KR20220147328A - 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 atg-v5 균주 또는 이를 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents

신규한 락토바실러스 퍼멘텀 atg-v5 균주 또는 이를 포함하는 면역증강용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주 또는 이를 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 균주는 세포독성이 없고, 대식세포의 NO(Nitric Oxide), IL-6(Interleukin 6) 및 TNF(Tumor Necrosis Factor) 분비량, 및 식세포작용(phagocytosis)을 증가시키고, 대식세포의 IL-1β(Interleukin 1β)의 분비량을 감소시키며, 비장세포의 세포 생존력을 증가시키고, 혈액 내 항체 및 사이토카인 분비량을 증가시키는 등 면역증강 효능이 있으므로, 상기 균주는 면역증강용 약학적 조성물 및 식품 조성물 소재로서 유용하게 사용할 수 있고, 상기 조성물은 개체의 면역 활성을 증진시키는 데 유용하게 사용할 수 있다. 아울러 상기 식품 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 또한 개체의 면역 활성 증진에 효과적이다.

Description

신규한 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주 또는 이를 포함하는 면역증강용 조성물{Novel Lactobacillus fermentum ATG-V5, and composition for enhancing immunity comprising thereof}
본 발명은 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주 또는 이를 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
면역이란 인체 내에서 외부로부터 침입하는 미생물 동종의 조직 등의 다른 물질, 특이 세포가 발생하면 면역계가 관여하여 이들을 항원으로 인식하여 특이하게 반응하여 항체를 생산하는 능력을 나타냄으로서 개체의 항상성을 유지하려는 현상을 말하며, 면역 반응에 관여하는 세포는 임파구, 대식세포(macrophage), NK 세포(NK cell, Natural killer cell), 수지상세포 등이 있다. 최근 들어 인공화합물이 아닌 천연물로 치료하는 면역요법 등이 각광받으면서, 면역활성 증진 효능을 갖는 천연 유래 소재를 탐색하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있다.
사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스(probiotics)라고 한다. 프로바이오틱스로서 효과가 있기 위해서는 경구로 섭취될 때, 대부분이 기본적으로 내산성, 내담즙성 및 장 상피세포 부착능력이 우수하여야 한다. 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당하기 때문에 프로바이오틱스로 사용된다. 유산균은 장내 정상균총의 유지, 장내 균총의 개선, 항당뇨 및 항고지혈증 효과, 발암 억제, 대장염 억제, 그리고 숙주의 면역체계의 비특이적 활성 등의 효과를 나타낸다고 보고되고 있다. 그 중에서도 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질 내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로 오래전부터 알려져 왔고 미국의 공중건강 가이드라인(U.S. Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주 기탁기관(ATCC)에 기탁된 락토바실러스 균주 모두 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안정 수준(Bio-safty Level) 1'로 분류되어 있다. 한편, 김치 유산균은 김치 발효에 관여하는 유산균으로서 면역증강, 항 미생물, 항산화, 항암 효과, 항비만 효과, 고혈압 예방 또는 변비 예방 효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다[Hivak P, Odrska J, Ferencik M, Ebringer L, Jahnova E, Mikes Z. : One-year application of Probiotic strain Enterococcus facium M-74 decreases Serum cholesterol levels. : Bratisl lek Listy 2005; 106(2); 67-72; Agerholm-Larsen L. Bell ML. Grunwald GK. Astrup A. : The effect of a probiotic milk product on plasma cholesterol : a metaanalysis of short-term intervention studies ; Eur J Clin Nutr. 2000; 54(11) 856-860; Renato Sousa, Jaroslava Helper, Jian Zhang, Strephen J Lewis and Wani O Li; Effect of Lactobacillus acidophilus supernants on body weight and leptin expression in rats ; BMC complementary and alternative medicine. 2008; 8(5)1-8]. 이러한 유산균의 다양한 생리활성이 알려지면서, 최근 인체에 안전하면서도 기능이 우수한 유산균 균주를 개발하고 이를 의약품 또는 기능성 식품으로 적용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
이에, 본 발명자들은 안전하고 면역증강 효능이 우수한 유산균을 찾고자 노력한 결과, 제주도 한라봉으로부터 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)의 아종(sub sp.) 균주를 분리하였고, 상기 균주가 생체 아민(biogenic amine)을 생성하지 않으며, 우수한 내산성, 내담즙성 및 면역증강 효능(대식세포 활성능 등)을 갖는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 기탁번호 KCTC14481BP로 기탁된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 균주, 이를 함유하는 면역증강용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 상기 식품 조성물을 함유하는 면역증강용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC14481BP로 기탁된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 식품 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 식품 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 균주는 세포독성이 없고, 대식세포의 NO(Nitric Oxide), IL-6(Interleukin 6) 및 TNF(Tumor Necrosis Factor) 분비량, 및 식세포작용(phagocytosis)을 증가시키고, 대식세포의 IL-1β(Interleukin 1β)의 분비량을 감소시키며, 비장세포의 세포 생존력을 증가시키고, 혈액 내 항체 및 사이토카인 분비량을 증가시키는 등 면역증강 효능이 있으므로, 상기 균주는 면역증강용 약학적 조성물 및 식품 조성물 소재로서 유용하게 사용할 수 있고, 상기 조성물은 개체의 면역 활성을 증진시키는 데 유용하게 사용할 수 있다. 아울러 상기 식품 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 또한 개체의 면역 활성 증진에 효과적이다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주(이하 V5 균주)의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 도이다.
도 2는 V5 균주 및 양성 대조군의 용혈 작용 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 V5 균주 및 양성 대조군의 생체 아민(biogenic amine) 생성 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 V5 균주의 완전 해독된 유전체 지도(2,222,724bp의 염색체 및 16,984bp의 플라스미드)를 나타낸 도이다.
도 5는 V5 균주에 의한 마우스 대식세포 raw264.7 세포의 증식 여부를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 V5 균주에 의한 마우스 대식세포 raw264.7 세포의 NO(Nitric Oxide) 분비량 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 V5, K23 및 K24 균주에 의한 마우스 대식세포 raw264.7 세포의 NO 분비량 증가 정도를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 V5 균주에 의한 마우스 대식세포 raw264.7 세포의 식세포작용(phagocytosis) 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 V5 균주에 의한 마우스 대식세포 raw264.7 세포의 IL-6(Interleukin 6) 분비량 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 V5 균주에 의한 마우스 대식세포 raw264.7 세포의 TNF(Tumor Necrosis Factor) 분비량 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9c는 V5 균주에 의한 마우스 대식세포 raw264.7 세포의 IL-1β(Interleukin 1β) 분비량 감소 여부를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9d는 V5 균주에 의한 마우스 대식세포 raw264.7 세포의 IL-10(Interleukin 10) 분비량 증가 여부를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 CPP(cyclophosphamide) 유도 동물모델을 이용한 V5 균주의 투여 실험 일정 및 투여 조건을 도식화한 도이다.
도 11a는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 흉선(thymus) 무게 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 비장(spleen) 무게 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델에서의 NK 세포(NK cell, Natural Killer cell)의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델에서의 비장세포(splenocytes)의 세포 생존력(cell viability)을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14a는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 비장세포에서 T 세포 아형(subset)인 Th1 세포의 분화 변화를 확인하기 위해, TBX21(T-Box Transcription Factor 21) mRNA의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14b는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 비장세포에서 T 세포 아형인 Th2 세포의 분화 변화를 확인하기 위해, GATA3(GATA Binding Protein 3) mRNA의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14c는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 비장세포에서 T 세포 아형인 Th17 세포의 분화 변화를 확인하기 위해, RORγt(ROR-related orphan receptor gamma) mRNA의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14d는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 비장세포에서 T 세포 아형인 Th17 세포의 분화 변화를 확인하기 위해, IL-17(Interleukin 17) mRNA의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14e는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 비장세포에서 T 세포 아형인 Treg 세포의 분화 변화를 확인하기 위해, Foxp3(Forkhead Box P3) mRNA의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14f는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 비장세포에서 T 세포 아형인 Treg 세포의 분화 변화를 확인하기 위해, CTLA-4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated Protein 4) mRNA의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15a는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 IgG 분비량 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15b는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 IgA 분비량 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15c는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 IgM 분비량 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16a는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 IL-6(Interleukin 6) 분비량 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16b는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 IL-2(Interleukin 2) 분비량 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16c는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 IL-10(Interleukin 10) 분비량 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16d는 V5 균주 투여에 의한 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 IL-4(Interleukin 4) 분비량 변화를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC14481BP로 기탁된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 균주을 제공한다.
상기 균주는 한라봉으로부터 분리된 것일 수 있고, 바람직하게는 제주도 한라봉으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 유산균은 2020년 2월 8일에 제주도에서 수득한 한라봉으로부터 분리한 후 16S rRNA 염기서열 분석을 수행한 결과, 16S rRNA sequencing을 통해 얻은 서열번호 1의 염기서열을 NCBI의 BLAST database에 대조한 결과, Lactobacillus fermentum strain 8867와 16S rRNA 서열이 100.0% 일치하여 분류학상 위치는 Lactobacillus fermentum에 속하는 것을 확인하였다.
상기 균주는 면역증강 효능이 있을 수 있다. 상기 면역증강 효능이 있는 균주는 암 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다. 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 면역증강 효능의 일 예시로, 상기 균주는 대식세포의 NO(Nitric Oxide) 분비량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, V5 균주가 대식세포의 NO(Nitric Oxide) 분비량을 증가시키는지 여부를 확인하기 위해, raw264.7 세포:V5 균주로 1:1.25, 1:2.5, 1:5, 1:10, 1:20 및 1:40의 균주 농도를 세포에 처리하고, 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양하여 NO의 생성을 유도한 결과, V5 균주를 처리했을 때 상기 raw264.7 세포에서 NO의 생성을 농도의존적으로 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다(도 6 참조). 또한, V5 균주는 균주 농도 20에서 K23 및 K24 균주 대비 NO의 분비를 더 유도하는 것을 확인하였다(도 7 참조).
상기 면역증강 효능의 다른 예시로, 상기 균주는 대식세포의 식세포작용(phagocytosis)을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, V5 균주에 의한 대식세포의 식세포작용(phagocytosis) 증가 여부를 확인하기 위해, raw264.7 세포:V5 균주로 1:2.5, 1:5, 1:10 및 1:20의 균주 농도를 세포에 처리하고 raw264.7 세포의 식세포작용을 측정한 결과, V5 균주를 처리했을 때 대조군과 대비하여 상기 raw264.7 세포에서 식세포작용이 증가함을 확인하였다(도 8 참조).
상기 면역증강 효능의 다른 예시로, 상기 균주는 대식세포의 IL-6(Interleukin 6) 및 TNF(Tumor Necrosis Factor) 분비량을 증가시킬 수 있고, IL-1β(Interleukin 1β)의 분비량을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, V5 균주가 대식세포의 사이토카인 분비량에 미치는 영향을 확인하기 위해, raw264.7 세포:V5 균주로 1:1.25, 1:2.5, 1:5, 1:10, 1:20 및 1:40의 균주 농도를 세포에 처리하고, IL-6, TNF-α, IL-1β 및 IL-10에 대한 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 실시한 결과, 상기 V5 균주는 면역 자극성 사이토카인인 IL-6 및 TNF를 농도의존적으로 증가시킴을 확인하였고(도 9a 및 9b 참조), 면역조절에 기여하는 IL-1β의 양을 감소시킴을 확인하였다(도 9c 참조).
상기 면역증강 효능의 다른 예시로, 상기 균주는 개체의 흉선(thymus)의 무게를 증가시키고, 비장(spleen)의 무게를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, CPP(cyclophosphamide) 유도 동물모델에서 V5 균주의 면역 강화 효능을 확인하기 위해, V5 균주 농도별 실험을 진행하였고(도 10 참조), 상기 동물모델의 흉선 및 비장 무게를 측정한 결과, 흉선의 무게가 0.031g(CPP)에서 0.048g(V5 1010 CFU)으로 유의미하게 증가하였고, 비장의 무게는 0.170g(CPP)에서 0.111g(V5 1010 CFU)으로 유의미하게 감소하였음을 확인하였다(도 11a 및 11b 참조).
상기 면역증강 효능의 다른 예시로, 상기 균주는 NK 세포(NK cell, Natural killer cell)의 세포독성 활성(cytotoxicity)을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, NK 세포의 세포독성 활성을 측정하기 위해, CPP 유도 동물모델에서 비장세포(splenocytes)를 확보한 후, YAC-1 세포와 YAC-1 세포:비장세포 = 1:50의 비율로 섞어준 후, LDH-cell cytotoxicity assay kit를 통해 LDH의 양을 측정한 결과, CPP 유도 동물모델에서 V5 균주에 의해 NK 세포의 세포독성 활성이 144%(CPP)에서 494%(V5 109 CFU) 및 521%(V5 1010 CFU)로 증가함을 확인하였다(도 12 참조).
상기 면역증강 효능의 다른 예시로, 상기 균주는 비장세포의 세포 생존력(cell viability)을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 비장세포의 세포 생존력을 측정하기 위해, 각각의 마우스의 비장세포를 배양시킨 후, WST를 처리하여 세포 생존력을 측정한 결과, CPP 유도 동물모델에서 V5 균주에 의해 비장세포의 세포 생존력이 99.98%(CPP)에서 135.95%(V5 1010 CFU)로 증가함을 확인하였다(도 13 참조).
상기 면역증강 효능의 다른 예시로, 상기 균주는 Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 T 세포 아형(subset)의 세포 수를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 비장세포에서 분리한 mRNA로 T 세포의 아형(subset)인 Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포의 분화 변화를 확인하기 위해, 상기 세포들의 mRNA 발현량을 측정한 결과, CPP에 의해 미접촉 T 세포(naive T cell)의 분화가 억제됨으로써 전체적인 T 세포 아형의 수가 억제되어 있음을 확인하였고, V5 균주에 의해 Th1, Th2, Th17 및 Treg cell의 수가 유의미하게 증가함을 확인하였다(도 14a 내지 14f 참조).
상기 면역증강 효능의 다른 예시로, 상기 균주는 혈액 내 항체 분비량을 증가시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 항체는 IgG 및 IgA 인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, CPP 유도 동물모델의 혈액에서 IgG 및 IgA의 분비량을 분석한 결과, CPP에 의해 IgG 및 IgA의 분비량이 감소함을 확인하였고, V5 균주에 의해서 IgG 및 IgA의 분비량이 증가함을 확인하였다(도 15a 및 15b 참조).
상기 면역증강 효능의 다른 예시로, 상기 균주는 혈액 내 사이토카인 분비량을 증가시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 사이토카인은 IL-6, IL-2(Interleukin 2), IL-10(Interleukin 10) 및 IL-4(Interleukin 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, CPP 유도 동물모델에서 사이토카인을 분석한 결과, CPP에 의해 전반적인 사이토카인의 감소 경향을 확인하였고, V5 균주에 의해 증가하는 것을 확인하였다(도 16a 내지 16d 참조).
상기 균주는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 균주의 배양액, 대사산물 및 사균체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 상기 개시된 면역증강 효능에 효과적이다. 상기 면역증강 효능이 있는 약학적 조성물은 암 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다. 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주는 본 발명의 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 균주는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 상기 개시된 면역증강 효능에 효과적이다. 상기 면역증강 효능이 있는 식품 조성물은 암 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다. 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주는 본 발명의 식품 조성물에 0.001~50 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 식품 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 식품 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는, 예를 들어, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 발효유, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 기능성 평가를 위한 유산균의 분리 및 동정
<1-1> V5 균주의 16S rRNA 염기서열 분석
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 유산균은 2020년 2월 8일에 제주도에서 수득한 한라봉으로부터 분리하였다.
구체적으로, 상기 한라봉을 0.9% 식염수에 10배 연쇄 희석법으로 희석한 결과물을 MRS(de Man Rogosa Sharpe) 배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하였고, 배양된 MRS 배지에서 발생한 유산균들의 콜로니를 현미경으로 관찰하여 간균 형태, 카탈라제(catalase) 반응이 없는 것을 골라낸 후, 이를 ATG-V5 균주(이하 V5 균주)라 명명하였다.
V5 균주의 16S rRNA 염기서열 분석은 ㈜ 솔젠트(Solgent, Daejeon)에 의뢰하였다. 염기서열 분석을 위한 프라이머(primer)는 27F(5' - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3'), 518F(5' - CCA GCA GCC GCG GTA ATA C - 3'), 907R(5' - CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT - 3'), 1492R(5' - GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3')을 이용하여 총 4번의 염기서열 리딩(reading)을 하였고, 각 리딩의 염기서열 정렬(alignment)을 통해 도출된 컨티그(contig) 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST online tool(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 분석하였다.
16S rRNA sequencing을 통해 얻은 하기 서열번호 1의 염기서열을 NCBI의 BLAST database에 대조한 결과, Lactobacillus fermentum strain 8867와 16S rRNA 서열이 100.0% 일치하여 분류학상 위치는 Lactobacillus fermentum에 속하는 것을 확인하였다.
이에, 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2021년 3월 4일자로 본 발명의 균주(수탁번호: KCTC1481BP)를 기탁하였다.
<1-2> V5 균주의 당발효패턴 확인
당발효 패턴을 통한 동정 및 특성을 파악하기 위해, API 50 CH test(BioMerieux, 프랑스)를 실시하였다.
구체적으로, 10mL API 50 CHL medium(BioMerieux, 프랑스)에 순수배양된 유산균을 약 0.5의 OD600 흡광도가 되도록 현탁한 후, 현탁배양액을 API 50 CH test strip의 각 앰플(ampule)에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 접종 후 24, 48시간이 지난 시점에서 당발효 결과를 확인하였다.
V5 균주의 당분해능을 조사한 결과, 만노오스(Mannose) 및 D-글루코네이트(D-Gluconate)에 대해 약한 양성 반응(48시간 이내에 파란색이 녹색으로 변화함)이 나타났고, 리보오스(Ribose), 갈락토스(Galctose), 프럭토스(Fructose), 말토오스(Maltose), 락토오스(Lactose), 멜리비오스(Melibiose), 수크로스(Sucrose), 라피노스(Raffinose)에 대해서는 양성 반응(48시간 이내에 파란색이 노란색으로 변화함)이 나타났다(표 1).
Carbohydrates Lactobacillus fermentum ATG-V5 Carbohydrates Lactobacillus fermentum ATG-V5
Glycerol - Esculin -
Erythritol - Salicin -
D-Arabinose - Cellbiose -
L-Arabinose - Maltose +
Ribose + Lactose +
D-Xylose - Melibiose +
L-Xylose - Sucrose +
Adonitol - Trehalose -
Methyl-βanoside - Inulin -
Galactose + Melezitose -
Glucose + Raffinose +
Fructose + Starch -
Mannose w Glycogen -
Sorbose - Xylitol -
Rhamnose - Gentiobiose -
Dulcitol - Turanose -
Inositol - Lyxose -
Mannitol - Tagatose -
Sorbitol - D-Fructose -
Methyl-αD-Mannopyranoside - D-Arabitol -
Methyl-αD-Glucopyranoside - L-Arabitol -
N-Acetylglucosamine - Gluconate w
Amygdalin - 2-keto-Gluconate -
Arbutin - 5-keto-Gluconate -
*Lactobacillus fermentum ATG-V5의 당발효 패턴(양성: +, 약한 양성: w, 음성: -)
<실시예 2> V5 균주의 특성 확인
<2-1> V5 균주의 항생제 내성 안전성 확인
항생제 테스트는 암피실린(Ampicillin), 반코마이신(Vancomycin), 겐타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 클린다마이신(Clindamycin), 에리트로마이신(Erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol)의 9종의 항생제 E-test strip(BioMerieux, 프랑스)를 이용하여 최저 저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 값을 확인하였다.
구체적으로, V5 균주를 약 OD600 흡광도 0.8로 각각 현탁하여 멸균된 면봉을 이용하여 MRS 고체배지에 도말하였다. 상기 균주가 도말된 고체배지를 약 3분 간 건조한 후 E-test strip을 올려 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 단, 유산균들의 특성상 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 계열인 겐타마이신, 카나마이신 및 스트렙토마이신에 대하여 자연적 고유내성(intrinsic resistance)이 발생하는 경우가 있으므로, 상기 항생제들에 대한 test medium은 plate count agar(PCA, Difco Laboratories, USA) 또는 Mueller-Hinton agar(MHA, Difco Laboratories, USA)를 사용하였다. 항생제의 종류와 안전하다고 판단될 수 있는 최저 저해농도의 기준은 EFSA(European food safety authority)에서 발간한 가이드라인을 참조하였다(EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed, 2012).
상기 항생제 9종에 대한 V5 균주의 최저저해농도(MIC) 측정 실험을 수행한 결과, V5 균주는 EFSA 가이드라인의 한계치보다 낮은 항생제 감수성을 갖는 것을 확인하였다(표 2).
Organism AMP VAN GEN KAN STR CD ERY TET CM
Lactobacillus fermentum ATG-V5 0.125 NR 2 12 12 0.094 0.19 2 4
EFSA 기준 4 NR 8 64 64 1 1 16 4
각 수치의 단위는 ㎍/㎖,
AMP, ampicillin; VAN, vancomycin; GEN, gentamicin; KAN, kanamycin; STR, Streptomycin;
CD, clindamycin; ERY, erythromycin; TET, tetracycline; CM, Chloramphenicol; 및 NR, not required.
<2-2> V5 균주의 용혈성 확인
프로바이오틱스의 안전성과 관련하여 V5 균주의 용혈 작용 여부를 알기 위해, V5 균주를 5% sheep blood를 포함한 배지(BAPI, 아산제약)에 접종한 후, 37℃에서 24 내지 48시간 동안 배양하였다.
그 결과, 상기 고체배지에서 V5 균주의 성장이 확인되었으나, 용혈 작용 및 그로 인한 억제환(clear zone)은 발견되지 않았다(도 2).
<2-3> V5 균주의 생체 아민(biogenic amine) 생성 확인
V5 균주가 인체에 유해할 수 있는 히스타민(Histamine), 타이라민(Tyramine), 퓨트레신(Putrescine) 및 카다베린(Cadaverine) 등 생체 아민(biogenic amine)을 생성하는지 여부를 확인하기 위해, Bover-Cid 및 Holzapfel이 제시한 방법에 따라 시험을 수행하였다(Bover-Cid and Holzafel, 1999).
구체적으로, "Bover-Cid and Holzapfel, 1999"에서 제시한 시험용 고체배지의 성분에 따라 배지를 조성한 후, 상기 V5 균주를 접종하여 37℃에서 72시간 동안 배양하여 배지의 색상 변화를 관찰하였다. 생체 아민이 양성인 경우, 탈탄산효소(decarboxylase)의 작용에 의해 V5 균주가 접종된 주변의 pH 값이 올라가게 되어 상기 배지에 포함된 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple) 시약이 노란색에서 보라색으로 변하게 된다.
그 결과, 상기 고체배지에서 V5 균주의 성장은 확인되었으나, 색상 변화는 없으므로 히스타민, 타이라민, 퓨트레신 및 카다베린 중 어느 하나 이상의 생체 아민도 생성되지 않았음을 확인하였다(도 3).
<2-4> V5 균주의 항균 효과 확인
V5 균주의 항균 기능성을 확인하기 위해, 그람양성(gram-positive) 4종 SA(Staphylococcus aureus, KCTC1621), LM(Listeria monocytogenes, KCTC3569), SM(Streptococcus mutans, KCTC3065) 및 SS(Streptococcus salivarius ATG-P1), 및 그람음성(gram-negative) 3종 EC(Escherichia coli, KCTC1682), PA(Pseudomonas aeruginosa, KCTC2004) 및 CS(Cronobacter sakazakii, KCTC2949) 등 총 7종의 감염성 또는 기회감염성 세균을 이용하여 disc test를 수행하였다.
구체적으로, 하룻밤 BHI 평판배지에서 배양한 7종의 세균을 1X PBS(phosphate buffered saline)에 약 0.8의 OD600으로 각각 현탁하였고, 각 현탁액은 멸균된 면봉으로 흡수하여 BHI와 MRS를 1:1로 혼합한 유산균 항균활성 시험용 agar medium에 전체 도말하고 약 3분간 건조하였다. 건조된 시험용 agar medium에 8mm paper disc(Advantec, Japan)를 부착하고 MRS broth에서 약 18 내지 20시간 배양한 V5 균액을 각각 35μL씩 paper disc에 접종한 후 약 3분간 건조하였고, 37℃에서 배양하며 경과를 관찰하였다. 배양 후 생성된 억제환(clear zone)의 크기는 지름을 측정하여 paper disc의 지름인 8mm를 제하여 최종 값을 산출하였다.
상기 7종의 감염성 또는 기회감염성 세균에 대한 V5 균주의 항균활성을 측정한 결과, 상기 V5 균주는 SS를 제외한 6종의 기회감염성 세균에 대해서 항균효과가 있음을 확인하였다(표 3).
Organism SA LM SM SS EC PA CS
Lactobacillus fermentum ATG-V5 4 6 4 0 4 10 4
SA, Staphylococcus aureus KCTC1621; LM, Listeria monocytogenes KCTC3569; SM, Streptococcus mutans KCTC3065; SS, Streptococcus salivarius ATG-P1; EC, Escherichia coli KCTC1682, PA, Pseudomonas aeruginosa KCTC2004; 및 CS, Cronobacter sakazakii KCTC2949
<2-5> V5 균주의 내산 내담즙성 확인
유산균은 음식물과 함께 섭취하였을 때 강한 위산을 분비하는 위에서 1시간 정도 머무른 후, 십이지장에서는 고농도의 담즙에서 2시간 정도 머무른 후 장으로 이동하게 된다. 유산균이 이런 극심한 환경에서 살아남아 장으로 들어갈 수 있어야 장에 달라붙어 숙주에게 좋은 영양을 끼치게 되어 프로바이오틱스로서의 역할을 한다고 알려져 있으므로, 인체(위 및 십이지장) 환경과 비슷한 조건으로 설정된 SSDP(simulated stomach duodenum passage) 방법으로 분리한 V5 균주의 내산성 및 내담즙성 실험을 수행하였다.
구체적으로, V5 균주를 18시간 동안 MRS 액체배지에서 배양시킨 후, 1ml의 균주액을 멸균된 일회용 튜브에 담아 12,000xg 로 5분 간 4℃에서 원심분리하였다. 그 다음, 상층액은 버리고 세포 펠렛은 생리식염수로 씻어주는 과정을 2회 반복 수행한 후 생리식염수를 제거하고, 침전된 V5 균주 pH 2으로 조절된 MRS 액체배지 10ml에 섞은 후 충분히 섞었다. 현탁액 중 1ml을 취해 10배로 계단식 희석하여 MRS 고체배지에 도말하여 계수함으로써, 최초 균의 CFU/ml을 계수하고 나머지 9ml에 1.5ml의 담즙산(10g 옥스갈(oxgall)에 증류수 100ml을 섞어 고압멸균하여 사용) 및 17ml의 십이지장액(duodenum juice; 6.4g/L NaHCO3, 0.239g/L KCl 및 1.28g/L NaCl을 증류수에 잘 섞은 후 pH를 7.4로 맞추어 고압멸균하여 사용)을 연속적으로 섞은 후 MRS로 총 부피를 30mL이 되도록 맞춰준 뒤 37℃ 배양기에서 2시간 배양하였다. 2시간 후 배양액에서 1mL을 취하여 10배씩 계단 희석하여 MRS 고체배지에 도말하여 살아남은 균의 수를 계수하였고, 계수된 최초 균의 CFU/ml과 3시간 후 살아 남아있는 균의 CFU/ml을 비교하여 생존률을 계산하였다.
그 결과, V5 균주의 경우 pH 2.0에서 92%의 생존율이 있는 것을 확인하였으며, 이후 십이지장액 및 0.5% 옥스갈을 처리하였을 때, 0.05%의 생존율이 있는 것을 확인하였다(표 4). 이는 V5 균주가 위산 조건에서 충분히 생존할 수 있음을 나타낸다.
초기 세포수
(logCFU/ml)		 pH 2.0에서
한 시간 후
(logCFU/ml)		 pH 2.0에서
한 시간 후 생존율(%)		 0.5% 옥스갈에서
두 시간 이상 후
(logCFU/ml)		 총 생존율(%)
V5 8.70±0.09 8.67±0.04 92.2 5.39±0.20 0.05
<2-6> V5 균주의 전장유전체 분석
V5 균주의 전장 유전체 분석을 위해, 상기 V5 균주의 genomic DNA를 추출하여 Pacific Bioscience 사의 SMRT(Single Molecule Real-Time) sequencing 기법을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 생산된 염기서열 데이터는 SMRT analysis software v2.3.0의 Hierarchical Genome Assembly Process(HAGP) 2 protocol을 이용하여 조립(assemble) 하였으며, 주석 처리(annotation)를 위해 Rapid Annotation using Subsystem Technology(RAST) server (http://rast.nmpdr.org/)를 활용하였다. 또한, 알려진 Lactobacillus reuteri strain들과의 유사성 확인을 위해 Average Nucleotide Identity(ANI) analysis를 진행하였으며, PathoFinder 1.1 https://cge.cbs.dtu.dk/services/PathogenFinder/)을 이용하여 유전정보로부터 안전성 여부를 한번 더 검증하였다.
V5 균주의 유전체 정보분석 결과, 2,222,724bp의 염색체(chromosome)와 16,984bp의 플라스미드(plasmid)를 가졌으며(도 4), 유전체 상의 16S rRNA gene sequence를 이용하여 균주 동정을 수행한 결과, Lactobacillus fermentum 종임을 확인하였다.
주석 처리(annotation) 결과에서 V5 균주의 신규성 확인을 위해, Lactobacillus fermentum 종의 표준 균주(type strain)와 유전체 크기가 비슷하며 완전 해독된 유전체 정보를 가지는 여덟 균주 및 상기 V5 균주를 이용하여 ANI 분석을 진행한 결과, 상기 균주들의 유전체 크기가 모두 달랐으며, 0.45 내지 2.37%의 상이성을 보여, 상기 V5 균주는 기존에 알려지지 않은 새로운 균주임을 확인하였다(표 5).
Strain Size (bp) ANI Assembly level Release Date
ATG-V5 2,239,708 해당 균주 Complete 미공개
DSM 20052 (표준균주) 1,887,974 99.27 Scaffold 2020-07-08
LMT2-75 2,298,221 99.13 Complete 2018-12-02
3872 2,297,851 99.26 Complete 2015-06-17
FTDC 8312 2,239,921 99.38 Complete 2017-05-09
AGR 1485 2,226,862 98.89 Complete 2020-02-27
SNUV175 2,176,678 99.03 Complete 2017-01-10
CECT 5716 2,100,449 99.55 Complete 2010-06-29
SK152 2,092,273 99.01 Complete 2017-08-07
AGR 1487 1,939,032 97.63 Complete 2020-02-27
주석 처리(annotation)된 정보를 바탕으로 코딩 서열(coding sequence)을 카테고리화한 결과, 상기 V5 균주는 전체 2,100개의 기능 유전자 중 119개의 carbohydrate transport and metabolism 관련 유전자 및, 85개의 Cell wall, membrane, 및 envelope biogenesis 관련 유전자를 가져 프로바이오틱스 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다(표 6).
또한, PathoFinder를 이용하여 상기 V5 균주의 유전적 안전성을 살펴본 결과, 병원성 균주가 아닌 것으로 확인되어 산업화에 문제가 없는 것을 확인하였다.
Predicted function Gene count
Translation, ribosomal structure and biogenesis 135
RNA processing and modification 0
Transcription 115
Replication, recombination and repair 334
Chromatin structure and dynamics 0
Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning 21
Nuclear structure 0
Defense mechanisms 33
Signal transduction mechanisms 44
Cell wall/membrane/envelope biogenesis 85
Cell motility 4
Cytoskeleton 0
Extracellular structures 0
Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport 18
Posttranslational modification, protein turnover, chaperones 52
Energy production and conversion 82
Carbohydrate transport and metabolism 119
Amino acid transport and metabolism 183
Nucleotide transport and metabolism 91
Coenzyme transport and metabolism 64
Lipid transport and metabolism 47
Inorganic ion transport and metabolism 87
Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism 13
General function prediction only 123
Function unknown 460
<실시예 3> V5 균주의 대식세포 증식 및 기능 강화 효능 확인
<3-1> V5 균주에 의한 대식세포의 증식능 확인
V5 균주에 의한 대식세포의 증식능을 확인하기 위해, 대표적인 면역세포로 사용하는 마우스의 대식세포인 raw264.7 세포를 사용하였다.
구체적으로, raw264.7 세포를 3×104/well의 개수로 96well plate에 배양하였고, V5 균주를 일정량의 세포에 일정량의 비율로 처리하기 위해, MOI(Multiplicity of Infection)의 비율로 균 수를 계산하여 처리하였다. raw264.7 세포:V5 균주로 1:1.25, 1:2.5, 1:5, 1:10, 1:20 및 1:40의 균주 농도를 세포에 처리하고 24시간 배양하여 raw264.7 세포의 증식능을 WST 기질(DoGenBio, KR)을 이용하여 흡광도 450nm에서 측정하였다.
그 결과, V5 균주에 의한 대식세포의 증식 정도에서는 차이가 미비하지만, V5 균주에 의한 세포 독성은 없는 것을 확인하였다(도 5).
<3-2> V5 균주에 의한 대식세포의 NO 분비량 증가 확인
V5 균주가 대식세포의 NO(Nitric Oxide) 분비량을 증가시키는지 여부를 확인하기 위해, raw264.7 세포를 3×104/well의 개수로 96well plate에 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양하였다. raw264.7 세포:V5 균주로 1:1.25, 1:2.5, 1:5, 1:10, 1:20 및 1:40의 균주 농도를 세포에 처리하고, 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양하여 NO의 생성을 유도하였다. LPS 1μg/ml는 positive control(양성 대조군)로 사용하였다. 24시간 동안 배양한 상층액 50μl 및 그리스 시약(griess reagent; sigma, USA) 50μl를 섞은 후 15 내지 30분 동안 반응시킨 후 흡광도 540nm에서 측정하였다.
그 결과, V5 균주를 처리했을 때, 상기 raw264.7 세포에서 NO의 생성을 농도의존적으로 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다(도 6).
<3-3> 대식세포의 NO 분비량 증가에 대한 V5 균주 및 기타 균주의 효능 비교
raw264.7 세포를 3×104/well의 개수로 96well plate에 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양하였다. raw264.7 세포:V5, K23 또는 K24 균주로 1:10 및 1:20의 균주 농도를 세포에 처리하고, 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양하여 NO의 생성을 유도하였다. LPS 1μg/ml는 positive control(양성 대조군)로 사용하였다. 24시간 동안 배양한 상층액 50μl 및 그리스 시약(griess reagent; sigma, USA) 50μl를 섞은 후 15 내지 30분 동안 반응시킨 후 흡광도 540nm에서 측정하였다.
Lactobacillus fermentum ATG-V5 (V5 균주), ATG-K23 (K23 균주) 및 ATG-K24 (K24 균주)를 처리하여 Nitric oxide (NO)의 분비량을 비교한 결과, NO는 V5, K23 및 K24 균주에서 분비되는 것을 확인하였지만, V5 균주에서 농도의존적으로 증가함을 확인하였으며, 균주 농도 20에서 V5 균주(95.1%)가 K23 (65.2%) 및 K24 균주(69.9%)에 비해 NO의 분비를 더 유도하는 것을 확인하였다(도 7).
<3-4> V5 균주에 의한 대식세포의 식세포작용 증가 확인
또한, V5 균주에 의한 대식세포의 식세포작용(phagocytosis) 증가 여부를 확인하기 위해, raw264.7 세포를 5×104/well의 개수로 96well plate에 배양하였다. raw264.7 세포:V5 균주로 1:2.5, 1:5, 1:10 및 1:20의 균주 농도를 세포에 처리하고 raw264.7 세포의 식세포작용을 측정하기 위해 zymosan substrate를 처리한 후, 2시간 배양하였다. "Inhibitor(억제제)"는 식세포작용의 실험유도 여부를 확인하기 위한 대조군으로 사용하였으며, raw264.7 세포에 의한 zymosan substrate 섭취량을 흡광도 405nm에서 측정하였다.
그 결과, V5 균주를 처리했을 때, 대조군과 대비하여 상기 raw264.7 세포에서 식세포작용이 증가함을 확인하였다(도 7).
<3-5> V5 균주가 대식세포의 사이토카인 분비량에 미치는 영향 확인
V5 균주가 대식세포의 사이토카인 분비량에 미치는 영향을 확인하기 위해, raw264.7 세포를 3×104/well의 개수로 96well plate에 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양하였다. raw264.7 세포:V5 균주로 1:1.25, 1:2.5, 1:5, 1:10, 1:20 및 1:40의 균주 농도를 세포에 처리하고, 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양하여 사이토카인의 생성을 유도하였다. LPS 1μg/ml은 positive control(양성 대조군)로 사용하였고, 24시간 동안 배양한 상층액을 이용하여 IL-6, TNF-α, IL-1β 및 IL-10에 대한 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 실시하였다.
그 결과, 상기 V5 균주는 면역 자극성 사이토카인인 IL-6 및 TNF를 농도의존적으로 증가시킴을 확인하였고(도 8a 및 8b), 면역조절에 기여하는 IL-1β의 양을 감소시킴을 확인하였으며(도 8c), 면역 억제성 사이토카인인 IL-10의 분비를 유도하지 않음을 확인하였다(도 8d).
<실시예 4> CPP 유도 동물모델에서 V5 균주의 면역 강화 효능 확인
<4-1> 실험 일정 및 V5 균주 투여 조건
CPP(cyclophosphamide) 유도 동물모델에서 V5 균주의 면역 강화 효능을 확인하기 위해, V5 균주 농도별 실험을 진행하였다. Cyclophosphamide(CPP)는 각종 암과 육종, 백혈병, 악성림프종에 널리 사용되는 항암제이며, 비특이적 면역억제제이다. CPP 처리에 의해 면역이 억제된 마우스의 면역력 증강 활성을 측정함으로써 프로바이오틱스와 같은 시험물질의 면역 증강 소재로서의 가능성을 평가해볼 수 있다. CPP에 의해 면역력이 억제되면 면역 조직인 흉선의 무게와 흉선 세포수가 감소하고 면역억제에 대한 방어기작으로 비장의 무게가 증가한다. 또한 T 세포와 B 세포의 분화 감소, 대식세포의 탐식작용 저하, 면역 활성물질인 사이토카인들의 분비와 NK 세포 활성이 감소 등 전반적인 면역 기능 저하가 나타난다.
구체적으로, 그룹당 7마리씩 normal control(NC), CPP 150mg/kg, ATG-V5(V5 균주) 1×109 CFU/mouse(109 CFU), ATG-V5(V5 균주) 1×1010 CFU/mouse(V5 1010 CFU)의 4그룹으로 실험을 진행하였다. 실험 기간은 1차 CPP 유도(-2day)부터 매일 ATG-V5를 경구투여하였으며, 7일차에 해부를 진행하였다(도 9).
<4-2> V5 균주 투여에 따른 CPP 유도 동물모델의 흉선 및 비장 무게 변화 확인
V5 균주가 CPP 유도 동물모델의 흉선(thymus) 및 비장(spleen) 무게에 미치는 영향을 확인하기 위해, 상기 동물모델의 흉선 및 비장 무게를 측정하였다.
CPP에 의해 흉선의 무게가 0.061g에서 0.03g으로 감소하였고, 비장의 무게는 0.105g에서 0.170g으로 증가하였고, CPP 유도 동물모델에 V5 균주를 투여한 결과, 흉선의 무게가 0.031g(CPP)에서 0.048g(V5 1010 CFU)으로 유의미하게 증가하였고, 비장의 무게는 0.170g(CPP)에서 0.111g(V5 1010 CFU)으로 유의미하게 감소하였음을 확인하였다(도 10a 및 10b).
<4-3> V5 균주 투여에 따른 CPP 유도 동물모델 내 NK 세포의 세포독성 활성 증가 확인
NK 세포(NK cell, natural killer cell)의 세포독성 활성(cytotoxicity)을 측정하기 위해, CPP 유도 동물모델에서 비장을 분리한 후, 조직을 갈아서 비장세포(splenocytes)를 확보하였고 YAC-1 세포와 YAC-1 세포:비장세포 = 1:50의 비율로 섞어준 후, 37℃ CO2 incubator에서 4시간 동안 배양시켰다. LDH-cell cytotoxicity assay kit를 통해 LDH의 양을 측정하였다.
그 결과, CPP 유도 동물모델에서 V5 균주에 의해 NK 세포의 세포독성 활성이 144%(CPP)에서 494%(V5 109 CFU) 및 521%(V5 1010 CFU)로 증가함을 확인하였다(도 11).
<4-4> V5 균주 투여에 따른 CPP 유도 동물모델 내 비장세포의 세포 생존력 증가 확인
여러 가지 세포성 면역에 관여하는 세포들이 모여 있는 비장세포의 세포 생존력을 측정하기 위해, 각각의 마우스의 비장세포를 96well plate에 1×104개/well씩 분주(seeding)하고 37℃ CO2 incubator에서 48시간 동안 배양시켰다. 그 후, WST를 처리하여 세포 생존력(cell viability)을 측정하였다.
그 결과, CPP 유도 동물모델에서 V5 균주에 의해 비장세포의 세포 생존력이 99.98%(CPP)에서 135.95%(V5 1010 CFU)로 증가함을 확인하였다(도 12).
<4-5> V5 균주 투여에 따른 CPP 유도 동물모델의 비장 내 T 세포 아형 변화 확인
또한, 상기 비장세포를 2Х106개/sample씩 TRIzol Reagent(Thermo, US)를 사용하여 RNA를 분리하였고 AccuPower® RT PreMix & Master Mix(바이오니아, KO)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 AccuPower® GreenStar?? qPCR PreMix (바이오니아, KO)를 사용하여 T 세포의 아형(subset)인 Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포의 분화 변화를 확인하기 위해, 상기 세포들의 TBX21, GATA3, RORγt, IL-17A, Foxp3, CTLA-4 mRNA 발현량을 측정하였다.
그 결과, CPP에 의해 미접촉 T 세포(naive T cell)의 분화가 억제됨으로써 전체적인 T 세포 아형의 수가 억제되어 있음을 확인하였고, V5 균주에 의해 Th1, Th2, Th17 및 Treg cell의 수가 유의미하게 증가함을 확인하였다(도 13a 내지 13f).
<4-6> V5 균주 투여에 따른 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 항체 분비량 변화 확인
CPP 유도 동물모델의 혈액을 상온 2시간 반응 후 4000 rpm, 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 이용하여 IgG, IgA 및 IgM ELISA kit (Thermo, US)를 사용하여 분비량을 측정하였다.
CPP 유도 동물모델의 혈액에서 IgG, IgA 및 IgM의 분비량을 분석한 결과, CPP에 의해 IgG 및 IgA의 분비량이 감소함을 확인하였고, V5 균주에 의해서 IgG 및 IgA의 분비량이 증가함을 확인하였다(도 14a 및 14b). 한편, IgM은 CPP에 의해 변화가 없으며, V5 균주에 의해서도 변화를 보이지 않음을 확인하였다(도 14c).
<4-7> V5 균주 투여에 따른 CPP 유도 동물모델의 혈액 내 사이토카인 분비량 증가 확인
또한, 상기 혈청을 이용하여 IL-6, IL-2, IL-10 및 IL-4에 대한 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 실시하였다.
CPP 유도 동물모델에서 사이토카인을 분석한 결과, CPP에 의해 전반적인 사이토카인의 감소 경향을 확인하였고, V5 균주에 의해 증가하는 것을 확인하였다(도 15a 내지 15d).
<110> AtoGen <120> Novel Lactobacillus fermentum ATG-V5, and composition for enhancing immunity comprising thereof <130> P2021-0137 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1448 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of Limosilactobacillus fermentum ATG-V5 <400> 1 atgcagtcga acgcgttggc ccaattgatt gatggtgctt gcacctgatt gattttggtc 60 gccaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc tgcccagaag cgggggacaa 120 catttggaaa cagatgctaa taccgcataa cagcgttgtt cgcatgaaca acgcttaaaa 180 gatggcttct cgctatcact tctggatgga cctgcggtgc attagcttgt tggtggggta 240 acggcctacc aaggcgatga tgcatagccg agttgagaga ctgatcggcc acaatgggac 300 tgagacacgg cccatactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatgggcgca 360 agcctgatgg agcaacaccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa gctctgttgt 420 taaagaagaa cacgtatgag agtaactgtt catacgttga cggtatttaa ccagaaagtc 480 acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt 540 attgggcgta aagagagtgc aggcggtttt ctaagtctga tgtgaaagcc ttcggcttaa 600 ccggagaagt gcatcggaaa ctggataact tgagtgcaga agagggtagt ggaactccat 660 gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctacctgg 720 tctgcaactg acgctgagac tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta 780 gtccatgccg taaacgatga gtgctaggtg ttggagggtt tccgcccttc agtgccggag 840 ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt 900 gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct 960 taccaggtct tgacatcttg cgccaaccct agagataggg cgtttccttc gggaacgcaa 1020 tgacaggtgg tgcatggtcg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080 acgagcgcaa cccttgttac tagttgccag cattaagttg ggcactctag tgagactgcc 1140 ggtgacaaac cggaggaagg tggggacgac gtcagatcat catgcccctt atgacctggg 1200 ctacacacgt gctacaatgg acggtacaac gagtcgcgaa ctcgcgaggg caagcaaatc 1260 tcttaaaacc gttctcagtt cggactgcag gctgcaactc gcctgcacga agtcggaatc 1320 gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380 ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt taggagccag 1440 ccgcctaa 1448

Claims (13)

  1. 기탁번호 KCTC14481BP로 기탁된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-T5 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 대식세포의 NO(Nitric Oxide) 분비량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 대식세포의 식세포작용(phagocytosis)을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 NK 세포(NK cell, Natural killer cell)의 세포독성 활성(cytotoxicity)을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 비장세포의 세포 생존력(cell viability)을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 T 세포 아형(subset)의 세포 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 혈액 내 IgG 및 IgA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항체 분비량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 혈액 내 IL-6(Interleukin 6), IL-2(Interleukin 2), IL-10(Interleukin 10) 및 IL-4(Interleukin 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인 분비량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 퍼멘텀 ATG-V5 균주.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ATG-V5 균주의 배양액, 대사산물 및 사균체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 락토바실러스 ATG-V5 균주.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 식품 조성물.
  13. 제12항의 식품 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 면역증강용 건강기능식품.
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