JPH0665060A - 治療薬を送達するための親水性クリーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 適当な増粘剤により増粘された、創傷部位へ
の治療薬の効果的な送達が可能であり、創傷清浄効果に
優れた親水性クリームの提供。 【構成】 水性担体、創傷清浄化酵素、創傷治療薬およ
び抗細菌剤からなる群より選択される治療薬、ならびに
非発熱原性の種子ガラクトマンナン増粘剤からなる開口
した創傷または粘膜に適用するための親水性クリーム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、中性の治療薬および荷
電した治療薬の双方を、開口した創傷および粘膜に送達
し、浸出液の存在下であっても、それらの治療薬を治療
部位に維持しておくように設計された、適当な増粘剤を
伴った滅菌親水性クリームに関する。また、グアーガム
から非常に高度に精製れたグアラン標品を得る方法およ
びその標品に関する。

【０００２】

【従来の技術】熱傷、漬瘍および外科的切開のごとき開
口した創傷は、毒素、免疫原および発熱原を含めた汚染
物質の全身的なシステムを提供する。拡張した体表面が
含まれる熱傷の局所的治療の場合、多量の局所治療薬を
患者に適用する必要がある。例えば、体重７０ｋｇの熱
傷患者の全体表の５０％に１.０ｍｍの厚さの局所用ク
リームを適用する場合、約８５０ｇのクリームが必要で
ある。したがって、局所的治療薬中１％の汚染物質は、
患者に８.５ｇの汚染物質を適用することになる。

【０００３】創傷清浄化酵素および創傷治癒因子のごと
き多くの局所的治療薬は、生理学的ｐＨにおいてはもと
もと幾分荷電したペプチドまたは蛋白である。イオン交
換クロマトグラフィー樹脂に見られるように、イオンの
相互作用により荷電分子が逆に荷電した高分子増粘剤と
結合する。高分子ポリマー増粘剤に対する治療薬の強力
な会合は、治療薬の創傷部位への拡散を阻害し、治療薬
の創傷部位への送達あるいはその治療的効果を妨げる可
能性がある。したがって、水溶液中生理学的ｐＨにおい
て荷電しておらず、基本的に汚染物質を含まない増粘剤
が適当である。

【０００４】ガラクトマンナンは、自然界に比較的広く
分布し、ある種の植物の細胞壁および胚乳中、ならびに
種々の菌類の菌糸に存在が確認されている。特に本発明
の実施に有用と思われるガラクトマンナンは、種子ガラ
クトマンナンである。種子ガラクトマンナンは、植物起
源の多糖であり、エイ・エム・ステフェン（A.M.Stephe
n）、ザ・ポリサッカライズ（The Polysaccharides）１
１５〜１１６ページ（１９８３年）に記述された性質を
有する。一般的に用いられる２種の種子ガラクトマンナ
ンはグアーガムおよびローカストビーンガム由来であ
る。これら２種の種子由来のガラクトマンナンを区別す
る特徴は、それらのガラクトースに対するマンノースの
組成比である。グアランはマンノース：ガラクトースが
２：１であり、ローカストビーンガムは４：１である。
これらの多糖はいずれもイオン化しうる基を有しておら
ず、よって、水溶液中では荷電していない。

【０００５】水溶液中に溶解すると、グアランは高粘性
を有し、グアランの未精製形態であるグアーガムは、か
つて、食品、ローションおよびクリームの増粘剤ならび
に錠剤の結合剤として使用されていた。グアランは、そ
の粘弾性により、漬瘍、外科的切開および熱傷患者の痂
皮への、および粘膜への薬剤送達担体の興味深い増粘成
分といえる。グアランはこれらの患者の循環系に入るこ
とができるため、汚染物質の少ない、特に蛋白およびエ
ンドトキシン含量の少ないグアラン標品が望ましい。

【０００６】粘性のある滅菌親水性クリームの使用に関
する１つの示唆は創傷清浄化酵素のごとき治療薬の熱創
傷部位への送達である。熱傷の痂皮の酵素的創傷清浄化
は、血液の損失および外科的外傷を最小限にとどめる外
科的切開に対する興味深い創傷清浄化法であり、生物学
的特異性があるにせよ、壊死および生細胞を区別するこ
とができる。熱傷痂皮の主成分が変性蛋白であるため、
種々のプロテアーゼが創傷清浄化酵素として開発されて
きた。

【０００７】アナナイン(ananain)およびコモサイン(co
mosain)は、粗ブロメラインの２種の主なプロテアーゼ
成分として同定されており、１９９２年４月２１日付け
の米国特許第５,１０６,６２１号に充分記載されてお
り、その関連する開示部分をここに一体化させる。これ
ら２種のプロテアーゼは粗ブロメライン中の可溶性蛋白
の約５％を占め、パイナップル茎粉末からクロマトグラ
フィー的に精製でき、充分特徴のはっきりとした標品が
得られる。

【０００８】酵素的創傷清浄化剤の送達に関する都合良
い担体は、安全で、酵素の送達に有効で、創傷部位に蛋
白分解酵素を維持するに十分な粘性を有し、創傷面を水
和するに十分な親水性を有し、創傷部位からの浸出液を
吸収でき、適用が容易であり、創傷部位を浄化するもの
でなくてはならない。アナナインおよびコモサインプロ
テアーゼを有効な担体中に処方する試みが、２つの理由
のためになされてきた。第一の理由は、既知の局所用ク
リームおよびゲルは、創傷部位に適用した場合に非常に
軟化し、創傷からの液体により希釈されると創傷部位か
ら移動してしまうことである。第二の理由は、アナナイ
ンおよびコモサインシステインプロテアーゼはｐＩ＞
８.５において強力に陽性であり、生理学的ｐＨにおい
て処方した場合、イオン的相互作用により、多糖および
合成ゴムのごとき一般的に用いられる陰性の増粘剤に結
合することである。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、創傷部位へ
の治療薬の効果的な送達のための適当な増粘剤を開発す
ることを目的とする。また、適用すべき部位に適用した
場合、あまり粘性が高すぎず、ベトつきが少なく、しか
しながら、体液で希釈されても粘性を保つクリームを開
発することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく、増粘剤およびクリームについて鋭意研究を
行った。その結果、創傷清浄化酵素、創傷治療薬および
抗細菌剤ならびに基本的に荷電しておらず、発熱原を含
まない種子ガラクトマンナン、好ましくはグアーガムま
たはローカストビーンガム由来のガラクトマンナンから
なる群から選択される治療薬からなる開口した創傷に適
用するための粘性のある親水性クリームを開発し、本発
明を完成するに至った。

【００１１】熱傷または漬瘍による壊死組織の創傷清浄
化については、治療薬が１種またはそれ以上のシステイ
ンプロテアーゼからなるものとする。好ましくは、シス
テインプロテアーゼが、パイナップル茎粉末由来のアナ
ナインおよびコモサインであり、ガラクトマンナン増粘
剤が、精製により蛋白およびエンドトキシンのレベルを
減じたグアランとする。

【００１２】治療薬とともに処方する親水性クリーム
を、典型的に、創傷の痂皮のごとき壊死組織に適用し、
創傷清浄化酵素を担体から組織へと拡散させる。数時間
以上にわたり１回以上の適用を含む、適当なクリーム塗
布を行った後、創傷部位を浄化し、クリームを除去す
る。

【００１３】好ましくは、本発明により調製する親水性
担体は、高度に精製した種子ガラクトマンナンにより増
粘したｏ／ｗクリームベースからなるものとし、好まし
くはローカスとビーンガムまたはグアランからなるもの
とする。本発明により調製する創傷清浄化剤は、２種の
パイナップル茎粉末由来の陽性システインプロテアーゼ
であるアナナインおよびコモサインからなり、グアラン
により増粘した親水性クリーム担体中に存するものとす
る。付加的な成分は、酵素活性化剤および細菌の増殖を
抑制する保存剤を含んでいてもよい。

【００１４】親水性クリーム担体は、２種の鍵成分から
なる。１つはｏ／ｗクリームベースであり、もう１つは
高度に精製したグアランまたはローカストビーンガムで
ある。

【００１５】親水性クリームベースは、次表の公称およ
び好ましい濃度範囲の、以下の成分を含有していてもよ
い（数値は重量％）。成分 公称濃度 好ましい濃度 油性物質 （油層） ０.５〜６０ ５〜４０ 乳化剤 ０.２〜１０ １〜５ 抗菌剤 保存剤 ０.０５〜２.５ ０.２〜１.５ 添加物 ０〜２０ ０〜５ 精製水 ＱＳＡＤ＊１００ ＱＳＡＤ１００ 添加物は、緩衝剤（りん酸ナトリウムのごとき）、保湿
剤（グリセリンまたはソルビトールのごとき）および当
業者に知られた他の賦形剤を含んでいてもよい。 ＊ＱＳＡＤは調製に十分量を表す。

【００１６】グアランはグアー種子（シアモプシス テ
トラゴノロブス（Cyamopsis tetragonolobus））の胚乳
から抽出したガラクトマンナンである。食品に使用する
等級のグアーガムは、デラウェア州ウィルミントンのア
クアロン社（Aqualon Company,Wilmington,DE）および
ニュージャージー州クリフトンのハイテック・ポリマー
ズ・インク社（Hi-Tek Polymers Inc.Clifton,NJ）をは
じめとする多くの業者から商業的に入手できる。食品に
使用する等級のグアーガムの技術的規格によると、不純
物として少なくとも４％の蛋白を含んでいる。この不純
物を含む製品は滅菌された形では販売されておらず、し
ばしばグアーガム１ｇあたり５００コロニー形成単位を
越える微生物が混在している。また、ウサギの発熱試験
（ＵＳＰXXII、１５１５ページ）において食品に使用す
る等級のグアーガムは発熱性であり、カブトガニ血球溶
解物試験（ＵＳＰ XXII、１４９３ページ）においてｍ
ｇあたり約５エンドトキシン単位という高い反応性を示
した。

【００１７】非常に高度に精製されたグアランを、限外
濾過および溶媒沈澱工程の組み合わせにより調製でき
る。文献（エフ・スミス（F.Smith）およびアール・モ
ントゴメリー（R.Montgomery）、ザ・ケミストリー・オ
ブ・プラント・ガムズ・アンド・ムシラクズ（The Chem
istry of Plant Gums and Mucilaqes）（１９５９年）
参照）記載の方法で調製されたか、あるいは、業者（デ
ラウェア州ウィルミントンのアクアロン社（Aqualon Co
mpany、Wilmington、DE））から購入した食品に使用する
等級のグアーガムが、本発明の出発物質として適当であ
る。０.２５％ないし０.５％、好ましくは０.２５％の
濃度にガムを水溶液中に懸濁する。水溶液は、塩（例え
ば、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウム）および／ま
たは緩衝剤（例えば、トリスまたは酢酸塩）を含有して
いてもよい。溶液のｐＨは、ｐＨ３ないしｐＨ９の間、
好ましくは約６.５である。所望であれば、メチルパラ
ベンのごとき抗菌剤を添加してもよい。

【００１８】４℃ないし８０℃の間で溶解を行うことが
でき、ゆるやかに溶液を撹拌あるいは振とうして溶解を
促進してもよい。溶液の粘度が１時間以上たっても増加
しなくなった時点で溶解が完了したとみなす。溶解後、
濾過すべき好ましい段階で、溶液を遠心分離または濾過
し、不溶物を除去してもよい。種々の市販の濾紙を使用
できる。例えば、ＮＡ１０００フィルター・カートリッ
ジ（カリフォルニア州サクラメントのエフピーアイ・イ
ンク社（FPI Inc.,Sacramento,CA））により、大きな不
溶粒子を除去する。さらなる濾過工程により濾過を行
い、溶媒沈澱を行ってもよい。例えば、ＮＡ６００フィ
ルター・カートリッジ、ＮＡ４５フィルター・カートリ
ッジおよび０.２μポシダイン（Posidyne）フィルター
・カートリッジ（ニューヨーク州グレンコアのポール社
（Pall;Gleln Core,NY））により、、以下の沈澱工程に
適した透明な溶液を得る。他のフィルターの組み合わせ
も可能である。濾過工程にて、発熱原性物質の大部分を
除去することができる。

【００１９】Ｃ₁〜Ｃ₄アルコールまたはアセトンのごと
き水混和性溶媒と混合することにより、グアランを濾液
から沈澱させる。好ましい溶媒としてはエタノールまた
はイソプロピルアルコールが挙げられる。グアラン溶液
を溶媒に添加、あるいは溶媒をグアラン溶液に添加のい
ずれかにより、満足な沈澱が得られるが、後者が好まし
い。エタノールを溶媒として用いた場合、エタノール：
グアランの体積比を１.５：１とすると満足な沈澱が得
られる。大部分のグアランは繊維状に沈澱する。グアラ
ンを集め、９５％水性エタノールで洗浄し、ついで、凍
結乾燥または真空乾燥にて乾燥する。

【００２０】本法により調製したグアランは蛋白含量
（＜０.２％ｗ／ｗ）およびエンドトキシン含量（０.０
３エンドトキシン単位；ＵＳＰ XXII、１４９３ペー
ジ）が著しく減少しており、ウサギに３３ｍｇ／ｋｇ
（ＵＳＰ XXII、１５１５ページ）で系統的に投与した
場合、非発熱原性である。そのうえ、該種子ガラクトマ
ンナンはその粘弾性を保持しており、高分子である。
「非常に高度に精製した」および「発熱原性のない」と
いう語はこれらの一般的性質を有する種子ガラクトマン
ナンを定義するものである。

【００２１】別々の水層および油層を６０〜７０℃で混
合することにより、高度に精製したグアランにより増粘
したｏ／ｗエマルジョンのごとき親水性クリーム担体を
処方してもよい。水層は、保存剤および種子ガラクトマ
ンナン増粘剤、および所望により緩衝剤を含有していて
もよい。油層は、水不溶性成分を含有する。担体の親水
性を最大にするには、油層を４０重量％以下に、好まし
くは約５％ないし３０％の間とする。本発明の目的の適
当なｏ／ｗ親水性クリーム担体は、例えば、フォックス
（Fox）に１９７３年９月２５日に付与された米国特許
第３,７６１,５９０号および以下の処方ＡおよびＢに記
載される：処方Ａ 重量パーセント セチルアルコール １２ 白ロウ １ 鉱物油 ３ プロピレングリコール ５ イミド尿素 ０.３ ポリオキシエチレンステアリルエーテル （ブリージ７２） ０.６ ポリオキシエチレンステアリルエーテル （ブリージ７２１） ４.０ ガラクトマンナン ２.５ 精製水 １００.０とするに十分な量処方Ｂ 重量パーセント 白灯油 ７.０ イソステアリルアルコール ５.０ モノリノレン酸グリセリド ５.０ セチルアルコール １.５ ソルビトール溶液ＵＳＰ ５.０ ベンジルアルコール １.５ ポリオキシル４０ステアレート ３.５ ポリオキシエチル（４）ラウリルエーテル １.０ ガラクトマンナン ２.５ 精製水 １００.０とするに十分な量

【００２２】ｏ／ｗエマルジョン型のいかなるクリーム
も本発明の目的に適する。しかしながら、最も好ましく
は、アナナインおよびコモサインまたは他の荷電した治
療薬と相互作用しうるイオン性物質を含有しないものと
する。好ましいクリームは、４０重量％以下の油層を有
し、最も好ましくは５ないし３０％の間とする。当業者
に知られた種々の成分を親水性クリームに含有させても
よいが、抗菌剤、保存剤、抗酸化剤、薬剤安定化剤、活
性化剤および緩衝剤に限定するものではない。

【００２３】担体中の種子ガラクトマンナン含量は、一
般的には約０.２％ないし約７％であり、好ましくは２
％ないし４％である。

【００２４】手順に従って担体を、ガラス製ビーカー中
に１ｋｇのスケールで調製することができる。スタティ
ック・ヘッド・ホモジナイザーを備えた研究室用ミキサ
ーまたは高速プロペラ・ミキサーを用いてグアランを懸
濁してもよい。好ましくは、グアランを室温で素早く加
え、水層の粘度が、グアランの分散がもはや機械的に不
可能であるところまで上昇する前に、均一な懸濁液とす
る。標準的な研究室用高速ミキサーにより、熱油層を熱
水層中に混合する。

【００２５】別法として、製造中に大量のグアランを均
一に親水性クリーム担体に取り込ませてもよい。このこ
とは、油層を水層に添加した後すぐに、激しく撹拌しな
がらグアランを熱エマルジョンに素早く加えることによ
り、達成できる。

【００２６】調製した担体を、滅菌バイアルに入れてバ
ッチ方式で熱滅菌するかまたは担体を適当なジャーに分
取し熱滅菌、たとえばオートクレーブする。滅菌した
後、油層の分散を維持させるために、７０℃以下になる
まで担体を水性ベース中に混合する。ビンの中での最終
的な滅菌の場合には、冷却している間、ビンを振とう
し、必要な分散を維持する。

【００２７】陽性のシステインプロテアーゼであるアナ
ナインおよびコモサインは、本発明の好ましい創傷清浄
化酵素である。本明細書中、「創傷清浄化酵素」なる語
は、熱創傷部位および真皮漬瘍から壊死組織を除去する
能力のある酵素を意味する。

【００２８】パイナップル茎粉末から、溶媒抽出、２度
のイオン交換クロマトグラフィー工程および透析濾過を
含む精製手順により、アナナインおよびコモサインを一
緒に精製する。２番目のイオン交換クロマトグラフィー
工程を逆相樹脂によるクロマトグラフィーに置き換えて
もよい。しかしながら、イオン交換クロマトグラフィー
が好ましい方法である。ｐＨ４.０〜９.０の水性緩衝
液、好ましくはｐＨ５.０の酢酸ナトリウムを用いて、
パイナップル茎粉末からの抽出をすることができる。ポ
リスルフォエチルアスパルトアミド（メリーランド州コ
ロンビアのポリエルシー社（PolyLC,Columbia,MD））お
よびＳ−セファロース（ニュージャージー州ピスカタウ
ェイのファルマシア社（Pharmacia,Piscataway,NJ))を
はじめとする種々の陽イオン交換樹脂、好ましくはＳ−
セファロースを用いてイオン交換クロマトグラフィーを
行うことができる。ｐＨ５.０にて、０.６Ｍ以下の低濃
度の緩衝剤／塩により、汚染物質を溶出することによ
り、最初のＳ−セファロースカラムでの精製を行い、つ
いで、高濃度の緩衝剤／塩により、部分精製されたアナ
ナインおよびコモサインを含むフラクションを溶出す
る。

【００２９】２番目のＳ−セファロースカラムでの精製
を、イオン強度効果およびｐＨ変化の組み合わせにより
行うことができる。結合親和性の低い残存汚染物質を、
低濃度の緩衝剤／塩により溶出し、ついで、ｐＨを上げ
て、好ましくはｐＨ９.０の炭酸ナトリウム緩衝液に
て、さらに汚染物質を溶出する。ｐＨ９.０で塩濃度を
上げるか、またはｐＨ５.０における高濃度の緩衝剤／
塩により、一緒に精製されるアナナインおよびコモサイ
ンを、２番目の陽イオン交換カラムから溶出することが
できる。２番目のイオン交換クロマトグラフィー工程に
好ましい溶出緩衝液は、ｐＨ５.０の１.６Ｍ酢酸ナトリ
ウムである。

【００３０】別法として、２番目のイオン交換工程を、
ポリスチレンジビニルベンゼン（マサチューセッツ州ケ
ンブリッジのパーセプティブ・バイオシステムズ（PerS
eptive Biosystems,Cambridge,MA））のような好ましい
クロマトグラフィー担体を用いた逆相クロマトグラフィ
ーに置き換えてもよい。ｐＨ５.０〜９.０の高濃度の緩
衝剤／塩中の逆相クロマトグラフィー系に酵素を適用
し、ついで、Ｃ₁〜Ｃ₃アルカノールを含む水性緩衝液で
逆相樹脂から酵素を溶出することができる。アナナイン
およびコモサインを一緒に溶出するに好ましい緩衝液
は、ｐＨ５.８の２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１５０
ｍＭ ＮａＣｌ中３６％エタノールである。

【００３１】一緒に精製されたアナナインおよびコモサ
インの塩濃度を、透析、ゲル濾過クロマトグラフィーま
たは透析濾過であるような好ましい方法をはじめとする
多くの方法で、減少させることができる。

【００３２】さらに、共溶媒としてアルカノールを用い
た場合、同様な透析、ゲル濾過クロマトグラフィーまた
は透析濾過法により、アルカノールを除去することがで
きる。分子量１０,０００ダルトンを排除限界とするＹ
Ｍ−１０膜（マサチューセッツ州ダンバースのアミコン
社（Amicon,Danvers,MA））を用いた限外濾過により、
精製および透析濾過した酵素を濃縮することができる。

【００３３】精製したプロテアーゼ混合物は、１５％Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのクーマシー染色により
２本の主なバンドを示す。２３,８００ダルトンに相当
する移動度を有する蛋白バンドはアナナインであり、２
４,４００ダルトンに相当する移動度を有する蛋白バン
ドはコモサインである。典型的に、使用時において、コ
モサインに対するアナナインの比率は、重量比で約５.
５：１である。プロテアーゼを凍結乾燥により単離し、
典型的に、使用時において、０.５〜５.０％となるよう
に、滅菌親水性クリーム中に処方する。

【００３４】本発明の実施に利用される他の治療薬は、
細菌の増殖を抑制するかまは細菌を撲滅すると定義され
る抗菌剤、ならびに成長因子および創傷の治癒を早める
薬剤と定義される創傷治療薬を含む。

【００３５】有効な治療薬を創傷部位に放出する送達担
体の有効性を、生体外で、適当な溶媒による治療薬の抽
出性を試験することにより、評価することができる。創
傷清浄化酵素であるアナナインおよびコモサインの担体
からの放出を評価するのに好ましい溶媒は、ｐＨ６.５
の５０ｍＭりん酸のごとき水性緩衝液である。担体およ
び溶媒の振とうまたは混合をはじめとする、多くの機械
的方法のいずれによっても、抽出を行うことができる。

【００３６】抽出操作に続いて、遠心分離により不溶物
を除去することができ、上部の油層から水層をピペット
で単離する。抽出溶媒に放出された治療薬の量を、いか
なる適当な分析法によっても、評価することができる。
創傷清浄化酵素であるアナナインおよびコモサインのご
とき蛋白の放出に関しては、プロテアーゼ活性および放
出蛋白量の双方を定量することができる。

【００３７】アナナインおよびコモサインの活性を、高
度に特異的な市販の色素生成基質により評価することが
できる。以前、アナナインおよびコモサイン測定用とし
て同定された、２種のかかる基質であるｂｚ−ＦＶＲ−
ＮＨＭｅｃおよびｚ−ＲＲ−ＮＨＭｅｃは、１９９２年
４月２１日付けの米国特許第５,１０６,６２１号にそれ
ぞれ記載されている。同様の方法で、これらのクマライ
ド結合ペプチド基質（ＮＨＭｅｃ）、ｐ−ニトロアニリ
ド結合類似体（ｐＮＡ）、ｂｚ−ＦＶＲ−ｐＮＡおよび
ｚ−ｒｒ−ｐＮＡは、アナナインおよびコモサインに対
し、同様の特異性を示す。蛋白を基礎とした治療薬の放
出を、いかなる標準的な蛋白分析法、好ましくはブラッ
ドフォード（Bradford）分析により評価することができ
る。

【００３８】本発明のガラクトマンナンで増粘した担体
は、増粘剤を含まないように処方した担体と比較した場
合、創傷清浄化酵素アナナインおよびコモサインの放出
において、効果的である。陰イオン性多糖増粘剤である
カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびキサンタ
ンガムとともに処方した担体は、送達に関してより効果
的でなかった。

【００３９】創傷部位への治療薬の送達における、ガラ
クトマンナンで増粘した親水性クリーム担体の有効性
を、適当な動物モデルを用いて評価することができる。
熱傷の痂皮へのアナナインおよびコモサイン創傷清浄化
酵素混合物の送達における、ガラクトマンナンで増粘し
た担体の有効性を評価するために、ブタの皮膚全厚にわ
たる熱傷のモデルを用いた。担体中の治療薬を適当な濃
度で処方する。精製した創傷清浄化酵素を、治療期間１
０時間にわたって、乾燥した皮膚全厚にわたる傷の完全
な創傷清浄化を達成するに十分な濃度となるよう担体中
に処方した。

【００４０】いかなる適当な治療処方も、１０時間にわ
たる治療期間において２および５時間目の創傷清浄化酵
素の適用についての好ましい処方による治療薬の送達に
よる。治療薬とともに処方した親水性クリームを、創傷
清浄化酵素アナナインおよびコモサインの送達に関して
好ましい適当な１.５ｍｍ〜２.０ｍｍの厚さで適用する
ことができる。治療期間において、バイオクルージブ^TM
（ニュージャージー州ニュー・ブランズウィックのジョ
ンソン・アンド・ジョンソン社（Johnson & Johnson,Ne
w Bruswick,NJ））またはテガダーム（ミネソタ州セン
ト・ポールの３Ｍ社（3M,St.Paul,MN))のごとき密閉包
帯で創傷部位を覆ってもよい。

【００４１】顕微鏡的方法を用いて、酵素的創傷清浄化
剤の有効性を評価してもよい。皮膚全厚にわたる熱傷の
創傷清浄化の評価については、痂皮の量および創傷部位
に残存する体毛の量の両方を用いた。４匹のブタについ
ての創傷清浄化試験の結果は、ガラクトマンナンで増粘
した担体が、有効に創傷清浄化酵素アナナインおよびコ
モサインを送達することを示した。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定される
ものではない。 実施例１−高度に精製したグアランの調製 ８０℃で３時間以上混合しながら、６２５ｇのグアーガ
ム（デラウェア州ウィルミントンのアクアロン社（Aqua
lon Company,Wilmington,DE））を、２５０Ｌの注射用
水（ＵＳＰ）中に水和させる。混合物をペリスタリック
・ポンプにて、ＮＡ６００膜（５μｍ、１８平方フィー
ト）およびＮＡ４５膜（０.３μｍ、１８平方フィー
ト）のセルロース深型フィルター・カートリッジ（カリ
フォルニア州サクラメントのエフピーアイ・インク社
（FPI Inc.,Sacramento,CA））を通過させる。操作中に
フィルター・カートリッジが詰まった場合には交換す
る。グアラン含有溶液すべてを処理するのに、全部で３
個のＮＡ６００フィルター・カートリッジおよび２個の
ＮＡ４５フィルター・カートリッジを要した。グアラン
含有溶液を０.２μｍポシダイン・フィルター・カート
リッジ（ニューヨーク州グレンコアのポール社（Pall;G
len Core,NY））を通す濾過により、発熱原物質をさら
に減少させた。全溶液を処理するのに、約６個のポシダ
イン膜カートリッジ（２０インチ）を要した。グアラン
をさらに精製し、１.５倍容の９５％エタノールを濾液
に添加することにより集めた。沈澱となったグアランを
沈降させ、３０Ｌの９５％エタノールで２回洗浄した。
最終的に精製したグアラン多糖を遠心分離によって集
め、４０℃で１００ミリトールにて２４時間乾燥させ
た。本法により精製したグアランは、表１に示した一般
的性質を有していた。表１ 非常に高度に精製したグアランの性質 性質 値 試験方法 ガラクトマンナン含量 ＞９５％ 単糖の分析 外観 白色繊維状 肉眼観察 または粉末 分子量 １.０〜２.０×１０⁶ ＳＥＣ ＭＡＬＬＳ ダルトン ＴＳＫ ＰＷ４０００ −ＰＷ６０００ ０.５％溶液、ｐＨ＝１０ 蛋白含量 ＜０.２％ ブラッドフォード 微量分析（ＢＳＡ標準） エンドトキシン・レベル ＜０.０３ＥＵｍｇ^-1 ＵＳＰ ＬＡＬ試験 発熱原性 非発熱原性 ＵＳＰ発熱原試験 （３３ｍｇｋｇ^-1）

【００４３】実施例２−プロテアーゼ混合物の調製 使用緩衝液は、緩衝液Ａ：０.３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５.０）、１.０ｍＭＥＤＴＡ；緩衝液Ｂ：０.３７５
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）、１.０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ；緩衝液Ｃ：０.６Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）、
１.０ｍＭ ＥＤＴＡ；緩衝液Ｄ：１.５Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ５.０）、１.０ｍＭＥＤＴＡ；緩衝液Ｅ：５０
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）；緩衝液Ｆ：６３ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ９.０）、２５ｍＭ塩化ナトリ
ウム；緩衝液Ｇ：０.５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.
０）、１.０ｍＭ ＥＤＴＡ；緩衝液Ｈ：２０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、１.０ｍＭ ＥＤＴＡ。２ｋｇの粗パイナップ
ル茎粉末（ニューヨーク州ニューヨークのエンザイム・
ディベロップメント・コーポレーション社（Enzyme Dev
elopment Corporation,New York,New York））を、混合
しながら２０Ｌの緩衝液Ａにて抽出した。１時間後、
５,９００ｇ、２５分の遠心分離、ついで、公称０.２μ
ｍのフィルター・カートリッジ（ニューヨーク州ボヘミ
アのザルトリウス社（Sartorius,Bohemia,NY））による
濾過からなる方法により不溶性粒子を除去した。得られ
た透明な上清を、緩衝液Ｂであらかじめ平衡化しておい
た１８ＬのＳ−セファロースカラム（ニュージャージー
州ピスカタウェイのファルマシア社（Pharmecia,Piscat
away,NJ））に適用した。続いて、１２６Ｌの緩衝液Ｂ
で樹脂を洗浄し、ついで、緩衝液Ｃで洗浄した。陽性シ
ステインプロテアーゼであるアナナインおよびコモサイ
ンは、３６Ｌの緩衝液Ｄとともに溶出した。このプロテ
アーゼのフラクションを、２番目のＳ−セファロースカ
ラムにより、さらに精製した。アナナインおよびコモサ
インを含むフラクションを、脱イオン水で４倍に希釈
し、緩衝液Ｅで平衡化した３ＬのＳ−セファロースカラ
ムに適用した。続いて、６Ｌの緩衝液Ｅでカラムを洗浄
し、９Ｌの緩衝液Ｆ、６Ｌの緩衝液Ｅおよび１８Ｌの緩
衝液Ｇで洗浄した。 精製されたアナナインおよびコモ
サインを、８Ｌの緩衝液Ｄで溶出した。このフラクショ
ンを、アミコン・スパイラルＹＭ−１０膜を用いて、緩
衝液Ｈに対して透析濾過した。最終緩衝液濃度が２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム、１.０ｍＭＥＤＴＡの時点で透析濾
過を完了した。続いて、アナナインおよびコモサインプ
ロテアーゼを、同じ透析濾過システムを用いて、５０ｍ
ｇ／ｍＬにまで濃縮した。濃縮したプロテアーゼ溶液
を、１２.５±２.０ｍＭのＬ−システイン濃度となるよ
う調節し、ついで、凍結乾燥にて精製プロテアーゼを単
離した。

【００４４】実施例３−グアランで増粘した親水性送達
担体の処方 ７０℃のウォーターバス中の２Ｌビーカー中で、１００
ｇの白灯油（ペンシルバニア州バトラーのペンレコ社
（Penreco,Butler,PA））、１５０ｇのステアリルアル
コール（オハイオ州ダブリンのシェレックス・ケミカル
・カンパニー・インク社（Sherex Chemical Co.,Inc.,D
ublin,OH））４０ｇのミリスチン酸イソプロピル（ペン
シルバニア州フィラデルフィアのイノレックス・ケミカ
ル・カンパニー社（Inolex Chemical Co.,Philadelphi
a,PA））、２.５ｇのソルビタンモノオレエート（デラ
ウェア州ウィルミントンのアイシーアイ・スペシャルテ
ィー・ケミカルズ社（ICI Specialty Chemicals,Wilmin
gton,DE））、２２.５ｇのポリオキシル４０ステアレー
ト（デラウェア州ウィルミントンのアイシーアイ・スペ
シャルティー・ケミカルズ社（ICI Specialty Chemical
s,Wilmington,DE））、２.４ｇのプロピルパラベン（ペ
ンシルバニア州フィラデルフィアのイノレックス・ケミ
カル・カンパニー社（Inolex Chemical Co.,Philadelph
ia,PA））を混合することにより、油層を調合し、全て
の成分を融解し混合し、溶解させた。まず、担体緩衝液
を調製することにより、水層を調合した。緩衝液は、１
３０５ｇの注射用水（ＵＳＰ）中に、１１.３４ｇの１
塩基りん酸ナトリウム１水和物（ケンタッキー州パリス
のマリンクロッド・スペシャルティー・ケミカルズ社
（Mallinckrodt Specialty Chemicals,Paris,KY））、
１.８４ｇの水酸化カリウム（ケンタッキー州パリスの
マリンクロッド・スペシャルティー・ケミカルズ社（Ma
llinckrodt Specialty Chemicals,Paris,KY））を含有
していた。緩衝液のｐＨを、水酸化カリウムまたはりん
酸ナトリウムのいずれかにより、６.５±０.１に合わせ
た。６１６ｇの緩衝液に、３.０ｇのメチルパラベン
（ペンシルバニア州フィラデルフィアのイノレックス・
ケミカル・カンパニー社（Inolex Chemical Co.,Philad
elphia,PA））および５０ｇのグリセリン（オハイオ州
シンシナティのクアンタム・エメリー・ディブ社（Quan
tum,Emery Div.,Cincinatti,OH））を添加した。上記物
質を混合することにより溶解した後、２７.５ｇの実施
例１の高度に精製したグアランを激しく混合しながら添
加し、５秒以内に均一なグアランの懸濁液を調製した。
調合した水層を、さらに１０分間混合し、粘度を増加さ
せた。２層を混合するために、まず、調合した水層を、
ウォーターバス中で６５ないし７０℃の間に加熱した。
調合した７０℃の油層を水層に添加し、１０分間混合し
た。５０ｇの担体を、ポリエチレン製スクリューキャッ
プ栓のついた１００ｍＬのパイレックスガラス製コンテ
ナーに分注し、ゆっくりと排気することにより１２１
℃、１５分間オートクレーブした。オートクレーブ室が
室温になったらすぐに、ビンを取り出し、ビンが５０℃
以下になるまで、２分おきに約１０秒間ずつ、手で振と
うした。

【００４５】実施例４〜７−他の多糖増粘剤を用いたク
リームの調製 高度に精製したグアランに代えて、他の多糖増粘剤を用
いた以下は、実施例３記載により製品を調製した。増粘
剤を、適当な粘性のある標品を与える高度に精製したグ
アランと同程度の濃度に処方した。以下の標品を処方し
た： 実施例４ 増粘剤を含有せず 実施例５ ２５ｇローカストビーンガンム含有 実施例６ ２７.５ｇキサンタンガム含有 実施例７ ２０ｇカルボキシメチルセルロースナトリウ
ム含有

【００４６】実施例８−創傷清浄化処方の調製 実施例２の創傷清浄化酵素混合物を、適用直前に、担体
中に凍結乾燥酵素粉末を混合することにより、実施例３
〜７の担体中に処方した。実施例９記載の適用について
は、通常、酵素を５％（ｗ／ｗ）の濃度で、実施例１０
記載の適用については、４.５％の濃度で処方した。

【００４７】実施例９−酵素送達有効性に関する生体外
分析 実施例３〜７記載の創傷清浄化処方の０.５ｍＬを、そ
れぞれ２.０ｍＬのｐＨ６.５の５０ｍＭりん酸緩衝液に
て抽出した。創傷清浄化処方を３ｃｃの注射筒に入れ、
注射筒を三方コックを介して抽出用緩衝液の入った別の
３ｃｃの注射筒に接続することにより、抽出を行った。
抽出用緩衝液を、創傷清浄化処方の入った注射筒に三方
コックを介して機械的に移し、ついで、緩衝液の入って
いたもとの注射筒に戻した。この操作を１０回繰り返し
た。１４,０００ｇ、４分間の微量遠心分離により、残
存する担体成分を、抽出系から除去した。生じたペレッ
トと微量遠心チューブの上層の比重の小さいフタ状物と
の間から、約０.４ｍＬの水層を、２２ゲージ注射針に
適合する注射筒を用いて抜き取った。水層の酵素含量
を、蛋白および酵素活性の両方により測定した。蛋白定
量は、ブラッドフォード・プロテイン・アッセイ（メリ
ーランド州ベセスダのバイオ・ラッド社（Bio-Rad,Beth
esda,MD）を用いて行った。活性測定は、発色性のｂｚ
−ＦＶＲ−ｐ−ニトロアニリドおよびｚ−ＲＲ−ｐ−ニ
トロアニリドプロテアーゼ用基質（ペンンシルバニア州
フィラデルフィアのバケム・バイオサイエンス・インク
社（Bachem Bioscience Inc.,Philadelphia,PA））を用
いて行った。ｐ−ニトロアニリド基質の保存溶液は、以
下の組成である：最終体積１.０ｍＬ中、ｐＨ７.５のＨ
ｅｐｅｓ緩衝液、５.０ｍＭＬ−システイン、０.１ｍＬ
の２０ｍＭｂｚ−ＦＶＲ−ｐＮＡアナナイン測定用基質
または０.０４ｍＬのｚ−ＲＲ−ｐＮＡコモサイン測定
用基質のいずれか、および０.０５ｍＬの適当に希釈し
た水層。基質としてｂｚ−ＦＶＲ−ｐＮＡを用いる場合
には、水層を４００倍に、基質としてｚ−ＲＲ−ｐＮＡ
を用いる場合には、４０倍に希釈した。抽出分析の結果
を、酵素活性および増粘剤なしで処方した担体から抽出
した蛋白の量に関して、以下の表２に示す。 表２：創傷清浄化酵素抽出分析 担体 抽出された酵素単位＊ 抽出された蛋白＊ 増粘剤 ｂｚ−ＦＶＲ−ｐＮＡ ｚ−ＲＲ−ｐＮＡ なし １.０ １.０ １.０ グアラン ０.９ ０.９ ０.９ ローカストビーンガム ０.９ ０.９ ０.９ キサンタンガム ＜０.１ ＜０.１ ＜０.１ カルボキシメチル ０.９ ０.７ ０.９ セルロース ＊増粘剤なしで処方した担体で得られた値に対する相対
値 これらのデータは、アナナインおよびコモサインが、ガ
ラクトマンナンで増粘した担体から、同程度に効率良く
抽出されうることを示す。陰性のキサンタンガムで増粘
した担体から抽出した場合、抽出された酵素量は最少で
あり、カルボキシメチルセルロースで増粘したクリーム
から抽出した場合、２種の酵素の抽出量が異なってい
た。

【００４８】実施例１０−有効性の生体内での適用 ４匹の麻酔したブタ（〜５０ｋｇ）のそれぞれの背中に
皮膚全厚にわたる１２カ所の３.５×３.５ｃｍ四方の傷
を負わせた。オーブン中で１００℃に加熱した１２.２
５ｃｍ²の面積を有する６０グラムのアルミニウム・ブ
ロックで、熱傷を形成させた。動物の皮膚表面に、１.
２×１０⁴Ｐａの力で４５秒間、押し付けた。熱傷を形
成した後すぐに、傷からケラチン層を、ガーゼで拭き取
ることにより除去し、傷を約２４時間乾燥させた。処理
後、ブタを再び一旦麻酔し、それぞれの創傷部位に２.
２ｇのグアランで増粘した創傷清浄化処方を適用し、適
用物を密閉包帯、バイオクルージブ^TM（ニュージャージ
ー州ニュー・ブランズウィックのジョンソン・アンド・
ジョンソン社（Johnson&Johnson,New Brunswick,NJ））
で覆った。５時間後、処方を除去し、創傷清浄化された
痂皮をプラスチック製薬さじでかき取り、部分的に創傷
清浄化した傷を、生理食塩水を浸したガーゼで拭浄し
た。ついで、さらに２.２ｇの創傷清浄化処方を、それ
ぞれの傷に適用し、さらに５時間創傷清浄化を進行させ
た。処理後１０時間で、５時間の時点で記載したよう
に、傷を洗浄創傷清浄化酵素、創傷清浄化の程度につい
て顕微鏡的に観察記録した。

【００４９】顕微鏡的評価：顕微鏡的評価を、２つのマ
ーカーに基づいて行った；すなわち、融解したコラーゲ
ンに対する創傷清浄化および真皮深部にある毛胞のごと
き壊死細胞に対する創傷清浄化である。以下の基準を用
いた。スコア 創傷面の様子 ０ 創傷清浄化なし １ 毛胞上のみ痂皮清浄化 ２ 幾分体毛除去、痂皮清浄化 ３ 全体毛除去、痂皮清浄化 １０時間の処理期間後、すべての創傷は、平均スコア
２.６６（Ｎ＝４０）で、優れた清浄化を示した。これ
と同じモデルを用いて、無処理の創傷あるいは担体のみ
で処理した創傷は、スコア０を示す。これらのデータ
は、ガラクトマンナンで増粘した担体が、創傷清浄化酵
素の送達に効果的であることを示す。

【００５０】

【発明の効果】本発明によれば、適当な増粘剤により増
粘された、創傷部位への治療薬の効果的な送達が可能で
あり、創傷清浄効果に優れた親水性クリームが提供され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェイムズ・アール・ラスムッセン アメリカ合衆国02142マサチューセッツ州 ケンブリッジ、ケンブリッジ・パークウェ イ75−83番 イー−411

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水性担体、創傷清浄化酵素、創傷治療薬
   および抗細菌剤からなる群より選択される治療薬、なら
   びに非発熱原性の種子ガラクトマンナン増粘剤からなる
   開口した創傷または粘膜に適用するための親水性クリー
   ム。
2. 【請求項２】 ｏ／ｗ型である請求項１記載の親水性ク
   リーム
3. 【請求項３】 ガラクトマンナンがグアーガムまたはロ
   ーカストビーンガム由来である請求項１記載の親水性ク
   リーム。
4. 【請求項４】 ガラクトマンナンがグアランである請求
   項３記載の親水性クリーム。
5. 【請求項５】 創傷清浄化酵素がパイナップル茎粉末由
   来である請求項１記載の親水性クリーム。
6. 【請求項６】 酵素がアナナイン(ananain)およびコモ
   サイン(comosain)である請求項５記載の創傷清浄化酵
   素。
7. 【請求項７】 開口した創傷が熱傷または漬瘍である請
   求項１記載の親水性クリーム。
8. 【請求項８】ａ）水和ガラクトマンナン水溶液から不溶
   性物質を除去し、 ｂ）該溶液を陽性の膜に通して発熱原性物質を除去し、 ｃ）該溶液から非発熱原性ガラクトマンナンを沈澱させ
   る工程からなることを特徴とする非発熱性の種子ガラク
   トマンナンの製法。
9. 【請求項９】 ガラクトマンナンがグアランである請求
   項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項８の方法により調製される発熱
    原を含まないグアラン。