KR20220151286A

KR20220151286A - 아니카 발효 추출물을 이용한 소염진통 조성물

Info

Publication number: KR20220151286A
Application number: KR1020210058330A
Authority: KR
Inventors: 최미정
Original assignee: 주식회사 바이오의생명공학연구소
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2022-11-15
Also published as: KR102587456B1

Abstract

본 발명은 아니카 몬타나(Arnica Montana)의 발효 추출물을 이용한 소염진통 조성물을 개시한다. 상기 발효 추출물은 아니카 몬타나(Arnica Montana) 및 브이 아말라(Bhuiamala)를 이용한 초음파 추출물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 것으로, 이를 알코올로 추출하여 소염진통 효과를 제공한다.

Description

아니카 발효 추출물을 이용한 소염진통 조성물 {ANTI―INFLAMMATORY PAIN COMPOSITION USING BACTERIA FERMENTATION-MICROWAVE EXTRACT OF ARNICA ANGUSTIFOLIA}

본 발명은 아니카의 발효 추출물을 이용한 삠, 타박상, 근육통, 관절통, 골절통, 요통, 어깨결림, 신경통, 류마티스 통증, 피부가려움, 벌레물린데, 동창 치료능을 발현할 수 있는 소염진통 조성물에 관한 것이다.

아니카 몬타나(Arnica Montana)는 국화과 국화목에 속하는 아니카 몬타나의 꽃으로서 고원의 풀밭에서 자라며, 높이는 20∼30cm이다. 잎은 뿌리에서 나와 사방으로 퍼지고 줄기에서는 마주달린다. 끝에서 가지가 갈라져서 두화(頭花)가 1∼3개 달린다. 꽃은 6∼7월에 노란 색으로 피며 지름 6∼8cm이고 전체적으로 선모와 털이 빽빽이 난다. 꽃과 뿌리줄기는 쓴맛이 있으며 정유와 수지가 들어 있다. 유럽의 민간에서는 옛날부터 꽃과 뿌리줄기를 만능약으로 사용하였다. 한방에서도 협심증의 자극, 혈관확장, 혈관경련 완화, 타박상·치질 등의 지혈제로 사용한다. 본 발명의 아니카 몬타나는 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 수피, 가지, 꽃, 뿌리, 열매, 줄기 등) 중 전초를 사용한다.

브이 아말라(Bhui amala)는 학명 필란투스 니루리(Phyllanthus niruri)의 열대 식물로, 부드럽고 연한 녹색을 띠는 초본 식물이다. 황달, 만성 이질, 소화불량, 기침, 당뇨, 요로 질환, 피부 질환, 궤양,및 부기를 비롯한 다양한 질병에 대한 전통 의학에서 사용되어 왔다. 필란투스 니루리는 전체 식물로서 수확 및 사용될 수 있거나, 또는 선택적으로 식물의 하나 이상의 부분(예를 들어, 식물의 꽃, 종자, 뿌리, 근경, 줄기, 열매 및/또는 잎)이 사용될 수 있다. 필란투스 니루리 식물 또는 그 부분은, 예를 들어, 분쇄 또는 밀링에 의해서 분말로 미분될 수 있다. 그러나, 브이 아말라의 소염 진통 성능과 관련하여 문헌 어디에도 개시되거나 공개된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 아니카와 브이 아말라에 대한 연구를 하던 중, 삠, 타박상을 비롯한 소염진통능을 발현할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국 공개특허 제2016-0070947호

본 발명의 목적은 아니카 몬타나(Arnica Montana)의 발효 추출물을 이용한 삠, 타박상, 근육통, 관절통, 골절통, 요통, 어깨결림, 신경통, 류마티스 통증, 피부가려움, 벌레물린데, 동창 치료능을 동시에 발현하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 하기 설명된 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

아니카 몬타나(Arnica Montana) 및 브이 아말라(Bhuiamala)를 이용한 초음파 추출물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 소염진통 조성물을 제공한다.

상기 분말 또는 추출물은 발효물을 알코올 추출시켜 수득될 수 있다.

상기 알코올 추출은 리플럭스 하에 60 내지 70℃ 에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것일 수 있다.

상기 초음파 추출물은 2200 내지 2500 MHz의 주파수에서 10 내지 20분간 추출할 수 있다.

상기 발효균주는 Enterococcus faecium(KCTC 13225) 또는 Lactobacillus plantarum(KCTC 11322)일 수 있다.

상기 소염진통은 삠, 타박상, 근육통, 관절통, 골절통, 요통, 어깨결림, 신경통, 류마티스 통증, 피부가려움, 벌레물린데, 또는 동창 치료능일 수 있다.

본 발명에 따르면, 삠, 타박상, 근육통, 관절통, 골절통, 요통, 어깨결림, 신경통, 류마티스 통증을, 피부가려움, 벌레물린데, 또는 동창 부위에 소염 진통 성능을 통해 통증 완화가 가능한 아니카의 발효 추출물의 분말이나 추출물을 유효성분으로 하는 소염진통 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플 4종에 대해 세포생존율 평가결과를 대비한 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플 4종에 대해 NO 농도 평가결과를 대비한 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플 4종에 대해 사이토카인 농도 평가결과를 정량화한 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플 4종을 사용한 콜라겐유도 관절염 마우스에서 관절염 위중도 평가결과를 대비한 그래프이다.
도 5는 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플 4종을 사용한 콜라겐유도 관절염 마우스에서 사이토카인 농도를 대비한 그래프이다.

이하 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 발명을 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 점을 감안하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 아니카 몬타나(Arnica Montana) 및 브이 아말라(Bhuiamala)를 이용한 초음파 추출물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물을 제조할 경우 그 분말이나 그 추출물이 삠, 타박상, 근육통, 관절통, 골절통, 요통, 어깨결림, 신경통, 류마티스 통증, 피부가려움, 벌레물린데, 또는 동창 치료능을 발현하는 것을 확인함으로써 완성된 것이다.

아니카 미발효 추출물은 에탄올 추출물, 아니카 초음파 추출물 뿐 아니라 초음파 추출과 에탄올 추출을 모두 수행한 추출물에 대해서도 소염진통효과를 충분히 나타내지 않았으며, 또한 아래의 실험예에서 제시되어 있지 않지만, 아니카 몬타나(Arnica Montana) 및 브이 아말라(Bhuiamala)를 이용한 고상의 건조물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물의 분말이나 그 추출물도 근 기능 증진효과를 충분히 나타내지 않았다.

본 발명의 세포생존율, NO 농도, 사이토카인 농도, 콜라겐유도 관절염 동물모델에서 관절염 및 사이토카인 농도를 이용한 소염진통을 구현하는 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 소염진통 조성물은 아니카 몬타나(Arnica Montana)에 브이 아말라(Bhuiamala)의 1:0.5~1.5의 중량비로 혼합한 다음 초음파 추출하고 발효균주로서 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 유산균을 접종하여 얻어진 발효물의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 기재에서 유효성분은 달리 특정하지 않는 한, 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

상기 초음파 처리는 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 처리법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격 효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출 효율을 증가시킬 수 있다.

초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 일례로 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

후술하는 실시예에서 보듯이, 초음파 처리 이후 알코올 추출하는 경우 보다 개선된 소염진통 성능을 제공하는 점에서 초음파 처리시 용매로 알코올을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 초음파 추출은 2200 내지 2500 MHz의 주파수에서 10 내지 20분간 수행할 수 있다. 이 경우에 유효물질 추출효율 증대를 제공할 수 있다.

상기 초음파 추출물의 발효물을 알코올 추출시켜 수득될 수 있다.

상기 초음파 추출물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 유산균을 10⁴ 내지 10⁷ CFG/g, 구체적인 예로 10⁵ 내지 10⁶ CFG/g로 첨가한다.

본 발명에서, 상기 발효균주는 아래의 실시예에서 사용된 Enterococcus faecium(KCTC 13225) 또는 Lactobacillus plantarum(KCTC 11322)인 것인 소염진통 조성물을 제공하기에 바람직하며, 이외에도 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 등도 대체 혹은 배합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 발효균주는 상기 접종 전 아니카 몬타나(Arnica Montana) 추출물로 활성화된 유산균, 구체적으로 아니카 물(열수 포함) 추출물과 당릴 등의 탄소원이 포함된 배지에 유산균을 접종, 배양시켜 얻어진 것을 사용할 수도 있다. 본 발명자들은 아래의 실험예에서 제시하지는 않았지만 아니카 물(열수 포함) 추출물로 활성화된 유산균을 사용할 경우 초음파 추출물(분쇄물)의 심부까지 발효가 진행될 것으로 보고 있다. 이러한 아니카 물(열수 포함) 추출물로 활성화된 유산균은 아니카 물 추출물과 탄소원이 포함된 배지를 제조하고 여기에 유산균을 접종하여 얻어질 수 있는데, 이때 탄소원은 당업계에 공지된 임의의 탄소원, 예를 들어 올리고당, 유당, 포도당, 과당, 설탕, 당릴, 덱스트로스, 전분, 글루코스, 프럭토즈, 만노오스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스 및 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 배지에의 첨가량인 1 내지 10%(w/v) 범위일 수 있으며, 또한 배지에는 질소원이나 미량 원소가 0.1 내지 3%(w/v) 범위로 더 포함될 수 있는데, 질소원으로는 암모니아, 암모늄염, 우레아, 아미노산, 대두박, 대두 단백질, 효모 추출물, 육즙 등을 들 수 있고, 미량원소로는 K, Mg, Na, Co, Mo, Ca, Mn, Zn, Cu, Fe, P, S 등을 들 수 있다. 또한 배양은 25 내지 40℃ 또는 35 내지 37℃에서 12시간 내지 2일 정도 수행될 수 있다.

본 발명에서, 상기 접종 후의 배양은 15 내지 45℃, 30 내지 40℃ 또는 35 내지 37℃에서 수행될 수 있다. 배양온도가 상기 범위보다 낮을 경우 발효 속도가 느려지거나 원치않는 부산물이 생겨날 수 있으며, 배양 온도가 상기 범위보다 높은 경우에도 발효 미생물의 사멸에 따라 마찬가지로 발효 속도가 느려지거나 원치않는 발효 부산물이 생겨날 수 있다. 배양 시간은 1일 내지 7일 정도, 또는 2일 내지 5일 정도 수행될 수 있다.

그런 다음 임의의 공지 방법에 따라 원심분리하여 상등액을 추출하며, 이렇게 수득된 상등액으로부터 추출물을 추출할 수 있다.

이때 전술한 상등액(즉, 발효물의 상등액)의 추출물은 달리 특정하지 않는 한, 추출 대상인 발효물 상등액 자체를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다.

본 기재에서는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 고온 하에 추출하는 것이 최적의 유효성분 추출조건을 제공하기에 적절하다. 바람직하게는 리플럭스 하에 수행할 수 있다. 이때 고온은 일례로 85℃ 이하, 구체적인 예로 50 내지 80℃일 수 있고, 추출 시간은 이에 한정하는 것은 아니나, 12시간 이하, 구체적인 예로 1 내지 6시간 동안 반복하여 추출할 수 있다. 상기 반복 추출 횟수는 5회 이하, 구체적인 예로 2 내지 3회일 수 있다.

또한, 환류 추출을 진행하여 수증기는 반응기 내로 되돌리고 나머지 가스들은 배출하는 것이 추출효율을 극대화할 수 있어 바람직하다.

분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합, 정치시켜 얻은 분획물, 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다.

상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 부탄올 등) 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물의 의미한다.

본 기재에서, 결과 추출물의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 환(pills) 형태, 과립 형태, 가루 형태를 비롯한 분말 또는 기타 추출물 형태일 수 있다.

본 기재에서 상기 아니카 몬타나(Arnica Montana)와 그리고 브이 아말라(Bhuiamala)은 깨끗이 세정한 다음 고상물 형태로 얻어질 수 있다. 깨끗이 세정한 후에는 자연건조(음건), 열풍건조 등 임의의 방식으로 건조됨으로써 수분의 일부가 제거된 후에(고상물의 수분 함량이 10%(w/w) 이하가 되도록 분쇄물 형태로) 10 내지 50 메쉬, 구체적으로는 30 내지 50 메쉬로 파쇄한 다음 유산균 발효에 사용될 수 있다.

나아가, 분쇄물 형태를 그대로 또는 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용될 수 있으며, 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용하는 것이 유효성분의 증대 효과를 제공할 수 있어 바람직하다.

본 발명의 소염진통 조성물은 그 유효성분 이외에 분산제와 담체를 포함하여 제조될 수 있다.

해당 분산제로는 물, 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 글리세린 등), 케톤(예를 들어, 아세톤, 메틸에틸케톤 등), 에테르(예를 들어, 디옥산, 테트라하이드로푸란, 셀로솔브, 디에틸렌글리콜 디메틸에테르 등), 지방족 탄화수소(예를 들어, 헥산, 케로센 등), 방향족 탄화수소(예를 들어, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 나프탈렌, 메틸나프탈렌 등), 할로겐화 탄화수소(예를 들어, 클로로포름, 카본 테트라클로라이드 등), 산 아마이드(예를 들어, 디메틸포름아마이드), 에스터(예를 들어, 메틸아세테이트 에스터, 에틸아세테이트 에스터, 부틸아세테이트 에스터, 지방산글리세린 에스터 등), 니트릴(예를 들어 아세토니트릴 등), 계면활성제(예를 들어, 고급알코올 설페이트 에스터, 알킬설폰산, 알킬알릴설폰산, 4급암모늄염, 옥시알킬아민, 지방산에스터, 폴리알킬렌옥사이드 화합물, 무수소르비톨 화합물 등)을 들 수 있으며, 단독으로 또는 2종 이상 혼합되어 본 발명의 항균용 조성물에 포함되어 제조될 수 있다.

필요에 따라서는 상기 발효물에 전술한 분산제를 적용하고 포집체, 포집 응집체, 또는 이의 추출물을 제조하는데 사용할 수도 있다. 구체적으로 아래의 실시예에서 처럼 발효물의 포집응집 상등액에 무게 대비 10 내지 20배의 60 내지 70% 에탄올을 투입하고 70℃에서 3시간 동안 환류관을 연결하여 추출할 수 있다. 얻어진 추출액은 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한 다음 3시간 동안 진공 및 상온에서 농축하여 추출물로 제공될 수 있다.

담체의 경우, 점토(예를 들어, 카올린, 벤토나이트, 산 점도 등), 활석(예를 들어 활석 분말, 납석 분말 등), 실리카(예를 들어 규조토, 규산 무수물, 운모 분말 등), 알루미나, 황 분말, 활성탄 등이 예시될 수 있으며, 이들 담체도 단독 또는 2종 이상 혼합물로 본 발명의 소염진통 조성물에 포함되어 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 소염진통을 필요로 하는 용도로 다양하게 사용될 수 있다. 구체적인 효과 또는 그 용도는 삠, 타박상, 근육통, 관절통, 골절통, 요통, 어깨결림, 신경통, 류마티스 통증, 피부가려움, 벌레물린데, 또는 동창 치료능으로 이해될 수 있다.

소염진통 조성물의 구체적인 액제화 또는 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있는 기술을 다양하게 적용할 수 있다.

전술한 소염진통 조성물로 파악될 경우, 해당 조성물은 제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 클렌징, 오일, 분말 파우더, 유탁액 파우더, 왁스 파우더, 유용제, 레이 등의 제품 형태를 띨 수 있다.

전술한 소염진통 조성물의 경우에는 그 유효성분 이외에 통상적으로 이용되는 성분들, 예를 들어 용매, 안정화제, 용해화제, 유탁화제, 희석제, 현탁제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

예를 들어, 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아마이드 파우더 등이 사용될 수 있고, 특히 스프레이의 경우에는 클로로플루오로하이드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 용매, 용해화제 또는 유탁화제로는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질알콜, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스터, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄의 지방산 에스터 등이 이용될 수 있다.

상기 희석제 또는 현탁제로는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제가 사용되거나 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨에스터, 폴리옥시에틸렌 소르비탄에스터와 같은 현탁제, 또는 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로도 파악될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 파악될 경우 그 약리효과 또는 그 용도는 소염진통 치료로 이해될 수 있다.

나아가, 전술한 양태 이외에 소염진통이 발현될 것이 요구되는 용도라면 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 소염진통 조성물, 약제학적 조성물은 해당 분야에 공지된 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에서 통상적으로 행해지는 해당 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

본 기재의 소염진통 조성물을 설명함에 있어서, 명시적으로 기재하지 않은 다른 조건이나 장비 등은 당업계에서 통상적으로 실시되는 범위 내에서 적절히 선택할 수 있고, 특별히 제한되지 않음을 명시한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정하는 것은 아니다.

[실시예]

<실시예 1> 발효아니카 추출물의 제조

아니카 몬타나(Arnica Montana), 브이 아말라(Bhuiamala)을 각각 구입하였다.

(1)아니카 몬타나(Arnica Montana), 브이 아말라(Bhuiamala)을 깨끗이 세정한 후 건조하여 40 메쉬로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g)으로 혼합하였다.

(2)상기 건조한 원료에 중량 대비 10배의 70% 에탄올을 투입하고 마이크로웨이브 추출기(Soxwave 100 제품, 210W 설정후 안정화)를 2,450 MHz의 주파수에서 15분간 추출하였다.

(3)상기 초음파 추출물에 Enterococcus plantarum(KCTC 11322)]]을 10⁶ CFU/g의 농도로 혼합 접종하여 30℃에서 3일간 발효시켰다.

(4)상기 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하고 그 무게 대비 10 배의 70% 에탄올을 투입하고 70 ℃에서 3시간 리플럭스 하에 추출하였다.

(5)상기 추출을 3회 반복하고 얻어진 추출액을 여과하고 얻어진 추출액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 발효 아니카 추출물(샘플 AB-4)을 제조하였다.

<비교예 1> 비발효아니카 추출물의 제조1

(4')상기 건조한 원료에 중량 대비 10배의 70% 에탄올을 투입하고 70 ℃에서 3시간 리플럭스 하에 추출하였다.

(5)상기 추출을 3회 반복하고 얻어진 추출액을 여과하고 얻어진 추출액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 발효 아니카 추출물(샘플 AB-1)을 제조하였다.

<비교예 2> 비발효아니카 추출물의 제조2

(5')얻어진 추출액을 여과하고 얻어진 추출액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 발효 아니카 추출물(샘플 AB-2)을 제조하였다.

<비교예 3> 비발효아니카 추출물의 제조3

(4")상기 초음파 추출물에 그 무게 대비 10 배의 70% 에탄올을 투입하고 70 ℃에서 3시간 리플럭스 하에 추출하였다.

(5)상기 추출을 3회 반복하고 얻어진 추출액을 여과하고 얻어진 추출액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 발효 아니카 추출물(샘플 AB-3)을 제조하였다.

<실험예>

<실험예 1> 세포생존율 평가시험

상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 세포생존율 평가실험을 외부 항원정보를 T 세포에 전달하여 세포매개면역반응을 하는 면역반응에 중추적인 역할을 하는 큰포식세포를 사용하여 수행하였다.

해당 실험은 실시예 1 및 비교예 1 내지 3의 세포독성을 확인하기 위하여 각각 100 μg/ml, 500 μg/ml, 1,000 μg/ml 농도에서 큰포식세포인 Raw 246.7 cell의 세포생존율을 확인하였다.

구체적으로, 마우스의 큰포식세포주인 RAW 264.7 cell을 100 IU/mL 페니실린, 100 IU/mL 스트렙토마이신, 10 % 소태아혈청 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37 ℃, 5 % 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

RAW 264.7 cell을 96-well plate에 3x10⁴ cell/well의 농도로 분주한 후, 37 ℃, 5 % 이산화탄소배양기에서 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고, 시험물질(AB-1~4)을 PBS(phosphate buffered saline)에 희석하여 0, 100, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 처리하고 well당 20 μL의 MTT 용액((4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)을 첨가하여 4시간 동안 반응시킨다. 이후 100 μL의 DMSO를 처리하고 1시간 후, microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 흡광도 값을 이용하여 세포생존율을 비교한다. 평가 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보듯이, 큰포식세포에서 실험물질의 세포독성은 무처리 군의 세포생존율(cell viability: 100 %)을 기준으로 비교한 결과, 0 ~ 1,000 μg/ml 농도에서 모든 실험물질의 세포생존율이 95 % 이상으로 확인되었다.

따라서 실시예 1 뿐 아니라 비교예 1 내지 3의 경우 또한 큰포식세포에서 세포독성에 대한 영향이 없는 것을 알 수 있다.

<실험예 2> NO 농도 평가시험

상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대하여 0 ~ 1,000 μg/ml 농도에서 산화질소 생성능(NO 농도)에 대한 영향을 미치는지에 대하여 확인하였다. 참고로, NO의 농도가 정상범위 이상일 경우 염증질환을 유발하기 때문에 NO의 농도를 정상범위로 유지시키는 것이 중요하므로, LPS 처리를 통하여 RAW 246.7 cell의 NO 생성을 유도한 대조군과 실험군을 비교함으로 생성된 NO의 감소여부를 확인하였다.

RAW 264.7 cell을 96-well plate에 3x10⁴ cell/well의 농도로 분주한 후, 1 μg 37 ℃, 5 % 이산화탄소배양기에서 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고, 염증유도 물질인 LPS 1 μg/mL와 시험물질(AB-1~4)을 PBS(phosphate buffered saline)에 희석하여 0, 100, 250, 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 재배양하였다. 배양액의 상측액을 얻어 같은 양의 그리스 시약(0.5% 설파닐아미드, 2.5 % 인산 및 0.5 % 나프틸에틸렌아민)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시키고, 540 nm에서 흡광도를 측정한다. NO의 농도는 아질산염의 표준곡선과 비교하여 계산하였다. 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

하기 도 2에서 보듯이, Raw cell 246.7 cell에 LPS를 처리한 대조군과 실험군(AB-1~4)을 24 시간 배양 후, NO 농도를 비교한 결과, 대조군의 NO 농도가 가장 높은 것으로 분석되었으며 실험군은 실험물질의 농도가 증가할수록 NO 농도가 감소하는 경향이 확인되었다.

NO 농도는 실시예 1 및 비교예 1 내지 3 모두 500 μg/ml 에서 가장 크게 감소하였으며, 특히 실시예 1의 경우 3.8±0.7 μM로 가장 낮은 농도로 확인되었으며, 비교예들 중에서는 비교예 3, 비교예 2, 비교예 1의 순서로 각각 5.0±1.0 μM, 5.6±0.5 μM, 6.0±0.4 μM로 분석되었다.

<실험예 3> 사이토카인 농도 평가시험

사이토카인은 큰포식세포가 외부 항원에 의해 활성화 되었을 때, 분비되는 신호전달 물질이다. LPS 처리를 통하여 RAW 246.7 cell의 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 생성을 유도한 대조군과 실험군을 비교함으로 생성된 사이토카인의 감소여부를 확인하였다.

구체적으로, 세포배양액 내의 염증관련 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 생성량 평가를 위하여 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 세포를 96-well plate에 3x10⁴ cell/well의 농도로 분주한 후, 1 μg 37 ℃, 5 % 이산화탄소배양기에서 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고 염증유도 물질인 LPS 1 μg/mL와 시험물질(AB-1~4)을 PBS(phosphate buffered saline)에 희석하여 0, 100, 250, 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 재배양하였다. 이후 상등액을 채취한 뒤, 각 사이토카인에 반응하는 항체를 부착시킨 96-well plate에 분주하여 2시간 반응 시킨다. 이후 detection antibody, Sav-HRP reagent, substrate solution을 넣어 반응 후, 반응정지액을 넣고 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 결과를 하기 도 3에 나타내었다.

하기 도 3에서 보듯이, Raw cell 246.7 cell에 LPS를 처리한 대조군과 실시예 1과 비교예 1 내지 3을 24 시간 배양 후, L-1β, IL-6, TNF-α 생성량을 비교한 결과, LPS만 처리한 대조군의 L-1β, IL-6, TNF-α 농도가 가장 높은 것으로 분석되었다.

실시예 1과 비교예 1 내지 3은 모두 실험물질의 양이 증가할수록 L-1β, IL-6, TNF-α 농도가 감소하는 경향이 확인되었다.

NF-α 농도는 500 μg/ml 농도에서 가장 크게 감소하였으며, 특히 실시예 1에서 528.9±39.9 μg/ml로 가장 낮은 농도로 확인되었다. 비교예들 중에서는 비교예 3, 비교예 2, 비교예 1의 순서로 각각 427.0±30.7 μg/ml, 549.2±15.4 μg/ml, 528.9±19.3 μg/ml로 분석되었다.

IL-1β, IL-6 생성량은 500 μg/ml 농도에서 가장 크게 감소하였으며, 특히 실시예 1에서 5.2±1.2 μg/ml, 112.2±15.0 μg/ml로 가장 낮은 농도로 확인되었다. 비교예들 중에서는 비교예 3, 비교예 1, 비교예 2의 순서로 각각 6.5±1.3 μg/ml와 135.8±13.7 μg/ml, 8.9±1.1 μg/ml와 166.1±21.1 μg/ml, 8.5±1.5 μg/ml와 155.9±22.3 μg/ml으로 IL-1β로 분석되었다.

<실험예 4> 콜라겐 유도 관절염 마우스에서 관절염 위중도 평가시험

실험물질은 세포실험을 통하여 대조군 대비 NO의 농도 및 사이토카인 감소량이 높은. 실시예 1과 비교예 3의 샘플을 선정하여 류마티스관절염의 대표적인 동물모델 방법인 콜라겐유도관절염 마우스를 통하여 관절염 위중도를 평가하였다.

위중도 평가는 관절염이 유도된 3주부터 6주까지 마우스의 발가락 및 발등, 발목에 부종과 홍조 발생여부를 비교하여 관절염 발생률, 발목의 두께와 증상의 경중을 점수로 평가하여 관절염위중도를 평가하였다.

<콜라겐유도관절염 동물모델 제작>

6주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰 쥐를 구입하여 물과 고형사료를 충분히 공급시켜 실험실환경(온도 22±2℃, 습도 55±5% 12시간 명암주기)에 적응시켜 관리한다. 마리당 150 μg의 제 2형 콜라겐과 2 mg/mL 농도의 complete Freund's adjuvant를 1:1로 혼합하여 마우스 꼬리 기저부 1 cm 아래쪽의 피내투여한다. 3주뒤 100 μg의 제 2형 콜라겐과 incomplete Freund's adjuvant를 1:1로 혼합하여 마우스 꼬리 기저부 1 cm 아래쪽에 피내투여하여 콜라겐유도관절염(Collagen induced arthritis, CIA)을 유도하였다.

실시예 1과 비교예 3의 샘플을 500 mg/kg/day 총 6주간 경구 투여하였으며, 대조군은 생리식염수를 투여하였다. 각 군 당 10마리씩 총 3군으로 분류하였다.

구체적인 예로, 콜라겐유도관절염 2차 주사 이후 일주일에 1회씩 육안으로 실험 마우스들의 2개의 앞발과 2개의 뒷발의 발적과 부종의 발생 유무를 관찰하여 각 시기별 관절염 발생율 및 관절염의 위중도를 평가하였다.

위중도 평가는 실험군과 대조군에 대한 정보를 알지 못하는 관찰자에 의하여 평가되었다. 각 다리당 관절염의 위중도는 0∼3점으로 분류하였다. 0점은 발에 아무런 증상이 나타나지 않은 정상적인 상태이며, 1점은 발가락, 발등, 발목 등에서 한군데라도 최소한의 종창이나 홍조가 유발된 상태, 2점은 발가락, 발등, 발목중 두군데 이상에서 확실한 부종과 홍조가 발생한 상태, 3점은 발가락에서 발목전부위에 걸쳐서 상당한 부종과 종창이 관찰되거나 강직으로 발을 자유로이 이용하지 못하는 상태로 규정하였다. 마우스에서 관절염점수가 2점 이상인 경우를 관절염이 발생한 것으로 간주하였다. 발목의 두께는 electrical caliper를 사용하여 부종이 가장심한 부위에서 측정을 하였다. 평가는 6주 동안 진행하였다. 결과를 하기 도 4에 나타내었다.

하기 도 4에서 보듯이, 실시예 1과 비교예 3 모두 대조군보다 저감되었으며, 특히 실시예 1의 샘플은 비교예 3의 샘플을 사용한 경우에 비해 관절염 위중도가 저감되는 것을 알 수 있다.

<실험예 5> 콜라겐 유도 관절염 마우스에서 사이토카인 농도 평가시험

상기 실험예 4의 관절염위중도 평가를 마친 콜라겐유도관절염 마우스를 희생하여 얻은 혈액으로 대조군 및 실험물질(AB-3, 4)의 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)을 ELISA를 통하여 확인하였다.

구체적으로, 실험동물로부터 전혈을 얻은 뒤 4℃ 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리한다. 혈청에 존재하는 염증관련 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 생성량 평가를 위하여 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 각 사이토카인에 반응하는 항체를 부착시킨 96-well plate에 분주하여 2시간 반응 시킨다. 이후 detection antibody, Sav-HRP reagent, substrate solution을 넣어 반응 후, 반응정지액을 넣고 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.

하기 도 5에서 보듯이, 콜라겐유도관절염 마우스에서 IL-1β, IL-6, TNF-α의 농도는 실시예 1과 비교예 3 모두 대조군보다 함량이 낮게 분석되었다. 이는 세포실험의 사이토카인 농도 결과와 경향성이 일치하였으며, 콜라겐유도관절염 마우스의 관절염위중도의 감소를 통하여 사이토카인이 감소한 것으로 확인된다.

나아가, 실시예 1의 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 함량은 각각 207.9±22.6 pg/mL, 139.2±25.5 pg/mL, 21.9±9.6 pg/mL으로 대조군 대비 IL-1β, IL-6, TNF-α 함량 460.4±71.2 pg/mL, 586.4±82.2 pg/mL, 107.7±26.7 pg/mL과 비교하여 감소한 것을 확인하였으며, 비교예 1의 샘플과 비교하여 더욱 저감된 것으로 분석되었으며, 이러한 결과는 전술한 실험예 4의 관절염위중도 평가와 경향성이 일치하였다.

결론적으로, 아니카 몬타나(Arnica Montana) 및 브이 아말라(Bhuiamala)를 이용한 초음파 추출물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 경우, 수득된 조성물은 삠, 타박상, 근육통, 관절통, 골절통, 요통, 어깨결림, 신경통, 류마티스 통증, 피부가려움, 벌레물린데, 동창 치료능을 동시에 발현하여 개선된 소염진통효과를 필요로 하는 적용처에 적합함을 확인할 수 있었다.

Claims

아니카 몬타나(Arnica Montana) 및 브이 아말라(Bhuiamala)를 이용한 초음파 추출물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 소염진통 조성물.
제1항에 있어서,
상기 분말 또는 추출물은 발효물을 알코올 추출시켜 수득된 것인 소염진통 조성물.
제2항에 있어서,
상기 알코올 추출은 리플럭스 하에 60 내지 70℃ 에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것인 소염진통 조성물.
제1항에 있어서,
상기 초음파 추출물은 2200 내지 2500 MHz의 주파수에서 10 내지 20 분간 추출한 것인 소염진통 조성물.
제1항에 있어서,
상기 발효균주는 Enterococcus faecium(KCTC 13225) 또는 Lactobacillus plantarum(KCTC 11322)인 것인 소염진통 조성물.
제1항에 있어서,
상기 소염진통은 삠, 타박상, 근육통, 관절통, 골절통, 요통, 어깨결림, 신경통, 류마티스 통증, 피부가려움, 벌레물린데, 또는 동창 치료능인 것인 소염진통 조성물.