CN114650990B - 抑制tyk2活性的杂环类化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物1‑8及其药学上可接受的盐或前药。化合物1‑8是TYK2的JH2选择性结合物，对TYK2的生理功能有明显的抑制作用，具有良好的体内药动学性质。化合物1‑5和7的甲基被若干氘取代以改善其药代动力学(PK)性质。

Description

抑制TYK2活性的杂环类化合物
发明领域
本发明涉及可用于调控TYK2以引起信号转导抑制的杂环类化合物。这些化合物具有改进的动物药代动力学性质。
发明背景
酪氨酸激酶2(TYK2)是属于Janus激酶(JAK)家族的非受体酪氨酸蛋白激酶，已显示在调节IL-12、IL-23和I型干扰素受体的下游信号转导级联反应中起关键作用。
串联激酶结构域是JAK的标志。JH1是典型蛋白酪氨酸激酶结构域，而JH2被分类为伪激酶结构域。JAK家族的结构显示在图1中。
最近的生化和结构数据表明，TYK2的伪激酶结构域具有低水平的催化活性，反向调控激酶结构域的活性。
当细胞因子受体结合细胞因子时，将触发结合到细胞内区域的TYK2及其家族成员JAK1和/或JAK2的磷酸化，从而通过二聚作用激活信号转导和转录激活因子(STATs)。然后，二聚化的STATs迁移到细胞核内并调节相关基因的表达和转录，从而完成信号从细胞膜到细胞核的转导。因此，JAK通过JAK-STAT通路转导细胞因子介导的信号，在细胞因子依赖性调节的细胞增殖、分化、凋亡以及免疫反应等许多细胞功能中起重要作用。TYK2缺陷小鼠在结肠炎、银屑病和多发性硬化的实验模型具有抵抗力，表明TYK2介导的信号转导在自身免疫和相关疾病中起的重要作用。
人类中表达TYK2失活变异体的个体可免受多发性硬化症和其他自身免疫性疾病的侵扰。全基因组关联研究表明，TYK2的其他变异与自身免疫性疾病，例如克罗恩病、牛皮癣、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎有关，进一步证明了TYK2在自身免疫中的重要性。
TYK2基因敲除小鼠的红细胞数正常，能够存活。TYK2缺乏表达，表现为多种促炎细胞因子信号转导减弱，T辅助细胞分化严重失衡。来自基因相关研究结果支持TYK2是一个共同的易感自身免疫疾病基因。TYK2调控的通道在疾病治疗上也被抗体疗法进一步证实，例如的靶向于IL-12/IL-23、用于治疗牛皮癣的优特克单抗ustekinumab和靶向于I型干扰素受体、用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)的anifrolumab在临床试验中显示了明显疗效。
TYK2还与一些癌症相关，比如急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)细胞的异常生存与TYK2的激活相关。基因敲除实验显示出88％T-ALL细胞系和63％来自病人的T-ALL细胞对TYK2有依赖性，因此，TYK2是T-ALL的致癌基因(Sanda et.al,Cancer Disc.2013,3,564-77)。TYK2选择性抑制剂NDI-031301能够诱导细胞凋亡来抑制人类T-ALL细胞系的生长，在带有KOPT-K1 T-ALL肿瘤细胞的小鼠模型上也有很好的安全性和疗效(Akahane et.al,British J.Haematol.2017,177,271-82)，显示出TYK2选择性抑制剂在治疗T-ALL方面的前景。因此，TYK2是治疗炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症的热门靶点之一(Alicea-Velazquez et.al,Curr.Drug Targets 2011,12,546-55)。
TYK2和其它JAK家族成员在结构上都具有一个激酶区JH1(Janus Homology 1)和相邻的一个伪激酶区JH2(Janus Homology 2)。JH2也能结合ATP，但不起催化功能，而是对JH1的激酶活性起调控作用(Staerk et.al,J.Biol.Chem.2015,280,41893-99)。由于JAK家族(JAK1、JAK2、JAK3和TYK2)激酶区JH1的高度序列相似性，开发一个针对TYK2的JH1，而不抑制JAK1、JAK2和JAK3的选择性抑制剂是非常有挑战性的。大多数JAK抑制剂结合在JAK的激酶区，比如tofacitinib、ruxolitinib、baricitinib、upadacitinib，因此在同家族JAK中选择性不够高，在临床显示出剂量限制性副作用，比如贫血。因此，开发高选择性TYK2抑制剂吸引了制药公司的关注。基于TYK2的JH1和JH2在ATP结合部结构上的差别，Bristol-Myers Squibb公司开发了TYK2的高选择性JH2结合剂BMS-986165，其只抑制TYK2介导的生理功能，而不与JAKs的激酶区(JH1)的结合。BMS-986165目前正处于治疗自身免疫疾病的临床三期研究(Wrobleski et.al,J.Med.Chem.2019,62,8973-95)。
BMS-986165的结构如下所示(WO2014/074661)：
Figure BDA0003630582840000031
目前仍然需要开发新的化合物，其选择性地结合TYK2的伪激酶结构域(JH2)，同时与JAK家族的激酶结构域，特别是JAK2的结合最小。
附图的简要说明
图1显示JAK家族(JAK1、JAK2、JAK3和TYK2)的二级结构。
图2显示了在抗CD40抗体诱导的IBD结肠炎动物模型中的体内药效。分别用溶媒、参照化合物和三种不同剂量的化合物3治疗的动物在不同治疗天数的相对体重％变化。
本发明的详细说明
发明人发现了不针对TYK2的催化活性位点，而是靶向作用于TYK2伪激酶结构域(JH2)的选择性TYK2抑制剂。本发明涉及化合物1-8及其药学上可接受的盐或前药。化合物1-8是TYK2的JH2选择性结合剂。通过与伪激酶结构域(JH2)结合，化合物1-8抑制TYK2的激酶催化活性，抑制蛋白磷酸化，并对TYK2的生理功能表现出显著的抑制作用。化合物1-8与TYK2的激酶结构域(JH1)结合弱或不结合。化合物1-8通过与JH2结合而选择性地抑制TYK2的激酶活性，并且对其他JAK家族成员的激酶活性具有低抑制活性。相对于其他JAK家族成员(JAK1、JAK2和JAK3)，化合物1-8对TYK2的选择性抑制最大程度上减少了诸如贫血等副作用。化合物1-8在动物中显示出优异的体内药代动力学特性。
Figure BDA0003630582840000032
Figure BDA0003630582840000041
Figure BDA0003630582840000051
Figure BDA0003630582840000061
本文所述“药学上可接受的盐”是指保留本化合物所具有的生物活性的盐，并且不会引起毒副作用。药学上可接受的盐包括不同盐的各种晶型以及无定形形式。本发明的碱性杂环化合物的药学上可接受的盐可与无机酸或有机酸生成。
本文所述“前药”是指一种化合物在给药后通过代谢或化学反应转化成本化合物1-8和/或其盐。在体内转化成具有生物活性的化合物1-8的任何前药都包括在本发明范围内。各种形式的前药是众所周知的。
化合物1在三唑环上有三氘代甲基和三氘代甲基酰胺。
化合物2在三唑环上有三氘代甲基。
化合物3在苯环上有三氘代甲氧基。
化合物4在苯环上有三氘代甲氧基和三氘代甲酰胺。
化合物5含有(S)-6-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰氨基)和三氘代甲基酰胺。
化合物6含有(S)-6-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰氨基)，无任何氘取代。
化合物7含有(R)-6-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰氨基)和三氘代甲基酰胺。
化合物8含有(R)-6-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰氨基)，无任何氘取代。
化合物1-5和7的甲基被若干氘取代以改善其药代动力学(PK)性质。化合物5-8在环丙烷上具有二氟。本发明的化合物对JAK的激酶结构域的结合活性低，并且对TYK2的细胞功能例如抑制γ-干扰素和IL-23的分泌具有高抑制活性。当口服服用后，本发明的化合物具有良好的生物利用度。本发明的化合物使用安全，可有效治疗炎症性肠病(IBD)，如在小鼠的抗CD40结肠炎(IBD)模型中所证明的那样，在用化合物2、3和5治疗中，体重没有明显降低。
药物组合物
本发明提供含有一个或多个药物上可接受的载体和活性化合物1-8或其药物上可接受的盐的药物组合物。所述药物组合物中的活性化合物或其药物上可接受的盐的量通常为：对于外用制剂，约0.01-20％，或0.05-20％，或0.1-20％，或0.2-15％，或0.5-10％，或1-5％(w/w)；对于注射剂，约0.1-5％；对于贴片剂，约0.1-5％；对于片剂，约1-90％；对胶囊，约1-100％。
在一个实施例中，活性化合物被混入任何可接受的载体中，包括乳霜、凝胶、乳液或其他类型的悬浮液。这些载体可稳定该活性化合物并通过外用给药将其输送至受影响部位。在另一个实施例中，所述药物组合物可为片剂、胶囊剂、颗粒剂、细颗粒剂、粉末、糖浆、栓剂、注射溶液、贴片等。上述药物组合物可通过常规方法制备。
可药用的载体为非活性成分，可被本领域技术人员以常规标准选择。可药用的载体包括但不限于非水性溶液、悬浮液、乳液、微乳液、胶束溶液、凝胶和软膏。可药用的载体也包括但不限于盐水和电解质溶液；离子和非离子渗透剂如氯化钠、氯化钾、甘油和葡萄糖；pH调节剂和缓冲剂如氢氧化物、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸盐和三乙醇胺；抗氧化剂如亚硫酸氢酸、亚硫酸、偏亚硫酸氢酸、硫代亚硫酸、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、生育酚和抗坏血酸棕榈酸酯及其盐；表面活性剂如磷脂酰胆碱、包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇等的磷脂；泊洛沙姆和普洛沙明，聚山梨酯80、聚山梨酯60和聚山梨酯20等聚山梨酯，聚乙二醇和聚丙烯二醇等聚醚；聚乙烯醇和聚维酮等聚乙烯醇；纤维素衍生物，如甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素及其盐；石油衍生物，如矿物油和白矿脂；脂肪，如羊毛脂、花生油、棕榈油、大豆油；甘油单、双和三酯；丙烯酸聚合物，如羧聚甲基凝胶和疏水改性的交联丙烯酸酯共聚物；多糖，如右旋糖酐和糖胺聚糖，如透明质酸钠。这样的可药用的载体可以用众所周知的防腐剂保存，以防止细菌污染，包括但不限于苯扎氯铵、乙二胺四乙酸及其盐类、苄索氯铵、洗必泰、氯丁醇、甲基对羟基苯甲酸、硫柳汞和苯乙醇，或者可以是一次或多次使用的未加保存的配方。
例如，活性化合物的片剂或胶囊剂可以包含其他没有生物活性并且不与活性化合物反应的赋形剂。片剂或胶囊的赋形剂可包括填充剂、粘合剂、润滑剂和胶质剂、崩解剂、润湿剂和释放速率调节剂。粘合剂可促进配方颗粒的粘附，对片剂配方非常重要。片剂或胶囊的赋形剂的实例包括但不限于羧甲基纤维素、纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、刺槐树胶、淀粉、黄芪胶、明胶、硬脂酸镁、二氧化钛、聚丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。例如，片剂可含有非活性成分，如胶态二氧化硅、克罗夫酮、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素、聚乙二醇、乙醇酸淀粉钠和/或二氧化钛。胶囊制剂可含有非活性成分，如明胶、硬脂酸镁和/或二氧化钛。
例如，活性化合物的贴片剂可以包含一些非活性成分，例如1,3-丁二醇、氨基乙酸二羟基铝、依地酸二钠、D-山梨醇、明胶、高岭土、对羟基苯甲酸甲酯、聚山梨酯80、聚维酮、丙二醇、对羟基苯甲酸丙酯、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、酒石酸，二氧化钛和纯净水。贴片制剂还可含有皮肤通透性增强剂，例如乳酸酯(乳酸月桂酯等)或二甘醇单乙醚。
活性化合物的外用制剂可以是凝胶、乳膏、乳液、液体、乳液、软膏、喷雾、溶液和悬浮液的形式。外用制剂中的非活性成分包括但不限于二甘醇单乙醚(润肤剂/渗透增强剂)、二甲基亚砜(溶解度增强剂)、硅弹性体(流变性/质地改性剂)、辛酸/癸酸甘油三酯(润肤剂)、辛二酸(润肤剂/紫外线滤光剂)，有机硅液体(润滑剂/稀释剂)、角鲨烯(润肤剂)、葵花油(润肤剂)和二氧化硅(增稠剂)。
使用方法
本发明的化合物不与JAKs的激酶结构域结合，因此对激酶结构域的激酶活性没有抑制作用。发明人已经证明，本发明化合物特异性地与TYK2伪激酶结构域(JH2)结合并显著抑制NK92细胞中TYK2的生理功能。本化合物在大鼠体内也显示出良好的药代动力学特性。
本发明涉及一种预防或治疗TYK2所介导的疾病的方法，包括但不限于自身免疫性疾病、炎症性疾病(包括小肠炎症和大肠炎症)、癌症、皮肤病、糖尿病、眼疾、神经退行性疾病、过敏反应、哮喘，其他阻塞性气道疾病和移植排斥反应等。该方法包括向有需要的患者施用有效量的本发明化合物或其前药以及其药学上可接受的盐。本文所述的“有效量”是通过改善疾病的病理状态或减轻疾病的症状来治疗疾病的有效剂量。
本发明的药物组合物可以是局部给药和全身给药。局部给药包括外用给药。全身给药包括口服(包括口腔或舌下)、肠胃外(如静脉、肌肉、皮下或直肠)和其他全身给药途径。在全身给药中，活性化合物首先进入血浆，然后分布到靶组织。局部给药和口服给药是本发明的优选给药途径。
组合物的剂量可以根据损伤程度和每个患者的个人反应而定。对于全身给药，活性化合物的血浆浓度可以不同，但通常为1x10-10-1x10-4摩尔/升，最好为1x10-8-1x10-5摩尔/升。
在一个实施方案中，将组合物局部施用于患处并擦入患处。根据医学问题和慢性或急性的疾病病理，每天至少局部施用1或2次，或每天施用3至4次。一般而言，局部用组合物包含有约0.01-20％、或0.05-20％、或0.1-20％、或0.2-15％、0.5-10或1-5％(w/w)的活性化合物。活性化合物透过皮肤进到不适部位。
在一个实施方案中，将药物组合物口服给予受试者。口服剂量一般为至少0.1mg/kg/天和小于1000mg/kg/天。例如，口服给药的剂量为每天0.5mg至1g，优选1mg至700mg，或5mg至300mg化合物。
本领域技术人员将认识到多种给药机制都适用于本发明。
本发明可用于治疗哺乳动物，例如人类、马和狗。本发明优选用于治疗人类。
下列实施例进一步说明本发明。这些实施例仅意在说明本发明，而不应理解为是限制性的。
实施例
实施例1-8说明了本发明化合物的合成。反应的每个步骤中的产物通过本领域已知的分离技术获得，包括但不限于萃取、过滤、蒸馏、结晶和色谱分离。合成所需的起始原料和化学试剂可以根据文献(可从SciFinder中搜索到)常规地合成或购买。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或质谱(MS)来确定的。NMR的测定是用BrukerASCEND-400核磁仪。溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDC13)或氘代甲醇(CD3OD)。内标为四甲基甲硅烷(TMS)。化学位移是以10-6(ppm)作为单位给出。
MS的测定使用Agilent SQD(ESI)质谱仪(生产商：安捷伦，型号：6120)。
HPLC的测定使用安捷伦1260DAD高压液相色谱仪(Poroshell120 EC-C18，50×3.0mm，2.7μm色谱柱)或Waters Arc高压液相色谱仪(Sunfire C18，150×4.6mm，5μm色谱柱)。
薄层层析硅胶板使用青岛海洋GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4～0.5mm硅胶板。
柱层析一般使用青岛海洋200～300目硅胶为载体。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG、Acros Organics、Sigma-Aldrich Chemical Company、韶远化学科技(Accela ChemBio Inc.)、北京偶合化学品、以及其他公司。
下列实施例中如无特殊说明，反应均在氩气气氛或氮气气氛下进行。
氩气气氛或氮气气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
氢气气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
微波反应使用CEM Discover-SP型微波反应器。
实施例中如无特殊说明，反应的温度为室温，温度范围是20-30℃。
实施例中的反应进程的监测使用安捷伦的液质联用仪(1260/6120)。反应进程的监测也可采用薄层色谱法(TLC)，展开剂所使用的体系有A：二氯甲烷和甲醇体系；B：石油醚和乙酸乙酯体系；C：实施例中所示溶剂体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂的体系包括A：二氯甲烷和甲醇体系；B：石油醚和乙酸乙酯体系；C：实施例中所示溶剂体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和酸性或碱性试剂等进行调节。
纯化化合物还采用Waters的质谱导向自动制备系统(质谱检测器：SQD2)，根据化合物的极性用适当的乙腈/水(含0.1％三氟乙酸或甲酸)或乙腈/水(含0.05％氨水)梯度于20mL/min的流速洗脱反相高压柱(XBridge-C18，19×150mm，5μm)。
实施例1：6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-(甲基-d3)哒嗪-3-羧酰胺(1)
Figure BDA0003630582840000111
第一步
2-甲氧基-3-硝基苯甲酸甲酯(1b)
室温下向2-氟-3-硝基苯甲酸甲酯1a(10g，50mmol)的甲醇(50mL)溶液中加入甲醇钠(12.6g，70mmol)。室温搅拌4小时后，用水(200mL)稀释溶液，然后用乙酸乙酯(3×60mL)萃取。有机相合并后用饱和食盐水(2×100mL)洗涤，再用无水硫酸钠干燥并过滤。滤液在减压条件下除去溶剂，得到目标产物1b(10g，固体)，产率：98％。
MS m/z(ESI):212[M+1]
第二步
2-甲氧基-3-硝基苯甲酰胺(1c)
室温下向2-甲氧基-3-硝基苯甲酸甲酯1b(10g，47mmol)的甲醇(40mL)溶液中加入氨水(20mL)。室温下搅拌48小时后，减压除去溶剂，得到目标产物1c(粗品，10g，固体)。该粗品未经进一步纯化，直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):197[M+1]
第三步
3-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-1,2,4-三唑(1d)
将2-甲氧基-3-硝基苯甲酰胺1c(10g，51mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(50mL)中，加热至95℃并搅拌2小时。冷却至室温后，减压除去溶剂，然后将残余物溶于乙醇(30mL)中，得到溶液A。0℃下向乙酸(35mL)和乙醇(150mL)的混合物中缓慢加入水合肼(25mL)，然后在0℃下向溶液中加入溶液A。逐渐升温到室温并搅拌12小时后，减压除去溶剂。残余物分散到水(400mL)中后过滤，所得固体用水洗涤，干燥后得到目标产物1d(6g，固体)，产率：55％。
MS m/z(ESI):221[M+1]
第四步
3-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑(1e)
0℃下向3-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-1H-1,2,4-三唑1d(1.2g，5.3mmol)、碳酸钾(2.2g，16mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(10mL)的混合物中加入氘代碘甲烷(1g，6.9mmol)。室温搅拌12小时后，所得溶液用反相制备高效液相色谱纯化，得到目标产物1e(530mg，固体)，产率：42％。
MS m/z(ESI):238[M+1]
第五步
2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯胺(1f)
向3-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑1e(530mg，1.61mmol)的甲醇(10mL)溶液中加入10％钯碳(50mg)。该反应混合物在氢气气氛下搅拌12小时后过滤，滤液在减压条件下除去溶剂，得到目标产物1f(430mg，固体)。该产品未经进一步纯化，直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):208[M+1]
第六步
4,6-二氯哒嗪-3-羧酸锂(1h)
向4,6-二氯哒嗪-3-羧酸甲酯1g(5g，24.15mmol)、二异丙基乙胺(9.4g，72.5mmol)、乙腈(13.5mL)和水(3.25mL)的混合物中加入溴化锂(6.3g，72.5mmol)。将所得混合物在室温下搅拌12小时后过滤，所得固体用乙腈(8mL)洗涤，干燥后得到目标产物1h(4.53g，固体)，产率：90％。
MS m/z(ESI):193[M+1]
第七步
6-氯-4-((2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌(1i)
室温下向4,6-二氯哒嗪-3-羧酸锂1h(380mg，1.9mmol)、2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯胺1f(471mg，2.27mmol)、异丙醇(0.5mL)和水(5mL)的混合物中加入醋酸锌(350mg，1.9mmol)。将该混合物加热到65℃并搅拌12小时。冷却至室温后，用水(30mL)稀释，然后搅拌老化30分钟并过滤。固体用水(2×30mL)和四氢呋喃(2×30mL)洗涤，真空干燥后得到目标产物1i(490mg，固体)，产率：71％。
MS m/z(ESI):364[M+1]
第八步
6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌(1j)
向6-氯-4-((2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌1i(490mg，1.15mmol)、环丙烷甲酰胺(300mg，3.45mmol)、(2R)-1-[(1R)-1-[双(1,1-二甲基乙基)膦基]乙基]-2-(二环己基膦基)二茂铁(63mg，0.115mmol)、醋酸钯(25mg，0.0575mmol)、甲苯(9mL)和乙腈(5mL)的混合物中依次加入碳酸钾(320mg，7.8mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(180mg，1.5mmol)。将所得混合物用氮气换气3次，然后在80℃下搅拌72小时。冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物用反相制备高效液相色谱纯化，得到目标产物1j(560mg，固体)，产率：99％。
MS m/z(ESI):413[M+1]
第九步
6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-(甲基-d3)哒嗪-3-羧酰胺(1)
将6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌1j(280mg，0.68mmol)、氘代甲胺盐酸盐(60mg，0.81mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(181mg，0.95mmol)、1-羟基苯并三唑(53mg，0.34mmol)、乙腈(3mL)、N-甲基吡咯烷酮和N-甲基咪唑(41mg，0.5mmol)的混合物加热至65℃并搅拌1小时。冷却至室温后，在减压条件下除去溶剂，残余物反相制备高校液相色谱纯化，得到目标产物1(44mg，固体)，产率：15％。
MS m/z(ESI):429[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),10.97(s,1H),9.13(s,1H),8.56(s,1H),8.15(s,1H),7.65(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.54–7.46(m,1H),7.32–7.22(m,1H),3.72(s,3H),2.12–2.03(m,1H),0.88–0.73(m,4H).
实施例2：6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-甲氧基-3-(1-(甲基-d3)-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-甲基哒嗪-3-羧酰胺(2)
化合物2参照实施例1的操作方法合成，但在第九步中用甲胺盐酸盐(CH3NH2·HCl)代替氘代甲胺盐酸盐(CD3NH2·HCl)。
MS m/z(ESI):426[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),10.97(s,1H),9.22–9.11(m,1H),8.56(s,1H),8.15(s,1H),7.66(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.51(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.31–7.22(m,1H),3.72(s,3H),2.86(d,J＝4.8Hz,3H),2.15–2.01(m,1H),0.87–0.75(m,4H).
实施例3：6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-甲基哒嗪-3-羧酰胺(3)
Figure BDA0003630582840000151
第一步
N-甲基甲酰肼
室温下向硫酸甲基肼3a(40g，277mmol)的甲醇(250mL)溶液添加甲醇钠(100g，554mmol)。将所得混合物搅拌24小时并过滤。然后向滤液中添加甲酸甲酯(17g，277mmol)，并在室温下搅拌18小时。减压除去溶剂，得到目标产物3b(22g，粗品)。该粗品无需进一步纯化即可直接用于下一步。
MS m/z(ESI):75[M+1]
第二步
5-氯-2-(甲氧基-d3)苯甲腈(3d)
室温下向5-氯-2-羟基苯甲腈3c(4g，26mmol)、碳酸钾(7.3g，53mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(30mL)的混合物中加入氘代碘甲烷(10g，78mmol)。将所得混合物加热至70℃并搅拌12小时。冷却至室温后，将反应混合物用水(200mL)稀释，并用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并的有机相用饱和盐水(2×100mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩至干，得到目标化合物3d(4.3g，固体)，产率：97％。
MS m/z(ESI):171[M+1]
第三步
3-(5-氯-2-(甲氧基-d3)苯基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑硫酸盐(3e)
0℃下向叔丁醇钾(11.3g，101mmol)的四氢呋喃(30mL)溶液中依次加入5-氯-2-(甲氧基-d3)苯甲腈3d(4.3g，25.3mmol)和N-甲基甲酰肼(4.1g，58mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液。室温下搅拌12小时后，向混合物中加入水(50mL)，加热至40℃并搅拌40分钟。冷却至室温后，分出有机相，用饱和盐水(40mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩至干。将残余物溶于乙酸乙酯(40mL)。室温下向所得溶液中缓慢加入浓硫酸(5g)并搅拌12小时。然后将混合物过滤并干燥，得到目标化合物(5.6g，固体)，产率：83％。
MS m/z(ESI):227[M+1]
第四步
3-(5-氯-2-(甲氧基-d3)-3-硝基苯基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑(3f)
0℃下向3-(5-氯-2-(甲氧基-d3)苯基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑硫酸盐3e(5.6g，24.7mmol)的硫酸(25g)溶液中加入硝酸(2g)。将所得溶液逐渐加热至室温，搅拌12小时，然后再次冷却至0℃。在0℃下将水(67mL)和甲醇(47mL)加入溶液中，然后加热至室温并搅拌1小时。将该溶液加热至40℃，并向其中加入氨水(42mL)。将溶液冷却至20℃，搅拌2小时，然后过滤。用水(2×30mL)洗涤固体，并在真空下干燥，得到目标化合物3f(3.37g，固体)，产率：50％。
MS m/z(ESI):272[M+1]
第五步
2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯胺(3g)
向3-(5-氯-2-(甲氧基-d3)-3-硝基苯基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑3f(3.37g，12.25mmol)的甲醇(10mL)溶液加入10％钯碳(400mg)和碳酸氢钠(1.6g，25mmol)。将所得混合物在氢气气氛下搅拌12小时，然后过滤。减压浓缩滤液至干，并将残余物溶于二氯甲烷(25mL)。将得到的混合物过滤，并将滤液减压浓缩至干，得到目标化合物3g(2.35g，固体)，产率：92％。
MS m/z(ESI):208[M+1]
第六步
6-氯-4-((2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌(3h)
室温下向4,6-二氯哒嗪-3-羧酸锂1h(3g，15.1mmol)、2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯胺3e(2.35g，11.3mmol)、异丙醇(2.5mL)和水(18mL)的混合物中加入醋酸锌(2.5g，13.6mmol)。将该混合物加热到65℃并搅拌12小时。冷却至室温后，用水(20mL)稀释，然后搅拌老化30分钟并过滤。所得固体用水(2×30mL)和四氢呋喃(2×30mL)洗涤，真空干燥后得到目标产物3f(4.3g，固体)，产率：100％。
MS m/z(ESI):364[M+1]
第七步
6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌(3i)
室温下将6-氯-4-((2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌3f(4.3g，11mmol)、环丙烷甲酰胺(2.4g，27.56mmol)、(2R)-1-[(1R)-1-[双(1,1-二甲基乙基)膦基]乙基]-2-(二环己基膦基)二茂铁(600mg，1.1mmol)、醋酸钯(125mg，0.55mmol)、甲苯(34mL)、乙腈(17mL)、碳酸钾(3.1g，22mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(1.7g，11mmol)混合，然后在氮气气氛下加热到80℃并搅拌12小时。冷却至室温后，依次加入乙酸水溶液(50％，17mL)和冰醋酸(40mL)。室温下搅拌1小时后，用石油醚(2×20mL)洗涤，然后加入水(50mL)并在室温下老化4小时，过滤。所得固体依次用乙腈水溶液(50％，20mL)和乙腈(20mL)洗涤，然后在65℃下真空干燥30分钟，得到目标产物3g(3g，固体)，产率：66％。
MS m/z(ESI):413[M+1]
第八步
6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-甲基哒嗪-3-羧酰胺
将6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌3g(1.5g，3.38mmol)、甲胺盐酸盐(280mg，4.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(900mg，4.73mmol)、1-羟基苯并三唑(230mg，1.7mmol)、乙腈(3mL)、N-甲基吡咯烷酮(3mL)和N-甲基咪唑(200mg，2.4mmol)混合，然后加热到65℃并搅拌12小时。反应完成后保持65℃，用水(1.5mL)和乙腈(4.5mL)淬灭反应。所得混合物在65℃下老化1小时，然后在0℃老化3小时并过滤。所得固体依次用乙腈水溶液(33％，4.5mL)和乙腈(4.5mL)洗涤，然后在65℃下真空干燥8小时，得到目标产物3(811mg，固体)，产率：56％。
MS m/z(ESI):426[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),10.97(s,1H),9.24–9.08(m,1H),8.57(s,1H),8.15(s,1H),7.66(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.52(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.33–7.20(m,1H),3.96(s,3H),2.87(d,J＝4.8Hz,3H),2.14–2.01(m,1H),0.91–0.73(m,4H).
可以通过以下步骤将化合物3转化为盐酸盐：
向反应烧瓶中加入3(5.00g，11.75mmol)和DMSO(27mL)。在搅拌的同时将所得混合物加热至50～55℃，直到固体完全溶解为均匀溶液为止。然后向混合物中加入浓盐酸(36％～38％，1.18g)，然后加水(3mL)和晶种(25mg)。将所得混合物在50～55℃下搅拌0.5小时，冷却至35～40℃，在0.5～1.0h内逐滴添加异丙醇(60mL)，并在35～40℃下搅拌0.5小时。将混合物在1小时内缓慢冷却至20～25℃，搅拌过夜，然后过滤。滤饼用异丙醇(2×15mL)洗涤，并在65℃减压干燥过夜，得到3的单盐酸盐(4.5g，固体)，产率：83％。
MS m/z(ESI):426[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.72(brs,1H),12.13(s,1H),11.40(s,1H),9.22(q,J＝4.5Hz,1H),8.87(s,1H),8.00(s,1H),7.78(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.61(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.35(t,J＝7.9Hz,1H),4.01(s,3H),2.89(d,J＝4.8Hz,3H),2.14–2.00(m,1H),1.00–0.84(m,4H).
实施例4：6-(环丙烷甲酰胺基)-4-((2-(甲氧基-d3)-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-(甲基-d3)哒嗪-3-羧酰胺(4)
化合物4参照实施例3的操作方法合成，但在第八步中用氘代甲胺盐酸盐(CD3NH2·HCl)代替甲胺盐酸盐(CH3NH2·HCl)。
MS m/z(ESI):429[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.32(s,1H),10.98(s,1H),9.14(s,1H),8.57(s,1H),8.15(s,1H),7.66(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.52(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.32–7.21(m,1H),3.96(s,3H),2.14–2.03(m,1H),0.89–0.75(m,4H).
实施例5：(S)-6-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰氨基)-4-((2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-(甲基-d3)哒嗪-3-羧酰胺(5)
Figure BDA0003630582840000191
第一步
(S)-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2,2-二氟环丙烷-1-甲酰胺(5b)
将化合物(S)-2,2-二氟环丙烷-1-羧酸5a(1.5g，12.3mmol)、HATU(5.7g，15mmol)、二异丙基乙胺(4.8g，37mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(15mL)混合，然后加入2,4-二甲氧基苄胺(4.0g，24.4mmol)。室温下搅拌3小时，减压除去溶剂，残余物用反相制备高效液相色谱纯化，得到目标产物5b(4.4g，固体)。
MS m/z(ESI):272[M+1]
第二步
(S)-2,2-二氟环丙烷-1-甲酰胺(5c)
将(S)-N-(2,4-二甲氧基苄基)-2,2-二氟环丙烷-1-甲酰胺5g(4.4g，12.2mmol)溶于三氟乙酸(10mL)中，加热到70℃并搅拌1小时。冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物用硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝100/0至9/1)纯化，得到目标产物5h(1.4g，固体)，产率：两步93％。
MS m/z(ESI):122[M+1]
第三步
3-(5-氯-2-甲氧基苯基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑(5d)
将叔丁醇钾(34g，290mmol)溶于四氢呋喃(200mL)中，冷却到0℃后依次加入5-氯-2-甲氧基苯甲腈(20g，120mmol)和N-甲基甲酰肼3b(22g，粗品)的溶液。室温下搅拌72小时后，加入水(500mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。有机相合并后，用饱和食盐水(2×300mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。过滤后，滤液在减压条件下除去溶剂，得到目标产物5d(17.1g，固体)，产率：88％。
MS m/z(ESI):224[M+1]
第四步
3-(5-氯-2-甲氧基-3-硝基苯基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑(5e)
0℃下向3-(5-氯-2-甲氧基苯基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑5d(16.13g，72mmol)的浓硫酸(72g)溶液中加入浓硝酸(8.5g，87mmol)。搅拌2小时后，将所得溶液在0℃下加到水(250g)和甲醇(150g)的混合溶液中。用氨水调节至pH>7后过滤，然后用水(2×100mL)洗涤固体。该固体用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝100/0至3/7)纯化，得到目标产物5e(17.1g，固体)，产率：88％。
MS m/z(ESI):269[M+1]
第五步
2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯胺(5f)
向3-(5-氯-2-甲氧基-3-硝基苯基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑5e(17g，63mmol)的甲醇(170mL)溶液中加入10％钯碳(3g)和碳酸氢钠(10.5g，126mmol)。混合物在氢气气氛下搅拌5小时后过滤。滤液减压浓缩至干，残余物用反相制备高校液相色谱纯化，得到目标产物5f(8.8g，固体)，产率：68％。
MS m/z(ESI):205[M+1]
第六步
6-氯-4-((2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌(5g)
向4,6-二氯哒嗪-3-羧酸锂1h(4.53g，22.87mmol)、2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯胺5f(5.6g，27.44mmol)、异丙醇(4.5mL)和水(34mL)的混合物中加入乙酸锌(4.2g，22.87mmol)。将反应混合物加热到65℃并搅拌12小时。冷却至室温后，用水(30mL)稀释，静置30分钟后过滤。将固体用水(2×30mL)和四氢呋喃(2×30mL)洗涤，干燥，得到目标产物5(7.6g，固体)。产率：93％。
MS m/z(ESI):361[M+1]
第七步
(S)-6-(2,2-二氟环-1-甲酰氨基)-4-((2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌(5h)
将6-氯-4-((2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌5k(1.6g，3.93mmol)、(S)-2,2-二氟环丙烷-1-甲酰胺5g(1.2g，9.8mmol)、(2R)-1-
[(1R)-1-[双(1,1-二甲基乙基)膦基]乙基]-2-(二环己基膦基)二茂铁(220mg，0.393mmol)、醋酸钯(44mg，0.196mmol)、甲苯(18mL)、乙腈(11mL)、碳酸钾(1.1g，7.8mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(600mg，3.93mmol)的混合物在氮气气氛下加热至80℃并搅拌72小时。冷却至室温后，混合物用乙酸(27mL)和水(9mL)稀释，然后用石油醚(2×30mL)洗涤。下层溶液分出后，加入水(50mL)，静置3小时。过滤后将固体干燥，得到目标产物5h(1.1g，固体)，产率：62％。
MS m/z(ESI):446[M+1]
第八步
(S)-6-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰氨基)-4-((2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-(甲基-d3)哒嗪-3-羧酰胺(5)
向(S)-6-(2,2-二氟环-1-甲酰氨基)-4-((2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)哒嗪-3-羧酸锌5h(1.1g，2.46mmol)、氘代甲胺盐酸盐(210mg，2.95mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(660mg，3.44mmol)、1-羟基苯并三唑(190mg，1.23mmol)、乙腈(6mL)和N-甲基吗啉(6mL)的混合物中加入N-甲基咪唑(141mg，1.72mmol)。将反应混合物加热至65℃并搅拌1小时。冷却至室温后，减压除去乙腈，残余物用反相制备高效液相色谱纯化，得到目标产物5(420mg，固体)，产率：37％。
MS m/z(ESI):462[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.52(s,1H),11.01(s,1H),9.18(s,1H),8.58(s,1H),8.09(s,1H),7.67(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.53(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.33–7.23(m,1H),3.95(s,3H),3.73(s,3H),3.13–2.97(m,1H),2.10–1.95(m,2H).
实施例6：(S)-6-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰氨基)-4-((2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-甲基哒嗪-3-羧酰胺(6)
根据实施例5的方法合成化合物6，但是要将步骤8中的氘代甲胺盐酸盐(CD3NH2·HCl)替换为甲胺盐酸盐(CH3NH2·HCl)。
MS m/z(ESI):459[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.52(s,1H),11.01(s,1H),9.20(d,J＝4.8Hz,1H),8.56(s,1H),8.09(s,1H),7.67(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.52(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.33–7.23(m,1H),3.95(s,3H),3.73(s,3H),3.11–2.98(m,1H),2.86(d,J＝4.8Hz,3H),2.10–1.94(m,2H).
实施例7：(R)-6-(2,2-二氟环丙烷-1-甲酰氨基)-4-((2-甲氧基-3-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)氨基)-N-(甲基-d3)哒嗪-3-羧酰胺(7)
根据实施例5的方法合成化合物7，但是要将步骤1中的(S)-2,2-二氟环丙烷-1-羧酸(5a)替换为(R)-2,2-二氟环丙烷-1-羧酸。
MS m/z(ESI):462[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.52(s,1H),11.01(s,1H),9.18(s,1H),8.56(s,1H),8.09(s,1H),7.67(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.53(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.28(m,1H),3.95(s,2H),3.73(s,3H),3.11-2.99(m,1H),2.10–1.95(m,2H).
实施例8：(R)-6-(2,2-difluorocyclopropane-1-carboxamido)-4-((2-methoxy-3-(1-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-yl)phenyl)amino)-N-methylpyridazine-3-carboxamide(8)
根据实施例5的方法合成化合物8，但是要将步骤1中的(i)(S)-2,2-二氟环丙烷-1-羧酸(5a)用(R)-2,2-二氟环丙烷-1-羧酸代替，而且要(ii)将步骤8中的氘代甲胺盐酸盐(CD3NH2·HCl)替换为甲胺盐酸盐(CH3NH2·HCl)。
MS m/z(ESI):459[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.52(s,1H),11.01(s,1H),9.27–9.16(m,1H),8.56(s,1H),8.09(s,1H),7.67(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.52(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.33–7.24(m,1H),3.95(s,2H),3.73(s,2H),3.11–2.99(m,1H),2.86(d,J＝4.8Hz,3H),2.08–1.95(m,2H).
实施例9：JAK2激酶结构域酶活性测定
本发明化合物对重组JAK2激酶结构域(JH1)酶活性的作用效果可通过使用HTRF激酶测定检测试剂盒(Cisbio，货号62TK0PEC)检测激酶反应中的底物磷酸化水平来评估(表1)。
实验方法概述如下：
反应缓冲液包含以下组分：试剂盒自带酶反应缓冲液(1×)、5mM MgCl2、1mM DTT和0.01％Brij35；人源重组JAK2蛋白(Carna Biosciences，货号08-045)用反应缓冲液稀释成0.15ng/μL的激酶溶液；底物反应溶液包括用反应缓冲液稀释成0.25μM的生物素标记的酪氨酸激酶底物和2.5μM ATP；检测缓冲液包括用反应缓冲液稀释成0.1ng/μL的Eu3+标记的笼状抗体(Cisbio，货号61T66KLB)和12.5nM链霉亲和素标记的XL665(Cisbio，货号610SAXLB)。
将待测化合物在DMSO中溶解稀释至1mM，然后用DMSO进行4倍的系列稀释至最低浓度为61nM，每个浓度点再使用反应缓冲液稀释40倍。
向384孔检测板(Corning，货号3674)中添加4μL化合物溶液和2μL JAK2激酶溶液，混合均匀后室温孵育15分钟。随后加入4μL底物反应溶液，将反应混合物在室温孵育30分钟。随后加入与反应等体积的10μL检测缓冲液，混合均匀并在室温条件下静置30分钟后，用Envision读板机(Perkin Elmer)在620nm和665nm波长下检测反应进程。665nm和620nM处吸光度的信号比值与底物的磷酸化程度呈正相关性，从而检测出JAK2激酶的活性。该实验中，未加JAK2激酶蛋白组作为100％抑制组，加JAK2激酶蛋白但是未加化合物组作为％抑制组。化合物对JAK2活性抑制百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(信号比值待测化合物-信号比值100％抑制组)/(信号比值0％抑制组-信号比值100％抑制组)
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为S型曲线的底部平台值，Top为S型曲线的顶部平台值，slope factor为曲线斜率系数。
实施例10：TYK2激酶结构域酶活性测定
本发明化合物对重组TYK2激酶结构域(JH1)酶活性的作用效果可通过使用HTRF激酶测定检测试剂盒(Cisbio，货号62TK0PEC)检测激酶反应中的底物磷酸化水平来评估(表1)。
实验方法概述如下：
反应缓冲液包含以下组分：试剂盒自带酶反应缓冲液(1×)、5mM MgCl2、1mM DTT、10nM SEB(Cisbio，货号61SEBALB)、0.625mM EGTA和0.01％Brij35；人源重组TYK2蛋白(Carna Biosciences，货号08-147)用反应缓冲液稀释成0.25ng/μL的激酶溶液；底物反应溶液包括用反应缓冲液稀释成0.5μM的生物素标记的酪氨酸激酶底物和11.25μM ATP；检测缓冲液包括用反应缓冲液稀释成0.1ng/μL的Eu3+标记的笼状抗体(Cisbio，货号61T66KLB)和25nM链霉亲和素标记的XL665(Cisbio，货号610SAXLB)。
将待测化合物在DMSO中溶解稀释至1mM，然后用DMSO进行4倍的系列稀释至最低浓度为61nM，每个浓度点再使用反应缓冲液稀释40倍。
向384孔检测板(Corning，货号3674)中添加4μL化合物溶液和2μL TYK2激酶溶液，混合均匀后室温孵育15分钟。随后加入4μL底物反应溶液，将反应混合物在室温孵育40分钟。随后加入与反应等体积的10μL检测缓冲液，混合均匀并在室温条件下静置30分钟后，用Envision读板机(Perkin Elmer)在620nm和665nm波长下检测反应进程。665nm和620nM处吸光度的信号比值与底物的磷酸化程度呈正相关性，从而检测出TYK2激酶的活性。该实验中，未加TYK2激酶蛋白组作为100％抑制组，加TYK2激酶蛋白但是未加化合物组作为0％抑制组。化合物对TYK2活性抑制百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(信号比值待测化合物-信号比值100％抑制组)/(信号比值0％抑制组-信号比值100％抑制组)
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为S型曲线的底部平台值，Top为S型曲线的顶部平台值，slope factor为曲线斜率系数。
实施例11：TYK2伪激酶结构域酶活性测定
本发明化合物与TYK2伪激酶结构域(JH2)的结合通过使用时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)，并通过与市售的荧光素标记探针(Alexa-Fluor 647-conjugated kinasetracer 178)竞争的生物化学方法测定(表1)。
实验方法概述如下：
反应缓冲液包含20mM Hepes pH 7.5、150mM NaCl，10mM MgCl2、0.015％Brij35、2mM DTT，0.625mM EGTA和100mM KF。TYK2的JH2结构域(完整蛋白质中氨基酸556-871)在清华大学蛋白质纯化和鉴定平台上表达和纯化。将测试化合物在DMSO中溶解至0.1mM，然后用DMSO连续4倍稀释至最低浓度为61nM。用反应缓冲液将每种浓度进一步稀释40倍。
向384孔测定板(Corning，货号4512)中添加5μL化合物溶液和5μLTYK2JH2结构域溶液(160nM)。将该混合物在室温下孵育30分钟，然后添加10μL荧光素标记的探针(ThermoFisher，货号PV5593)(20nM)和GST-Euro(Eu)标记的抗体(Cisbio，货号61GSTKLA)(40ng/mL)。在室温下进一步孵育30分钟后，在Envision读板仪(Perkin Elmer)上测量HTRF信号(发射波长分别为615nm和665nm的荧光强度比，分别对应荧光素受体和铕离子供体)。抑制百分比是根据以下公式与不含测试化合物的阳性对照和不含蛋白质的阴性对照进行比较得出的：
抑制百分比＝100-100*(信号待测化合物-信号阴性对照)/(信号阳性对照-信号阴性对照)
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为S型曲线的底部平台值，Top为S型曲线的顶部平台值，slope factor为曲线斜率系数。
表1
Figure BDA0003630582840000261
本发明的化合物对JAK2或TYK2的激酶结构域具有弱或低的抑制活性。表1显示，化合物2、3、4、7和8具有直接抑制激酶活性的IC50>10μM，而对照化合物的IC50较低，为2.9μM。测试化合物和对照化合物均与TYK2 JH2具有强结合力(IC50在nM范围内)。
实施例12：NK92细胞中IL-12诱导的IFN-γ分泌量抑制的测定
通过酶联免疫吸附(ELISA)方法评估本发明的化合物对IL-12诱导的NK92细胞中IFN-γ分泌量的影响(表2)。
IL-12受体主要在活化的T细胞、NK细胞(NK92是一种NK细胞系)、DC细胞和B细胞中表达。当与IL-12结合时，它激活NK细胞和T淋巴细胞内的JAK2/TYK2信号转导途径，从而诱导IFN-γ的分泌。
实验方法概述如下：
将待测化合物用DMSO溶解稀释至2.5mM，然后用DMSO进行4倍的系列稀释至最低浓度为0.31μM，每个浓度点再使用不含FBS的MEMα培养基(Gibco，货号12561-056)稀释50倍。
NK92细胞(南京科佰，货号CBP60980)在含有12.5％FBS(Ausbian，货号VS500T)、12.5％马血清(Gibco，货号16050-122)、0.02mM叶酸(Sigma，货号F8758)、0.2mM肌醇(Sigma，货号17850)、0.55mMβ-巯基乙醇(Gibco，货号21985-023)、200U/mL IL-2(R&DSystems，货号202-1L)和100U/mL青链霉素混合液(Thermofisher，货号15140122)的MEMα完全培养基中培养，当细胞在培养容器中覆盖率达80-90％时，将细胞吹散后种植于96孔板(Thermofisher，货号167425)，每孔100000细胞(80μL不含IL-2的MEMα完全培养基)，然后将96孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。
培养过夜后，每孔加入10μL稀释后的化合物，以及10μL 50ng/mL的IL-12(R&DSystems，货号219-1L)，轻轻混匀，然后将96孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。24小时后取出于室温800rpm离心10分钟，将50μL上清液转移至已包被了抗IFN-γ的抗体的96孔板(Sigma，货号CLS3695)，按照Human IFN-gamma DuoSet ELISA检测试剂盒(R&DSystems，货号DY285B)的方法检测IFN-γ的分泌量。其中，无刺激对照组不加IL-12和测试的化合物，用MEMα培养基替代(100％抑制)；刺激对照组加IL-12和0.2％DMSO(0％抑制)。化合物对NK92细胞中IL-12诱导的IFN-γ分泌量抑制的百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(信号值化合物-信号值无刺激对照)/(信号值刺激对照-信号值无刺激对照)
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为S型曲线的底部平台值，Top为S型曲线的顶部平台值，slope factor为曲线斜率系数。
表2
Figure BDA0003630582840000271
Figure BDA0003630582840000281
本发明的化合物对由TYK2诱导的NK92细胞中IFN-γ的分泌具有显着的抑制作用。
实施例13：大鼠体内药代动力学测定
本发明评价了化合物3和对照化合物BMS-986165的药代动力学。化合物3在苯环上具有OCD3，而对照化合物在酰胺部分上具有CD3。甲基通常在体内不稳定，在甲基酰胺的情况下会受到酰胺酶的水解，在甲氧基和甲基三唑的情况下会受到CYP的氧化脱甲基作用。用三氘代甲基取代甲基可改善化合物的生物利用度和体内暴露，并在相同剂量下提供更好的化合物功效。
以5mg/kg的剂量向三只雄性Sprague Dawley大鼠口服给予含0.5mg/mL的化合物3和对照化合物的5％N,N-二甲基乙酰胺+20％Solutol+75％生理盐水的溶液。给药后0.25、0.5、1、2、4、8和24小时收集血样。血浆中化合物的浓度通过使用API-4500质谱仪的LC-MS/MS进行定量。分析的定量限(LOQ)为1ng/mL。药代动力学(PK)参数是使用WinNonlin通过非房室方法计算的，并且体现在表3中。结果表明，本发明的化合物3具有比参考化合物更好的体内暴露。
表3
Figure BDA0003630582840000282
实施例14：抗CD40抗体诱导的结肠炎动物模型的体内药效评估
将购自北京维通利华实验室的雌性CB17-Scid小鼠(8-10周大，18-20g)随机分为5组(每组n＝8)。在第0天，通过在腹膜内注射100μg PBS中的FGK4.5抗CD40 mAb(BioXCell，货号EB0016-2)在小鼠中诱发结肠炎。从第0天到第7天开始，治疗组的小鼠每天两次口服给予在DMSO/solutol/PEG-400(10:5:30)溶媒中的0、1.5、5、15mg/kg化合物3或5mg/kg BMS-986165，而溶媒组的小鼠口服给予上述溶媒。每天对小鼠称重并监测结肠炎的体征，包括体重减轻以及随之而来的大便稀疏和腹泻。在第8天，对所有动物实施安乐死，收集脾组织并称重。结果表明，与溶媒组中的小鼠相比，1.5mg/kg，5mg/kg和15mg/kg剂量的化合物3和5mg/kg剂量的对照化合物在防止体重降低(图2，表4)和脾脏肿大(表4)方面显著地保护小鼠免于结肠炎。
表4
Figure BDA0003630582840000291
*体重的相对变化(RCBW)由公式RCBW(％)＝(BWx–BW0)/BW0×100％计算，其中BWx是第x天的平均体重而BW0是第0天的平均体重。SEM：平均值的标准误差。
应当理解，前述内容描述了本发明的优选实施例，并且可以在不脱离权利要求书所阐述的本发明的范围的情况下对其进行修改。

Claims (5)

1.一种化合物，为化合物3，或化合物2，或化合物1，或化合物4，或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0003890781770000011
2.根据权利要求1所述的化合物，为化合物3，或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1所述的化合物，为化合物2，或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1所述的化合物，为化合物1，或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1所述的化合物，为化合物4，或其药学上可接受的盐。
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