KR20220150776A

KR20220150776A - 혈액 응고 활성을 갖는 펩타이드와 이의 용도

Info

Publication number: KR20220150776A
Application number: KR1020210058155A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 조미희; 권경난
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2021-05-04
Filing date: 2021-05-04
Publication date: 2022-11-11
Also published as: JP2024514093A; CN117255796A; EP4335860A1; KR102647642B1; WO2022234963A1

Abstract

본 발명은 pH 조건에 따라 겔화되는 특성이 있는 신규한 서열의 펩타이드에 관한 것으로, 상기 펩타이드는 혈액의 응고를 유도할 수 있는바 상기 펩타이드를 포함하는 조성물은 지혈을 유도하기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

혈액 응고 활성을 갖는 펩타이드와 이의 용도{Peptides having blood coagulation activity and use thereof}

본 발명은 혈액의 응고를 유도할 수 있는 신규 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

혈관계는 동물 내에서 각종 영양소를 운반하고 산소나 이산화탄소를 운반하는 중요한 역할을 하며, 혈관과 조직 사이에서 혈액과 체액이 서로 교환된다. 그런데, 피부 조직이나 혈관 등에 손상이 발생할 경우 혈액 및 체액이 외부로 유출될 수 있는데 이러한 출혈이 과다할 경우 산소의 운반 등이 정상적으로 이루어지지 않아 죽음에까지 이를 수 있어, 출혈을 감소시키기 위한 지혈 방법들이 개발되어 왔다.

생체 내에서는 자체적으로 혈액의 응고를 유도하는 시스템이 갖추어져 있는데, 효소 반응 통해 형성되는 트롬빈과 이로부터 만들어지는 피브린 섬유에 의해 혈구 세포가 엉겨붙어 혈전 또는 혈병을 형성하면서 혈액이나 체액 성분의 유출을 억제시켜 지혈이 일어날 수 있다. 그러나, 깊고 큰 상처의 발생으로 인해 출혈이 과다하게 발생할 경우 생체의 응고 시스템만으로는 충분히 지혈되지 않을 수 있으며, 외과적 수술시 수반될 수밖에 없는 과도한 출혈을 조절해야 할 필요성도 크기 때문에 효과적으로 지혈하기 위한 방법과 지혈 활성을 갖는 물질에 대한 수요는 언제나 높다고 할 수 있다.

종래 지혈을 목적으로 활용되는 제품의 성분으로, 키토산, 콜라겐, 전분, 밀랍 등이 이용되어 왔으며 이를 파우더, 스폰지, 시트, 겔 형태 등으로 제조해 적용하고 있다. 한국 공개특허공보 제2018-0027126호에서는 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 조성물을 이용해 지혈 효과를 유도하였다.

그런데, 지혈을 위한 제제들은 기본적으로 손상, 상처가 발생한 부위에 적용되는 것이라는 점에서 생체에 무해한 성분이어야 하며 용혈 현상과 같은 부작용을 일으키지 않아야 한다. 종래 의료기기로 개발되어 있는 키토산, 폴리머 등을 이용한 지혈 제품은 지혈 효능이 미미하며, 생체에 적용 후 잔여물을 체내에서 분해하거나 배출해야 하는 문제점이 있고 잔여물에 의해 염증 반응이 유발될 수 있다. 또한, 종래 혈액 응고 기전을 가진 생물학적 의약품 제제의 경우, 생체 유래의 성분이므로 제조 및 운송/보관이 용이하지 않다는 단점이 있으며, 사용 전 해동 과정이 요구되거나 1제와 2제의 혼합 후 이용해야 하는 등 적용하기 위해 오랜 시간이 필요해 사용성이 좋지 않다는 단점을 가진다. 따라서, 제조 및 보관 안정성이 뛰어나고 지혈 효능이 우수하면서도, 생체 구성 성분인 아미노산 성분을 활용해 합성한 혈액 응고 촉진용 펩타이드 제제의 개발이 필요한 실정이다.

한국 공개특허공보 제2018-0027126호

본 발명은 특정 조건에서 겔화되어 혈액의 응고를 유도하기 위해 이용될 수 있는 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 펩타이드를 이용하여 효과적으로 지혈을 유도할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 지혈하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, pH 의존적 겔화 특성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 펩타이드를 포함하는, 지혈 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 출혈이 발생한 동물의 출혈 부위에 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 지혈 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 펩타이드는 중성 pH 조건에서 스스로 겔화되는 특성이 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 특정 pH 조건에서 겔화되어 응집체를 형성할 수 있으며 이에 따라 상기 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 혈액 또는 체액에 처리하였을 때, 혈액 내 pH 조건에 의해 상기 펩타이드의 겔화가 진행될 수 있다. 상기 펩타이드는 혈구 세포와 함께 응집되거나 상기 펩타이드의 겔화에 의해 형성된 나노섬유 구조가 혈구 세포 및 혈구 이외의 혈액 성분을 둘러싸 가두어 덩어리를 형성함에 따라, 침전되거나 혈액의 흐름이나 유출을 방해하여 지혈이 유도되도록 하는 효과가 있다.

본 발명의 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물은, 종래 시판되는 지혈제와 비교할 때 유사한 수준으로 혈액의 응고를 유도하는 활성이 있으며 지혈 시간을 단축시키는 효과가 우수한 특징이 있으며, 또한 용혈 작용을 유발하지 않으므로 지혈을 유도하기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

특히, 산성 조건에서는 겔화가 진행되지 않고 액체 또는 졸(sol)의 형태를 나타낼 수 있는바, 본 발명의 펩타이드 및 조성물은 실제 혈액 또는 체액에 적용되기 이전에는 산성 pH 조건을 유지함에 따라 유동성을 가져 보관하거나 적용하기에 더 적합한 성상을 나타낼 수 있다. 그리고 혈액이나 체액에 적용되었을 때 이의 중성 pH에 따라 겔화가 진행되어 실제 출혈 부위에서 효율적으로 지혈 효과를 나타낼 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물은 생체를 구성하는 아미노산 성분으로 제조되는 것이므로, 생체에 적용하였을 때 부작용이나 분해/배출의 문제점이 발생할 가능성이 적다는 장점이 있으며, 이에 따른 염증반응의 발생 가능성이 낮다. 그리고 종래 지혈용 제제와 비교할 때 제조가 용이하고 보관 안정성이 뛰어난 효과가 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 pH 변화에 따라 본 발명의 펩타이드가 나타내는 광산란 세기 kcps 값 및 입자 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 염(NaCl) 농도 변화에 따라 본 발명의 펩타이드가 포함된 용액의 광학밀도 값(OD 600)을 측정하여 나타낸 그래프와, 염 농도에 따른 상기 용액의 형태를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드의 농도 차이에 따라 나타나는 겔화 정도의 차이를 비교하여 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드가 포함된 조성물을 농도 별로 쥐로부터 채취한 적혈구 현탁액과 혼합하여 관찰한 혈구 응집 시험 결과이다. 원으로 표시된 부분은 혈구가 침전되지 않고 혈전을 형성하기 시작한 농도의 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드가 포함된 조성물을 이용해 혈액 응고 시험을 수행한 결과로, 13초 경과 후에 혈액의 응고가 일어났음을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드가 포함된 조성물을 이용해 혈액 응고 시험을 수행한 결과로, 원심분리시킨 시료의 상층액의 광학밀도를 측정해 비교한 결과이다. 증류수를 처리한 음성대조군(DW)의 수치를 기준으로 상대적인 수치를 나타냈으며, 그린플라스트(GreenplastQ) 및 RADA16 펩타이드 제제를 처리한 군이 대조군으로 사용되었다.
도 7은 본 발명의 펩타이드가 포함된 조성물이 나타내는 지혈 효과에 대한 동물 실험 결과로, 아무것도 처리하지 않은 대조군(No Treatment), 그린플라스트를 처리한 대조군(Greenplast Q), 그리고 본 발명의 펩타이드를 각각 1% 및 2.5%의 농도로 처리한 군의 출혈 부위 사진과 출혈량, 출혈 시간 수치를 나타낸 것이다. 아무런 처리를 하지 않은 대조군의 경우 출혈 시작 후 90초 후 출혈량을 측정하였다.
도 8은 본 발명의 펩타이드가 포함된 조성물이 나타내는 지혈 효과에 대한 동물 실험 결과로, 아무것도 처리하지 않은 대조군(NC), 그린플라스트를 처리한 대조군(Greenplast Q), 그리고 본 발명의 펩타이드를 각각 1% 및 2.5%의 농도로 처리한 군의 출혈 시간 수치를 비교하여 나타낸 그래프이다. 아무런 처리를 하지 않은 대조군의 경우 출혈 시작 후 약 90초 후 실험을 중단하였다.
도 9는 본 발명의 펩타이드가 포함된 조성물이 나타내는 지혈 효과에 대한 동물 실험 결과로, 아무것도 처리하지 않은 대조군(NC), 그린플라스트를 처리한 대조군(Greenplast Q), 그리고 본 발명의 펩타이드를 각각 1% 및 2.5%의 농도로 처리한 군의 출혈량 수치를 비교하여 나타낸 그래프이다. 아무런 처리를 하지 않은 대조군의 경우 출혈 시작 후 약 90초 후 출혈량을 측정하였다.
도 10은 본 발명의 펩타이드가 포함된 조성물을 이용한 용혈 시험 결과를 비교하여 나타낸 사진 및 그래프로, 대조군으로는 1%의 SDS와 PBS를 본 발명 조성물 대신 처리하여 그 결과를 확인하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. pH 의존적 겔화 특성을 갖는 펩타이드

본 발명의 일 측면은 pH 의존적으로 겔화되는 특성을 갖는 신규한 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다.

본 발명에서 용어 “겔화(gelation)”는 겔(gel) 형태(형상)으로 변화되는 현상을 의미하며, 용액 속의 콜로이드 입자가 유동성을 잃고 고체 또는 반고체 상태의 일정한 형태를 가지게 되는 것을 의미한다. 일반적으로 겔이란 액체 내에 고체 입자가 분산되어 있는 졸(sol)이 화학 결합 등을 형성하면서 겔화된 것일 수 있다.

상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 펩타이드는 상기 펩타이드의 특성 또는 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 가지는 변이체 펩타이드를 포함할 수 있으며, 또는 동일한 기능을 가지는 단백질 단편의 형태일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함함에 따른 특성 또는 활성을 전체적으로 변경시키지 않는, 단백질 및 펩타이드 수준에서의 아미노산 변형은 본 발명의 기술분야에 공지되어 있으며, 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열뿐만 아니라 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 변이체를 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지는 서열을 포함하면서 동일한 활성을 가지는 펩타이드라면 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하면서, pH에 의존적으로 겔화되는 특성을 나타내는 20개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 20개 이하, 18개 이하, 15개 이하 또는 12개의 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 펩타이드는 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오타이드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있으나, 이의 제조방법에 의해 한정되는 것은 아니다.

또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 중성 pH에서 겔화되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 pH 4 내지 pH 8, pH 4 내지 pH 7, pH 4.5 내지 pH 7 또는 pH 5 내지 pH 7의 범위의 pH 조건에서 겔화되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 펩타이드는 사람 또는 사람을 제외한 동물의 혈액 또는 체액이 나타낼 수 있는 pH 범위에서 겔화되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 산성 pH에서 졸(sol) 또는 액체 형태를 나타내는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드가 포함된 용액은 산성 pH, 예를 들어 pH 0 내지 pH 3.9의 범위에서 졸 또는 액체 형태일 수 있으며, 본 발명의 펩타이드는, pH가 변화되어 중성 pH 조건이 주어지게 됨에 따라 겔화(gelation)되어 유동성을 잃고 고체 또는 반고체 형태의 겔을 형성하는 특성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, pH를 변화시키면서 상기 펩타이드의 광산란 세기 kcps 값 및 크기를 측정하였고, pH 4 이상인 조건에서 용액 내 입자의 크기가 증가하며 kcps 값이 점차 증가하는 것을 확인하여 겔화가 진행됨을 확인하였다. 특히, pH 6 이상의 조건에서는 육안으로도 펩타이드의 응집이 관찰되었는바, 본 발명의 펩타이드는 pH에 의존적으로, 보다 구체적으로는 중성 pH 조건에서 겔화되는 특성이 있는 것임을 확인할 수 있었다.

상기 펩타이드는 염이 존재하는 조건에서 겔화되는 특성을 갖는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 염은 염화나트륨(NaCl)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 펩타이드는 상기 염의 농도가 50 mM 이상, 60 mM 이상, 70 mM 이상 또는 100 mM 이상인 조건에서 겔화될 수 있으며, 염의 농도가 높아짐에 따라 겔화되는 정도가 증가할 수 있다. 상기 펩타이드는 사람 또는 사람을 제외한 동물의 혈액 또는 체액이 나타낼 수 있는 염 농도 범위에서 겔화되는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 염의 농도를 변화시키면서 상기 펩타이드의 응집 정도를 광학밀도를 측정하고 육안으로 확인하였고, 그 결과 염화나트륨(NaCl)의 농도가 100 mM 이상일 때 탁도가 점차 증가하고 점도가 증가하여 겔화가 일어나는 것을 확인하였다.

앞서 설명한 것과 같은 상기 펩타이드의 특성에 따라, 상기 펩타이드는 혈액 응고를 유도할 수 있다. 상기 혈액 응고란 혈액이 굳는 것을 의미하며, 상기 펩타이드는 액체 상태의 혈액이 고체 상태의 혈전, 혈병 등으로 굳어지는 반응을 유도할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 펩타이드는 겔화되는 특성이 있으므로 펩타이드의 겔화로 인해 형성되는 나노섬유 형태의 구조가 혈액 내 혈구 및 그 외 혈액 성분을 둘러싸 응집되도록 유도할 수 있다. 본 발명의 펩타이드와 함께 응집된 혈구 세포는 덩어리를 형성할 수 있으며, 이에 따라 부피가 커져 침전되거나 혈액의 흐름, 유출을 방해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 출혈이 발생하였을 때 혈액의 응고를 유도할 수 있는 활성이 있으므로, 본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 지혈을 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

2. 지혈 유도용 조성물 및 이를 이용한 지혈 방법

본 발명의 또 다른 측면은 상기 펩타이드를 포함하는, 지혈 유도용 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것이며, 이에 관한 설명은 '1. pH 의존적 겔화 특성을 갖는 펩타이드' 항목에서 설명한 펩타이드와 동일한바, 구체적인 설명은 이를 원용한다.

본 발명에서 용어 '지혈'은 출혈을 감소시키는 것을 의미하며, 이는 혈액의 유출뿐만 아니라 혈액 이외의 체액의 유출을 감소시키는 것을 모두 의미할 수 있다. 또한, 상기 지혈은 혈액 또는 체액의 응고를 유도 또는 촉진하는 것, 출혈량을 감소시키는 것, 출혈 시간을 감소시키는 것, 출혈을 멈추게 하는 것, 혈전 또는 혈병의 형성을 촉진하는 것 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 상기 펩타이드는 pH에 의존적으로 겔화되는 특징이 있으므로, 이를 포함하는 조성물도 pH 조건에 따라 응집되어 겔화될 수 있으며, 혈구와 함께 응집됨에 따라 지혈을 유도하기 위한 용도로 이용될 수 있다. 구체적으로, 출혈이 발생한 부위에서 상기 조성물에 포함된 펩타이드의 겔화가 일어날 수 있으며, 이에 따라 형성된 겔 또는 나노섬유의 형태가 혈구 세포 및 그 외 혈액 성분을 둘러싸면서 응집될 수 있다. 이렇게 형성된 응집체는 커다란 덩어리를 이루어 침전되거나 혈액의 흐름, 유출을 방해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 출혈 부위에서 지혈을 유도하기 위해 유용하게 이용될 수 있다.

상기 조성물은 산성 pH를 나타내는 것일 수 있다. 예를 들어 상기 조성물은 pH 0 내지 pH 3.9의 범위를 나타낼 수 있으며, 이에 따라 겔화가 진행되지 않은 액체 또는 졸(sol)의 형태일 수 있다.

상기 펩타이드는 상기 조성물 내에 0.5 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 0.5 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖ 내지 40 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖ 내지 35 ㎎/㎖ 또는 20 ㎎/㎖ 내지 30 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물에 포함되는 펩타이드의 농도가 상기 범위일 경우, 펩타이드에 의한 겔화가 충분히 일어날 수 있어 혈액의 응고가 유도되고 지혈 효과가 충분히 나타날 수 있다는 장점이 있다.

상기 조성물은 칼슘 이온을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 칼슘 이온은 예컨대 염화칼슘(CaCl₂)의 형태로 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있다. 칼슘 이온은 혈액 내에서 혈액의 응고 반응을 유도, 촉진하는 것으로 알려져 있으며 보다 구체적으로는 혈액 응고 반응에 관여하는 트롬보키나아제 등의 효소에 의한 트롬빈 형성 반응에 도움을 줄 수 있다. 따라서, 상기 칼슘 이온은 본 발명의 조성물이 나타내는 혈액의 응고 또는 지혈 효과에 도움을 줄 수 있으며, 또한 적절한 염 농도를 형성하기 위해 포함될 수도 있다.

상기 조성물은 중성 pH에서 혈액을 응고시키는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 pH 4 내지 pH 8, pH 4 내지 pH 7, pH 4.5 내지 pH 7 또는 pH 5 내지 pH 7의 범위의 pH 조건에서 혈액을 응고시킬 수 있는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 사람 또는 사람을 제외한 동물의 혈액 또는 체액이 나타낼 수 있는 pH 범위에서 혈액을 응고시키는 것일 수 있다.

상기 조성물은 염 농도가 50 mM 이상인 조건에서 혈액을 응고시키는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 염의 농도가 50 mM 이상, 60 mM 이상, 70 mM 이상 또는 100 mM 이상인 조건에서 혈액을 응고시킬 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 사람 또는 사람을 제외한 동물의 혈액 또는 체액이 나타낼 수 있는 염 농도 범위에서 혈액을 응고시키는 것일 수 있다.

상기 조성물은 용혈 현상을 일으키지 않는 것일 수 있다. 상기 용혈 현상이란 혈구가 파괴되는 현상을 의미하며, 구체적으로 적혈구가 파괴되는 현상일 수 있다. 본 발명의 조성물은 용혈 현상을 일으키지 않기 때문에 혈액이나 출혈 부위에 적용하기에 적합한 특징이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 쥐로부터 채취한 혈액으로부터 분리한 적혈구에 본 발명의 조성물을 처리한 후 원심분리하여 상층액의 광학밀도를 측정한 결과, 1% SDS를 처리하였을 때와 비교하여 상기 측정값이 현저하게 작게 측정되었다. 이는 적혈구의 용혈 현상이 발생하지 않아 나타난 결과로, 본 발명의 조성물은 혈액의 용혈 작용을 유발하지 않음을 확인할 수 있었다.

상기 조성물은 지혈을 유도하기 위해 다양한 형태의 제제로 만들어질 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 분말형 제제, 패치제, 거즈, 스프레이제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 조성물에 포함된 펩타이드가 겔화되어 혈구 및 그 외 혈액 성분과 함께 응집될 수 있다면 어떠한 형태로든 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 조성물을 이용하는 지혈 방법을 제공한다.

본 발명의 지혈 방법은, 출혈이 발생한 동물의 출혈 부위에 청구항 4의 조성물을 처리하는 단계를 포함한다. 상기 동물은 사람 또는 사람 이외의 동물을 모두 포함하며, 상기 사람 이외의 동물은 예를 들어 소, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말, 쥐 또는 가금류(닭, 오리, 거위, 칠면조, 타조, 칠면조, 꿩)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 혈관계를 보유하고 있는 동물이라면 제한 없이 적용될 수 있다.

상기 출혈 부위는 혈액 또는 혈액 이외의 체액이 유출되는 모든 부위를 포함하며, 예를 들어 피부의 표면에 손상이 발생하여 혈액 또는 체액이 유출되는 부위, 혈관에 손상 또는 절단이 발생하여 혈액이 유출되는 부위, 장내 출혈 부위 등을 모두 포함할 수 있다.

상기 조성물을 처리하는 방법은, 상기 조성물의 형태에 따라 달라질 수 있으며, 예컨대 상기 조성물이 분말형 제제, 스프레이제 등일 경우 출혈 부위에 분사하거나 도포하여 처리될 수 있으며, 패치제, 거즈 등일 경우 출혈 부위 표면에 부착하여 처리될 수 있다. 또한, 상기 조성물이 주사제일 경우 출혈 부위에 주사기를 이용해 주사하여 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 지혈 방법은, 상기 조성물을 처리하는 단계 이후 출혈 부위에 물리적인 압박을 가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 지혈 방법은 이에 제한되지 않으며, 통상적으로 출혈을 억제하기 위해 이용되는 지혈 방법이라면 어떠한 것이든 제한 없이 본 발명의 조성물 처리 단계와 함께 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

[제조예] 펩타이드의 제작

자동 펩타이드 합성기(Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기의 표 1에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(Waters Associates, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 ㎜ × 100 ㎜, 1.7㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.

서열번호	펩타이드 서열
1	SASQAYLAGNIT

[실험예 1] pH 변화에 따른 펩타이드의 겔화 확인

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 펩타이드의 겔화 현상을 확인하기 위하여, pH를 조절하면서 본 발명 펩타이드의 물성 변화를 측정함으로써 겔화 정도의 변화를 확인하였다. 구체적으로, 10 mM의 아세트산 완충용액(pH 3.4 내지 pH 5.5)와 10 mM의 인산 완충용액(pH 6.0 내지 pH 7.4)을 이용하여 본 발명 펩타이드를 1 ㎎/㎖의 농도로 용해하였다. 그리고 pH가 각각 3.4, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7 및 7.4일 때 상기 펩타이드를 대상으로 광산란 분석장치(ZetaSizer, Malvern panalytical, UK)를 이용해 크기 및 광산란 세기(단위: kcps)를 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이, pH 3.4 및 4일 때에는 광산란 세기의 kcps 값의 변화가 크지 않았으나 pH가 4.5로 증가되었을 때부터 kcps 값이 크게 증가하는 것으로 측정되어 본 발명 펩타이드의 겔화가 시작되는 pH인 겔화점(gelling point)는 pH 4와 pH 4.5의 사이인 것으로 확인되었다. 그리고 pH가 점차 증가함에 따라 kcps 값도 점차 증가하였고 pH 5.5일 때 가장 높은 것으로 측정되었다. 이는 pH가 증가하면서 본 발명 펩타이드의 구조적인 변화가 유도되고 이에 따른 입자의 배열로 인해 겔화 특성을 가지게 되기 때문인 것으로 예상된다. pH 6에서도 상기 펩타이드의 kcps 값은 높게 유지되었으며 육안으로 펩타이드의 응집(aggregation)이 일어난 것을 확인할 수 있었다. pH가 증가함에 따라 입자의 크기는 점차 커지는 것으로 나타나 중성 pH에서 펩타이드의 응집 및 겔화가 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 펩타이드는 산성 pH 조건에서는 겔화가 진행되지 않아 응집 현상이 관찰되지 않다가, pH가 점차 증가하여 pH 4 내지 4.5일 때 겔화가 시작되어 중성 pH에 이르러 응집되어 겔 형상을 이루는 특성이 있는 것임을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 펩타이드는 이의 pH 조건에 따라 응집체를 형성할 수 있고 이를 혈액의 응고를 유도하기 위한 용도로 이용할 수 있는 가능성이 있으며, 특히 동물의 혈액, 체액과 유사한 pH 범위에서 겔화가 일어나는 본 발명 펩타이드의 특성을 고려할 때 이는 생체에 적용하기에 적합함을 확인할 수 있었다.

[실험예 2] 염 농도에 따른 펩타이드의 겔화 확인

상기 실험예 1에 따라 본 발명의 펩타이드가 pH 증가에 따라 겔화되는 특성이 있음을 확인한 것에 더하여, NaCl과 같은 염의 농도에 따라 상기 펩타이드의 겔화 현상이 어떻게 변화하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 각가 0, 10, 50, 100, 150 및 200 mM의 NaCl 수용액을 준비한 다음, 상기 NaCl 수용액 200 ㎕에 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 25 ㎎/㎖의 본 발명 펩타이드를 100 ㎕ 첨가하고 3,500 rpm으로 볼텍싱하여 혼합하였다. 그리고 상기 펩타이드와 염 수용액의 혼합물의 광학밀도를 600 ㎚ 파장으로 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, NaCl의 농도가 100 mM일 때 혼합물의 탁도가 증가하기 시작하였으며 NaCl이 200 mM 농도에 이르기까지 혼합물의 탁도는 계속 증가하였다. 이는, 본 발명의 펩타이드 분자 사이의 상호작용 증가에 따라 응집이 촉진되기 때문인 것으로 예상된다. 또한, NaCl 150 mM 농도까지 점도가 증가하는 경향이 있음을 확인하였다.

동물의 혈액이나 체액은 일정량의 염이 용해되어 있는바, 혈액 및 체액과 유사한 환경에서도 본 발명의 펩타이드의 겔화가 충분히 일어나는지 여부를 확인할 필요성이 있다. NaCl의 농도에 따른 상기 펩타이드의 겔화 여부 결과로 볼 때 본 발명의 펩타이드는 생체 내 환경에서 겔 성상을 형성함으로써 혈액의 응고를 유도하기 위한 용도 등으로 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 3] 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 겔화 확인

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 본 발명 펩타이드의 농도에 따라, 상기 펩타이드의 겔화 정도가 어떻게 변화하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 상기 펩타이드를 각각 5, 10 및 25 ㎎/㎖의 농도로 증류수와 혼합해 용해시킨 다음, 여기에 5N NaOH를 첨가하여 pH를 점차 증가시키면서 상기 펩타이드가 포함된 혼합물의 상전이를 육안으로 관찰하였다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드는 최초 산성 pH 조건에서는 대체로 졸(sol) 성상을 나타내고 있으나, pH가 증가함에 따라 겔화가 진행되었다. 상기 펩타이드의 농도가 0.5 ㎎/㎖인 경우에는 pH가 7.5에 이르러도 겔화가 일어나지 않았으나 펩타이드의 농도가 증가할수록 펩타이드의 겔화는 더 촉진되는 것으로 나타났으며, 25 ㎎/㎖의 농도로 펩타이드가 포함된 튜브에서는 pH 4.2 조건에서부터 겔화가 진행되었음을 확인할 수 있었다.

[실험예 4] 본 발명 펩타이드의 혈구 응집 효과 확인 (Hemagglutination assay)

중성 pH 조건에서 겔화되어 응집하는 특성이 있는 것으로 확인된 상기 제조예의 펩타이드를 이용하여, 혈액 내에서 적혈구에 대한 응집 효과가 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 쥐로부터 채취한 혈액을 1.5 ㎖ EP 튜브에 분주한 후 1,500 g에서 10분 동안 원심분리를 수행한 다음, 상층의 플라즈마를 제거하고 0.9%의 염화나트륨 수용액으로 3회 세척하였다. 그리고 적혈구와 염화나트륨 수용액을 3:11(v/v)의 비율로 혼합하여 적혈구 현탁액을 준비하였다. 본 발명 펩타이드에 대한 대조군으로, 지혈 활성이 있는 것으로 알려져 시중에 판매되고 있는 연구용 RADA16 펩타이드 시료(3D Matrix)을 이용하였다. v-type 96 웰 플레이트에 본 발명의 제조예 펩타이드 및 상기 대조군 펩타이드를 정제수에 용해하여 각각 0, 62.5, 125, 250, 500 및 1,000 ㎍/㎖의 농도로 10 ㎕ 처리한 다음, 염화나트륨 수용액 90 ㎕을 첨가하였다. 여기에 상기 적혈구 현탁액 10 ㎕을 첨가한 후 300 rpm에서 10분 동안 혼합하여 4 ℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 그리고 적혈구 현탁액의 침전 정도를 육안으로 확인함으로써 각 시료의 나노섬유 형성에 의한 혈구의 응집 정도를 평가하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 500 ㎍/㎖ 이상의 본 발명 펩타이드 농도에서 적혈구 현탁액이 침전되지 못하고 혈전을 형성하는 것으로 나타났다. 이는, 본 발명 펩타이드에 의해 형성된 나노섬유로 인해 적혈구가 응집되어 나타나게 된 효과로, 혈구에 대한 응집 효과가 있는 것으로 알려진 대조군 펩타이드 시료와 유사한 수준으로 혈액의 응고 촉진 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 펩타이드나 이를 포함하는 조성물은 혈구의 응집을 유도함으로써 지혈을 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 5] 본 발명 펩타이드의 혈액 응고 효과 확인 (Blood coagulation test)

본 발명 펩타이드가 혈액의 응고 반응을 유도하는 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여, 쥐로부터 채취한 혈액에 본 발명의 펩타이드를 처리한 다음 혈액의 응고 여부를 확인하였다.

먼저, 본 발명의 펩타이드 처리에 따른 혈액의 응고 시간을 평가하였다. 헤파린 진공채혈관에 채취한 쥐의 혈액 응고 반응을 억제시킨 상태에서 300 ㎕의 혈액을 EP 튜브에 옮겨 담고 본 발명의 펩타이드를 정제수에 용해시킨 용액을 150 ㎕ 처리하였다. 10초 간격으로 튜브를 뒤집어 혈액의 흐름성을 육안으로 평가함으로써 응고 시간을 측정하였다. 대조군으로는 상기 RADA16 펩타이드 시료와 그린플라스트(Greenplast Q, GC 녹십자)를 사용하여 본 발명 펩타이드와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

그 결과, 하기 표 2 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 2.5% 농도의 제조예의 펩타이드를 처리한 경우, 13초 경과 후 혈액이 응고되는 것을 확인할 수 있었다. 그린플라스트를 처리하였을 때에는 혈액이 응고되기까지 20초 이내의 시간이 소요되었고 RADA16 펩타이드를 처리하였을 때에는 30초 이내의 시간이 소요되었는바, 본 발명의 펩타이드는 기존에 지혈제로 이용되던 시판 제제와 유사하거나 더 우수한 혈액 응고 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

	혈액 응고 시간
증류수	-
Greenplast Q	< 20초
RADA16 2.5%	< 30초
본 발명 펩타이드 2.5%	13초

또한, 본 발명 펩타이드의 응고 효능을 평가하기 위하여, 상기 제조예의 펩타이드를 쥐의 혈액에 처리한 후 이의 광학밀도(optical density)를 측정하였다. 구체적으로, 헤파린 진공채혈관에 채취한 쥐의 혈액 응고 반응을 억제시킨 상태에서 300 ㎕의 혈액을 15 ㎖ 코니컬 튜브로 옮긴 후 본 발명의 펩타이드 용액을 300 ㎕ 넣어 가볍게 섞어주었다. 그리고 0.2 M의 CaCl₂ 용액을 30 ㎕ 넣어 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션 함으로써 응고 반응을 촉진시켰다. 그 다음 10 ㎖의 증류수를 조심스럽게 넣어준 뒤 균일하게 분산된 상층액 200 ㎕을 96 웰 플레이트에 넣고 분광광도계에서 540 ㎚ 파장에서 광학밀도를 측정하였다. 마찬가지로 대조군으로 그린플라스트와 RADA16 펩타이드 제제를 사용하였다.

그 결과, 도 6에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 측정된 광학밀도는, 증류수를 처리한 음성대조군의 혈액 응고 정도를 기준으로 0.41 수준으로 나타나 상층액 내 혈구의 양이 현저하게 감소한 것으로 측정되었다. 이는, 종래 시판되던 지혈제인 RADA16 펩타이드 제제를 처리하였을 때의 효과(0.7)보다 더 우수한 혈액 응고 효과를 나타내는 것으로, 본 발명의 펩타이드와 이를 포함하는 조성물은 혈액의 응고를 촉진시키기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 6] 본 발명 펩타이드의 지혈 효과 동물 실험 (in vivo test)

본 발명의 펩타이드가 나타내는 혈액 응고 효과가 실제 동물에서도 나타나는지 여부를 확인하기 위하여 동물 실험을 수행하였다. 구체적으로, 8주령의 암컷 쥐(SD-rat)의 대퇴부를 절개하여 동맥을 노출시킨 다음, 21 G의 니들로 노출된 동맥을 손상시켜 출혈 모델을 구축하였다. 그리고, 출혈 즉시 본 발명의 펩타이드를 정제수에 용해시켜 각각 1% 및 2.5%의 농도로 제조한 시료를 각각 200 ㎕ 출혈 부위에 처리한 다음, 미리 무게를 측정한 거즈로 출혈된 혈액을 흡수시켰다. 그리고 출혈이 정지되기까지 소요된 시간을 측정하고, 혈액이 흡수된 상기 거즈의 무게를 측정해 출혈량을 확인하였다. 양성대조군으로는 그린플라스트 제제를 사용하였으며, 아무런 처리를 하지 않은 음성대조군의 경우 출혈이 시작된 후 90초 후 실험을 중단하여 그 때까지의 출혈량을 확인하였다.

그 결과, 도 7 내지 도 9에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 경우 쥐의 출혈이 멈춰 지혈 효과가 있는 것으로 나타났다. 1%의 펩타이드를 처리한 경우 96초 후 출혈이 멈췄으며 2.5%의 펩타이드를 처리한 경우에는 59초 후 지혈이 되어, 그린플라스트를 처리한 양성대조군의 지혈 시간(84초)과 비교할 때 유사하거나 더 우수한 지혈 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 출혈된 혈액량을 비교하였을 때에도 2.5%의 본 발명 펩타이드를 처리한 경우, 아무런 처리를 하지 않고 90초 동안 출혈이 일어난 음성대조군과 비교할 때 출혈량이 현저하게 감소하였다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 실제로 출혈이 발생한 동물에 처리하였을 때에도 지혈 효과가 나타나며 기존에 시판되고 있던 지혈제와 유사한 수준의 효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실험예 7] 본 발명 펩타이드에 의한 용혈 현상 발생 여부 확인 (Hemolysis test)

나아가, 본 발명의 펩타이드 처리에 의해 혈구가 파괴되는 용혈 현상이 일어나는지 여부를 확인하였다. 헤파린 진공채혈관에 채취한 쥐의 혈액 응고 반응을 억제시킨 상태에서 EP 튜브에 옮겨 담고 1,500 g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상층 플라즈마를 제거한 다음 침전된 적혈구에 본 발명의 펩타이드 2.5% 및 5%를 각각 200 ㎕ 처리하였다. 용혈 작용에 대한 양성대조군으로는 1%의 SDS를 처리하여 사용하였다. 37 ℃ 인큐베이터에서 각 시료를 1시간 동안 보관한 다음 다시 1,500 g에서 10분 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 96 웰 플레이트에 200 ㎕씩 옮겨 540 ㎚의 파장에서 광학밀도를 측정하였다.

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이, SDS를 처리한 군에서는 용혈 현상이 발생하였지만, 본 발명의 펩타이드는 2.5% 및 5% 농도 모두에서 음성대조군과 마찬가지로 용혈 작용을 유발하지 않는 것으로 나타났다. 그러므로, 본 발명의 펩타이드는 혈구를 파괴시키지 않으므로 혈액의 응고를 유도하기 위한 목적으로 사용하더라도 문제가 없음을 확인할 수 있었고, 이를 포함하는 조성물을 지혈을 위한 용도로 유용하게 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Peptides having blood coagulation activity and use thereof <130> 2021DPA4062 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide having blood coagulation activity <400> 1 Ser Ala Ser Gln Ala Tyr Leu Ala Gly Asn Ile Thr 1 5 10

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, pH 의존적 겔화 특성을 갖는 펩타이드.
청구항 1에 있어서,
상기 펩타이드는 pH 4 내지 pH 8에서 겔화되는 것인, 펩타이드.
청구항 1에 있어서,
상기 펩타이드는 혈액 응고를 유도할 수 있는 것인, 펩타이드.
청구항 1의 펩타이드를 포함하는, 지혈 유도용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 펩타이드는 상기 조성물 내에 0.5 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 것인, 지혈 유도용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 조성물은 칼슘 이온을 더 포함하는 것인, 지혈 유도용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 조성물은 pH 4 내지 pH 8에서 혈액을 응고시키는 것인, 지혈 유도용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 조성물은 염 농도가 50 mM 이상인 조건에서 혈액을 응고시키는 것인, 지혈 유도용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 조성물은 용혈 현상을 일으키지 않는 것인, 지혈 유도용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 조성물은 분말형 제제, 패치제, 거즈, 스프레이제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 형태인 것인, 지혈 유도용 조성물.
출혈이 발생한 동물의 출혈 부위에 청구항 4의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 지혈 방법.