CN117255796A - 具有凝血活性的肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新序列的肽，其特征在于根据pH条件凝胶化。由于该肽可以诱导凝血，因此包含该肽的组合物可用于诱导止血的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够诱导凝血的新肽及其用途。
背景技术
血管系统在动物体内运输各种营养物质并且运输氧气和二氧化碳方面起着重要作用，从而在血管和组织之间进行血液和体液的交换。然而，当皮肤组织或血管发生损伤时，血液和体液会外流。当出血过量时，氧气的运输不能正常发生，这可能会导致死亡。因此，已经开发出减少出血的止血方法。
在生物体中，存在自行诱导血液凝固的系统。通过由酶促反应形成的凝血酶和由此产生的纤维蛋白纤维使血细胞聚集形成血凝块或血块，抑制血液或体液成分的流出，从而进行止血。然而，当由于出现深的大伤口从而发生过量出血时，仅利用生物体的凝血系统可能无法充分止血，并且还亟需控制在外科手术时不可避免地出现的过量出血。因此，可以认为对用于有效止血的方法和具有止血活性的物质的需求一直很高。
壳聚糖、胶原、淀粉、蜂蜡等已经用作用于止血用途的常规制品的成分，并且这些成分以粉末、海绵、片材、凝胶等形式制造和施加。在韩国待审查专利公开出版物No.2018-0027126中，使用包含交联透明质酸衍生物基质的组合物诱导止血效果。
然而，止血用制剂应当对生物体无害，因为它们基本上施加至受损或受伤的区域，而不应当引起诸如溶血的副作用。作为常规医疗器械开发的使用壳聚糖、聚合物等的止血制品的止血功效微乎其微，并且存在一个问题，即，在施加至生物体后，残留物必须分解或从体内排出，并且残留物可诱导炎症反应。此外，在具有凝血机制的常规生物药物制剂的情况下，存在一个缺点，即，由于这些生物药物制剂是生物衍生成分，因此不容易制造和运输/储存。这些常规生物药物制剂还具有可用性差的缺点，因为需要很长时间才能适用，例如，在使用前需要解冻过程，或者在将第一剂和第二剂混合后才能使用这些生物药物制剂。因此，有必要开发一种用于促进凝血的肽制剂，该肽制剂使用作为生物成分的氨基酸成分合成，同时具有优异的制造和储存稳定性以及止血功效。
发明内容
[技术问题]
本发明的目的是提供一种可在特定条件下凝胶化并用于诱导凝血的肽。
此外，本发明的目的是提供一种能够使用该肽有效诱导止血的组合物。
此外，本发明的目的是提供一种使用该组合物止血的方法。
[技术方案]
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种具有pH依赖性凝胶化特性的肽，其包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
本发明的另一方面提供了一种用于诱导止血的包含该肽的组合物。
本发明的还一方面提供了一种用于止血的方法，包括用该组合物处理发生出血的动物的出血部位的步骤。
[有利效果]
本发明提供的肽在中性pH条件下具有自凝胶化的特性。具体而言，该肽可以在特定的pH条件下凝胶化以形成聚集体，因此，当用该肽或包含该肽的组合物处理血液或体液时，该肽可以根据血液中的pH条件进行凝胶化。该肽与血细胞聚集在一起，或由该肽的凝胶化形成的纳米纤维结构包围并捕获血细胞和除了血细胞以外的血液成分，以形成团块。因此，具有通过沉淀或阻碍血液的流动或流出，从而诱导止血的效果。
本发明的肽和包含该肽的组合物具有与常规止血剂相似水平的诱导凝血的活性，具有缩短止血时间的优异效果，并且不会引起溶血，因此本发明的肽和包含该肽的组合物可以有效地用于诱导止血。
特别是，在酸性条件下，不进行凝胶化，并且可以是液体或溶胶的形式。因此，由于本发明的肽和组合物在施加至实际血液或体液之前保持酸性pH条件，因此本发明的肽和组合物可由于流动性从而表现出更适合储存或施加的特性。此外，当施加至血液或体液时，根据血液或体液的中性pH进行凝胶化，其优点是在实际出血部位有效地表现出止血。
此外，将本发明的肽和包含该肽的组合物制备为构成生物体的氨基酸成分。因此，当施加至生物体时，存在的优势是不太可能产生副作用或分解/排出的问题，因此炎症反应的可能性很低。此外，与常规止血用制剂相比，本发明的肽和包含该肽的组合物易于制造并且具有优异的储存稳定性。
然而，本发明的效果不限于上述效果，并且本领域技术人员将通过以下描述清楚地理解其他未提及的效果。
附图说明
图1为示出了根据pH变化测定的本发明的肽的光散射强度kcps值和粒度的图。
图2为示出了根据盐(NaCl)浓度变化，测定的包含本发明的肽的溶液的光密度值(OD 600)的图，以及示出了根据盐浓度的溶液形式的照片。
图3为示出了根据本发明的肽的浓度差异的凝胶化程度差异的照片。
图4为通过将不同浓度的包含本发明的肽的组合物与从小鼠采集的红细胞悬浮液混合观察到的红细胞凝集试验的结果。用圆圈标记的区域代表血细胞不沉淀并开始形成血块的浓度的实验结果。
图5为示出了由于使用包含本发明的肽的组合物进行凝血试验从而在13秒后发生凝血的照片。
图6为使用包含本发明的肽的组合物进行凝血试验的结果，并且为测定和比较离心样品的上清液的光密度的结果。基于用蒸馏水处理的阴性对照组(DW)的值示出相对值，并将用Greenplast(GreenplastQ)和RADA16肽制剂处理的组用作对照组。
图7为包含本发明的肽的组合物的止血效果的动物实验的结果，并且示出了未用任何试剂处理的对照组(未处理)、用Greenplast(Greenplast Q)处理的对照组、以及用浓度分别为1％和2.5％的本发明的肽处理的组的出血部位、失血量和出血时间值的图片。对于未进行任何处理的对照组，在开始出血90秒后测量失血量。
图8为示出了包含本发明的肽的组合物的止血效果的动物实验的结果的图。该图示出了未用任何试剂处理的对照组(NC)、用Greenplast(Greenplast Q)处理的对照组、以及用浓度分别为1％和2.5％的本发明的肽处理的组的出血时间值的比较。对于未进行任何处理的对照组，在开始出血90秒后停止实验。
图9为示出了包含本发明的肽的组合物的止血效果的动物实验的结果的图。该图示出了未用任何试剂处理的对照组(NC)、用Greenplast(Greenplast Q)处理的对照组、以及用浓度分别为1％和2.5％的本发明的肽处理的组的失血值的比较。对于未进行任何处理的对照组，在开始出血90秒后测量失血量。
图10为使用包含本发明的肽的组合物的溶血试验结果的比较的照片和图。作为对照，用1％ SDS和PBS代替本发明的组合物进行处理，并且结果得到确认。
具体实施方式
以下，将详细描述本发明。
1.具有pH依赖性凝胶化特性的肽
本发明的一个方面提供了一种具有pH依赖性凝胶化特性的新肽。
在本发明中，术语“肽”是指由通过肽键连接的两个以上氨基酸组成的聚合物。
在本发明中，术语“凝胶化”是指变为凝胶形式(形态)的现象，并且意味着溶液中的胶体颗粒失去流动性并且具有固态或半固态的某种形式。通常，当在固体颗粒分散在液体中的溶胶中形成化学键时，凝胶可以凝胶化。
该肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在不影响肽的特性或活性的范围内，该肽可包括通过氨基酸残基的缺失、插入和置换、或它们的组合而具有不同序列的突变肽，或者可为具有相同功能的蛋白片段的形式。不完全改变所包括的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的特性或活性的蛋白和肽水平的氨基酸修饰在本领域中是已知的。在一些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化等进行修饰。因此，该肽不仅包括SEQ IDNO:1的氨基酸序列，而且还包括具有与该肽基本上相同的氨基酸序列的肽及其变体。具有基本上相同的氨基酸序列的肽可为包括以下氨基酸序列的肽，该氨基酸序列为与SEQ IDNO:1的氨基酸序列的氨基酸序列同源性为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％，但不限于此。包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列同源性为至少90％的序列且具有相同活性的任何肽都包括在本发明的范围内。
本发明的肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且可以由以pH依赖性方式表现出凝胶化特征的20个以下氨基酸组成。具体而言，肽可以由20个以下氨基酸、18个以下氨基酸、15个以下氨基酸或12个氨基酸组成。
此外，本发明的肽可以通过本领域公知的各种方法获得。例如，本发明的肽可以使用多核苷酸重组和蛋白表达系统制备，或者通过诸如肽合成的化学合成和无细胞蛋白合成进行体外合成，但不限于这些制备方法。
此外，为了获得更好的化学稳定性、增强的药理学特性(半衰期、吸收性、效价、功效等)、改变的特异性(例如，宽的生物活性谱)和降低的抗原性，可以将保护基结合至肽的N端或C端。例如，保护基可为乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(PEG)，然而，保护基可包括能够修饰肽、特别是增强肽的稳定性的任何成分，没有限制。“稳定性”是指储存稳定性(例如，室温储存稳定性)以及保护本发明的肽在体内免受蛋白裂解酶的攻击的体内稳定性。
本发明的肽可为在中性pH中凝胶化的肽。具体而言，该肽可以在范围为pH 4至pH8、pH 4至pH 7、pH 4.5至pH 7或pH 5至pH7的pH条件下凝胶化，但不限于此。该肽可以在能够由人类或除了人类以外的动物的血液或体液表现出的pH范围内凝胶化。
此外，本发明的肽可以在酸性pH中示出溶胶或液体形式。具体而言，包含该肽的溶液可以在例如范围为pH 0至pH 3.9的酸性pH时呈溶胶或液体形式。本发明的肽可以具有凝胶化的特性，当pH改变并给定中性pH条件时，失去流动性并形成固体或半固体凝胶。
在本发明的具体实施方案中，在改变pH的同时测定肽的光散射强度kcps值和尺寸，并且通过在pH 4以上的条件下确认溶液中颗粒的尺寸增加以及kcps值逐渐增加从而确认进行了凝胶化。特别是，在pH 6以上的条件下用肉眼观察到肽聚集。因此，确认本发明的肽以pH依赖性方式具有凝胶化特性，更具体而言，是在中性pH条件下以pH依赖性方式具有凝胶化特性。
该肽可以在盐的存在下具有凝胶化特性，例如，盐可为氯化钠(NaCl)，但不限于此。肽可以在盐浓度为50mM以上、60mM以上、70mM以上或100mM以上的条件下凝胶化，并且凝胶化程度可以随着盐浓度的增加而增加。该肽可以在人类或除了人类以外的动物的血液或体液能够表现出的盐浓度范围内凝胶化。
在本发明的具体实施方案中，通过在改变盐浓度的同时测定光密度从而目视确认肽的聚集程度。其结果是，确认了当氯化钠(NaCl)的浓度为100mM以上时，浊度逐渐增加，并且由于粘度增加而发生了凝胶化。
根据上述肽的特性，该肽可以诱导凝血。凝血意味着血液固化，因此该肽可诱导液体血液凝固成固体血栓和血块的反应。更具体而言，由于该肽具有凝胶化特性，因此由于该肽的凝胶化而形成的纳米纤维结构围绕血液中的血细胞和其他血液成分并诱导聚集。与本发明的肽聚集在一起的血细胞可形成团块，这可增加体积并沉淀或阻碍血液流动和流出。因此，由于本发明的肽具有在发生出血时能够诱导凝血的活性，因此本发明的肽或包含该肽的组合物可有效地用于止血。
2.诱导止血用组合物及使用该组合物的止血方法
本发明的另一方面提供了一种用于诱导止血的包含该肽的组合物。
该肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且其描述与“1.具有pH依赖性凝胶化特性的肽”部分中的肽的描述相同，因此将该具体描述并入本部分。
在本发明中，术语“止血”是指减少出血，这可意味着减少血液流出以及除了血液以外的体液流出这两者。此外，止血的概念包括全部以下内容：诱导或促进血液或体液的凝固、减少失血量、缩短出血时间、停止出血、促进血栓或血块的形成等。
本发明的肽的特征在于以pH依赖性方式凝胶化。因此，包含该肽的组合物也可根据pH条件聚集和凝胶化，并且可以用于诱导止血，因为包含该肽的组合物与血细胞聚集。具体而言，组合物所含的肽的凝胶化可发生在出血部位，并且形成的凝胶或纳米纤维可在包围血细胞和其他血液成分的同时聚集。以这种方式形成的聚集体可沉淀成大块或阻碍血液的流动或流出。因此，本发明的组合物可有效地用于在出血部位诱导止血。
该组合物可表现出酸性pH。例如，该组合物的pH范围可为0至3.9，因此该组合物可呈未进行凝胶化的液体或溶胶的形式。
组合物所含的肽的浓度可为0.5mg/ml至50mg/ml。具体而言，该肽的浓度可为0.5mg/ml至50mg/ml、1mg/ml至40mg/ml、10mg/ml至35mg/ml或20mg/ml至30mg/ml，但不限于此。当本发明的组合物所含的肽的浓度在上述范围内时，该肽可以充分进行凝胶化，从而诱导凝血并充分表现出止血效果。
该组合物还可包含钙离子。钙离子可以例如以氯化钙(CaCl2)的形式添加到本发明的组合物中。已知钙离子诱导和加速血液中的凝血反应，更具体而言，钙离子可以帮助参与凝血反应的诸如凝血酶原激酶之类的酶形成凝血酶的反应。因此，钙离子可以有助于本发明的组合物的凝血或止血效果，并且所含的钙离子还可以形成适当的盐浓度。
该组合物可在中性pH时凝血。更具体而言，该组合物能够在pH 4至pH 8、pH 4至pH7、pH 4.5至pH 7或pH 5至pH 7的pH条件下凝血，但不限于此。该组合物可在能够由人类或除了人类以外的动物的血液或体液表现出的pH范围内凝胶化。
该组合物可在盐浓度为50mM以上的条件下凝血。更具体而言，该组合物可在盐浓度为50mM以上、60mM以上、70mM以上或100mM以上的条件下凝血，但不限于此。该组合物可在能够由人类或除了人类以外的动物的血液或体液表现出的盐浓度范围内凝血。
该组合物能够不引起溶血。溶血现象是指破坏了血细胞的现象，具体而言可为破坏了红细胞的现象。由于本发明的组合物不会引起溶血，因此该组合物适合于施加至血液或出血部位。
在本发明的具体实施方案中，用本发明的组合物处理从小鼠采集的血液中分离的红细胞，然后离心以测定上清液的光密度。其结果是，测定值显著小于当用1％ SDS处理时的测定值。这是由于没有发生红细胞溶血而出现的结果，因此已经确认本发明的组合物不会诱导血液溶血。
该组合物可制成各种类型的制剂以诱导止血。具体而言，该组合物可为选自由粉末剂、贴剂、纱布剂、喷雾剂和注射剂组成的组中的至少一种形式，但不限于此。当该组合物所含的肽可以凝胶化并与血细胞及其他血液成分聚集在一起时，可以以任何形式提供该组合物。
本发明的另一方面提供了一种使用该组合物止血的方法。
本发明的止血方法包括用权利要求4所述的组合物处理发生出血的动物的出血部位的步骤。动物包括人类和非人类动物这两者，并且非人类动物包括例如牛、猪、绵羊、山羊、鹿、马、大鼠或家禽(家鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟、火鸡、野鸡)，但不限于此，并且可以施加至不限于具有血管系统的任何动物。
出血部位包括流出血液或除了血液以外的体液的全部部位。例如，出血部位可包括由于皮肤表面损伤而导致血液或体液流出的全部区域、由于血管损伤或切割而导致血液流出的区域以及肠道出血区域。
用组合物处理的方法可根据组合物的形式而变化。例如，当组合物为粉末剂、喷雾剂等时，可通过喷洒或涂覆至出血区域进行处理，并且当组合物为贴剂、纱布剂等时，可通过贴合至出血区域的表面进行处理。此外，当组合物为注射剂时，可通过使用注射器注射出血部位进行处理，但不限于此。
止血方法还可包括在用组合物处理的步骤之后向出血部位施加物理压力的步骤。然而，本发明的止血方法不限于此，并且通常用于抑制出血的任何止血方法都可以与用本发明的组合物处理的步骤一起施加，但不限于此。
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。
然而，以下实施例具体说明了本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
[制备例]肽的制备
使用自动肽合成仪(Milligen 9050，Millipore，美国)合成具有下表1所示的SEQID NO:1的氨基酸序列的肽，然后使用C18反相高效液相色谱(HPLC，Waters Associates，美国)纯化合成的肽。将ACQUITY UPLC BEH300 C18(2.1mm×100mm，1.7μm，Waters Co，美国)用作色谱柱。
[表1]
| SEQ ID NO: | 肽序列 |
| 1 | SASQAYLAGNIT |
[实验例1]确认肽根据pH变化的凝胶化
为了确认具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的本发明的肽的凝胶化现象，通过在调节pH的同时测定本发明的肽的物理特性的变化从而确认凝胶化程度的变化。具体而言，使用10mM醋酸盐缓冲液(pH3.4至pH 5.5)和10mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0至pH 7.4)以1mg/ml的浓度溶解本发明的肽。并且当pH分别为3.4、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7和7.4时，使用光散射分析仪(ZetaSizer，Malvern panalytical，英国)测量肽的尺寸和光散射强度(单位：kcps)。
结果可参见图1，在pH为3.4和4时，光散射强度的kcps值变化不大，但当pH增加至4.5时，测定到kcps值显著增加。因此，确认凝胶化点，即本发明的肽开始凝胶化的pH在pH 4和pH 4.5之间。并且随着pH逐渐增加，kcps值也逐渐增加，并且在pH 5.5时测定到最高值。预期这是因为本发明的肽随着pH的增加诱导了结构变化，并且由此产生的颗粒排列引起凝胶化特性。即使在pH 6时，肽的kcps值也保持较高，并且目视确认发生了肽聚集。随着pH的增加，颗粒的尺寸逐渐增加，确认了在中性pH时发生肽聚集和凝胶化。
通过上述结果，可以确认该肽具有在酸性pH条件下不进行凝胶化的特征，因此没有观察到聚集现象，但是当pH逐渐增加至pH 4至4.5时开始凝胶化，并且当达到中性pH时，该肽聚集以形成凝胶。因此，该肽可以根据其pH条件形成聚集体，并且有可能可用于诱导血液的凝固。特别是，考虑到本发明的肽的特征，即凝胶化发生在类似于动物的血液和体液的pH范围内，确认了本发明的肽适用于施加至生物体。
[实验例2]确认肽根据盐浓度的凝胶化
除了根据实验例1确认本发明的肽具有随着pH的增加从而凝胶化特征以外，还确认了肽的凝胶化如何根据诸如NaCl之类的盐的浓度而改变。具体而言，制备0mM、10mM、50mM、100mM、150mM和200mM NaCl水溶液，并将25mg/ml的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的本发明的肽分别添加至200μl的NaCl水溶液中，随后以3,500rpm通过涡旋混合。并测定肽和盐溶液的混合物在600nm波长处的光密度。
结果可参见图2，当NaCl的浓度为100mM时，混合物的浊度开始增加，并且混合物的浊度继续增加，直到NaCl的浓度达到200mM为止。预期这是由于随着本发明的肽的分子之间的相互作用增加，促进了聚集。此外，确认直至NaCl浓度为150mM，粘度倾向于增加。
由于一定量的盐溶解在动物血液或体液中，因此有必要检查本发明的肽是否充分发生了凝胶化，即使在类似于血液或体液的环境中亦是如此。由于肽根据NaCl的浓度凝胶化，因此确认了本发明的肽可通过在体内环境中形成凝胶相从而有效地用于诱导血液的凝固。
[实验例3]确认肽根据肽浓度的凝胶化
根据具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的本发明的肽的浓度，确认了肽的凝胶化程度如何变化。具体而言，将肽分别以5mg/ml、10mg/ml和25mg/ml的浓度与蒸馏水混合，并溶解在1.5ml微管中。通过向包含肽的混合物中添加5N NaOH从而逐渐增加pH，同时目视观察包含肽的混合物的相变。
结果可参见图3，本发明的肽在最初的酸性pH条件下主要示出溶胶相，但凝胶化随着pH的增加而进行。当肽的浓度为0.5mg/ml时，即使当pH达到7.5也不会发生凝胶化，但随着肽的浓度增加，进一步促进了肽的凝胶化。确认了在含有浓度为25mg/ml的肽的试管中，在pH 4.2的条件下开始凝胶化。
[实验例4]确认本发明的肽的红细胞凝集效果(红细胞凝集试验)
使用确认了在中性pH条件下具有凝胶化和聚集特性的制备例的肽，确认了该肽是否对血液中的红细胞具有聚集效果。具体而言，将从大鼠采集的血液分配到1.5ml EP管中，以1,500g离心10分钟，然后除去上层的血浆，并用0.9％氯化钠水溶液洗涤三次。将红细胞和氯化钠水溶液以3:11(v/v)的比例混合以制备红细胞悬浮液。作为本发明的肽的对照，使用了已知具有止血活性的研究用市售RADA16肽样品(3D Matrix)。将本发明的制备例的肽和对照肽溶解在纯水中，在v型96孔板中分别以各自浓度为0μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml和1000μg/ml处理至10μl，然后向其中添加90μl的氯化钠水溶液。再向其中添加10μl的红细胞悬液后，将混合物以300rpm混合10分钟，并在4℃反应2小时以上。此外，通过目视检查红细胞悬浮液的沉淀程度，评价由于各样品的纳米纤维的形成引起的血细胞聚集程度。
结果如图4所示，发现当本发明的肽的浓度为500μg/ml以上时，红细胞悬浮液不沉淀并形成血块。这是由于由本发明的肽形成的纳米纤维引起的红细胞聚集从而引发的效果，并且确认了凝血促进效果类似于已知对血细胞具有聚集效果的对照肽样品。因此，确认了本发明的肽或包含该肽的组合物可通过诱导血细胞的聚集从而有效地用于止血。
[实验例5]确认本发明的肽的凝血效果(凝血试验)
为了确认本发明的肽是否具有诱导凝血的效果，用本发明的肽处理从大鼠采集的血液，然后确认血液是否凝固。
首先，评价了用根据本发明的肽处理后的血液的凝血时间。在肝素化真空采集管中抑制采集的大鼠血液的凝血反应的状态下，将300μl的血液转移到EP管中，并在EP管中处理了150μl的溶解在纯水中的本发明的肽的溶液。通过以10秒的间隔反转管并目视评估血液的流动性从而测定凝血时间。作为对照组，以与本发明的肽相同的方式，将RADA16肽样品和Greenplast(Greenplast Q，GC Green Cross)用于进行实验。
结果可参见以下的表2和图5，当用2.5％的浓度的制备例的肽处理时，确认了血液在13秒后凝成血块。当用Greenplast处理时，血液发生凝固的用时小于20秒，而用RADA16肽处理时小于30秒。因此，确认了本发明的肽具有类似于或优于先前用作止血剂的市售试剂的凝血功效。
[表2]
| 凝血时间 | |
| 蒸馏水 | - |
| Greenplast Q | <20秒 |
| RADA16 2.5％ | <30秒 |
| 本发明的肽2.5％ | 13秒 |
此外，为了评价本发明的肽的凝血功效，用制备例的肽处理大鼠血液，并测定其光密度。具体而言，在肝素化真空采集管中抑制采集的大鼠血液的凝血反应的状态下，将300μl的血液转移到15ml锥形管中，并向其中添加300μl的本发明的肽溶液并轻轻混合。然后，向其中添加30μl的0.2M CaCl2溶液，并在37℃孵育10分钟以加速凝血反应。然后，小心地向其中添加10ml的蒸馏水，并将200μl的均匀分散的上清液添加到96孔板中，并使用分光光度计测定540nm波长处的光密度。同样地，将Greenplast和RADA16肽制剂用作对照。
结果可参见图6，基于用蒸馏水处理的阴性对照组的凝血程度，当用本发明的肽处理时测定的光密度为0.41，这表明上清液中的血细胞的量显著减少。这示出了比当用作为市售止血剂的RADA16肽制剂处理时的效果(0.7)更好的效果。因此，确认了本发明的肽和包含该肽的组合物可有效地用于促进凝血。
[实验例6]本发明的肽的止血效果的动物实验(体内试验)
进行动物实验以确认本发明的肽的凝血效果是否也在实际动物中表现出来。具体而言，通过切开8周龄雌性大鼠(SD大鼠)的腿部从而使动脉暴露，然后用21G针损伤暴露的动脉以构建出血模型。然后，在出血后立即分别用200μl的以1％和2.5％的浓度溶解在纯水中的本发明的肽制备的样品处理出血部位，然后用预先称重的纱布吸收出血。在测定出血停止所需的时间后，通过测量吸收血液的纱布的重量确认失血量。将Greenplast制剂用作阳性对照组，并且在未用任何试剂处理的阴性对照组的情况下，在出血开始后90秒停止实验，并检查到停止点时的失血量。
结果可参见图7至图9，当用本发明的肽处理时，将发现止血效果视为大鼠出血停止。在用1％肽处理的情况下，出血在96秒后停止，并且在用2.5％肽处理的情况下，59秒后止血。因此，确认了与用Greenplast处理的阳性对照组的止血时间(84秒)相比，用本发明的肽处理时的止血效果相似或更好。即使在比较失血量时，当用2.5％的本发明的肽处理时，与发生90秒出血而没有任何处理的阴性对照组相比，失血量也显著减少。因此，确认了本发明的肽即使在对实际发生出血的动物进行处理时也示出了止血效果，并且可示出类似于市售止血剂的效果。
[实验例7]确认本发明的肽是否发生溶血(溶血试验)
此外，确认了通过用本发明的肽进行处理是否会发生破坏了血细胞的溶血。在肝素化真空采集管中抑制采集的大鼠血液的凝血反应的状态下，将大鼠血液转移到EP管中，并以1,500g离心10分钟。除去上清液血浆后，分别用200μl的2.5％和5％的本发明的肽处理沉淀的红细胞。将用1％ SDS处理的样品用作溶血的阳性对照。将各样品在37℃培养箱中保存1小时，然后再次以1,500g离心10分钟。将200μl的上清液转移到96孔板中，并测定在540nm波长处的光密度。
结果可参见图10，SDS处理组发生溶血，但浓度为2.5％和5％的本发明的肽这两者均与阴性对照组一样，未诱导溶血。因此，由于本发明的肽不破坏血细胞，因此可以确认，即使在用于诱导凝血的目的的情况下也不存在问题，并且包含该肽的组合物可有效地用于止血。
在上文中，本发明仅针对所描述的实施方案进行详细描述，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，在本发明的技术思想的范围内可以进行各种改变和修改，并且这些改变和修改自然落入所附权利要求的范围内。
<110> 凯尔格恩有限公司
<120> 具有凝血活性的肽及其用途
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<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 具有凝血活性的肽
<400> 1
Ser Ala Ser Gln Ala Tyr Leu Ala Gly Asn Ile Thr
1 5 10
Claims (11)
1.一种具有pH依赖性凝胶化特性的肽，其包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽在pH 4至pH 8凝胶化。
3.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽可诱导凝血。
4.一种用于诱导止血的组合物，其包含权利要求1所述的肽。
5.根据权利要求4所述的用于诱导止血的组合物，其中所述组合物所含的所述肽的浓度为0.5mg/ml至50mg/ml。
6.根据权利要求4所述的用于诱导止血的组合物，其中所述组合物还包含钙离子。
7.根据权利要求4所述的用于诱导止血的组合物，其中所述组合物在pH 4至pH 8使血液凝固。
8.根据权利要求4所述的用于诱导止血的组合物，其中所述组合物在盐浓度为50mM以上的条件下使血液凝固。
9.根据权利要求4所述的用于诱导止血的组合物，其中所述组合物不引起溶血。
10.根据权利要求4所述的用于诱导止血的组合物，其中所述组合物的形式为选自由粉末剂、贴剂、纱布剂、喷雾剂和注射剂组成的组中的至少一者。
11.一种用于止血的方法，包括用权利要求4所述的组合物处理发生出血的动物的出血部位的步骤。
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