를 나타내며, NADP+는 산화된 형태를 지정하고 NADPH는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트의 환원된 형태를 지정한다.
반응 혼합물 중 산화환원 보조인자 NAD(P)+ 및/또는 NAD(P)H의 농도는 바람직하게는 0.001mM 내지 10mM, 더욱 바람직하게는 0.05mM 내지 1mM이다.
특히 바람직하게는, NAD(P)+ 및 하나 이상의 페레독신 환원효소의 존재 하에 재생될 수 있는 산화환원 파트너로서 페레독신이 사용된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 적어도 하나 이상의 페레독신은 아드레노독신(adrenodoxins), 푸티다레독신(putidaredoxins) 및 플라보독신(flavodoxins)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 선택적으로 이들의 조합도 또한 사용될 수 있다.
가능한 한 쌍의 산화환원 파트너는 바람직하게는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터의 푸티다레독신 및 푸티다레독신 환원효소를 포함한다. 더욱이, 당업자는 본 발명에 따른 시토크롬 P450에 대한 잠재적인 산화환원 파트너인 추가의 페레독신 단백질 및 페레독신 환원효소를 확인할 수 있다. 산화환원 파트너로서의 적합성은 예를 들어 실시예 3 내지 5에 기재된 바와 같이 기능적 분석에서 검증될 수 있다. 이러한 실시예에서 사용된 푸티다레독신 및/또는 여기에 사용된 푸티다레독신 환원효소는 각각 가능한 대체 단백질 또는 효소로 대체될 수 있다. 원하는 제품(예를 들어, 우르소콜산(ursocholic acid))의 충분한 형성이 관찰되는 경우, 상기 테스트된 산화환원 파트너는 푸티다레독신 및/또는 푸티다레독신 환원효소에 대한 기능적 대안으로 간주될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 페레독신은 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 85% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 95% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 96% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 97% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 98% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 99% 이상, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 X는 메티오닌 잔기이거나 아미노산이 아니다.
서열번호 7
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 적어도 하나 이상의 페레독신 리덕타제는 플라보독신 리덕타제 및 푸티다레독신 리덕타제의 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 하이드록실화 반응 과정에서 산화된 페레독신은 페레독신 환원효소 및 NAD(P)H의 도움으로 환원될 수 있다. 그 결과, 환원된 페레독신이 다시 제공되거나 본 발명에 따른 기질의 추가 하이드록실화 반응을 위해 NAD(P)H를 소비하면서 각각 재생된다. 상기 페레독신 환원효소는 플라보독신 환원효소 및/또는 푸티다레독신 환원효소일 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 페레독신 환원효소는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 85% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 95% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 96% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 97% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 98% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 99% 이상, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 8
서열번호 7 및 8의 아미노산 서열은 바람직하게는 각각 서열번호 9 및 10에 의해 인코딩되며, 핵산 서열 서열번호 11 및 12는 E. coli에서의 발현을 위해 최적화된다.
서열번호 9
(ATG)0 또는 1
서열번호 10
서열번호 11
(ATG)0 또는 1
서열번호 12
박테리아, 특히 E. coli에서 본 발명에 따른 시토크롬 P450 및 임의의 페레독신 및 페레독신 환원효소의 발현은 핵산 서열이 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 11 및/또는 서열번호 12가 사용될 때 특히 유리하다. 따라서 본 발명의 추가 양태는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 11 및 서열번호 12 및 벡터 및/또는 세포, 특히 이들 서열 중 적어도 하나를 포함하는 E. coli 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열을 갖는 핵산(DNA 및/또는 RNA)에 관한 것이다.
상기 언급된 페레독신 및 페레독신 환원효소가 생산 균주(예를 들어, E. coli 균주)에서 시토크롬 P450과 함께 발현(공동-발현)되는 것이 유리한 것으로 나타났다. 페레독신, 페레독신 환원효소 및 시토크롬 P450은 또한 서로 별도로 발현될 수 있다. 또한 페레독신과 시토크롬 P450 또는 페레독신 환원효소와 시토크롬 P450을 공동 발현하는 것이 유리하다. 이상적으로는 동일한 프로모터 하에 3개의 단백질 또는 각각 효소의 공동-발현을 통해 효소 간의 이상적인 균형이 확립될 수 있으며, 이는 기질의 효소적 전환에 특히 유리한 효과를 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 하나 이상의 산화환원효소는 산화환원효소(oxidoreductase)(EC: 1.1.1), 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase) (EC: 1.2.1), 아미노산 탈수소효소(amino acid dehydrogenase)(EC: 1.4.1), 플라빈 환원효소(flavin reductase)(EC: 1.5.1), 트랜스하이드로게나제(transhydrogenase)(EC: 1.6.1), 아질산염 환원효소(nitrite reductase)(EC: 1.7.1) 및 포스포네이트 탈수소효소(phosphonate dehydrogenase)(EC: 1.20.1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 알코올 탈수소효소, 히드록시스테로이드 탈수소효소, 포스파이트 탈수소효소 및 당 탈수소효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 산화환원 파트너 시스템, 특히 공정에 사용되는 보조인자(NADH/NAD+ 및/또는 NADPH/NADP+)를 재생하기 위해, 일반 화학식 I을 갖는 스테로이드가 일반 화학식 II를 갖는 7-데옥시스테로이드로 전환되는 동안, 상기 전환 반응이 생성물 쪽으로 밀려나도록, 산화환원 파트너 시스템, 유리하게는 산화환원효소를 재생하기 위한 시스템을 반응 혼합물에 첨가하는 것이 유리하다. 산화환원효소는 환원 및 산화에 의해 기질을 전환하는데, 이러한 반응 과정에서 NADH는 NAD+로 산화되고 NADPH는 NADP+로 산화되거나 각각 NAD+는 NADH로 환원되고 NADP+는 NADPH로 환원된다. 따라서, 상기 산화환원 파트너 시스템을 재생하기 위한 시스템은 바람직하게는 적어도 하나의 산화환원효소 및 적어도 하나의 산화환원효소의 적어도 하나의 기질을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 산화환원효소는 바람직하게는 알코올 및/또는 당 탈수소효소이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 적어도 하나 이상의 산화환원효소는 글루코오스 탈수소효소(glucose dehydrogenase), 글루고오스-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase), 아라비노스 탈수소효소(arabinose dehydrogenase), 자일로스 탈수소효소(xylose dehydrogenase), 소르비톨 탈수소효소(sorbitol dehydrogenase), 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase), 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소(12α-hydroxysteroid dehydrogenase), 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소(7α-hydroxysteroid dehydrogenase), 20α-히드록시스테로이드 탈수소효소(20α-hydroxysteroid dehydrogenase), 17β-히드록시스테로이드 탈수소효소(17β-hydroxysteroid dehydrogenase), 17α-히드록시스테로이드 탈수소효소(17α-hydroxysteroid dehydrogenase), 3α-하이드록시스테로이드 탈수소효소(3α-hydroxysteroid dehydrogenase), 3β-하이드록시-델타5 탈수소효소(3β-hydroxy-delta5 dehydrogenase), 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소(11β-hydroxysteroid dehydrogenase) 및 포르메이트 탈수소효소(formate dehydrogenase)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기에서 언급한 산화환원효소 중 하나 또는 여러 개를 사용하는 것은 전환 반응에 사용되는 보조인자를 재활용하는 데 특히 유리하다.
기질의 생성물로의 높은 전환율을 달성하기 위해 반응 혼합물에 아라비노스 탈수소효소, 소르비톨 탈수소효소 및/또는 자일리톨 탈수소효소를 첨가하는 것이 특히 유리한 것으로 나타났다.
상기 반응 혼합물은 하나 이상의 산화환원효소 및 하나의 히드록시화효소(hydroxylase)를 포함할 수 있다. 2개 또는 3개 이상의 산화환원효소의 조합, 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소 및 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소의 조합 또는 각각, 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소, 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소 및 NAD(P)H 산화효소의 조합 또는 각각, NADH 의존성 알코올 탈수소효소 및 수산화효소의 조합 또는 각각을 반응 혼합물에 첨가하는 것이 특히 유리하며, NADPH-의존성 알코올 탈수소효소 및 히드록실라제는 기질 혼합물, 예를 들어 콜산의 자연 발생 혼합물의 동시 산화 및 히드록실화에 특히 매우 적합하다.
본 발명에 따른 방법의 반응 혼합물에서 보조인자의 산화 또는 환원 반응을 각각 촉매하기 위해, 그 안에 존재하는 산화환원효소에 대한 적어도 하나 이상의 기질을 제공하는 것이 필요하다. 따라서, 상기 반응 혼합물은 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 소르비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol), 콜란-24-산(cholane-24-acid), 3α,12α-디히드록시콜린-24-산-2,3-부탄디올(3α,12α-dihydroxycholane-24-acid-2,3-butanediol), 아세토인(acetoin), 2-프로판올(2-propanol), 글루타메이트(glutamates), 에탄올(ethanol), 포스포네이트(phosphonates), 포스파이트(phosphites), 니트라이트(nitrites), 4-메틸-2-펜탄올(4-methyl-2-pentanol), 2-부탄올(2-butanol), 2-옥탄올(2-octanol), 사이클로헥산올(cyclohexanol), 에탄디올(ethanediol), 1,2-프로판디올(1,2-propanediol), 1-프로판올(1-propanol), 1-부탄올(1-butanol), 3-히드록시부타노에이트(3-hydroxybutanoate), 및 포르메이트(formate)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 산화환원효소의 적어도 하나 이상의 기질을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 15℃ 내지 38℃, 보다 바람직하게는 20℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는 22℃ 내지 26℃의 온도에서 수행된다. 본 발명에 따른 반응에 대한 시토크롬 P450의 효소 활성은 이 영역에서 특히 높다는 것이 본 발명에 따라 밝혀졌다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 7 내지 8, 더욱 바람직하게는 7.2 내지 7.8의 pH에서 수행된다. 이 pH 값에서 시토크롬 P450의 효소 활성이 가장 높아 기질의 적절한 전환이 가능하다.
데옥시스테로이드 또는 각각 데옥시스테로이드 유도체의 히드록실화는 스테로이드 백본의 위치 7에서 위치선택적으로 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 특히, 7 베타-히드록실기(7beta-hydroxyl group)가 입체선택적으로 도입되어 예를 들어 우르소콜산 및/또는 우르소콜산 유도체가 생성될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 유기 용매의 존재하에 수행된다. 바람직하게는, 단일 유기 용매가 사용되어 단일-상 시스템이 제공된다. 또한, 본 발명에 따라 단일-상 시스템이 제공되도록 서로 혼화성(miscible)인 2종 이상의 유기 용매의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다. 상기 유기 용매는 양성자성 또는 비양성자성일 수 있으며, 비양성자성 용매가 바람직하다.
놀랍게도, 유기 용매, 특히 비양성자성 유기 용매의 존재는 본 발명에 따른 방법에 따라 일반 화학식 II의 7-데옥시스테로이드에서 화학식 I의 스테로이드로의 전환을 상당히 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 상기 유기 용매의 존재 하에 본 발명에 따른 방법을 실행하면 놀랍게도 산화환원 파트너 시스템이 재생될 수 있다.
알코올, 에테르, 에스테르, 글리콜, 케톤, 아미드, 술폭시드, 유기산, 시클로알칸, 방향족 및 염소화 탄화수소는 예를 들어 유기 용매로 사용될 수 있다. 적합한 유기 용매의 실시예는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 2-부탄올, 4-메틸-2-펜탄올(메틸 이소부틸 알코올(methyl isobutyl alcohol), MIBA), 디에틸 에테르(Et2O), 디이소프로필 에테르(iPr2O), 디옥산, 테트라히드로푸란(THF), 2-메틸테트라히드로푸란(Me-THF), 에틸 아세테이트, 에틸렌 글리콜, 메틸 이소부틸 케톤(MIBK), 2-부탄온, 아세톤, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA), 시클로헥산, 톨루엔, 트리클로로메탄(CHCl3), 디클로로메탄(CH2Cl2), 헥산 또는 이들의 혼합물이다. 적합한 혼합물은 예를 들어, 헥산과 에틸 아세테이트 또는 이소프로판올의 혼합물 뿐만 아니라 트리클로로메탄과 페놀의 혼합물이다. 본 발명은 상기 예시적인 용매 목록으로 제한되지 않는다.
상기 유기 용매는 바람직하게는 비양성자성 유기 용매, 특히 바람직하게는 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 디메틸아세트아미드(DMA)로 이루어진 군에서 선택되는 용매이다.
본 발명에 따르면, 유기 용매의 양은 일반 화학식 II의 화합물이 완전히 용해되고 효소 활성이 보존되도록 선택된다. 바람직하게는, 화학식 II의 화합물, 예를 들어 리토콜산은 용해도 한계까지 유기 용매에 용해된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 효소의 기질은 유기 용매에 위치된다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 생성물의 분리는 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 생성물은 적합한 유기 용매에 의해 반응 혼합물로부터 추출될 수 있다. 상기 기질에 따라, 이러한 용매는 문헌에 설명되어 있다. 본 발명에 따르면, 예를 들어 HCl을 사용하여, 선택적으로 반응 혼합물의 산성화 후, 예를 들어 에틸 아세테이트를 사용하여 반응 혼합물로부터 콜산 및 그의 유도체를 단리할 수 있다. 담즙산이 수용액에 염(예를 들어, 나트륨 염)의 형태로 존재하는 방법은 특별한 경우를 구성한다.
이 경우, 상기 생성물의 침전은 반응 혼합물을 산성화함으로써 영향을 받을 수 있다. 이를 위해, 예를 들어 HCl 또는 묽은 HCl을 반응 혼합물에 충분한 양으로 첨가할 수 있다. 예를 들어, 1 내지 4, 바람직하게는 2 내지 3의 pH 값이 공정에서 달성되는 경우, 생성물은 주로 현탁액 형태로 존재한다. 그 다음, 상기 생성물은 예를 들어 여과 또는 원심분리와 같은 일반적인 방법에 의해 반응 혼합물로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 또는 이온-교환 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법은 예를 들어 생성물 분리에 사용할 수 있는 또 다른 대안이다. 또한, 예를 들어, 상기 반응 용매를 증발시켜 생성물을 얻는 것이 가능하다.
대안적으로, 본 발명에 따른 방법에서, 상기 생성물(들)은 또한 예를 들어 훨씬 더 많은 반응을 수행하고 이러한 반응의 완료 시 최종 생성물을 선택적으로 단리하기 위해 반응 후에 반응 혼합물에 남아 있을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법을 위한 기질(들)은 이전 반응 또는 병렬로 일어나는 반응에 의해 동일한 반응 배치에서 생성되는 것으로 생각할 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 페레독신, 페레독신 환원효소 및 산화환원효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자가 3' 말단 및/또는 5' 말단에 있는 상기 정의된 시토크롬 P450 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물은 직접 또는 스페이서를 통해 결합된다.
본 발명에 따른 핵산 구축물은 초기에 정의된 바와 같은 스테로이드의 생산에 특히 적합하다. 시토크롬 P450 효소 및 페레독신, 페레독신 환원효소 및 산화환원효소로 이루어진 그룹에서 선택되는 적어도 하나 이상의 단백질을 핵산 구조체로부터 발현시켜서, 본 발명에 따른 방법의 효율적인 실행에 필요한 양으로 이들 효소 또는 단백질을 각각 생산하는 것이 가능해진다. 이러한 단백질 모두가 본 발명에 따른 핵산 구축물에서 동일한 프로모터의 제어 하에 발현되는 경우 특히 유리하다. 본 발명의 추가 양태 본 발명에 따른 핵산 구축물을 포함하는 벡터이다.
시토크롬 P450 효소를 코딩하는 핵산 분자는 효소 또는 각각 단백질을 코딩하는 추가 핵산 분자에 결합될 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 방법에서 직접 또는 스페이서 또는 각각 스페이서 서열을 통해 사용될 수 있다. 이러한 구축물의 장점은 그러한 구축물이 본 발명에 따른 방법에 사용되는 효소 및 단백질, 특히 시토크롬 P450 및 페레독신 및/또는 페레독신 환원효소를 비교할만한 양으로 발현할 수 있다는 점이다.
본원에 사용된 "스페이서(spacer)" 또는 각각 "스페이서 서열(spacer sequence)"은 정지 코돈도 없고 임의의 다른 기능적 모티프도 갖지 않는 핵산 서열이다. 스페이서 또는 각각 스페이서 서열은 필요한 경우 이러한 ORF의 전사를 개선하기 위해 두 ORF 사이의 거리 유지기 역할을 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 시토크롬 P450 효소는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 핵산 서열과 적어도 90%, 특히 100% 동일한 핵산에 의해 인코딩된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 페레독신은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 페레독신 환원효소는 아드레노독신 환원효소(adrenodoxin reductase), 바람직하게는 푸티다레독신 환원효소(putidaredoxin reductase)이다.
상기 페레독신 환원효소는 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 핵산 구축물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터일 수 있고, 그것이 도입되는 유기체에 따라, 예를 들어 ORF의 전사를 가능하게 하기 위해 적절한 섹션을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 재조합으로 도입되고 핵산 구축물 상에 위치한 ORF의 클로닝 또는 발현에 사용될 수 있다.
이러한 숙주 세포의 용해물은 숙주 세포가 본 발명에 따른 방법에 필요한 효소 또는 단백질 중 적어도 하나 이상을 각각 세포내 또는 세포외에서 발현시킨다는 조건에 따라 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다. 일반 화학식 II를 갖는 7-데옥시 스테로이드 또는 이의 유도체는 바람직하게는 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양 상층액 및/또는 용해물 중의 세포 현탁액 또는 세포와 접촉하게 된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 화학식 II를 갖는 7-데옥시 스테로이드 또는 그의 유도체는 적어도 하나 이상의 페레독신, 적어도 하나 이상의 페레독신 환원효소 및/또는 적어도 하나 이상의 산화환원효소를 발현할 수 있는 적어도 하나 이상의 숙주 세포의 적어도 하나 이상의 배양 상층액 및/또는 용해물과 접촉된다.
본 발명은 하기 실시예를 사용하여 더욱 상세히 설명되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 박테리아 균주의 테스트(Test of bacterial strains)
다음 박테리아 균주는 German Strain Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ [Deutsche Stammsammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen])에서 입수하였다: 사카로트릭스 롱기스포라(Saccharothrix longispora) (DSM-43749), 카텔라토스포라 시트라에(Catellatospora citrae) (DSM-44097), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus) (DSM-40578) 및 아사노아 페루기니아(Asanoa ferruginea) (DSM-44099). 상기 균주는 DSMZ에서 권장하는 표준 조건에서 배양되었다. 상기 배양물의 성장이 가시적인 탁도를 초래하자마자, 데옥시콜산(0.5mM)을 첨가하고, 최대 72시간 동안 추가로 배양하였다. 원심분리 단계 후, 상기 배양물의 상층액을 에틸 아세테이트로 추출하고 HPLC 및 GC/MS로 분석하였다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)와의 반응에 대한 HPLC 크로마토그램에서 우르소콜산(ursocholic acid)의 머무름 시간에 해당하는 피크가 나타났다. GC/MS 분석은 잠재적인 우르소콜산 피크가 3개의 하이드록실 그룹을 갖는 담즙산에서 유래함을 나타낸다. 다른 균주의 검사는 데옥시콜산의 7-하이드록실화 생성물에 대한 징후를 나타내지 않았다.
실시예 2: P450 유전자의 게놈 시퀀싱 및 주석(Genome sequencing and annotation of the P450 genes)
DSMZ 규정에 따라, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 하이그로스코피쿠스 (DSM-40578) 배양 시, 균주의 게놈 DNA를 분리하였다 (Kieser et al. (2000), Practical Streptomyces genetics (Norwich: John Innes Foundation)). 상기 게놈은 Illumina MiSeq를 사용하여 시퀀싱되었으며 스트렙토마이세스 라파미시니쿠스(Streptomyces rapamycinicus)의 알려진 게놈을 기반으로 어셈블리가 수행되었다(Microsynth GmbH, Switzerland). 42개의 P450 유전자는 상동성 비교에 의해 확인될 수 있었다.
실시예 3: 발현 시스템의 클로닝(Cloning of expression system)
제한 효소 XhoI를 사용하여 푸티다레독신 환원효소(putidaredoxin reductase) (PtR) 및 푸티다레독신(putidaredoxin) (Ptx)에 대한 코딩 영역을 포함하는 다음 구성물을 플라스미드 pJ411(DNA 2.0)에 클로닝하였다.
합성 DNA(Life Technologies): 5', XhoI 인터페이스(interface), HindIII 인터페이스, 약 50bp 스페이서 DNA(spacer DNA), 리보솜 결합 부위 (ribosome binding site) (rbs), ORF(오픈 리딩 프레임(open reading frame)) 푸티다레독신 환원효소(putidaredoxin reductase) (PtR), 약 50bp 스페이서 DNA, rbs, ORF 푸티다레독신(Ptx), XhoI 인터페이스, 3'.
클로닝 단계의 결과는 제한 효소 분해 및 DNA 시퀀싱을 통해 확인되었다.
이어서, 제한효소 NdeI 및 HindIII를 사용하여 실시예 2에서 확인된 P450 효소를 코딩하는 각각의 ORF를 상기 언급된 합성 DNA 또는 플라스미드에 각각 클로닝하였다(Life Technologies). 상기 결과는 제한효소 소화 및 DNA 시퀀싱을 통해 다시 확인되었다. 이 실시예에 사용된 발현 벡터 및 사용된 산화환원 파트너(redox partners)는 본 발명에 따른 시토크롬 P450 효소를 발현하는 단 하나의 방법을 구성하며, 이 방법은 실시예로서 선택되었다.
상기 확인된 P450 후보로 생성된 발현 플라스미드(실시예 2 참조)는 푸티다레독신 환원효소 및 푸티다레독신과 함께 각각의 P450 단백질을 공동으로 발현하는 데 사용할 수 있다. 각각의 발현 플라스미드의 3개의 ORF는 공통 mRNA 상의 T7 프로모터의 제어 하에 발현되지만, 별개의 폴리펩티드로서 발현된다.
실시예 4: P450/Ptx/PtR의 발현
Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus의 게놈 시퀀싱 후, 가능한 데옥시콜산-7-히드록실라제의 후보로 고려된 42개의 P450 서열이 있었다. 찾고 있는 효소를 확인하기 위해, 상기 후보의 ORF를 실시예 3에 기재된 발현 시스템 및 푸티다레독신 환원효소(PtR) 및 푸티다레독신(Ptx)에 대한 코딩 영역이 없는 pJ411(DNA 2.0) 발현 벡터에 클로닝하였다. 상기 발현에는 다음 프로토콜이 사용되었다.
TB-P450 발현 배지:
TB(Terrific broth) 배지
+ 50 μ카나마이신(kanamycin)
+ 0.5mM 5-아미노레불린산(aminolevulinic acid) (100x 상위 용액(parent solution)에서)
+ 1mM 티아민(thiamine) (100x 상위 용액에서)
+ 1mM MgCl2 + 2.5mM 황산암모늄 + 50μM FeCl3(100x 상위 용액에서)
+ 0.5mM IPTG(1M 상위 용액에서)
(첨가제는 각각 0.2μm 멸균 여과됨)
P450 용해 버퍼:
100mM 트리스(Tris) pH 7.5
20%(v/v) 글리세린(glycerin)
1 mg/ml 리소자임(lysozyme)
시험 대상인 P450 후보의 구조체를 대장균(E. coli) 발현 균주 BL21(DE3)로 형질전환시켰다. 하룻밤 배양은 단일 콜로니(LB(리소제니 브로스(lysogeny broth)) + 카나마이신)에서 접종되었다. 다음날, 1:100 발현 배양액(150ml TB(terrific broth) - P450 발현 배지)을 접종하고, 초기에 배플 플라스크(baffled flasks)(1L)에서 37℃에서 3시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 온도를 24℃로 낮추고, 22시간 더 진탕시켰다. 상기 배양물을 5000g에서 10분 동안 원심분리하여 수확하고, 0.9%(w/v) NaCl로 1회 세척하고, 펠렛을 -80℃에서 동결하였다. 상기 세포 펠렛을 해동하고, 무게를 측정하고, 동량의 P450 용해 버퍼로 재현탁하고, 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 초음파 분석기를 사용하여 소화시켰다. 원심분리(30분, 21000g) 시, 상기 상층액을 테스트 반응에 사용하였다.
실시예 5: DA 하이드록실화에 대한 P450 후보의 테스트
반응 혼합물(Reaction mixture):
10-80 μ100 mM NADH (redox cofactor)
250 μ1 M Tris-HCl pH 7.5
17.5 μ글리세린 (50%)
100 μ50 mM 데옥시콜산 용액(deoxycholic acid solution) pH 8.5 (최종 10 mM)
50 μE. coli 용해물 P450/PtR/Ptx (실시예 4 참조)
17.5-87.5 μdH2O
상기 반응물을 1.5 ml 나사형 병에 넣고 알루미늄 호일로 뚜껑으로 밀봉하였다. 상기 호일에 여러 곳에 구멍을 뚫었다. 24℃에서 18시간 동안 부드럽게 진탕하였다. 200㎕의 반응 배치를 600㎕ 아세토니트릴/5㎕ H3PO4(50%)로 희석하고 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 20817 rcf에서 5분 동안 원심분리하고 HPLC/DAD를 사용하여 분석하였다(예를 들어, Agilent 1200 시리즈; 컬럼: Merck Purospher STAR RP-18e 125 x 4 mm, 5 μm; 유속: 1.5 ml/분, 구배 H2O+H3PO4(pH=2.6)/아세토니트릴(acetonitrile)). 상기 조사된 후보 중 하나("P450_c866")는 데옥시콜산을 우르소콜산으로 히드록실화할 수 있었다. 사용된 데옥시콜산은 이 과정에서 전환되었다(다음 표 참조). 생성물 우르소콜산의 정체는 GC/MS 분석 및 2D NMR로 확인하였다.
이 실시예에서 산화환원 보조인자(NADH)는 P450/Ptx/PtR 반응에 의해 산화된다.
실시예 6: 아라비노스 탈수소효소(arabinose dehydrogenase)의 보조인자 재활용을 사용한 DA 하이드록실화에 대한 P450 후보의 테스트
반응 혼합물:
65 μ100 mM NADH (최종 0.5 mM)
1 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5 + 20% (v/v) 글리세린
130 μ50 mM 데옥시콜산 용액 pH 8.5 (최종 0.5 mM)
6.5 μ클로람페니콜 용액(chloramphenicol solution) (최종 20 μ
100 μL-아라비노스 탈수소효소(L-arabinose dehydrogenase)
(대장균(E. coli)에서 재조합으로 발현된 벌크홀데리아 비에트나미엔시스(Burkholderia vietnamiensis), recombinantly expressed in 400 U/ml)
98 mg L-아라비노스(L-arabinose) (최종 50 mM)
2.0 ml E. coli 용해물 P450/PtR/Ptx (실시예 4 참조)
9.6 ml dH2O
상기 반응물을 50ml 비-배플 삼각 플라스크에 넣고 알루미늄 호일로 밀봉하였다. 이 필름은 여러 곳에 구멍을 뚫었다. 24℃에서 16시간 동안 부드럽게 진탕하였다. 상기 상층액에 존재하는 물질을 에틸 아세테이트로 추출하고 증발시켰다. 이를 더 적은 부피의 HPLC 용리액(메탄올/아세토니트릴/H2O+H3PO4(pH=3.0); 40:30:33)에 용해시켰다. 그 후, 상기 샘플은 HPLC/RID를 사용하여 분석되었다(예를 들어, Agilent 1200 시리즈; 컬럼: Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 x 150 mm, 5 μ유속: 0.8 ml/분). 조사된 후보 중 하나("P450_c866")는 데옥시콜산을 우르소콜산으로 수산화할 수 있었다. 사용된 데옥시콜산은 공정에서 거의 완전히 전환되었다(>95%). 상기 생성물 우르소콜산의 정체는 GC/MS 분석 및 2D NMR에 의해 확인되었다(데이터는 표시되지 않음).
이 실시예에서 산화환원 보조인자(redox cofactor)(NADH)는 P450/Ptx/PtR 반응에 의해 산화된다. 상기 산화환원 보조인자는 보조인자 재생(이 경우, 예를 들어, 당 탈수소효소 아라비노스 탈수소효소 사용)에 의해 원래 상태로 환원된다(이 경우 아라비노스는 아라비노락톤(arabinolactone)/아라본산(arabonic acid)으로 산화됨). 이것은 아화학량론적 양(substoichiometric amount)의 산화환원 보조인자의 사용을 가능하게 한다.
실시예 7: 실시예: 보조 인자 재활용을 통한 보조 인자 농도 변환(cofactor concentration conversion)에 따른 변환
반응 혼합물:
10 μ10 mM NAD+
250 μ100 mM TEA pH 8.2
25 μ글리세린 (50%)
100 μ50 mM 데옥시콜산 용액 pH 8.0 (최종 10 mM)
100 mM TEA pH 8.0 및 25% 글리세린에 22.5% 현탁액으로 6.75 mg 세포 (wW)
5 μ카탈라아제 (소(bovine), Sigma 4 mg/ml)
1.7 units 자일리톨(xylitol)/소르비톨 탈수소효소(sorbitol dehydrogenase)
25 μ2M 소르비톨(sorbitol) (최종 100 mM)
70.8 μdH2O
상기 반응물을 1.5 ml 나사형 병에 넣고 알루미늄 호일로 뚜껑으로 밀봉하였다. 상기 호일의 여러 곳에 구멍을 뚫었다. 24℃에서 18시간 동안 부드럽게 진탕하였다.
NADH의 회수는 소르비톨 및 NAD+의 존재 하에 각각 소르비톨 또는 자일리톨 탈수소효소에 의해 수행되었다.
200㎕의 반응 배치를 600㎕ 아세토니트릴/5㎕ H3PO4(50%)로 희석하고 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 샘플을 20817 rcf에서 5분 동안 원심분리하고 HPLC/DAD를 사용하여 분석하였다(예를 들어, Agilent 1200 시리즈; 컬럼: Merck Purospher STAR RP-18e 125 x 4 mm 또는 Agilent Zorbax XDB-C8 mm 150 x 4.6 mm, 3.5 μ5 μ유속: 1.5 ml/min, 기울기 H2O+H3PO4 (pH=2.6)/아세토니트릴)..
사용된 데옥시콜산은 상기 언급된 조건 하에서 우르소콜산으로 정량적으로 전환되었다(100% 전환율). 상기 생성물 우르소콜산의 정체는 GC/MS 분석 및 2D NMR로 확인하였다.
이 실시예에서, 보조인자 재활용 시스템인 소르비톨/자일리톨 탈수소효소/소르비톨/NAD+에 의해 얻은 산화환원 보조인자(NADH)가 하이드록실화 반응에 사용된다. 그러나, 보조 인자 재활용을 위한 다른 시스템도 사용할 수 있다(다음 표 참조).
[1] 20% 콜산 용액으로 사용
[2] 담즙산 용액으로 사용 (237 mM 콜산(cholic acid); 45 mM 데옥시콜산(deoxycholic acid))
실시예 8: 정량적 LCA(리토콜산(lithocholic acid)) 전환
반응 화합물:
10 μ10 mM NAD+
250 μ100 mM TEA pH 8.2
10 mM (최종) 리토콜산(lithocholic acid)
100 mM TEA pH 8.0 및 25% 글리세린에서 22.5% 현탁액으로서 9.2mg 세포(wW)
5 μ카탈라아제(catalase) (소(bovine), Sigma 4 mg/ml)
1.7 units 자일리톨(xylitol)/소르비톨(sorbitol) 탈수소효소
25 μ2M 소르비톨 (최종 100 mM)
176 μdH2O
상기 반응물을 1.5 ml 나사형 병에 넣고 알루미늄 호일로 뚜껑으로 밀봉하였다. 상기 호일에 여러 곳에 구멍을 뚫었다. 24℃에서 18시간 동안 부드럽게 진탕하였다.
NADH의 회수는 소르비톨 및 NAD+의 존재 하에 각각 소르비톨 또는 자일리톨 탈수소효소에 의해 수행되었다.
200㎕의 반응 배치를 600㎕ 아세토니트릴/5㎕ H3PO4(50%)로 희석하고 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 샘플을 20817 rcf에서 5분 동안 원심분리하고 HPLC/DAD를 사용하여 분석하였다 (예를 들어, Agilent 1200 시리즈; 컬럼: Merck Purospher STAR RP-18e 125 x 4 mm 또는 Agilent Zorbax XDB-C8 mm 150 x 4.6 mm, 3.5 μ5 μ유속: 1.5 ml/min, 기울기 H2O+H3PO4(pH=2.6)/아세토니트릴).
상기 조건 하에서 전환 후 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid )만 검출되었다.
실시예 9: 유기 용매의 존재 하에 LCA(리토콜산)의 우르소데옥시콜산으로의 전환
먼저, 다양한 유기 용매에 대한 LCA 및 UDCA의 용해도 한계를 결정하였다. 이를 위해, 각각 10mg 또는 100mg의 LCA 또는 UDCA를 15mL 플라스크에 넣었다. 상기 유기 용매를 100μL씩 첨가하고, 상기 혼합물을 와류 진탕기 및 선택적으로 초음파 배스에서 진탕함으로써 처리하였다. 투명한 용액이 존재하는지 여부를 시각적으로 평가하였다.
다음 표에는 분석된 용매에 대해 결정된 용해도 한계가 요약되어 있다:
용매의 존재 하에 LCA에서 UDCA로의 전환은 하기 표에 나타낸 바와 같이 결정되었다:
실시예 10: 비양성자성 용매의 존재 하에 증가된 기질 농도를 갖는 리토콜산의 우르소데옥시콜산으로의 전환
반응 혼합물:
10 μ10 mM NAD+
250 μ200 mM TEA pH 8.4 (10.8% 글리세린 포함)
DMF에서 25 μl 500 mM 리토콜산
100mM TEA pH 9.0에서 30% 현탁액으로 30mg 세포(wW)
5 μ카탈라아제 (소, Sigma 4 mg/ml)
1.7 units 자일리톨/소르비톨 탈수소효소
25 μ2M 소르비톨 (최종 100 mM)
73 μdH2O
상기 반응물을 1.5 ml 나사형 병에 넣고 알루미늄 호일로 뚜껑으로 밀봉하였다. 상기 호일에 여러 곳에 구멍을 뚫었다. 24℃에서 18시간 동안 부드럽게 진탕하였다.
NADH의 회수는 소르비톨 및 NAD+의 존재 하에 각각 소르비톨 또는 자일리톨 탈수소효소에 의해 수행되었다.
상기 반응 배치를 공기 흐름에서 완전히 증발시키고 1.1 ml IPA + 0.5% TFA로 재용해시켰다. 이어서, 상기 샘플을 20817 rcf에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 HPLC/RID로 분석하였다 (예를 들어, Agilent 1200 시리즈; 컬럼: Phenomenex Luna®Silica 100 Å, 250 x 4.6 mm, 5 μ유속: 1.0 ml/min, n-헥산/IPA 4:1 + 0.05% TFA 등용매).
상기 조건 하에서 전환 후 70% 우르소데옥시콜산이 검출되었다.
Claims (18)
- 적어도 하나 이상의 산화환원 파트너 시스템(redox partner system) 및 산화환원 파트너 시스템을 재생하기 위한 시스템의 존재 하에 시토크롬 P450 히드록실라제 또는 이의 기능적 변이체로, 일반 화학식 II를 갖는 7-데옥시스테로이드(7-deoxysteroid)를 전환하는 단계를 포함하는, 일반 화학식 I을 갖는 스테로이드의 제조방법으로서, 시토크롬 P450 히드록실라제는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 특히 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 스테로이드의 제조방법:
<화학식 II>
<화학식 I>
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 H, Cl, F, Br, I, CF3, C1 내지 C6 알킬 라디칼(alkyl radical), OH, C1 내지 C6 알콕시 라디칼(alkoxy radical), CN, NO2, N(R6)2, 에폭시 기(epoxy group), CHO 또는 CO2R6 라디칼(radical)이며,
R6는 C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph, -C(O)CH2Ph,이고,
R1 및 R2는 독립적으로 H, OH, OR7 또는 O이며,
R7은 -C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph, -C(O)CH2Ph이며,
R3는 H, OH, OR8, C1 내지 C10 알킬 라디칼, C1 내지 C10 알케닐 라디칼, -CHO, -C(O)(CH3), -C(O)(CH2OH), -CH(CH3)C(O)CH3, -CH(CH3)((CH2)2CO2R9) 또는 -CH(CH3)((CH2)2CONHR9) 이며,
R8은 -C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph 또는 -C(O)CH2Ph이고,
R9는 -CH3, -CH2COOH, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)2CH3, -(CH2)2SO3H, C(CH3)3, -(CH2)3CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH2(CH3)2, 아릴기(aryl group) 또는 알킬아릴기(alkylaryl group)이고,
R4는 H, OH, 또는 -OR10이며,
R10은 -C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph 또는 -C(O)CH2Ph,이고.
R5는 H, CF3, C1 내지 C6 알킬 라디칼, C1 내지 C6 알케닐 라디칼, OH, O, 또는 C1 내지 C6 알콕시 라디칼이며, 여기서 점선은 임의의 이중 결합을 나타내고, 단 A 고리가 C4-C5 이중 결합을 갖는 경우 B 고리는 이중 결합을 갖지 않고, X1 및 X2가 에폭시 기를 형성하는 경우 C 고리는 이중 결합을 갖지 않는다. - 제1항에 있어서, X1,X2,R4 및 R5는 H이고,
R1 및 R2는 독립적으로 H, OH, OR8 또는 O이며,
R8은 -C(O)H, -C(O)CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)(CH2)2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)(CH2)3CH3, -C(O)CH(CH3)CH2CH3, -C(O)CH2CH2(CH3)2, -C(O)C(CH3)3, -C(O)Ph, -C(O)CH2Ph이고,
R3는 C1 내지 C10 알킬 라디칼, C1 내지 C10 알킬렌 라디칼, -CH(CH3)((CH2)2CO2R9) 또는 -CH(CH3)((CH2)2CONHR9)이며,
R9는 -CH3, -CH2COOH, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -(CH2)2CH3, -(CH2)2SO3H, C(CH3)3, -(CH2)3CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH2(CH3)2, 아릴기 또는 알킬 아릴기인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아릴기는 페닐 라디칼, F, Cl, Br, NO2 또는 CH3로 치환된 페닐 라디칼 및 헤테로아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알킬아릴기는 벤질기(benzyl group), 할로겐화된 벤질 기(halogenated benzyl group)로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서 할로겐은 F, Cl 또한 Br이며, 벤질기는 NO2로 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 OH이고, R2는 O 또는 OH이고, R3는 CH(CH3)((CH2)2CO2R5)이고, R4는 H이며, R5는 H인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테로이드는 7β,12α-디히드록시-3-케토-5β-콜란-24-산(7β,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholane-24-acid), 3α,7β-디히드록시-12-케토-5β-콜란-24-산(3α,7β-dihydroxy-12-keto-5β-cholane-24-acid), 7β-히드록시-3,12-디케토-5β-콜란-24-산(7β-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholane-24-acid), 3α,7β-디히드록시-5β-콜란-24-산(3α,7β-dihydroxy-5β-cholane-24-acid) 및 3β,7β-디히드록시-5β-콜란-24-산(3β,7β-dihydroxy-5β-cholane-24-acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 일반 화학식 I를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 7-데옥시스테로이드는 3α,12α-디히드록시-5β-콜란-24-산(3α,12α-dihydroxy-5β-cholane-24-acid), 3α,12β-디히드록시-5β-콜란-24-산(3α,12β-dihydroxy-5β-cholane-24-acid), 3β,12α-디히드록시-5β-콜란-24-산(3β,12α-dihydroxy-5β-cholane-24-acid), 3ß,12ß-디히드록시-5ß-콜란-24산(3ß,12ß-dihydroxy-5ß-cholane-24-acid), 3β-히드록시-12-케토-5β-콜란-24-산(3ß-hydroxy-12-keto-5ß-cholane-24-acid), 3-케토, 12ß-하이드록시-5ß-콜란-24-산(3-keto,12ß-hydroxy-5ß-cholane-24-acid), 3-케토, 12α-히드록시-5β-콜란-24-산(3-keto,12α-hydroxy-5β-cholane-24-acid), 3α-히드록시-5β-콜란-24-산(3α-hydroxy-5β-cholane-24-acid), 3-케토-5β-콜란-24-산(3-keto-5β-cholane-24-acid), 3β-히드록시-5β-콜란-24-산(3β-hydroxy-5β-cholane-24-acid) 및 각 산의 에스테르(esters)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시토크롬 P450 효소가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 90%, 특히 100% 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 산화환원 파트너 시스템이
(i) 페레독신(ferredoxin), 페레독신 환원효소 및 NAD(P)H;
(ii) 시토크롬 P450 환원효소 및 NAD(P)H; 또는
(iii) NAD(P)H
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제9항에 있어서, 상기 페레독신은 아드레노독신(adrenodoxins), 푸티다레독신(putidaredoxins) 및 플라보독신(flavodoxins)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 페레독신 환원효소는 플라바독신 환원효소 및 푸티다레독신 환원효소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화환원 파트너 시스템의 재생을 위한 시스템이 적어도 하나 이상의 산화환원효소(oxidoreductase) 및 적어도 하나 이상의 산화환원효소의 적어도 하나 이상의 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 적어도 하나 이상의 산화환원효소는 산화환원효소 (oxidoreductase) (EC: 1.1.1), 알데히드 탈수소효소 (aldehyde dehydrogenase) (EC: 1.2.1), 아미노산 탈수소효소 (amino acid dehydrogenase) (EC: 1.4.1), 플라빈 환원효소 (flavin reductase) (EC: 1.5.1), 트랜스하이드로게나제 (transhydrogenase) (EC: 1.6.1), 니트라이트 환원효소 (nitrite reductase) (EC: 1.7.1) 및 포스포네이트 탈수소효소 (phosphonate dehydrogenase) (EC: 1.20.1)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 알코올 탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 히드록시스테로이드 탈수소효소(hydroxysteroid dehydrogenase), 포스파이트 탈수소효소(phosphite dehydrogenase) 및 당 탈수소효소(sugar dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 산화환원효소는 글루코오스 탈수소효소(glucose dehydrogenase), 글루고오스-6-포스페이트 탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase), 아라비노스 탈수소효소(arabinose dehydrogenase), 자일로스 탈수소효소(xylose dehydrogenase), 소르비톨 탈수소효소(sorbitol dehydrogenase), 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase), 12α-히드록시스테로이드 탈수소효소(12α-hydroxysteroid dehydrogenase), 7α-히드록시스테로이드 탈수소효소(7α-hydroxysteroid dehydrogenase), 20α-히드록시스테로이드 탈수소효소(20α-hydroxysteroid dehydrogenase), 17β-히드록시스테로이드 탈수소효소(17β-hydroxysteroid dehydrogenase), 17α-히드록시스테로이드 탈수소효소(17α-hydroxysteroid dehydrogenase), 3α-하이드록시스테로이드 탈수소효소(3α-hydroxysteroid dehydrogenase), 3β-하이드록시-델타5 탈수소효소(3β-hydroxy-delta5 dehydrogenase), 11β-히드록시스테로이드 탈수소효소(11β-hydroxysteroid dehydrogenase) 및 포르메이트 탈수소효소(formate dehydrogenase)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나 이상의 산화환원효소의 기질은 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 소르비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol), 콜란-24-산(cholane-24-acid), 3α,12α-디히드록시콜린-24-산-2,3-부탄디올(3α,12α-dihydroxycholane-24-acid-2,3-butanediol), 아세토인(acetoin), 2-프로판올(2-propanol), 글루타메이트(glutamates), 에탄올(ethanol), 포스포네이트(phosphonates), 포스파이트(phosphites), 니트라이트(nitrites), 4-메틸-2-펜탄올(4-methyl-2-pentanol), 2-부탄올(2-butanol), 2-옥탄올(2-octanol), 사이클로헥산올(cyclohexanol), 에탄디올(ethanediol), 1,2-프로판디올(1,2-propanediol), 1-프로판올(1-propanol), 1-부탄올(1-butanol), 및 포르메이트(formate), 3-히드록시부타노에이트(3-hydroxybutanoate)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나 이상의 유기 용매의 존재 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 유기 용매가 양성자성 또는 비양성자성 용매이고, 바람직하게는 비양성자성 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 유기 용매는 디메틸포름아미드(dimethylformamide) (DMF), 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) (DMSO) 및 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide) (DMA)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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