KR20220152303A - Tyk2 활성을 저해하기 위한 헤테로시클릭 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화합물 1-8, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 프로드러그에 관한 것이다. 화합물 1-8 은 TYK2 의 JH2 에 대한 선택적 결합제이며, 이들은 TYK2 의 생리적 기능에 대해 상당한 저해 효과를 나타내며, 이들은 우수한 생체내 약동학적 특성을 가진다. 화합물 1-5 및 7 은 약동학적 (PK) 특성을 개선하기 위해서 메틸 상에 여러 중수소 치환을 가진다.

Description

TYK2 활성을 저해하기 위한 헤테로시클릭 화합물

본 발명은 신호 전달 저해를 유발하기 위한 TYK2 의 조절에 유용한 헤테로시클릭 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 동물에서 개선된 약동학적 특성을 제공한다.

티로신 키나아제 2 (TYK2) 는 야누스 키나아제 (JAK) 패밀리에 속하는 비-수용체 티로신 단백질 키나아제이며, IL-12, IL-23 및 유형 I 인터페론에 대한 수용체의 신호 전달 캐스케이드 다운스트림을 조절하는데 중요한 것으로 나타났다.

탠덤 키나아제 도메인은 JAK 의 특징이다. JH1 은 표준 단백질 티로신 키나아제 도메인인 반면, JH2 는 슈도키나아제 도메인으로서 분류된다. JAK 패밀리의 구조는 도 1 에 도시되어 있다.

최근의 생화학적 및 구조적 데이터는, TYK2 의 슈도키나아제 도메인이 낮은 수준의 촉매 활성을 가지며, 키나아제 도메인의 활성을 부정적으로 조절한다는 것을 시사한다.

사이토카인 수용체가 사이토카인에 결합할 때, 세포내 영역에 결합하는 TYK2 및 이의 다른 패밀리 구성원인 JAK1 및/또는 JAK2 의 포스포릴화가 촉발되어, 이량체화에 의한 신호 전달 및 전사 활성화 인자 (STAT) 의 활성화가 일어난다. 이어서, 이량체화된 STAT 는 핵 내부로 이동하고, 관련된 유전자의 발현 및 전사를 조절하여 세포막에서 핵으로의 신호의 전달을 완료한다. 그러므로, JAK 는 JAK-STAT 경로를 통해 사이토카인-매개된 신호를 전달하고, 많은 세포 기능, 세포 증식의 사이토카인-의존적 조절, 분화, 세포사멸사, 면역 반응 등에서 중요한 역할을 한다. TYK2-결핍 마우스는 대장염, 건선 및 다발성 경화증의 실험 모델에 내성이 있어, 자가면역 및 관련된 장애에서 TYK2-매개된 신호전달의 중요성을 입증한다.

인간에서, TYK2 의 비활성 변이체를 발현하는 개체는 다발성 경화증 및 가능하게는 다른 자가면역 장애로부터 보호된다. 게놈 전반에 걸친 연관성 연구는 TYK2 의 다른 변이체가 크론병, 건선, 전신성 홍반성 루푸스 및 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환과 관련이 있다는 것을 나타냈으며, 이는 자가면역에서 TYK2 의 중요성을 추가로 입증한다.

TYK2 녹아웃 마우스는 정상적인 적혈구 수를 가지며, 이들은 생존할 수 있다. TYK2 발현의 결핍은 다양한 전-염증성 사이토카인의 약화된 신호전달 및 T 헬퍼 세포 분화의 심각한 불균형에서 나타난다. 유전-관련 연구로부터의 증거는 TYK2 를 공유된 감수성 자가면역 질환 유전자로서 지지한다. TYK2-조절된 경로는 질환 치료를 위한 항체 요법에 의해 확인되었다. 예를 들어, 건선 치료를 위한 IL-12/IL-23 을 표적으로 하는 우스테키누맙, 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 를 치료하기 위한 I 형 인터페론 수용체 (SLE) 를 표적으로 하는 아니프롤루맙은 임상 시험에서 상당한 효능을 입증하였다.

TYK2 는 급성 림프구성 백혈병 (T-ALL) 세포의 비정상적인 생존과 TYK2 의 활성화 사이의 상관 관계에 의해 일부 암과 관련이 있다. T-ALL 의 종양 유전자로서, T-ALL 세포주의 88 % 및 환자 유래의 T-ALL 세포의 63 % 가 유전자 녹아웃 실험을 통해 TYK2 에 의존하였다 (Sanda et. al, Cancer Disc. 2013, 3, 564-77). TYK2 선택적 저해제 NDI-031301 은 인간 T-ALL 세포주의 성장을 저해하기 위해서 세포사멸사를 유도하였으며, KOPT-K1 T-ALL 종양 세포를 갖는 마우스 모델에서 양호한 안전성 및 효능을 나타냈으며 (Akahane et. al, British J. Haematol. 2017, 177, 271-82), 이는 T-ALL 을 치료하기 위한 TYK2 의 선택적 저해제의 전망을 입증한다. 그러므로, TYK2 는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암을 치료하기 위한 뜨거운 표적 중 하나이다 (Alicea-Velazquez et. al, Curr. Drug Targets 2011, 12, 546-55).

TYK2 및 JAK 패밀리의 다른 구성원은 구조적으로 키나아제 도메인 JH1 (JAK 상동성 1) 및 인접한 슈도키나아제 도메인 JH2 (JAK 상동성 2) 를 가진다. JH2 는 ATP 에 결합할 수 있지만, 촉매 기능을 갖지 않으며, 대신 JH1 의 키나아제 활성을 부정적으로 조절한다 (Staerk et. al, J. Biol. Chem. 2015, 280, 41893-99). JAK 패밀리 (JAK1, JAK2, JAK3, 및 TYK2) 중에서 키나아제 도메인 JH1 의 높은 서열 유사성으로 인해, JAK1, JAK2 또는 JAK3 의 JH1 을 저해하지 않고서, TYK2 의 JH1 에 대한 선택적 저해제를 개발하는 것은 어렵다. 토파시티닙, 룩솔리티닙, 바리시티닙, 우파다시티닙 등을 포함하는, JAK 의 키나아제 도메인에 결합하는 대부분의 JAK 저해제는 JAK 패밀리 구성원 중에서 매우 선택적이지 않으며, 임상적으로 빈혈과 같은 투여량-의존적 부작용을 나타낸다. 고도로 선택적인 TYK2 저해제의 개발은 제약 회사들 사이에서 여전히 매력적이다. TYK2 의 JH1 및 JH2 에서의 ATP 결합 포켓 사이의 구조적 차이를 기반으로, Bristol-Myers Squibb Company 는 JAK 의 키나아제 도메인 (JH1) 에 결합하지 않고서, TYK2 에 의해 매개된 생리적 기능 만을 저해하는 고도로 선택적인 JH2 결합제 BMS-986165 를 개발하였다. BMS-986165 는 현재 자가면역 질환에 대한 3 상 임상 시험 중에 있다 (Wrobleski et. al, J. Med. Chem. 2019, 62, 8973-95).

BMS-986165 의 구조는 다음과 같다 (WO 2014/074661):

JAK 패밀리, 특히 JAK2 의 키나아제 도메인에 대한 최소한의 결합으로, TYK2 의 슈도키나아제 도메인 (JH2) 에 선택적으로 결합하는 신규 화합물을 개발할 필요가 남아 있다.

도 1 은 JAK 패밀리 (JAK1, JAK2, JAK3, 및 TYK2) 의 통상적인 2차 구조를 보여준다.
도 2 는 항-CD40 항체 유도된 IBD 대장염 동물 모델에서의 생체내 효능을 보여준다. 3 가지 상이한 투여량에서 비히클, 참조 화합물 및 화합물 3 으로 처리된 동물의 체중의 상대적인 % 변화를 처리 후의 일 수에 대해 플롯한다.

본 발명자들은 TYK2 의 촉매 활성 부위를 표적으로 하지 않지만, TYK2 슈도키나아제 도메인 (JH2) 을 표적으로 하는 선택적 TYK2 저해제를 발견하였다. 본 발명은 화합물 1-8, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 프로드러그에 관한 것이다. 화합물 1-8 은 TYK2 의 JH2 에 대한 선택적 결합제이다. 슈도키나아제 도메인 (JH2) 에 결합함으로써, 화합물 1-8 은 TYK2 의 키나아제 촉매 활성을 저해하고, 단백질 포스포릴화를 저해하며, TYK2 의 생리적 기능에 대한 상당한 저해 효과를 나타낸다. 화합물 1-8 은 TYK2 의 키나아제 도메인 (JH1) 에 약하게 결합하거나 또는 결합하지 않는다. 화합물 1-8 은 JH2 에 결합함으로써 TYK2 의 키나아제 활성을 선택적으로 저해하고, 다른 JAK 패밀리 구성원의 키나아제 활성에 대해 낮은 저해 활성을 가진다. 다른 JAK 패밀리 구성원 (JAK1, JAK2 및 JAK3) 에 비해 TYK2 를 저해하기 위한 화합물 1-8 의 선택성은 빈혈과 같은 부작용을 최소화시킨다. 화합물 1-8 은 동물에서 우수한 생체내 약동학적 특성을 갖는 것으로 나타났다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "약학적으로 허용 가능한 염" 은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고, 원하지 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염이다. 약학적으로 허용 가능한 염 형태는 다양한 결정질 다형체, 뿐만 아니라, 상이한 염의 무정형 형태를 포함한다. 본 발명의 염기성 헤테로시클릭 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 무기 산 또는 유기 산으로 형성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "프로드러그" 는 대상에게 투여시, 대사적 또는 화학적 과정에 의해 화학적 전환을 거쳐 화합물 1-8 의 화합물 및/또는 이의 염을 생성하는 화합물을 지칭한다. 화합물 1-8 의 생물 활성제를 제공하기 위해 생체내에서 전환되는 임의의 화합물은 본 발명의 범위 내의 프로드러그이다. 다양한 형태의 프로드러그가 당업계에 충분히 공지되어 있다.

화합물 1 은 트리아졸 고리 상에 트리-중수소화 메틸 및 트리-중수소화 메틸 아미드를 가진다.

화합물 2 는 트리아졸 고리 상에 트리-중수소화 메틸을 가진다.

화합물 3 은 벤젠 고리 상에 트리-중수소화 메톡시를 가진다.

화합물 4 는 벤젠 고리 상에 트리-중수소화 메톡시 및 트리-중수소화 메틸 아미드를 가진다.

화합물 5 는 (S)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도) 및 트리-중수소화 메틸 아미드를 가진다.

화합물 6 은 임의의 중수소 치환없이 (S)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)를 가진다.

화합물 7 은 (R)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도) 및 트리-중수소화 메틸 아미드를 가진다.

화합물 8 은 임의의 중수소 치환없이 (R)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)를 가진다.

화합물 1-5 및 7 은 약동학적 (PK) 특성을 개선하기 위해서 메틸 상에 여러 중수소 치환을 가진다. 화합물 5-8 은 시클로프로판 상에 디플루오로를 가진다. 본 발명의 화합물은 JAK 의 키나아제 도메인에 대해 낮은 결합 활성을 가지며, γ-인터페론 및 IL-23 의 분비를 저해하는 것과 같은 TYK2 의 세포 기능에 대해 높은 저해 활성을 가진다. 본 발명의 화합물은 경구 투여시 양호한 생체이용률을 제공한다. 본 발명의 화합물은 사용하기에 안전하고, 화합물 2, 3 및 5 로 처리 후에 유의한 체중 감소를 나타내지 않은 마우스에서의 항-CD40 대장염 (IBD) 모델에서 입증된 바와 같이, 염증성 장 질환 (IBD) 을 치료하는데 효과적이다.

약학 조성물

본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및 화합물 1-8 의 활성 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물에서의 활성 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 일반적으로 국소 제제의 경우 약 0.01-20 % (w/w), 또는 0.05-20 % (w/w), 또는 0.1-20 % (w/w), 또는 0.2-15 % (w/w), 또는 0.5-10 % (w/w), 또는 1-5 % (w/w); 주사용 제제의 경우 약 0.1-5 % (w/w); 패치 제제의 경우 0.1-5 % (w/w); 정제 제제의 경우 약 1-90 % (w/w); 및 캡슐 제제의 경우 1-100 % (w/w) 의 양이다.

하나의 구현예에 있어서, 활성 화합물은 활성 화합물을 안정화시킬 수 있으며, 이를 국소 적용에 의해 환부에 전달할 수 있는 크림, 겔, 로션 또는 다른 유형의 현탁액을 포함하는 임의의 허용 가능한 담체에 혼입된다. 또다른 구현예에 있어서, 약학 조성물은 정제, 캡슐, 과립, 미세 과립, 분말, 시럽, 좌제, 주사용 용액, 패치 등과 같은 투여 형태일 수 있다. 상기 약학 조성물은 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

비활성 성분인 약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적인 기준을 사용하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는, 비제한적으로, 비-수계 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 미셀 용액, 겔 및 연고를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 또한 비제한적으로, 염수 및 수성 전해질 용액; 이온성 및 비이온성 삼투제, 예컨대 염화 나트륨, 염화 칼륨, 글리세롤 및 덱스트로오스; pH 조절제 및 완충제, 예컨대 히드록사이드, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 보레이트의 염; 및 트롤아민; 산화방지제, 예컨대 비술파이트, 술파이트, 메타비술파이트, 티오술파이트, 아스코르브산, 아세틸 시스테인, 시스테인, 글루타티온, 부틸화된 히드록시아니솔, 부틸화된 히드록시톨루엔, 토코페롤 및 아스코르빌 팔미테이트의 염, 산 및/또는 염기; 계면활성제, 예컨대 레시틴, 비제한적으로 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨을 포함하는 인지질; 폴록사머 및 폴록사민, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 20, 폴리에테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜; 폴리비닐, 예컨대 폴리비닐 알코올 및 포비돈; 셀룰로오스 유도체, 예컨대 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 및 이들의 염; 석유 유도체, 예컨대 광유 및 백색 바셀린; 지방, 예컨대 라놀린, 땅콩유, 팜유, 대두유; 모노-, 디- 및 트리글리세리드; 아크릴산의 중합체, 예컨대 카르복시폴리메틸렌 글리콜, 및 소수성으로 개질된 가교된 아크릴레이트 공중합체; 다당류, 예컨대 덱스트란 및 글리코사미노글리칸, 예컨대 나트륨 히알루로네이트를 포함하는 성분을 함유할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 충분히 공지된 방부제를 사용하여 박테리아 오염에 대해 보존될 수 있으며, 이들은, 비제한적으로, 벤잘코늄 클로라이드, 에틸렌디아민테트라아세트산 및 이의 염, 벤제토늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 메틸파라벤, 티메로살 및 페닐에틸 알코올을 포함하거나, 또는 단일 또는 다중 사용을 위한 비-보존된 제제로서 제제화될 수 있다.

예를 들어, 활성 화합물의 정제 제제 또는 캡슐 제제는 생체활성이 없으며, 활성 화합물과의 반응이 없는 다른 부형제를 함유할 수 있다. 정제 또는 캡슐의 부형제는 충전제, 결합제, 윤활제 및 활택제, 붕괴제, 습윤제 및 방출 속도 조절제를 포함할 수 있다. 결합제는 제제의 입자의 접착을 촉진하며, 정제 제제에 중요하다. 정제 또는 캡슐의 부형제의 예는, 비제한적으로, 카르복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카라야 검, 전분, 트라가칸트 검, 젤라틴, 마그네슘 스테아레이트, 이산화 티탄, 폴리(아크릴산) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 예를 들어, 정제 제제는 콜로이달 이산화 규소, 크로스포비돈, 히프로멜로오스, 마그네슘 스테아레이트, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 전분 글리콜레이트 및/또는 이산화 티탄과 같은 비활성 성분을 함유할 수 있다. 캡슐 제제는 젤라틴, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 이산화 티탄과 같은 비활성 성분을 함유할 수 있다.

예를 들어, 활성 화합물의 패치 제제는 1,3-부틸렌 글리콜, 디히드록시알루미늄 아미노아세테이트, 디나트륨 에데테이트, D-소르비톨, 젤라틴, 카올린, 메틸파라벤, 폴리소르베이트 80, 포비돈, 프로필렌 글리콜, 프로필파라벤, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 나트륨 폴리아크릴레이트, 타트타르산, 이산화 티탄 및 정제수와 같은 일부 비활성 성분을 포함할 수 있다. 패치 제제는 또한 락테이트 에스테르 (예를 들어, 라우릴 락테이트) 또는 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르와 같은 피부 침투성 강화제를 함유할 수 있다.

활성 화합물을 포함하는 국소 제제는 겔, 크림, 로션, 액체, 에멀젼, 연고, 스프레이, 용액 및 현탁액의 형태일 수 있다. 국소 제제에서의 비활성 성분은, 예를 들어, 비제한적으로, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (연화제/침투 강화제), DMSO (용해성 강화제), 실리콘 엘라스토머 (레올로지/텍스쳐 조절제), 카프릴산/카프르산 트리글리세리드 (연화제), 옥티살레이트 (연화제/UV 충전제), 실리콘 유체 (연화제/희석제), 스쿠알렌 (연화제), 해바라기유 (연화제) 및 이산화 실리콘 (증점제) 을 포함한다.

사용 방법

본 발명자들은 본 발명의 화합물이 TYK2 의 슈도키나아제 도메인 (JH2) 에 특이적으로 결합하고, NK92 세포에서의 TYK2 의 생리적 기능을 유의하게 저해한다는 것을 입증하였다. 상기 화합물은 또한 래트에서 우수한 약동학적 특성을 나타낸다.

본 발명은, 비제한적으로, 자가면역 질환, 염증성 질환 (장관 염증 및 장 염증 포함), 암, 피부 질환, 당뇨병, 안 질환, 신경변성 질환, 알레르기 반응, 천식, 다른 폐쇄성 기도 질환 및 이식 거부 등을 포함하는 TYK2-매개된 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 염증성 장 질환, 건선 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 를 치료하는데 특히 유용하다. 상기 방법은 본 발명의 화합물 또는 이의 프로드러그, 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "유효량" 은 병리학적 상태를 개선하거나 또는 질환의 증상을 감소시킴으로써 질환을 치료하는데 효과적인 양이다.

본 발명의 약학 조성물은 국소 투여 및 전신 투여에 의해 적용될 수 있다. 국소 투여는 국부 투여를 포함한다. 전신 투여는 경구 (협측 또는 설하 포함), 비경구 (예컨대, 정맥내, 근육내, 피하 또는 직장), 및 다른 전신 투여 경로를 포함한다. 전신 투여에서, 활성 화합물은 먼저 혈장에 도달한 후, 표적 조직으로 분포된다. 국소 투여 및 경구 투여는 본 발명의 바람직한 투여 경로이다.

조성물의 투여량은 부상의 정도 및 각 환자의 개별 반응에 따라 달라질 수 있다. 전신 투여의 경우, 전달되는 활성 화합물의 혈장 농도는 다양할 수 있지만, 일반적으로 1×10^-10 - 1×10^-4 몰/리터, 및 바람직하게는 1×10^-8 - 1×10^-5 몰/리터이다.

하나의 구현예에 있어서, 조성물은 환부에 국소적으로 적용하고, 문지른다. 조성물은 의학적 문제 및 만성 또는 급성인 질환 병리에 따라, 적어도 1 일 1 또는 2 회, 또는 1 일 3 내지 4 회 국소적으로 적용된다. 일반적으로, 국소 조성물은 약 0.01-20 % (w/w), 또는 0.05-20 % (w/w), 또는 0.1-20 % (w/w), 또는 0.2-15 % (w/w), 0.5-10 % (w/w), 또는 1-5 % (w/w) 의 활성 화합물을 포함한다. 활성 화합물은 피부를 통과하여 불편한 부위로 전달된다.

하나의 구현예에 있어서, 약학 조성물은 대상에게 경구 투여된다. 경구 투여를 위한 투여량은 일반적으로 0.1 mg/kg/일 이상 1000 mg/kg/일 미만이다. 예를 들어, 경구 투여를 위한 투여량은 1 일 0.5 mg 내지 1 g, 바람직하게는 1 mg 내지 700 mg, 또는 5 mg 내지 300 mg 의 화합물이다.

당업자는 매우 다양한 전달 메커니즘이 또한 본 발명에 적합하다는 것을 인식할 것이다.

본 발명은 인간, 말 및 개와 같은 포유동물 대상을 치료하는데 유용하다. 본 발명은 인간을 치료하는데 특히 유용하다.

하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1-8 은 모 화합물의 합성을 예시한다. 반응의 각 단계에서의 생성물은, 비제한적으로, 추출, 여과, 증류, 결정화 및 크로마토그래피 분리를 포함하는 당업계에 공지된 분리 기술에 의해 수득된다. 합성에 필요한 출발 물질 및 화학 시약은 통상적으로 문헌 (SciFinder 에서 검색 가능) 에 따라서 합성하거나 구입할 수 있다.

화합물의 구조는 핵 자기 공명 (NMR) 또는 질량 분석 (MS) 에 의해 결정된다. NMR 은 Bruker ASCEND-400 NMR 분광계를 사용하여 측정하였다. 용매는 중수소화된 디메틸술폭시드 (DMSO-d₆), 중수소화된 클로로포름 (CDCl₃) 또는 중수소화된 메탄올 (CD₃OD) 이었다. 내부 표준은 테트라메틸실란 (TMS) 이었다. 화학적 이동은 10^-6 (ppm) 의 단위로 제공된다.

MS 는 Agilent SQD (ESI) 질량 분광계 (제조사: Agilent, 모델: 6120) 를 사용하여 측정하였다.

HPLC 는 Agilent 1260 DAD 고압 액체 크로마토그래피 (Poroshell120 EC-C18, 50 × 3.0 mm, 2.7 ㎛ 컬럼) 또는 Waters Arc 고압 액체 크로마토그래피 (Sunfire C18, 150 × 4.6 mm, 5 ㎛ 컬럼) 를 사용하여 측정하였다.

박층 크로마토그래피 (TLC) 는 Qingdao Ocean GF254 실리카 겔 플레이트를 사용하여 실행하였다. 반응 모니터링 및 생산 분리/정제를 위한 TLC 의 사양은 각각 0.15 ∼ 0.2 mm 및 0.4 ∼ 0.5 mm 이다.

컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 Qingdao Ocean silica gel 200-(300 메시) 를 담체로서 사용하여 실행하였다.

본 발명에서 사용되는 공지의 출발 물질은 당업계에 공지된 방법에 따라 합성될 수 있거나, 또는 ABCR GmbH & Co. KG, Acros Organics, Sigma-Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc., Beijing Ouhe chemicals, 및 다른 회사로부터 구입할 수 있다.

하기의 실시예에서, 달리 명시하지 않는 한, 반응은 모두 아르곤 분위기 또는 질소 분위기 하에서 수행하였다.

수소화 반응은 통상적으로 배기되고, 수소가 충전되며, 3 회 반복적으로 작동되는 반응기에서 실행하였다.

마이크로파 반응은 CEM Discover-SP 마이크로파 반응기를 사용하여 실행하였다.

하기의 실시예에서, 달리 명시하지 않는 한, 반응 온도는 20 ℃ 내지 30 ℃ 의 실온이었다.

반응의 진행은 Agilent LCMS 기기 (1260/6120) 에 의해 모니터링하였다. 이것은 또한 TLC 에 의해 모니터링할 수 있다. TLC 에 대한 용매 시스템은 A: 디클로로메탄 및 메탄올 시스템; B: 석유 에테르 및 에틸 아세테이트 시스템; C: 실시예에서 나타낸 시스템이었다. 용매의 부피비는 화합물의 극성에 따라서 조절하였다.

화합물 정제 과정에서 사용되는 컬럼 크로마토그래피 및 TLC 에 대한 용리액 시스템은 A: 디클로로메탄 및 메탄올 시스템; B: 석유 에테르 및 에틸 아세테이트 시스템; C: 실시예에서 나타낸 시스템을 포함하였다. 용매의 부피비는 화합물의 극성에 따라서 조절하였으며, 조절에는 소량의 트리에틸아민 및 산성 및 염기성 시약이 첨가될 수 있다.

화합물의 정제는 또한 Waters 의 질량 분석-지향의 자동화 제조 시스템 (SQD2 의 질량 검출기를 구비한 prep-HPLC) 을 사용하여 수행될 수 있다. 화합물의 극성에 따라, 적절한 아세토니트릴/물 (0.1 % 트리플루오로아세트산 또는 포름산 함유) 또는 아세토니트릴/물 (0.05 % 수산화 암모늄 함유) 용리 프로파일을 사용하여 20 mL/min 의 유속으로 역상 고압 컬럼 (XBridge-C18, 19 × 150 mm, 5 ㎛) 을 세정하였다.

실시예 1. 6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-(메틸-d ₃ )-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-(메틸-d ₃ )피리다진-3-카르복스아미드 (1)

단계 1

메틸 2-메톡시-3-니트로벤조에이트 (1b)

메틸 2-플루오로-3-니트로벤조에이트 1a (10 g, 50 mmol) 의 메탄올 (50 mL) 용액에, 실온에서 나트륨 메톡시드 (12.6 g, 70 mmol) 를 첨가하였다. 실온에서 4 시간 동안 교반한 후, 용액을 물 (200 mL) 로 희석시키고, 이어서 에틸 아세테이트 (3 × 60 mL) 로 추출하였다. 유기 상을 조합하고, 포화 염수 (2 × 100 mL) 로 세정하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 여과액을 감압하에서 농축 건조시켜, 표적 화합물 1b (10 g, 고체) 를 98 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 212 [M+1]

단계 2

2-메톡시-3-니트로벤즈아미드 (1c)

메틸 2-메톡시-3-니트로벤조에이트 1b (10 g, 47 mmol) 의 메탄올 (40 mL) 용액에, 실온에서 수산화 암모늄 (20 mL) 을 첨가하였다. 실온에서 48 시간 동안 교반한 후, 용매를 감압하에서 제거하여, 표적 화합물 1c (미정제, 10 g, 고체) 를 수득하였다. 미정제 생성물을 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.

MS m/z (ESI): 197 [M+1]

단계 3

3-(2-메톡시-3-니트로페닐)-1H-1,2,4-트리아졸 (1d)

2-메톡시-3-니트로벤즈아미드 1c (10 g, 51 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈 (50 mL) 용액을 95 ℃ 로 가열하고, 2 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 용매를 감압하에서 제거하고, 잔류물을 에탄올 (30 mL) 에 용해시켜 용액 A 를 수득하였다. 히드라진 수화물 (25 mL) 을 0 ℃ 에서 아세트산 (35 mL) 과 에탄올 (150 mL) 의 혼합물에 서서히 첨가한 후, 용액 A 를 첨가하였다. 실온으로 서서히 가온시키고, 12 시간 동안 교반한 후, 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 물 (400 mL) 에 분산시키고, 여과하였다. 수득된 고체를 물로 세정하고, 건조시켜, 표적 화합물 1d (6 g, 고체) 를 55 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 221 [M+1]

단계 4

3-(2-메톡시-3-니트로페닐)-1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸 (1e)

3-(2-메톡시-3-니트로페닐)-1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸 1d (1.2 g, 5.3 mmol), 탄산 칼륨 (2.2 g, 16 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 의 혼합물에, 중수소화된 요오도메탄 (1 g, 6.9 mmol) 을 첨가하였다. 실온에서 12 시간 동안 교반한 후, 생성된 용액을 역상 prep-HPLC 에 의해 정제하여, 표적 화합물 1e (530 mg, 고체) 를 42 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 238 [M+1]

단계 5

2-메톡시-3-(1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)아닐린 (1f)

3-(2-메톡시-3-니트로페닐)-1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸 1e (530 mg, 1.61 mmol) 의 메탄올 (10 mL) 용액에, 10 % 팔라듐/탄소 (50 mg) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 분위기 하에서 12 시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과액을 감압하에서 농축 건조시켜, 표적 생성물 1f (430 mg, 고체) 를 수득하였다. 생성물을 추가의 정제없이 다음 반응에 사용하였다.

MS m/z (ESI): 208 [M+1]

단계 6

리튬 4,6-디클로로피리다진-3-카르복실레이트 (1h)

메틸 4,6-디클로로피리다진-3-카르복실레이트 1g (5 g, 24.15 mmol), 디이소프로필에틸아민 (9.4 g, 72.5 mmol), 아세토니트릴 (13.5 mL) 및 물 (3.25 mL) 의 혼합물에, 브롬화 리튬 (6.3 g, 72.5 mmol) 을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반하고, 여과하였다. 생성된 고체를 아세토니트릴 (8 mL) 로 세정하고, 진공하에서 건조시켜, 표적 화합물 1h (4.53 g, 고체) 를 90 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 193 [M+1]

단계 7

아연 6-클로로-4-((2-메톡시-3-(1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 (1i)

리튬 4,6-디클로로피리다진-3-카르복실레이트 1h (380 mg, 1.9 mmol), 2-메톡시-3-(1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)아닐린 1f (471 mg, 2.27 mmol), 이소프로판올 (0.5 mL) 및 물 (5 mL) 의 혼합물에, 실온에서 아연 아세테이트 (350 mg, 1.9 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 65 ℃ 로 가열하고, 12 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 물 (30 mL) 로 희석시키고, 30 분 동안 교반하고, 여과하였다. 고체를 물 (2 × 30 mL) 및 테트라히드로푸란 (2 × 30 mL) 으로 세정하고, 진공하에서 건조시켜, 표적 화합물 1i (490 mg, 고체) 를 71 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 364 [M+1]

단계 8

메틸 6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 (1j)

아연 6-클로로-4-((2-메톡시-3-(1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 1i (490 mg, 1.15 mmol), 시클로프로판카르복스아미드 (300 mg, 3.45 mmol), (2R)-1-[(1R)-1-[비스(1,1-디메틸에틸)포스피노]에틸]-2-(디시클로헥실포스피노)페로센 (63 mg, 0.115 mmol), 팔라듐 아세테이트 (25 mg, 0.0575 mmol), 톨루엔 (9 mL) 및 아세토니트릴 (5 mL) 의 혼합물에, 탄산 칼륨 (320 mg, 7.8 mmol) 및 1,8-디아자비시클로운데크-7-엔 (180 mg, 1.5 mmol) 을 순차적으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소하에 80 ℃ 에서 72 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 용매를 감압하에서 제거하고, 잔류물을 역상 prep-HPLC 에 의해 정제하여, 표적 화합물 1j (560 mg, 고체) 를 99 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 413 [M+1]

단계 9

6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-(메틸-d₃)피리다진-3-카르복스아미드 (1)

메틸 6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-(메틸-d₃)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 1j (280 mg, 0.68 mmol), 중수소화된 메틸아민 하이드로클로라이드 (60 mg, 0.81 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (181 mg, 0.95 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (53 mg, 0.34 mmol), 아세토니트릴 (3 mL), N-메틸피롤리돈 및 N-메틸이미다졸 (41 mg, 0.5 mmol) 의 혼합물을 65 ℃ 로 가열하고, 1 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 용매를 감압하에서 제거하고, 잔류물을 역상 prep-HPLC 에 의해 정제하여, 표적 화합물 1 (44 mg, 고체) 을 15 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 429 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.32 (s, 1H), 10.97 (s, 1H), 9.13 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.65 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.54 - 7.46 (m, 1H), 7.32 - 7.22 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.12 - 2.03 (m, 1H), 0.88 - 0.73 (m, 4H).

실시예 2. 6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-(메틸-d ₃ )-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-메틸피리다진-3-카르복스아미드 (2)

단계 9 에서 중수소화된 메틸아민 하이드로클로라이드 (CD₃NH₂·HCl) 대신 메틸아민 하이드로클로라이드 (CH₃NH₂·HCl) 를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1 에 대한 방법에 따라서 화합물 2 를 합성하였다.

MS m/z (ESI): 426 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.32 (s, 1H), 10.97 (s, 1H), 9.22 - 9.11 (m, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.31 - 7.22 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.86 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.15 - 2.01 (m, 1H), 0.87 - 0.75 (m, 4H).

실시예 3. 6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-(메톡시-d ₃ )-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-메틸피리다진-3-카르복스아미드 (3))

단계 1

N-메틸포르모히드라지드

메틸히드라진 술페이트 3a (40 g, 277 mmol) 의 메탄올 (250 mL) 용액에, 실온에서 나트륨 메톡시드 (100 g, 554 mmol) 를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 24 시간 동안 교반하고, 여과하였다. 이어서, 여과액에 메틸 포르메이트 (17 g, 277 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하여, 표적 화합물 5b (22 g, 미정제) 를 수득하였다. 미정제 생성물을 추가의 정제없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.

MS m/z (ESI): 75 [M+1]

단계2

5-클로로-2-(메톡시-d₃)벤조니트릴 (3d)

5-클로로-2-히드록시벤조니트릴 3c (4 g, 26 mmol), 탄산 칼륨 (7.3 g, 53 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (30 mL) 의 혼합물에, 실온에서 중수소화된 메틸 요오다이드 (10 g, 78 mmol) 를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 70 ℃ 로 가열하고, 12 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 물 (200 mL) 로 희석시키고, 에틸 아세테이트 (2 × 100 mL) 로 추출하였다. 조합된 유기 상을 포화 염수 (2 × 100 mL) 로 세정하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축 건조시켜, 표적 화합물 3d (4.3 g, 고체) 를 97 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 171 [M+1]

단계 3

3-(5-클로로-2-(메톡시-d₃)페닐)-1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸 술페이트 (3e)

칼륨 tert-부톡시드 (11.3 g, 101 mmol) 의 테트라히드로푸란 (30 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 5-클로로-2-(메톡시-d₃)벤조니트릴 3d (4.3 g, 25.3 mmol) 및 N-메틸포르밀히드라지드 (4.1 g, 58 mmol) 의 테트라히드로푸란 (20 mL) 용액을 순차적으로 첨가하였다. 실온에서 12 시간 동안 교반한 후, 혼합물에 물 (50 mL) 을 첨가하고, 40 ℃ 로 가열하고, 40 분 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 유기 상을 분리하고, 포화 염수 (40 mL) 로 세정하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (40 mL) 에 용해시켰다. 생성된 용액에, 실온에서 진한 황산 (5 g) 을 서서히 첨가하고, 12 시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고, 건조시켜, 표적 화합물 3e (5.6 g, 고체) 를 83 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 227 [M+1]

단계 4

3-(5-클로로-2-(메톡시-d₃)-3-니트로페닐)-1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸 (3f)

3-(5-클로로-2-(메톡시-d₃)페닐)-1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸 술페이트 3e (5.6 g, 24.7 mmol) 의 황산 (25 g) 용액에, 0 ℃ 에서 질산 (2 g) 을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 서서히 가온시키고, 12 시간 동안 교반한 후, 다시 0 ℃ 로 냉각시켰다. 물 (67 mL) 및 메탄올 (47 mL) 을 0 ℃ 에서 용액에 첨가한 후, 실온으로 가온시키고, 1 시간 동안 교반하였다. 용액을 40 ℃ 로 가열하고, 이것에 수산화 암모늄 (42 mL) 을 첨가하였다. 용액을 20 ℃ 로 냉각시키고, 2 시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 고체를 물 (2 × 30 mL) 로 세정하고, 진공하에서 건조시켜, 표적 화합물 3f (3.37 g, 고체) 를 50 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 272 [M+1]

단계 5

2-(메톡시-d₃)-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)아닐린 (3g)

3-(5-클로로-2-(메톡시-d₃)-3-니트로페닐)-1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸 3f (3.37 g, 12.25 mmol) 의 메탄올 (10 mL) 용액에, 10 % 팔라듐/탄소 (400 mg) 및 중탄산 나트륨 (1.6 g, 25 mmol) 을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 수소 분위기 하에서 12 시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과액을 감압하에서 농축 건조시키고, 잔류물을 디클로로메탄 (25 mL) 에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압하에서 농축 건조시켜, 표적 화합물 3g (2.35 g, 고체) 를 92 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 208 [M+1]

단계 6

아연 6-클로로-4-((2-(메톡시-d₃)-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 (3h)

리튬 4,6-디클로로피리다진-3-카르복실레이트 1h (3 g, 15.1 mmol), 2-(메톡시-d₃)-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)아닐린 3g (2.35 g, 11.3 mmol), 이소프로판올 (2.5 mL) 및 물 (18 mL) 의 혼합물에, 실온에서 아연 아세테이트 (2.5 g, 13.6 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 65 ℃ 로 가열하고, 12 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 물 (20 mL) 로 희석시키고, 30 분 동안 교반하고, 여과하였다. 고체를 물 (2 × 30 mL) 및 테트라히드로푸란 (2 × 30 mL) 으로 세정하고, 진공하에서 건조시켜, 표적 화합물 3h (4.3 g, 고체) 를 100 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 364 [M+1]

단계 7

메틸 6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-(메톡시-d₃)-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 (3i)

아연 6-클로로-4-((2-(메톡시-d₃)-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 3h (4.3 g, 11 mmol), 시클로프로판카르복스아미드 (2.4 g, 27.56 mmol), (2R)-1-[(1R)-1-[비스(1,1-디메틸에틸)포스피노]에틸]-2-(디시클로헥실포스피노)페로센 (600 mg, 1.1 mmol), 팔라듐 아세테이트 (125 mg, 0.55 mmol), 톨루엔 (34 mL), 아세토니트릴 (17 mL), 탄산 칼륨 (3.1 g, 22 mmol) 및 1,8-디아자비시클로운데크-7-엔 (1.7 g, 11 mmol) 의 혼합물을 질소 분위기 하에서 80 ℃ 로 가열하고, 12 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물에 수성 아세트산 (50 %, 17 mL) 및 빙초산 (40 mL) 을 순차적으로 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 생성된 균질 혼합물을 석유 에테르 (2 × 20 mL) 로 세정하였다. 물 (50 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 숙성시킨 후, 여과하였다. 고체를 아세토니트릴 수용액 (50 %, 20 mL) 및 아세토니트릴 (20 mL) 로 순차적으로 세정한 후, 65 ℃ 에서 30 분 동안 진공하에서 건조시켜, 표적 생성물 3i (3 g, 고체) 를 66 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 413 [M+1]

단계 8

6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-(메톡시-d₃)-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-메틸피리다진-3-카르복스아미드

메틸 6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-(메톡시-d₃)-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 3i (1.5 g, 3.38 mmol), 메틸아민 하이드로클로라이드 (280 mg, 4.0 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (900 mg, 4.73 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (230 mg, 1.7 mmol), 아세토니트릴 (3 mL), N-메틸피롤리돈 (3 mL) 및 N-메틸이미다졸 (200 mg, 2.4 mmol) 의 혼합물을 65 ℃ 로 가열하고, 12 시간 동안 교반하였다. 반응을 완료한 후, 반응물을 물 (1.5 mL) 및 아세토니트릴 (4.5 mL) 로 급냉시켰다. 생성된 혼합물을 65 ℃ 에서 1 시간 동안 및 0 ℃ 에서 3 시간 동안 숙성시킨 후, 여과하였다. 고체를 아세토니트릴 수용액 (33 %, 4.5 mL) 및 아세토니트릴 (4.5 mL) 로 순차적으로 세정하고, 65 ℃ 에서 8 시간 동안 진공하에서 건조시켜, 표적 생성물 3 (811 mg, 고체) 을 56 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 426 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.32 (s, 1H), 10.97 (s, 1H), 9.24 - 9.08 (m, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.33 - 7.20 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.87 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.14 - 2.01 (m, 1H), 0.91 - 0.73 (m, 4H).

화합물 3 은 하기의 절차를 통해 HCl 염으로 전환될 수 있다:

반응 플라스크에, 3 (5.00 g, 11.752 mmol) 및 DMSO (27 mL) 를 첨가하였다. 생성된 혼합물을, 고체가 균질한 용액에 완전히 용해될 때까지 교반하면서 50-55 ℃ 로 가열하였다. 이어서, 혼합물에, 진한 염산 (36-38 %, 1.18 g), 이어서 물 (3 mL) 및 결정 시드 (25 mg) 를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50-55 ℃ 에서 0.5 h 동안 교반하고, 35-40 ℃ 로 냉각시키고, 이소프로판올 (60 mL) 을 0.5-1.0 h 에 걸쳐 적하하고, 35-40 ℃ 에서 0.5 h 동안 교반하였다. 혼합물을 1 h 에 걸쳐 20-25 ℃ 로 서서히 냉각시키고, 밤새 교반한 후, 여과하였다. 여과된 케이크를 이소프로판올 (2 × 15 mL) 로 세정하고, 감압하에 65 ℃ 에서 밤새 건조시켜, 3 의 모노-HCl 염 (4.5 g, 고체) 을 83 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 426 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13.72 (brs, 1H), 12.13 (s, 1H), 11.40 (s, 1H), 9.22 (q, J = 4.5 Hz, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.78 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.61 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 7.35 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.01 (s, 3H), 2.89 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.14 - 2.00 (m, 1H), 1.00 - 0.84 (m, 4H).

실시예 4. 6-(시클로프로판카르복스아미도)-4-((2-(메톡시-d ₃ )-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-(메틸-d ₃ )피리다진-3-카르복스아미드 (4)

단계 8 에서 메틸아민 하이드로클로라이드 (CH₃NH₂·HCl) 대신 중수소화된 메틸아민 하이드로클로라이드 (CD₃NH₂·HCl) 를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3 에 대한 방법에 따라서 화합물 4 를 합성하였다.

MS m/z (ESI): 429 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.32 (s, 1H), 10.98 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.32 - 7.21 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.14 - 2.03 (m, 1H), 0.89 - 0.75 (m, 4H).

실시예 5. (S)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-(메틸-d ₃ )피리다진-3-카르복스아미드 (5)

단계 1

(S)-N-(2,4-디메톡시벤질)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미드 (5b)

(S)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복실산 5a (1.5 g, 12.3 mmol), HATU (5.7 g, 15 mmol), 디이소프로필에틸아민 (4.8 g, 37 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (15 mL) 의 혼합물에, 2,4-디메톡시벤질아민 (4.0 g, 24.4 mmol) 을 첨가하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 용매를 감압하에서 제거하고, 잔류물을 역상 prep-HPLC 에 의해 정제하여, 표적 화합물 5b (4.4 g, 고체) 를 수득하였다.

MS m/z (ESI): 272 [M+1]

단계 2

(S)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미드 (5c)

(S)-N-(2,4-디메톡시벤질)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미드 5b 의 트리플루오로아세트산 (10 mL) 용액을 70 ℃ 로 가열하고, 1 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 농축 건조시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄/메탄올 100/0 내지 9/1) 에 의해 정제하여, 표적 화합물 5d (1.4 g, 고체) 를 2 개의 단계에서 93 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 122 [M+1]

단계 3

3-(5-클로로-2-메톡시페닐)-1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸 (5d)

칼륨 tert-부톡시드 (34 g, 290 mmol) 의 테트라히드로푸란 (200 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 5-클로로-2-메톡시-벤조니트릴 (20 g, 120 mmol) 및 메틸포르밀 히드라지드 3b (22 g, 미정제) 를 순차적으로 첨가하였다. 실온에서 72 시간 동안 교반한 후, 물 (500 mL) 을 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 × 300 mL) 로 추출하였다. 유기 상을 조합하고, 포화 염수 (2 × 300 mL) 로 세정하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축 건조시켜, 표적 화합물 5d (17.1 g, 고체) 를 88 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 224 [M+1]

단계 4

3-(5-클로로-2-메톡시-3-니트로페닐)-1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸 (5e)

3-(5-클로로-2-메톡시페닐)-1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸 5d (16.13 g, 72 mmol) 의 진한 황산 (72 g) 용액에, 0 ℃ 에서 진한 질산 (8.5 g, 87 mmol) 을 첨가하였다. 2 시간 동안 교반한 후, 생성된 용액을 0 ℃ 에서 물 (250 g) 과 메탄올 (150 g) 의 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 수산화 암모늄에 의해 pH > 7 로 조정하고, 여과하였다. 고체를 물 (2 × 100 mL) 로 세정하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (석유 에테르/에틸 아세테이트 100/0 내지 3/7) 에 의해 정제하여, 표적 생성물 5e (17.1 g, 고체) 를 88 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 269 [M+1]

단계 5

2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)아닐린 (5f)

3-(5-클로로-2-메톡시페닐)-1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸 5e (17 g, 63 mmol) 의 메탄올 용액에, 10 % 팔라듐/탄소 (3 g) 및 중탄산 나트륨 (10.5 g, 126 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 수소 분위기 하에서 5 시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 여과액을 감압하에서 농축 건조시키고, 잔류물을 역상 prep-HPLC 에 의해 정제하여, 표적 화합물 5f (8.8 g, 고체) 를 68 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 205 [M+1]

단계 6

아연 6-클로로-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 (5g)

리튬 4,6-디클로로피리다진-3-카르복실레이트 1h (4.53 g, 22.87 mmol), 2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)아닐린 5f (5.6 g, 27.44 mmol), 이소프로판올 (4.5 mL) 및 물 (34 mL) 의 혼합물에, 아연 아세테이트 (4.2 g, 22.87 mmol) 를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 65 ℃ 로 가열하고, 12 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 물 (30 mL) 로 희석시키고, 30 분 동안 숙성시킨 후, 여과하였다. 고체를 물 (2 × 30 mL) 및 테트라히드로푸란 (2 × 30 mL) 으로 세정하고, 진공하에서 건조시켜, 표적 화합물 5g (7.6 g, 고체) 를 93 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 361 [M+1]

단계 7

아연 (S)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 (5h)

아연 6-클로로-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 5g (1.6 g, 3.93 mmol), (S)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미드 5c (1.2 g, 9.8 mmol), (2R)-1-[(1R)-1-[비스(1,1-디메틸에틸)포스피노]에틸]-2-(디시클로헥실포스피노)페로센 (220 mg, 0.393 mmol), 팔라듐 아세테이트 (44 mg, 0.196 mmol), 톨루엔 (18 mL), 아세토니트릴 (11 mL), 탄산 칼륨 (1.1 g, 7.8 mmol) 및 1,8-디아자비시클로운데크-7-엔 (600 mg, 3.93 mmol) 의 혼합물을 질소 분위기 하에 80 ℃ 에서 72 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 아세트산 (27 mL) 및 물 (9 mL) 로 희석시키고, 생성된 용액을 석유 에테르 (2 × 30 mL) 로 세정하였다. 이어서, 물 (50 mL) 을 첨가하고, 3 시간 동안 방치하였다. 혼합물을 여과하고, 고체를 진공하에서 건조시켜, 표적 화합물 5h (1.1 g, 고체) 를 62 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 446 [M+1]

단계 8

(S)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-(메틸-d₃)피리다진-3-카르복스아미드

아연 (S)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)피리다진-3-카르복실레이트 5h (1.1 g, 2.46 mmol), 중수소화된 메틸아민 하이드로클로라이드 (210 mg, 2.95 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (660 mg, 3.44 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (190 mg, 1.23 mmol), 아세토니트릴 (6 mL) 및 N-메틸피롤리돈 (6 mL) 의 혼합물에, N-메틸이미다졸 (141 mg, 1.72 mmol) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 65 ℃ 로 가열하고, 1 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 감압하에서 농축 건조시키고, 잔류물을 역상 prep-HPLC 에 의해 정제하여, 표적 화합물 5 (420 mg, 고체) 를 37 % 의 수율로 수득하였다.

MS m/z (ESI): 462 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.52 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.33 - 7.23 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.13 - 2.97 (m, 1H), 2.10 - 1.95 (m, 2H).

실시예 6. (S)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-메틸피리다진-3-카르복스아미드 (6)

단계 8 에서의 중수소화된 메틸아민 하이드로클로라이드 (CD₃NH₂·HCl) 를 메틸아민 하이드로클로라이드 (CH₃NH₂·HCl) 로 대체한 것을 제외하고는, 실시예 5 의 절차에 따라서 화합물 6 을 합성하였다.

MS m/z (ESI): 459 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.52 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.20 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.33 - 7.23 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.11 - 2.98 (m, 1H), 2.86 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.10 - 1.94 (m, 2H).

실시예 7. (R)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-(메틸-d ₃ )피리다진-3-카르복스아미드 (7)

단계 1 에서의 (S)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복실산 (5a) 을 (R)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복실산으로 대체한 것을 제외하고는, 실시예 5 의 절차에 따라서 화합물 7 을 합성하였다.

MS m/z (ESI): 462 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.52 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 7.9, 1.5 Hz, 1H), 7.28 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.11-2.99 (m, 1H), 2.10 - 1.95 (m, 2H).

실시예 8. (R)-6-(2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복스아미도)-4-((2-메톡시-3-(1-메틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)아미노)-N-메틸피리다진-3-카르복스아미드 (8)

(i) 단계 1 에서의 (S)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복실산 (5a) 을 (R)-2,2-디플루오로시클로프로판-1-카르복실산으로 대체하고, (ii) 단계 8 에서의 중수소화된 메틸아민 하이드로클로라이드 (CD₃NH₂·HCl) 를 메틸아민 하이드로클로라이드 (CH₃NH₂·HCl) 로 대체한 것을 제외하고는, 실시예 5 의 절차에 따라서 화합물 8 을 합성하였다.

MS m/z (ESI): 459 [M+1]

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 11.52 (s, 1H), 11.01 (s, 1H), 9.27 - 9.16 (m, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.52 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.33 - 7.24 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 3.73 (s, 2H), 3.11 - 2.99 (m, 1H), 2.86 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.08 - 1.95 (m, 2H).

실시예 9. JAK2 키나아제 도메인 효소 활성 분석

재조합 JAK2 키나아제 도메인 (JH1) 의 효소 활성에 대한 본 발명의 화합물의 효과는 HTRF 키나아제 분석 검출 키트 (Cisbio, Cat. No. 62TK0PEC) 를 사용하여 키나아제 반응에서 기질 포스포릴화 수준을 검출함으로써 평가한다 (표 1).

실험 방법은 일반적으로 다음과 같다:

하기의 성분을 함유하는 반응 완충액: 효소 완충액 (1×), 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT 및 키트로부터의 0.01 % Brij35; 반응 완충액으로 0.15 ng/μL 의 용액으로 희석된 인간 재조합 JAK2 키나아제 도메인 단백질 (Carna Biosciences, Cat. No. 08-045); 2.5 μM ATP 및 반응 완충액으로 0.25 μM 로 희석된 비오틴화된 티로신 키나아제 기질을 함유하는 기질 반응 용액; 반응 완충액 중에 0.1 ng/μL Eu³⁺ 표지된 케이지 항체 (Cisbio, Cat. No. 61T66KLB) 및 12.5 nM 스트렙트아비딘-표지된 XL665 (Cisbio, Cat. No. 610SAXLB) 를 함유하는 검출 용액.

시험 화합물을 DMSO 에 1 mM 로 용해시키고, 이어서 DMSO 로 연속 4-배 희석하여 61 nM 의 최소 농도가 되게 한다. 각각의 농도는 반응 완충액으로 40-배 추가로 희석한다.

384-웰 분석 플레이트 (Corning, Cat. No. 3674) 에, 4 μL 의 화합물 용액 및 2 μL 의 JAK2 키나아제 용액을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 15 분 동안 배양한 후, 4 μL 의 기질 반응 용액을 첨가한다. 실온에서 30 분 동안 추가로 배양한 후, 반응 혼합물에 동일한 부피의 10 μL 검출 용액을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 방치한다. 이어서, Envision 플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 를 사용하여 620 nm 및 665 nm 에서 반응의 진행을 측정한다. 665 nm 및 620 nm 에서의 흡광도의 비율은 기질 포스포릴화 정도와 긍정적으로 상관 관계가 있으며, 따라서 JAK2 키나아제의 활성이 검출된다. 이 실험에서, JAK2 키나아제 단백질이 없는 그룹은 100 % 저해 그룹이며, JAK2 키나아제 단백질이 있지만, 시험 화합물이 없는 그룹은 0 % 저해 그룹이다. 시험 화합물에 의한 JAK2 키나아제 활성에 대한 저해율은 하기 식을 사용하여 계산된다:

저해율 = 100 - 100 × (비율_화합물 - 비율_{100% 저해}) / (비율_{0% 저해} - 비율_{100% 저해})

시험 화합물의 IC₅₀ 값은 XLfit 소프트웨어 (ID Business Solutions Ltd., UK) 를 사용하여 8 개의 농도 지점에서 하기 식에 의해 계산된다:

Y = 하단 + (상단 - 하단) / (1+10^((logIC₅₀ - X) × 기울기 계수))

(식 중, Y 는 저해율이고, X 는 시험 화합물의 농도의 대수이며, 하단은 S-형 곡선의 하단 안정기 값이고, 상단은 S-형 곡선의 상단 안정기 값이며, 기울기 계수는 곡선의 기울기 계수이다).

실시예 10. TYK2 키나아제 도메인 효소 활성 분석

재조합 TYK2 키나아제 도메인 (JH1) 의 효소 활성에 대한 본 발명의 화합물의 효과는 HTRF 키나아제 분석 검출 키트 (Cisbio, Cat. No. 62TK0PEC) 를 사용하여 키나아제 반응에서 기질 포스포릴화 수준을 검출함으로써 평가한다 (표 1).

실험 방법은 일반적으로 다음과 같다:

하기의 성분을 함유하는 반응 완충액: 효소 완충액 (1×), 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 10 nM SEB (Cisbio, Cat. No. 61SEBALB), 0.625 mM EGTA 및 키트로부터의 0.01 % Brij35; 반응 완충액으로 0.25 ng/μL 의 용액으로 희석된 인간 재조합 TYK2 키나아제 (JH1) 도메인 단백질 (Carna Biosciences, Cat. No. 08-147); 11.25 μM ATP 및 반응 완충액으로 0.5 μM 로 희석된 비오틴화된 티로신 키나아제 기질을 함유하는 기질 반응 용액; 반응 완충액 중에 0.1 ng/μL Eu³⁺ 표지된 케이지 항체 (Cisbio, Cat. No. 61T66KLB) 및 25 nM 스트렙트아비딘-표지된 XL665 (Cisbio, Cat. No. 610SAXLB) 를 함유하는 검출 용액.

시험 화합물을 DMSO 에 1 mM 로 용해시키고, 이어서 DMSO 로 연속 4-배 희석하여 61 nM 의 최소 농도가 되게 한다. 각각의 농도는 반응 완충액으로 40-배 추가로 희석한다.

384-웰 분석 플레이트 (Corning, Cat. No. 3674) 에, 4 μL 의 화합물 용액 및 2 μL 의 TYK2 키나아제 용액을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 15 분 동안 배양한 후, 4 μL 의 기질 반응 용액을 첨가한다. 실온에서 40 분 동안 추가로 배양한 후, 반응 혼합물에 동일한 부피의 10 μL 검출 용액을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 방치한다. 이어서, Envision 플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 를 사용하여 620 nm 및 665 nm 에서 반응의 진행을 측정한다. 665 nm 및 620 nm 에서의 흡광도의 비율은 기질 포스포릴화 정도와 긍정적으로 상관 관계가 있으며, 따라서 TYK2 키나아제의 활성이 검출된다. 이 실험에서, TYK2 키나아제 단백질이 없는 그룹은 100 % 저해 그룹이며, TYK2 키나아제 단백질이 있지만, 시험 화합물이 없는 그룹은 0 % 저해 그룹이다. 시험 화합물에 의한 TYK2 키나아제 활성에 대한 저해율은 하기 식을 사용하여 계산된다:

저해율 = 100 - 100 × (비율_화합물 - 비율_{100% 저해}) / (비율_{0% 저해} - 비율_{100% 저해})

시험 화합물의 IC₅₀ 값은 XLfit 소프트웨어 (ID Business Solutions Ltd., UK) 를 사용하여 8 개의 농도 지점에서 하기 식에 의해 계산된다:

Y = 하단 + (상단 - 하단) / (1+10^((logIC₅₀ - X) × 기울기 계수))

(식 중, Y 는 저해율이고, X 는 시험 화합물의 농도의 대수이며, 하단은 S-형 곡선의 하단 안정기 값이고, 상단은 S-형 곡선의 상단 안정기 값이며, 기울기 계수는 곡선의 기울기 계수이다).

실시예 11. TYK2 슈도키나아제 도메인 결합 분석

TYK2 슈도키나아제 도메인 (JH2) 에 대한 본 발명의 화합물의 결합은 상업적 플루오레세인-표지된 프로브 (Alexa-Fluor 647-conjugated kinase tracer 178) 와의 경쟁을 통한 TR-FRET (Time-Resolved Fluorescence Energy Transfer) 생화학적 분석을 사용하여 결정된다 (표 1).

실험 방법은 일반적으로 다음과 같다:

결합 완충액은 20 mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 0.015 % Brij35, 2 mM DTT, 0.625 mM EGTA 및 100 mM KF 를 함유한다. TYK2 의 JH2 도메인 (전장 단백질 내의 아미노산 556-871) 은 Tsinghua University 단백질 정제 및 식별 플랫폼에서 발현 및 정제한다. 시험 화합물을 DMSO 에 0.1 mM 로 용해시키고, 이어서 DMSO 로 연속 4-배 희석하여 61 nM 의 최소 농도가 되게 한다. 각각의 농도는 반응 완충액으로 40-배 추가로 희석한다.

384-웰 분석 플레이트 (Corning, Cat. No. 4512) 에, 5 μL 의 화합물 용액 및 5 μL 의 TYK2 JH2 도메인 용액 (160 nM) 을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 30 분 동안 배양한 후, 플루오레세인-표지된 프로브 (ThermoFisher, Cat. No. PV5593) (20 nM) 와 GST-Europium (Eu)-표지된 항체 (Cisbio, Cat. No. 61GSTKLA) (40 ng/mL) 의 혼합물 10 μL 를 첨가한다. 실온에서 30 분 동안 추가로 배양한 후, HTRF 신호 (플루오레세인 수용체 및 유로퓸 공여체에 대해 각각 615 nm 및 665 nm 의 방출 파장에서 형광 강도의 비율) 를 Envision 플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 상에서 측정한다. 저해율은 시험 화합물이 없는 양성 대조군과 단백질이 없는 음성 대조군을 비교하여 하기 식에 따라서 계산된다:

저해율 = 100 - 100 × (신호_화합물 - 신호_{음성 대조군}) / (신호_{양성 대조군} - 신호_{음성 대조군})

시험 화합물의 IC₅₀ 값은 XLfit 소프트웨어 (ID Business Solutions Ltd., UK) 를 사용하여 8 개의 농도 지점에서 하기 식에 의해 계산된다:

Y = 하단 + (상단 - 하단) / (1+10^((logIC₅₀ - X) × 기울기 계수))

(식 중, Y 는 저해율이고, X 는 시험 화합물의 농도의 대수이며, 하단은 S-형 곡선의 하단 안정기 값이고, 상단은 S-형 곡선의 상단 안정기 값이며, 기울기 계수는 곡선의 기울기 계수이다).

표 1

본 발명의 화합물은 JAK2 또는 TYK2 의 키나아제 도메인에 대해 약한 또는 낮은 저해 활성을 가진다. 표 1 은 화합물 2, 3, 4, 7 및 8 이 키나아제 활성의 직접적인 저해에 대해 IC₅₀ > 10 μM 을 가진 반면, 참조 화합물은 2.9 μM 의 더 낮은 IC₅₀ 을 가졌다는 것을 보여준다. 시험 화합물 및 참조 화합물은 모두 TYK2 JH2 에 대해 강한 결합을 가졌다 (nM 범위의 IC₅₀)

실시예 12. NK92 세포에서 IL-12-유도된 IFN-γ 분비의 저해

NK92 세포에서 TYK2 에 의해 유도된 IFN-γ 분비에 대한 본 발명의 화합물의 효과는 효소-결합된 면역수착 분석 (ELISA) 에 의해 평가한다 (표 2).

IL-12 수용체는 활성화된 T-세포, NK 세포 (NK92 는 NK 세포주이다), DC 세포 및 B-세포에서 주로 발현된다. IL-12 에 결합하는 경우, 이것은 NK 세포 및 T 림프구 내에서 JAK2/TYK2 신호 전달 경로를 활성화시킴으로써, IFN-γ 의 분비를 유도한다.

실험 방법은 일반적으로 다음과 같다:

시험 화합물을 DMSO 에 2.5 mM 로 용해시키고, 이어서 DMSO 로 연속 4-배 희석하여 0.31 μM 의 최소 농도가 되게 한다. 각각의 농도는 FBS-비함유 MEMα 배지 (Gibco, Cat. No. 12561-056) 로 50-배 추가로 희석한다.

NK92 세포 (Nanjing Cobioer, Cat. No. CBP60980) 를 12.5 % FBS (Ausbian, Cat. No. VS500T), 12.5 % 말 혈청 (Gibco, Cat. No. 16050-122), 0.02 mM 엽산 (Sigma, Cat No. F8758), 0.2 mM 이노시톨 (Sigma, Cat No. 17850), 0.55 mM β-메르캅토에탄올 (Gibco, Cat No. 21985-023), 200 U/mL IL-2 (R & D Systems, Cat No. 202-1L) 및 100 U/mL 페니실린 (ThermoFisher, Cat No. 15140122) 을 함유하는 완전 MEMα 배지에서 배양한다. 배양 용기 표면의 80-90 % 를 덮을 때, 세포를 96-웰 플레이트 (ThermoFisher, Cat No. 167425) 상에서 웰 당 100,000 세포로 분산시키고 플레이팅한다 (IL-2 가 없는 완전 MEMα 배지 80 μL). 이어서, 96-웰 플레이트를 37 ℃ / 5 % CO₂ 인큐베이터에서 밤새 배양한다.

밤새 배양한 후, 10 μL 의 시험 화합물 및 10 μL 의 50 ng/mL IL-12 (R & D Systems, Cat. No. 219-1L) 를 각각의 웰에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 96-웰 플레이트를 37 ℃ / 5 % CO₂ 인큐베이터에서 추가로 24 시간 동안 배양한다. 플레이트를 실온에서 10 분 동안 800 rpm 으로 원심분리하고, 각각의 웰로부터의 50 μL 의 상청액을 항-IFN-γ 항체가 코팅된 또다른 96-웰 플레이트 (Sigma, Cat No. CLS3695) 로 옮긴다. IFN-γ 분비의 양은 Human IFN-gamma DuoSet ELISA kit (R & D Systems, Cat No. DY285B) 로부터의 지시에 따라 검출된다. 실험에서, IL-12 가 있으며, 시험 화합물이 MEMα 배지로 대체된 그룹은 비-자극된 대조군 (100 % 저해) 이며, IL-12 및 0.2 % DMSO 가 있는 그룹은 자극된 그룹 (0 % 저해) 이다. 시험 화합물에 의한 NK-92 세포에서의 IL-12 유도된 IFN-γ 분비에 대한 저해율은 하기 식을 사용하여 계산된다:

저해율 = 100 - 100 × (신호_화합물 - 신호_{비-자극된 대조군}) / (신호_{자극된 대조군} - 신호_{비-자극된 대조군})

시험 화합물의 IC₅₀ 값은 XLfit 소프트웨어 (ID Business Solutions Ltd., UK) 를 사용하여 8 개의 농도 지점에서 하기 식에 의해 계산된다:

Y = 하단 + (상단 - 하단) / (1+10^((logIC₅₀ - X) × 기울기 계수))

(식 중, Y 는 저해율이고, X 는 시험 화합물의 농도의 대수이며, 하단은 S-형 곡선의 하단 안정기 값이고, 상단은 S-형 곡선의 상단 안정기 값이며, 기울기 계수는 곡선의 기울기 계수이다).

표 2

본 발명의 화합물은 NK92 세포에서 TYK2 에 의해 유도된 IFN-γ 의 분비에 대한 유의한 저해 효과를 가졌다.

실시예 13. 생체내 래트 PK 결정

본 발명의 화합물 3 및 참조 화합물 BMS-986165 의 약동학을 평가하였다. 화합물 3 은 벤젠 고리 상에 OCD₃ 를 갖는 반면, 참조 화합물은 아미드 부분 상에 CD₃ 를 가졌다. 메틸기는 전형적으로 생체내에서 불안정하며, 메틸아미드의 경우 아미다아제에 의해 가수분해되고, 메톡시 및 메틸트리아졸의 경우 CYP 에 의해 산화적 탈메틸화된다. 메틸을 트리-중수소화 메틸로 치환하면, 화합물의 생체이용률 및 생체내 노출이 개선되며, 동일한 투여량에서 화합물의 보다 양호한 효능이 제공된다.

5 % N,N-디메틸아세트아미드 + 20 % 솔루톨 + 75 % 식염수를 함유하는 0.5 mg/mL 용액 중의 화합물 3 및 참조 화합물을 3 마리의 수컷 Sprague Dawley 래트에 5 mg/kg 의 투여량으로 경구 투여하였다. 투여 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 및 24 시간 후에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈장에서의 화합물의 농도는 API-4500 질량 분광계를 사용하여 LC-MS/MS 에 의해 정량화하였다. 분석의 정량 한계 (LOQ) 는 1 ng/mL 였다. 약동학적 (PK) 매개변수는 WinNonlin 을 사용하는 비-구획 방법에 의해 계산하였으며, 표 3 에 나타낸다. 결과는 본 발명의 화합물 3 이 참조 화합물보다 더 양호한 생체내 노출을 가졌다는 것을 보여준다.

표 3

실시예 14. 항-CD40 항체-유도된 대장염 동물 모델에서의 생체내 효능 평가

Beijing Vital River laboratory 로부터의 암컷 CB17-Scid 마우스 (8-10 주령, 18-20 g) 를 무작위로 5 개 그룹 (그룹 당 n = 8) 으로 나누었다. 0 일 째에, PBS 중 100 ㎍ 의 FGK4.5 항-CD40 mAb (BioXCell, Cat. No. EB0016-2) 의 단일 복강내 주사로 각각 마우스에서 대장염을 유도하였다. 0 일 에서 7 일 까지, 처리군에서의 마우스에, DMSO/솔루톨/PEG-400 (10:5:30) 의 비히클 중 0, 1.5, 5, 15 mg/kg 의 화합물 3 또는 5 mg/kg 의 BMS-986165 를 1 일 2 회 경구 투여한 반면, 비히클군에서의 마우스에는 상기에서 언급한 비히클을 경구 투여하였다. 매일, 마우스의 체중을 측정하고, 체중 감소 및 동반된 묽은 변 및 설사를 포함한 대장염의 징후에 대해 모니터링하였다. 8 일 째에, 모든 동물을 안락사시켰다. 비장 조직을 수집하고, 무게를 측정하였다. 결과는 1.5 mg/kg, 5 mg/kg 및 15 mg/kg 투여량의 화합물 3 및 5 mg/kg 투여량의 참조 화합물이 비히클군에서의 마우스와 비교하여, 체중 감소 (도 2, 표 4) 및 비장 확대 (표 4) 를 예방하는데 있어서 대장염으로부터 마우스를 유의하게 보호하였다는 것을 보여준다.

표 4

* 상대적인 체중 변화 (RCBW) 는 하기 식: RCBW (%) = (BWx - BW0) / BW0 × 100 % (식 중, BWx 는 x 일 째의 평균 체중이며, BW0 은 0 일 째의 평균 체중이다) 에 따라서 계산된다. SEM: 평균의 표준 오차.

상기의 내용은 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하며, 청구범위에 나타낸 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서 수정이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

Claims (8)

1. 화합물 3 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   
   화합물 3.
2. 화합물 2 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   
   화합물 2.
3. 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   
   화합물 1.
4. 화합물 4 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   
   화합물 4.
5. 화합물 5 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   
   화합물 5.
6. 화합물 6 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   
   화합물 6.
7. 화합물 7 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   
   화합물 7.
8. 화합물 8 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   
   화합물 8.

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