KR20220149047A - 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP4 유전자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP4 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 OsSIRP4 유전자의 발현을 조절하여 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있으므로, 환경 스트레스에 내성을 갖는 새로운 형질전환 식물체를 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP4 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물은 병원균 감염 및 초식 동물, 곤충의 공격과 같은 생물 스트레스와 가뭄, 더위, 추위, 영양결핍과 같은 환경 스트레스 속에서 끊임없이 신호를 주고받으며 살아간다. 환경 스트레스에 저항성이 낮은 식물은 분리한 환경에 적응할 때 많은 에너지를 필요로 하고 많은 물과 비료를 소비하여 환경에 큰 부담을 줄 수 있다. 환경 스트레스 중 고염, 가뭄, 온도의 변화는 고착생활을 하는 식물의 생육과 발달에 큰 영향을 미친다. 토양에서 염의 농도가 증가할 경우 식물의 성장, 개화시기 등에 영향을 줄 수 있고, 세포 내 이온 농도와 삼투압의 불균형이 일어나 영양 장해, 대사 장해 또는 광합성 장해 등을 유발시켜 식물의 생산량을 감소시킬 수 있다. 이처럼 고착 생활을 하는 식물은 여러 환경 스트레스에 직면하여 살아가고 있다. 스트레스를 받는 환경에서 식물들은 이온 및 식물의 저항성과 세포의 안정성을 위해 단백질 대사 및 유전자 발현을 조절한다.
한편, RING(Really Interesting New Gene) E3 리가아제는 시스테인과 히스티딘 잔기로 이루어진 공통서열(Cys-X2-Cys-X9-Cys-X1-3-His-X2-3-Cys/His-X2-Cys-X4-48-Cys-X2-Cys, X는 모든 아미노산이 위치할 수 있음)을 가지고 있으며, 이들 구조는 2개의 아연 원자와 결합하고 있다. 이러한 구조는 일반적으로 링-핑거 단백질(RING-finger protein)들이 시스테인 또는 히스티딘 위치에 근거하여 RING-H2 및 RING-HC를 포함하는 2개의 기본 형태로 분류된다고 알려져 있다. 또한, RING-D, RING-v, RING-S/T, RING-G 및 RING-C2와 같은 몇 가지 변형된 형태가 애기장대 또는 벼를 포함하는 포함하는 고등식물의 게놈에서 발견되었다.
최근, 많은 연구자들이 환경 스트레스에 관여하는 유전자의 기능에 관심을 가지고 활발히 연구하고 있으며, 육종가들은 이러한 유전자를 이용한 품종개량을 통해 환경 스트레스에 내성을 가지는 작물을 개발하는 시도를 하고 있다. 기존의 품종개량 기술은 각각 원하는 특성을 지닌 유사한 종들을 교배하여 생성된 잡종 중 목적하는 품종만을 선별하는 것으로, 한 품종을 개발하기 위해서는 많은 시행착오와 시간이 소요된다. 이에 비해 유전자 재조합 기술은 원하는 특성을 가진 유전자를 다른 생물체에 직접 삽입함으로써 목적하는 품종을 얻을 수 있다. 또한 삽입하고자 하는 유전자는 같은 생물종뿐만 아니라 서로 다른 생물종에서도 얻을 수 있으므로, 품종개량의 폭이 넓고 종래의 품종개량에 비해 소요시간이 짧은 장점이 있다.
한편, 한국등록특허 제2231136호에는 '식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsCP1 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1962751호에는 '식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsMAR1 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP4 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 염 처리시 벼의 줄기 및 뿌리에서 OsSIRP4 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, OsSIRP4 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환체를 제조하여 분석한 결과, 과발현 형질전환체의 뿌리 생장, 생존율, 엽록소 함량 및 항산화 효소의 활성이 대조구 식물체에 비해 감소하였고, 떡잎 탈색율 및 과산화수소 함량은 증가하는 것을 통해 OsSIRP4 유전자의 과발현을 통해 염 스트레스에 대한 민감성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4(Oryza sativa salt-induced RING finger protein 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsSIRP4 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 염 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 OsSIRP4 유전자는 식물의 염 스트레스 내성을 조절할 수 있으므로, 환경 스트레스에 대해 내성을 갖는 식물체를 개발하여 농작물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 벼에 염(NaCl)을 처리하고 벼의 줄기(shoot) 및 뿌리(root)에서 OsSIRP4 유전자의 상대적 발현양을 측정한 결과이다.
도 2A는 OsSIRP4 단백질과 다른 벼과 식물인 야생 잔디(Brachypodium distachyon) 유래 Bradi5g02290, 옥수수(Zea mays) 유래 GRMZM2G131611 및 수수(Sorghum bicolor) 유래 Sb06g000460 단백질의 링 핑거 도메인(RING finger domain)을 다중 정렬 분석한 결과이고, 도 2B는 OsSIRP4 단백질의 E3 리가아제 활성을 확인한 in vitro 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay) 결과이다. MBP; 말토오즈 결합 단백질(maltose binding protein), Poly-Ub; 폴리 유비퀴틴 사슬(poly-ubiquitin chain), OsSIRP4C269A; OsSIRP4 단백질의 링 핑거 도메인에서 269번째 잔기의 시스테인(Cysteine, C)이 알라닌(Alanine, A)으로 치환된 돌연변이 OsSIRP4 단백질.
도 3은 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)에서 뿌리 생장을 관찰한 사진(A) 및 뿌리 생장을 측정한 결과(B)이다.
도 4는 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)의 떡잎 탈색율을 측정한 결과(A) 및 탈색된 떡잎을 관찰한 사진(B)이다.
도 5는 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)의 생존율(A) 및 엽록소 함량(B)을 측정한 결과이다. Ca; 엽록소 a, Cb; 엽록소 b, C(a+b); 총 엽록소
도 6은 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)의 과산화수소 함량(A), superoxide dismutase 활성(B), catalase 활성(C), peroxidase 활성(D), 프롤린 함량(E) 및 가용성 당 함량(F)을 측정한 결과이다.
도 7은 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)의 AtSOS1(A), AtAKT1(B), AtNHX1(C) 및 AtHKT1;1(D) 유전자의 상대적 발현양을 측정한 결과이다.
도 2A는 OsSIRP4 단백질과 다른 벼과 식물인 야생 잔디(Brachypodium distachyon) 유래 Bradi5g02290, 옥수수(Zea mays) 유래 GRMZM2G131611 및 수수(Sorghum bicolor) 유래 Sb06g000460 단백질의 링 핑거 도메인(RING finger domain)을 다중 정렬 분석한 결과이고, 도 2B는 OsSIRP4 단백질의 E3 리가아제 활성을 확인한 in vitro 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay) 결과이다. MBP; 말토오즈 결합 단백질(maltose binding protein), Poly-Ub; 폴리 유비퀴틴 사슬(poly-ubiquitin chain), OsSIRP4C269A; OsSIRP4 단백질의 링 핑거 도메인에서 269번째 잔기의 시스테인(Cysteine, C)이 알라닌(Alanine, A)으로 치환된 돌연변이 OsSIRP4 단백질.
도 3은 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)에서 뿌리 생장을 관찰한 사진(A) 및 뿌리 생장을 측정한 결과(B)이다.
도 4는 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)의 떡잎 탈색율을 측정한 결과(A) 및 탈색된 떡잎을 관찰한 사진(B)이다.
도 5는 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)의 생존율(A) 및 엽록소 함량(B)을 측정한 결과이다. Ca; 엽록소 a, Cb; 엽록소 b, C(a+b); 총 엽록소
도 6은 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)의 과산화수소 함량(A), superoxide dismutase 활성(B), catalase 활성(C), peroxidase 활성(D), 프롤린 함량(E) 및 가용성 당 함량(F)을 측정한 결과이다.
도 7은 염(NaCl)을 처리하고 OsSIRP4 유전자 과발현체(OE-OsSIRP4), 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체(Mutated OE-OsSIRP4) 및 대조구 식물체(WT)의 AtSOS1(A), AtAKT1(B), AtNHX1(C) 및 AtHKT1;1(D) 유전자의 상대적 발현양을 측정한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4(Oryza sativa salt-induced RING finger protein 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsSIRP4 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법은, 상기 OsSIRP4 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 염 스트레스에 대한 민감성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 OsSIRP4 단백질의 범위는 벼로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 범위는 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(antibiotics resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법에 있어서, 상기 OsSIRP4 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
또한, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 염 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있는 벼 유래 OsSIRP4 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 증가되면, 식물체의 염 스트레스에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명은 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 염 처리에 따른 벼 식물체에서
OsSIRP4
유전자의 발현 양상 분석
벼(Oryza sativa cv. Donganbye)의 종자를 30℃, 70% 상대습도 조건의 성장 챔버에서 배양하였고, 14일령의 벼 식물체에 150 mM 염화나트륨(NaCl)이 함유된 MS(Murashige and Skoog) 배지를 시간별(6, 12, 24 및 48 시간)로 처리한 후 정방향(5'-TCTATGCGACAATTCAGT-3', 서열번호 3) 및 역방향(5'-CCTCCACCGTATAATCTC-3', 서열번호 4) 프라이머를 사용한 qPCR 분석을 통하여 OsSIRP4 유전자의 발현양을 측정하였다.
그 결과, 염 처리시 벼 줄기 및 뿌리에서 OsSIRP4 유전자의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 1).
실시예 2. OsSIRP4 단백질의 구조 및 E3 리가아제 활성 분석
2-1. OsSIRP4 단백질의 구조 분석
OsSIRP4 단백질의 구조를 분석하기 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 보존 도메인 데이터베이스(Conserved Domain Database, CDD; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)를 이용하여 서열 유사성 분석을 수행한 결과, OsSIRP4 단백질이 C4HC3 타입의 링 도메인(C4HC3-type RING domain)을 갖고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 OsSIRP4 아미노산 서열과, C4HC3 타입의 링 도메인을 갖고 있는 다른 벼과 식물의 아미노산 서열을 이용하여 다중 정렬 분석(Clustalw2 software, http://ebi.ac.uk/clustalw/)을 수행하였다.
그 결과, OsSIRP4 단백질이 야생 잔디(Brachypodium distachyon) 유래 Bradi5g02290, 옥수수(Zea mays) 유래 GRMZM2G131611 및 수수(Sorghum bicolor) 유래 Sb06g000460 단백질과 유사한 아미노산 서열을 갖는 것을 확인하였다(도 2A).
2-2. OsSIRP4 단백질의 E3 리가아제 활성 분석
OsSIRP4 단백질이 C4HC3 타입의 링 도메인을 갖는다는 것은 E3 리가아제(ligase) 활성을 갖는다는 것을 의미하므로, in vitro 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay)을 수행하여 OsSIRP4 단백질의 E3 리가아제 활성을 측정하였다. MBP(maltose binding protein)가 포함된 pMAL-c5x 벡터(New England BioLabs, 미국)에 OsSIRP4 유전자를 클로닝하였고, 돌연변이 유발 프라이머를 이용한 위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 통해 돌연변이-OsSIRP4(mutant-OsSIRP4, C269A)를 제조하였다. 재조합 단백질을 대장균에서 발현시켜 아밀로스 레진(amylose resin, New England BioLabs)을 이용하여 정제하였으며, 정제된 MBP-OsSIRP4 단백질은 인간 E1, 애기장대 E2(AtUBC10), 유비큐틴(Ub) 및 유비퀴틴화 버퍼(50 mM Tris-HCl, PH 7.5; 40 mM ATP; 100 mM MgCl2; 40 mM dithiothreitol)에서 30℃ 조건으로 2시간 동안 반응시킨 후, 웨스턴 블랏을 수행하였다. 1차 항체로 anti-MBP 항체 또는 anti-Ub 항체를, 2차 항체로 goat anti-mouse IgG 또는 goat anti-rabbit IgG 항체를 사용하였고, ChemiDocTM XRS+이미징 시스템(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 밴드를 확인하였다.
그 결과, MBP-OsSIRP4 단백질을 E1과 AtUBC10에서 반응시켰을 때(레인 4)에는 폴리-유비퀴틴 사슬(poly-ubiquitein chain; Poly-Ub)이 검출된 반면, 돌연변이-OsSIRP4(C269A) 단백질을 E1과 AtUBC10에서 반응시켰을 때(레인 5)에는 폴리-유비퀴틴 사슬이 검출되지 않는 것을 확인하였다(도 2B). 상기 결과를 통해, OsSIRP4 단백질이 E3 리가아제 활성을 가지는 것을 알 수 있었다.
실시예 3.
OsSIRP4
유전자가 과발현된 애기장대 형질전환 식물체에서 염 스트레스에 대한 반응 분석
OsSIRP4 유전자가 식물체의 염 스트레스의 내성 조절에 미치는 영향을 분석하기 위해, 35S:OE-OsSIRP4-YFP(과발현) 및 35S:mutated OE-OsSIRP4-YFP(돌연변이), 35S:YFP(대조구)가 각각 도입된 아그로박테리움 GV3101 균주를 사용하여 애기장대 식물체를 형질전환시켰다. 형질전환된 종자(T3)는 half MS(Murashige and Skoog) 배지에서 16시간/8시간(명/암), 22℃ 조건의 성장 챔버에서 3일간 배양하였으며, 150 및 200 mM의 염화나트륨을 배지에 각각 처리하였다.
OsSIRP4 유전자가 과발현된 형질전환체, 돌연변이 OsSIRP4 유전자가 과발현된 형질전환체 및 대조구 식물체 각각의 T3 라인(#1, #2 및 #3)의 전사체 발현 수준을 q-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)로 분석하였다. 그 결과, 대조구 식물체에 비해 OsSIRP4 유전자 과발현체에서 OsSIRP4 유전자의 발현이 증가하였고, 이를 통해 OsSIRP4 유전자 과발현체가 제대로 제작되었음을 확인하였다.
3-1. 뿌리 생장 분석
OsSIRP4 유전자 과발현체, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체 및 대조구 식물체에 염화나트륨을 10일 동안 각각 처리하여 뿌리 생장을 측정한 결과, 염을 처리하지 않은 경우, OsSIRP4 유전자 과발현체와 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체 및 대조구 식물체 간에 뿌리 생장은 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다. 그러나, 처리한 염의 농도가 증가할수록 OsSIRP4 유전자 과발현체의 뿌리 생장은 대조구 식물체에 비해 현저하게 감소한 것을 확인하였고, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체의 뿌리 생장은 대조구 식물체와 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다(도 3).
3-2. 떡잎 탈색율 분석
OsSIRP4 유전자 과발현체, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체 및 대조구 식물체에 염화나트륨을 10일 및 24일 동안 각각 처리하여 떡잎 탈색율을 확인한 결과, OsSIRP4 유전자 과발현체의 떡잎 탈색율은 대조구 식물체에 비해 현저하게 증가한 것을 확인하였고, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체의 떡잎 탈색율은 대조구 식물체와 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다(도 4).
3-3. 생존율 및 엽록소 함량 분석
OsSIRP4 유전자 과발현체, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체 및 대조구 식물체에 150 mM의 염화나트륨을 24일 동안 각각 처리하여 생존율을 확인한 결과, OsSIRP4 유전자 과발현체의 생존율은 대조구 식물체에 비해 약 50% 이상 감소한 것을 확인하였고, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체의 생존율은 대조구 식물체와 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다(도 5A).
또한, OsSIRP4 유전자 과발현체의 엽록소 함량은 대조구 식물체에 비해 현저하게 감소한 것을 확인하였고, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체의 엽록소 함량은 대조구 식물체와 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다(도 5B).
3-4. 항산화 활성 분석
OsSIRP4 유전자 과발현체, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체 및 대조구 식물체에 150 mM의 염화나트륨을 24일 동안 각각 처리하여 과산화수소(H2O2) 함량, superoxide dismutase(SOD) 활성, catalase(CAT) 활성, peroxidase(POD) 활성, 프롤린(proline) 함량 및 가용성 당(soluble sugar) 함량을 측정하였다.
애기장대 식물체에 0.1 %(w/v) trichloroacetic acid를 첨가하고 얼음에서 1시간 동안 반응시킨 후, 12,000 g에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 취하여 25 mM 황산제2철암모늄, 0.5 M 황산, 0.1 M 솔비톨 및 0.125 mM 자일레놀 오렌지를 첨가하고 암조건에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 560 nm에서 흡광도를 측정하여 과산화수소 함량을 분석하였다. SOD, CAT 및 POD 활성은 Beauchamp C 등(1971, Anal Biochem. 44:276-287), Aebi H 등(1984, Methods Enzymol. 105:121-126) 및 Chance B 등(1955, Methods enzymol. 2:764-775)에 기술된 방법에 따라 각각 측정하였고, 프롤린 및 가용성 당 함량은 Bates LS 등(2013, Plant Soil. 39:205-207) 및 Ci DW 등(2009. Chemosphere. 77:1620-1625)에 기술된 방법에 따라 각각 측정하였다.
그 결과, OsSIRP4 유전자 과발현체의 과산화수소 함량은 대조구 식물체에 비해 현저하게 증가한 것을 확인하였고, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체의 과산화수소 함량은 대조구 식물체와 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다. 또한, OsSIRP4 유전자 과발현체의 SOD, CAT 및 POD 활성과 프롤린 및 가용성 당 함량은 대조구 식물체에 비해 감소한 것을 확인하였고, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체의 과산화수소 함량은 대조구 식물체와 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다(도 6).
3-5. 염 스트레스 반응에 관여하는 유전자 발현 분석
OsSIRP4 유전자 과발현체, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체 및 대조구 식물체에 150 mM의 염화나트륨을 24일 동안 각각 처리하여 염 스트레스 반응에 관여한다고 알려진 AtSOS1(K+ uptake and transport), AtAKT1(K+ uptake), AtNHX1(Na+/H+ antiporter) 및 AtHKT1;1(K+ uptake and transport) 유전자의 발현양을 측정하였다.
그 결과, OsSIRP4 유전자 과발현체의 염 스트레스 반응에 관여하는 유전자 발현양은 대조구 식물체에 비해 현저하게 감소한 것을 확인하였고, 돌연변이 OsSIRP4 유전자 과발현체의 염 스트레스 반응에 관여하는 유전자 발현양은 대조구 식물체와 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다(도 7).
상기 결과를 통해, OsSIRP4 유전자가 식물체에서 과발현되면 염 스트레스에 대한 민감성이 증가되는 것을 확인함으로써 OsSIRP4 유전자의 발현 조절을 통해 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation
<120> OsSIRP4 gene from Oryza sativa for controlling salt stress
tolerance of plant and uses thereof
<130> PN20258
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
atgaccgtga tttttctaaa taattctttt agctacaaat tgtccatgat ttcgggattg 60
tttgcccttc accagtttga gattgattcc tcctcatacc ctaccctacc ctctctgctg 120
aatgaaatta atgggactag tactgctaca actgttccat tgcaaggtga ccctgcttct 180
gatcaccacc cacatctctc aatcgacata ccaccagctg cagcaagcat gtcacctgca 240
ccgacacaag ctgctgcaga tatcacaccc acaccgacca cttcgatttt gagcaccaaa 300
gcgagcacac ctgcaggttc atgttccagc agaagcacca gcgttgcccc aaagccgcaa 360
cgatcgtcat ccttcatgct gaggcagact gtcaagagcc tcttgccagt gggaagcttc 420
aagtcgtcag tcaagttctt caacgccaga atttcgagga catcgtcgct cccggtgacc 480
gatgtctcgc aggaacaagc cgataaaact tcgactactc atgctgttga taaagcaggt 540
cacatgtacc ggtcacagtc gcttcccatg aacatgaaga aattgaataa tggaaagagc 600
ttcaagagaa tgaattcact cggcggtgtc taccgcgtag ttccttcgac accatcagtc 660
cccgtgacaa gcagcaatgt catcccagat atagtcccat ctgaaccagg tgatgaagat 720
ggagaggaca tagcagagga agaggcagta tgcaggatct gcatggttga gctgtcagaa 780
gggagtgaca ctctgaagct ggagtgttca tgcaagggcg agctcgctct agctcacaag 840
cactgcgcca tgaagtggtt caccatgaaa ggtaccagga catgcgaggt ctgcaaggaa 900
gatgttcaga acctccctgt cacccttgtt cgtgttcaga gcatgcagca gcctgagctt 960
cagaccaacc ctgccaacgc atcaagatac gatcgcctca ggatgtggca gggagcgcca 1020
atccttgtga tcgtcagcat cctcgcctac ttctgcttct tggaacagct gctggttgcc 1080
cgtgatggta ttgcagcgct ggcaatatcg ctgcccttct catgtatcct tggcctcttc 1140
tcatccctca ccacaacaag catggtggca aggagatacg tgtggatcta tgcgacaatt 1200
cagtttctgt tcgtcgtctt cttcacccat ctcttctaca gatatctcca tttgcaagcg 1260
gtgatatcaa tcatcctggc cacgtttgcc gggttcggcg tagggatgac cggcaactcc 1320
atcatcgtgg agattatacg gtggagggcg gcgagggcgg cggcggcgcc gccggctcaa 1380
acccgtcatc gtcgtcgtcg tcatggtcgc aggcaacaac agccaccacc tgcacaacca 1440
gctgcttctt cagctgccgt cgccgacgtt gagaacccac ctgtataa 1488
<210> 2
<211> 495
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Thr Val Ile Phe Leu Asn Asn Ser Phe Ser Tyr Lys Leu Ser Met
1 5 10 15
Ile Ser Gly Leu Phe Ala Leu His Gln Phe Glu Ile Asp Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Pro Thr Leu Pro Ser Leu Leu Asn Glu Ile Asn Gly Thr Ser Thr
35 40 45
Ala Thr Thr Val Pro Leu Gln Gly Asp Pro Ala Ser Asp His His Pro
50 55 60
His Leu Ser Ile Asp Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ser Met Ser Pro Ala
65 70 75 80
Pro Thr Gln Ala Ala Ala Asp Ile Thr Pro Thr Pro Thr Thr Ser Ile
85 90 95
Leu Ser Thr Lys Ala Ser Thr Pro Ala Gly Ser Cys Ser Ser Arg Ser
100 105 110
Thr Ser Val Ala Pro Lys Pro Gln Arg Ser Ser Ser Phe Met Leu Arg
115 120 125
Gln Thr Val Lys Ser Leu Leu Pro Val Gly Ser Phe Lys Ser Ser Val
130 135 140
Lys Phe Phe Asn Ala Arg Ile Ser Arg Thr Ser Ser Leu Pro Val Thr
145 150 155 160
Asp Val Ser Gln Glu Gln Ala Asp Lys Thr Ser Thr Thr His Ala Val
165 170 175
Asp Lys Ala Gly His Met Tyr Arg Ser Gln Ser Leu Pro Met Asn Met
180 185 190
Lys Lys Leu Asn Asn Gly Lys Ser Phe Lys Arg Met Asn Ser Leu Gly
195 200 205
Gly Val Tyr Arg Val Val Pro Ser Thr Pro Ser Val Pro Val Thr Ser
210 215 220
Ser Asn Val Ile Pro Asp Ile Val Pro Ser Glu Pro Gly Asp Glu Asp
225 230 235 240
Gly Glu Asp Ile Ala Glu Glu Glu Ala Val Cys Arg Ile Cys Met Val
245 250 255
Glu Leu Ser Glu Gly Ser Asp Thr Leu Lys Leu Glu Cys Ser Cys Lys
260 265 270
Gly Glu Leu Ala Leu Ala His Lys His Cys Ala Met Lys Trp Phe Thr
275 280 285
Met Lys Gly Thr Arg Thr Cys Glu Val Cys Lys Glu Asp Val Gln Asn
290 295 300
Leu Pro Val Thr Leu Val Arg Val Gln Ser Met Gln Gln Pro Glu Leu
305 310 315 320
Gln Thr Asn Pro Ala Asn Ala Ser Arg Tyr Asp Arg Leu Arg Met Trp
325 330 335
Gln Gly Ala Pro Ile Leu Val Ile Val Ser Ile Leu Ala Tyr Phe Cys
340 345 350
Phe Leu Glu Gln Leu Leu Val Ala Arg Asp Gly Ile Ala Ala Leu Ala
355 360 365
Ile Ser Leu Pro Phe Ser Cys Ile Leu Gly Leu Phe Ser Ser Leu Thr
370 375 380
Thr Thr Ser Met Val Ala Arg Arg Tyr Val Trp Ile Tyr Ala Thr Ile
385 390 395 400
Gln Phe Leu Phe Val Val Phe Phe Thr His Leu Phe Tyr Arg Tyr Leu
405 410 415
His Leu Gln Ala Val Ile Ser Ile Ile Leu Ala Thr Phe Ala Gly Phe
420 425 430
Gly Val Gly Met Thr Gly Asn Ser Ile Ile Val Glu Ile Ile Arg Trp
435 440 445
Arg Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Gln Thr Arg His Arg
450 455 460
Arg Arg Arg His Gly Arg Arg Gln Gln Gln Pro Pro Pro Ala Gln Pro
465 470 475 480
Ala Ala Ser Ser Ala Ala Val Ala Asp Val Glu Asn Pro Pro Val
485 490 495
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
tctatgcgac aattcagt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
cctccaccgt ataatctc 18
Claims (6)
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4(Oryza sativa salt-induced RING finger protein 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsSIRP4 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 OsSIRP4 유전자를 과발현시켜 식물체의 염 스트레스에 대한 민감성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법. - 제3항의 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체.
- 제4항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsSIRP4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 염 스트레스 내성 조절용 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020210056184A KR102608324B1 (ko) | 2021-04-30 | 2021-04-30 | 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP4 유전자 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20220149047A true KR20220149047A (ko) | 2022-11-08 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020210056184A KR102608324B1 (ko) | 2021-04-30 | 2021-04-30 | 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsSIRP4 유전자 및 이의 용도 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102608324B1 (ko) |
-
2021
- 2021-04-30 KR KR1020210056184A patent/KR102608324B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| D. G. Oh, Molecular Characterization of Chilling-induced Rice RING Finger Ligase 1 (OsCRF1),Journal of Agricultural, Life and Environmental Sciences. March 2018. 1-11 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102608324B1 (ko) | 2023-11-29 |
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