TWI727378B - 嗜熱鏈球菌菌株st4及其抗發炎及預防癌症功效 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一株新穎之嗜熱鏈球菌菌株，命名為嗜熱鏈球菌ST4，及其用於製備治療及/或預防發炎性疾病及/或癌症藥物及/或食品組合物之用途。

Description

嗜熱鏈球菌菌株ST4及其抗發炎及預防癌症功效
本發明係有關一種新穎嗜熱鏈球菌菌株。特別是，本發明提供一種新穎嗜熱鏈球菌菌株用於治療或預防發炎性疾病或癌症之用途。
根據估計，約20%大腸癌是由於遺傳所造成的，約80%的大腸癌是由腸道慢性發炎、腸道菌相等因素所貢獻的。
腸道發炎能夠啟動腸道腫瘤生成，並加速腫瘤的生長速度，例如格蘭氏陰性菌的細胞壁成分脂多醣(Lipopolysaccharide,LPS)，可以藉由促進發炎反應促進大腸癌細胞的生長與擴散。科學研究已證實透過抑制腸道發炎能夠有效預防大腸癌、減緩大腸癌的疾病進展。
腸道菌群失衡是誘發大腸癌的危險因子，目前已發現多種細菌在大腸癌患者的腸道內明顯較多，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、鏈球菌屬(Streptococcus)，曾感染Streptococcus gallolyticus或Streptococcus infantarius的患者罹患大腸癌的比例明顯較高，而研究進一步證實牛鏈球菌(Streptococcus bovis)的細胞壁成分、Streptococcus infantarius細胞壁的蛋白質成分，能有效誘發THP-1等細胞釋放促發炎激素TNF-α與IL-8，並促進大腸癌 前病變異常腺窩病灶(Aberrant crypt foci)生成，顯示鏈球菌屬的部分菌種，可透過發炎反應誘發大腸癌的生成。
嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)是常見的益生菌種，且廣泛用於生產發酵乳製品，雖然科學文獻卻報導鏈球菌屬可能與腸道發炎及大腸癌相關，然而不同菌株的特性與能力是可變的，因此有必要發展安全且可抑制發炎、大腸癌的嗜熱鏈球菌菌株。
本發明係由牛乳生乳的微生物群落中經分離而得新穎嗜熱鏈球菌ST4菌株，其與現有已知的菌株不同。本發明新穎嗜熱鏈球菌菌株具有治療或預防發炎性疾病或大腸癌之功效。
因此，在一方面，本發明提供一種經分離之嗜熱鏈球菌ST4菌株(Streptococcus thermophilus ST4)，其中該菌株具有以下特性：2019年5月28日寄存於德國微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，寄存編號：DSM33165。同時於2019年7月23日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC910922。
在另一方面，本發明提供一種包含有效量之該嗜熱鏈球菌株之組合物，其中該嗜熱鏈球株為活菌或死菌。該組合物可為藥物或食品，可用於治療及/或預防個體之發炎性疾病，特別是抑制該個體之TNF-α的產生。
在更另一方面，本發明所提供之藥物或食品組合物可用於治療及/或預防癌症，其中該癌症係選自由大腸癌、食道癌及胃癌所組成的群組，較佳為大腸癌。
本發明又提供一種於所需個體治療或預防發炎性疾病或治療癌症之方法，其包括將有效量的該嗜熱鏈球菌菌株投予至該個體中。
當結合附圖閱讀時，將更佳地理解前述發明內容以及以下對本發明的詳細描述。為了說明本發明的目的，在附圖中顯示目前較佳的具體實施例。
圖1顯示嗜熱鏈球菌ST4菌株之細胞形狀。
圖2提供嗜熱鏈球菌ST4菌株之VITEK鑑定系統分析結果。
圖3提供嗜熱鏈球菌ST4菌株、s1、s2、s3及BCRC13869菌株，其熱滅活菌體之抑制TNF-α分泌活性。
圖4顯示嗜熱鏈球菌ST4菌株減少azoxymethane(AOM)/dextransulfatesodium(DSS)誘導的大腸腫瘤數目。*，p<0.05；**，p<0.01。
除非另外定義，本文所用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬領域之技術者普遍了解之相同意義。應理解本文所使用的術語僅具有針對描述具體實施例之目的，而意不在於限制。
如本文所用，單數形式「一」(a、an)及「該」包括複數參照，除非另外明確指示內容。因此，例如，對「一樣本」之參照包括複數個此等樣本及熟習本技術者已知之其等同物。
如本文所用，術語「菌落形成單位」(Colony-forming unit，CFU)定義為如由瓊脂培養基上微生物生成所揭露的細菌細胞數目。
如本文所用，術語「治療」係指施加或投予一或多個活性藥劑至具有疾病、疾病症狀或疾病傾向之個體，其目的在於治療、治癒、緩解、減輕、改變、補救、改善、改進、或影響疾病、疾病症狀或疾病傾向。舉例而言，本文所使用的「治療發炎性疾病」係指減少局部或全身性的過度發炎反應，其係藉由抑制TNF-α表現。
如本文所用，術語「有效量」係指個體中足以達到上述治療功效之活性藥劑或組合物的量。有效量可例如依藥劑或組合物之種類或劑量及欲治療個體之體重、年齡及健康狀況而變。
本發明提供一種經分離的嗜熱鏈球菌ST4菌株(Streptococcus thermophilus ST4)，係於2019年5月28日寄存於德國微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，寄存編號：DSM33165。同時於2019年7月23日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC910922。
如本文所用，「嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)」係指一種革蘭氏陽性細菌，為同型發酵(homofermentative)兼性厭氧，屬於草綠色鏈球菌。對細胞色素、氧化酶及過氧化氫酶試驗陰性，甲型溶血性試驗陽性。不運動，無內生孢子。
本發明之嗜熱鏈球菌ST4菌株係由牛乳生乳的微生物群落中經分離而得。經菌學特徵分析，該菌株為革蘭氏陽性菌，呈圓球形或卵圓形、成對或長鏈狀、無孢子形成及無運動性，於厭氧或好氧環境下生長且不具過氧化氫酶及氧化酶活性。進一步以16S rDNA序列分析及VITEK鑑定系統鑑定，結果顯示ST4菌株確認為一種嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。
本發明之ST4菌株可以任何方式存在，包括活菌或死菌形式，亦包括具相同特徵的等同菌株及由該等菌株衍生所得之菌體或產物。
藉由使用本發明所提供之寄存菌株作為起始物質，熟習該項技術者可通常藉由習知突變誘發或再分離技術，獲得其他突變體或其衍生物，該突變體或衍生物保持或增強形成本發明組合物之菌株的本文所述之相關特徵及優點。
在部分具體實施例中，本發明所提供之組合物具有治療發炎性疾病的作用。具體而言，如實施例中所示，本發明組合物可以抑制LPS誘發THP-1細胞分泌TNF-α的功效。
在部分具體實施例中，本發明所提供之組合物具有抑制大腸腫瘤增生的作用。具體而言，如實施例中所示，本發明組合物可以抑制由致突變劑azoxymethane(AOM)及dextran sulfate sodium(DSS)引發的大腸癌，且還具有防止大腸腫瘤增生的作用。
在另一方面，本發明提供一種包括有效量之本發明ST4菌株的組合物，其用作醫藥產品、藥劑、食品、可食用產品、食品增補劑或醫學食品。
本發明之組合物可呈固體或液體形式，且可尤其呈散劑、錠劑或口含錠、吸吮錠劑、膜製劑、溶液、氣溶膠、顆粒、丸劑、懸浮液、乳液、膠囊、腸溶包衣錠劑及膠囊、糖漿、液體、酏劑、糖果、口嚼錠、栓劑、微型灌腸劑、乳膏、凝膠或軟膏之形式。
根據本發明之組合物可調配成一種形式，其中本發明之菌株為唯一活性劑或與一或多種其他活性劑混合及/或在食品或可食用產品的情況下與醫藥學上可接受之賦形劑或足夠添加劑或成分混合。
本發明的組合物可以被製造為各類食品，該等食品類的產品可利用常規賦形劑或填料以任何常規技術製造，並且如需要與添加劑混合。
本發明的組合物可以被製造為食品增補劑，其可原樣投予，可與適合的可飲用液體，諸如水、酸酪乳、牛乳或果汁混合，或可與固體或液體食品混合。在一些實施例中，食品增補劑可呈錠劑或口含錠、丸劑、膠囊、顆粒、散劑、懸浮液、藥囊、糖果、棒條、糖漿之形式及相對應投予形式、通常呈單位劑量形式。較佳地，包括本發明組合物之食品增補劑呈在製備飲食增補劑之習知方法中製造之錠劑、口含錠、膠囊或散劑形式投予。
本發明的組合物可以被製造為各類藥品，該等藥物可利用治療有效量的本發明組合物和其醫藥上可接受的載劑以一般的藥物技術或方法製造。本發明的組合物的給藥包括口服或注射劑給藥，並且可以進一步包括醫藥上可接受的載劑、稀釋劑和/或賦形劑。上述載劑可以是溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。稀釋劑可以是抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝液、林格溶液或葡萄糖溶液等。賦形劑可以是碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸鈉、乳糖、澱粉、明膠、藻酸、硬脂酸、硬脂酸鎂等。
再一方面，本發明之組合物提供用於個體上預防或治療發炎性疾病之用途，其中該發炎性疾病之非限制性實例包括發炎性及自體免疫性疾病，例如癌症、克隆式疾病(Crohn’s Disease)、發炎性腸疾(Inflammatory Bowel Disease，IBD)及發炎性大腸疾病。
再更一方面，本發明之組合物提供用於個體上預防或治療癌症之用途，其中該個體係選自由具高度發炎情形之癌症之族群。該等癌症已知亦為「發炎性特徵」且包括上升細胞激素訊息傳遞(如，TNF-α)之癌症。於一實施例 中，癌症係為發炎性腫瘤，舉例而言，但不限於，係為大腸癌、食道癌及胃癌，且特別是大腸癌。
以上對本發明之描述及以下實施例說明本發明之內容，但並非用於限制本發明之範圍。
實施例1 嗜熱鏈球菌ST4菌株之分離
本發明從牛乳生乳的微生物群落中分離菌株。取牛乳生乳加入MRS肉湯培養基，在42℃厭氧環境下培養24小時後，將該培養物塗佈在MRS瓊脂平板上，於42℃厭氧環境下培養3天，再收集於瓊脂培養基上出現的單一菌落，並進一步純化，分離出革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性，呈圓球形或卵圓形，成對或長鏈狀之嗜熱鏈球菌ST4菌株(Streptococcus thermophilus ST4)。
實施例2 嗜熱鏈球菌ST4菌株之菌學特徵
嗜熱鏈球菌ST4菌株之菌學特徵如下所示：
(1)形態學特徵：
(a)細胞形狀與革蘭氏染色：當細菌置於MRS肉湯培養基中，在42ºC厭氧環境下培養24小時後，於顯微鏡下觀察之外觀呈圓球形或卵圓形，成對或呈長鏈狀，無鞭毛，革蘭氏染色呈陽性，如圖1。
(b)活動力：無運動性。
(c)孢子形成：無孢子形成。
(d)革蘭氏染色：陽性。
(2)培養特徵：
(a)培養基：MRS肉湯培養基，pH=6.25。
(b)培養條件：42ºC厭氧或好氧環境。
(3)生理學特徵：
(a)過氧化氫酶：陰性。
(b)氧化酶：陰性。
實施例3 嗜熱鏈球菌ST4菌株之菌種鑑定
ST4菌株之菌種鑑定使用16S rDNA、VITEK系統，以兩種鑑定方法確保鑑定結果正確。
3.1 16S rDNA定序分析
萃取嗜熱鏈球菌ST4菌株之DNA，進行16S rDNA(ribosomal DNA)片段放大，並將所得到之PCR產物進行瓊脂凝膠電泳確認產物符合預期大小，並進行定序，所得嗜熱鏈球菌ST4菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示；將ST4菌株序列對照複合序列比對資料集(NCBI blastn)進行序列比對，序列比對結果與Streptococcus salivarius subsp.thermophilus ATCC 19258T最為接近，相似度達99.67%。
3.2 VITEK鑑定系統分析
根據VITEK半自動鑑定系統分析結果，ST4菌株最接近Streptococcus salivariussubsp.thermophilus，達99%，如圖2所示。
根據16S rDNA定序鑑定、VITEK比對結果和原核生物系統學國際委員會公告的Approved Lists of Bacterial Names 1980，顯示ST4菌株應為Streptococcus thermophilus(同種異名為Streptococcus salivariussubsp.thermophilus)。
實施例4、嗜熱鏈球菌ST4菌株對TNF-α之抑制
4.1 嗜熱鏈球菌熱滅活菌體製備
於37℃環境下靜置培養，將嗜熱鏈球菌株ST4、s1、s2、s3、BCRC13869分別培養於Brain heart infusion(BHI)培養液中24小時後，對培養液進行離心(4000RCF,10分)，將上清液去除後，以Phosphate buffer saline(PBS)清洗並以相同條件離心，共重覆兩次。菌體清洗後懸浮於PBS中，先以分光光度計測定吸光值，再以70℃水浴30分鐘，最後於-20℃冷凍保存樣品待後續試驗使用。製備之樣品再接種至BHI培養液後於37℃培養兩天，結果無生長跡象，表示菌體已全數死滅。
4.2 細胞實驗設計
人類單核球THP-1細胞株(BCRC 60430)購買自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,Hsinchu,Taiwan)，並以含有10%胎牛血清(fetal bovine serum)、0.05mM 2-mercaptoethanol、10,000I.U./mL Penicillin、10,000μg/mL Streptomycin、25μg/mL Amphotericin的RPMI 1640培養液，於37℃ 5% CO2培養。THP-1細胞以濃度6*10^5/mL的濃度接種至96孔盤中培養18小時，於嗜熱鏈球菌熱滅活菌體存在時(調整吸光值至終濃度OD600=0.01)，以500ng/mL之LPS刺激20小時後收取培養上清液，分析細胞激素TNF-α的含量。實驗控制組則單獨加入LPS刺激而不含菌體，對照組則僅有細胞培養液。
4.3 嗜熱鏈球菌ST4菌株抑制發炎激素TNF-α分泌
圖3顯示在嗜熱鏈球菌熱滅活菌s1、s2、s3、BCRC13869菌株存在時會促進THP-1細胞分泌TNF-α，然而在熱滅活菌ST4菌株存在時會抑制THP-1細胞分泌TNF-α，結果顯示ST4菌株滅活菌體降低單核球細胞因LPS引起的TNF-α，指出ST4具有抗發炎活性。
實施例5 嗜熱鏈球菌ST4菌株預防大腸癌
5.1 動物實驗設計
實驗動物為五週齡的ICR公鼠(28~30g)，實驗鼠採隨機分組的方式，預養一週後分組成三組，每組4隻小鼠進行實驗，分別為對照組、造症組、ST4組，所有的組別飼料皆給予一般商業配方(Laboratory Rodent Diet.5001)並採自由攝食(ad libitum)。本實驗為預防疾病模式，首先給予試驗樣品，再誘發大腸癌的發生。小鼠分組後，對照組與造症組管餵PBS、ST4組管餵嗜熱鏈球菌ST4 1×108CFU/day/mouse，直至第15周犧牲為止。管餵試驗樣品一週後，造症組、ST4組每隻小鼠腹腔注射10mg/kg體重的致突變劑azoxymethane(AOM)，再一週後，在飲用水中加入致大腸潰瘍藥劑2.5% dextransulfatesodium(DSS)連續給予7天，之後再更換成普通的飲用水14天，再給予7天2.5% DSS以誘發大腸癌的發生，最後更換成普通的飲用水直至第15周犧牲為止；而對照組腹腔注射PBS，且飲用水不加入DSS。
5.2 統計方法
數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示。組別之間的差異系由Student's t-test統計顯著性。當p<0.05(*)或p<0.01(**)時，造症組和其他組別間的差異被認為具有統計學意義。
5.3 嗜熱鏈球菌ST4菌株減少AOM/DSS誘導的大腸腫瘤數目
如圖4，相較於對照組，造症組可以顯著誘導大腸腫瘤生成，顯示在大腸發炎的狀況下致突變劑可誘導腫瘤生成。ST4組大腸腫瘤數目顯著較造症組低，即口服ST4菌株具有預防大腸癌的效果。
本領域中的通常知識者將理解，可以對上述具體實施例進行改變而不脫離其廣泛的發明構思。因此，應當理解，本發明不限於所揭露的特定具 體實施例，而是旨在涵蓋由所附的申請專利範圍所界定的本發明的精神及範圍內的修改。
【生物材料寄存】
嗜熱鏈球菌ST4菌株(Streptococcus thermophilus ST4)，2019年5月28日寄存於微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，寄存編號：DSM33165。
嗜熱鏈球菌ST4菌株(Streptococcus thermophilus ST4)，於2019年7月23日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC910922。
<110> 生展生物科技股份有限公司 陳，威仁 吳，炫慧 龔，巧鈴 蔡，侑倫
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<211> 1496
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 1
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Figure 108126266-A0305-02-0014-1

Claims (10)

  1. 一種經分離之嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)菌株，命名為嗜熱鏈球菌株ST4，其係於2019年7月23日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC910922。
  2. 一種組合物，其包括一有效量之如請求項1之分離嗜熱鏈球菌菌株。
  3. 如請求項2之組合物，其中該嗜熱鏈球菌菌株為活菌或死菌。
  4. 如請求項3之組合物，其中該嗜熱鏈球菌菌株為死菌。
  5. 如請求項2之組合物，其為一醫藥組合物或一食品組合物。
  6. 如請求項2之組合物，其用於治療及/或預防發炎性疾病。
  7. 如請求項6之組合物，其用於抑制TNF-α的產生。
  8. 如請求項2之組合物，其用於治療及/或預防癌症。
  9. 如請求項8之組合物，其中該癌症為選自由大腸癌、食道癌及胃癌所組成的群組。
  10. 一種如請求項1之分離嗜熱鏈球菌菌株用於製備用於治療及/或預防發炎性疾病及/或大腸癌之藥物或食品之用途。
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２、 Li Zhong et al：Emerging roles of lactic acid bacteria in protection against colorectal cancer. World J Gastroenterol 2014 June 28; 20(24): 7878-7886.
３、 G. Marcial et al：Exopolysaccharide-producing Streptococcus thermophilus CRL1190 reduces the inflammatory response caused by Helicobacter pylori. Beneficial Microbes, 2017; 8(3): 451-461.

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