SI24543A - Metoda za izolacijo in selekcijo bakterijskih sevov, bakterijski sevi in naäśin njihove uporabe - Google Patents

Abstract

Predloženi izum opisuje postopek izolacije in selekcije novih sevov Lactobacillus in Bifidobacterium iz bioptičnih vzorcev človeške črevesne sluznice. Sevi so bili izbrani na osnovi občutljivosti za protimikrobne snovi, sposobnosti preživetja v simuliranih razmerah okolja prebavil in izkazovanja protimikrobne aktivnosti. Osnova za ta izum so tudi celotna genomska zaporedja Lactobacillus fermentum L930BB in Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386. Izum se nanaša na uporabo kateregakoli od teh dveh sevov ali obeh skupaj v proizvodnji probiotičnega ali farmacevtskega izdelka, predvsem pri preprečevanju in/ali zdravljenju funkcionalnih motenj prebavil in bolezni v območju spodnjega prebavnega trakta, kot so sindrom razdražljivega črevesja (IBS) in kronične vnetne črevesne bolezni (IBD) (Crohn-ova bolezen in ulcerozni kolitis).

Description

1 • ·

METODA ZA IZOLACIJO IN SELEKCIJO BAKTERIJSKIH SEVOV, BAKTERIJSKI SEVI IN NAČIN NJIHOVE UPORABE

PROBLEM

Izum se nanaša na dva nova bakterijska seva iz črevesne sluznice debelega črevesa otroka in njuno uporabo kot probiotika, zlasti kot imunomudolatoma bioterapevtska sredstva.

STANJE TEHNIKE

Sluznica prebavil pri človeku je največja površina, na kateri poteka interakcija med gostiteljem in zunanjim okoljem, zato ima le-ta pomembno vlogo pri obrambi gostitelja. Je gosto poseljena s črevesno mikrobioto. Črevesna mikrobiota igra ključno vlogo pri delovanju imunskega sistema gostitelja, vpliva na prebavo in presnovo, in je vključena v komunikacijo med možgani in črevesjem. Tako je bistvenega pomena za vzdrževanje normalne črevesne fiziologije in zdravja. Črevesna imunska homeostaza je dosežena preko interakcije med epitelnimi celicami, makrofagi in dendritičnimi celicami (DC), ki je odgovor na črevesno mikrobioto, odraža pa se v diferenciaciji T celic. Komenzalna mikrobiota vpliva na razvoj in usposabljanje prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, reguliranega z različnimi receptorji PRR (pattem recognition receptors), ki prepoznavajo bakterijske molekulske vzorce MAMP (microbe-associates molecular pattems). Sposobnost gostitelja, da razlikuje med patogenimi in zdravimi črevesnimi bakterijami, ki je ključnega pomena za toleranco normalne črevesne mikrobiote, je zagotovljena s Toll-u podobnimi receptorji (TLR), ki sodijo v enega od dveh razredov PRR, ki prevladujejo v črevesju. Mehanizmi tolerance omogočajo gostiteljskemu organizmu preprečevanje tako okužb, kakor tudi poškodb tkiv kot posledice prekomernega vnetnega odziva. Porušenje črevesne mikrobiote lahko vodi do zmanjšane tolerance za komenzalne bakterije in do nekaterih vnetnih bolezni, kot so na primer sindrom razdražljivega črevesja (Intestinal bowel syndrome, IBS) in kronične vnetne črevesne bolezni (Intestinal bowel disease, IBD).

Imunski mehanizmi vključujejo proizvodnjo citokinov. Peyerjeve plošče so specializirani limfoidni agregati, na katerih se nahajajo M celice, ki so razporejene po 2 « ··· celotnem tankem in debelem črevesu. Na teh mestih poteka predstavljanje luminalnih antigenov, vključno z bakterijami, kar povzroči stimulacijo ustreznih celic T in B, inducira splet citokinov in izločanje protiteles v prebavni trakt.

Citokin IL-10 je tipičen protivnetni citokin, ki ga izločajo celice Th2, Treg, monociti in makrofagi. IL-10 zavira izražanje vnetnih citokinov, kot so TNF- a, IL-1, IL-6, IL-8 in IL-12. Šibka proizvodnja protivnetnega citokina IL-10 v črevesni sluznici bolnikov z IBD velja za pomemben dejavnik pri patogenezi IBD, zato je ta citokin zanimiv za terapevtsko uporabo. Na mišjem modelu kolitisa se je pokazalo, da miši (IL)-10(-/-) spontano razvijejo črevesno vnetje. Posamezni probiotični sevi, za katere je značilno, da dvigujejo nivo IL-10 in znižujejo nivo inflamatomega citokina IL-12 in vitro, so sposobni zaščititi živali pred razvojem kolitisa.

Različne bakterije lahko izzovejo različni imunski odziv pri različnih imunskih celicah, vnetni ali protivnetni, odvisno od seva. Tudi različni sevi rodu Lactobacillus in Bifidobacteria lahko sprožijo različne citokinske odzive.

Mlečnokislinske bakterije {Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc in Pediococcus) in bifidobakterije se že stoletja uporabljajo v proizvodnji fermentirane hrane. Danes jih pogosto uporabljajo v živilski industriji, industriji živalske krme in farmacevtski industriji kot starter kulture v fermentacijskih procesih in kot probiotike.

Probiotiki so opredeljeni kot "živi mikroorganizmi, ki ugodno vplivajo na gostiteljevo zdravje, če so zaužiti v ustrezni količini" (FAO/WHO. 2002. Smernice za vrednotenje probiotikov v hrani, London). Uvrščanje posameznih sevov med probiotike mora temeljiti na znanstvenih dokazih, ki potijujejo določen (specifičen za sev) učinek na gostitelja.

Lactobacillus fermentum je po Gramu pozitivna heterofermentativna vrsta bakterij iz rodu Lactobacillus. Ta vrsta je najpogosteje izolirana iz kislega testa ali iz fermentiranega živalskega in rastlinskega materijala, pogosto pa jo najdemo tudi na površini sluznice zdravih ljudeh in v materinem mleku (Jimenez, E. et al. 2010. Journal of Bacteriology. 192:4800-4800). Ta vrsta je po presoji znanstvenega sveta in enot Evropske agencije za varnost hrane (EFSA) vključena v seznam domnevno varnih (qualified presumption of safety, QPS) bioloških učinkovin, priporočljivih za uporabo v 3 • · hrani in krmi, (2012. EFSA Journal. 10:3020). Doslej (do oktobra 2013) so bila objavljena zaporedja celotnih genomov treh sevov L. fermentum (http://www.ncbi.nlb.nih.gOv/eenome/711. 10. oktobra 2013), to je CECT 5716, F-6 in IFO 3956. Lactobacillus fermentum CECT 5716 je sev, izoliran iz človeka, ki ima protimikrobne, protivnetne in imunomudolatome lastnosti (Jimenez, E. et al. 2010. Journal of Bacteriology. 192:4800-4800). F-6 je bil izoliran iz tradicionalnih mlečnih izdelkov, ki jih pripravljajo manjšine na Kitajskem, in ima nekaj dobrih probiotičnih lastnosti, kot so dobra odpornost proti nizkim vrednostim pH, žolčnim solem ter protibakterijsko delovanje. IFO 3956, izolat iz fermentiranega rastlinskega materiala, proizvaja kobalamin in reuterin (Morita, H. et al. 2008. DNA Research. 15:151-161).

Nekateri sevi L. fermentum se uvrščajo med probiotike in jih najdemo v probiotičnih izdelkih. Med komercialnimi probiotičnimi sevi najdemo L. fermentum PCC in ME-3. Bifidobacterium animalis so po Gramu-pozitivne anaerobne paličaste bakterije, ki se pogosto nahajajo v debelem črevesu večine sesalcev, vključno z ljudmi. Vrsta je po presoji znanstvenega sveta in enot Evropske agencije za varnost hrane (EFSA) vključena v seznam domnevno varnih (qualified presumption of safety, QPS) bioloških učinkovin, priporočljivih za uporabo v hrani in krmi, (2012. EFSA Journal. 10:3020).

Več sevov te vrste, ki vsebuje podvrsti B. animalis ssp. lactis in B. animalis ssp. animalis, se uporablja kot probiotike. Med primeri uporabe te vrste kot probiotikov so zmanjšanje vnetja prebavil in s tem povezanih bolezni, kot so IBD (US 2012/0308523, US 2008/0107635), zmanjšanje abdominalnega oboda (US 2010/0303763), preprečevanje ali zdravljenje okužb gornjega respiratornega trakta (WO2013104783), učinkovito lajšanje poškodb jeter z alkoholom (CN102845528), delovanje proti patogeni Enterobacter sakazakii (KR20120107780), imunska stimulacija in prilagoditev črevesne mikrobiote (CN101260377) ter sinteza vitaminov BI, B2 in B3 (MD20020020).

Do danes je bilo objavljeno celotno zaporedje genoma enega predstavnika Bif animalis ssp. animalis., to je seva ATCC 25527, izoliranega iz blata podgan (Loquasto, J. R. in sod. 2011. Journal of Dairy Science. 94:5864-5870), in enajstih predstavnikov B. animalis ssp. lactis, med katerimi je BB-12, ki je zelo razširjen probiotični sev (http://www.ncbi.nlb.nih.gov/genome/844.10. oktober 2013). 4

Sindrom razdražljivega črevesja (IBS) je funkcionalna motnja prebavil, za katero je značilna abdominalna bolečina ali neugodje, neredno odvajanje blata in zaprtje ali diareja. Bolnike lahko razdelimo v tri podtipe glede na odvajanje blata: prevladujoča driska (IBS-D), pretežno zaprtje (IBS-C) ali mešani podtip (IBS-M). Simptome spremlja tudi visceralna bolečina. Pogosto so bili prepoznani tudi nekateri drugi simptomi, ki niso vezani na prebavila, kot so utrujenost, pekoč občutek, napenjanje, anksioznost in depresija. Skupaj bistveno poslabšajo kakovost življenja bolnikov. Patofiziologija ali etiologija IBS ni znana, in ni na voljo dokazano učinkovite terapije. Med možnimi dejavniki, ki sodelujejo pri razvoju IBS, so tudi genetski dejavniki, spremenjena Gl gibljivost in visceralna preobčutljivost, psihološki stres in motnje oz. spremembe v sestavi mikrobiote prebavil, kronična vnetja in bakterijski gastroenteritis. Bolnike z IBS se pogosto zdravi z moksonidinom in njegovimi farmakološko sprejemljivimi kislinsko adicijskimi solmi, ki lahko zmanjšajo visceralno občutljivost na bolečino. Ta uporaba je opisana v patentu US6300336.

Spremenjena gastrointestinalna mikrobiota je redno opažena pri bolnikih z IBS (Kassinen, A. et al. 2007. Gastroenterology. 133:24-33 in Rajilic-Stojanovic, M. et al. 2011. Gastroenterology. 141:1792-1801). V študijah, ki temeljijo na uporabi kultivacijskih tehnik, so bile pri bolnikih z IBS koncentracije laktobacilov in bifidobakterij pogosto nižje, medtem ko so podatki o koliformnih bakterijah in enterobakterijah med študijami nasprotujoči. Mehanizmi še vedno niso pojasnjeni. Glede na to, da so interakcije med gostiteljem in mikrobioto dvosmerne, bi bilo lahko tudi mogoče, da so te spremembe prej sekundarne kot pa vzrok za bolezenski proces (Quigley, E.M.M. 2011. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Čare. 14:497-503). V zadnjem času opravljene študije z različnimi probiotiki kažejo pozitivne rezultate v smislu ublažitve simptomov, še posebej bolečin v trebuhu in napihnjenosti ter stabilizacije črevesne mikrobiote (Kajander, K. et al. 2008. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 27:48-57).

Vse več je dokazov kroničnega vnetja črevesne sluznice in imunske aktivacije pri bolnikih z IBS. V primerjavi z zdravim človekom so pri bolnikih z IBS potrdili zvišano raven vnetnih citokinov, kot so IL-Ιβ, TNF-α, IL-6 in IL-8, v plazmi/serumu. 5

Zato so lahko probiotične bakterije, ki imajo zmožnost protivnetnega delovanja, učinkovite pri IBS. Imunomodulatomi učinek je bil pripisan tudi nekaterim probiotikom. Preko interakcije s celicami imunskega sistema lahko vplivajo na nastajanje posameznih imunoglobulinov (IgA) in citokinov (IL-10, TNF-α, IL-6).

Ulcerozni kolitis (UC), pouchitis in Crohnova bolezen (CD) so primeri kroničnih vnetnih črevesnih bolezni (IBD), za katere je značilno kronično vnetje v črevesju. Trenutno ni na voljo zdravila za IBD. IBD se zdravi na način, da se zmanjša vnetje in obvladuje gastrointestinalne simptome z aminosalicilati, kortikosteroidi in imunosupresivnimi zdravili, antibiotiki ali biološkimi zdravili. Spremembe v sestavi mikrobiote blata in črevesne sluznice so odkrili v obeh primerih IBD, pri Crohnovi bolezni in ulceroznem kolitisu. Ker je pojavnost IBD povezana z moteno mikrobioto in vnetjem, predstavljajo določeni probiotični sevi, ki imajo imunomodulatome sposobnosti in zmožnost spreminjanja črevesne mikrobiote, alternativo za zdravljenje IBD.

Uporaba probiotikov za preprečevanje in zdravljenje IBS in IBD je predstavljena v različnih patentih. WO2011092261 na primer razkriva uporabo Lactobacillus plantarum CECT 7484, Lactobacillus plantarum CECT 7485 in Pediococcus acidilactici CECT 7483 za zdravljenje gastrointestinalnih bolezni ali stanj, kot so IBD, IBS ali abdominalna napihnjenost in napenjanje. WO2011051760 opisuje uporabo seva Bifidobacterium animalis subsp. lactis DN- 173010 za zdravljenje motenj, povezanih z želodčno-črevesnimi vnetji (CD, UC, IBS). V W00042168 predlagajo imunomodulatome Bifidobacterium longum infantis UCC35624 in Lactobacillus salivarius UCC 118, njihove mutante ali njihove variante za zdravljenje vnetnih bolezni, zlasti bolezni prebavil, kot so IBD in IBS.

Predpogoj za učinkovitost probiotikov pri preprečevanju in zdravljenju IBS in IBD je preživetje mikroorganizmov pri prehodu skozi zgornji del gastrointestinalnega trakta, za katerega je značilen nizek pH (želodec), prisotnost žolča in encimov trebušne slinavke (dvanajstnik), do črevesne sluznice in uspešna kolonizacija črevesne sluznice. Probiotične bakterije so pogosto izolirane iz vzorcev blata, kot je opisano v patentih WO2011/092261, W02008/l 17266, WO2012126481 in mnogih drugih. Bakterije, ki se nahajajo v blatu, zagotavljajo preživelost v pogojih, ki so značilne za zgornji prebavni 6 sistem, ni pa nujno, da bodo te bakterije tudi kolonizirale črevesno sluznico. Možno je domnevati, da bodo imele bakterije, ki izvirajo iz črevesne sluznice, boljše možnosti, da kolonizirajo črevesno sluznico, potem ko jih zaužijemo kot probiotike, saj so bolje prilagojene okolju črevesne sluznice. Uporaba bakterijskih izolatov iz človeških bioptičnih vzorcev še ni bila opisana v patentni literaturi. Bakterije, opisane v patentu W00042168, so prav tako izolirane iz človeškega prebavnega trakta, vendar v primerjavi z opisanim izumom, so le-te dobili iz kosov črevesnega tkiva, pridobljenih z resekcijo, kar zahteva drugačno metodo za izolacijo in selekcijo bakterijskih sevov.

PODROBEN OPIS IZUMA

Predloženi izum opisuje postopek selekcije novih bakterijskih sevov, ki domnevno pripadajo rodovom Lactobacillus in Bifidobacterium, z gojenjem in prečiščevanjem na agaiju UriSelect 4. Kromogeno gojišče UriSelect 4 je bilo razvito za izolacijo in štetje patogenih mikroorganizmov, ki so najpogostejši povzročitelji okužb sečil, in sicer Escherichia coli, Proteus in Enterococcus, na osnovi razlik v β-galaktozidazni, triptofan-deaminazni in β-glukozidazni aktivnosti bakterij. Do sedaj se gojišče UriSelect 4 ni uporabljalo za gojenje ali prečiščevanje bakterij rodu Lactobacillus in Bifidobacterium. Gojenje na UriSelect 4 omogoča razlikovanje sevov Lactobacillus in Bifidobacterium, ki jih ni mogoče razlikovati na običajnih gojiščih za te skupine bakterij, kot sta Rogosa in TOS, na osnovi barve in morfologije (Primer 1, Slika 1). Čiščenju domnevnih sevov Lactobacillus in Bifidobacterium na UriSelect 4 je sledilo testiranje občutljivosti teh sevov za antibiotike ter sposobnosti teh sevov, da preživijo v prebavnem traktu po peroralnem zaužitju in da naselijo črevesno sluznico ljudi, kar je posebna lastnost izbranih sevov, ki so bili izolirani iz nje.

Glavna prednost predloženega izuma je metoda za izbiro probiotičnih mikrobnih sevov, ki obsega naslednje korake: • pridobivanje človeške črevesne sluznice z biopsijo; • izolacijo morebitnih probiotičnih bakterijskih sevov; 7 • · • uporabo kromogenega gojišča UriSelect 4 za razlikovanje izolatov rodov Lactobacillus in Bifidobacterium; • selekcijo sevov, ki so vami za humano uporabo glede na občutljivost na protimikrobna zdravila, pomembna v medicini in veterini; • selekcijo sevov, ki so po zaužitju sposobni preživeti prehod skozi prebavila do črevesne sluznice in ki so prilagojeni na človeško črevesno sluznico in jo zaradi tega lahko naselijo. V skladu z izumom je prednostno črevesna sluznica človeškega izvora. Testni probiotični sevi so po metodi izuma lahko katerekoli probiotične bakterije, izbrane iz rodov Lactobacillus in Bifidobacterium. Ti probiotični sevi so prednostno pridobljeni iz bioptičnih vzorcev črevesne sluznice, še bolj prednostno iz humane. Nadaljnje podrobnosti postopka, vezane na izum, so navedene v nadaljevanju v "Primeru 1".

Kot je opisano v "Primera 4", je bila z E -testom (Bio - Merieux, Francija) ugotovljena občutljivost bakterijskih izolatov tega izuma za izbrane protimikrobne snovi, saj je občutljivost bakterijskih sevov za protimikrobne snovi, pomembne v medicini in veterini, pomembno merilo za izbor bakterij, namenjenih za uporabo pri ljudeh in živalih. Za oceno odpornosti proti antibiotikom, pomembnim v medicini in veterini (ampicilin, vankomicin, gentamicin, kanamicin, streptomicin, eritromicin, klindamicin, tetraciklin, kloramfenikol), so bila uporabljena merila EFSA (Evropska agencija za varnost hrane), posodobljena leta 2012 (2012. EFSA Journal. 10:2740).

Kot je opisano v "Primera 5" in prikazano na Slikah 8 in 9, je bila preskušena in vitro odpornost bakterijskih izolatov tega izuma v razmerah prebavil sesalcev (kislo okolje, žolčne soli in encimi trebušne slinovke). Preskusi so pokazali, da sevi predstavljenega izuma preživijo po 3 ure izpostavitve simuliranemu želodčnemu soku s pFl 2 ali več. Bakterije tega izuma preživijo 3 ure v suspenziji simuliranega črevesnega soka, ki ima pH 8 in vsebuje 0,15 % žolčnih soli, pri čemer so bile predhodno izpostavljene simuliranemu želodčnemu soku. Izraz "preživetje" pomeni, da vsaj 20 % bakterij, ki so bile prvotno resuspendirane v testnem gojišču, ugotovimo z metodo štetja mikroorganizmov na ploščah, ki je poznana strokovnjakom s tega področja, in so torej δ »» • · · · · · ··· * • ···· · · · · sposobne preživeti prehod skozi prebavni trakt (v nadaljevanju tudi "GIT"). To je v primeru peroralno zaužitih živih bakterij zaželeno, saj je predpogoj za kolonizacijo črevesja z bakterijami predstavljenega izuma, da preživijo prehod skozi požiralnik in želodec.

Sevi predstavljenega izuma so dobro prilagojeni na črevesno sluznico, glede na to da so bili izolirani iz tega mikrookolja. To jim omogoča, da se dlje obdržijo v črevesju in da stopajo v interakcije s črevesnim epitelijem in z gostiteljevimi imunskimi celicami. Tako lahko in situ neprekinjeno izkazujejo svoje probiotične učinke.

Razen tega, ta izum obravnava vsak bakterijski sev, izbran po metodi, ki je predmet izuma. Dva od teh novih bakterijskih sevov, ki kažejo številne lastnosti koristne za zdravje ljudi, zlasti v preprečevanju ali zdravljenju prebavnih in drugih bolezni, povezanih z imunskim sistemom, kot so vnetja, sta bila 24. oktobra 2013 deponirana v skladu z Budimpeškim sporazumom v zbirko mikroorganizmov Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrahe 7 B,38124 Braunschweig, Nemčija. Ta bakterijska seva in njune značilnosti so:

DSMZ 26139: Lactobacillus fermentum L930BB, pridobljen z biopsijo sluznice debelega črevesa zdravega moškega, starega 14 let, izbran po predlaganem postopku in označen s profilom RAPD, prikazanim na Slikah 2 in 3 ter naslednjim genomskim zaporedjem (SEK ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38, SEQ ID N° 39, SEQ ID N° 40, SEQ ID N° 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 48, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 52, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 65, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 70, SEQ ID N° 71, SEQ ID 9 Ν° 72, SEQ ID N° 73, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 75, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 77, SEQ ID N° 78) in lastnostmi, prikazanimi na Slikah 6 in 9 ter v Preglednicah 1 in 2. Poleg DSMZ 26139 so zaščiteni tudi njega analogi ali funkcionalno enakovredni sevi. DSMZ 26137 : Bifidobacterium animalis ssp. animalis IM386, pridobljen z biopsijo sluznice debelega črevesa zdravega moškega, starega 14 let, izbran po predlaganem postopku in označen s profilom RAPD, prikazanim na Slikah 4 in 5 ter naslednjim genomskim zaporedjem (SEQ ID N° 79, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81, SEQ ID N° 82, SEQ ID N° 83, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 85, SEQ ID N° 86) in lastnostmi, prikazanimi na Slikah 7 in 8 ter v Preglednicah 1 in 3.

Poleg DSMZ 26137 so zaščiteni tudi njega analogi ali funkcionalno enakovredni sevi. Razen tega smo s primerjavo genomskih zaporedij dveh bakterijskih sevov tega izuma z ostalimi bakterijskimi zaporedji za isto vrsto, shranjenimi v GenBank, ugotovili, daje z uporabo metod iz tega izuma mogoče izbrati nove specifične seve, kakor je opisano zgoraj.

Predloženi izum temelji na ugotavljanju zaporedja celotnega genoma Lactobacillus fermentum L930BB, ki je bil shranjen pri ENA (Evropski arhiv nukleotidov) dne 30. oktobra 2013 pod zaporednimi št. CBUR010000001 do CBUR010000072. Predloženi izum temelji na ugotavljanju zaporedja celotnega genoma Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386, kije bil shranjen pri ENA (Evropski arhiv nukleotidov) dne 24. oktobra 2013 pod zaporednimi št. CBUQ010000001 do CBUQ010000008.

Predmet predloženega izuma so nukleotidna zaporedja SEQ ID N°:7 to N°:78 genoma Lactobacillus fermentum L930BB in nukleotidna zaporedja SEQ ID N°:79 to SEQ ID N°:86 genoma Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386.

Nukleotidna zaporedja SEQ ID N°:7 do N°:78 in SEQ ID N°:79 do SEQ ID N°:86 so bila pridobljena s sekvenciranjem genomov Lactobacillus fermentum L930BB in Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 s sistemoma Illumina in PacBio. Sestavljanje de novo odčitkov Illumina je bilo opravljeno z uporabo Velvet (Zerbino & Bimey, Genome Research 2008 (18): 821-829). Prečiščevanje sestavljenih zaporedij in sestavljanje genoma je bilo opravljeno s podatki PacBio.

Pridobljeni podatki o zaporedjih omogočajo strokovnjakom dizajniranje in sintezo primernih začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje želenih odsekov z reakcijo 10 pomnoževanja s polimerazo. Zato prijavljeni izum obsega tudi nukleotidna zaporedja, izbrana iz zaporedij SEQ ID N°:7 do N°:78 in SEQ ID N°:79 do SEQ ID N°:86, ki jih je mogoče uporabiti kot začetne oligonukleotide za pomnoževanje mukleotidnih zaporedij.

Izum se nanaša na uporabo kateregakoli od teh dveh sevov ali obeh skupaj v proizvodnji probiotičnega ali farmacevtskega izdelka, predvsem pri preprečevanju in/ali zdravljenju funkcionalnih motenj prebavil in bolezni v območju spodnjega prebavnega trakta, kot so sindrom razdražljivega črevesja (IBS) in kronične vnetne črevesne bolezni (IBD) (Crohn-ova bolezen in ulcerozni kolitis). Farmacevtski izdelek se nanaša na spekter izdelkov od zdravil do medicinskih pripomočkov.

Razen tega ta izum obravnava kombinacijo obeh sevov iz izuma. V tem pogledu se izum nanaša na biološko čiste kulture vsakega od sevov ali mešanico obeh. Tako je omenjeni vidik tega izuma proizvodnja različnih sestav, ki vsebujejo vsaj enega od sevov izuma, pri čemer je vsak od sevov zastopan v deležu 0.1% do 99.9%, prednostno od 1 % do 99%, še bolj prednostno od 10% do 90%. V prednostni izvedbi pripravek vsebuje vsaj enega od bakterijskih sevov izuma skupaj z drugim sevom, pri čemer je vsak od sevov zastopan v sestavi deležu 0.1% do 99.9%, prednostno od 1% do 99%, še bolj prednostno od 10% do 90%.

Nadaljnji vidik predloženega izuma predstavljajo farmacevtske pripravke z najmanj enim sevom izuma, kulturo, sestavo ali izdelek v skladu z izumom in farmacevtsko sprejemljivimi ekscipienti. Te farmacevtske pripravke se lahko uporabi tudi kot nutracevtike, pri čemer so ekscipienti primerni za tak izdelek. Izraz nutracevtik se nanaša na izdelke, ki zajemajo od prehranskih dopolnil do funkcionalne hrane in živil za posebne zdravstvene namene.

Razen tega izum opisuje pripravek ali farmacevtski pripravek za uporabo kot probiotik. V prednostni izvedbi so sevi tega izuma vsebovani v pomožnem materijalu v količini od okrog 105 ke/g do okrog 1014 ke/g pomožnega materijala (ke pomeni kolonijske enote).

Nadaljnji vidik predloženega izuma predstavlja pripravek ali farmacevtski pripravek za uporabo kot zdravilo. Zahtevani odmerek bakterijskih sevov izuma v pripravku ali farmacevtskem pripravku, opisanem zgoraj, se spreminja glede na naravo motnje ali 11

predlagane uporabe sestave, ki se uporabi bodisi za preprečevanje bodisi za zdravljenje. S pripravo farmacevtskega pripravka v skladu z izumom se v primeren nosilec vključi najmanj enega od sevov, v količini od 105 ke/g do okrog 1014 ke/g pomožnega materij ala.

Vendar je aktivnost novih mikroorganizmov pri posamezniku seveda odvisna od odmerka. To pomeni, da višje kot je število novih mikroorganizmov, ki so vnešeni z zaužitjem ali vnosom zgoraj opisanega farmacevtskega pripravka ali živila, višja je zaščitna in/ali terapevtska aktivnost mikroorganizmov. Ker so mikroorganizmi tega izuma izolirani iz bioptičnih vzorcev zdrave črevesne sluznice otroka, in ker pripradajo vrsti, ki je vključena v seznam domnevno varnih bioloških sredstev (qualified presumption of safety, QPS) za hrano in krmo, se smatra, da niti v največjih količinah ne morejo biti škodljivi za gostitelja. Zato se sme v farmacevtski pripravek ali v živilski izdelek vključiti veliko količino bakterij.

Prednostno naj bi sevi izuma, pripravka z njimi ali farmacevtskega pripravka dosegli površine sluznic. Zato so namenjeni za peroralno uživanje.

Prednostno so sevi izuma, sestave z njimi ali farmacevtske sestave primerni za zdravljenje ali preprečevanje gastrointestinalnih motenj in bolezni v spodnjem predelu prebavil, kakor so vnetne bolezni prebavil. Razen tega se lahko uporabijo v povezavi z ostalimi postopki zdravljenja, tako da izboljšajo ali podpirajo njihovo učinkovitost.

Nadaljnja izvedba izuma je uporaba sevov izuma, pripravkov z njimi ali farmacevtskih pripravkov za preprečevanje in zdravljenje kroničnih vnetnih bolezni, kot so, ne pa zgolj teh, kronične vnetne črevesne bolezni (IBD), sindrom razdražljivega črevesa (IBS), zaradi sposobnosti probiotičnih sevov, da zmanjšajo proizvodnjo vnetnih citokinov v aktiviranih makrofagih (celični model THP-1).

Pomemben vidik tega izuma je zato metoda za preprečevanje ali zdravljenje bolezni, razmer ali motenj pri sesalcih, vključno z izpostavljanjem sesalca, delov sesalca, ali tkiva sesalca sevu Lactobacillus fermentum L930BB, DSMZ depozit št. 26139 ali njegovi varianti, analogu ali funkcionalnemu ekvivalentu. Nadalje, isto velja tudi za Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 strain, DSMZ depozit št. 26137 ali njegove variante, analoge ali funkcionalne ekvivalente. 12

Nadaljnje podrobnosti protivnetne aktivnosti bakterijskih sevov tega izuma, ugotovljene in vitro na celičnem modelu THP-1, so opisane spodaj v “Primeru 6”.

Razen že zgoraj opisanih lastnosti smo preskušali tudi fermentacij ske sposobnosti sevov tega izuma, ker te lahko izboljšajo njihovo naselitev v črevesni sluznici. Metabolizem ogljikovih hidratov je podrobno opisan v “Primeru 3”.

Nadaljnja izvedba izuma je užiten izdelek, sestavljen iz učinkovite količine sevov, ki pripadajo Lactobacillus fermentum L930BB, njegovim analogom ali funkcionalnim ekvivalentom in/ali Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386, njegovim analogom ali funkcionalnim ekvivalentom ali njihovim pripravkom ali farmacevtskim pripravkom, skupaj s primernimi količinami užitnih sestavin.

Nadaljnji vidik izuma je, daje užitni izdelek nutracevtik.

Primeri, ki sledijo, ilustrirajo izum. PRIMER 1 - Osamitev laktobacilov in bifidobakterij iz črevesne sluznice

Prvotna osamitev je bila izvedena iz zamrznjenega (pri -80 °C) bioptičnega vzorca črevesne sluznice debelega črevesa 14-letnega moškega osebka, pridobljenega z endoskopijo. Za namene osamitve bakterij je bilo tkivo homogenizirano v 1200 pL anaerobnega razredčila z naslednjo sestavo: 1 g peptona/L; 2 g prašičje želatine/L; 8,5 g NaCl/L in 0,557 g cistein hidroklorid monohidrata/L. Suspenzija (100 pL) je bila nacepljena na agar Rogosa (Merck) z 0,05 % cisteina (Merck) in na agar TOS (Yakult) z mupirocinom (50 mg/L) (Applichem). Plošče so bile inkubirane anaerobno, z uporabo anaerobnih posod in sistema GENbox (Bio-Merieux, Francija) za 72 ur pri 37 °C. Domnevni izolati Lactobacillus so bili nagojeni iz naključno izbranih kolonij z gojišču Rogosa, na agaiju MRS z 0,05 % cistein hidroklorida. Domnevni izolati Bifidobacterium so bili nagojeni iz naključno izbranih kolonij, zraslih na gojišču TOS. Posamezne kolonije so bile nadalje prečiščene z večkratnim zaporednim kultiviranjem na UriSelect 4 kromogeno gojišče (Bio-Rad, Francija). V tem izumu je bil agar UriSelect 4 uporabljen za medsebojno razlikovanje izolatov laktobacilov ali bifidobakterij na podlagi barve kolonij, zraslih na tem gojišču. Barva kolonij je odvisna 13 od posedovanja različnih encimov, ki razgrajujejo kromogene substrate v gojišču. Po Gramu pozitivni izolati z morfološkimi značilnostmi, tipičnimi za laktobacile ali bifidobakterije, so bili shranjeni v bujonu MRS z dodatkom 0,05 % cistein-hidroklorida in 30 % glicerola pri -80 °C za nadaljnjo karakterizacijo.

Slika 1: Primer uporabe kromogenega gojišča UriSelect 4 za razlikovanje med sevi.

Slika prikazuje primer uporabe kromogenega gojišča UriSelect 4 za razlikovanje kolonij, izoliranih iz človeške črevesne sluznice, med prečiščevanjem sevov. A: Sev Lactobacillus fermentum (L930BB) je viden kot kolonije v obliki večjih krogov in sev Lactobacillus rhamnosus kot kolonije v obliki manjših krogov. B: Sev Lactobacillus fermentum (L930BB) je viden kot kolonije v obliki večjih krogov in Bifidobacterium animalis (IM386) kot kolonije v obliki manjših krogov. PRIMER 2 - Genski prstni odtis (RAPD - PCR) in identifikacija vrst (16S rDNA sekvenciranje)

RAPD-PCR

Za medsebojno razlikovanje posameznih izolatov je bila uporabljena analiza z naključnim pomnoževanjem polimorfne DNA, RAPD - PCR (randomly amplified polymorphic DNA). Genomska DNA je bila pripravljena s toplotno obdelavo kolonij čiste kulture pri 99 °C za 15 minut v 10 pL pufra Go - Taq Flexi (Promega, Madison, WI, ZDA). Za RAPD - PCR so bili uporabljeni začetni oligonukleotidi 1254 (SEQ ID N°: 1) in KGT80 (SEQ ID N°: 2). PCR pomnoževanje z začetnim oligonukleotidom KGT80 je bilo izvedeno pod naslednjimi pogoji: 1 cikel pri 95 °C / 3 min, 35 ciklov pri 95 °C / 3 min, 37 °C / 2 min, 72 °C / 2 min; 1 cikel pri 72 °C / 5 min. Pomnoževanja z začetnim oligonukleotidom 1254 je bilo izvedeno, kot je opisano v literaturi (Hilton A. C. et al. 1996. Journal of Applied Bacteriology. 81: 575-584). Pomnožki PCR so bili analizirani z elektroforezo v 2 % agaroznem gelu v 5 X pufru TAE, ki je potekala 3,5 h na 70 V. DNA molekulska velikostna označevala (500 bp in 1000 bp molekulske lestvice Fermentas) smo uporabili kot velikostni standard. Po elektroforezi so bili agarozni geli obarvani s SYBR-safe ter pregledani pod UV transilluminatorjem (Syngene, Cambridge, Velika Britanija).

Slika 2: RAPD - PCR vzorci bakterijskih izolatov Lactobacillus iz bioptičnih vzorcev črevesne sluznice, pridobljeni z začetnim oligonukleotidom 1254.

Ta slika predstavlja primer analize RAPD - PCR bakterijskih izolatov iz črevesne sluznice z začetnim oligonukleotidom 1254, pri čemer so bili produkti pomnoževanja ločeni z elektroforezo v agaroznem gelu. Proga L vsebuje DNA velikostni označevalec, ostale proge pa vsebujejo DNA pomnožke različnih bakterijskih izolatov. Proga 61 odgovarja sevu L930BB tega izuma. Vzorec RAPD proge 61 je opaziti tudi v nekaterih drugih progah, kar kaže, da ti izolati pripadajo istemu sevu.

Slika 3: RAPD - PCR vzorci bakterijskih izolatov Lactobacillus iz bioptičnih vzorcev črevesne sluznice, pridobljeni z začetnim oligonukleotidom KGT-80.

Ta slika predstavlja primer analize RAPD - PCR bakterijskih izolatov iz črevesne sluznice z začetnim oligonukleotidom KGT-80, pri čemer so bili produkti pomnoževanja ločeni z elektroforezo v agaroznem gelu. Proga L vsebuje DNA velikostni označevalec, ostale proge pa vsebujejo DNA pomnožke različnih bakterijskih izolatov. Proga 61 odgovarja sevu L930BB tega izuma. Vzorec RAPD proge 61 je opaziti tudi v nekaterih drugih progah, kar kaže, da ti izolati pripadajo istemu sevu.

Slika 4: RAPD - PCR vzorci bakterijskih izolatov Bifidobacterium iz bioptičnih vzorcev črevesne sluznice, pridobljeni z začetnim oligonukleotidom 1254.

Ta slika predstavlja primer analize RAPD - PCR bakterijskih izolatov iz črevesne sluznice z začetnim oligonukleotidom 1254, pri čemer so bili produkti pomnoževanja ločeni z elektroforezo v agaroznem gelu. Proga L vsebuje DNA velikostni označevalec, ostale proge pa vsebujejo DNA pomnožke različnih bakterijskih izolatov. Proga 85 odgovarja sevu IM386 tega izuma.

Slika 5: RAPD - PCR vzorci bakterijskih izolatov Bifidobacterium iz bioptičnih vzorcev črevesne sluznice, pridobljeni z začetnim oligonukleotidom KGT-80. 15 • ·

Ta slika predstavlja primer analize RAPD - PCR bakterijskih izolatov iz črevesne sluznice z začetnim oligonukleotidom KGT-80, pri čemer so bili produkti pomnoževanja ločeni z elektroforezo v agaroznem gelu. Proga L vsebuje DNA velikostni označevalec, ostale proge pa vsebujejo DNA pomnožke različnih bakterijskih izolatov. Proga 85 odgovarja sevu IM386 tega izuma.

Identifikacija vrste (16S rDNA sekvenciranje)

Izolati, domnevni predstavniki Lactobacillus in Bifidobacterium, so bili identificirani do vrste z delnim sekvenciranjem gena za 16S rRNA. Skupna genomske DNA je bila ekstrahirana iz 1 mL vzorcev prekonočne kulture, zrasle v bujonu MRS z 0,05 % cistein hidroklorida, pri 37 °C v anaerobnih pogojih, s pomočjo Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA), v skladu z navodili proizvajalca. Pred ekstrakcijo DNA smo celice obdelali z lizocimom (5 mg/mL) in mutanolizinom (25U/mL) v pufru TE. 16S rDNA je bila pomnožena z uporabo začetnih oligonukleotidov 27F (SEQ ID N°: 3) in 1495r (SEQ ID N°: 4) v 100 mL reakcijske zmesi, kot je bilo opisano (Yu, J. et al. 2011. Journal of Dairy Science. 94:3229-3241). Pomnožena DNA je bila očiščena z Wizard SV Gel in PCR Clean - Up sistem v skladu z navodili proizvajalca (Promega Madison, WI, ZDA). Pomnožki PCR so bili preverjeni z elektroforezo na 1 % agaroznem gelu, ki ji je sledilo barvanje s SYBR -Safe in pregledovanje pod UV transilluminatoijem (Syngene, Cambridge, Združeno kraljestvo). Sekvenciranje DNA je bilo opravljeno v Microsynth (Balgach, Švica). Za primerjavo nukleotidnih zaporedij z zaporedji v Genbank sekvenc, je bilo uporabljeno orodje NCBI BLAST 2.2.28 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/: Zhang, Z. et al. 2000. Journal of Computational Biology. 7:203-14).

Rezultat sekvenciranja pomnožkov PCR, pridobljenih s PCR pomnoževanjem gena za 16S rRNA seva L930BB z začetnima oligonukleotidoma 27F in 1495r ( SEQ ID N°: 5):

GGT GCTTGC ACCTG ATT GATTTT GGT CGCC AACG AGT GGCGG AC GGGT GAG T A AC ACGT AGGT A AC CTGCCC AGAAGC GGGGG AC A AC ATTT GG A AAC AG AT GCTAATACCGCATAACANCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGC TTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGG 16 • ·

TAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGC

CACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG

AATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAG

AAGGGTTTCGGCTC GT A A AGCT CT GTT GTT A AAG A AG AAC ACGT AT G AG AG

TAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGT

GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGG

GCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGC

TTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGT

AGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACC

AGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCA

TGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGA

GTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAA

GCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGAC

GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAA

GAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTC

CTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGT

GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCA

GC ATT AAGTT GGGC ACT CT AGT G AG ACT GCCGGT G AC AA ACCGGAGG AAGG

TGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTG

CTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTC

TTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTC

GGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGG

CCTTGT AC AC ACCGCCCGT C AC ACC AT G AG AGTTT GT AAC ACCC AAAGTCG

GTGGG

Molekulama identifikacija bakterijskega izolata L930BB na podlagi 16S rRNA genskega zaporedja je pokazala naj večjo homologijo (99 % ujemanje, 0 % vrzeli) s sevi, ki pripadajo vrsti Lactobacillus fermentum, vključno s tipskim sevom ATCC 14931.

Rezultat sekvenciranja pomnožkov PCR, pridobljenih s PCR pomnoževanjem gena za 16S rRNA seva IM386 z začetnima oligonukleotidoma 27F in 1495r (SEQ ID N°: 6): 17

CAGTCGAACGGGATCCCTGGCGGCCTGGCTGCCGGGGTGAGAGTGGCGAAC

GGGT G AGT AATGCGT GACC AACCT GCCCTGT GC ACCGGAAT AGCT CCT GGA

AACGGGTGGT A ATACCGGAT GCTCCGCCCC ACCGC ATGGT GGGGT GGGAAA

TGCTTTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGT

GATGGCCCACCAAGGCGTTGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCC

ACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA

ATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGG

AGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTTCAAGGGCAAGGCACGGCTTCGG

GCCGTGTTGAGTGGATTGTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCA

GCCGCGGT AAT ACGT AGGGTGCG AGCGTT ATCCGG ATTT ATTGGGCGT AAA

GGGCTCGT AGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGT GAAAGTCC ATCGCCT AACGG

TGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGA

ATTCCCGGT GT AACGGT GGAAT GTGT AGAT ATCGGGAAG AAC ACC AAT GGC

GAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGA

GCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTG

GATGTGGGGCCCTTTCCACGGGTCCTGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATC

CCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGG

GCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAAC

CTTACCTGGGCTTGACATGTGCCGGATCGCCCCGGAAACGGGGTTTCCCTTC

GGGGC CGGTT C AC AGGT GGT GC AT GGT C GTCGT C AGCTCGT GTCGT GAGAT

GTT GGGTT A AGT CCCGC AACG AGCGC AACCCT CGCCGC AT GTT GCC AGCGG

GTTATGCCGGGAACTCATGTGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTG

GGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTA

CAATGGCCGGTACAACGCGATGCGACACGGTGACGTGGGGCGGATCGCTGA

AAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGG

AGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGC

CTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGG

TGGCCCGACCCTCGT

Molekulama identifikacija bakterijskega izolata IM386 na podlagi 16S rRNA genskega zaporedja je pokazala največjo homologijo (100 % ujemanje, 0 % vrzeli) s sevi, ki pripadajo podvrsti Bifidobacterium animalis subsp. animalis, vključno s tipskim sevom ATCC 25527.

Sekvenciranje genomov izolatov L930BB in IM386

Za ugotavljanje genomskega nukleotidnega zaporedja izolatov L930BB in IM386 je bila genomska DNA ekstrahirana iz 1 mL vzorcev prekonočne kulture, zrasle v bujonu MRS z 0,05 % cistein hidroklorida pri 37 °C v anaerobnih pogojih, s pomočjo DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Pred ekstrakcijo DNA smo celice obdelali z lizocimom (5 mg/mL) in mutanolizinom (25U/mL) v pufru TE. Nukleotidno zaporedje genomske DNA je bilo pridobljeno z Illumina MySeq, na način »paired end« (analize opravili Fundacion Parque Cientifico de Madrid, Madrid, Španija), ter s PacBio RS (analize opravili Expression Analyses - A Quintiles Company, Durham, NC 2771, ZDA). Zaporedja so bila sestavljena s pomočjo Velvet (Zerbino, D.R. et al. 2008. Genome Research. 18:821-829; performed by Era7, Granada, Spain). Kontigi (72) seva L930BB se nahajajo v priloženem seznamu nukleotidnih zaporedij, ki je bil oddan skupaj s patentno prijavo pod zaporednimi številkami SEQ ID N° 7 - SEQ ID N° 78. Kontigi (8) seva IM386 se nahajajo v priloženem seznamu nukleotidnih zaporedij, ki je bil oddan skupaj s patentno prijavo pod zaporednimi številkami SEQ ID N° 79 - SEQ ID N° 86. PRIMER 3 - Morfologija in fermentacijska sposobnost

Morfologija kolonij in celic

Morfološke značilnosti kolonij in bakterijskih celic Lactobacillus fermentum L930BB so bile opisane po rasti čiste kulture za 48 ur na agarju MRS z 0,05 % cistein hidroklorida pri 37 °C v anaerobnih pogojih. Kolonije so bele, nesvetleče, z zamegljenimi robovi. Barvanje po Gramu je pokazalo, da so po Gramu pozitivne, dolge paličaste bakterije (Slika 6). 19

Morfološke značilnosti kolonij in bakterijskih celic Bifidobacterium animalis IM386 so bile opisane po rasti čiste kulture za 48 ur na agarju MRS z 0,05 % cistein hidroklorida pri 37 °C v anaerobnih pogojih. Kolonije so bele, svetleče, z ostrimi robovi. Barvanje po Gramu je pokazalo, da so po Gramu pozitivne paličaste bakterije, pogosto organizirane v parih ali v obliki črke V (Slika 7).

Slika 6: Mikroskopska slika Lactobacillus fermentum L930BB po barvanju po Gramu (1000x povečava). Ta slika prikazuje mikromorfološke značilnosti bakterijskih celic Lactobacillus fermentum L930BB tega izuma, vidne ob mikroskopskem pregledu po Gramu obarvanih čistih kultur. Bakterije tega seva so po Gramu pozitivne paličaste bakterije, ki se pojavljajo kot posamezne celice ali organizirane v kratkih verižicah.

Slika 7: Mikroskopska slika Bifidobacterium animalis IM386 po barvanju po Gramu (1000x povečava). Ta slika predstavlja mikromorfološke lastnosti bakterijskih celic Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 tega izuma, vidne ob mikroskopskem pregledu po Gramu obarvanih čistih kultur. Bakterije tega seva so po Gramu pozitivne paličice, ki so najbolj pogosto organizirane v parih oblike črke V.

Metabolizem ogljikovih hidratov (API)

Analiza metabolizma ogljikovih hidratov je bila opravljena s pomočjo standardiziranega sistema API 50 CH (Biomerieux, Francija), ki ga sestavlja 50 celic, ki vsebujejo različne substrate iz družine ogljikovih hidratov in njihove derivate (heterozidi, polialkoholi, uranske kisline). Substrate, ki so v liofilizirani obliki, se rehidrira z gojiščem API 50 CHL ter inokulira s testnimi bakterijskimi sevi. Med inkubacijo zaznamo spremembo barve indikatorskega barvila v celici, ki je posledica anaerobne proizvodnje kisline in znižanja vrednosti pH. Prva celica, ki ne vsebuje substrata, služi kot negativna kontrola.

Sevi so zrasli v gojišču, prilagojenem za njihovo rast (laktobacili-MRS, bifidobakterije-MRS z 0,05 % cisteina w / v). Kolonije so bile prenešene s pomočjo vatirane paličice v gojišče API 50 CHL. Rezultate smo odčitali po določenem inkubacijskem času (24h, 48h), odvisno od vrste reakcije. Rezultati so predstavljeni v Preglednici 1. • · • · · ·

Lactobacillus fermentum L930BB je sposoben fermentirati naslednje substrate: L-arabinoza, D-riboza, D-galaktoza, D-fruktoza, D-manitol, N-acetilglucozamin, eskulin, salicin, D-maltoza, D-laktoza, D-melibioza, D-saharoza, D-trehaloza in D-rafinoza.

Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 je sposoben fermentirati naslednje substrate: D-riboza, D-galaktoza, D-glukoza, D-fruktoza, D-manoza, D-manitol, N-acetilglucozamin, amigdalin, arbutin, eskulin, salicin, D-celiobioza, D-maltoza, D-laktoza, D-trehaloza, D-melezitoza, gentiobioza in D-tagatoza.

Sposobnost bakterijskih sevov iz predloženega izuma, da fermentirajo različne ogljikove hidrate, omogoča, da jih lahko probiotična seva v črevesju uporabita kot vir ogljika in je posledično učinkovitost njune kolonizacije boljša.

Preglednica 1: Fermentacijska vzorca sevov iz izuma. Substrati, ki sta jih testna seva fermentirala, so označeni s +; - negativni, ? dvomljiv rezultat.

Celica Test Substrat Količina (mg/celico) Lactobacillus fermentum L930BB Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 0 CONTROL - - - 1 GLY glicerol 1,64 - - 2 ERY eritritol 1,44 - - 3 DARA D-arabinoza 1,4 - - 4 LARA L- arabinoza 1,4 + - 5 RIB D-riboza 1,4 + + 6 DXYL D-ksiloza 1,4 - - 7 LXYL L-ksiloza 1,4 - - 8 ADO D-adonitol 1,36 - - 9 MDX metil-PD- ksilopiranozid 1,28 - - 10 GAL D-galaktoza 1,4 + + 11 GLU D-glukoza 1,56 + + 21 • · FRU D-fruktoza 1,4 + + MNE D-manoza 1,4 ? + SBE L-sorboza 1,4 - - RHA L-ramnoza 1,36 - - DUL dulcitol 1,36 - - INO inozitol 1,4 - - MAN D-manitol 1,36 + + SOR D-sorbitol 1,36 ? - MDM methil-aD- 1,28 - - manopiranozid MDG methyl-aD- 1,28 - - glukopiranozid NAG N-acetilglukozamin 1,28 + + ΑΜΥ amigdalin 1,08 - + ARB arbutin 1,08 ? + ESC eskulin železov citrat 1,16 + + SAL salicin 1,04 + + CEL D-celiobioza 1,32 - + MAL D-maltoza 1,4 + + LAC D-laktoza (goveji 1,4 + + izvor) MEL D-melibioza 1,32 + - SAC D-saharoza 1,32 + - TRE D-trehaloza 1,32 + + INU inulin 1,28 - - MLZ D-melezitoza 1,32 - + RAF D-rafinoza 1,56 + - AMD Amidon (škrob) 1,28 - - GLYG glikogen 1,28 - - XLT ksilitol 1,4 - - GEN gentiobioza 0,5 - + TUR D-turanoza 1,32 - - 41 LYX D-liksoza 1,4 - - 42 TAG D-tagatoza 1,4 - + 43 DFUC D-fukoza 1,28 - - 44 LFUC L-fukoza 1,28 - - 45 DARL D-arabitol 1,4 - - 46 LARL L-arabitol 1,4 - - 47 GNT Na glukonat 1,84 ? ? 48 2KG Na 2-Ketoglukonat 2,12 - - 49 5 KG Na 5-Keto glukonat 1,8 + - PRIMER 4 - Občutljivost za protimikrobne substance, pomembne v medicini in veterini E-test (Bio-Merieux, Francija) za ugotavljanje občutljivosti za antibiotike je bil izveden, kakor so opisali M. Danielsen in A. Wind (2003. International Journal of Food Microbiology. 82:1-11), z naslednjimi gojišči: a) 90 % agar Iso - sensitest, 10 % MRS, 0,05 % cistein hidroklorid, pH = 6,7 ali b) 90 % agar Mueller Hinton, 10 % MRS, 0,05 % cistein hidroklorid, pH = 6,7 (Klare, I. et al. 2005.Applied and Environmental Microbiology.71:8982-8986). Po 48-umi inkubaciji v anaerobni atmosferi (Anaerobox, Bio-Merieux, Francija), so bile vrednosti MIC (minimalna inhibitoma koncentracija) odčitane, kakor priporoča proizvajalec. Upoštevani so bili kriteriji EFSA za oceno odpornosti na antibiotike, pomembne v medicini in veterini, posodobljeni leta 2012 (2012. EFSA Journal. 10:2740).

Preglednica 2: Občutljivost Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 iz tega izuma za 9 protimikrobnih snovi (mg/L)

Protimikrobna snov EFSA mejna MIC (MH) MIC (ISO) vrednost za

MIC (koncentracijski obseg) • · m m 23 ·· · · ·· ·· ampicilin (AM) (0,016-256) 0,016 0,016 2 vankomicin (VA) (0,016-256) 0,38 0,19 2 gentamicin (GM) (0,064-1024) 64 32 64 kanamicin (KM) (0,016-256) >256 >256 n.r. streptomicin (SM) (0,064-1024) 48 12 128 eritromicin (EM) (0,016-256) 0,125 0,094 1 klindamicin (CM) (0,016-256) 1 0,50 1 tetraciklin (TC) (0,016-256) 0,50 0,25 8 kloramfenikol (CL) (0,016-256) 0,75 0,50 4 MIC - minimalna inhibitoma koncentracija, MH - 90% agar Mueller Hinton + 10% agar MRS + 0,05 % cistein hidroklorid; ISO - 90 % Iso-sensitest + 10 % agar MRS + 0,05 % cistein hidroklorid, n.r.-test ni zahtevan od EFSA; seve z MIC večjo od mejne vrednosti (2012. EFSA Journal. 10:2740) smatrajo za rezistentne. Preglednica 3: Občutljivost Lactobacillus fermentum L930BB iz tega izuma za 9 protimikrobnih snovi (mg/L) Protimikrobna snov EFSA mejna MIC (MH) MIC (ISO) vrednost za (koncentracijski obseg) MIC ampicilin (AM) (0,016-256) 0,094 0,125 2 vankomicin (VA) (0,016-256) >256 >256 n.r. gentamicin (GM) (0,064-1024) 4 1 16 kanamicin (KM) (0,016-256) 32 32 32 streptomicin (SM) (0,064-1024) 12 12 64 ··· · · · · · • ···· · · · · · • · · · · · * ·· ·· ···· · eritromicin (EM) (0,016-256) 0,50 0,50 1 klindamicin (CM) (0,016-256) 0,016 0,016 1 tetraciklin (TC) (0,016-256) 1 1,5 8 kloramfenikol (CL) (0,016-256) 1,5 1 4 MIC - minimalna inhibitoma koncentracija, MH - 90 % agar Mueller Hinton + 10 % agar MRS + 0,05 % cistein hidroklorid; ISO - 90 % Iso-sensitest + 10 % agar MRS + 0,05 % cistein hidroklorid, n.r.-test ni zahtevan od EFSA; seve z MIC večjo od mejne vrednosti (2012. EFSA Journal. 10:2740) smatrajo za rezistentne.

Za seva Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 in Lactobacillus fermentum L930BB iz tega izuma je bilo ugotovljeno, da sta občutljiva za devet protimikrobnih snovi, pomembne v medicini in veterini, za katere EFSA zahteva, da so vključene v oceno varnosti bakterijskih sevov, namenjenih za uporabo pri ljudeh in živalih. PRIMER 5 - Preživetje v razmerah gastrointestinalnega trakta (GIT)

Izolate Lactobacillus in Bifidobacterium smo inkubirali v bujonu MRS z 0,05 % cisteina (w / v) 18 h pri 37 °C v anaerobnih pogojih. Po izpiranju v sterilni fiziološki raztopini (NaCl , 0,9 %) in centrifugiranju smo bakterijskim celicam dodali 50 mL simuliranega želodčnega soka, z naslednjo sestavo: NaCl, 125 mmol/L; KC1 7 mmol/L; NaHC03, 45 mmol/L in pepsina, 3 g/L. Končni pH je bil uravnan s HC1 na pH 2 in 3, ali z NaOH na pH 7. Bakterijsko suspenzijo smo inkubirali s stresanjem (200 vrtljajev/min), ki je simuliralo peristaltiko, pri 37 °C. Alikvote za ugotavljanje števila kolonijskih enot smo odvzemali po 0, 90 in 180 min. Simulirani črevesni sok je bil pripravljen iz 0,1 % (w/v) pankreatina in 0,15 % (w/v) žolčnih soli Oxgall v destilirani vodi, pH pa je bil uravnan na 8 z NaOH. Suspenzijo bakterij smo inkubirali nadaljnjih 180 min in po 0, 90 in 180 min zbrali vzorce za štetje kolonijskih enot (Femandez, MF 2003. Journal of Applied Microbiology. 94:449-455). 25 25 • · ·

Rezultati preživetja Lactobacillus fermentum L930BB, Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 in referenčnega probiotičnega seva Lactobacillus rhamnosus GG v razmerah prebavil so predstavljeni na Slikah 8 do 10.

Preživetje sevov Lactobacillus fermentum L930BB in Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 v simuliranem želodčnem soku je 82-91 % in 74-83 %, v odvisnosti od pH želodčnega soka. Zlasti v zelo kislih pogojih (pH = 2), je bilo preživetje obeh sevov iz tega izuma boljše kot preživetje referenčnega probiotičnega seva Lactobacillus rhamnosus GG (<1%).

Preživetje sevov Lactobacillus fermentum L930BB in Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 v simuliranem črevesnem soku je bilo 21-81 % in 26-100 %, v odvisnosti od pH želodčnega soka, ki so mu bile celice izpostavljene pred tretiranjem v črevesnem soku. Še posebej za bakterije, ki so bile izpostavljene črevesnemu soku po tretiranju z želodčnim sokom (pH = 3), je bilo preživetje obeh sevov iz tega izuma bolje kot preživetje referenčnega probiotičnega seva Lactobacillus rhamnosus GG (1,4 %).

Slika 8: Preživetje Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 v simuliranih razmerah prebavil.

Ta slika prikazuje preživetje seva IM386 tega izuma v simuliranem želodčnem soku (pH = 2, pH = 3, pH = 7) in simuliranem črevesnem soku (pH = 8). Potem ko so bile izpostavljene simuliranemu želodčnemu soku za 180 min, so bile bakterijske celice prenesene v simulirani črevesni sok in inkubirane naslednjih 180 minut. Rezultati so predstavljeni kot povprečje treh neodvisnih eksperimentov.

Slika 9: Preživetje Lactobacillus fermentum L930BB v simuliranih razmerah prebavil.

Ta slika prikazuje preživetje seva L930BB tega izuma v simuliranem želodčnem soku (pH = 2, pH = 3, pH = 7) in simuliranem črevesnem soku (pH = 8). Potem ko so bile izpostavljene simuliranemu želodčnemu soku za 180 min, so bile bakterijske celice prenesene v simulirani črevesni sok in inkubirane naslednjih 180 minut. Rezultati so predstavljeni kot povprečje treh neodvisnih eksperimentov.

Slika 10 : Preživetje Lactobacillus rhamnosus GG v simuliranih razmerah prebavil. 26 26

« · 9 m

Ta slika prikazuje preživetje referenčnega probiotičnega seva GG v simuliranem želodčnem soku (pH = 2, pH = 3, pH = 7) in simuliranem črevesnem soku (pH = 8). Potem ko so bile izpostavljene simuliranemu želodčnemu soku za 180 min, so bile bakterijske celice prenesene v simulirani črevesni sok in inkubirane naslednjih 180 minut. Rezultati so predstavljeni kot povprečje treh neodvisnih eksperimentov. PRIMER 6 - Protivnetna aktivnost

Da bi raziskali protivnetni potencial sevov Lactobacillus in Bifidobacterium, smo merili proizvodnjo TNF-α, IL-8, IL-10 in IL-6 v celicah THP-1 (ATCC TIB - 202, humana monocitna celična linija) po stimulaciji z LPS (lipopolisaharidi E. coli Olll : B4), z bakterijami ali s kombinacijo LPS in bakterij. Čisti sevi Lactobacillus in Bifidobacterium so bili kultivirani v MRS z 0,05 % L -cistein hidroklorida v anaerobnih pogojih 18 ur. Vse bakterije so bile izločene s centrifugiranjem in sprane s fosfatnim pufrom (PBS). Število kolonijskih enot (k.e.) je bilo ugotovljeno s štetjem na ploščah, na gojišču MRS z 0,05 % L - cistein hidroklorida.

Celice THP-1 so bile nagojene v gojišču RPMI, dopolnjenem z FBS, glukozo, L-glutaminom in antibiotiki in resuspendirane v koncentraciji 106 celic/mL v istem gojišču, na ploščicah za celične kulture s 24 vdolbinami. Pred poskusom smo celice stimulirali s PMA (forbolni ester) za 48 ur, daje induciral diferenciacijo v makrofage. Celice so bile zatem inkubirane bodisi z izbranim bakterijskim sevom {Lactobacillus fermentum L930BB, Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386), LPS ali kombinacijo LPS in bakterij resuspenzije v popolnem gojišču RPMI, brez antibiotikov. Plošče smo inkubirali pri 37 °C v 5 % CO2 atmosferi. Vse teste smo izvedli v treh ponovitvah. Z vzorci supematantov celične linije, zbranih po 4, 6 in 8 ur inkubacije, so bile opravljene analize vsebnosti citokinov IL-10, IL-6, IL-8 in TNF-α z uporabo standardnega testsa ELISA (Enzyme - Linked Immunoabsorbent test, eBioscience, ZDA), po navodila proizvajalca. Tehnika je dobro znana strokovnjakom s področja. Dobljeni rezultati (Preglednica 4) kažejo, da bi uživanje probiotičnih sevov iz tega izuma lahko imelo ugoden učinek na nekatere vnetne bolezni gostitelja. Lactobacillus fermentum L930BB je induciral proizvodnjo IL-10 v celicah THP-1. LPS sami niso inducirali proizvodnje IL-10.

Lactobacillus fermentum L930BB je zmanjšal proizvodnjo pro-vnetnega IL-6, inducirano z LPS. Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 je zmanjšal proizvodnjo pro-vnetnih IL-6, IL-8 in TNF-α, inducirano z LPS. Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 in Lactobacillus fermentum L930BB dodana skupaj, sta zmanjšala proizvodnjo pro-vnetnega IL-6, induciranega z LPS. Bifidobacterium animalis IM386 in Lactobacillus fermentum L930BB dodana skupaj sta zmanjšala proizvodnjo pro-vnetnega IL-6, induciranega z LPS.

Preglednica 4: Vpliv Lactobacillus fermentum L930BB in Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 na proizvodnjo citokinov interlevkin 6, interlevkin 8, TNF-α in interlevkin 10 v LPS - induciranih THP-1 celicah med sočasno inkubacijo.

Interlevkin 6 (IL-6) 1 Interlevkin 8 (IL-8)1 TNF-α 1 Interlevkin 10 (IL-10)2 IM 386 Jr 8 ur 99 % ± 1 % i 8 ur 37 % ± 8 % i 8 ur 91 %± 1 % Ni povečanja L 930 BB i 6 ur 74 %± 1 % Ni zmanjšanja Ni zmanjšanja t 8 ur 812 %± 18% IM 386 + L 930 BB -2-:—1 i 8 ur 93 % ± 1 % i 6 ur 37 %± 19% Ni zmanjšanja Ni povečanja % povečanja količine IL-10, proizvedenega v celicah THP-1 med sočasno inkubacijo z izolati iz tega izuma (IM386, L930BB ali kombinacija obeh) v primerjavi s količino proizvedenega IL-10 v celicah THP-1, induciranih samo z LPS. 1 % zmanjšanja količine citokinov (IL-6, IL-8 ali TNF-α), proizvedene v celicah 2 THP-1, induciranih z LPS, med sočasno inkubacijo z izolati tega izuma (IM386, L930BB ali kombinacija obeh) v primerjavi s količino proizvedenih citokinov v celicah THP-1, induciranih samo z LPS. 28 Čas (6 ur ali 8 ur) označuje čas vzorčenja, pri katerem je bil opažen največji učinek bakterijskih sevov na proizvodnjo citokinov v celicah THP-1.

Claims (20)

1. 29

   PATENTNI ZAHTEVKI 1. Postopek za izolacijo in selekcijo bakterijskih sevov iz bioptičnih vzorcev človeške črevesne sluznice, ki obsega naslednje korake: (a) pridobivanje sevov iz človeške črevesne sluznice; (b) izolacijo morebitnih bakterijskih sevov; (c) uporabo kromogenega gojišča UriSelect 4 za razlikovanje izolatov bakterijskih sevov; (d) selekcijo morebitnih sevov, ki so po predvidevanjih občutljivi za protimikrobne snovi, pomembne za sesalce; (e) selekcijo morebitnih sevov, ki so po predvidevanjih sposobni preživeti v razmerah prebavil sesalcev.
2. 2. Postopek po zahtevku 1, pri čemer je morebitni bakterijski sev iz rodu Lactobacillus ali Bifidobacterium.
3. 3. Sev Lactobacillus fermentum L930BB, shranjen v DSMZ, depozit št. 26139, njegovi analogi ali funkcionalno enakovredni sevi.
4. 4. Sev Lactobacillus fermentum L930BB označen z genomskim zaporedjem, izbranim iz skupine, ki vsebuje SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38, SEQ ID N° 39, SEQ ID N° 40, SEQ ID N° 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 48, SEQ ID N° 30

   49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 52, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 65, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 70, SEQ ID N° 71, SEQ ID N° 72, SEQ ID N° 73, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 75, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 77, SEQ ID N° 78.
5. 5. Sev Lactobacillus fermentom L930BB, po kateremkoli izmed zahtevkov od 3 do 4, ki ima protivnetno delovanje.
6. 6. Sev Lactobacillus fermentom L930BB, DSMZ depozit št. 26139 ali njegove variante, analoge ali funkcionalne ekvivalente za uporabo pri preprečevanju in/ali zdravljenju bolezni, stanja ali motnje pri sesalcih, kjer uporaba obsega izpostavljanje sesalca, dela sesalca ali tkiva sesalca omenjenemu sevu.
7. 7. Sev Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386, shranjen v DSMZ, depozit št. 26137, njegovi analogi ali funkcionalno enakovredni sevi.
8. 8. Sev Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 označen z genomskim zaporedjem, izbranim iz skupine, ki vsebuje SEQ ID N° 79, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81, SEQ ID N° 82, SEQ ID N° 83, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 85, SEQ ID N° 86.
9. 9. Sev Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386 po kateremkoli od zahtevkov od 7 do 8, ki ima protivnetno delovanje.
10. 10. Sev Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386, DSMZ depozit št. 26137 ali njegove variante, analoge ali funkcionalne ekvivalente za uporabo pri preprečevanju in/ali zdravljenju bolezni, stanja ali motnje pri sesalcih, kjer uporaba obsega izpostavljanje sesalca, dela sesalca ali tkiva sesalca omenjenemu sevu. 31
11. 11. Uporaba seva po kateremkoli izmed zahtevkov od 3 do 5 ali od 7 do 9 za pripravo probiotika kot nutracevtskega in/ali farmacevtskega produkta, zlasti za preprečevanje in/ali zdravljenje funkcionalnih motenj prebavil in bolezni v območju spodnjega prebavnega trakta.
12. 12. Farmacevtski pripravek, ki vsebuje vsaj sev Lactobacillus fermentum L930BB, shranjen v DSMZ, depozit št. 26139, kulturo in farmacevtsko sprejemljiv ekscipient.
13. 13. Farmacevtski pripravek, ki vsebuje vsaj Bifidobacterium animalis subsp. animalis IM386, shranjen v DSMZ, depozit št. 26137, kulturo in farmacevtsko sprejemljiv ekscipient.
14. 14. Pripravek vsebuje vsaj enega izmed sevov po katerem koli izmed zahtevkov od 3 do 5 ali od 7 do 9, in kjer je vsak izmed bakterijskih sevov prisoten v pripravku v razmerju od 0,1% do 99,9 %, prednostno od 1 % do 99 %, še bolj prednostno od 10 % do 90 %.
15. 15. Pripravek po katerem koli izmed zahtevkov od 12 do 14 za uporabo kot probiotika.
16. 16. Pripravek po katerem koli od zahtevkov od 12 do 14 za uporabo kot zdravilo.
17. 17. Sev po kateremkoli izmed zahtevkov od 3 do 5 ali od 7 do 9, ali pripravek po kateremkoli izmed zahtevkov od 11 do 16 za uporabo pri zdravljenju in/ali preprečevanju funkcionalnih motenj prebavil in bolezni v območju spodnjega prebavnega trakta.
18. 18. Sev po kateremkoli izmed zahtevkov od 3 do 5 ali od 7 do 9, ali pripravek po kateremkoli izmed zahtevkov od 11 do 16 za uporabo pri zdravljenju in/ali preprečevanju sindroma razdražljivega črevesja in kroničnih vnetnih črevesnih bolezni. 32
19. 19. Užitni proizvod, ki vsebuje učinkovito količino seva po katerem koli izmed zahtevkov od 3 do 5 ali od 7 do 9 ali pripravek po kateremkoli od zahtevkov od 12 do 16, skupaj z ustreznimi količinami drugih užitnih sestavin.
20. 20. Užitni proizvod po zahtevku 19, kije nutracevtik.