KR20220151968A - 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 dtc 유전자 개인 맞춤형 노화 방지용 화장료 조성물 - Google Patents
삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 dtc 유전자 개인 맞춤형 노화 방지용 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 개인 유전자 특성으로 인해 발생할 수 있는 노화를 방지하는 데 도움을 주는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 AGER과 MMP1 유전자에 의해 발현되는 노화를 일으키는 단백질의 생성을 저해하고, 콜라겐 생성을 촉진하는 삼백초 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 개인 유전자 특성으로 인해 발생할 수 있는 피부 노화를 방지하는 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 AGER과 MMP1 유전자에 의해 발현되는 노화를 일으키는 단백질의 생성을 저해하고, 콜라겐 생성을 촉진하는 삼백초 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 삼백초 추출물을 포함하여 AGER 유전자에 의한 세포 당화작용으로 일어나는 노화나 MMP1 유전자에 의해 발생하는 노화 촉진 단백질의 생성을 저해하여 노화를 예방하고 피부 주름 생성을 효과적으로 개선할 수 있다.
최근 개성을 중시하는 소비 트렌드의 확산으로 맞춤형에 대한 소비자의 관심과 수요가 증가하고 있다. 현대 소비문화는 대중의 니즈에 휩쓸리던 시대를 지나 개인의 개성과 가치에 따라 자신만의 취향을 추구하는 시대로 접어들고 있다. 이에 따라 산업 전반에서 ‘맞춤형 제품’을 겨냥한 다양한 제품과 마케팅이 쏟아져나오고 있다.
이러한 소비트렌드에 따라 화장품 업계에도 맞춤형 화장품 시장이 형성되고 있다. 맞춤형 화장품은 소비자의 피부 상태를 진단하고, 소비자의 요구사항에 맞추어 제품을 생산 판매하는 형태이며, 2018년 3월에 화장품법이 개정됨에 따라 그 범위가 더 명확해졌다. 또한 맞춤형화장품 업무에 종사하는 맞춤형화장품 조제관리사 제도를 도입함에 따라 소비자의 관심과 니즈가 더욱 증가하는 추세이다.
보건복지부에서 2016년부터 국민의 보건과 건강을 위해 유전형에 따라 생활 습관 개선 등에 도움을 주고자 12개 항목에 대한 DTC (Direct to Customer) 검사를 허용해 왔다.
DTC 유전자 검사는 의료기관이 아닌 유전자 검사기관이 소비자가 보낸 검체를 수집하여 분석하는 것을 의미한다. 단순히 분석에 그치지 않고 검사 결과에 따른 맞춤형 라이프 스타일을 제공함에 따라 소비자의 관심이 증가하고 있다. 최근 검사 허용 항목이 최대 70까지 확대됨에 따라 소비자의 관심은 더욱 증가할 것으로 예측된다. DTC 유전자 검사의 검사항목과 해당 유전자는 아래 표 1과 같다.
| 번호 | 검사항목(유전자수) | 유전자명 |
| 1 | 체질량지수(3) | FTO, MC4R, BDNF |
| 2 | 중성지방농도(8) | GCKR,DOCK7, ANGPTL3, BAZ1B, TBL2,MLXIPL, LOC108375745, TRIB1 |
| 3 | 콜레스테롤(8) | CELSR2, SORT1, HMGCR, ABO, ABCA1, MYL2, LIPG, CETP |
| 4 | 혈당(8) | CDKN2A/B, G6PC2, GCK, GCKR, GLIS3, MTNR1B, DGKB-TMEM195, SLC30A8 |
| 5 | 혈압(8) | NPR3, ATP2B1, NT5C2, CSK, HECTD4, GUCY1A3, CYP17A1, FGF5 |
| 6 | 색소침착(2) | OCA2, MC1R |
| 7 | 탈모(3) | chr20p11, IL2RA, HLA-DQB1 |
| 8 | 모발굵기(1) | EDAR |
| 9 | 피부노화(1) | AGER |
| 10 | 피부탄력(1) | MMP1 |
| 11 | 비타민C농도(1) | SLC23A1 |
| 12 | 카페인대사(2) | AHR, CYP1A1-CYP1A2 |
화장품 업계에서도 주름, 미백, 모발, 비만 등에 맞춤형 화장품을 제공하고 있으나, 유전자의 발현, 변형 등의 문제점을 해결하기 위한 수단은 전무한 실정이다. DTC 유전자 검사항목 중 화장품에 적용할 수 있는 항목은 색소침착, 탈모, 모발굵기, 노화 등이 있으며, 피부 노화와 관련된 유전자로는 AGER과 MMP1이 검사항목에 있다. 현재의 노화 방지 화장품은 콜라겐(collagen) 생합성이나 콜라게나제(collagenase) 발현 조절 소재에 한정되어 있다. 따라서 개인 DTC 유전자에 따른 맞춤형 화장품을 개발을 위해서는 단순 콜라겐 생합성이나 콜라게나제 발현 조절 소재에 한정하지 않고 유전자 수준에서의 조절을 통한 소재 개발이 필요하다.
피부 노화와 관련된 유전자 중 AGER 유전자 발현 이상 및 변이가 있는 경우, 피부에서 쉽게 당화가 발생하여 피부탄력을 유지하는 콜라겐, 엘라스틴 등의 변성, 손상을 일으키는 단백질의 발현을 촉진하며, 이로 인해 노화가 빠른 속도로 일어난다. MMP1 유전자 발현 이상 및 변이가 있는 경우, 피부탄력을 유지하는 콜라겐을 빠른 속도로 분해하는 단백질의 발현을 촉진하여 피부 탄력이 떨어진다. 이와 같이 개인 피부노화 유전자인 AGER, MMP1의 변형이나 이상 발현을 통해 피부의 탄력 및 기계적 특성을 부여하는 콜라겐이 변형되거나 분해되어 피부 노화에 결정적인 영향을 미친다.
현재의 맞춤형 화장품은 소비자의 피부측정이나 피부상태, 개인의 라이프스타일 등을 파악하여 피부 상태에 적합한 화장품을 제공하는 것을 의미한다. 일반적으로 정해져 있는 기본 제형에 제형의 변화가 없는 범위 내에서 소비자가 원하는 특정 성분을 혼합하여 제공된다. 개개인에 맞춘 다양한 화장품을 제조하기 위해서는 각 특성에 맞는 다양한 원료가 필요하다. 하지만 현재는 다양한 원료가 출시되어 있지 않기 때문에 일반적으로 알려진 특정 기능성 화장품 원료만을 혼합하는 실정이다.
한편, 본 발명의 삼백초 추출물과 관련하여, 한국등록특허 제10-1736725호에서는 삼백초 추출물에서 분리한 마나산틴 B(manassantin B)를 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 개시한다.
또한, 한국등록특허 제10-1482661호에서는 삼백초 추출물은 아비큘라린, 마나산틴 A, 마나산틴 B, 소서네올 D를 포함하며, 위염 억제 효과를 갖는다고 개시한다.
기존의 주름 개선 제품들은 노화와 연관되어 있는 콜라겐의 발현을 단백질 및 RNA수준에서 연구하여 일반적인 다수를 위한 화장품 개발에 한정되어 있는 반면에, 본 발명은 유전자 정보 즉 DTC 유전자 연구를 통해 각 개인에 맞는 개인 맞춤형 노화 방지용 화장품 원료를 제공하고자 한다. 따라서 본 발명은 개인 유전 특성에 따른 유전자의 문제로 야기되는 피부 문제를 해결하는 데 발판이 될 수 있을 것이다.
본 발명은, DTC 유전자 검사 항목 중 노화에 관련된 AGER과 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 억제하여 개인 피부 특성에 맞는 소재를 개발하는 것으로, 개인이 유전자 검사를 통해 진단된 유전자 발현 이상이나 변형으로부터 야기되는 문제를 해결할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 AGER 및 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 억제하는 삼백초 추출물을 개발하고 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 데 목적이 있다.
상기한 과제는, 삼백초 추출물에서 분리된 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하고, 개인 유전자 특성에 의해 유발되는 피부 노화를 방지하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 의해 달성된다.
바람직하게는, 상기 에틸아세테이트 분획물은 소서네올(saucerneol) D를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 에틸아세테이트 분획물은 AGER 유전자 또는 MMP1 유전자에 의해 발현되는 노화 촉진 단백질의 생성을 억제할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 에틸아세테이트 분획물은 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타낼 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 에틸아세테이트 분획물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.01 중량% 내지 20.0 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명에 따르면 소서네올 D를 포함하는 삼백초 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물은 DTC유전자 검사 항목 중 노화에 관련된 AGER과 MMP1유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 효과적으로 억제하여 개인 유전자에 의해 발생하는 피부 노화를 완화하는 데 우수한 효과를 나타낸다.
도 1은 HPLC를 이용하여 본 발명의 삼백초 추출물의 소서네올 D 함유 여부를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 삼백초 추출물 및 소서네올 D의 AGER 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 삼백초 추출물 및 소서네올 D의 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 도시한 것이다.
도 4는 AGER 및 MMP1 유전자에 의해 저해될 수 있는 콜라겐 생성 회복률이 본 발명에 따른 삼백초 추출물 및 소서네올 D에 의해 촉진되는 것을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 삼백초 추출물 및 소서네올 D의 AGER 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 삼백초 추출물 및 소서네올 D의 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 도시한 것이다.
도 4는 AGER 및 MMP1 유전자에 의해 저해될 수 있는 콜라겐 생성 회복률이 본 발명에 따른 삼백초 추출물 및 소서네올 D에 의해 촉진되는 것을 도시한 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가
기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이라는 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명은 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 DTC 유전자 개인 맞춤형 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.
삼백초(Saururus chinensis (Lour.) Baill.)는 어성초를 닮은 여러해살이풀로 잎에 흰 반점이 있으며, 꽃이 희고, 뿌리가 희다 하여 삼백초(三白草)라고 부른다. 삼백초(三百草)는 제주도를 비롯한 우리나라 남부지방의 숲 속 물기가 많은 땅에서 드물게 자라며, 키는 30~90센티미터이고, 뿌리는 희고 털이 있다. 삼백초는 변비, 당뇨병, 간장병, 암, 고혈압, 심장병, 부인병, 신장병 등 갖가지 성인병의 예방과 치료에 주목할 만한 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 삼백초의 유효물질인 퀘르세틴, 루틴 등 플라본계 물질은 은행잎 플라본계 물질 이상으로 모두 피를 맑게 하고, 많은 피를 전신의 각 조직 깊숙이 고루 공급해주는 말초동맥을 강화 보호하는 작용을 하며, 수용성 타닌은 DNA(유전자) 변이를 막는 작용이 있어 발암억제력이 크다는 연구가 있다.
본 발명은 삼백초 추출물에서 아세테이트 분획물을 분리하고, 상기 분획물에 포함된 소서네올 D를 확인하고, 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 삼백초 추출물을 유효성분으로 하는 화장료 조성물은 AGER과 MMP1유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 효과적으로 억제하며, 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타낸다.
본 발명의 AGER과 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 효과적으로 억제하는 삼백초 추출물의 제조방법은 아래의 단계를 포함하는 방법으로 도출할 수 있다:
(a) 소서네올 D를 함유하는 삼백초 추출물을 제조하는 단계;
(b) 상기 삼백초 추출물의 AGER 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 확인하는 단계;
(c) 상기 삼백초 추출물의 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 확인하는 단계; 및
(d) 상기 삼백초 추출물의 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인하는 단계 ;
이하, 본 발명에 대해 각 단계별로 상세히 설명하고자 한다.
단계 (a) : 소서네올 D를 함유하는 삼백초 추출물을 제조하는 단계
본 발명의 삼백초 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.
바람직하게는, 물, 탄소수 1 내지 4인 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용한 용매 추출법, 열수 추출법 및 초음파 추출법 중 선택되는 어느 하나의 추출법을 통해 추출된 것이다. 바람직하게는 본 발명의 삼백초 추출물은 삼백초 전초의 분쇄물을 70 %(v/v) 에탄올로 추출하여 용매 추출물을 제조하고, 이를 에틸 아세테이트를 이용하여 분획한 에틸 아세테이트 분획물이며, 바람직하게는 유효성분으로 소서네올 D를 포함한다.
단계 (b) : 삼백초 추출물의 AGER 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 확인하는 단계
상기 삼백초 추출물은 소서네올 D를 포함하며, 세포 당화를 일으켜 노화를 촉진시키는 AGER 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성을 효과적으로 억제하는 것을 특징으로 한다.
단계 (c) : 삼백초 추출물의 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 확인하는 단계
상기 삼백초 추출물은 소서네올 D를 포함하며, 피부 탄력을 유지하는 콜라겐을 빠르게 분해하는 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성을 효과적으로 억제하는 것을 특징으로 한다.
단계 (d) : 삼백초 추출물의 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인하는 단계
상기 삼백초 추출물은 소서네올 D를 포함하며, 피부 탄력을 유지하는 콜라겐의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 한다.
상기 삼백초 추출물은 AGER 유전자와 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 효과적으로 억제하며, 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 DTC 유전자 개인 맞춤형 노화 방지용 화장료 조성물이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 삼백초 추출물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.01 중량% 내지 20.0 중량%로 포함될 수 있다. 상기 삼백초 추출물의 함량이 0.01중량% 미만인 경우에는 피부 노화 방지 효과가 나타나지 않으며, 20.0중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부 노화 방지 효과 증대 정도가 미미하고, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며, 경제적이지 않다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.001 내지 30중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림 또는 클렌징 폼의 제형으로 제조될 수 있다.
한편, 하기 실험예에 의하면, 본 발명의 삼백초 추출물이 효과적으로 AGER과 MMP1유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 억제하고, 콜라겐 생성을 촉진하여 노화에 도움을 주는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 삼백초의 70 %(v/v) 에탄올 추출물 제조
건조 및 분쇄된 삼백초 전초 500g을 상온의 70 %(v/v) 에탄올 5000g에 8시간 추출한 다음, 여과지(Whatman No. 2)로 여과한 후 농축하여 50g의 농축물을 수득하였다.
실시예 2: 삼백초 추출물의 에틸 아세테이트 분획물 제조
상기 실시예 1에서 얻은 삼백초 에탄올 추출농축물 50g을 정제수에 현탁한 다음, 에틸 아세테이트를 이용하여 통상적인 방법으로 분획을 실시한 후 감압농축하여 에틸 아세테이트 분획물 3.4g을 수득하였다. 상기 에틸 아세테이트 분획물 0.5g을 부틸렌글라이콜에 완전히 용해한 다음, 여과지(Whatman No. 2)로 여과하여, 아래 실험예에 사용하였다.
실험예 1 : 삼백초 에틸아세테이트 분획물의 유효성분 분리 및 분석
상기 실시예 2에서 얻어진 삼백초 에틸 아세테이트 분획물 0.1g을 정밀하게 달아 메탄올을 녹여 10ml로 한 액을 가지고 검액으로 한다. 따로 소서네올 D(C31H36O8: 536.6) 표준품을 10mg 정밀하게 달아 메탄올에 녹여 100ml로 하고, 다시 이 액을 1/2, 1/4로 희석하여 표준액으로 하였다. 검액 및 표준액 10㎕씩을 가지고 HPLC 분석하여 Saucerneol D 함량을 측정하였다.
HPLC를 통한 분석은 2998 PDA detector가 장착된 HPLC 시스템(Waters 1525 Binary HPLC Pump, 2707 Autosampler)을 이용하였다. 고정상으로는 안지름 약 4.6 ㎜, 길이 약 25 ㎝인 스테인레스관에 5 ㎛의 액체크로마그래프용 옥타데실실릴화한 실리카 겔을 충전한 것을 사용하였다. 이동상으로는 0.5% 포름산(formic acid; A)과 메탄올(methanol; B)의 혼합용액을 이용하였으며, 0.5% 포름산 30%, 메탄올 70%의 비율로 진행하였다. 유속은 분당 1.0 ml이었고, 자외선 검출기의 검출파장은 260 nm로 설정하였다. HPLC 분석결과를 도 1 에 나타내었다.
도 1을 보면, 실시예 2에서 제조된 삼백초 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 소서네올 D를 포함하는 것을 확인할 수 있다.
실험예 2: 소서네올 D와 실시예 3 삼백초 추출물의 AGER 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과
인간 피부 섬유아 세포(HDFn)를 6 well plate에 3 x 105 cells/well로 분주하고 37oC, 5% CO2 세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. UVA를 1 J/cm2로 조사하여 자극을 유발한 후 시료를 농도별로 처리하고 6 시간 동안 반응시킨 후 scraper를 이용하여 세포를 수집하였다. 1 x 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. Gel상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 blocking하였다. 1 x TTBS 용액으로 3 회 세척하고 1차 항체(AGER)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1 x TTBS로 3 회 세척하고 ECL용액을 반응시켜 Chemi Doc 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 AGER 발현 억제율을 계산하였으며 Image J 1.47 software를 이용하여 수치화하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 도시되는 바와 같이 소서네올 D는 3 μg/ml 농도부터 통계적으로 유의한 억제 효능을 나타내었으며, 소서네올 D를 함유하는 삼백초 추출물 역시 10 μg/ml 농도부터 AGER 발현을 유의적으로 억제하였다. 소서네올 D와 소서네올 D를 함유하는 삼백초 추출물 모두 농도 의존적으로 AGER의 발현을 억제하여 각각 최대 54.2%, 66.7% AGER의 발현을 억제하였다.
실험예 3 : 소서네올 D와 실시예 2 삼백초 추출물의 MMP1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과
인간 피부 섬유아 세포(HDFn)를 6 well plate에 3 x 105 cells/well로 분주하고 37oC, 5% CO2 세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. UVA를 1 J/cm2로 조사하여 자극을 유발한 후 시료를 농도별로 처리하고 6 시간 동안 반응시킨 후 scraper를 이용하여 세포를 수집하였다. 1 x 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. Gel상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 blocking하였다. 1 x TTBS 용액으로 3 회 세척하고 1차 항체(MMP1)를 4℃에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1 x TTBS로 3 회 세척하고 ECL용액을 반응시켜 Chemi Doc 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 MMP1 발현 억제율을 계산하였으며 Image J 1.47 software를 이용하여 수치화하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3은 소서네올 D와 실시예 2의 삼백초 추출물에 대한 MMP-1 발현 억제율 결과이다. 도 3에 도시되는 바와 같이 소서네올 D 및 소서네올 D를 함유하는 삼백초 추출물 모두 3 μg/ml 농도부터 통계적으로 유의하게 MMP1의 발현을 억제하였으며 각각 최대 83.3%, 58.3% MMP1의 발현을 억제하였다.
실험예 4 : 소서네올 D와 실시예 2 삼백초 추출물의 콜라겐 생성 회복 효과
인간 피부 섬유아 세포(HDFn)를 1×105cells/well의 농도로 24 well-plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 안정화시켰다. FBS free 배지로 교환한 후 UVA를 1 J/cm2로 조사하여 자극을 유발하고 시료를 농도별로 처리하여 24 시간 동안 반응시켰다. 양성대조군으로 10 ng/ml농도의 TGF-β를 사용하였다. 24시간 후에 상층액을 수집하고 procollagen type I peptide EIA kit를 사용하여 콜라겐(collagen) 발현량을 확인하였다. Collagen ELISA assay 후 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 생성된 콜라겐 양을 계산한 후, 대조군과 비교하여 콜라겐 발현 회복율(%)을 계산하였다.
도 4는 소서네올 D와 실시예 2의 삼백초 추출물에 대한 콜라겐 생성 회복 평가 실험 결과이다. 도4에 도시되는 바와 같이 소서네올 D는 1 μg/ml 농도부터 통계적으로 유의하게 콜라겐 생성 회복 효능을 나타내었으며, 소서네올 D를 함유하는 삼백초 추출물은 1 μg/ml 농도부터 콜라겐 생성을 회복시켰다. 소서네올 D와 소서네올 D를 함유하는 삼백초 추출물 모두 농도 의존적으로 콜라겐 생성을 회복시켜 UV 조사군과 비교하여 각각 최대 183.3%, 183.4% 콜라겐 발현 회복율을 보였으며 양성대조군인 TGF-β와 비교하여 1.2배 이상 높은 콜라겐 회복 효능을 보였다.
제조예 1 : 실시예 2의 삼백초 추출물을 함유하는 노화 방지용 화장료 조성물 제조
상기 실시예 2의 삼백초 추출물을 3 중량% 포함된 노화 방지용 화장료 조성물은 하기 표의 조성으로 설명하나, 여러 가지 제형으로 응용 가능하다. 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 한다.
본 제형예의 화장료 조성물은 아래 표 2의 함량에 따라 화장료를 제조하였다.
| 구분 | 성분 |
제형예 1
(중량%) |
비교제형예 1
(중량%) |
| A | 실시예 2 | 3.0 | - |
| EDTA-2Na | 0.02 | 0.02 | |
| 정제수 | to 100 | to 100 | |
| B | 세토스테아릴알코올 | 2.0 | 2.0 |
| 글리세릴스테아레이트 | 1.5 | 1.5 | |
| 마이크로크리스탈린 | 0.7 | 0.7 | |
| 스쿠알란 | 5.0 | 5.0 | |
| 유동파라핀 | 3.0 | 3.0 | |
| 트리옥타노인 | 5.0 | 5.0 | |
| 폴리솔베이트 | 1.2 | 1.2 | |
| 솔비탄스테아레이트 | 0.5 | 0.5 | |
| 토코페릴아세테이트 | 0.2 | 0.2 | |
| 사이클로메치콘 | 3.0 | 3.0 | |
| BHT | 0.05 | 0.05 | |
| C | 향,방부제 | 적량 | 적량 |
| 합계 | 100 | 100 |
실험예 5 : 삼백초 추출물을 포함하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물의 주름 개선 효능 분석
본 실험예에서는 상기 제형예 1의 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물과 비교제형예 1의 삼백초 추출물을 함유하지 않는 화장료 조성물을 비교하여 삼백초 추출물의 주름 개선 효능을 알아보고자 하였다.
임상 실험을 위하여, AGER유전자의 발현율이 60% 이상인 피험자 40명을 무작위로 20명씩 2개 그룹(A, B)으로 나눈 후, A 그룹을 대상으로 제형예 1의 화장료 조성물을, B 그룹을 대상으로 비교제형예 1의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 도포하였다. 이후, 피부 주름의 변화를 확인하기 위해 기기적 평가와 육안 평가를 함께 진행하였다. 기기적 평가는 PRIMOS(Primos Lite system 45x30mm, Canfield Scientific Inc, USA)를 이용한 피부 거칠기 촬영과 PRIMOS Software(PRIMOS Lite version 5.8E)를 이용한 피부 표면 거칠기 분석을 수행하였다. PRIMOS의 피부 표면 거칠기 분석 변수로는 Ra, R3z, Rq, Rz, Rmax를 선정하였다. Ra(Arithmetic roughness average)는 PRIMOS로 측정된 주름의 굴곡의 절대값들에 대한 산술 평균값을 의미하며, Rq(Quadratic roughness average)는 Ra의 값을 제곱평균제곱근의 방법으로 구한 값을 의미한다. R3z(Base roughness depth)은 주름 단면도를 다섯개의 길이로 균등하게 분할한 후 그 중 세 번째로 높은 산과 세 번째로 낮은 골간의 5개의 거리의 산술 평균값을 의미한다. Rz(Roughness)는 주름의 단면도에서 임의의 선을 긋고 가장 높은 다섯 개의 산과 기준선으로부터 가장 낮은 다섯 개의 골의 기준선부터의 거리에 대한 산술 평균값을 의미하며, Rmax(Maximal ruughness)는 주름의 단면 중 중심선에서 가장 높은 산과 가장 깊은 골을 사이의 단일 평가 거리를 의미한다. 측정 변수의 분석값이 작아질수록 피부 주름의 깊이가 낮아짐을 의미하며 단위는 ㎛이다.
육안 평가는 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 주름 개선 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 4와 표 5에 나타내었다. 표 4는 주름 개선 효능의 기기적 평가 결과를, 표 5는 주름 개선 효능의 육안 평가 결과를 나타내었으며, 이때 육안 평가는 주름 개선 효능 정도를 다음의 표 3의 주름 개선 효능 평가 기준에 따라 분류하여 평가하였다.
| -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 |
| 매우 악화 | 악화 | 약간 악화 | 변화 없음 | 약간 개선 | 개선 | 매우 개선 |
| 피검자 | 제품 사용 8주 후 PRIMOS 화상분석 결과 (μm) | |||||||||
| A 그룹 | B 그룹 | |||||||||
| Ra | R3z | Rq | Rz | Rmax | Ra | R3z | Rq | Rz | Rmax | |
| 1 | 25.0 | 55.7 | 30.6 | 119.5 | 166.3 | 18.9 | 45.7 | 23.3 | 92.9 | 116.1 |
| 2 | 21.1 | 44.3 | 26.0 | 103.7 | 165.4 | 17.1 | 41.3 | 21.1 | 87.9 | 113.7 |
| 3 | 16.6 | 41.8 | 20.8 | 85.7 | 111.1 | 17.0 | 41.6 | 21.0 | 85.7 | 112.6 |
| 4 | 18.0 | 38.1 | 22.8 | 92.1 | 123.7 | 18.3 | 45.1 | 22.6 | 92.0 | 120.0 |
| 5 | 21.2 | 48.7 | 26.2 | 107.4 | 139.0 | 18.1 | 44.8 | 22.3 | 91.7 | 116.6 |
| 6 | 21.2 | 50.7 | 25.8 | 103.4 | 131.1 | 20.8 | 49.8 | 25.7 | 102.8 | 147.2 |
| 7 | 13.5 | 31.8 | 16.8 | 69.6 | 88.2 | 16.1 | 37.4 | 19.8 | 80.1 | 108.0 |
| 8 | 24.9 | 51.1 | 30.3 | 118.3 | 165.1 | 27.1 | 57.1 | 33.7 | 131.5 | 186.8 |
| 9 | 12.1 | 30.9 | 15.1 | 62.3 | 84.6 | 15.4 | 34.2 | 19.0 | 76.1 | 107.5 |
| 10 | 19.1 | 44.7 | 23.6 | 93.4 | 127.4 | 21.3 | 50.6 | 26.7 | 109.6 | 146.5 |
| 11 | 16.2 | 38.7 | 19.9 | 79.1 | 107.0 | 17.3 | 42.2 | 21.2 | 83.9 | 116.7 |
| 12 | 19.0 | 44.9 | 23.5 | 94.7 | 132.9 | 18.8 | 43.4 | 23.3 | 94.0 | 129.9 |
| 13 | 22.2 | 53.2 | 27.3 | 106.2 | 136.2 | 18.5 | 40.5 | 23.0 | 92.4 | 123.4 |
| 14 | 17.0 | 40.1 | 21.0 | 86.2 | 110.1 | 21.0 | 50.9 | 25.9 | 106.1 | 143.6 |
| 15 | 24.1 | 54.7 | 29.5 | 115.5 | 160.5 | 22.9 | 57.6 | 28.3 | 110.4 | 141.8 |
| 16 | 25.3 | 59.8 | 30.7 | 119.4 | 156.8 | 25.5 | 55.7 | 31.4 | 123.3 | 163.6 |
| 17 | 14.4 | 33.4 | 17.8 | 72.6 | 96.3 | 6.7 | 42.1 | 20.5 | 83.7 | 109.9 |
| 18 | 19.6 | 47.9 | 24.3 | 98.0 | 132.1 | 24.0 | 59.8 | 29.6 | 119.2 | 155.0 |
| 19 | 18.8 | 41.3 | 23.5 | 96.6 | 130.0 | 19.8 | 48.4 | 24.5 | 98.2 | 128.5 |
| 20 | 18.8 | 44.3 | 23.1 | 93.0 | 125.0 | 19.0 | 45.9 | 23.5 | 94.2 | 122.9 |
| 평균 | 19.41 | 44.81 | 23.90 | 95.84 | 127.94 | 19.68 | 46.71 | 24.32 | 97.79 | 130.52 |
| 0주차 평균 | 19.79 | 45.87 | 24.40 | 97.96 | 131.77 | 19.69 | 46.17 | 24.28 | 97.10 | 130.52 |
실험 결과, 기기적 평가 결과에서 A그룹은 모든 측정 변수의 분석값이 작아지는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 피검자의 주름의 깊이가 낮아짐, 즉 주름이 옅어짐을 확인할 수 있었다. B그룹의 경우 모든 변수에서 분석값이 크게 달라지지 않음을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물의 주름 개선 효과를 확인할 수 있었다.
| 피검자 | 숙련자의 객관적 평가(ΔL) | 피검자의 주관적 평가(ΔL) | ||
| A 그룹 | B 그룹 | A 그룹 | B 그룹 | |
| 1 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| 2 | 1 | 1 | 2 | 0 |
| 3 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| 4 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| 5 | 2 | 0 | 2 | 1 |
| 6 | 1 | 1 | 1 | 0 |
| 7 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| 8 | 2 | 2 | 1 | 2 |
| 9 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| 10 | 1 | 2 | 1 | 0 |
| 11 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 12 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| 13 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 14 | 2 | 1 | 2 | 2 |
| 15 | 1 | 2 | 1 | 1 |
| 16 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| 17 | 1 | 1 | 1 | 0 |
| 18 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| 19 | 1 | 0 | 1 | 0 |
| 20 | 2 | 1 | 1 | 1 |
| 평균 | 1.55 | 1.15 | 1.35 | 0.85 |
육안 평가 결과 역시 A그룹에서 주름 개선 효과를 확인할 수 있었다. 숙련자에 의한 주름 개선 평가에서 숙련자에 의한 주름 개선 평가에서 A그룹은 1.55, B 그룹은 1.15 이었으며, 피검자에 의한 주름 개선 평가에서는 A그룹은 1.35, B 그룹은 0.85 로 나타났다. 이를 통해, 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물의 주름 개선 효과를 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (5)
- 삼백초 추출물에서 분리된 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하고, 개인 유전자 특성에 의해 유발되는 피부 노화를 방지하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 소서네올(saucerneol) D를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 AGER 유전자 또는 MMP1 유전자에 의해 발현되는 노화 촉진 단백질의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.01 중량% 내지 20.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210059332A KR102683032B1 (ko) | 2021-05-07 | 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 dtc 유전자 개인 맞춤형 노화 방지용 화장료 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210059332A KR102683032B1 (ko) | 2021-05-07 | 삼백초 추출물을 유효성분으로 포함하는 dtc 유전자 개인 맞춤형 노화 방지용 화장료 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220151968A true KR20220151968A (ko) | 2022-11-15 |
| KR102683032B1 KR102683032B1 (ko) | 2024-07-10 |
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