KR20220132593A - 톨-유사 수용체 7 (TLR7) 효능제로서의 1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘 화합물 - Google Patents

톨-유사 수용체 7 (TLR7) 효능제로서의 1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘 화합물 Download PDF

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KR20220132593A
KR20220132593A KR1020227029272A KR20227029272A KR20220132593A KR 20220132593 A KR20220132593 A KR 20220132593A KR 1020227029272 A KR1020227029272 A KR 1020227029272A KR 20227029272 A KR20227029272 A KR 20227029272A KR 20220132593 A KR20220132593 A KR 20220132593A
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alkanediyl
mmol
cycloalkyl
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매튜 콕스
나이두 에스. 초우다리
아쉬비니쿠마르 브이. 가바이
산지브 강와르
크리스틴 엠. 타비
얌 포우델
무루가이아 안다판 무루가이아 수바이아
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

화학식 I 또는 II에 따른 화합물은 톨-유사 수용체 7 (TLR7)의 효능제로서 유용하다. 이러한 화합물은 암 치료, 특히 항암 면역요법제와 조합하여 또는 백신 보조제로서 사용될 수 있다.

Description

톨-유사 수용체 7 (TLR7) 효능제로서의 1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘 화합물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하의 2020년 7월 29일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/058230 및 2020년 1월 27일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/966144의 이익을 청구하고; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
개시내용의 배경
본 개시내용은 톨-유사 수용체 7 ("TLR7") 효능제 및 그의 접합체, 및 이러한 효능제 및 그의 접합체의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
톨-유사 수용체 ("TLR")는 특정 클래스의 병원체 내에 보존된 소분자 모티프인 병원체-연관 분자 패턴 ("PAMP")을 인식하는 수용체이다. TLR은 세포의 표면 상에 또는 세포내에 위치될 수 있다. TLR과 동족 PAMP의 결합에 의한 TLR의 활성화는 숙주 내에서 연관된 병원체의 존재- 즉, 감염 -를 신호전달하여, 숙주의 면역계가 감염과 싸우도록 자극한다. 인간은 TLR1, TLR2, TLR3 등으로 명명되는 10종의 TLR을 갖는다.
효능제에 의한 TLR의 활성화는 - TLR7이 가장 많이 연구됨 - 전체적인 면역 반응을 자극함으로써, 실제 병원체 감염 이외의 다양한 상태의 치료에서 백신 및 면역요법제의 작용에 대한 긍정적인 효과를 가질 수 있다. 따라서, 백신 보조제로서의 또는 암 면역요법에서 인핸서로서의 TLR7 효능제의 사용에 상당한 관심이 있다. 예를 들어, 문헌 [Vasilakos and Tomai 2013, Sato-Kaneko et al. 2017, Smits et al. 2008, 및 Ota et al. 2019]을 참조한다.
엔도솜의 막에 위치된 세포내 수용체인 TLR7은 단일-가닥 RNA 바이러스와 연관된 PAMP를 인식한다. 그의 활성화는 제I형 인터페론 예컨대 IFNα 및 IFNβ의 분비를 유도한다 (Lund et al. 2004). TLR7은 2개의 결합 부위를 가지며, 하나는 단일 가닥 RNA 리간드에 대한 것이고 (Berghoefer et al. 2007), 하나는 소분자 예컨대 구아노신에 대한 것이다 (Zhang et al. 2016).
TLR7은 구아노신-유사 합성 효능제 예컨대 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린 스캐폴드에 기반한 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 가르디퀴모드에 결합하고, 그에 의해 활성화될 수 있다. 소분자 TLR7 효능제의 검토를 위해, 문헌 [Cortez and Va 2018]을 참조한다.
Figure pct00001
프테리디논 분자 스캐폴드에 기반한 합성 TLR7 효능제는 베사톨리모드에 의해 예시된 바와 같이 공지되어 있다 (Desai et al. 2015).
Figure pct00002
퓨린-유사 스캐폴드에 기반한 다른 합성 TLR7 효능제는 빈번하게 화학식 (A)에 따라 개시된 바 있다:
Figure pct00003
여기서 R, R', 및 R"은 구조적 가변기이고, R"은 전형적으로 비치환되거나 또는 치환된 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 함유한다.
퓨린-유사 스캐폴드를 갖는 생물활성 분자 및 상태 예컨대 섬유증, 염증성 장애, 암 또는 병원성 감염을 치료하기 위한 그의 용도에 대한 개시내용은 하기를 포함한다: Akinbobuyi et al. 2015 and 2016; Barberis et al. 2012; Carson et al. 2014; Ding et al. 2016, 2017a, and 2017b; Graupe et al. 2015; Hashimoto et al. 2009; He et al. 2019a and 2019b; Holldack et al. 2012; Isobe et al. 2009a and 2012; Poudel et al. 2019a and 2019b; Pryde 2010; 및 Young et al. 2019.
기 R"는 피리딜일 수 있다: Bonfanti et al. 2015a and 2015b; Halcomb et al. 2015; Hirota et al. 2000; Isobe et al. 2002, 2004, 2006, 2009a, 2009b, 2011, and 2012; Kasibhatla et al. 2007; Koga-Yamakawa et al. 2013; Musmuca et al. 2009; Nakamura 2012; Ogita et al. 2007; 및 Yu et al. 2013.
화학식 (A)의 6,5-융합 고리계 - 이미다졸 5원 고리에 융합된 피리미딘 6원 고리 -가 변형된 것인 관련 분자의 개시내용이 존재한다. (a) 문헌 [Dellaria et al. 2007, Jones et al. 2010 and 2012, 및 Pilatte et al. 2017]은 피리미딘 고리가 피리딘 고리로 대체된 것인 화합물을 개시한다. (b) 문헌 [Chen et al. 2011, Coe et al. 2017, Poudel et al. 2020a and 2020b, 및 Zhang et al. 2018]은 이미다졸 고리가 피라졸 고리로 대체된 것인 화합물을 기재한다. (c) 문헌 [Cortez et al. 2017 and 2018; Li et al. 2018; 및 McGowan et al. 2016a, 2016b, and 2017]은 이미다졸 고리가 피롤 고리로 대체된 것인 화합물을 기재한다.
문헌 [Bonfanti et al. 2015b and 2016 및 Purandare et al. 2019]는 퓨린 모이어티의 2개의 고리가 마크로사이클에 의해 가교된 것인 TLR7 조정제를 개시하고 있다:
TLR7 효능제는 예를 들어 인지질, 폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG"), 항체 또는 또 다른 TLR (통상적으로 TLR2)일 수 있는 파트너 분자에 접합될 수 있다. 예시적인 개시내용은 하기를 포함한다: Carson et al. 2013, 2015, and 2016, Chan et al. 2009 and 2011, Cortez et al. 2017, Gadd et al. 2015, Lioux et al. 2016, Maj et al. 2015, Vernejoul et al. 2014, 및 Zurawski et al. 2012. 빈번한 접합 부위는 화학식 (A)의 R" 기이다.
문헌 [Jensen et al. 2015]은 TLR7 효능제의 전달을 위한 양이온성 지질 비히클의 용도를 개시하고 있다.
레시퀴모드를 포함하여, 일부 TLR7 효능제는 이중 TLR7/TLR8 효능제이다. 예를 들어 문헌 [Beesu et al. 2017, Embrechts et al. 2018, Lioux et al. 2016, 및 Vernejoul et al. 2014]을 참조한다.
제1 저자 또는 발명자 및 연도에 따른 본원에 인용된 문헌에 대한 정식 인용은 본 명세서의 말미에 열거되어 있다.
개시내용의 간단한 요약
본 명세서는 TLR7 효능제로서의 활성을 갖는, 1H-피라졸로[4,3d]피리미딘 방향족계를 갖는 화합물에 관한 것이다.
Figure pct00004
한 측면에서, 화학식 (I) 또는 (II)에 따른 구조를 갖는 화합물이 제공된다.
Figure pct00005
여기서
각각의 X는 독립적으로 N 또는 CR2이고;
W는 R3 또는
Figure pct00006
이고;
R1은 (C1-C5 알킬),
(C2-C5 알케닐),
(C1-C8 알칸디일)0-1(C3-C6 시클로알킬),
(C1-C8 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
(C2-C8 알칸디일)OH,
(C2-C8 알칸디일)O(C1-C3 알킬),
(C1-C4 알칸디일)0-1(5-6원 헤테로아릴),
(C1-C4 알칸디일)0-1페닐,
(C1-C4 알칸디일)CF3,
(C2-C8 알칸디일)N[C(=O)](C1-C3 알킬),
또는
(C2-C8 알칸디일)NRxRy
이고;
각각의 R2는 독립적으로 H, O(C1-C3 알킬), S(C1-C3 알킬), SO2(C1-C3 알킬), C1-C3 알킬, O(C3-C4 시클로알킬), S(C3-C4 시클로알킬), SO2(C3-C4 시클로알킬), C3-C4 시클로알킬, Cl, F, CN; 또는 [C(=O)]0-1NRxRy이고;
R3은 NH2,
NH[C(=O)]0-1(C1-C5 알킬),
N(C1-C5 알킬)2,
NH[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C8 시클로알킬),
NH[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C4-C10 비시클로알킬),
NH[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
N(C3-C6 시클로알킬)2,
N[C1-C3 알킬]C(=O)(C1-C6 알킬),
NH(SO2)(C1-C5 알킬),
NH(SO2)(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C8 시클로알킬),
NH(SO2)(C1-C4 알칸디일)0-1(C4-C10 비시클로알킬),
NH(SO2)(C1-C4 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
6-원 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티,
5-원 헤테로방향족 모이어티, 또는
하기 구조를 갖는 모이어티
Figure pct00007
이고;
R5는 H, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C3-C6 시클로알킬, 할로, O(C1-C5 알킬), (C1-C4 알칸디일)OH, (C1-C4 알칸디일)O(C1-C3 알킬), 페닐, NH(C1-C5 알킬), 5 또는 6원 헤테로아릴,
Figure pct00008
이고;
R6은 NH2,
(NH)0-1(C1-C5 알킬),
N(C1-C5 알킬)2,
(NH)0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C8 시클로알킬),
(NH)0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C4-C10 비시클로알킬),
(NH)0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
N(C3-C6 시클로알킬)2,
또는
하기 구조를 갖는 모이어티
Figure pct00009
이고;
R7 및 R8은 독립적으로
C1-C4 알킬,
C2-C4 알킬렌,
C3-C4 시클로알킬
이거나, 또는 R7 및 R8은 이들이 결합되어 있는 탄소와 조합되어 3- 내지 7-원 시클로알킬 모이어티를 형성하고;
Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 Rx 및 Ry는 이들이 결합되어 있는 질소와 조합되어 3- 내지 7-원 헤테로사이클을 형성하고;
여기서 R1, R2, R3, R5, R6, R7, 및 R8에서
알킬 모이어티, 알칸디일 모이어티, 시클로알킬 모이어티, 또는 하기 화학식
Figure pct00010
의 모이어티는 OH, 할로, CN, (C1-C3 알킬), O(C1-C3 알킬), C(=O)(C1-C3 알킬), SO2(C1-C3 알킬), NRxRy, (C1-C4 알칸디일)OH, (C1-C4 알칸디일)O(C1-C3 알킬)로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
알킬, 알칸디일, 시클로알킬, 또는 하기 화학식
Figure pct00011
의 모이어티는 CH2 기가
O, SO2, CF2, C(=O), NH,
N[C(=O)]0-1(C1-C3 알킬),
N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)CF3,
N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)OH,
또는
N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C5 시클로알킬)
로 대체될 수 있다.
본원에 개시된 화합물은 TLR7 효능제로서 활성을 갖고, 일부는 의도된 작용의 표적 조직 또는 기관에 대한 표적화 전달을 위해 항체에 접합될 수 있다. 이들은 또한 PEG화되어 이들의 제약 특성을 조정할 수 있다.
본원에 개시된 화합물 또는 그의 접합체 또는 그의 PEG화 유도체는 면역계의 활성화에 의한 치료에 적용가능한 상태를 앓는 대상체에게 치료 유효량의 이러한 화합물 또는 그의 접합체 또는 그의 PEG화 유도체를 특히 백신 또는 암 면역요법제와 조합하여 투여함으로써, 상기 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
개시내용의 상세한 설명
화합물
한 측면에서, W는 R3이다.
한 측면에서, 화학식 (I)에서 모이어티
Figure pct00012
는
Figure pct00013
이다.
한 측면에서, 화학식 (II)에서 모이어티
Figure pct00014
는
Figure pct00015
이다.
한 측면에서, 본 개시내용의 화합물은 R1, R3, R7 및 R8이 화학식 (I)에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia)에 따른 것이다:
Figure pct00016
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 화합물은 R1, R3, R7 및 R8이 화학식 (II)에 정의된 바와 같은 화학식 (IIa)에 따른 것이다:
Figure pct00017
한 실시양태에서, 각각의 R7 및 R8은 C1-C4 알킬이다. 그러나, 이러한 예에서, R7 및 R8은 반드시 동일한 C1-C4 알킬인 것은 아니다.
또 다른 실시양태에서, R7 및 R8은 둘 다 Me이다.
또 다른 실시양태에서,
Figure pct00018
는
Figure pct00019
이다.
또 다른 실시양태에서, R7 및 R8은 이들이 결합되어 있는 탄소와 조합되어 3- 내지 7-원 시클로알킬 모이어티를 형성한다. 임의로, 이러한 시클로알킬 모이어티는 CH2 기가 O로 대체되고; 바람직하게는
Figure pct00020
는
Figure pct00021
가 되도록 옥세타닐 고리를 형성한다.
적합한 기 R1의 예는
Figure pct00022
를 포함한다.
R2는 바람직하게는 OMe, O(시클로프로필), 또는 OCHF2, 보다 바람직하게는 OMe이다.
한 측면에서, R5는 H이다.
한 측면에서, 화학식 (Ia) 또는 (IIa)에 따른 화합물이 제공된다.
Figure pct00023
여기서
R1은
Figure pct00024
이고;
Figure pct00025
는
Figure pct00026
이다.
또 다른 측면에서, 화학식 (I') 또는 (II')에 따른 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
Figure pct00027
여기서
각각의 X는 독립적으로 N 또는 CR2이고;
R1은 (C1-C5 알킬),
(C2-C5 알케닐),
(C1-C8 알칸디일)0-1(C3-C6 시클로알킬),
(C1-C8 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
(C2-C8 알칸디일)OH,
(C2-C8 알칸디일)O(C1-C3 알킬),
(C1-C4 알칸디일)0-1(5-6원 헤테로아릴),
(C1-C4 알칸디일)0-1페닐,
(C1-C4 알칸디일)CF3,
(C2-C8 알칸디일)N[C(=O)](C1-C3 알킬),
또는
(C2-C8 알칸디일)NRxRy
이고;
각각의 R2는 독립적으로 H, O(C1-C3 알킬), S(C1-C3 알킬), SO2(C1-C3 알킬), C1-C3 알킬, O(C3-C4 시클로알킬), S(C3-C4 시클로알킬), SO2(C3-C4 시클로알킬), C3-C4 시클로알킬, Cl, F, CN; 또는 [C(=O)]0-1NRxRy이고;
R5는 H, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C3-C6 시클로알킬, 할로, O(C1-C5 알킬), (C1-C4 알칸디일)OH, (C1-C4 알칸디일)O(C1-C3 알킬), 페닐, NH(C1-C5 알킬), 5 또는 6원 헤테로아릴,
Figure pct00028
이고;
R7 및 R8은 독립적으로
C1-C4 알킬,
C2-C4 알킬렌,
C3-C4 시클로알킬
이거나, 또는 R7 및 R8은 이들이 결합되어 있는 탄소와 조합되어 3- 내지 7-원 시클로알킬 모이어티를 형성하고;
Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 Rx 및 Ry는 이들이 결합되어 있는 질소와 조합되어 3- 내지 7-원 헤테로사이클을 형성하고;
여기서 R1, R2, R5, R7, 및 R8에서
알킬 모이어티, 알칸디일 모이어티, 시클로알킬 모이어티, 또는 하기 화학식
Figure pct00029
의 모이어티는
OH, 할로, CN, (C1-C3 알킬), O(C1-C3 알킬), C(=O)(C1-C3 알킬), SO2(C1-C3 알킬), NRxRy, (C1-C4 알칸디일)OH, (C1-C4 알칸디일)O(C1-C3 알킬)로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
알킬, 알칸디일, 시클로알킬, 또는 하기 화학식
Figure pct00030
의 모이어티는 CH2 기가
O, SO2, CF2, C(=O), NH,
N[C(=O)]0-1(C1-C3 알킬),
N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)CF3,
N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)OH,
또는
N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C5 시클로알킬)
로 대체될 수 있다.
또 다른 측면에서, 화학식 (Ia')에 따른 구조를 갖는 화합물이 제공된다.
Figure pct00031
여기서
R1은
Figure pct00032
이고,
Figure pct00033
는
Figure pct00034
이다.
본원에 개시된 화합물의 구체적 예는 하기 표 A에 제시된다. 표는 또한 하기 생물학적 활성과 관련된 데이터를 제공한다: 하기 제공된 절차에 따라 결정된, 인간 TLR7 효능작용 (리포터) 검정 및/또는 인간 전혈에서의 CD69 유전자의 유도. 가장 우측 칼럼은 정보 분석 데이터 (질량 스펙트럼, HPLC 체류 시간, 및 NMR)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물은 (a) 1,000 nM 미만의 인간 TLR7 (hTLR7) 리포터 검정 EC50 값 및 (b) 1,000 nM 미만의 인간 전혈 (hWB) CD69 유도 EC50 값을 갖는다. (검정이 다수회 수행되는 경우에, 보고된 값은 평균임).
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
제약 조성물 및 투여
또 다른 측면에서, 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제제화되는, 본원에 개시된 화합물 또는 그의 접합체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 이는 1종 이상의 추가의 제약 활성 성분, 예컨대 생물학적 또는 소분자 약물을 임의로 함유할 수 있다. 제약 조성물은 또 다른 치료제, 특히 항암제와의 조합 요법으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 1종 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장화제, 및 그의 조합을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 용도는 문헌 [Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에 교시되어 있다.
바람직하게는, 제약 조성물은 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 이를 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 이를 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다. 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 제약 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 형태일 수 있다. 그들은 또한 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도를 달성하기에 적합한 다른 정렬된 구조로 제제화될 수 있다. 조성물은 또한 투여 전에 물 중 재구성을 위해, 동결건조물 형태로 제공될 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상체 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이며, 일반적으로 치료 효과를 생성시키는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로 100%를 기준으로, 이 양은 제약상 허용되는 담체와 조합된 활성 성분의 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 활성 성분의 약 1% 내지 약 30% 범위일 것이다.
투여 요법은 치료 반응을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량이 상황의 위급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. "투여 단위 형태"는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 목적하는 치료 반응을 생성시키도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을, 필요한 제약 담체와 함께 함유한다.
투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 통상적으로 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg, 또는 대안적으로 0.1 내지 5 mg/kg 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여이다. 바람직한 투여 요법은 하기 투여 스케줄 중 하나를 사용하여, 정맥내 투여를 통한 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함한다: (i) 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg 체중 1회에 이은 3주마다 1 mg/kg 체중. 일부 방법에서, 투여량은 약 1-1000 μg/mL, 및 일부 방법에서는 약 25-300 μg/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다.
"치료 유효량"의 본 발명의 화합물은 바람직하게는 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간에서의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 생성시킨다. 예를 들어, 종양-보유 대상체의 치료를 위해, "치료 유효량"은 바람직하게는 종양 성장을 비치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 치료 유효량의 치료 화합물은 전형적으로 인간이지만 또 다른 포유동물일 수 있는 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나 또는 증상을 달리 호전시킬 수 있다. 2종 이상의 치료제가 조합 치료로 투여되는 경우에, "치료 유효량"은 개별적으로 각 작용제의 효능이 아닌 조합의 전체로서의 효능을 지칭한다.
제약 조성물은 임플란트, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 또는 지속 방출 제제일 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 의료 장치 예컨대 (1) 무바늘 피하 주사 장치; (2) 마이크로-주입 펌프; (3) 경피 장치; (4) 주입 장치; 및 (5) 삼투 장치를 통해 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 생체내에서 적절한 분포가 보장되도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 화합물이 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 것을 보장하기 위해, 이들은 리포솜 중에 제제화될 수 있으며, 이는 특이적 세포 또는 기관에 대한 선택적 수송을 증진하기 위한 표적화 모이어티를 추가적으로 포함할 수 있다.
산업상 적용성 및 용도
본원에 개시된 TLR7 효능제 화합물은 TLR7의 활성화에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 상태의 치료에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, TLR7 효능제는 면역-종양학 작용제로도 알려져 있는 항암 면역요법제와 조합으로 사용된다. 항암 면역요법제는 신체의 면역계를 자극하여, 특히 T 세포의 활성화를 통해 암 세포를 공격하고 파괴함으로써 작용한다. 면역계는 수많은 체크포인트 (조절) 분자를 가져, 면역계가 적당한 표적 세포를 공격하는 것과 면역계가 건강한 정상 세포를 공격하는 것을 방지하는 것 사이의 균형을 유지하도록 돕는다. 일부는 그의 결속이 T 세포 활성화를 촉진하고, 면역 반응을 증진시키는 것을 의미하는 자극제 (상향-조절자)이다. 다른 것은 그의 결속이 T 세포 활성화를 억제하고, 면역 반응을 감소시키는 것을 의미하는 억제제 (하향-조절자 또는 브레이크)이다. 효능작용 면역요법제의 자극성 체크포인트 분자로의 결합은 후자의 활성화 및 암 세포에 대한 증진된 면역 반응으로 이어질 수 있다. 반대로, 길항작용 면역요법제의 억제 체크포인트 분자로의 결합은 후자에 의한 면역계의 하향-조절을 방지하고, 암 세포에 대한 격렬한 반응을 유지하는 것을 보조할 수 있다. 자극성 체크포인트 분자의 예는 B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, CD40, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 및 CD28H이다. 억제 체크포인트 분자의 예는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, 갈렉틴 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, 갈렉틴-1, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, CD96 및 TIM-4이다.
어떠한 항암 면역요법제의 작용 방식이든지, 그의 유효성은 면역계의 일반적 상향조절 예컨대 TLR7의 활성화에 의해 증가될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 명세서는 암을 앓는 환자에게 항암 면역요법제와 본원에 개시된 TLR7 효능제의 치료상 유효한 조합을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 암을 치료하는 방법을 제공한다. 투여 시기는 동시, 순차적, 또는 교대일 수 있다. 투여 방식은 전신 또는 국부일 수 있다. TLR7 효능제는 접합체를 통해, 표적화 방식으로 전달될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 조합 치료로 치료될 수 있는 암의 비제한적 예는 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 카포시 육종, 림프종, 항문암, 충수암, 기형양/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 기관지 종양, 카르시노이드 종양, 심장 종양, 자궁경부암, 척삭종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수증식성 신생물, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 담관암, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 안암, 난관암, 담낭암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양, 배세포 종양, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간암, 하인두암, 췌장암, 신장암, 후두암, 만성 골수 백혈병, 구순암 및 구강암, 폐암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 구내암, 구강암, 골육종, 난소암, 음경암, 인두암, 전립선암, 직장암, 타액선암, 피부암, 소장암, 연부 조직 육종, 고환암, 인후암, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 및 외음부암을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 조합 요법에 사용될 수 있는 항암 면역요법제는 하기를 포함한다: AMG 557, AMP-224, 아테졸리주맙, 아벨루맙, BMS 936559, 세미플리맙, CP-870893, 다세투주맙, 두르발루맙, 에노블리투주맙, 갈릭시맙, IMP321, 이필리무맙, 루카투무맙, MEDI-570, MEDI-6383, MEDI-6469, 무로모납-CD3, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 스파르탈리주맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 우토밀루맙, 바를리루맙, 본레롤리주맙. 하기 표 B는 그의 대체 명칭 (상표명, 이전 명칭, 연구 코드 또는 동의어) 및 각 표적 체크포인트 분자를 열거한다.
Figure pct00041
TLR7 효능제를 사용하는 조합 치료의 한 실시양태에서, 항암 면역요법제는 길항작용 항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체이다. 암은 폐암 (비소세포 폐암 포함), 췌장암, 신장암, 두경부암, 림프종 (호지킨 림프종 포함), 피부암 (흑색종 및 메르켈 피부암 포함), 요로상피암 (방광암 포함), 위암, 간세포성암 또는 결장직장암일 수 있다.
TLR7 효능제를 사용하는 조합 치료의 또 다른 실시양태에서, 항암 면역요법제는 길항작용 항-CTLA-4 항체, 바람직하게는 이필리무맙이다.
TLR7 효능제를 사용하는 조합 치료의 또 다른 실시양태에서, 항암 면역요법제는 길항작용 항-PD-1 항체, 바람직하게는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙이다.
본원에 개시된 TLR7 효능제는 백신 보조제로서 유용하다.
본 발명의 실시는 추가로 하기 실시예를 참조하여 이해될 수 있고, 이는 제한이 아니라 예시로 제공된다.
분석 절차
NMR
양성자 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼을 수득하기 위해 하기 조건을 사용하였다: 용매 및 내부 표준으로서 DMSO-d6 또는 CDCl3을 사용하여 400 Mz 또는 500 Mhz 브루커 기기에서 NMR 스펙트럼을 수득하였다. 조 NMR 데이터를 ADC 랩스(ADC Labs)에 의한 ACD 스펙트러스 버전 2015-01 또는 메스트레노바 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
화학적 이동은 내부 테트라메틸실란 (TMS)으로부터 또는 중수소화 NMR 용매에 의해 추론된 TMS의 위치로부터 백만분율 (ppm) 다운필드로 보고된다. 겉보기 다중도는 단일선-s, 이중선-d, 삼중선-t, 사중선-q 또는 다중선-m으로 보고된다. 광폭화를 나타내는 피크는 br로 또한 나타낸다. 적분은 근사치이다. 적분 강도, 피크 형상, 화학적 이동 및 커플링 상수는 용매, 농도, 온도, pH 및 다른 인자에 따라 달라질 수 있음을 주목해야 한다. 또한, NMR 스펙트럼에서 물 또는 용매 피크와 중첩되거나 교환되는 피크는 신뢰가능한 적분 강도를 제공하지 않을 수 있다. 일부 경우에, NMR 스펙트럼은 물 피크 억제를 사용하여 수득될 수 있으며, 가시적이지 않거나 또는 변경된 형상 및/또는 적분을 갖는 중첩 피크를 생성할 수 있다.
액체 크로마토그래피
하기 정제용 및/또는 분석용 (LC/MS) 액체 크로마토그래피 방법을 사용하였다.
분석용 LC/MS 절차 A: 칼럼: 워터스 엑스브리지 C18, 2.1 mm x 50 mm, 1.7 μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴:물, 10 mM NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴:물, 10 mM NH4OAc 포함; 온도: 50℃; 구배: 3분에 걸쳐 0%B에서 100%B, 이어서 100%B에서 0.50분 유지; 유량: 1 mL/분; 검출: MS 및 UV (220 nm).
분석용 LC/MS 절차 B: 칼럼: 엑스브리지 BEH C18 XP (50 x 2.1 mm), 2.5 μm; 이동상 A: 5:95 CH3CN: H2O, 10 mM NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 CH3CN: H2O, 10 mM NH4OAc 포함; 온도: 50℃; 구배: 3분에 걸쳐 0-100% B; 유량: 1.1 mL/분).
합성 - 일반적 절차
일반적으로, 본원에 개시된 절차는 피라졸로피리미딘 고리계의 1H 또는 2H 위치에서 알킬화된 위치이성질체의 혼합물을 생성한다 (이는 또한 알킬화된 질소를 지칭하는 N1 및 N2 위치이성질체로 각각 지칭됨). 간결하게 하기 위해, N2 위치이성질체는 편의상 나타내지 않았지만, 이들은 초기 생성물 혼합물 중에 존재하고, 예를 들어 정제용 HPLC에 의해 나중에 분리되는 것으로 이해되어야 한다.
Figure pct00042
위치이성질체의 혼합물은 합성의 초기 단계에서 분리되고, 나머지 합성 단계는 1H 위치이성질체를 사용하여 수행될 수 있거나, 또는 대안적으로, 합성은 위치이성질체의 혼합물을 보유하여 진행되고, 분리는 목적하는 바에 따라 후속 단계에서 실시될 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 합성 유기 화학의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다수의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 하기 기재된 것들 또는 그의 변형을 포함한다. 바람직한 방법은 하기 반응식 1-4에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
반응식 1
Figure pct00043
화합물 10을 상기 반응식 1에 약술된 합성 순서에 의해 제조할 수 있다. 니트로피라졸 1을 환원시켜 상응하는 아민 2를 수득하고, 이어서 1,3-비스(메톡시카르보닐)-2-메틸-2-티오슈도우레아를 사용하여 고리화시켜 히드록시피라졸로피리미딘 3을 수득한다. 아민을 BOP/ DBU 커플링 조건을 사용하여 도입하여 화합물 4를 수득한다. NBS를 사용한 후속 브로민화는 브로모피라졸로피리미딘 5를 제공한다. 벤질 할라이드 6을 사용한 알킬화에 의해 N1 및 N2 생성물의 혼합물을 수득하며, 이를 분리하여 N1 중간체 7을 수득하며, 이를 촉매 수소화를 사용하여 탈브로민화하여 시아노 중간체 8을 수득하며, 이를 이어서 그리냐르 시약 및 티타늄 (IV)이소프로폭시드를 사용하여 같은자리-디알킬아민 9로 전환시킨다. 최종적으로, 수산화나트륨을 사용하여 메틸 카르바메이트를 제거하여 목적 화합물 10을 수득한다.
반응식 2
Figure pct00044
대안적으로, 시아노 중간체 8은 상기 반응식 2에 기재된 경로를 사용하여 접근할 수 있다. 중간체 3을 NBS를 사용하여 브로민화시켜 화합물 11을 수득하고, 이를 벤질 할라이드 6을 사용하여 알킬화시켜 히드록시 중간체 12를 수득한다. BOP / DBU를 사용한 아민 RaNH2의 도입에 이은 탈브로민화에 의해 목적 중간체 8을 수득한다.
반응식 3
Figure pct00045
화합물 10으로의 또 다른 대안적 경로는 상기 반응식 3에 기재된다. 벤조니트릴 13을 그리냐르 시약 및 티타늄 (IV)이소프로폭시드를 사용하여 디알킬아민 14로 전환시킨다. 이어서, 아민 14를 벤질 클로로포르메이트를 사용하여 보호하여 중간체 15를 수득하고, 이를 NBS/AIBN을 사용하여 벤질 브로마이드 16으로 전환시킨다. 벤질 브로마이드 16을 DMF 중 Cs2CO3를 사용하여 피라졸로피리미딘 중간체 11에 부착시킨다. 생성된 생성물 17을 BOP/DBU를 사용하여 RaNH2로 아미노화시킨다. 이는 중간체 18을 수득하고, 이를 브로모 기 및 CBz 보호기를 제거하기 위한 촉매 수소화에 이어서 메틸 카르바메이트를 제거하기 위한 수산화나트륨을 사용하여 최종 화합물 10으로 전환시킨다.
상기 반응식은 화학식 (I)의 위치이성질현상에 도시된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 동일한 반응식이 필요한 변경을 가하여 화학식 (II)에 따른 화합물을 제조하는 데 적합화될 수 있음을 이해할 것이다.
반응식 4
Figure pct00046
상기 반응식 4는 중간체 16을 아민-함유 피라졸로피리미딘 5에 부착시켜 중간체 18을 수득하는 대안적 접근법을 제시한다. 촉매 수소화 및 수산화나트륨을 사용하여 이전과 같이 중간체 18을 탈보호하여 목적 화합물 10을 수득한다.
반응식 5
Figure pct00047
중간체 아민 14의 제조에 대한 추가의 대안은 반응식 5에 예시된다. 벤질 할라이드 19를 리튬화시키고, 술핀아미드 20으로 켄칭하여 보호된 아민 21을 수득할 수 있다. 디옥산 중 HCl을 사용하여 탈보호시켜 목적하는 아민 14를 히드로클로라이드 염으로서 수득한다.
반응식 6
Figure pct00048
대칭 3급 알콜 3 (둘 다 Ra 동일한 기)을 상기 반응식 6에 따라 제조할 수 있다. 그리냐르 시약 RaMgBr을 화합물 1에 첨가하고 (US 2020/0038403), 이어서 메틸 카르바메이트 보호기를 제거하여 목적 화합물 3을 수득한다.
반응식 7
Figure pct00049
비대칭 3급 알콜은 상기 반응식 7에 따라 제조할 수 있다. 에스테르 1을 산 2로 가수분해하고, 이어서 웨인렙 아미드 3으로 전환시킨다. 아미드 3을 그리냐르 시약 RaMgBr을 사용하여 케톤 4로 전환시킨다. 제2 그리냐르 시약 RbMgBr을 사용한 알킬화 및 메틸 카르바메이트 보호기의 후속 제거는 비대칭 3급 알콜 6을 수득한다.
반응식 8
Figure pct00050
3급 알콜로의 대안적 경로는 상기 반응식 8에 제시된다. 벤질 알콜 1은 보호된다 (예시로서 TBS 기가 사용됨). n-BuLi를 사용한 화합물 2에서의 브로민 위치의 금속화 및 케톤 RaC(=O)RB으로의 켄칭은 알콜 3을 유도한다. (Ra 및 Rb는 동일하거나 상이할 수 있음). 단계 3에서 3급 알콜의 보호 (예를 들어, 아세테이트로서) 및 벤질 알콜의 탈보호는 벤질 알콜 4를 수득하고, 이를 티오닐 클로라이드를 사용하여 상응하는 벤질 클로라이드 6으로 전환시킨다. 단계 5에 따라 커플링시켜 화합물 6을 수득한다. (C3에서의 브로민 기는 N2 위치에 비해 우선적으로 N1 위치로의 커플링을 지시하는 것을 돕는다.) 브로민을 제거하기 위한 수소화 및 카르바메이트 보호기의 가수분해는 최종 생성물 7을 수득한다.
합성 - 구체적 실시예
상기를 추가로 예시하기 위해, 하기 비제한적인 하기 예시적인 합성 반응식이 포함된다. 청구범위의 범주 내의 이들 예의 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해범위 내에 있으며, 본 개시내용의 범주 내에 속하는 것으로 간주된다. 독자는 본 개시내용 및 관련 기술분야의 통상의 기술에 의해 통상의 기술자가 철저한 실시예 없이도 본원에 개시된 화합물을 제조하고 사용할 수 있을 것임을 인식할 것이다.
100 이상의 번호의 화합물에 대한 분석 데이터는 표 A에서 확인된다.
실시예 1 - 화합물 101
Figure pct00051
단계 1. DMF / MeCN (1:1, 120 mL) 중 메틸 (7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (10 g, 37.8 mmol)의 교반 현탁액에 NBS (7.41 g, 41.6 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (150 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가로 10분 동안 교반하였다. 생성물을 여과에 의해 수집하고, 물 (3 x 50 mL)로 세척하여 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (6.1 g, 17.77 mmol, 47.0% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ 343.0, 345.0.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.87 (br s, 1H), 9.80 (s, 1H), 7.57 (br s, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.59 - 3.48 (m, 2H), 1.62 (quin, J=7.2 Hz, 2H), 1.40 (dq, J=14.9, 7.3 Hz, 2H), 0.94 (t, J=7.4 Hz, 3H)
단계 2. 0℃에서 DMF (10 mL) 중 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (1 g, 2.91 mmol) 및 Cs2CO3 (1.899 g, 5.83 mmol)의 교반 현탁액에 DMF (2 mL) 중 4-(브로모메틸)-3-메톡시벤조니트릴 (0.527 g, 2.331 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온하고, 밤새 교반하고, 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 40 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (3 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (80 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 70% EtOAc)하여 고체로서 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (320 mg, 0.655 mmol, 22.49% 수율)를 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ 488.3, 490.3.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.88 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.39 - 7.32 (m, 2H), 6.77 (d, J=7.7 Hz, 1H), 5.78 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.51 (q, J=6.6 Hz, 2H), 1.55 (quin, J=7.3 Hz, 2H), 1.21 (sxt, J=7.4 Hz, 2H), 0.86 (t, J=7.4 Hz, 3H).
단계 3. 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (315 mg, 0.645 mmol)를 EtOH (15 mL) 중에 현탁시켰다. 탄소 상 10% 팔라듐 (15 mg)을 첨가하였다. 반응 용기를 배기시키고, 수소로 6회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 2시간 동안 교반하고, 여과하고, 증발 건조시켜 메틸 (7-(부틸아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (264 mg, 0.645 mmol, 98% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ 410.4.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 9.99 (br s, 1H), 8.73 (br s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.25 - 7.18 (m, 2H), 7.11 (s, 1H), 6.12 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.80 (q, J=6.8 Hz, 2H), 1.64 (quin, J=7.4 Hz, 2H), 1.34 - 1.21 (m, 2H), 0.89 (t, J=7.4 Hz, 3H)
단계 4. 마이크로웨이브 바이알에 메틸 (7-(부틸아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (60 mg, 0.147 mmol) 및 THF (2 mL)를 충전하였다. 메틸마그네슘 브로마이드 (0.293 mL, 0.879 mmol)를 첨가하였다. 발포가 중지된 후, 바이알을 마개를 막고, 반응 혼합물을 마이크로웨이브 오븐에서 100℃로 10분 동안 가열하였다. 티타늄(IV) 이소프로폭시드 (42 mg, 0.147 mmol) 및 메틸마그네슘 브로마이드 (0.293 mL, 0.879 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 100℃에서 추가로 10분 동안 가열하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 용액 (20 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (2 x 5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 디옥산 (2 mL) 중에 용해시키고, NaOH (0.440 mL, 2.198 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 가열하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 5N HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 2% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 2-42% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 101 (9.2 mg, 0.024 mmol, 16% 수율)을 수득하였다.
실시예 2 - 화합물 102
Figure pct00052
단계 1. DMF (40 mL) 중 메틸 (3-브로모-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (2 g, 6.94 mmol)의 교반 용액에 Cs2CO3 (2.488 g, 7.64 mmol)을 첨가하였다. 빙조에서 냉각시킨 후, DMF (10 mL) 중 4-(브로모메틸)-3-메톡시벤조니트릴 (1.570 g, 6.94 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 천천히 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (200 mL) 및 물 (200 mL)에 붓고, EtOAc (200 mL)를 첨가하였다. 매우 불량한 용해도로 인한 층의 분리 없이, 혼합물을 여과하였다. 침전물을 물 (2 x 50 mL) 및 MeCN (2 x 50 mL)으로 세척하여 메틸 (3-브로모-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (1.1 g, 2.54 mmol, 36.6% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M-H] = 431.1, 433.1.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.53 (br s, 2H), 7.60 - 7.49 (m, 1H), 7.43 - 7.29 (m, 1H), 6.92 (br d, J=7.7 Hz, 1H), 5.73 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.75 (s, 3H).
단계 2. DMSO (20 mL) 중 메틸 (3-브로모-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (1 g, 2.308 mmol), (S)-1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-아민 (1.231 g, 3.46 mmol) 및 BOP (1.531 g, 3.46 mmol)의 교반 용액에 DBU (1.044 mL, 6.92 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 70 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (4 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (80 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 50% EtOAc)를 사용하여 정제하여 메틸 (S)-(3-브로모-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (1.091 g, 1.415 mmol, 61.3% 수율)를 오일로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 770.3, 772.2.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.83 (s, 1H), 7.58 - 7.53 (m, 2H), 7.50 - 7.45 (m, 3H), 7.43 - 7.33 (m, 4H), 7.27 - 7.22 (m, 2H), 7.11 (dd, J=7.9, 1.3 Hz, 1H), 6.62 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.53 (d, J=7.7 Hz, 1H), 5.86 - 5.71 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.62 - 3.52 (m, 5H), 1.87 - 1.77 (m, 2H), 1.57 - 1.43 (m, 2H), 1.15 (br dd, J=17.6, 10.8 Hz, 2H), 0.92 (s, 9H), 0.79 (t, J=7.4 Hz, 3H).
단계 3. 에탄올 (70 mL) 중 메틸 (S)-(3-브로모-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (1.08 g, 1.401 mmol)의 용액에 탄소 상 10% Pd (100 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 6회 퍼징한 다음, 반응물을 수소 분위기 하에 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 에탄올 (50 mL)로 세척하면서 셀라이트(CELITE)™을 통해 여과하고, 여과물을 증발 건조시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 100% EtOAc)를 사용하여 정제하여 생성물 183 mg을 수득하였다. 상기 칼럼을 재용출시켜 (25분에 걸쳐 DCM 중 0에서 10% MeOH) 추가의 435 mg의 생성물을 수득하였다. 2개의 배치를 합하여 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (618 mg, 0.893 mmol, 63.7% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 692.4
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.55 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.55 (d, J=7.2 Hz, 2H), 7.49 - 7.34 (m, 7H), 7.23 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.01 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.36 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.29 (d, J=7.7 Hz, 1H), 5.81 (d, J=2.4 Hz, 2H), 4.57 (br d, J=7.5 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.61 - 3.58 (m, 3H), 3.57 - 3.48 (m, 2H), 1.86 - 1.72 (m, 2H), 1.55 - 1.41 (m, 2H), 1.20 - 0.97 (m, 2H), 0.93 (s, 9H), 0.77 (t, J=7.4 Hz, 3H).
단계 4. 마이크로웨이브 바이알에 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (150 mg, 0.217 mmol) 및 THF (7 mL)를 채웠다. 메틸마그네슘 브로마이드 (0.361 mL, 1.084 mmol)를 첨가하고, 바이알을 마개를 막고, 반응물을 마이크로웨이브에서 80℃에서 20분 동안 가열하였다. 티타늄(IV)이소프로폭시드 (0.127 mL, 0.434 mmol)를 첨가하고, 이어서 추가의 메틸마그네슘 브로마이드 (0.361 mL, 1.084 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 마이크로웨이브에서 80℃에서 추가 20분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 NH4Cl 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켜 메틸 (S)-(1-(4-(2-아미노프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (150 mg, 0.145 mmol, 66.9% 수율, 70% 순도)를 검으로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 724.4.
단계 5. 메틸 (S)-(1-(4-(2-아미노프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (150 mg, 0.145 mmol)를 디옥산 (4 mL) 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (0.118 mL, 0.725 mmol)를 첨가하고, 반응물을 70℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, NaOH (1.450 mL, 7.25 mmol)를 첨가하고, 반응물을 80℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 5N HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 2% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 2-42% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 102 (22.2 mg, 0.050 mmol, 34.7% 수율)를 수득하였다.
실시예 3 - 화합물 103
Figure pct00053
단계 1. DMSO (10 mL) 중 메틸 (3-브로모-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (742 mg, 1.713 mmol), (5-메틸이속사졸-3-일)메탄아민 (288 mg, 2.57 mmol) 및 BOP (1136 mg, 2.57 mmol)의 교반 용액에 DBU (0.775 mL, 5.14 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고 EtOAc (3 x 70 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (4 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (80 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 85% EtOAc)하여 메틸 (3-브로모-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-7-(((5-메틸이속사졸-3-일)메틸)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (295 mg, 0.559 mmol, 32.7% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 527.1, 529.1.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 1H), 8.03 (t, J=5.7 Hz, 1H), 7.49 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.35 (dd, J=7.7, 1.3 Hz, 1H), 6.87 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.21 (d, J=0.9 Hz, 1H), 5.78 (s, 2H), 4.77 (d, J=5.7 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.74 - 3.58 (m, 3H), 2.39 - 2.30 (m, 3H).
단계 2. 에탄올 (15 mL) 중 메틸 (3-브로모-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-7-(((5-메틸이속사졸-3-일)메틸)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (290 mg, 0.550 mmol)의 교반 용액에 탄소 상 10% 팔라듐 (29 mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 6회 퍼징한 다음, 반응물을 수소 분위기 하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (24 g SiO2 칼럼, DCM 중 0에서 10% MeOH)를 사용하여 정제하여 메틸 (3-브로모-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-7-(((5-메틸이속사졸-3-일)메틸)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (290 mg, 0.550 mmol)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 449.1.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.37 (br s, 1H), 8.20 (br s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.50 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.32 (dd, J=7.8, 1.2 Hz, 1H), 6.71 (br d, J=7.5 Hz, 1H), 6.16 (s, 1H), 5.81 (s, 2H), 4.76 (br d, J=5.7 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 2.35 (s, 3H).
단계 3. 마이크로웨이브 바이알에 메틸 (1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-7-(((5-메틸이속사졸-3-일)메틸)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (70 mg, 0.156 mmol), THF (3 mL) 및 메틸마그네슘 브로마이드 (0.260 mL, 0.780 mmol)를 채웠다. 반응물을 80℃에서 마이크로웨이브에서 20분 동안 가열하였다. 티타늄(IV) 이소프로폭시드 (0.091 mL, 0.312 mmol)를 첨가하고, 이어서 메틸마그네슘 브로마이드 (0.260 mL, 0.780 mmol)를 첨가하고, 반응물을 마이크로웨이브에서 70℃에서 추가 20분 동안 가열하였다. 추가의 메틸마그네슘 브로마이드 (0.260 mL, 0.780 mmol)를 첨가하고, 반응물을 마이크로웨이브에서 70℃에서 추가 30분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 NH4Cl 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (3 x 5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 디옥산 (2 mL) 중에 용해시키고, NaOH (0.937 mL, 4.68 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 냉각되도록 하였다. 반응 혼합물을 5N HCl을 사용하여 중화시킨 다음, 증발 건조시키고, DMF (2 mL) 중에 재용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 0% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 0-40% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 103 (5.3 mg, 0.012 mmol, 7.65% 수율)을 수득하였다.
실시예 4 - 화합물 104
Figure pct00054
단계 1. DMF (40 mL) 중 메틸 (3-브로모-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (2 g, 6.94 mmol)의 교반 용액에 Cs2CO3 (2.488 g, 7.64 mmol)를 첨가하였다. 빙조에서 냉각시킨 후, DMF (10 mL) 중 3-(브로모메틸)-4-메톡시벤조니트릴 (1.570 g, 6.94 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 천천히 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 교반 하에 물 (1 L)에 천천히 부었다. 침전물을 여과하고, 물 (2 x 50 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 메틸 (3-브로모-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (2.3 g, 5.31 mmol, 76% 수율)를 회색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H] = 433.1.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.51 (brs, 2H), 7.83 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 1H)., 5.70 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.76 (s, 3H).
단계 2. DMSO (9.23 ml) 중 메틸 (3-브로모-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (0.4 g, 0.923 mmol), (S)-1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-아민 (0.657 g, 1.847 mmol) 및 BOP (0.613 g, 1.385 mmol)의 교반 용액에 DBU (0.418 ml, 2.77 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고 EtOAc (3 x 70 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (4 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (이스코, 40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 50% EtOAc, 30분에 걸침)를 사용하여 정제하여 메틸 (S)-(3-브로모-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (0.34 g, 0.441 mmol, 47.8% 수율)를 연갈색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 770.3.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.58 (s, 1H), 7.55 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 7.37 - 7.31 (m, 2H), 7.30 - 7.25 (m, 2H), 7.20 - 7.10 (m, 4H), 7.06 - 6.99 (m, 3H), 6.94 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.61 - 5.32 (m, 2H), 4.44 (dq, J = 11.5, 5.6, 4.1 Hz, 1H), 3.51 (s, 3H), 3.45 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.37 (s, 3H), 1.67 (m, 2H), 1.44 - 1.21 (m, 2H), 1.09 - 0.89 (m, 2H), 0.70 (s, 9H), 0.59 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
단계 3. 메틸 (S)-(3-브로모-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (0.34 g, 0.441 mmol)를 EtOH (22.05 ml) 중에 용해시켰다. 탄소 상 10% Pd (33 mg)를 첨가하고, 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 3회 퍼징하였다. 반응물을 수소 분위기 하에 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 에탄올 (50 mL)로 세척하면서 셀라이트™을 통해 여과하고, 여과물을 증발시켜 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (300 mg, 0.434 mmol, 98% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 692.3.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.85 - 7.76 (m, 1H), 7.66 - 7.58 (m, 1H), 7.52 (ddt, J = 18.0, 6.9, 1.5 Hz, 4H), 7.46 - 7.32 (m, 5H), 7.32 - 7.11 (m, 4H), 5.95 - 5.63 (m, 2H), 4.61 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.73 - 3.61 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.31 - 1.11 (m, 3H), 0.92 (s, 9H), 0.82 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
단계 4. 마이크로웨이브 바이알에 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (50 mg, 0.072 mmol) 및 THF (2 mL)를 채웠다. 메틸마그네슘 브로마이드 (0.241 mL, 0.723 mmol)를 첨가하였다. 바이알을 마개를 막고, 반응 혼합물을 마이크로웨이브 오븐에서 100℃에서 20분 동안 가열하였다. 티타늄(IV) 이소프로폭시드 (0.042 mL, 0.145 mmol)를 첨가하고, 이어서 메틸마그네슘 브로마이드 (0.120 mL, 0.361 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 마이크로웨이브 오븐에서 100℃에서 추가 20분 동안 가열하였다. LCMS는 생성물의 형성을 나타냈다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 희석하고, 포화 NH4Cl 용액 (20 mL)으로 켄칭하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 10 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켜 황색 검을 수득하였고, 이를 아세토니트릴/물 (0.1% TFA)을 사용하여 Accq Prep 20x150 mm 엑스브리지 칼럼 상에서 추가로 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜 메틸 (S)-(1-(5-(2-아미노프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (25 mg, 0.035 mmol, 47.8% 수율)를 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 724.4.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.43 (brs, 1H), 8.33 (s, 2H), 7.81 (s, 1H), 7.59 - 7.47 (m, 3H), 7.42 (td, J = 6.4, 2.9 Hz, 3H), 7.38 - 7.24 (m, 5H), 7.19 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.19 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.75 - 5.39 (m, 2H), 4.51 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.61 (t, J = 1.6 Hz, 2H), 3.51 (s, 3H), 1.76 m, 2H), 1.55 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.37 (s, 3H), 1.35 (s, 3H),1.07 (m, 2H), 0.86 (s, 9H), 0.72 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
단계 5. 메틸 (S)-(1-(5-(2-아미노프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (50 mg, 0.069 mmol)를 디옥산 (2 mL) 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (0.056 mL, 0.345 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, NaOH (1.450 mL, 7.25 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 추가로 1시간 동안 가열하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 5N HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 2% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 2-42% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 104 (18.6 mg, 60% 수율)를 수득하였다.
실시예 5 - 화합물 105
Figure pct00055
단계 1. DMSO (10 mL) 중 메틸 (3-브로모-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (500 mg, 1.154 mmol), 부탄-1-아민 (0.172 mL, 1.731 mmol) 및 BOP (766 mg, 1.731 mmol)의 교반 용액에 DBU (0.522 mL, 3.46 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고 EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (4 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (이스코, 40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 80% EtOAc, 30분에 걸침)를 사용하여 정제하여 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (0.4 g, 0.819 mmol, 71.0% 수율)를 연갈색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 488.1.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.87 (s, 1H), 7.84 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.71 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 3.61 - 3.48 (m, 2H), 1.61 (tt, J = 7.7, 6.7 Hz, 2H), 1.38 - 1.21 (m, 2H), 0.89 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
단계 2. 에탄올 (16.38 ml) 중 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (0.4 g, 0.819 mmol)의 용액에 10% Pd/C (0.044 g, 0.041 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 3회 퍼징한 다음, 수소 분위기 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 증발 건조시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (이스코, 40 g SiO2 칼럼, 고체 로딩, 20분에 걸쳐 DCM 중 0-20% MeOH)를 이용하여 정제하여 메틸 (7-(부틸아미노)-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (270 mg, 0.659 mmol, 81% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 410.2.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.38 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.84 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.80 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.62 (dt, J = 7.9, 5.9 Hz, 2H), 1.60 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 1.29 (h, J = 7.3 Hz, 2H), 0.89 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
단계 3. 마이크로웨이브 바이알에 메틸 (7-(부틸아미노)-1-(5-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (10 mg, 0.024 mmol) 및 THF (1 mL)를 채웠다. 메틸마그네슘 브로마이드 (0.144 mL, 0.488 mmol)를 첨가하였다. 바이알을 마개를 막고, 반응물을 마이크로웨이브 오븐에서 90℃에서 20분 동안 가열하였다. 티타늄(IV) 이소프로폭시드 (0.014 mL, 0.049 mmol)를 첨가하고, 이어서 메틸마그네슘 브로마이드 (0.072 mL, 10 당량)를 첨가하였다. 반응물을 마이크로웨이브 오븐에서 80℃에서 20분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 NH4Cl 용액 (1 mL)으로 켄칭하고, 농축시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, Accq 정제용 30x150 mm 엑스브리지 칼럼에 의해 정제하였다. 15분에 수집된 50% 아세토니트릴/물 (0.1% TFA) 분획을 동결건조시켜 메틸 (1-(5-(2-아미노프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트, TFA 염 (4 mg, 7.20 μmol, 29.5% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 442.5.
단계 4. 메틸 (1-(5-(2-아미노프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (9 mg, 0.020 mmol)를 디옥산 (2 mL) 중에 용해시켰다. NaOH (0.041 mL, 0.408 mmol)를 첨가하고, 반응물을 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 6N HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 2% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 2-42% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 105 (3.4 mg, 8.10 μmol, 39.8% 수율)를 수득하였다.
실시예 6 - 화합물 106
Figure pct00056
단계 1. DMSO (20 mL) 중 메틸 (3-브로모-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (1 g, 2.31 mmol), (S)-1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜탄-3-아민 (1.18 g, 3.46 mmol) 및 BOP (1.53 g, 3.46 mmol)의 교반 용액에 DBU (1.04 mL, 6.92 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고 EtOAc (3 x 70 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (4 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (80 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 50% EtOAc)를 사용하여 정제하여 메틸 (S)-(3-브로모-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜탄-3-일)아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (320 mg, 0.42 mmol, 18.3% 수율)를 검으로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 756.2, 758.2.
단계 2. 에탄올 (5 mL) 중 메틸 (S)-(3-브로모-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜탄-3-일)아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (320 mg, 0.42 mmol)의 용액에 탄소 상 10% 팔라듐 (32 mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 6회 퍼징한 다음, 수소 분위기 하에 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 100% EtOAc, 이어서 DCM 중 0에서 10% MeOH)를 사용하여 정제하여 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜탄-3-일)아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (120 mg, 0.18 mmol, 41.9% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 678.3.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.58 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.56 - 7.51 (m, 2H), 7.51 - 7.33 (m, 7H), 7.24 - 7.18 (m, 2H), 6.98 (dd, J=7.7, 1.3 Hz, 1H), 6.42 - 6.31 (m, 2H), 5.85 - 5.74 (m, 2H), 4.54 - 4.44 (m, 1H), 3.85 - 3.76 (m, 3H), 3.66 - 3.55 (m, 3H), 1.87 - 1.71 (m, 2H), 1.55 (quin, J=7.2 Hz, 2H), 0.91 (s, 9H), 0.75 (t, J=7.4 Hz, 3H).
단계 3. 마이크로웨이브 바이알에 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜탄-3-일)아미노)-1-(4-시아노-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (115 mg, 0.17 mmol) 및 THF (10 mL)를 채웠다. 메틸마그네슘 브로마이드 (0.28 mL, 0.85 mmol) 용액을 첨가하고, 바이알을 마개를 막고, 반응물을 마이크로웨이브에서 80℃에서 20분 동안 가열하였다. 티타늄 (IV)이소프로폭시드 (0.1 mL, 0.34 mmol)를 첨가하고, 이어서 추가의 메틸마그네슘 브로마이드 (0.28 mL, 0.85 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응물을 마이크로웨이브에서 80℃에서 추가로 20분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켜 메틸 (S)-(1-(4-(2-아미노프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜탄-3-일)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (105 mg, 60% 순도, 0.053 mmol, 52.3% 수율)를 검으로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 710.6.
단계 4. 메틸 (S)-(1-(4-(2-아미노프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)펜탄-3-일)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (105 mg, 0.148 mmol)를 디옥산 (4 mL) 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (0.120 mL, 0.739 mmol)를 첨가하고, 반응물을 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 5N NaOH 용액 (1.479 mL, 7.39 mmol)을 첨가하고, 반응물을 70℃에서 추가로 2시간 동안 가열하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 5N HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 0% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 0-40% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 106 (8.4 mg, 0.020 mmol, 13.5% 수율)을 수득하였다.
실시예 7 - 화합물 107, 디트리플루오로아세테이트
Figure pct00057
단계 1. 테트라히드로푸란 (90 mL) 중 4-브로모-2-메톡시-1-메틸벤젠 (2 g, 9.95 mmol)의 교반 용액을 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸리튬 (9.33 mL, 14.92 mmol)을 첨가하고, 반응물을 -78℃에서 1시간 동안 교반하였다. 테트라히드로푸란 (10 mL) 중 2-메틸-N-(옥세탄-3-일리덴)프로판-2-술핀아미드 (1.918 g, 10.94 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응물을 실온으로 천천히 가온되도록 하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 용액 (100 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (3 x 40 mL)로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (80 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 75% EtOAc)를 사용하여 정제하여 N-(3-(3-메톡시-4-메틸페닐)옥세탄-3-일)-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (937 mg, 3.15 mmol, 31.7% 수율)를 검으로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 298.2.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.16 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.00 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 6.23 (s, 1H), 5.00 (t, J=6.2 Hz, 2H), 4.89 (d, J=6.6 Hz, 1H), 4.67 (d, J=6.2 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 1.20 - 1.07 (m, 9H).
단계 2. 디옥산 (25 mL) 중 N-(3-(3-메톡시-4-메틸페닐)옥세탄-3-일)-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (700 mg, 2.354 mmol)의 교반 용액에 디옥산 중 4N HCl (1.177 mL, 4.71 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 생성물을 여과하고, 디에틸 에테르 (100 mL)로 세척하여 3-(3-메톡시-4-메틸페닐)옥세탄-3-아민 히드로클로라이드 (501 mg, 2.181 mmol, 93% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 194.2.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.24 (br s, 3H), 7.34 - 7.10 (m, 2H), 7.01 (br s, 1H), 4.96 (br s, 4H), 3.84 (br s, 3H), 2.17 (br s, 3H).
단계 3. DCM (25 mL) 중 3-(3-메톡시-4-메틸페닐)옥세탄-3-아민 히드로클로라이드 (500 mg, 2.177 mmol) 및 DIPEA (0.950 mL, 5.44 mmol)의 용액을 빙조에서 냉각시켰다. 벤질 클로로포르메이트 (0.340 mL, 2.394 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온으로 가온되도록 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고, DCM (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (3 x 40 mL)로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 50% EtOAc)를 사용하여 정제하여 벤질 (3-(3-메톡시-4-메틸페닐)옥세탄-3-일)카르바메이트 (475 mg, 1.451 mmol, 66.7% 수율)를 오일로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 328.2.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 - 8.36 (m, 1H), 7.36 (br s, 5H), 7.12 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.00 - 6.91 (m, 2H), 5.02 (br s, 2H), 4.82 (d, J=6.6 Hz, 2H), 4.72 (d, J=6.4 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.13 (s, 3H).
단계 4. CCl4 (15 mL) 중 벤질 (3-(3-메톡시-4-메틸페닐)옥세탄-3-일)카르바메이트 (470 mg, 1.436 mmol), NBS (268 mg, 1.507 mmol) 및 AIBN (47.1 mg, 0.287 mmol)의 용액을 75℃로 가열하고, 이 온도에서 1시간 동안 유지하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 40% EtOAc)를 사용하여 정제하여 벤질 (3-(4-(브로모메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-일)카르바메이트 (175 mg, 0.431 mmol, 30.0% 수율)를 오일로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 406.2, 408.1.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.57 - 8.45 (m, 1H), 7.47 - 7.29 (m, 6H), 7.09 - 6.98 (m, 2H), 5.03 (br s, 2H), 4.82 (d, J=6.8 Hz, 2H), 4.79 - 4.71 (m, 2H), 4.68 - 4.62 (m, 2H), 3.86 - 3.79 (m, 3H).
단계 5. 0℃에서 DMF (2 mL) 중 메틸 (3-브로모-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (120 mg, 0.417 mmol)의 교반 용액에 Cs2CO3 (204 mg, 0.625 mmol)을 첨가하고, 이어서 DMF (1 mL) 중 벤질 (3-(4-(브로모메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-일)카르바메이트 (169 mg, 0.417 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (3 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켜 메틸 (1-(4-(3-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)옥세탄-3-일)-2-메톡시벤질)-3-브로모-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (220 mg, 0.251 mmol, 60.3% 수율, 70% 순도)를 고체로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 613.2, 615.2.
단계 6. DMSO (4 mL) 중 메틸 (1-(4-(3-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)옥세탄-3-일)-2-메톡시벤질)-3-브로모-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (220 mg, 0.251 mmol, 70% 순도), 부탄-1-아민 (52.5 mg, 0.717 mmol), BOP (238 mg, 0.538 mmol) 및 DBU (0.162 mL, 1.076 mmol)의 용액을 60℃로 20분 동안 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기부를 염수 (4 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켜 메틸 (1-(4-(3-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)옥세탄-3-일)-2-메톡시벤질)-3-브로모-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (245 mg, 0.220 mmol, 87.6% 수율, 60% 순도)를 오일로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 668.3, 670.3.
단계 7. EtOH (10 mL) 중 메틸 (1-(4-(3-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)옥세탄-3-일)-2-메톡시벤질)-3-브로모-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (240 mg, 0.215 mmol)의 용액에 탄소 상 10% 팔라듐 (24 mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, H2로 6회 퍼징한 다음, H2 분위기 하에 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 디옥산 (4 mL) 중에 용해시키고, NaOH (1.077 mL, 5.38 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하고, 냉각시키고, 5N HCl을 사용하여 중화시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 10% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 10-50% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켰다. 물질을 추가로 정제용 LC/MS에 의해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 페닐, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, 0.05% TFA 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, 0.05% TFA 포함; 구배: 5% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 5-55% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 107 디트리플루오로아세테이트 (22.2 mg, 0.032 mmol, 14.94% 수율)를 수득하였다.
실시예 8 - 화합물 108
Figure pct00058
단계 1. DMSO (2 mL) 중 메틸 (1-(4-(3-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)옥세탄-3-일)-2-메톡시벤질)-3-브로모-7-히드록시-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (150 mg, 0.245 mmol), BOP (162 mg, 0.367 mmol) 및 DBU (0.111 mL, 0.734 mmol)의 교반 용액에 DMSO (2 mL) 중 (S)-1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-아민 (130 mg, 0.367 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 8 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (4 x 5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (24 g SiO2 칼럼, 헥산 중 0에서 60% EtOAc)를 사용하여 정제하여 메틸 (S)-(1-(4-(3-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)옥세탄-3-일)-2-메톡시벤질)-3-브로모-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (79 mg, 0.083 mmol, 34.0% 수율)를 검으로서 수득하였다.
LC-MS (ES, m/z): [M+H]+ = 950.5, 952.5.
단계 2. 메틸 (S)-(1-(4-(3-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)옥세탄-3-일)-2-메톡시벤질)-3-브로모-7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (79 mg, 0.083 mmol)를 에탄올 (10 mL) 중에 용해시켰다. 탄소 상 10% 팔라듐 (8 mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, H2로 6회 퍼징한 다음, H2 분위기 하에 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 디옥산 (3 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 (0.135 mL, 0.831 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 5N NaOH (0.665 mL, 3.32 mmol)를 첨가하고, 반응물을 80℃에서 추가 2시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응물을 5N HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 3% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 3-43% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 108 (15.0 mg, 0.034 mmol, 40.9% 수율)을 수득하였다.
실시예 9 - 화합물 110
Figure pct00059
4 mL 섬광 바이알에 들은 THF (1 mL) 중 메틸 4-((7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시벤조에이트 (40 mg, 0.090 mmol)의 교반 용액에 메틸마그네슘 브로마이드 (0.075 mL, 0.226 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 물 (1 mL)로 켄칭하고, 이어서 10분 동안 교반하고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 디옥산 (1 mL) 중에 용해시키고, NaOH (0.271 mL, 1.356 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃로 가열하고, 이 온도에서 밤새 유지하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 5N HCl (271 uL)로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 14% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 14-54% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 110 (4.3 mg, 12% 수율)을 수득하였다.
화합물 111을 유사하게 제조하였다.
실시예 10 - 화합물 112
Figure pct00060
단계 1. THF (6 mL) 중 메틸 4-((7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시벤조에이트 (500 mg, 1.130 mmol)의 교반 용액에 수산화리튬 (3.39 mL, 3.39 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료되지 않았기 때문에, 추가의 수산화리튬 (3.39 mL, 3.39 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 30℃에서 추가 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 역상 플래쉬 크로마토그래피 (50 g C18 칼럼, DMSO / 물 / MeCN 중에 로딩함, 0.05% 포름산을 함유하는 물 중 0에서 70% MeCN)를 사용하여 정제하여 4-((7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시벤조산 (262 mg, 54% 수율)을 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.00 (br s, 1H), 9.64 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.54 - 7.49 (m, 1H), 7.43 (dd, J=7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.03 (br t, J=5.4 Hz, 1H), 6.53 (d, J=7.9 Hz, 1H), 5.80 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.55 - 3.39 (m, 3H), 1.58 - 1.44 (m, 2H), 1.18 (sxt, J=7.4 Hz, 2H), 0.83 (t, J=7.4 Hz, 3H).
LC/MS [M+H]+ 429.18.
단계 2. 4-((7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시벤조산 (262 mg, 0.612 mmol), HATU (256 mg, 0.673 mmol) 및 N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (84 mg, 0.856 mmol)의 교반 용액에 DIPEA (0.235 mL, 1.345 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (30 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (4 x 20 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켜 메틸 (7-(부틸아미노)-1-(2-메톡시-4-(메톡시(메틸)카르바모일)벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (280 mg, 97% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC/MS [M+H]+ 472.22.
단계 3. THF (4 mL) 중 메틸 (7-(부틸아미노)-1-(2-메톡시-4-(메톡시(메틸)카르바모일)벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (250 mg, 0.530 mmol)의 교반 용액에 메틸마그네슘 브로마이드 (0.884 mL, 2.65 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 용액 (50 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (3 x 30 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, DCM 중 0에서 10% MeOH)하여 메틸 (1-(4-아세틸-2-메톡시벤질)-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (140 mg, 61%)를 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.48 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.06 (br t, J=5.4 Hz, 1H), 6.55 (d, J=7.9 Hz, 1H), 5.80 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.52 - 3.43 (m, 2H), 3.31 (s, 3H), 1.53 (quin, J=7.3 Hz, 2H), 1.19 (sxt, J=7.4 Hz, 2H), 0.83 (t, J=7.4 Hz, 3H).
LC/MS [M+H]+ 425.1.
단계 4. 메틸 (1-(4-아세틸-2-메톡시벤질)-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (25 mg, 0.059 mmol)를 THF (5 mL) 중에 용해시켰다. EtMgBr (39.1 mg, 0.293 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, MeOH (1 mL)로 켄칭하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 디옥산 (3 mL) 중에 용해시켰다. NaOH (0.234 mL, 1.172 mmol)를 첨가하고, 반응물을 80℃에서 4시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 1N HCl로 중화시킨 다음, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, 10-mM NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, 10 mM NH4OAc 포함; 구배: 16% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 16-56% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 화합물 112를 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켰다 (3.9 mg, 17% 수율).
화합물 113을 유사하게 제조하였다. 분석 데이터에 대해서는 표 A를 참조한다.
실시예 11 - 화합물 114
Figure pct00061
단계 1. DMF (50 mL) 중 (4-브로모-2-메톡시페닐)메탄올 (5 g, 23.03 mmol), TBS-Cl (4.17 g, 27.6 mmol) 및 이미다졸 (2.195 g, 32.2 mmol)의 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 70 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (4 x 50 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (120 g 칼럼, DCM 중에 로딩함, DCM으로 용리)하여 ((4-브로모-2-메톡시벤질)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 (6.766 g, 89% 수율)을 무색 액체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.22 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.00 (dd, J=8.1, 1.8 Hz, 1H), 6.84 (d, J=1.8 Hz, 1H), 4.60 - 4.54 (m, 2H), 3.76 - 3.68 (m, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).
단계 2. THF (40 mL) 중 ((4-브로모-2-메톡시벤질)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 (2.66 g, 8.03 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸리튬 (3.37 mL, 8.43 mmol)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 생성된 용액을 -78℃에서 15분 동안 교반하였다. THF (10 mL) 중 옥세탄-3-온 (0.550 g, 7.63 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 40 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (3 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (40 g 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 60% EtOAc)하여 3-(4-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-올 (1.36 g, 52% 수율)을 오일로서 수득하였으며, 이는 정치 시 응고하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.40 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.07 (dd, J=7.8, 1.7 Hz, 1H), 6.92 (d, J=1.5 Hz, 1H), 4.84 - 4.77 (m, 4H), 4.68 - 4.58 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 1.93 - 1.87 (m, 1H), 0.84 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).
단계 3. 20 mL 섬광 바이알에 3-(4-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-올 (488 mg, 1.504 mmol), 트리에틸아민 (0.419 mL, 3.01 mmol), DMAP (18.37 mg, 0.150 mmol) 및 DCM (5 mL)을 채웠다. 아세트산 무수물 (0.156 mL, 1.654 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시킨 다음, MeCN (2 x 5 mL) 중에 재용해시키고, 다시 증발 건조시켰다. 잔류물을 MeCN (2 mL) 중에 용해시켰다. TBAF (3.01 mL, 3.01 mmol)를 첨가하고 [THF 중 1 N], 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시킨 다음, MeCN (5 mL) 중에 용해시키고, 증발 건조시켰다 (2회). 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (40 g 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 80% EtOAc)를 사용하여 정제하여 3-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-일 아세테이트 (158 mg, 42% 수율)를 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3Cl) δ 7.33 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.06 - 6.99 (m, 1H), 5.07 (d, J=8.1 Hz, 2H), 4.96 (d, J=7.9 Hz, 2H), 4.71 (s, 2H), 3.93 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 1.86 (br s, 1H), 1.63 (br s, 1H).
LC/MS [M+H]+ 253.08.
단계 4. 3-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-일 아세테이트 (150 mg, 0.595 mmol)를 DCM (5 mL) 중에 용해시켰다. SOCl2 (0.130 mL, 1.784 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시킨 다음, 용해시키고, MeCN (5 mL)으로부터 2회 증발시켰다. DMF (2 mL) 중 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (190 mg, 0.554 mmol)의 교반 용액에 Cs2CO3 (361 mg, 1.108 mmol)을 첨가하고, 이어서 DMF (2 mL) 중 3-(4-(클로로메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-일 아세테이트 (150 mg, 0.554 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (4 x 5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, DCM 중 0에서 15% MeOH)하여 3-(4-((3-브로모-7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-일 아세테이트 (220 mg, 34%, 약 50% 순도, 2-위치이성질체 부산물로 주로 오염됨)를 수득하였다.
LC/MS [M-H]- 575.1, 577.0.
단계 5. 3-(4-((3-브로모-7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)옥세탄-3-일 아세테이트 (65 mg, 0.113 mmol)를 EtOH (4 mL) 중에 용해시켰다. Pd/C (50 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 6회 퍼징한 다음, 수소 분위기 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 증발 건조시켰다. 잔류물을 디옥산 (2 mL) 중에 용해시켰다. NaOH (0.349 mL, 1.745 mmol) 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, 10-mM NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, 10-mM NH4OAc 포함; 구배: 8% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 8-48% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 114 (2.1 mg, 4.7%)를 수득하였다.
실시예 12 - 화합물 115
Figure pct00062
1-(4-((5-아미노-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)에탄-1-온 (64 mg, 0.174 mmol)을 THF (5 mL) 중에 용해시켰다. TBAF (0.521 mL, 0.521 mmol)를 첨가하고, 반응물을 빙조에서 냉각시켰다. THF (1 mL) 중 (트리플루오로메틸)트리메틸실란 (루퍼트 시약, 0.126 mL, 1.737 mmol)의 용액을 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 천천히 가온되도록 하고, 1시간 동안 교반하였다. 추가의 (트리플루오로메틸)트리메틸실란 (0.126 mL, 1.737 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가로 30분 동안 교반하였다. 반응물을 물 (0.5 mL) 및 MeOH (0.5 mL)로 켄칭하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, 0.1% TFA 포함; 구배: 12% B에서 0-분 유지, 25분에 걸쳐 12-52% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켰다. 물질을 추가로 정제용 LC/MS에 의해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 페닐, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, 10-mM NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, 10-mM NH4OAc 포함; 구배: 28% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 28-68% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 115 (5.0 mg, 21% 수율)를 수득하였다.
실시예 13 - 화합물 116
Figure pct00063
단계 1. THF (40 mL) 중 ((4-브로모-2-메톡시벤질)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 (3 g, 9.05 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸리튬 (3.80 mL, 9.51 mmol)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 생성된 용액을 -78℃에서 15분 동안 교반하였다. THF (10 mL) 중 벤질 3-옥소아제티딘-1-카르복실레이트 (1.765 g, 8.60 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 40 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (3 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 60% EtOAc)하여 벤질 3-(4-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-3-메톡시페닐)-3-히드록시아제티딘-1-카르복실레이트 (679 mg, 16.39% 수율)를 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.38 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.27 - 7.17 (m, 5H), 6.95 (dd, J=7.9, 1.5 Hz, 1H), 6.81 (d, J=1.5 Hz, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.63 (s, 2H), 4.28 - 4.11 (m, 4H), 3.71 (s, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.00 (s, 6H).
단계 2. 20 mL 섬광 바이알에 벤질 3-(4-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-3-메톡시페닐)-3-히드록시아제티딘-1-카르복실레이트 (680 mg, 1.486 mmol), 트리에틸아민 (0.414 mL, 2.97 mmol), DMAP (18.15 mg, 0.149 mmol) 및 DCM (5 mL)을 채웠다. 아세트산 무수물 (0.154 mL, 1.634 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시키고, MeCN (5 mL) 중에 용해시키고, 2회 증발 건조시켰다. 잔류물을 MeCN (4 mL) 중에 용해시켰다. TBAF (2.97 mL, 2.97 mmol, THF 중 1N)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시킨 다음, MeCN (5 mL) 중에 용해시키고, 2회 증발 건조시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 60% EtOAc)를 사용하여 정제하여 벤질 3-아세톡시-3-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페닐)아제티딘-1-카르복실레이트 (260 mg, 45% 수율)를 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.38 - 7.27 (m, 6H), 6.95 (dd, J=7.7, 1.8 Hz, 1H), 6.88 (d, J=1.5 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.66 (s, 2H), 4.47 - 4.39 (m, 4H), 3.86 (s, 3H), 2.10 (s, 3H).
단계 3. 벤질 3-아세톡시-3-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페닐)아제티딘-1-카르복실레이트 (260 mg, 0.675 mmol)를 DCM (5 mL) 중에 용해시켰다. SOCl2 (0.059 mL, 0.810 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시키고, MeCN (5 mL) 중에 용해시키고, 다시 증발시켜 벤질 3-아세톡시-3-(4-(클로로메틸)-3-메톡시페닐)아제티딘-1-카르복실레이트 (270 mg, 0.669 mmol, 99% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다.
단계 4. 20 mL 섬광 바이알에 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (200 mg, 0.583 mmol), Cs2CO3 (380 mg, 1.166 mmol) 및 DMF (2 mL)를 채우고, 빙조에서 냉각시켰다. DMF (3 mL) 중 벤질 3-아세톡시-3-(4-(클로로메틸)-3-메톡시페닐)아제티딘-1-카르복실레이트 (130 mg, 0.322 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 천천히 가온되도록 하고, 24시간 동안 교반하였다. 물 (10 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (4 x 5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (24 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, DCM 중 0에서 10% MeOH)하여 벤질 3-아세톡시-3-(4-((3-브로모-7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)아제티딘-1-카르복실레이트 (163 mg, 20% 수율, 약 50%, 2-위치이성질체로 오염됨)를 수득하였다.
LC/MS [M-H]- 708.0, 710.0.
단계 5. 에탄올 (20 mL) 중 벤질 3-아세톡시-3-(4-((3-브로모-7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)아제티딘-1-카르복실레이트 (163 mg, 0.229 mmol, 1- 및 2-위치이성질체의 혼합물)의 용액에 10% Pd/C (100 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 6회 퍼징한 다음, 수소 분위기 하에 2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발 건조시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, DCM 중 0에서 20% MeOH)하여 3-(4-((7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)아제티딘-3-일 아세테이트 (20 mg, 0.040 mmol, 17.52% 수율)를 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.63 (br s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.17 - 6.92 (m, 3H), 6.57 (d, J=7.9 Hz, 1H), 5.72 (s, 2H), 4.28 - 4.16 (m, 4H), 3.86 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.55 - 3.47 (m, 2H), 2.08 (s, 3H), 1.56 (quin, J=7.3 Hz, 2H), 1.25 (sxt, J=7.4 Hz, 2H), 0.91 - 0.84 (m, 3H).
LC/MS [M+H]+ 498.25.
단계 6. 3-(4-((7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)아제티딘-3-일 아세테이트 (20 mg, 0.040 mmol)를 디옥산 (2 mL) 중에 용해시켰다. NaOH (0.201 mL, 1.005 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 4% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 4-44% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 116 (3.5 mg, 22% 수율)을 수득하였다.
실시예 14 - 화합물 117
Figure pct00064
단계 1. THF (40 mL) 중 ((4-브로모-2-메톡시벤질)옥시)(tert-부틸)디메틸실란 (2.75 g, 8.30 mmol)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다. n-부틸리튬 (3.49 mL, 8.72 mmol)을 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 생성된 용액을 -78℃에서 15분 동안 교반하였다. THF (10 mL) 중 시클로부타논 (0.611 g, 8.72 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하고, 포화 NaHCO3 용액 (100 mL)에 부었다. EtOAc (3 x 40 mL)로 추출하여 합쳐진 유기 상을 수득하고, 이를 염수 (3 x 40 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (80 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 25% EtOAc)하여 1-(4-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-3-메톡시페닐)시클로부탄-1-올 (2.015 g, 75% 수율)을 오일로서 수득하였으며, 이는 정치 시 응고하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.35 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.98 (dd, J=7.7, 1.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J=1.5 Hz, 1H), 4.64 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.50 - 2.42 (m, 2H), 2.30 - 2.21 (m, 2H), 1.95 - 1.81 (m, 1H), 1.64 - 1.52 (m, 1H), 0.86 - 0.83 (m, 9H), 0.00 (s, 6H).
단계 2. 20 mL 섬광 바이알에 1-(4-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-3-메톡시페닐)시클로부탄-1-올 (2 g, 6.20 mmol), 트리에틸아민 (1.729 mL, 12.40 mmol), DMAP (0.076 g, 0.620 mmol) 및 DCM (20 mL)을 채웠다. 아세트산 무수물 (0.644 mL, 6.82 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 MeCN (5 mL) 중에 용해시키고, 2회 증발 건조시켰다. 잔류물을 MeCN (8 mL) 중에 재용해시켰다. TBAF (12.40 mL, 12.40 mmol, THF 중 1N)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시켰다. 잔류물을 MeCN (5 mL) 중에 용해시키고, 2회 증발 건조시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 1-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페닐시클로부틸 아세테이트 (1.0 g, 64% 수율)를 오일로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.26 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.07 (dd, J=7.8, 1.7 Hz, 1H), 6.98 (d, J=1.3 Hz, 1H), 4.67 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 2.70 - 2.55 (m, 4H), 2.09 - 1.92 (m, 4H), 1.74 (dquin, J=11.2, 8.8 Hz, 1H).
단계 3. 1-(4-(히드록시메틸)-3-메톡시페닐)시클로부틸 아세테이트 (500 mg, 1.998 mmol)를 DCM (10 mL) 중에 용해시키고, 빙조에서 냉각시켰다. DIPEA (0.436 mL, 2.497 mmol)를 첨가하고, 이어서 메탄술포닐 클로라이드 (0.467 mL, 5.99 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, DCM (2 x 5 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 NaHCO3 용액 (10 mL) 및 염수 (2 x 10 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켜 1-(3-메톡시-4-(((메틸술포닐)옥시)메틸)페닐)시클로부틸 아세테이트 (498 mg, 76% 수율)를 오일로서 수득하였다.
단계 4. 0℃에서 DMF (2 mL) 중 메틸 (3-브로모-7-(부틸아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (650 mg, 1.894 mmol)의 교반 용액에 Cs2CO3 (1234 mg, 3.79 mmol)을 첨가하고, 이어서 DMF (1 mL) 중 1-(3-메톡시-4-(((메틸술포닐)옥시)메틸)페닐)시클로부틸 아세테이트 (498 mg, 1.515 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 72시간 동안 교반하고, 포화 NaHCO3 용액 (50 mL)에 부었다. EtOAc (3 x 40 mL)로 추출하여 유기 상을 수득하고 이를 합하고 염수 (4 x 30 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고 농축하였다. 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 65% EtOAc)하여 1-(4-((3-브로모-7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)시클로부틸 아세테이트 (242 mg, 22% 수율)를 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.86 (s, 1H), 7.30 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.02 - 6.96 (m, 2H), 6.73 (d, J=7.7 Hz, 1H), 5.68 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.63 (s, 3H), 3.60 - 3.50 (m, 2H), 3.32 (s, 2H), 2.59 - 2.44 (m, 2H), 1.96 (s, 3H), 1.94 - 1.86 (m, 1H), 1.77 - 1.65 (m, 1H), 1.59 (quin, J=7.3 Hz, 2H), 1.27 (sxt, J=7.4 Hz, 2H), 0.88 (t, J=7.4 Hz, 3H). LC/MS [M+H]+ 575.37, 577.37.
단계 5. 1-(4-((3-브로모-7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시페닐)시클로부틸 아세테이트 (200 mg, 0.348 mmol)를 EtOH (25 mL) 중에 용해시켰다. 10% Pd/C (50 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 6회 퍼징하고, 수소 분위기 하에 밤새 교반하고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 디옥산 (2 mL) 중에 용해시켰다. NaOH (0.242 mL, 1.208 mmol)를 첨가하고, 반응물을 80℃로 가열하고, 이 온도에서 4시간 동안 유지하였다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 5N HCl로 중화시킨 다음, 증발 건조시켰다. 잔류물을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 16% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 16-56% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 117 (22.5 mg, 16% 수율)을 수득하였다.
실시예 15 - 화합물 118
Figure pct00065
-78℃에서 THF (8 mL) 중 티타늄(IV) 이소프로폭시드 (257 mg, 0.904 mmol)의 용액에 에틸마그네슘 브로마이드 (2.71 mL, 2.71 mmol)를 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 60분 동안 교반하였다. 이어서, THF (1 mL) 중 메틸 4-((7-(부틸아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시벤조에이트 (100 mg, 0.226 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 천천히 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응물을 물 (20 mL)로 켄칭하고, 여과하고, EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (3 x 5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 디옥산 (2 mL) 중에 용해시켰다. NaOH (0.436 mL, 2.179 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 이를 HCl로 중화시키고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 19% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 19-59% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켰다. 물질을 추가로 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 20% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 20-60% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 118 (9.4 mg, 11% 수율)을 수득하였다.
실시예 16 - 화합물 109
Figure pct00066
단계 1. THF (1 mL) 중 메틸 (S)-4-((7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-5-((메톡시카르보닐)아미노)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-1-일)메틸)-3-메톡시벤조에이트 (30 mg, 0.041 mmol; US 2020/0038403, 도 3A, 화합물 24)의 용액을 THF 중 메틸마그네슘 클로라이드 (0.069 mL, 0.207 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, LCMS는 반응의 완결을 나타냈다. 반응물을 MeOH (1mL)로 켄칭하고, 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 후속 단계에 그대로 사용하였다.
단계 2. 디옥산 (0.5 mL) 중 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-(4-(2-히드록시프로판-2-일)-2-메톡시벤질)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (26 mg, 0.036 mmol)의 용액을 NaOH (0.179 mL, 0.179 mmol)로 처리하고, 80℃에서 밤새 가열한 후, LCMS는 카르바메이트 및 TBDPS의 탈보호를 나타냈다. 반응물을 6M HCl의 느린 첨가에 의해 pH 7로 중화시키고, 용매를 증발시켰다. 조 물질을 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, 10-mM NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, 10-mM NH4OAc 포함; 구배: 11% B에서 0-분 유지, 20분에 걸쳐 11-51% B, 이어서 100% B에서 4-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 화합물 109를 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켰다.
실시예 17 - 화합물 119
Figure pct00067
단계 1. 바이알에 4,4,5,5-테트라메틸-2-(프로프-1-엔-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란 (0.832 g, 4.95 mmol), 6-브로모-3-메톡시-2-메틸피리딘 (1 g, 4.95 mmol), [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) (0.362 g, 0.495 mmol), 디옥산 (9.90 ml) 및 물 (2.475 ml)을 채웠다. 반응 혼합물을 65℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액 (10 mL)에 붓고, EtOAc (3 x 5 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (3 x 5 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (40 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 20% EtOAc)를 사용하여 정제하여 3-메톡시-2-메틸-6-(프로프-1-엔-2-일)피리딘 (366 mg, 45% 수율)을 오일로서 수득하였다.
LC/MS [M+H]+ 164.1.
단계 2. 물 (70mL) 중 옥살산철 (III) 6수화물 (1766 mg, 4.48 mmol)의 현탁액을 4시간 동안 교반하여 고체 물질을 용해시켰다. 이어서, 용액을 빙조에서 냉각시키고, 질소로 10분 동안 탈기하였다. EtOH (35 mL) 중 아지드화나트륨 (437 mg, 6.73 mmol)의 용액을 첨가하고, 이어서 EtOH (35 mL) 중 3-메톡시-2-메틸-6-(프로프-1-엔-2-일)피리딘 (366 mg, 2.242 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 5분 동안 교반한 다음; 수소화붕소나트륨 (254 mg, 6.73 mmol)을 5분 간격으로 2 부분으로 첨가하였다. 반응물을 30분 동안 교반하고, 암모니아 용액 (40 mL)으로 켄칭하고, 실온에서 추가로 30분 동안 교반하였다. 생성물을 DCM (3 x 50 mL)으로 추출하고, 합한 유기 상을 염수 (50 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 6-(2-아지도프로판-2-일)-3-메톡시-2-메틸피리딘 (290 mg, 63% 수율)을 무색 액체로서 수득하였다.
LC/MS [M+H]+ 207.2.
단계 3. 에탄올 (7 mL) 중 6-(2-아지도프로판-2-일)-3-메톡시-2-메틸피리딘 (290 mg, 1.406 mmol)의 용액에 탄소 상 10% 팔라듐 (74.8 mg, 0.070 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 4시간 동안 교반하고, 셀라이트™을 통해 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 DCM (7 mL) 중에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. DIPEA (0.737 mL, 4.22 mmol)를 첨가하고, 이어서 메틸 클로로포르메이트 (0.218 mL, 2.81 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 NaHCO3 용액 (20 mL)으로 켄칭하고, DCM (3 x 10 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (10 mL)로 세척하고, 건조하고 (MgSO4), 농축하였다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 메틸 (2-(5-메톡시-6-메틸피리딘-2-일)프로판-2-일)카르바메이트 (219 mg, 65% 수율)를 오일로서 수득하였다.
LC/MS [M+H]+ 239.2.
단계 4. 사염화탄소 (4 mL) 중 NBS (164 mg, 0.919 mmol) 및 AIBN (15.09 mg, 0.092 mmol)의 용액에 메틸 (2-(5-메톡시-6-메틸피리딘-2-일)프로판-2-일)카르바메이트 (219 mg, 0.919 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 75℃에서 3시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후, 이를 증발 건조시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (24 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 헥산 중 0에서 50% EtOAc)를 사용하여 정제하여 메틸 (2-(6-(브로모메틸)-5-메톡시피리딘-2-일)프로판-2-일)카르바메이트 (273 mg, 94% 수율)를 수득하였다.
LC/MS [M+H]+ 317.1, 319.1.
단계 5. DMF (5738 μl) 중 메틸 (7-히드록시-3-아이오도-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (288 mg, 0.861 mmol)의 교반 용액에 Cs2CO3 (308 mg, 0.947 mmol)을 첨가하고, 이어서 메틸 (7-히드록시-3-아이오도-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (288 mg, 0.861 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, EtOAc (50 mL)로 희석하고, 염수 (2 x 20 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 농축시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (0 - 20% MeOH/ DCM)를 사용하여 정제하였다. 생성물-함유 분획을 농축시켜 메틸 (7-히드록시-3-아이오도-1-((3-메톡시-6-(2-((메톡시카르보닐)아미노)프로판-2-일)피리딘-2-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (374 mg, 76% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC/MS [M+H]+ 572.2.
단계 6. DMSO (1645 μl) 중 메틸 (7-히드록시-3-아이오도-1-((3-메톡시-6-(2-((메톡시카르보닐)아미노)프로판-2-일)피리딘-2-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (94 mg, 0.165 mmol), (S)-3-아미노헥산-1-올, HCl (50.6 mg, 0.329 mmol) 및 BOP (109 mg, 0.247 mmol)의 교반 용액에 DBU (99 μl, 0.658 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, EtOAc (30 mL)로 희석하고, 염수 (4 x 20 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (24 g SiO2 칼럼, DCM 중에 로딩함, 0에서 10% MeOH/ DCM)를 사용하여 정제하여 메틸 (S)-(7-((1-히드록시헥산-3-일)아미노)-3-아이오도-1-((3-메톡시-6-(2-((메톡시카르보닐)아미노)프로판-2-일)피리딘-2-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (64 mg, 58.0% 수율)를 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.84 (s, 1H), 7.41 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.18 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.66 (d, J=8.6 Hz, 1H), 5.98 (d, J=17.6 Hz, 1H), 5.80 (d, J=17.6 Hz, 1H), 4.43 (br d, J=6.8 Hz, 1H), 4.34 (dd, J=6.6, 4.6 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.46 - 3.40 (m, 4H), 1.70 - 1.59 (m, 2H), 1.55 - 1.45 (m, 1H), 1.41 (br d, J=9.2 Hz, 1H), 1.14 - 0.96 (m, 8H), 0.73 - 0.68 (m, 3H).
LC/MS [M+H]+ 671.3.
단계 7. 메틸 (S)-(7-((1-히드록시헥산-3-일)아미노)-3-아이오도-1-((3-메톡시-6-(2-((메톡시카르보닐)아미노)프로판-2-일)피리딘-2-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (64 mg, 0.095 mmol)를 EtOH (4772 μl) 중에 용해시켰다. 탄소상 10% 팔라듐 (7.11 mg, 6.68 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기시키고, 수소로 3회 퍼징하고, 수소 분위기 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에탄올 (10 mL)로 세척하면서 셀라이트™을 통해 여과하였다. 여과물을 증발시켜 메틸 (S)-(7-((1-히드록시헥산-3-일)아미노)-1-((3-메톡시-6-(2-((메톡시카르보닐)아미노)프로판-2-일)피리딘-2-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (52.0 mg, 100% 수율)를 고체로서 수득하였다.
LC/MS [M+H]+ = 545.4.
단계 8. MeOH (955 μl) 중 메틸 (S)-(7-((1-히드록시헥산-3-일)아미노)-1-((3-메톡시-6-(2-((메톡시카르보닐)아미노)프로판-2-일)피리딘-2-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (52 mg, 0.095 mmol)의 교반 용액에 NaOH (191 μL, 1.910 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 밤새 교반하고, 농축시키고, 디옥산 (1 mL) 중에 재용해시켰다. 이어서, 이를 NaOH (0.2 mL)로 처리하고, 100℃에서 밤새 교반하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, HCl (159 μL, 1.910 mmol)로 켄칭하고, 농축시켰다. 조 물질을 DMF (2 mL) 중에 용해시키고, 여과하고, 정제용 LC/MS를 통해 하기 조건을 사용하여 정제하였다: 칼럼: 엑스브리지 C18, 200 mm x 19 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 5:95 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 이동상 B: 95:5 아세토니트릴: 물, NH4OAc 포함; 구배: 0% B에서 0-분 유지, 25분에 걸쳐 0-40% B, 이어서 100% B에서 0-분 유지; 유량: 20 mL/분; 칼럼 온도: 25℃. 분획 수집을 MS 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 119 (6.2 mg, 15% 수율)를 수득하였다.
실시예 18 - 화합물 120
Figure pct00068
단계 1. THF (50 mL) 중 메틸 4,6-디클로로니코티네이트 (5 g, 24.27 mmol)의 교반 용액에, 소듐 메탄올레이트 (5.41 mL, 29.1 mmol)를 0℃에서 2분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 5분 동안 교반한 다음, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (50 mL)과 에틸 아세테이트 (50 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수 용액 (100 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 조 생성물을 수득하였으며, 이를 플래쉬 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 칼럼, 석유 에테르 중 30% EtOAc)에 의해 정제하여 메틸 6-클로로-4-메톡시니코티네이트 (3.4 g, 16.86 mmol, 69.5% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.57 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.82 (s, 3H). LC-MS m/z 202.2 [M+H]+.
단계 2. 0℃에서 THF (40 mL) 중 메틸 6-클로로-4-메톡시니코티네이트 (3.2 g, 15.87 mmol)의 교반 용액에 LiAlH4 (31.7 mL, 31.7 mmol)를 10분에 걸쳐 적가 방식으로 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 물 (1.0 mL), 15% 수성 NaOH (1.0 mL) 및 물 (2.0 mL)을 연속적으로 적가하여 켄칭하였다. 30분 동안 교반한 후, 혼합물을 셀라이트™의 패드를 통해 여과하고, 이를 과량의 EtOAc로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 차가운 에테르 (15 mL)로 세척하고, 건조시켜 (6-클로로-4-메톡시피리딘-3-일)메탄올 (2.2 g, 12.67 mmol, 80% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.20 - 8.14 (m, 1H), 7.15 - 7.07 (m, 1H), 5.20 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.90 - 3.86 (m, 3H). LC-MS m/z 174.2 [M+H] +.
단계 3. DCM (30.0mL) 중 (6-클로로-4-메톡시피리딘-3-일)메탄올 (2.9 g, 16.71 mmol)의 교반 용액에 0℃에서 TEA (4.66 mL, 33.4 mmol), MsCl (2.60 mL, 33.4 mmol) 및 염화리튬 (무수, 1.416 g, 33.4 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 다음, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM과 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜, 담갈색 오일로서 2-클로로-5-(클로로메틸)-4-메톡시피리딘 (3.0 g, 9.22 mmol, 55.2% 수율)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 8.24 - 8.22 (m, 1H), 6.86 - 6.84 (m, 1H), 4.59 - 4.54 (m, 2H), 3.96 - 3.95 (s, 3H). LC-MS m/z 192.0 [M+H]+.
단계 4. DMF (50.0 mL) 중 메틸 (7-히드록시-3-아이오도-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (5.0 g, 14.92 mmol)의 교반 용액에 0℃에서 Cs2CO3 (9.72 g, 29.8 mmol) 및 2-클로로-5-(클로로메틸)-4-메톡시피리딘 (2.87 g, 14.92 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 물을 첨가하였다. 침전된 고체를 여과하고, 과량의 물에 이어서 석유 에테르로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 메틸 (1-((6-클로로-4-메톡시피리딘-3-일)메틸)-7-히드록시-3-아이오도-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (4.9 g, 8.79 mmol, 58.9% 수율)를 회백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 11.69 (br s, 1H), 11.40 - 11.34 (m, 1H), 7.97 - 7.94 (m, 1H), 7.23 - 7.19 (m, 1H), 5.70 - 5.67 (m, 2H), 3.88 - 3.84 (m, 3H), 3.78 - 3.74 (m, 3H). LC-MS m/z 490.8 [M+H]+.
단계 5. DMSO (30.0 mL) 중 메틸 (1-((6-클로로-4-메톡시피리딘-3-일)메틸)-7-히드록시-3-아이오도-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (4.0 g, 8.15 mmol)의 교반 용액에, DBU (3.69 mL, 24.46 mmol), BOP (5.41 g, 12.23 mmol) 및 (S)-1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-아민 (2.90 g, 8.15 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃에서 2시간 동안 교반한 다음, EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 화합물을 이스코 콤비플래쉬 크로마토그래피에 의해 클로로포름 중 50-100%에틸 아세테이트로 용리시켜 정제하여 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-((6-클로로-4-메톡시피리딘-3-일)메틸)-3-아이오도-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (2.89 g, 3.25 mmol, 39.8% 수율)를 담갈색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 9.74 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.59 - 7.55 (m, 2H), 7.52 - 7.33 (m, 7H), 7.28 - 7.22 (m, 2H), 7.16 (s, 1H), 6.75 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.78 - 5.59 (m, 2H), 4.72 - 4.61 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.71 - 3.66 (m, 2H), 3.59 (s, 3H), 1.95 - 1.86 (m, 2H), 1.66 - 1.47 (m, 2H), 1.32 - 1.14 (m, 2H), 0.93 (s, 9H), 0.86 - 0.81 (m, 3H); LC-MS m/z 828.2 [M+H]+.
단계 6. 에틸 아세테이트 (10.0 mL) 및 에탄올 (10.0 mL)의 혼합물 중 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-((6-클로로-4-메톡시피리딘-3-일)메틸)-3-아이오도-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (1.65 g, 1.992 mmol)의 교반 용액에, Pd/C (1.060 g, 0.996 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 주머니 압력 하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트™ 층을 통해 여과하였다. 셀라이트™ 층을 과량의 메탄올로 세척하였다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-((6-클로로-4-메톡시피리딘-3-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (1.5 g, 1.730 mmol, 87% 수율)를 담갈색 고체로서 수득하였다.
LC-MS m/z 702.2 [M+H]+.
단계 7. 1,4-디옥산 (4.0 mL) 및 물 (1.0 mL)의 혼합물 중 메틸 (S)-(7-((1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)아미노)-1-((6-클로로-4-메톡시피리딘-3-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)카르바메이트 (0.5 g, 0.712 mmol)의 교반 용액에, Cs2CO3 (0.696 g, 2.136 mmol), 4,4,5,5-테트라메틸-2-(프로프-1-엔-2-일)-1,3,2-디옥사보롤란 (0.201 mL, 1.068 mmol) 및 PdCl2(dppf).CH2Cl2 부가물 (0.058 g, 0.071 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소로 퍼징하고, 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트™ 층을 통해 여과하였다. 여과물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 화합물을 이스코 콤비플래쉬 크로마토그래피에 의해 클로로포름 중 40-100%에틸 아세테이트로 용리시켜 정제하여 (S)-N7-(1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)-1-((4-메톡시-6-(프로프-1-엔-2-일)피리딘-3-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5,7-디아민 (162 mg, 0.229 mmol, 32.2% 수율)을 갈색 반고체로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7.61 - 7.48 (m, 7H), 7.43 - 7.34 (m, 4H), 7.31 - 7.25 (m, 2H), 7.17 (s, 1H), 5.86 (s, 1H), 5.77 - 5.49 (m, 4H), 5.27 (s, 1H), 4.56 - 4.45 (m, 1H), 3.86 - 3.83 (m, 3H), 3.69 - 3.61 (m, 2H), 2.08 - 2.05 (m, 3H), 1.83 - 1.76 (m, 2H), 1.49 - 1.40 (m, 2H), 1.16 - 1.05 (m, 2H), 0.96 (s, 9H), 0.80 - 0.74 (m, 3H).
LC-MS m/z 650.4 [M+H]+.
단계 8. 옥살산철(III) 6수화물 (0.606 g, 1.539 mmol)을 물 (10.0 mL) 중에서 실온에서 2시간 동안 교반하여 균질 용액을 제조하였다. 이 혼합물을 질소로 10분 동안 0℃에서 탈기하였다. 이 혼합물에 THF (10.0 mL) 및 아지드화나트륨 (0.200 g, 3.08 mmol)을 첨가하고, 이어서 THF (10.0 mL) 중 (S)-N7-(1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)-1-((4-메톡시-6-(프로프-1-엔-2-일)피리딘-3-일)메틸)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5,7-디아민 (0.2 g, 0.308 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 5분 동안 교반하였다. 후속적으로, 수소화붕소나트륨 (0.075 g, 1.969 mmol)을 10분에 걸쳐 2개의 로트로 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 암모니아 용액으로 처리하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM과 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수 용액으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 조 화합물을 이스코 콤비플래쉬 크로마토그래피에 의해 클로로포름 중 0-20% 메탄올로 용리시켜 정제하여 (S)-1-((6-(2-아미노프로판-2-일)-4-메톡시피리딘-3-일)메틸)-N7-(1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5,7-디아민 (130 mg, 0.177 mmol, 57.6% 수율)을 담갈색 반고체로서 수득하였다.
LC-MS m/z 667.2 [M+H]+.
단계 9. MeOH (3.0 mL) 중 (S)-1-((6-(2-아미노프로판-2-일)-4-메톡시피리딘-3-일)메틸)-N7-(1-((tert-부틸디페닐실릴)옥시)헥산-3-일)-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5,7-디아민 (100.0 mg, 0.150 mmol)의 교반 용액에, 진한 HCl (1.0 mL, 1.500 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 디에틸 에테르 및 석유 에테르로 연화처리하고, 고체를 진공 하에 건조시켰다. 조 화합물을 역상 정제용 LC/MS (칼럼: 워터스 엑스브리지 C18, 19 x 150 mm, 5-μm 입자; 이동상 A: 10 mM NH4OAc; 이동상 B: 아세토니트릴; 구배: 20분에 걸쳐 15-55% B, 이어서 100% B에서 5-분 유지; 유량: 15 mL/분)에 의해 정제하였다. 분획 수집을 MS 및 UV 신호에 의해 개시하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 진백 장치를 사용하여 원심 증발을 통해 건조시켜 화합물 120 (11.1 mg, 0.026 mmol, 17.28% 수율)을 수득하였다.
실시예 19 - 출발 물질 및 중간체
차트 1은 본원에 개시된 TLR7 효능제의 제조를 위한 출발 물질 또는 중간체로서 유용할 수 있는 화합물을 제조하기 위한 반응식을 나타낸다. 반응식은 출발 물질 또는 중간체로서 사용될 수 있는 다른 유사한 화합물을 제조하기 위해 적합화될 수 있다. 사용된 시약은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 많은 경우에 그의 사용은 상기 실시예에서 입증되었다.
차트 1
Figure pct00069
생물학적 활성
TLR7 효능제로서 본원에 개시된 화합물의 생물학적 활성은 하기 절차에 의해 검정될 수 있다.
인간 TLR7 효능제 활성 검정
이 절차는 본 명세서에 개시된 화합물의 인간 TLR7 (hTLR7) 효능제 활성을 검정하는 방법을 기재한다.
인간 TLR7-분비 배아 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 리포터 트랜스진을 보유하는 조작된 인간 배아 신장 블루 세포 (HEK-블루™ TLR 세포; 인비보젠(Invivogen))를 비-선택적인 배양 배지 (10% 소 태아 혈청 (시그마(Sigma))이 보충된 DMEM 고-글루코스 (인비트로겐(Invitrogen))) 중에 현탁시켰다. HEK-블루™ TLR7 세포를 384-웰 조직-배양 플레이트의 각 웰에 첨가하고 (웰 당 15,000개 세포), 16-18시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 화합물 (100 nl)을 HEK-블루™ TLR 세포를 함유하는 웰에 분배하고, 처리된 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 18시간 처리 후, 10 마이크로리터의 새로 제조된 퀀티-블루™ 시약 (인비보젠)을 각각의 웰에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하고 (37℃, 5% CO2), SEAP 수준을 엔비전 플레이트 판독기 (OD = 620 nm)를 사용하여 측정하였다. 반수 최대 유효 농도 값 (EC50; 검정 기준선과 최대값 사이의 반응 중간값을 유도하는 화합물 농도)을 계산하였다.
인간 혈액에서의 제I형 인터페론 유전자 (MX-1) 및 CD69의 유도
제I형 인터페론 (IFN) MX-1 유전자 및 B-세포 활성화 마커 CD69의 유도는 TLR7 경로의 활성화시 발생하는 하류 이벤트이다. 하기는 TLR7 효능제에 반응하는 그의 유도를 측정하는 인간 전혈 검정이다.
헤파린첨가 인간 전혈을 인간 대상체로부터 수거하고, 1mM의 시험 TLR7 효능제 화합물로 처리하였다. 혈액을 RPMI 1640 배지로 희석하고, 에코(Echo)를 사용하여 웰당 10 nL을 적가하여 최종 농도 1uM (혈액 10uL 중 10nL)를 수득하였다. 30초 동안 진탕기에서 혼합한 후, 플레이트를 덮고, 챔버에 37℃에서 o/n=17시간 동안 두었다. 고정/용해 완충제를 제조하고 (H2O 중 5x->1x, 37℃에서 가온; Cat# BD 558049), 나중에 사용하기 위해 투과화 완충제 (얼음 상)를 유지하였다.
표면 마커 염색 (CD69)의 경우: 표면 Abs: 0.045ul hCD14-FITC (써모피셔(ThermoFisher) Cat # MHCD1401) + 0.6ul hCD19-ef450 (써모피셔 Cat # 48-0198-42) + 1.5ul hCD69-PE (cat# BD555531) + 0.855ul FACS 완충제를 제조했다. 3ul/웰을 첨가하고, 1분 동안 1000 rpm 회전시키고, 진탕기에서 30초 동안 혼합하고, 얼음 상에 30분 동안 두었다. 30분 후에 70uL의 미리가온된 1x 고정/용해 완충제를 사용하여 자극을 중지시키고, 펠릭스 메이트를 사용하여 재현탁시키고 (15회, 각 플레이트에 대해 팁을 바꿈), 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, HCS 플레이트 세척기로 흡인하고, 진탕기에서 30초 동안 혼합한 다음, 이어서 dPBS 70uL로 세척하고, 2xs (2000rpm, 5분 동안) 펠릿화하고, FACS 완충제 50ul로 세척하고, 1xs (2000rpm, 5분 동안) 펠릿화하였다. 진탕기에서 30초 동안 혼합하였다. 세포내 마커 염색 (MX-1)의 경우: 50ul의 BD 투과화 완충제 III을 첨가하고, 진탕기에서 30초 동안 혼합하였다. 얼음 상에서 30분 동안 (암소에서) 인큐베이션하였다. 50uL의 FACS 완충제 2X (투과화 후에 회전 @2300rpm x 5분)로 세척한 다음, 진탕기에서 30초 동안 혼합하였다. MX1 항체()(4812)-알렉사 647: 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals) #NBP2-43704AF647) 20ul FACS bf + 0.8ul hIgG + 0.04ul MX-1을 함유하는 20ul의 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 1000rpm로 1분 동안 회전시키고, 진탕기에서 30초 동안 혼합하고, 샘플을 암소에서 실온에서 45분 동안 인큐베이션한 다음, 이어서 2x FACS 완충제로 세척하였다 (투과 후에 회전 @2300rpm x 5분). 20ul (35uL, 웰 당 총계)의 FACS 완충제를 재현탁시키고, 호일로 덮고, 4℃에서 두어 다음날 판독하였다. 플레이트를 i큐플러스(iQuePlus)에서 판독하였다. 결과를 툴세트에 기록하고, 커브 마스터에서 IC50 곡선을 생성한다. y-축 100%를 1uM의 레시퀴모드로 설정한다.
마우스 혈액에서의 TNF-알파 및 제I형 IFN 반응 유전자의 유도
TNF-알파 및 제I형 IFN 반응 유전자의 유도는 TLR7 경로의 활성화시 발생하는 하류 이벤트이다. 하기는 TLR7 효능제에 반응하는 마우스 전혈에서의 그의 유도를 측정하는 검정이다.
헤파린첨가 마우스 전혈을 Pen-Strep을 함유한 RPMI 1640에 의해 5:4 (50 uL 전혈 및 배지 40 uL)의 비로 희석하였다. 희석된 혈액 90 uL의 부피를 팔콘(Falcon) 편평 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮기고, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100% DMSO 스톡 중 시험 화합물을 농도 반응 검정 동안 동일한 배지에서 20배 희석한 다음, 이어서 희석된 시험 화합물 10 uL을 웰에 첨가하여 최종 DMSO 농도가 0.5%가 되었다. 대조군 웰은 5% DMSO를 함유하는 10 uL 배지를 수용하였다. 이어서, 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 17시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배양 배지 100 uL을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 원심분리하고, 상청액 130 uL을 ELISA (인비트로젠, 카탈로그 번호 88-7324, 써모-피셔 사이언티픽(Thermo-Fisher Scientific)에 의함)에 의한 TNFa 생산의 검정에 사용하기 위해 제거하였다. 인비트로젠 mRNA 캐처 플러스 키트 (Cat#K1570-02)로부터의 DTT를 함유한 mRNA 캐처 용해 완충제 (1x) 70 uL 부피를 웰 내의 나머지 70 uL 샘플에 첨가하고, 5회 상하로 피펫팅하여 혼합하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 5 - 10분 동안 진탕한 다음, 이어서 프로테이나제 K 2 uL을 각 웰에 첨가하였다 (20 mg/mL). 이어서, 플레이트를 실온에서 15 - 20분 동안 진탕하였다. 이어서, 플레이트를 추가로 가공할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
동결된 샘플을 해동시키고, mRNA를 인비트로젠 mRNA 캐처 플러스 키트 (Cat# K1570-02)를 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 추출하였다. RNA 추출로부터의 절반 수율의 mRNA를 사용하여 인비트로젠 슈퍼스크립트 IV VILO 마스터 믹스 (Cat# 11756500)를 사용하여 20 μL 리버스 트랜스크립타제 반응물 중에 cDNA를 합성하였다. 택맨(TaqMan)® 실시간 PCR을 써모피셔 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))로부터의 퀀트스튜디오 실시간 PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. 모든 실시간 PCR 반응을 마우스 IFIT1, IFIT3, MX1 및 PPIA 유전자 발현에 대해 상업적으로 예비설계된 택맨 검정 및 택맨 마스터 믹스를 사용하여 이중으로 실행하였다. PPIA를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. 제조업체의 권장사항을 따랐다. 모든 미가공 데이터 (Ct)를 평균 하우스키핑 유전자 (Ct)에 의거해 정규화하고, 이어서 비교 Ct (ΔΔCt) 방법을 사용하여 실험적 분석에 대한 상대 유전자 발현을 정량화 (RQ)하였다.
정의
"지방족"은 명시된 수의 탄소 원자를 갖거나 (예를 들어, "C3 지방족", "C1-5 지방족", "C1-C5 지방족" 또는 "C1 내지 C5 지방족"에서와 같으며, 후자 3개의 어구는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모이어티에 대한 동의어임) 또는 탄소 원자의 수가 명확하게 명시되지 않은 경우에는 1 내지 4개의 탄소 원자 (불포화 지방족 모이어티의 경우에는 2 내지 4개의 탄소)를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다. 유사한 이해가 C2-4 알켄, C4-C7 시클로지방족 등에서와 같은 다른 유형에서의 탄소의 수에 적용된다. 유사한 맥락에서, "(CH2)1-3"과 같은 용어는 이러한 용어가 CH2, CH2CH2, 및 CH2CH2CH2를 나타내도록, 아래첨자가 1, 2, 또는 3인 것에 대한 약칭으로서 이해되어야 한다.
"알킬"은 포화 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C1-C4 알킬 모이어티는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸, 1-부틸, 2-부틸 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "알칸디일" (때때로 "알킬렌"으로도 지칭됨)은 알킬 기의 2가 대응물, 예컨대
Figure pct00070
를 의미한다.
"알케닐"은 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C2-C4 알케닐 모이어티는 에테닐 (비닐), 2-프로페닐 (알릴 또는 프로프-2-에닐), 시스-1-프로페닐, 트랜스-1-프로페닐, E- (또는 Z-) 2-부테닐, 3-부테닐, 1,3-부타디에닐 (부트-1,3-디에닐) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"알키닐"은 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C2-C4 알키닐 기는 에티닐 (아세틸레닐), 프로파르길 (프로프-2-이닐), 1-프로피닐, 부트-2-이닐 등을 포함한다.
"시클로지방족"은 1 내지 3개의 고리를 가지며, 각각의 고리가 3 내지 8개 (바람직하게는 3 내지 6개)의 탄소 원자를 갖는, 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다. "시클로알킬"은 각각의 고리가 포화된 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알케닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알키닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 시클로지방족 모이어티를 의미한다. 예시로서, 시클로지방족 모이어티는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸 및 아다만틸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 시클로지방족 모이어티는 시클로알킬 모이어티, 특히 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이다. "시클로알칸디일" (때때로 "시클로알킬렌"으로도 지칭됨)은 시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다. 유사하게, "비시클로알칸디일" (또는 "비시클로알킬렌") 및 "스피로시클로알칸디일" (또는 "스피로알킬렌")은 비시클로알킬 및 스피로알킬 (또는 "스피로시클로알킬") 기의 2가 대응물을 지칭한다.
"헤테로시클로지방족"은 그의 적어도 1개의 고리 내에서, 3개 이하 (바람직하게는 1 내지 2개)의 탄소가 N, O, 또는 S로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자로 대체된 것인 시클로지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 N 및 S는 임의로 산화될 수 있고, N은 임의로 4급화될 수 있다. 바람직한 시클로지방족 모이어티는 5- 내지 6-원 크기인 1개의 고리로 이루어진다. 유사하게, "헤테로시클로알킬", "헤테로시클로알케닐", 및 "헤테로시클로알키닐"은 그의 적어도 1개의 고리가 이렇게 하여 변형된, 각각 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 시클로알키닐 모이어티를 의미한다. 예시적인 헤테로시클로지방족 모이어티는 아지리디닐, 아제티디닐, 1,3-디옥사닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸릴, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로티오피라닐 술폰, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리닐 술폭시드, 티오모르폴리닐 술폰, 1,3-디옥솔라닐, 테트라히드로-1,1-디옥소티에닐, 1,4-디옥사닐, 티에타닐 등을 포함한다. "헤테로시클로알킬렌"은 헤테로시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"알콕시", "아릴옥시", "알킬티오", 및 "아릴티오"는 각각 -O(알킬), -O(아릴), -S(알킬), 및 -S(아릴)을 의미한다. 예는 각각 메톡시, 페녹시, 메틸티오 및 페닐티오이다.
보다 좁은 의미가 지정되지 않는 한, "할로겐" 또는 "할로"는 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘을 의미한다.
"아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 방향족인 모노-, 비-, 또는 트리시클릭 고리계 (바람직하게는 모노시클릭)를 갖는 탄화수소 모이어티를 의미한다. 고리계 내의 고리는 서로 융합될 수 있거나 (나프틸에서와 같음) 또는 서로 결합될 수 있으며 (비페닐에서와 같음), 비-방향족 고리에 융합 또는 결합될 수 있다 (인다닐 또는 시클로헥실페닐에서와 같음). 추가 예시로서, 아릴 모이어티는 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 비페닐, 페난트릴, 안트라세닐 및 아세나프틸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "아릴렌"은 아릴 기의 2가 대응물, 예를 들어 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌, 또는 1,4-페닐렌을 의미한다.
"헤테로아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 N, O, 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 방향족 고리인 모노-, 비-, 또는 트리시클릭 고리계 (바람직하게는 5 내지 7-원 모노시클릭)를 갖는 모이어티를 의미하며, 여기서 N 및 S는 임의로 산화될 수 있고, N은 임의로 4급화될 수 있다. 이러한 적어도 1개의 헤테로원자 함유 방향족 고리는 다른 유형의 고리에 융합될 수 있거나 (벤조푸라닐 또는 테트라히드로이소퀴놀릴에서와 같음) 또는 다른 유형의 고리에 직접 결합될 수 있다 (페닐피리딜 또는 2-시클로펜틸피리딜에서와 같음). 추가 예시로서, 헤테로아릴 모이어티는 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐 (티에닐), 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, N-옥소피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 퀴노잘리닐, 나프티리디닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 벤조티오페닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 페노티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 디벤조푸라닐, 카르바졸릴, 디벤조티오페닐, 아크리디닐 등을 포함한다. "헤테로아릴렌"은 헤테로아릴 기의 2가 대응물을 의미한다.
"비치환되거나 또는 치환된 C1-C5 알킬" 또는 "임의로 치환된 헤테로아릴"에서와 같은 "비치환되거나 또는 치환된" 또는 "임의로 치환된" 어구의 사용에 의해서와 같이 모이어티가 치환될 수 있는 것으로 나타낸 경우에, 이러한 모이어티는 1개 이상의 독립적으로 선택된 치환기, 바람직하게는 수에 있어서 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 수에 있어서 1 또는 2개를 가질 수 있다. 치환기 및 치환 패턴은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, 치환기가 부착되는 모이어티를 고려하여, 화학적으로 안정하고 관련 기술분야에 공지된 기술뿐만 아니라 본원에 제시된 방법에 의해 합성될 수 있는 화합물을 제공하도록 선택될 수 있다. 모이어티가 "비치환되거나 또는 치환된" 또는 "임의로 치환된" 것으로 확인되는 경우에, 바람직한 실시양태에서 이러한 모이어티는 비치환된다.
"아릴알킬", "(헤테로시클로지방족)알킬", "아릴알케닐", "아릴알키닐", "비아릴알킬" 등은, 예를 들어 벤질, 페네틸, N-이미다조일에틸, N-모르폴리노에틸 등에서와 같이, 경우에 따라 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 모이어티에서 개방 (비충족) 원자가를 갖는, 경우에 따라 아릴, 헤테로시클로지방족, 비아릴 등의 모이어티로 치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 모이어티를 의미한다. 반대로, "알킬아릴", "알케닐시클로알킬" 등은, 경우에 따라 예를 들어 메틸페닐 (톨릴) 또는 알릴시클로헥실에서와 같이, 경우에 따라 알킬, 알케닐 등의 모이어티로 치환된 아릴, 시클로알킬 등의 모이어티를 의미한다. "히드록시알킬", "할로알킬", "알킬아릴", "시아노아릴" 등은, 경우에 따라 확인된 치환기 (경우에 따라 히드록실, 할로 등) 중 1개 이상으로 치환된 알킬, 아릴 등의 모이어티를 의미한다.
예를 들어, 허용되는 치환기는 알킬 (특히 메틸 또는 에틸), 알케닐 (특히 알릴), 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로 (특히 플루오로), 할로알킬 (특히 트리플루오로메틸), 히드록실, 히드록시알킬 (특히 히드록시에틸), 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬) (특히 -OCF3), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), -SO2N(알킬)2 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치환될 모이어티가 지방족 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(=O)알킬, -S(시클로알킬), -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(아릴), =O, =NOH, =NO(알킬), -OC(=O)(알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, 및 -NHC(=NH)NH2이다. 페닐, 시아노, 할로, 히드록실, 니트로, C1-C4 알콕시, O(C2-C4 알칸디일)OH, 및 O(C2-C4 알칸디일)할로가 특히 바람직하다.
치환될 모이어티가 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(아릴), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), 알킬티오, 아릴티오, -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, 및 -NHC(=NH)NH2이다. C1-C4 알킬, 시아노, 니트로, 할로, 및 C1-C4알콕시가 특히 바람직하다.
"C1-C5 알킬" 또는 "5 내지 10%"에서와 같이 범위가 언급된 경우에, 이러한 범위는 첫 번째 경우에서는 C1 및 C5 및 두 번째 경우에서는 5% 및 10%에서와 같은 범위의 종점을 포함한다.
특정한 입체이성질체가 구체적으로 (예를 들어, 구조 화학식에서의 관련 입체중심에서 굵은선 또는 파선 결합에 의해, 구조 화학식에서 E 또는 Z 배위를 갖는 것으로서의 이중 결합의 도시에 의해, 또는 입체화학-지정 명명법 또는 기호의 사용에 의해) 나타나 있지 않은 한, 모든 입체이성질체는 순수한 화합물뿐만 아니라 그의 혼합물로서 본 발명의 범주 내에 포함된다. 달리 나타내지 않는 한, 라세미체, 개별 거울상이성질체 (광학적으로 순수하거나 또는 부분적으로 분해됨), 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 및 그의 조합 및 혼합물은 모두 본 발명에 의해 포괄된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 화합물이 본원에 사용된 구조 화학식에 도시된 것들과 등가인 호변이성질체 형태 (예를 들어, 케토 및 엔올 형태), 공명 형태 및 쯔비터이온 형태를 가질 수 있다는 것 및 구조 화학식이 이러한 호변이성질체, 공명 또는 쯔비터이온 형태를 포괄한다는 것을 인지할 것이다.
"제약상 허용되는 에스테르"는 생체내에서 (예를 들어 인간 신체에서) 가수분해되어 모 화합물 또는 그의 염을 생산하거나, 또는 그 자체로 모 화합물의 것과 유사한 활성을 갖는 에스테르를 의미한다. 적합한 에스테르는 C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐 또는 C2-C5 알키닐 에스테르, 특히 메틸, 에틸 또는 n-프로필을 포함한다.
"제약상 허용되는 염"은 제약 제제에 적합한 화합물의 염을 의미한다. 화합물이 1개 이상의 염기성 기를 갖는 경우에, 염은 산 부가염, 예컨대 술페이트, 히드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 말레에이트, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 파모에이트 (엠보네이트), 히드로아이오다이드, 니트레이트, 히드로클로라이드, 락테이트, 메틸술페이트, 푸마레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 메실레이트, 락토비오네이트, 수베레이트, 토실레이트 등일 수 있다. 화합물이 1개 이상의 산성 기를 갖는 경우에, 염은 칼슘 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 메글루민 염, 암모늄 염, 아연 염, 피페라진 염, 트로메타민 염, 리튬 염, 콜린 염, 디에틸아민 염, 4-페닐시클로헥실아민 염, 벤자틴 염, 나트륨 염, 테트라메틸암모늄 염 등과 같은 염일 수 있다. 다형성 결정질 형태 및 용매화물은 본 발명의 범주 내에 또한 포괄된다.
용어 "대상체"는 영장류 (예를 들어, 인간), 원숭이, 소, 돼지, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 또는 마우스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 동물을 지칭한다. 용어 "대상체" 및 "환자"는, 예를 들어 포유동물 대상체, 예컨대 인간과 관련하여 본원에서 참조로 상호교환가능하게 사용된다.
질환 또는 장애를 치료하는 것과 관련하여, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 장애, 질환 또는 상태, 또는 장애, 질환 또는 상태와 연관된 증상 중 1종 이상의 완화 또는 제거; 또는 질환, 장애 또는 상태 또는 그의 1종 이상의 증상의 진행, 확산 또는 악화의 저속화를 포함하도록 의도된다. "암의 치료"는 하기 효과: (1) 종양 성장의 (i) 저속화 및 (ii) 완전 성장 정지를 포함하는 어느 정도까지의 억제; (2) 종양 세포 수의 감소; (3) 종양 크기의 유지; (4) 종양 크기의 감소; (5) 말초 기관으로의 종양 세포 침윤의 (i) 감소, (ii) 저속화 또는 (iii) 완전 예방을 포함하는 억제; (6) 전이의 (i) 감소, (ii) 저속화 또는 (iii) 완전 예방을 포함하는 억제; (7) (i) 종양 크기의 유지, (ii) 종양 크기의 감소, (iii) 종양 성장의 저속화, (iv) 침습의 감소, 저속화 또는 예방을 유발할 수 있는 항종양 면역 반응의 증진, 및/또는 (8) 장애와 연관된 1종 이상의 증상의 중증도 또는 수의 어느 정도까지의 경감 중 1종 이상을 지칭한다.
본 명세서의 화학식에서, 결합을 가로지르는 파상선 (
Figure pct00071
) 또는 결합의 말단에서의 별표 (*)는 공유 부착 부위를 나타낸다. 예를 들어, 화학식
Figure pct00072
에서 R이
Figure pct00073
이거나 또는 R이
Figure pct00074
이다라는 언급은
Figure pct00075
임을 의미한다.
본 명세서의 화학식에서, 방향족 고리를 그의 2개의 탄소 사이를 가로지르는 결합은 결합에 부착된 기가 암시적으로 그곳에 존재하는 (또는 그려진 경우, 그곳에 명백하게 존재하는) 수소의 제거에 의해 이용가능하게 되는 방향족 고리의 임의의 위치에 위치할 수 있음을 의미한다. 예시로서:
Figure pct00076
는
Figure pct00077
를 나타내고,
Figure pct00078
는
Figure pct00079
를 나타내고,
Figure pct00080
는
Figure pct00081
를 나타낸다.
본 개시내용은 본원에 기재된 화합물에서 발생하는 원자의 모든 동위원소를 포함한다. 동위원소는 동일한 원자 번호를 갖지만 상이한 질량수를 갖는 원자를 포함한다. 일반적 예로서 및 비제한적으로, 수소의 동위원소는 중수소 및 삼중수소를 포함한다. 탄소의 동위원소는 13C 및 14C를 포함한다. 본 발명의 동위원소-표지된 화합물은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상의 기술에 의해 또는 본원에 기재된 것과 유사한 방법에 의해, 달리 사용되는 비-표지된 시약 대신에 적절한 동위원소-표지된 시약을 사용하여 제조될 수 있다. 예로서, C1-C3 알킬 기는 중수소화되지 않을 수 있거나, 부분적으로 중수소화되거나, 또는 완전히 중수소화되고, "CH3"은 CH3, 13CH3, 14CH3, CH2T, CH2D, CHD2, CD3 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 화합물의 다양한 성분은 그의 천연 동위원소 존재비로 존재한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 구조가 1종의 호변이성질체 형태 또는 또 다른 것 - 예를 들어, 케토 대 엔올 -로 그려질 수 있고, 2종의 형태는 동등한 것으로 인식될 것이다.
두문자어들 및 약어들
표 C는 본 명세서에 사용된 두문자어 및 약어의 목록을 그의 의미와 함께 제공한다.
Figure pct00082
Figure pct00083
참고문헌
본 명세서에 앞에서 제1 저자 (또는 발명자) 및 연도에 따른 약기 방식으로 인용된 하기 참고문헌에 대한 전체 인용이 하기에 제공된다. 각각의 이들 참고문헌은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
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상기 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정한 부분 또는 측면과 주로 또는 독점적으로 관련된 구절을 포함한다. 이는 명확성 및 편의성을 위한 것이고, 특정한 특색은 그것이 개시된 구절을 넘어 관련될 수 있으며, 본원의 개시내용은 상이한 구절에서 발견된 정보의 모든 적절한 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, 본원의 다양한 도면 및 설명은 본 발명의 구체적 실시양태와 관련되어 있지만, 구체적 특색이 특정한 도면 또는 실시양태의 문맥에서 개시되는 경우에, 이러한 특색은 또한 적절한 정도로, 또 다른 도면 또는 실시양태의 문맥에서, 또 다른 특색과 조합되어, 또는 본 발명에서 일반적으로 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
추가로, 본 발명이 특정의 바람직한 실시양태의 면에서 구체적으로 기재되기는 하였지만, 본 발명이 이러한 바람직한 실시양태로 제한되는 것은 아니다. 오히려, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 정의된다.

Claims (17)

  1. 화학식 (I) 또는 화학식 (II)에 따른 구조를 갖는 화합물.
    Figure pct00084

    여기서
    각각의 X는 독립적으로 N 또는 CR2이고;
    W는 R3 또는
    Figure pct00085
    이고;
    R1은 (C1-C5 알킬),
    (C2-C5 알케닐),
    (C1-C8 알칸디일)0-1(C3-C6 시클로알킬),
    (C1-C8 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
    (C2-C8 알칸디일)OH,
    (C2-C8 알칸디일)O(C1-C3 알킬),
    (C1-C4 알칸디일)0-1(5-6원 헤테로아릴),
    (C1-C4 알칸디일)0-1페닐,
    (C1-C4 알칸디일)CF3,
    (C2-C8 알칸디일)N[C(=O)](C1-C3 알킬),
    또는
    (C2-C8 알칸디일)NRxRy
    이고;
    각각의 R2는 독립적으로 H, O(C1-C3 알킬), S(C1-C3 알킬), SO2(C1-C3 알킬), C1-C3 알킬, O(C3-C4 시클로알킬), S(C3-C4 시클로알킬), SO2(C3-C4 시클로알킬), C3-C4 시클로알킬, Cl, F, CN; 또는 [C(=O)]0-1NRxRy이고;
    R3은 NH2,
    NH[C(=O)]0-1(C1-C5 알킬),
    N(C1-C5 알킬)2,
    NH[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C8 시클로알킬),
    NH[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C4-C10 비시클로알킬),
    NH[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
    N(C3-C6 시클로알킬)2,
    N[C1-C3 알킬]C(=O)(C1-C6 알킬),
    NH(SO2)(C1-C5 알킬),
    NH(SO2)(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C8 시클로알킬),
    NH(SO2)(C1-C4 알칸디일)0-1(C4-C10 비시클로알킬),
    NH(SO2)(C1-C4 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
    6-원 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티,
    5-원 헤테로방향족 모이어티, 또는
    하기 구조를 갖는 모이어티
    Figure pct00086

    이고;
    R5는 H, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C3-C6 시클로알킬, 할로, O(C1-C5 알킬), (C1-C4 알칸디일)OH, (C1-C4 알칸디일)O(C1-C3 알킬), 페닐, NH(C1-C5 알킬), 5 또는 6원 헤테로아릴,
    Figure pct00087

    이고;
    R6은 NH2,
    (NH)0-1(C1-C5 알킬),
    N(C1-C5 알킬)2,
    (NH)0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C8 시클로알킬),
    (NH)0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C4-C10 비시클로알킬),
    (NH)0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
    N(C3-C6 시클로알킬)2,
    또는
    하기 구조를 갖는 모이어티
    Figure pct00088

    이고;
    R7 및 R8은 독립적으로
    C1-C4 알킬,
    C2-C4 알킬렌,
    C3-C4 시클로알킬
    이거나, 또는 R7 및 R8은 이들이 결합되어 있는 탄소와 조합되어 3- 내지 7-원 시클로알킬 모이어티를 형성하고;
    Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 Rx 및 Ry는 이들이 결합되어 있는 질소와 조합되어 3- 내지 7-원 헤테로사이클을 형성하고;
    여기서 R1, R2, R3, R5, R6, R7, 및 R8에서
    알킬 모이어티, 알칸디일 모이어티, 시클로알킬 모이어티, 또는 하기 화학식
    Figure pct00089

    의 모이어티는
    OH, 할로, CN, (C1-C3 알킬), O(C1-C3 알킬), C(=O)(C1-C3 알킬), SO2(C1-C3 알킬), NRxRy, (C1-C4 알칸디일)OH, (C1-C4 알칸디일)O(C1-C3 알킬)로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
    알킬, 알칸디일, 시클로알킬, 또는 하기 화학식
    Figure pct00090

    의 모이어티는 CH2 기가
    O, SO2, CF2, C(=O), NH,
    N[C(=O)]0-1(C1-C3 알킬),
    N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)CF3,
    N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)OH,
    또는
    N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C5 시클로알킬)
    로 대체될 수 있다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1이
    Figure pct00091

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R2가 OMe인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R5가 H인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 화학식 (Ia)에 따른 구조를 갖는 화합물.
    Figure pct00092
  6. 제5항에 있어서,
    Figure pct00093
    가
    Figure pct00094
    인
    화합물.
  7. 제1항에 있어서, 화학식 (IIa)에 따른 구조를 갖는 화합물.
    Figure pct00095
  8. 제7항에 있어서,
    Figure pct00096
    가
    Figure pct00097
    인
    화합물.
  9. 화학식 (Ia) 또는 (IIa)에 따른 화합물.
    Figure pct00098

    여기서
    R1은
    Figure pct00099
    이고;
    Figure pct00100
    는
    Figure pct00101
    이다.
  10. 암을 앓는 환자에게 항암 면역요법제 및 제1항 또는 제9항에 따른 화합물의 치료상 유효한 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항암 면역요법제가 길항작용 항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 암이 폐암 (비소세포 폐암 포함), 췌장암, 신장암, 두경부암, 림프종 (호지킨 림프종 포함), 피부암 (흑색종 및 메르켈 피부암 포함), 요로상피암 (방광암 포함), 위암, 간세포성암 또는 결장직장암인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 항암 면역요법제가 이필리무맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인 방법.
  14. 화학식 (I') 또는 (II')에 따른 구조를 갖는 화합물.
    Figure pct00102

    여기서
    각각의 X는 독립적으로 N 또는 CR2이고;
    R1은 (C1-C5 알킬),
    (C2-C5 알케닐),
    (C1-C8 알칸디일)0-1(C3-C6 시클로알킬),
    (C1-C8 알칸디일)0-1(C5-C10 스피로알킬),
    (C2-C8 알칸디일)OH,
    (C2-C8 알칸디일)O(C1-C3 알킬),
    (C1-C4 알칸디일)0-1(5-6원 헤테로아릴),
    (C1-C4 알칸디일)0-1페닐,
    (C1-C4 알칸디일)CF3,
    (C2-C8 알칸디일)N[C(=O)](C1-C3 알킬),
    또는
    (C2-C8 알칸디일)NRxRy
    이고;
    각각의 R2는 독립적으로 H, O(C1-C3 알킬), S(C1-C3 알킬), SO2(C1-C3 알킬), C1-C3 알킬, O(C3-C4 시클로알킬), S(C3-C4 시클로알킬), SO2(C3-C4 시클로알킬), C3-C4 시클로알킬, Cl, F, CN; 또는 [C(=O)]0-1NRxRy이고;
    R5는 H, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C3-C6 시클로알킬, 할로, O(C1-C5 알킬), (C1-C4 알칸디일)OH, (C1-C4 알칸디일)O(C1-C3 알킬), 페닐, NH(C1-C5 알킬), 5 또는 6원 헤테로아릴,
    Figure pct00103

    이고;
    R7 및 R8은 독립적으로
    C1-C4 알킬,
    C2-C4 알킬렌,
    C3-C4 시클로알킬
    이거나, 또는 R7 및 R8은 이들이 결합되어 있는 탄소와 조합되어 3- 내지 7-원 시클로알킬 모이어티를 형성하고;
    Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 Rx 및 Ry는 이들이 결합되어 있는 질소와 조합되어 3- 내지 7-원 헤테로사이클을 형성하고;
    여기서 R1, R2, R5, R7, 및 R8에서
    알킬 모이어티, 알칸디일 모이어티, 시클로알킬 모이어티, 또는 하기 화학식
    Figure pct00104

    의 모이어티는
    OH, 할로, CN, (C1-C3 알킬), O(C1-C3 알킬), C(=O)(C1-C3 알킬), SO2(C1-C3 알킬), NRxRy, (C1-C4 알칸디일)OH, (C1-C4 알칸디일)O(C1-C3 알킬)로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
    알킬, 알칸디일, 시클로알킬, 또는 하기 화학식
    Figure pct00105

    의 모이어티는 CH2 기가
    O, SO2, CF2, C(=O), NH,
    N[C(=O)]0-1(C1-C3 알킬),
    N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)CF3,
    N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)OH,
    또는
    N[C(=O)]0-1(C1-C4 알칸디일)0-1(C3-C5 시클로알킬)
    로 대체될 수 있다.
  15. 화학식 (Ia')에 따른 구조를 갖는 화합물.
    Figure pct00106

    여기서
    R1은
    Figure pct00107

    이고,
    Figure pct00108
    는
    Figure pct00109

    이다.
  16. 제1항에 있어서, 모이어티
    Figure pct00110
    가
    Figure pct00111
    인
    화학식 (I)에 따른 화합물.
  17. 제1항에 있어서, 모이어티
    Figure pct00112
    가
    Figure pct00113
    인
    화학식 (II)에 따른 화합물.
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