KR20220137004A - 무라야 코에니기이 추출물 및 화장품에서의 그의 용도 - Google Patents
무라야 코에니기이 추출물 및 화장품에서의 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피부 노화를 방지하기 위한 무라야 코에니기이 추출물의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 무라야 코에니기이(Murraya koenigii)의 추출물 및 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 피부 치료, 특히 피부 노화를 위한 상기 추출물 또는 상기 화장료 조성물의 용도에 관한 것이다.
진피(dermis)는 조밀한 섬유탄성(fibroelastic) 결합 조직이며, 세포 및 특히 탄성 및 콜라겐 섬유를 함유하는 세포외 기질(ECM)로 만들어진다. 진피의 기능은 영양을 보장하고, 표피(epidermis)뿐만 아니라, 피부의 기계적 특성을 뒷받침한다. 진피 내의 다수의 세포인 섬유아세포는 ECM을 형성하는 단백질(콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸 및 당단백질)뿐만 아니라 ECM을 교체 또는 복구하기 위해 이를 분해하는 단백질분해효소(콜라게나제, 엘라스타제)도 합성한다.
탄성 섬유의 기원(genesis)은 발생의 초기에 시작하고 출생시 정점이 된다. 상기 공정은 대략 사춘기에 느려지고, 성인에서 거의 존재하지 않게 된다. 성숙한 탄성 섬유의 아키텍처(architecture)는 복잡하고 조직-의존성이며, 고려되는 조직의 생물학적 기능을 반영한다.
피부에서, 탄성 섬유는 개별화된 섬유로서 존재하며, 피부에 그 탄성 및 탄력을 제공한다. 더욱이, 탄성 섬유는 상기 섬유에 존재하는 엘라스틴의 비율에 따라 상이한 명칭을 갖는다. 따라서, 낮은 엘라스틴 함량을 갖는 섬유 및 90% 이상의 엘라스틴으로 구성된 섬유 사이를 구별하는 것이 가능하다; 이들은 각각 옥시탈란(oxytalan) 섬유, 엘라우닌(elaunin) 섬유 및 성숙한 탄성 섬유로 불린다. 피상적 진피에서, 옥시탈란 섬유는 진피-표피 접합부에 수직인 미세한 분지(arborization)를 형성하고, 유두상 진피에서 엘라우닌 섬유와 섞인다. 망상 진피에서, 탄성 섬유는 더 두껍고, 진피-표피 접합부에 평행하게 배향된다.
탄성 섬유는 기능적 탄성 섬유의 초분자적 조립체(supramolecular assembly)를 유도하는 세포내 및 세포외 공정의 세트를 나타내는 탄성섬유발생(elastogenesis) 동안에 합성된다. 탄성 섬유의 코어(core)는 피브릴린(fibrillin), 피불린(fibulin), MAGP(Microfibril-Associated Glycoprotein-1) 및 LTBP(LatentTGF-β-Binding Protein)와 같은 당단백질로 주로 구성되는 미세섬유성 외피막과 관련되는 엘라스틴으로 구성된다. 탄성 섬유에 그 탄성 및 탄력을 제공하고 집거나 늘어날 때 피부가 그 원래 위치로 되돌아가게 하는 것이 엘라스틴이다.
엘라스틴은 단백질분해에 매우 저항성인 단백질이고, 신체에서 가장 저항성인 단백질 중 하나이다. 성인에서 생리학적 조건 하에, 엘라스틴의 교체는 거의 없고, 그 반감기는 70년으로 추정된다. 그럼에도 불구하고, 엘라스틴 합성은 노화 동안에 손상/분해된 탄성 섬유를 복구하기 위해 때때로 재활성화된다. 그러나, 복구된 탄성 섬유는 발생 동안에 형성된 것보다 덜 기능적이다.
상기 미세섬유는 그 위에 트로포엘라스틴 모노머가 침적되고 성숙하는 섬유와 공유 결합을 형성하기 전에 정렬되는 당단백질 매트릭스(matrix)를 구성한다. 미세섬유는 주로 피브릴린, 예컨대 진피에서 고발현되는 피브릴린-1(FBN-1)으로 구성된다. 피불린, 예컨대 피불린-5(FBLN-5)는 피브릴린과 관련되며, 트로포엘라스틴 및 탄성 섬유의 초분자적 조립체에 대한 결합과 같은 탄성섬유발생의 몇 가지 핵심 단계와 연관된다.
진피는 유전자적으로 프로그램된 변경의 세트의 결과인 자연노화(chronoaging)(내인성 노화로도 불림)에 의해 영향을 받는다. 섬유아세포는 덜 풍부하고, 그 대사 활성은 감소되며, 예컨대 콜라겐 및 엘라스틴 합성이 감소된다. 임상적으로, 이것은 미세한 주름의 외형, 탄성의 점진적 소실 및 느린 치유로 귀결된다. 자연노화 동안, 섬유아세포는 또한 진피 ECM 성분의 단백질분해성 분해와 관련되는 더 많은 금속단백질분해효소(MMP)를 합성한다. 이후, 상기 효소는 탄성 섬유를 구성하는 엘라스틴 및 피브릴린을 분해할 수 있다. 조직학적 관점에서, 본 발명자들은 탄성 섬유의 밀도 및 수의 감소 및 직경의 감소와 함께 단편화되어 보이는 탄성 섬유의 탄성섬유용해(elastolysis) 현상을 조사하였다.
외인성 노화는 오염, 생활 방식, 및 태양 노출(또는 광노화)을 포함하는 많은 환경적 인자의 결과이며, 그 해로운 효과가 자연노화의 효과에 부가된다. 광노화는 진피에서의 현저한 변경에 의해 특정되며, 진한 주름의 형성 및 피부 탄성의 현저한 소실을 유도한다. 광노화 동안에 관찰된 변화는 주로 과도한 조직 분해를 유발하는 단백질분해성 효소의 강한 활성화를 유도하게 되는 활성 산소 종(ROS)의 생성에 기반한다. (섬유아세포 및 호중구 침투 유래의) 호중구 엘라스타제 및 (대식세포 유래의) MMP-12와 같은 단백질분해효소는 UV 광의 영향 하에 분비되어 트로포엘라스틴을 분해한다.
선진국에서 기대 수명의 증가와 함께, 피부의 외형 및 기능성에 대한 노화의 영향은 많은 연구의 주제인 주요 사안이다.
피부 노화의 생리학에 수반되는 메커니즘을 더 잘 이해하면 그 원하지 않는 효과를 늦추거나 복구할 수 있는 새로운 전략의 개발을 가능하게 하는 것으로 나타났다.
따라서, 임상 연구는 비타민 C-기반 크림을 적용하면 콜라겐 및 탄성 섬유 합성의 활성화를 통해 피부의 전체적인 외형을 개선하고 두드러진 주름을 감소시키는 것을 보였다.
비타민 A로부터 유래되는 레티노이드는 콜라겐 섬유의 합성 및 옥시탈란 섬유의 재형성을 자극함으로써 주름의 감소를 돕는다. 게다가, 이것은 MMP의 과발현을 차단함으로써 ECM 단백질의 과도한 단백질분해를 방지한다.
포도 및 포도주, 녹차 및 홍차, 과일, 및 채소에 자연적으로 존재하는 항산화제인 폴리페놀은 또한 MMP의 과발현을 억제하는 그 특성으로 인해 좋은 후보물질이다.
천연 및 다양한 분자가 풍부한 식물 추출물은 또한 광보호(photoprotection)의 내생적 매커니즘, 예컨대 세포의 항산화 방어 및 MMP 효소 활성의 억제를 자극하기 위한 좋은 후보물질이다. 그리고, 보다 특별하게는, 문헌 FR 2855968은 탄성 섬유의 형성을 자극하기 위한 딜(dill), 커런트(currant), 카르다몸(cardamom), 검은 무(black radish), 리틀 홀리(little holly), 시나몬(cinnamon), 귀리, 감자, 및 실크(silk)의 추출물을 기술한다.
예를 들면, 흔히 카레 또는 칼로우필(kaloupile) 나무로 알려져 있는 식물 종인 무라야 코에니기이 (L.) 스프렝(Spreng)은 운향과(Rutaceae family)에 속한다. 무라야 코에니기이 또는 M. 코에니기이는 최대 높이 6 미터에 도달할 수 있는 낙엽성의 향기로운 관목이다. 주로 인도 및 스리랑카가 원산지이며, 남아시아 및 동남아시아에서도 발견된다. 그 성장은 열대 또는 아열대 기후를 갖는 지역에서 최적이다.
M. 코에니기이의 상이한 부위, 예컨대 엽상 자루(leafy stalk)(또는 엽상 줄기(leafy stem)), 잎, 껍질, 과일, 종자, 뿌리의 식물화학물질(phytochemical) 조성은 종래 기술에 의해 잘 기술되어 있다. 이것은 주로 카르바졸 타입의 알칼로이드, 페놀성 화합물(플라보놀 타입의 플라보노이드, 벤조산 및 p-히드록시신남산 유래의 페놀산, 탄닌), 테르페노이드(사포닌, 카로테노이드), 정유(essential oil), 미네랄, 당, 및 아미노산의 존재에 의해 특정된다.
M. 코에니기이, 특히 그 엽상 줄기 및 잎은 전통적으로 음식 및 의약으로 사용된다. 잎은 카레 및 처트니(chutney)의 제조에 매우 자주 사용된다.
화장품 적용과 관련된 몇 가지 활성, 즉 항-히알루로니다아제(hyaluronidase), 항균제, 보습, 항산화제, 탈색(depigmenting), 모발 성장, 또는 광보호가 또한 M. 코에니기이에 대해 문헌에 보고되어 있다.
예를 들면, DERMALOGICA 회사에 의해 개발된 Age Smart® 나이트 세럼(night serum) 또는 ALDI-SUD 회사에 의해 판매되는 나이트 크림이 언급될 수 있다. 유사하게, M. 코에니기이 잎의 추출물을 포함하는 식물 추출물을 포함하는 조성물을 개시하는 US 2009/169651, 및 M. 코에니기이, M. 파니쿨라타(paniculata), 및 M. 엑소티카(exotica)의 지상부, 특히 잎의 효소 처리에 의해 수득된 타나카(Thanaka)를 포함하는 조성물을 기술하는 WO 2014/157910을 언급할 수 있다.
전통 의학에서, 무라야 코에니기이의 추출물은 소화(항-메스꺼움, 항-구토, 항-설사)를 촉진하고 (마이코-)박테리아, 진균, 바이러스, 및 기생충 감염을 방지한다는 말이 있다. 추출물은 세포의 항산화 시스템을 자극함으로써 산화적 스트레스를 방지하는 치료적 및 예방적 특성을 갖는 것으로 기술된다. 항-염증 특성은 주로 무라야 코에니기이 추출물에 함유된 알칼로이드에 기인한다. 유익한 신경학적(항-불안, 항우울, 및 항-스트레스) 및 대사적(항-당뇨 및 항-비만) 효과가 또한 무라야 코에니기이 추출물을 먹인 동물에서 발견된다.
예로서, WO 2018/172436은 메트포르민(metformin)을 포함하는 M. 코에니기이의 건조 잎 분말의 활성 성분을 포함하는 조성물을 대사 증후군 및 인지 장애의 치료에 사용하는 용도를 개시한다.
그러나, 상기 종래 기술로부터 무라야 코에니기이 추출물의 효능 및 생물학적 특성은 상기 추출물 내의 알칼로이드의 존재와 관련되는 것으로 보인다.
사실, 앞서 언급한 것과 같이, 무라야 코에니기이는 특히 카르바졸 타입의 알칼로이드의 중요한 공급원이다. 예를 들면, 줄기 껍질로부터 단리된 카르바졸은 기리님빈(girinimbine), 무라야닌(murrayanine) 또는 마하님빈(mahanimbine)이다; 카르바졸 마하님빈, 이소마하님빈, 마하닌(mahanine) 또는 코에놀린(koenoline)은 잎 줄기 및 잎으로부터 단리된다.
알칼로이드는 탄소, 수소, 및 특별히 질소를 함유하는 천연 기원의 분자의 군을 나타낸다. 대부분의 알칼로이드는 가장 흔하게는 신경계에 대한 생물학적 작용을 갖는다(향정신제, 정신활성제, 흥분제, 도핑(doping)제, 토닉(tonic), 구토제, 카밍(calming)제, 수면제, 및 진통제). 정제된 형태에서, 상기 분자는 매우 자주 급성 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 낮은 용량에서 습관화 영향 또는 장기간의 만성 독성과 함께 진정성(soothing) 약리학적 활성을 나타낸다. 따라서, 화장료 조성물에서, 알칼로이드와 관련된 독성의 위험성을 감소시키기 위하여, 때때로 상기 분자를 포함하는 활성 성분의 농도를 감소시킬 필요가 있다. 그러나, 활성 성분의 용량에서의 이러한 감소는 조성물의 유효성을 희생할 수 있다.
상기 내용으로부터, 화장료 제품에서 알칼로이드의 존재를 제한하거나 심지어 제거할 필요가 있는 것으로 보인다.
엽상 자루(또는 엽상 줄기), 및 잎은 또한 벤조산(갈산, 프로토카테추산, 시링산, …) 및 p-쿠마르산(p-쿠마르산, 페룰산, …) 유래의 페놀산뿐만 아니라 플라보놀 타입의 플라보노이드(퀘르세틴)도 함유한다. 상기 분자는 화장품 분야에서 유용한 생물학적 특성, 특히 항균, 항산화, 또는 심지어 치유 특성을 갖는다.
다른 한편으로, 상기 추출물을 수득하기 위해 이용가능한 용매를 선택하는 것은 소정 수의 어려움을 제공한다.
수성 용매는 그 안정성을 보장하기 위하여 미세생물학적 보존제의 첨가를 필요로 한다. 그러나, 보존제 사용 분야는 특히 독성학적 데이터를 필요로 하기 때문에 점점 더 제한되고 있다. 프로필렌 글리콜은 잠재적으로 독성인 것으로 나타났고, 현재 제조사에 의해 기피되고 있다. 영농-기반 부틸렌 글리콜은 상대적으로 고가여서 그 산업적 용도가 제한된다. 에탄올은 단독으로 또는 물과 혼합되어 양호한 추출 능력을 갖지만, 특히 휘발성 및 가연성이어서 운송 및 보관 문제를 유발한다. 다른 한편으로, 그 건조 특징으로 인해, 상기 용매는 피부의 수성지질막(hydrolipidic film)을 교란하고 민감성 피부에 자극을 초래할 수 있다.
더욱이, 식물 추출물은 흔히 화장료 조성물을 제형화하기 위해 사용되기 위한 운명이므로, 추출물 내에 아주 미량이 필연적으로 발견되게 되는 염 또는 산을 포함하는 추출 용매를 피하는 것이 중요하다. 사실, 겔 또는 에멀전 형태의 0.1%의 용량을 상회하는 염-기반 성분의 제형은 특히 복잡한 것이 잘 알려져 있다. 아울러, 산은 수득된 추출물의 pH를 낮추기 때문에, 겔 또는 에멀전 제형을 만들기 어렵게 하는 효과를 갖는다. 특히, 피부에 적용하기 위한 의도의 화장료 제품은 적합한 pH, 바람직하게는 피부에 가깝거나(약 pH 5.5) 중성인 pH를 가져야 한다. 따라서, 상기 조건 하에, 산을 함유하는 용매를 사용하는 것은 부형제, 특별히 pH 조절제의 첨가를 필요로 한다.
본 발명이 해결하기 위해 제안하는 문제는 피부의 탄성을 보존 또는 개선함으로써 피부 노화를 효과적으로 방지하고, 상기 언급된 것과 같은 약점, 특히 추출물 내의 알칼로이드의 존재와 연관된 약점을 갖지 않는 기존의 식물 추출물에 대한 대체제를 발견하는 것이다.
매우 놀랍게도, 출원인은 무라야 코에니기이의 추출물이 상기 언급된 필요성을 충족할 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 피부 및/또는 점막의 화장료 치료를 위한, 특히 피부 및/또는 점막의 외형을 개선하고, 피부의 강도 및/또는 탄성을 개선하고, 피부 노화, 주름, 또는 피부 느슨함(slackening)을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 무라야 코에니기이의 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 바람직하게는 비-치료적 용도에 관한 것이다.
제1 측면에 따르면, 본 발명은 피부 노화를 방지하기 위한 무라야 코에니기이의 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
한 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 피부의 탄성섬유발생 공정을 자극하기 위해 사용된다.
다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물, 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 피부 탄성 섬유의 형성을 자극하기 위해 사용된다.
유리하게는, 피부 탄성 섬유는 옥시탈란 섬유, 엘라우닌 섬유 및/또는 성숙한 탄성 섬유이다.
다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물, 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 피부의 세포외 기질(ECM)의 밀도를 높이기 위해 사용된다.
본 발명의 의미에서, "ECM의 밀도를 높이는"은, 본 발명자들은 ECM을 형성하는 단백질(콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 또는 당단백질)의 함량을 증가시키는 것을 의미한다.
다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 늘어진 피부를 방지하기 위해 사용된다.
다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 피부를 치유하기 위해 사용된다.
한 특정 구현예에 따르면, 앞선 용도에서 시행되는 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물은 고체/액체 추출 공정과, 이어지는 제2 고체/액체 분리 단계와, 마지막으로 액상(liquid phase)에서의 제3 회수 단계에 의해 수득될 수 있으며, 상기 용매는 베타인(betaine) 및 1,3-프로판디올 또는 프로판디올의 혼합물, 유리하게는 베타인, 프로판디올, 및 물의 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 용매는 물을 함유하거나 하지 않을 수 있다. 그러나, 용매 내에 물이 존재하면 용매를 희석(thinning)하고, 이에 따라 추출을 용이하게 하는 이점을 갖는다.
한 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물을 수득하기 위해 사용되는 추출 용매는 1:정확히 1.5 미만의 몰 비율; 유리하게는 1:1의 몰 비율의 베타인 및 프로판디올의 혼합물로 이루어진다.
다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물을 수득하기 위해 사용되는 추출 용매는 1:정확히 1.5 미만의 몰 비율의 베타인, 프로판, 및 물의 혼합물로 이루어지고, 상기 물은 용매의 15 내지 35 중량%를 나타낸다.
다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물을 수득하기 위해 사용되는 추출 용매는 1:1의 몰 비율의 베타인, 프로판디올, 및 물의 혼합물로 이루어지고, 상기 물은 유리하게는 용매의 15 내지 35 중량%를 나타낸다.
유리하게는, 본 발명에 따른 추출물을 수득하기 위해 사용되는 추출 용매는 1:1:5의 몰 비율의 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어진다.
특정 구현예에 따르면, 무라야 코에니기이 식물의 전체 또는 일부가 피부 노화를 방지하기 위한 추출물로서 사용될 수 있다. 실제로, 추출물로서 사용되는 식물의 부위는 과일, 꽃, 종자, 뿌리, 잎, 줄기, 엽상 자루(또는 엽상 줄기), 및 어린 순(young shoot)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
유리하게는, 사용되는 식물의 부위는 엽상 자루(또는 엽상 줄기), 및/또는 잎이다.
특정 구현예에 따르면, 사용되는 식물 부위는 신선하고, 냉동되고, 건조되고, 온전하고, 절단되고, 및/또는 분쇄된다.
유리하게는, 이것은 건조된 엽상 자루 및/또는 잎, 바람직하게는 건조되고 분쇄된 엽상 자루 및/또는 잎이다.
바람직하게는, 이것은 건조된 엽상 자루, 바람직하게는 건조되고 분쇄된 엽상 자루이다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 고체/액체 추출 공정과, 이어지는 제2 고체/액체 분리 단계와, 마지막으로 제3 액상 회수 단계에 의해 수득가능한 무라야 코에니기이 추출물에 관한 것이며, 그 용매는 베타인 및 프로판디올의 혼합물, 유리하게는 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
한 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물을 수득하기 위해 사용되는 추출 용매는 1:1:5의 몰 비율의 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어진다.
본 발명에 따르면, 무라야 코에니기이 식물의 전체 또는 일부가 본 발명에 사용될 수 있다. 실제로, 추출 공정에 사용되는 식물의 부위는 자루, 잎, 과일, 꽃, 종자, 뿌리, 엽상 자루(또는 엽상 줄기), 및 어린 순으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히 바람직한 방식에서, 사용되는 식물의 부위는 엽상 자루 및/또는 잎이다. 이것은 신선하고, 냉동되고, 건조되고, 온전하고, 절단되고, 또는 찧어진 잎 줄기 및/또는 잎일 수 있다.
유리하게는, 이것은 건조된 엽상 자루 및/또는 잎, 바람직하게는 건조되고 분쇄된 엽상 자루 및/또는 잎이다.
바람직하게는, 이것은 건조된 엽상 자루, 바람직하게는 건조되고 분쇄된 엽상 자루이다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물은 알칼로이드, 유리하게는 카르바졸, 바람직하게는 마하님빈, 무라야닌, 기리님빈, 이소마하님빈, 마하닌 및/또는 코에놀린이 부재한다.
본 발명의 목적을 위하여, "알칼로이드-부재"는 추출물 내에 알칼로이드가 없거나 5 ㎎/100 g의 추출물 미만의 농도로 알칼로이드가 미량 존재하는 것을 의미한다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물은 페놀산, 바람직하게는 p-히드록시신남산 유도체, 및/또는 플라보노이드, 바람직하게는 플라보놀 타입의 플라보노이드가 풍부하다.
본 발명의 의미에서, "풍부한"은, 본 발명자들은
- 100 ㎎/㎏의 추출물보다 더 높은, 유리하게는 250 ㎎/㎏의 추출물보다 더 높은 페놀산의 농도; 및
- 50 ㎎/㎏ 이상의 추출물, 유리하게는 100 ㎎/㎏의 추출물 이상의 플라보노이드 농도;를 의미한다.
본 발명에 따른 용매는 특히 실온에서 액체이며, 이것은 본 발명의 추출물을 유도하는 공정의 시행을 용이하게 한다.
실제로, 사용되는 용매는 투명하고 무색인 혼합물이 수득될 때까지 베타인 및 프로판디올 또는 베타인, 프로판디올 및 물을 교반 반응기에서 혼합함으로써 생산될 수 있다. 상기 혼합은 2℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 6시간, 바람직하게는 40℃ 내지 70℃에서 1시간 내지 2시간 동안 행할 수 있다.
본 발명에 따른 추출물은 고체/액체 추출 단계를 시행하는 공정에 의해 수득가능하다.
상기 고체/액체 추출은 본 기술분야의 사람에게 잘 알려진 상이한 기술, 예컨대 침용(maceration), 재침용, 소화, 동적 침용, 달임(decoction), 유동층 추출, 마이크로파-보조 추출, 초음파-보조 추출, 향류 추출, 침투(percolation), 재-침투, 침출(leaching), 감압 하 추출, 투석추출(diacolation)에 의해 수행될 수 있다.
실제로, 상기 추출 단계를 위해 적용되는 식물/용매 질량 비는 1:99 내지 50:50, 유리하게는 3:97 내지 10:90이다. 바람직하게는, 찧고 건조된 무라야 코에니기이 엽상 자루(또는 엽상 줄기) 및/또는 잎 대 용매의 질량 비는 1:99 내지 50:50, 바람직하게는 3:97 내지 10:90이다. 상기 추출 단계는 바람직하게는 2 내지 100℃, 보다 바람직하게는 20 내지 80℃의 온도에서 수행된다. 상기 추출 단계는 수 분 내지 수 일 동안 유지될 수 있다.
활성 화합물의 추출을 최적화하면서 상기 화합물을 대기의 산소에 의한 산화로부터 보호하기 위하여, 상기 고체/액체 추출 단계는 유리하게는 교반 하에 및/또는 질소 대기에서 수행된다.
본 발명에 따르면, 상기 고체/액체 추출 단계에 이어서 고체/액체 분리 단계가 뒤따르며, 그 목적은 활성 물질을 함유하는 고체/액체 분리 여과물이라 불리는 액상을 회수하는 것이다. 상기 분리는 본 기술분야의 기술자에게 알려진 임의의 기술, 특히 배수, 압축, 탈수, 원심분리, 또는 여과에 의해 수행될 수 있다.
선택적으로, 상기 액체/고체 분리 단계에 이어서 농축 단계가 뒤따를 수 있으며, 이것은 농축 인자에 따라 액체 또는 반-고체 형태로 농축물이 수득되게 한다. 실제로, 상기 농축 단계는 감압 하의 증발 또는 역삼투에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는, 상기 고체/액체 분리 여과물 또는 농축물은 부가적으로 하나 이상의 투명화 단계를 받는다. 상기 투명화 단계를 수행하기 위하여, 기술자는 본 분야에 알려진 임의의 타입의 전면(frontal) 및/또는 접선(tangential) 여과를 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 액체/고체 분리 또는 농축 또는 투명화 단계에 이어서 선택적으로 분별 단계가 이어질 수 있으며, 이것은 농축 인자에 따라 액체 또는 반-고체 형태로 하나 이상의 식물화학물질 패밀리의 분획물(fraction)이 수득되게 한다. 실제로, 상기 분별 단계는 본 기술분야의 기술자에게 알려진 임의의 기술, 특히 감압 하의 크로마토그래피, 한외여과, 또는 나노여과에 의해 수행될 수 있다.
마지막으로, 포장을 할 생각으로, 본 발명에 따른 액체 추출물을 수득하기 위한 공정은 멸균 여과를 포함할 수 있다. 멸균 여과는 전통적으로 0.22 ㎛의 직경을 갖는 구멍을 포함하는 필터를 통해 생성물을 여과함으로써 달성된다. 바람직하게는, 상기 멸균 여과 단계는 상기 공정의 최종 단계이다.
본 출원인은 또한 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물이 특별히 피부 단백질 합성을 자극하는 측면에서 특히 관심있는 생물학적 특성을 갖는 것을 발견하였다.
본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물은 피부 탄성과 관련되는 단백질의 발현을 조정할 수 있다.
사실, 실험 섹션에서 상술한 것과 같이, 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물은 탄성 섬유에 속하는 단백질, 특히 엘라스틴, 피브릴린-1, 피브릴린-2 또는 피불린-5의 발현을 자극하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 추출물은 특히 피부의 외형을 개선하고, 피부의 탄성을 보존 및/또는 개선하기 위한 화장품 용도에 대해 특히 관심이 있다. 결과적으로, 본 발명에 따른 추출물은 피부 노화, 바람직하게는 내인성 노화, 및/또는 외인성 노화, 특히 광노화의 효과를 방지하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 추출물의 이점은:
- 알칼로이드 함량이 없거나 낮을 때 생물학적(사전(pro)-탄성섬유발생적) 특성을 갖고;
- 전체적으로 천연이고, 즉 모든 성분이 천연이고; 및
- 모든 화장료 관리(care) 제품에서 호환성이고 완벽하게 제형화된다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물, 즉 피부 및/또는 점막, 및/또는 부속물에 국소 적용하기에 적합한 바람직하게는 화장료 조성물에 관한 것이다.
한 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 추출물은 조성물의 중량 기준으로 0.1% 내지 10%, 유리하게는 0.5% 내지 5%를 나타낸다.
한 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 피부 관리 조성물, 항-노화 피부 관리 조성물, 또는 자외선차단(sunscreen) 조성물이다.
본 발명에 따른 조성물은 모두 피부 및/또는 점막, 및/또는 부속물에 국소 적용하기 위해 보통 사용되는 갈레닉(galenic) 형태, 예를 들면 무수물 형태, 수중유 에멀전, 유중수 에멀전, 복합 에멀전, 실리콘 에멀전, 마이크로에멀전, 나노에멀전, 겔, 수용액 또는 수성알코올(hydroalcoholic) 용액의 형태일 수 있다.
상기 조성물은 대략 유체일 수 있고, 예를 들면, 크림, 연고, 우유, 로션, 세럼, 또는 겔의 형태일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 대개 화장료 분야에서 사용되는 부형제, 예컨대 지방, 세제 및/또는 컨디셔닝(conditioning) 계면활성제, 에멀전화제 및 공동-에멀전화제, 친수성 또는 친유성 겔화제, 보존제, 항산화제, 용매, 박리화제, 향수, 충진제, 친수성 및 친유성 필터, 착색 물질, 중화제, 사전-침투제, 및 폴리머를 함유할 수 있다. 이러한 타입의 부형제는 모두 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다.
실제로, 상기 상이한 부형제의 함량은 고려되는 분야에서 종래에 사용되는 함량이며, 상기 부형제의 합은 바람직하게는 조성물의 총 중량의 0.01% 내지 30%를 나타낸다.
적합한 지방은 미네랄 오일, 동물성 오일(예컨대, 라놀린), 식물성 오일, 합성 오일(예컨대, 이소프로필 미리스테이트, 옥틸도데실, 이소스테아릴 이소스테아레이트, 데실 올레에이트, 이소프로필 팔미테이트), 실리콘 오일(시클로메티콘, 디메티콘) 및 불소화 오일을 포함한다. 지방 알코올, 지방산, 왁스, 및 검, 특히 실리콘 엘라스토머가 지방으로 사용될 수 있다.
적합한 세제 및/또는 컨디셔닝 계면활성제는 비이온성, 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽성 계면활성제 및 이들의 혼합물, 예컨대, 예를 들면, 알킬 설페이트, 나트륨 라우릴 에테르 설페이트와 같은 알킬 에테르 설페이트, 코카미도프로필 베타인과 같은 알킬 베타인, 또는 4차 암모늄 염을 포함한다.
적합한 에멀전화제 및 공동-에멀전화제는, 예를 들면, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 수크로오스 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 옥시에틸렌화 소르비탄 지방산 에스테르, PEG 지방 알코올 에테르, 글리세롤 지방산 에스테르, 알킬 설페이트, 알킬 에테르 설페이트, 알킬 포스페이트, 알킬 폴리글루코시드, 디메티콘 코폴리올을 포함한다.
적합한 친수성 겔화제는, 예를 들면, 카르복시비닐 폴리머(카르보머), 아크릴성 코폴리머, 예컨대 아크릴레이트/알킬아크릴레이트 코폴리머, 폴리아크릴아미드, 폴리사카라이드, 예컨대 잔탄 검, 구아 검, 천연 검, 예컨대 셀룰로오스 검 및 유도체, 전분 및 그의 유도체, 클레이(clay), 및 2-아크릴아미도-2-메틸프로판산 코폴리머를 포함한다.
적합한 친유성 겔화제의 예는 변형된 클레이, 예컨대 벤톤, 지방산의 금속 염, 소수성 실리카, 및 에틸 셀룰로오스이다.
적합한 보존제는 벤조산, 소르브산, 프로피온산, 살리실산, 데히드로(dehydro)아세트산 및 그의 염, 벤질 알코올, 에틸헥실글리세린, 파라벤, 그의 염 및 에스테르, 트리클로산, 이미다졸리디닐 우레아, 5-페녹시에탄올, DMDM 히단토인(hydantoin), 디아졸리디닐 우레아, 클로르페네신을 포함한다.
적합한 항산화제의 예는 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 및 그의 염, 나트륨 메타비설파이트, 살리실산, 아스코르브산, 및 시트르산 및 그의 염, 나트륨 타르트레이트, 나트륨 글루코네이트, 카로테노이드, 및 토코페롤이다.
상기 화장료 조성물에서 사용될 수 있는 용매(추출 용매와 구별됨)는 물, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 소르비톨을 포함한다.
적합한 박리화제의 예는 화학적 박리제, 예컨대 AHA, 및 물리적 박리제, 예컨대 천연 또는 합성 분말을 포함한다.
적합한 충진제는 탈크, 카올린, 마이카, 세리사이트, 탄산마그네슘, 알루미늄 실리케이트, 마그네슘 실리케이트, 유기 분말, 예컨대 나일론을 포함한다.
적합한 염료는 화장료 조성물에서 흔히 사용되는 친유성 염료, 친수성 염료, 안료, 및 진주광택(pearlescent) 물질 및 이들의 혼합물을 포함한다.
적합한 중화제는 소다회(soda ash), 트리에탄올아민, 아미노메틸 프로판올 또는 수산화칼륨을 포함한다.
적합한 사전-침투제는, 예를 들면, 알코올 및 글리콜(에탄올, 프로필렌 글리콜), 에톡시디글리콜, 알코올 및 지방산(올레산), 지방산 에스테르 또는 디메틸 이소소르바이드이다.
본 발명의 조성물은 또한 본 발명에 따른 추출물 이외의 활성 성분을 함유할 수 있다. 적절한 활성 성분으로서, 본 발명자들은, 예를 들면 항-라디칼제 또는 보다 일반적으로는 항산화제, 미백제, 색소화제(pigmenting agent), 진정제(emollient), 보습제, 지루방지제(anti-seborrheic agent), 항-염증제, 항-여드름제, 각질용해제 및/또는 탈락화제(desquamating agent), 항-주름제 및 텐서제(tensor agent), 배수제(draining agent), 항-자극제, 진정제, 비타민 및 이들의 혼합물, 유분제거제(mattifying agent), 항-노화제, 예컨대 레티놀, 치유제, 소독제, 및 정유를 언급할 수 있다.
본 발명 및 그의 이점은 다음의 구현예로부터 자명해질 것이다.
본 발명이 수행될 수 있는 방식 및 그의 이점은 첨부된 도면에 나타낸 다음의 예시적이고 비제한적인 실시예로부터 보다 자명해질 것이다.
도 1은 무라야 코에니기이의 4가지 추출물의 페놀산, 플라보노이드, 및 알칼로이드 함량을 나타낸다.
도 1은 무라야 코에니기이의 4가지 추출물의 페놀산, 플라보노이드, 및 알칼로이드 함량을 나타낸다.
1/ 무라야 코에니기이 추출물의 제조
추출물 1: 1:1:5의 몰 비의 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어진 본 발명에 따른 용매를 이용하여 70℃에서 3시간 동안 질량 비 8:92의 식물 및 용매를 계속 교반 하에 추출함으로써 건조되고 분쇄된 잎 줄기 및 잎으로부터 수득된 무라야 코에니기이의 추출물(GHP115). 추출 후, 식물의 잔사(residue)를 기계적 공정(예컨대, 회전)에 의해 제거하고, 조(crude)추출물을 0.22 ㎛로 여과해 낸다.
추출물 1a: 식물/용매의 질량 비가 5:95인 것을 제외하고 상기 추출물 1에 대해 기술된 것과 동일한 작업 조건 하에 수득된 추출물.
추출물 2: 70:30의 질량 비의 에탄올/물 용매를 이용하여 70℃에서 3시간 동안 8:92의 질량 비의 식물 및 용매를 계속 교반 하에 추출함으로써 건조되고 분쇄된 엽상 자루 및 잎으로부터 수득된 무라야 코에니기이의 추출물. 추출 후, 식물의 잔사를 기계적 공정(예컨대, 회전)에 의해 제거한다. 조추출물을 0.08%의 활성탄 Acticarbone CPW CECA로 탈색한 후, 감압 하에 에탄올을 증발시키고, 수득된 수성 농축 추출물을 프로판디올에 가용화시켜, 최종 건조 추출물이 수성-에탄올성 추출물의 건조 추출물과 동일하게 한다.
추출물 3: 폴리페놀이 풍부하고 미량의 알칼로이드(< 10 ㎎/100 g의 분획물)만을 함유하는 추출물 2에 대해 기술된 탈색된 수성에탄올 추출물의 분획물. 상기 분획물은 추출물 2에 대해 기술된 것과 같이 활성탄으로 70:30 탈색된 에탄올/물 추출물을 Amberlite FPX 68 수지로 컬럼 여과함으로써 수득하고, 흡착되지 않은 여과물은 추출물 3을 구성한다.
추출물 4: 알칼로이드가 풍부하고 폴리페놀이 없는 추출물 2에 대해 기술된 탈색된 수성에탄올 추출물의 분획물. 상기 분획물은 추출물 2에 대해 기술된 것과 같이 컬럼에서 활성탄으로 탈색한 70:30 에탄올/물 추출물을 Amberlite FPX 68 수지 상에 여과/흡착한 후, 수지 상에 흡착된 분자를 에탄올로 탈착시킴으로써 수득한다.
2/ 상이한 몰 비율의 용매 베타인/프로판디올/물에 의한 무라야 코에니기이의 추출 능력의 특징분석
무라야 코에니기이의 엽상 자루(또는 엽상 줄기) 및 잎으로부터 폴리페놀 및 알칼로이드를 추출하는 능력을 표 1에 나타낸 (상이한 몰 비의) 베타인/프로판디올/물 혼합물의 6가지 조성물에 대해 연구하였다.
| GHP 몰 비 | 1:1:4 | 1:1:5 | 1:1.5:3 | 1:1.5:5 | 1:2:3 | 1:2:6 |
| 베타인(g) | 44.16 | 41.35 | 41.06 | 36.45 | 36.23 | 31.04 |
| 프로판디올(g) | 28.68 | 26.86 | 40.00 | 35.52 | 47.06 | 40.32 |
| 물(g) | 27.16 | 31.79 | 18.94 | 28.03 | 16.71 | 28.64 |
각각의 용매는 기계적 교반 하에 70℃에서 약 1시간 동안 베타인, 프로판디올 및 물을 혼합함으로써 제조한다. 각각의 추출물은 5%의 찧어진 무라야 코에니기이 엽상 자루 및 건조된 잎 및 95%의 용매로 70℃에서 4시간 동안 추출함으로써 수득한다. 추출 후, 식물 잔사를 기계적 공정에 의해 제거하고, 조추출물을 멸균 여과 한계(0.22 ㎛)로 여과한다.
(폴리페놀 군에 속하는) 플라보노이드 및 페놀산을 RP-UHPLC-UV에 의해 분석하였으며, 페놀산은 287 nm에서 클로로겐산의 눈금 선에 대해 점을 찍고 정량하였고, 플라보노이드는 355 nm에서 이소퀘르시트린의 눈금 선에 대해 확인 및 정량하였다. 물에 1/2 m/v로 희석한 후 각각의 추출물의 가드너(Gardner) 지수를 Lico 100 비색계를 이용해 측정하였다.
유리 병에 포장된 6가지 추출물의 물리적 안정성(시각적 측면)을 3가지 상이한 온도(4, 25 및 40℃)에서 7일 보관한 후에 관찰하였다.
각각의 추출물에 대한 플라보노이드 및 페놀산 농도는 표 2에 나타나 있다.
| 농도(㎎/100 g의 추출물) | 가드너 지수 | ||
| 용매 | 플라보노이드 | 페놀산 | |
| GHP 1:1:4 | 11 | 24 | 10 |
| GHP 1:1:5 | 12 | 27 | 9 |
| GHP 1:1.5:3 | 10 | 21 | 8 |
| GHP 1:1.5:5 | 11 | 24 | 10 |
| GHP 1:2:3 | 11 | 20 | 7 |
| GHP 1:2:6 | 12 | 25 | 11 |
상기 6가지 용매는 10 내지 12 ㎎/100 g의 추출물의 농도에 의해 특정되는 유사한 플라보노이드 추출 성능을 보인다. 페놀산에 관한 그 추출 성능의 경우에는 20 내지 27 ㎎/100 g의 추출물이다.
본 실시예에서 테스트된 모든 용매는 화장품에서 사용하기에 효과적인 수의 플라보노이드 및 페놀산을 포함하는 무라야 코에니기이의 추출물을 수득하기에 효과적이다. 플라보노이드 및 페놀산의 추출을 위한 가장 효율적인 용매는 1:1:5의 몰 비율의 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어지는 용매이다.
3/ 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물과 다른 추출물의 페놀산, 플라보노이드 및 알칼로이드 함량의 비교
실시예 1에 기술된 4가지 무라야 코에니기이 추출물의 알칼로이드, 페놀산, 및 플라보노이드 함량을 RP-HPLC-UV에 의해 평가하였다. 페놀산은 287 nm에서 네오클로로겐산의 눈금 선에 대해 확인 및 정량하였고, 플라보노이드는 355 nm에서 이소퀘르시트린의 눈금 선에 대해 점을 찍고 정량하였으며, 알칼로이드는 287 nm에서 마하님빈의 눈금 선에 대해 확인 및 정량하였다.
수득된 결과는 도 1에 도시되어 있다.
4가지 추출물의 조성물은 연구된 3가지 패밀리의 2차 대사물에 관한 정성적 및 정량적 관점에서 명확하게 구별된다. 따라서:
- 추출물 1(본 발명에 따른 GHP115)은 가장 높은 농도의 페놀산, 추출물 2 및 3의 경우와 동등한 농도의 플라보노이드, 및 미량의 알칼로이드의 존재에 의해 특정된다;
- 추출물 2는 각각의 3가지 패밀리의 화합물(페놀산, 플라보노이드, 및 알칼로이드)에 대한 현저한 농도에 의해 특정된다;
- 추출물 3은 추출물 2와 폴리페놀의 농도가 유사하지만 미량의 알칼로이드만을 함유하는 것에 의해 특정된다; 및
- 추출물 4는 추출물 2와 알칼로이드의 농도가 유사하지만 폴리페놀을 함유하지 않는 것에 의해 특정된다.
상기 내용으로부터, 1:1:5의 몰 비율의 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어지는 본 발명에 따른 용매만이 플라보노이드 및 페놀산이 풍부하고 미량 상태로 매우 낮은 함량의 알칼로이드를 갖는 무라야 코에니기이의 추출물을 수득하는 것을 가능하게 함이 명확하다.
4/ 식물/용매 비를 갖는 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물에서 페놀산, 플라보노이드 및 알칼로이드 함량의 비교
실시예 1에 기술된 무라야 코에니기이의 추출물 1 및 추출물 1a의 알칼로이드, 페놀산 및 플라보노이드 함량을 실시예 3에 기술된 조건 하에 RP-HPLC-UV에 의해 평가하였다.
그 결과는 아래의 표 3에 기술되어 있다.
| 농도 (㎎/100 g의 추출물) | ||||
| 추출물 | 식물/용매 비 | 페놀산 | 플라보노이드 | 알칼로이드 |
|
추출물
1a |
5:95 | 45 | 26 | 미량 |
| 추출물 1 | 8:92 | 92 | 57 | 5 |
상기 결과로부터, 식물/용매 비를 5:95(추출물 1a)로 감소시키면, 8:92 비(추출물 1)와 비교하여 정량하기 어려운 미량의 알칼로이드를 함유하지만 관심있는 농도의 페놀산 및 플라보노이드를 제공하는 추출물을 수득하는 것을 가능하게 하는 것으로 보인다.
5/ 탄성 섬유의 형성과 관련된 단백질의 발현에 대한 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물(추출물 1)의 효과의 연구
5.1/ 방법
실시예 1에서 기술된 무라야 코에니기이의 4가지 추출물(추출물 1, 2, 3 및 4)로 처리되거나 처리되지 않은 정상 인간 진피 섬유아세포에서 단백질 함량(프로테옴) 및 그 발현 편차를 나노-액체 크로마토그래피-직렬 질량 분광법(나노 LC-MS/MS)에 의해 확인하였다. 상기 분석 방법은 정량성, 민감성, 및 재현가능성이며, 생물정보학 분석(CORAVALID)에 의해 세포에서 발현되는 단백질의 확인을 가능하게 한다.
5.2/ 프로토콜
상기 프로테옴 연구는 실시예 1에 기술된 4가지 무라야 코에니기이 잎 추출물로 처리된 세포와 비교하여 비처리된(UT) 세포에서 발현되는 단백질의 정성적 및 정량적 분석으로 이루어진다. 상기 4가지 추출물은 그 최대 비-독성 농도, 즉 추출물 1(본 발명)은 0.2%, 추출물 2(프로판디올/물)는 0.04%, 추출물 3(에탄올/물)은 1%, 및 추출물 4(에탄올)는 0.1%에서 테스트하고, 24시간 동안 세포 배양 배지에서 인큐베이션한다.
이후, 상기 섬유아세포를 냉각된 포스페이트-식염수 버퍼로 세척하고, 회수한 후, -80℃에서 냉동시킨다. 단백질 용해물(lysate) 및 대응하는 펩티드 추출물을 위스니우스키 JR 등(Wisniewski JR et al, Nat Methods. 2009; 6(5):359-62)에 의해 기술된 방법에 DEK라 수득한다.
250 ng의 펩티드를 C18 프리-컬럼(300 ㎛ × 5 ㎜; 입자 직경 5 ㎛; Thermo Scientific) 내로 주입한 후, C18 컬럼(75 ㎛ × 500 ㎜; 입자 직경 2 ㎛; Thermo Scientific)으로 용출한다. Ultimate 3000 장비(Dionex)를 이용하여 300 nl/분의 유속에서 60분 동안 60-35% 아세토니트릴 구배(gradient)를 적용함으로써 액체 나노-크로마토그래피를 수행한다. Q-Exactive 질량 분석기(Thermo Scientific)를 이용해 데이터를 생성한다.
세포의 프로테옴을 UNIPROT 데이터베이스에서 SEQUEST-HT 알고리즘을 이용해 분석한다. 미노라(Minora) 알고리즘에 의해 단백질 정량화를 수행하고, 무라야 코에니기이 추출물로 처리된 세포/비처리된 세포의 비를 쌍별 비 기반 방법을 이용해 계산한 후, 생성된 모든 데이터의 기하 중앙값(geometric median)으로 나타낸다.
상기 연구는 3회의 독립적 실험(n=3)에 기반한다. 수행된 추정 테스트는 비처리된 섬유아세포 대 실시예 1에 기술된 4가지 무라야 코에니기이 추출물로 처리된 섬유아세포의 프로테옴을 비교하기 위한 분산의 분석(ANOVA)이었다.
5.3/ 결과
상기 연구는 탄성 섬유와 관련되는 4가지 단백질을 확인하였고, 그 발현은 무라야 코에니기이의 베타인/프로판디올/물 추출물(몰 비 1:1:5)로 처리된 진피 섬유아세포에서 현저하게 증가하였다.
상기 결과는 표 4에 나타나 있으며, 3회의 실험에 걸쳐 평균한 무라야 코에니기이 추출물로 처리된 세포/비처리된 세포의 발현 비로 나타낸다.
| 단백질 | 추출물 1/비처리의 비 | p 값 |
| 엘라스틴 | 2.18 | 6.6E-14 |
| 피브릴린-1 | 2.18 | 1.0E-17 |
| 피브릴린-2 | 2.07 | 2.8E-12 |
| 피불린-5 | 1.69 | 9.4E-11 |
놀랍게도, 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물(추출물 1: GHP115)만이 정상 인간 진피 섬유아세포에서 엘라스틴 및 그 3가지 파트너인 피브릴린-1, 피브릴린-2, 및 피불린-5의 단백질 발현을 현저하게 증가시킨다. 다른 3가지 추출물(추출물 2: 프로판디올/물; 추출물 3: 에탄올/물 및 추출물 4: 에탄올)은 탄성 섬유 단백질에 대한 영향이 없다(데이터는 나타내지 않음).
5.4/ 결론
베타인/프로판디올/물 혼합물(몰 비 1:1:5; 추출물 1)로 이루어진 용매에 의해 수득된 본 발명에 따른 무라야 코에니기이의 추출물은 탄성 섬유에 속하는 단백질의 발현을 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 베타인/프로판디올/물 추출물로 처리된 정상 인간 진피 섬유아세포는 피부 탄성 섬유의 재생 및 교체에 유리한 표현형을 나타낸다.
6/ 정상 인간 섬유아세포의 2D 배양에서 엘라스틴, 피브릴린-1, 및 피불린-5 합성에 대한 무라야 코에니기이 추출물(추출물 1 및 1a)의 효과의 연구
6.1/ 방법
본 연구는 무라야 코에니기이의 본 발명에 따른 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1:1:5)로 처리되거나 처리되지 않은 진피 섬유아세포의 단층 배양물에 침적된 엘라스틴, 피브릴린-1 및 피불린-5 합성을 측정하기 위하여 이미지 문석과 커플링된 인 시투(in situ) 형광 면역염색을 이용한다.
6.2/ 프로토콜
정상 인간 진피 섬유아세포를 0.2%의 최종 농도로 실시예 1에서 수득된 무라야 코에니기이의 본 발명에 따른 추출물(베타인/프로판디올/물 및 몰 비 1:1:5)(추출물 1 및 1)로 48시간 동안 처리한다. 비처리(UT) 세포를 대조군으로 사용한다. 이후, 상기 세포를 포스페이트-식염수 버퍼로 세척한 후, 1% BSA(소 혈청 알부민)로 30분 동안 고정 및 포화시킨다. 세포를 1차 항체(항-엘라스틴; 항-피브릴린-1 또는 항-피불린-5)로 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS 버퍼로 세척한 후, Alexa 594 형광색소(fluorochrome)-결합 2차 항체로 1시간 동안 인큐베이션한다. 형광은 적절한 필터를 갖는 Cytation 5 이미징 분광광도계(Biotek) 상에서 판독한다. 공통 획득 파라미터(common acquisition parameter)에 대하여 이미지 분석에 의한 형광 측정을 수행한다.
상기 연구는 3회의 독립적 실험(n=3)에 기반한다. 통계적 테스트는 비처리된 진피 섬유아세포 배양물 대 본 발명에 따른 무라야 코에니기이의 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1:1:5)로 처리된 섬유아세포에서 침적된 관심있는 단백질의 합성을 비교하기 위한 2 Way- ANOVA와, 이어지는 본페로니(Bonferroni) 다중 비교이다.
6.3/ 결과
6.3.1/ 엘라스틴 합성
본 발명자들은 무라야 코에니기이의 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1:1:5)로 처리되거나 처리되지 않은 진피 섬유아세포에 침적된 엘라스틴 합성을 정량하였다. 상기 결과는 표 5에 나타나 있으며, 비처리 세포(UT)의 %로 나타낸다. 값들은 3회의 모든 실험(n=3)에서의 평균±표준 편차로 나타낸다.
| 비처리 | 추출물 1 | 추출물 1a | |
| Exp_1 | 100±34 | 158±38 | 150±22 |
| Exp_2 | 100±21 | 151±26 | 168±27 |
| Exp_3 | 100±23 | 178±21 | 172±20 |
| n = 3 | 62%±14 | 63%±12 | |
| 통계: ****: p<0.0001 | **** | **** | |
동등한 방식으로, 본 발명에 따라 수득된 무라야 코에니기이 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1:1:5)는 진피 섬유아세포 내에서 침적된 엘라스틴의 단백질 합성에서의 현저한 증가를 유도한다(각각 +62% 및 +63%).
추출 용매 단독(무라야 코에니기이가 없는 1:1:5 몰 비의 베타인/프로판디올/물)은 침적된 엘라스틴 합성에서의 증가를 유도하지 않는다(데이터는 나타내지 않음).
6.3.2/ 피브릴린-1의 합성
본 발명자들은 무라야 코에니기이 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1:1:5)로 처리되거나 처리되지 않은 진피 섬유아세포에 침적된 피브릴린-1의 합성을 정량하였다. 상기 결과는 표 6에 나타나 있고, 비처리 세포(UT)의 %로 나타낸다. 값들은 3회의 모든 실험(n=3)에서의 평균±표준 편차로 나타낸다.
| 비처리 | 추출물 1 | 추출물 1a | |
| Exp_1 | 100±11 | 189±16 | 152±30 |
| Exp_2 | 100±32 | 129±44 | 137±26 |
| Exp_3 | 100±43 | 140±38 | 128±33 |
| n = 3 | 53%±32 | 39%±12 | |
| 통계: ****: p<0.0001 | **** | ** | |
본 발명에 따라 수득된 무라야 코에니기이 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1: 1:5)는 진피 섬유아세포에 침적된 피브릴린-1의 단백질 합성에서의 현저한 증가를 유도한다. 추출물 1(+53%)은 추출물 1a(+39%)보다 진피 섬유아세포에서 피브릴린-1의 단백질 합성을 보다 강하게 증가시키지만, 추출물 1 및 1a는 통계적으로 상이하지는 않다.
추출 용매 단독(무라야 코에니기이가 없는 1:1:5 몰 비의 베타인/프로판디올/물)은 침적된 피브릴린-1 합성에서의 증가를 유도하지 않는다(데이터는 나타내지 않음).
6.3.3/ 피브릴린-5의 합성
본 발명자들은 무라야 코에니기이의 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1:1:5)로 처리되거나 처리되지 않은 진피 섬유아세포에 침적된 피불린-5의 합성을 정량하였다. 상기 결과는 표 7에 나타나 있고, 비처리 세포(UT)의 %로 나타낸다. 값들은 3회의 모든 실험(n=3)에서의 평균±표준 편차로 나타낸다.
| 비처리 | 추출물 1 | 추출물 1a | |
| Exp_1 | 100±53 | 260±121 | 162±56 |
| Exp_2 | 100±56 | 222±133 | 196±74 |
| Exp_3 | 100±36 | / | 221±131 |
| n = 3 | 141%±27 | 93%±30 | |
| 통계: ****: p<0.0001 | **** | **** | |
본 발명에 따라 수득된 무라야 코에니기이 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1:1:5)는 진피 섬유아세포에 침적된 피브릴린-5의 단백질 합성에서의 현저한 증가를 유도한다. 추출물 1(+141%)은 추출물 1a(+93%)보다 진피 섬유아세포에서 피불린-5의 단백질 합성을 보다 강하게 증가시킨다.
추출 용매 단독(무라야 코에니기이가 없는 1:1:5 몰 비의 베타인/프로판디올/물)은 피불린-5 합성에서의 증가를 유도하지 않는다(데이터는 나타내지 않음).
6.4/ 결론
본 발명에 따른 무라야 코에니기이의 추출물 1 및 1a(베타인/프로판디올/물, 몰 비 1:1:5)는 진피에서 탄성 네트워크의 단백질 합성에서의 개선을 유도한다.
7/ 조성물의 실시예 - 천연 보습 크림 겔
| 성분명 | 조성물(질량%) |
| Emulium® Mellifera | 2.5 |
| 천연 스쿠알렌 | 2.0 |
| 디카프릴릴 카보네이트 | 15.0 |
| 탈염수 | QS100 |
| 글리세린 | 20.0 |
| 타피오카 전분 | 5.0 |
| 본 발명에 따른 무라야 코에니기이 추출물 | 2.0 |
| 에틸헥실글리세린 | 0.1 |
| 페녹시에탄올 | 0.9 |
| 향수 | 0.2 |
| 합계 | 100 |
Claims (13)
- 고체/액체 추출 공정과, 이어지는 제2 고체/액체 분리 단계와, 마지막으로 액상을 회수하기 위한 제3 단계에 의해 수득가능한 무라야 코에니기이의 추출물; 또는 상기 추출물을 포함하는 조성물;의 피부 노화를 방지하기 위한 용도로서,
그 용매는 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어지고, 여기서 상기 베타인:프로판디올의 몰 비율은 1:정확히 1.5 미만인 것을 특징으로 하는 용도. - 청구항 1에 있어서,
피부 탄성섬유발생의 공정을 자극하기 위한 용도. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
피부 탄성 섬유의 형성을 자극하기 위한 용도. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
피부 세포외 기질의 밀도를 높이기 위한 용도. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
피부 느슨함을 방지하기 위한 용도. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용매는 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어지고, 여기서 베타인:프로판디올의 몰 비율은 1:1인 것을 특징으로 하는 용도. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 물은 용매의 15 내지 35 중량%를 나타내는 것을 특징으로 하는 용도. - 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
상기 용매는 1:1:5의 몰 비율의 베타인, 프로판디올 및 물의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 용도. - 고체/액체 추출 공정과, 이어지는 제2 고체/액체 분리 단계와, 마지막으로 제3 액상 회수 단계에 의해 수득가능한 무라야 코에니기이의 추출물로서,
그 용매는 유리하게는 1:1:5의 몰 비율의 베타인, 프로판디올, 및 물의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 추출물. - 청구항 9에 있어서,
유리하게는 건조된 엽상 자루 및/또는 잎의 추출물인 것을 특징으로 하는 추출물. - 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
알칼로이드가 부재한 것을 특징으로 하는 추출물. - 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
1:99 내지 50:50의 무라야 코에니기이의 잎 줄기 및/또는 잎/용매의 질량 비를 갖는 것을 특징으로 하는 추출물. - 청구항 9 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 따른 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
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