KR20220150024A

KR20220150024A - 융모막 추출물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20220150024A
Application number: KR1020210057205A
Authority: KR
Inventors: 송재준; 고윤영
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2021-05-03
Filing date: 2021-05-03
Publication date: 2022-11-10
Also published as: KR102523933B1; WO2022235031A1

Abstract

본 발명은 융모막 추출물 내 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진, 골질환 예방 및 치료 효과를 갖는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 태반 속 융모막을 추출물화하여 제조한 융모막 추출물 내 엑소좀(exosomes)의 우수한 골형성 촉진 효능에 관한 것이다.

Description

융모막 추출물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR STIMULATING BONE FORMATION COMPRISING EXOSOMES ISOLATED FROM CHORION MEMBRANE EXTRACT}

본 발명은 융모막 추출물 내 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 태반 속 융모막을 추출물화하여 제조한 융모막 추출물 내 엑소좀(exosomes)의 우수한 골형성 촉진 효능에 관한 것이다.

양막(amnion membrane)은 태반을 구성하고 있는 가장 안쪽에 있는 막으로, 양수와 태아를 둘러싸고 있어 태아를 외부의 병원균으로부터 보호하고 양수와 태아의 생체항상성을 유지하여 태아가 정상적으로 성장 및 발달할 수 있는 환경을 조성하는 역할을 한다. 1910년 Davis가 처음 양막을 생체 재료로 사용한 후(Davis JW et al., Johns Hopkins Hosp Rep, 15; 307, 1910) 화상, 창상 및 안과 수술 후 상처 치유의 목적으로 널리 사용되고 있다(Faulk WP et al., The Lancet, 315(8179):1156-1158, 1980, Mohammadi AA et al., Burns, 39(2):349-353, 2013, Dua HS et, al., Survey of Ophthalmology, 49(1):51-77, 2004). 양막은 표피세포 성장인자 (epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 전환 성장인자 (transforming growth factor, TGF-b), 신경 성장인자 (nerve growth factor, NGF) 및 간장 성장인자 (hepatic growth factor, HGF)등을 포함하고 있는 것으로 알려져 있고, 그 자체로 콜라겐으로 구성된 세포 외 기질과 상피세포로 구성되어 있으며 항염증 (anti-inflammation), 항균 (anti-bacterial) 성분 및 혈관생성 조절 성분 (angiogenic modulatory properties)들이 있다(Hao Y et al., Cornea, 19(3):348-352, 2000).

엑소좀 (exosome)은 세포밖 소포체, 세포 외 소포 (EVs, extracellular vesicles), 분비성 미세소포 등으로 알려졌으며 세포 간 정보교환을 위해 세포들이 외부 환경으로 분비하는 나노 크기의 소포체이다(Thry C et al., J Extracel Vesic. 2018;7(1):1535750.). 엑소좀은 단백질, 지질, 핵산, 대사물질 등 생물학적 활성을 보이는 다양한 물질들을 포함하여 이러한 기능적 수하물을 운반하는 매개체로 세포 간 소통의 역할을 수행하는 것으로 알려졌으며, 최근에는 엑소좀 내 miRNA가 생체 내 중요한 기능을 수행하는 것으로 알려졌다(Yez-M M et al., J Extracel Vesic. 2015;4:27066, Colombo M et al., Ann Rev Cell Dev Biol. 2014;30:25589, Valadi H et al., Nat Cell Biol. 2007;9(6):6549). 엑소좀은 다양한 체액에서도 발견되어 질병의 진단에도 사용되고 있으며, 비교적 안정적으로 제조와 보관이 가능하여 진단 및 치료제로 개발되고 있다.

인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호해 주는 뼈는 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질, 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 성장이 끝난 성인의 뼈는 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 되는데, 이를 골재형성(bone remodeling)이라고 한다(Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl);664-669, 2005). 이러한 뼈의 순환은 성장과 스트레스에 의해 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 그 기능을 유지하는데 필수적이다. 성인에서는 매년 골격의 약 10 ~ 30%가 골흡수-골형성의 리모델링을 통하여 재형성된다.

골재형성은 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)가 관여하며 서로 밀접한 연관성으로 골의 항상성이 유지된다. 예를 들어, 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-kligand), 및 그의 유도 수용체인 OPG(osteoprotegerin)과 같은 물질의 분비를 통해 골흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내의 골 항상성을 유지한다. 이러한 골의 항상성이 물리적 영향, 호르몬 체계 등에 의해 유지되지 않은 경우 및 골조직 손상시 동반되는 골질환의 치료와 관련하여 과거에는 주로 골 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사 이상만을 중심으로 연구가 진행되어 왔으며, 그 기전 규명에 있어서 진전을 보지 못하였다. 일반적으로, 골다공증의 치료 및 예방을 위하여 칼슘이 함유된 식이요법이 추천되며, 폐경기의 여성들에게는 에스트로겐 또는 비타민 D 투여가 추천되고 있다. 그 외에, 포사맥스(Fosamax, 성분명: alendronate)와 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열이 파골세포를 억제하고 사멸을 유도하는 골흡수 억제제로서 새로운 대체 치료제로 주목받고 있다. 그러나, 골질환 치료제로 널리 사용되는 칼슘보강제는 부갑상선 호르몬의 분비를 억제하며 골흡수에 의한 골량 감소를 방지하나, 골량 유지의 개인 차이가 심한 것으로 알려져 있다(Heandy R.P. principles of bone biology, Academic press, 1007-1017, 1996). 또한, 에스트로겐이나 칼시토닌을 이용한 호르몬 요법의 경우 골밀도를 증가시키고 직장암의 발생을 감소시킨다는 보고도 있으나, 유방암, 심근경색, 정맥 혈전증 등의 부작용이 보고된 바 있다(Nelson, H.D et al., JAMA, 288:872-881, 2002; Lemay, A., J.Obstet. Bynaecol. Can., 24:711-7152-3). 또한, 비스포스포네이트 제제의 경우, 최근 복용하는 환자에서 턱뼈의 괴사, 중증 심방세동, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 해마다 증가되고 있다(Coleman RE., Br J Cancer, 98:1736-1740(2008). 따라서 부작용 발현이 적으면서도 효과적으로 골흡수를 억제할 수 있는 새로운 골질환 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

종래에는 융모막 추출물 내 엑소좀의 조골세포의 분화 및 골형성 촉진에 대한 효능이 개시된 적이 없었으며, 골재생을 요하는 질환 등에 융모막 추출물의 엑소좀이 이용된 바가 없다. 이에, 본 발명자들은 융모막 추출물 내의 엑소좀을 분리 분석하고 조골세포의 골분화 유도 시 융모막 추출물보다 융모막 추출물 내 엑소좀 처리 시 골재생 촉진 효능이 우수한 것을 확인하여 발명으로 제공하고자 한다.

한국등록특허 제10-1701227호 한국등록특허 제10-1824521호

본 발명은 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용, 및 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 골질환은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 골형성장애, 퇴행성 골질환 또는 부정교합 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 세포 외 소포체는 엑소좀, 미세소포체, 또는 마이크로파티클 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 세포 외 소포체는 1×10¹⁰ 내지 1×10¹²particles/well(여기서, well은 24well을 의미함)의 농도를 가질 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 세포 외 소포체는 평균 입자크기가 100nm 내지 150nm일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 조성물은 HA/bTCP(hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate) 지지체와 혼합되어 사용될 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용 액으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체는 조골세포의 분화와 골형성을 촉진할 수 있다.

또한, 본 발명의 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체는 융모막 추출물과 비교하여 우수한 미네랄 침착도를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체는 융모막 추출물 또는 융모막/양막 복합 추출물을 사용하는 것보다 우수한 골형성 효과(칼슘 침착평가)를 보여준다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 양막 추출물과 융모막 추출물 내의 엑소좀을 분리하여 분석한 결과이다.
도 2는 양막 추출물과 융모막 추출물의 ALP 활성도를 나타낸 것이다.
도 3은 분화 후 14일째의 융모막 추출물과 추출물 내 엑소좀의 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색 결과이다.
도 4는 양막, 양막/융모막 추출물, 및 융모막 추출물의 골재생 효능을 비교실험한 결과이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물이 제공된다. 상기 골형성 촉진은 임플란트시 조골세포의 골형성 촉진을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 '세포 외 소포체'는 세포가 외부 환경으로 분비하는 나노 크기의 소포체를 말하며, 엑소좀(exosomes), 마이크로파티클(microparticles), 미세소포체 및 마이크로베지클(microvesicles)을 포함한다.

상기 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체는, 인간의 태반으로부터 융모막을 분리하여 추출하는 단계; 상기 융모막 추출물에 엑소퀵(Exoquick)용액을 처리하고 원심분리하여 세포 외 소포체를 수집하는 단계; 를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.

상기 골형성 촉진은 융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체가 조골세포의 분화를 촉진하여 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 '골질환'은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 골형성장애, 퇴행성 골질환 또는 부정교합 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

일 측에 따르면, 상기 세포 외 소포체는 엑소좀, 미세소포체, 마이크로베지클 또는 마이크로파티클 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상술한 정의대로 세포가 외부환경으로 분비하는 막성 소포체로서 내부에 지질, 핵산, 단백질, 대사물질 등 생물학적 활성을 보이는 다양한 물질을 포함할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 세포 외 소포체는 1×10¹⁰ 내지 1×10¹²particles/well의 농도를 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포 외 소포체는 1×10¹²particles/well의 농도를 가질 수 있다.

상기 농도에서 융모막 추출물 내의 세포 외 소포체 조성물은 높은 ALP활성도와 미네랄 침착도를 보여주고, 우수한 조골세포 분화 촉진 및 골형성 촉진 효능을 가질 수 있다.

상기 ALP활성도는 조골세포의 초기 분화 및 골형성 지표로서, ALP(Alkaline Phosphatase)효소가 활성화된 정도를 나타낸다. 바람직하게는 아나스펙, Inc, Fermont, Canada의 ALP 키트를 사용하여 405 ㎚에서 측정될 수 있다.

상기 미네랄 침착도는 조골세포의 중후반 분화의 마커로 널리 이용되는 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S) 염색으로 평가될 수 있다. 바람직하게는 Millipore 사의 염색액을 제조사의 지침에 따라 사용하여 측정할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 세포 외 소포체는 평균 입자크기가 100nm 내지 150nm일 수 있다. 도 1의 양막 및 융모막 추출물 내의 엑소좀 크기를 보면, 융모막 추출물 내의 엑소좀이 양막 추출물 내의 엑소좀 보다 작은 것을 확인할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 조성물은 HA/bTCP(hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate) 지지체와 혼합되어 사용될 수 있다. HA/bTCP는 골재생 복합 지지체 등으로 이용되는 것으로, 상기 조성물에 포함하여 사용하는 경우, 골재생 효과를 높일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예1: 융모막 추출물의 제조

태반에 탯줄을 중심으로 칼집을 내고 양막을 태반으로부터 조심스럽게 박리하여 양막과 융모막으로 분리하여 채취하였다. 채취한 융모막은 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 첨가된 PBS 또는 생리식염수에 세척하였다. 융모막의 점액질과 혈액을 제거한 후 호모지나이저를 이용하여 분쇄시켰다. 융모막의 질량(g)과 PBS의 부피(mL)를 1:1의 비율로 하여 완충용액을 넣고 16시간(overnight) 동안 4℃에서 단백질이 방출되도록 하였다. 초음파 분쇄기를 이용하여 단백질이 방출되도록 한 후 원심분리기를 이용하여 추출물을 원심분리하여 상층액을 수집한 다음 실린지 필터하여 -80℃에 보관하였다. 융모막 추출물은 단백질의 농도를 측정하여 적정량을 실험에 사용하였다.

실시예2: 융모막 추출물 및 양막 추출물 내 엑소좀의 확인

융모막 추출물 및 양막 추출물을 각각 1mL에 0.2mL의 Exoquick 용액 (SBI 제조)을 섞어서 16시간(overnight) 동안 4℃에서 엑소좀이 분리되도록 한 후 원심분리기를 이용하여 엑소좀을 수집하였다. 분리된 엑소좀은 1/10 또는 1/20으로 희석하여 NTA 장비를 이용하여 사이즈와 농도를 분석하였고, TEM 장비를 이용하여 이중인지질 모양의 엑소좀을 확인하였다.

도 1에 따르면, 양막 추출물(AME)과 융모막 추출물(CME) 내의 엑소좀의 사이즈는 100nm 내지 150nm 범위에 속하나, 융모막 추출물 내의 엑소좀 사이즈가 더 작은 것을 알 수 있다. 한편, 각 추출물의 mg당 엑소좀의 수를 확인한 결과, 융모막 추출물 내의 엑소좀 농도가 양막 추출물 내의 엑소좀 농도보다 훨씬 높은 것(2.40×10¹³)을 확인할 수 있다.

실시예3: 융모막 추출물의 골형성 효과 측정

본 발명에서는 인간 골육종 세포주인 MG-63(한국세포주은행, KCLB)을 in vitro 골형성 실험에 사용하였으며, 상기 세포주는 조골세포와 유사한 세포로 알려져 있다. 배양조건은 10%(v/v) FBS(Fetal bonine serum) 및 1%(w/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37℃ 5% CO₂의 습윤한 환경에서 세포를 배양하였다.

실시예3-1: ALP 활성도 측정

골형성시 초기 단계에 나타나는 골 형성 지표인 ALP 효소 활성도를 측정하는 실험을 실시하였다. 융모막 추출물 내 엑소좀의 ALP의 효과를 확인하기 위하여, 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM), 상기 배지에 각각 양막 추출물, 양막 추출물 내의 엑소좀, 융모막 추출물, 및 융모막 추출물 내의 엑소좀을 처리한 실시예의 ALP활성도를 측정하였다. 이때, 융모막 추출물 및 양막 추출물 내의 엑소좀은 각각 1×10¹⁰particles/well, 1×10¹¹particles/well, 1×10¹²particles/well(24well 기준)으로 처리하였다. 융모막 추출물의 경우, 상기 골형성 유도 배지에서 MG-63 세포에 200 ㎍/well의 농도로 처리하였다.

구체적으로는, 3일 및 7일째의 시료를 취하여, 차가운 PBS buffer로 2회 세척한 다음, 0.1% Triton X-10이 첨가된 세포막 분해 용액(cell lysis buffer)으로 용해(lysis) 시켰다. 용해된 세포를 섭씨 4도, 13000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 회수하여 브래드포드법으로 정량하고, 동량의 단백질을 ALP kit(아나스펙, Inc, Fermont, Canada)로 제조사의 지침에 따라 405 ㎚에서 ALP 활성도를 측정하였으며, 그 결과를 도 2및 도 4에 나타내었다. 도 2에 의하면, 아무것도 처리하지 않은 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM), 양막 추출물 및 양막 추출물 내의 엑소좀에서는 ALP 활성도가 나타나지 않았고, 융모막 추출물 내의 엑소좀이 처리된 군은 기타 실험군에 비하여 높은 ALP 활성도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(*P<0.05). 특히, 1×10¹²particles/well의 경우, 다른 실험군에 비하여 매우 높은 ALP활성도가 나타났다.

실시예3-2: Alizarin Red S 염색 평가

알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색 평가는 조골세포의 분화 중 중후반 지표로 널리 사용된다. 융모막 추출물과 융모막 추출물 내 엑소좀의 미네랄 침착도를 비교하기 위하여, Alizarin Red S 염색 평가 실험을 실시하였다. 동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후, 각각 200㎍/well 융모막 추출물(200㎍/well 융모막 추출물에서 골재생 효과가 가장 좋다는 종래의 실험 결과에 기초하여 상기 농도를 선택하여 실험하였음)과 융모막 추출물 내의 엑소좀을 각각 1×10¹⁰particles/well, 1×10¹¹particles/well, 1×10¹²particles/well로 처리한 후, 분화 후 14일 후에 미네랄의 함량을 측정하였다. 미네랄의 함량은 Alizarin Red S 염색액 (Millipore)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 의하면, 융모막 추출물이 처리된 군에 비하여 융모막 추출물 내의 엑소좀이 처리된 군에서 미네랄 침착 유도 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다(*P<0.05, Day14).

상기 실시예 3-1, 3-2에 의하면, 상기 융모막 추출물 200ug은 4.8×10¹²particles/well의 엑소좀을 포함하고 있으나, 1×10¹²particles/well의 융모막 추출물 내의 엑소좀을 처리한 군 보다 오히려 ALP 활성도, 및 미네랄 침착도 효과가 낮게 나타났다. 한편, 이러한 결과로부터, 융모막 추출물 내의 엑소좀은 우수한 골형성 촉진 효과를 가지고, 융모막 추출물 자체보다 우수한 골형성 효과를 가지는 물질임을 확인할 수 있다.

실시예3-3: Calcium depisition 평가

양막 추출물과 융모막 추출물의 칼슘 침착(골재생 형성 평가)을 비교 평가하기 위하여, 칼슘 침착(Calcium deposition) 평가 실험을 실시하였다. 동일하게 골형성 유도 배지(osteogenesis induction medium, OIM)에서 MG-63 세포를 분화시킨 후, 각각 양막 추출물과 융모막 추출물을 처리한 후, 분화 후 7일에 칼슘 함량을 측정하였다.

도 4에 의하면, 양막 추출물은 융모막 추출물보다 월등히 우수한 골형성 촉진 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속하는 것을 알 수 있다.

Claims

융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물.
융모막 추출물로부터 분리된 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 골질환은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증 및 이로 인한 골절, 골형성장애, 퇴행성 골질환 또는 부정교합 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 외 소포체는 엑소좀, 미세소포체, 또는 마이크로파티클 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 외 소포체는 1×10¹⁰ 내지 1×10¹²particles/well의 농도를 갖는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 외 소포체는 평균 입자크기가 100nm 내지 150nm인 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 HA/bTCP(hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate)지지체와 혼합되어 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용 액으로 제형화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.