KR20220128177A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 실시간 ＲＴ－ＰＣＲ을 이용한 ＣＯＶＩＤ－１９ 진단방법 - Google Patents
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 실시간 ＲＴ－ＰＣＲ을 이용한 ＣＯＶＩＤ－１９ 진단방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220128177A KR20220128177A KR1020210032898A KR20210032898A KR20220128177A KR 20220128177 A KR20220128177 A KR 20220128177A KR 1020210032898 A KR1020210032898 A KR 1020210032898A KR 20210032898 A KR20210032898 A KR 20210032898A KR 20220128177 A KR20220128177 A KR 20220128177A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- primer
- sars
- cov
- virus
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 10
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 title abstract description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 75
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 60
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 60
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 60
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 36
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 33
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 32
- 101150001656 ORF3a gene Proteins 0.000 claims description 21
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims description 19
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 101150016678 RdRp gene Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 101000779242 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF3a protein Proteins 0.000 abstract description 9
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 abstract 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 55
- 241001274216 Naso Species 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241001479210 Human astrovirus Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- -1 dNTP Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000985 reactive dye Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 4-(bromomethyl)phenol Chemical compound OC1=CC=C(CBr)C=C1 MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 101100380241 Caenorhabditis elegans arx-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 description 1
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 241001508003 Mycobacterium abscessus Species 0.000 description 1
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 1
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 description 1
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 101500025257 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA-directed RNA polymerase nsp12 Proteins 0.000 description 1
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150092805 actc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 208000015688 methicillin-resistant staphylococcus aureus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010807 real-time PCR kit Methods 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/119—RNA polymerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 실시간 RT-PCR을 이용한 COVID-19 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브; 또는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브;를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물, 상기 검출용 조성물을 포함하는 COVID-19 진단용 키트 및 COVID-19 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 COVID-19 진단방법은 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자를 특이적으로 검출할 수 있으며, 기존 알려진 검출 방법에 비해 검출 특이도 및 민감도가 우수하므로 PCR을 통한 간단한 방법으로 COVID-19를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 실시간 RT-PCR을 이용한 COVID-19 진단방법에 관한 것이다.
2019년 중국 우한지역에서의 폐렴 발생에 대한 원인 병원체로 SARS-CoV-2 바이러스가 확인되었고, 전 세계적으로 7800만명의 감염자가 발생하였으며 국내 확진자 또한 급속도로 증가하여 2020년 12월 23일 현재 52,550명의 환자가 발생하였다.
코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 진단법으로는 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time reverse transcription PCR, Real-time RT-PCR)이 이용되고 있으며 세계적으로 다양한 프로토콜이 제시되어있다. 프로토콜마다 바이러스를 검출하는데 이용되는 유전자 부위에 차이가 존재하며 아직까지 최적의 프로토골에 대해서는 학술적 근거가 더 필요한 실정이다.
현재 코로나바이러스 감염증-19 진단법은 코로나바이러스-19 발생 국가·지역 방문 후 14일 이내 발열 또는 호흡기증상(기침, 인후통 등)을 보이는 자 및 확진환자와 밀접한 관련성이 있는 의심환자 대상으로 진단법이 시행되고 있다.
하지만 코로나바이러스 감염증-19에 감염된 환자들 중, 무증상 감염이 확인되고 있으며 증상 여부 상관없이 바이러스에 노출되어 면역 반응을 일으켰음을 알수 있는 방법으로 항체 검사법이 있으나, 코로나바이러스 감염증-19 진단과 관련해서 항체 진단법은 증상 발생후 1-2주후에 항체가 형성되어 초기 진단에는 유용하지 않다.
따라서 기존에 개발된 개별 진단법보다 민감도와 특이도가 우수할 뿐만 아니라 임상적 효용성이 커서 신속하고 정확하게 코로나바이러스 감염증-19를 진단할 수 있는 효과적인 진단방법의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 신속하고 정확하게 코로나바이러스 감염증-19를 진단할 수 있는 방법을 연구하던 중, SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 유전자 및 ORF3a 유전자를 타겟 마커로 사용할 수 있고, 이들 유전자를 높은 민감도 및 특이도로 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브; 또는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브;를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 진단용 키트를 이용한 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브; 또는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브;를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브는 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 유전자를 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브는 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF3a 유전자를 검출하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은, (1) 코로나바이러스 감염증-19가 의심되는 환자의 분리된 시료에서 핵산을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 진단용 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)를 통해 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자를 확인하는 단계;를 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (1)의 시료는 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 소변 또는 대변일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR 증폭은 컨벤셔널 중합효소 연쇄반응(C-PCR:conventional PCR), 네스티드 중합효소 연쇄반응(N-PCR:nested PCR), 다중 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응 및 역전사 중합효소연쇄반응으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계의 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 유전자는 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용하여 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계의 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF3a 유전자는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 이용하여 확인하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 COVID-19 진단방법은 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자를 특이적으로 검출할 수 있으며, 기존 알려진 검출 방법에 비해 검출 특이도 및 민감도가 우수하므로 PCR을 통한 간단한 방법으로 COVID-19를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물을 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의해 발병되는 COVID-19 진단을 위한 기술을 개발하기 위해 연구하던 중, SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자를 타겟 마커로 사용할 수 있음을 확인하였고, 상기 RdRp 또는 ORF3a 유전자는 SARS-CoV-2 바이러스에 특이적인 서열로 감염여부를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브임을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, SARS-CoV-2 바이러스 유전자에 대한 다양한 서열정보를 바탕으로, RdRp 또는 ORF3a 유전자 서열에서 서열 보존영역을 분석하였고, 상기 보존영역을 검출할 수 있는 다양한 염기서열로 구성된 프라이머 및 프로브들을 제작하였다. 특히 각기 다른 염기서열로 구성된 많은 프라이머 및 프로브들 중에서 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자에 대하여 민감도 및 특이도가 월등히 우수한 프라이머 및 프로브를 발굴하였다.
구체적으로 본 발명에서 발굴된 상기 프라이머 및 프로브로서, SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 유전자 검출이 가능한 nCoV_RdRp-126F 프라이머(5‘-GCTGGTTTTGCTAAATTC-3’, 서열번호 1), nCoV_RdRp-226R 프라이머 (5‘-GTGTGTCTCTTAACTACAA-3’, 서열번호 2) 및 nCoV_RdRp-151P 프로브(5‘-CTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAA- 3’, 서열번호 3)를 고안하였고, SARS-CoV-2 바이러스의 ORF3a 유전자 검출이 가능한 nCoV_3a-63F 프라이머(5‘-GGATGCTACTCCTTCAGA-3’, 서열번호 4), nCoV_3a-225R 프라이머(5‘-CTTGGAGAGTGCTAGTTG-3’, 서열번호 5) 및 nCoV_3a-100P 프로브(5‘-ACGATACCGATACAAGCCTCACTC- 3’, 서열번호 6)를 고안하였다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브; 또는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브;를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브는 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 유전자를 검출할 수 있고, 상기 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브는 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF3a 유전자를 검출할 수 있다.
본 발명에서 상기 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 유전자 서열은 서열번호 9에 나타내었고, 상기 ORF3a 유전자 서열은 서열번호 10에 나타내었다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 고안한 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용한 PCR 수행 결과, 서열번호 7의 101bp 증폭산물인 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 타겟 부위를 검출할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 고안한 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 이용한 PCR 수행 결과, 서열번호 8의 163bp 증폭산물인 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF3a 타겟 부위를 검출할 수 있음을 확인하였다.
나아가 본 발명의 다른 일실시예에서는, 종래 알려진 SARS-CoV-2 바이러스 검출용 키트와 본 발명의 프라이머 및 프로브를 함유한 키트를 이용하여 PCR 방법을 통해, SARS-CoV-2 바이러스 검출효과를 비교 분석하였는데, 종래 검출키트를 사용한 방법에 비해 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 경우가 더 우수한 민감도 및 특이도를 보인다는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따른 상기 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물은 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 또는 ORF3a 유전자를 특이적으로 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물로서, 분석하고자 하는 시료에 SARS-CoV-2 바이러스가 존재하는지의 여부를 분석할 수 있을 뿐만 아니라 COVID-19의 진단을 위한 진단용 조성물로도 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물을 포함하는, 코로나 19 감염증 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 본 발명의 검출용 또는 진단용 조성물은 상기에서 언급한 본 발명에 따른 프라이머 쌍 및 프로브 이외에 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용할 수 있는 성분, 예를 들면 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+ 이온, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
상기 반응용 완충용액은 1~10 mM TrisHCl, 10~40 mM KCl(pH9.0)을 사용할 수 있고, 상기 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한 상기 조성물은 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등을 포함할 수 있다.
상기 비반응성 염료 물질이란 중합효소 연쇄반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어져야 하며, 중합효소 연쇄반응 산물을 이용한 분석이나 식별을 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수용성 염료로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 액상 형태로 제공될 수 있으며, 안정성, 보관의 간편성 및 장기 보관성을 증가시키기 위하여 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한, 임의의 건조 방법은 모두 사용 가능하다. 상기와 같은 건조 방법은 사용되는 효소의 종류 및 양에 따라 상이하게 적용될 수 있다.
상기 조성물은 한 반응 튜브 내에 혼합시킨 후 동결하거나 건조시켜 안정화된 상태로 제조하여 사용하게 됨으로써, 중합효소 연쇄반응 동안에 별도의 혼합과정이 필요하지 않으므로 반응 중 혼합으로 인한 오류를 방지 할 수 있으며, 안정성, 반응성 및 보관성을 향상 시킬 수 있다.
상기의 조성물은 프라이머 쌍 및 프로브를 제외한 나머지 성분인 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+ 이온, DNA 중합효소들이 이미 함유된 시중에 판매되는 제품을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는, COVID-19 진단용 키트를 제공할 수 있다.
상기 진단은 분석하고자 하는 검체 시료에 SARS-CoV-2 바이러스 유전자, 구체적으로는 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자가 포함되어 있는지 여부를 판별하기 위해 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 사용할 수 있으며, 상기 중합효소연쇄반응은 일반적인 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응 (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR) 등을 포함한다. 본 발명의 일실시예에서는 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
본 발명의 진단 키트는 본 발명의 프라이머쌍 및 프로브 이외에도, 역전사효소, 중합효소, 중합효소연쇄반응을 위한 주형 DNA(template DNA)로서 상보적 DNA(cDNA), 및 버퍼 등의 반응 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 일반적인 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소연쇄반응 등에 사용될 수 있는데, 이 경우 분석하고자 하는 시료로부터 분리된 SARS-CoV-2 바이러스의 DNA 유전체를 대상으로 PCR 방법을 수행할 수 있고, 또는 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA 유전체로부터 역전사효소 (reverse transcriptase)의 작용을 통한 역전사 (reverse transcription) 반응을 별도로 수행하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고 이를 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용할 수 있다.
중합효소연쇄반응의 결과물은 아가로즈 겔 전기영동 (agarose gel electrophoresis) 또는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머쌍 및 프로브에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 SARS-CoV-2 바이러스의 감염 여부, 바람직하게는 COVID-19를 진단할 수 있다.
또한 본 발명에서는 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브(probe)를 사용하였는데, 상기 프로브는 각 말단에 형광물질 및 소광체(quencher)를 결합시켜 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 프로브의 5말단에는 형광물질이 결합되고 3말단에는 소광체가 결합된 것일 수 있으며, 프로브의 5말단 에는 적색, 녹색, 청색 등 특정 파장을 방출하는 형광물질이 결합되고 3말단에는 블랙홀 소광체(black hole quencher, BHQ)가 결합될 수 있다. 형광물질과 소광체가 프로브에 결합되어 있는 상태에서는 소광체가 형광물질이 방출하는 빛을 흡수하기 때문에 형광 신호가 검출되지 않는다. 반면, DNA의 합성 및 신장 과정에서 DNA 중합효소의 exonuclease activity에 의해 결합되어 있던 형광물질이 분리되면 형광신호를 검출할 수 있다. 중합효소연쇄반응이 진행되는 동안, 이러한 형광신호를 실시간으로 측정할 수 있으며, 증가한 형광신호를 바탕으로 바이러스 유전자 존재 유무를 판별할 수 있다. 이러한 프로브의 사용은 실시간 중합효소연쇄반응에 유용하게 사용될 수 있다.
나아가 본 발명은 COVID-19의 진단방법을 제공할 수 있으며, COVID-19의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.
바람직하게 상기 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 정보 제공 방법은, (1) 코로나바이러스 감염증-19가 의심되는 환자의 분리된 시료에서 핵산을 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 제4항의 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)를 통해 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자를 확인하는 단계를 포함한다.
또한, 추가로 상기 시료에서 핵산으로 RNA를 분리할 경우, 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 주형으로 본 발명의 진단 키트를 사용하여 실시간 PCR 증폭을 수행할 수 있다.
상기 시료는 이에 제한되지는 않으나, 포유동물로부터 수득한 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 소변 또는 대변일 수 있다.
또한 상기 방법에서 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 또는 ORF3a 유전자의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 방법을 통해 수행할 수 있다.
이상 본 발명에서 고안한 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브; 또는 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF3a 유전자에 특이적으로 결합하는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 본 발명의 키트를 사용할 경우, SARS-CoV-2 바이러스 유전자를 높은 민감도와 정확도로 신속하게 검출할 수 있다는 장점이 있으며, 매우 빠른 시간에 높은 정확도로 COVID-19의 진단이 가능하다는 것을 확인하였다.
그러므로 본 발명에서 고안한 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물을 이용한 COVID-19의 진단 방법 및 COVID-19 진단을 위한 정보 제공방법은 SARS-CoV-2 바이러스 유전자를 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있으며, 실시간으로 SARS-CoV-2 바이러스 유전자의 검출이 가능하기에 약물 투여에 따른 증상의 개선정도를 모니터링 할 수 있고, 나아가 타질환과 COVID-19 질환을 높은 특이도로 구별할 수 있어 보다 정확한 치료법의 선택에도 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
SARS-CoV-2 바이러스의 유전자 검출을 위한 프라이머와 프로브 디자인
한국의 COVID-19 감염증 환자에서 분리된 SARS-CoV-2 바이러스의 유전자 서열에 근거하여 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 유전자 및 ORF3a 유전자를 타겟 검출 유전자로 선정하였고, 각 유전자들의 서열을 분석하여 보존된 위치로 이들 유전자들을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 디자인하였다.
<실시예 2>
본 발명에 따른 프라이머와 프로브를 이용한 SARS-CoV-2 바이러스 검출의 민감도 및 특이도 분석
상기 실시예 1에서 고안된 SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 이용하여 실제적으로 SARS-CoV-2 바이러스 감염여부를 진단할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위한 실험은 하기와 같은 방법을 통해 진행하였다.
<2-1> 검체선정
○ 선정기준
1) 만16세 이상인 자
2) COVID-19 확진된 경증 환자 (NEWS scoring system상 0-4점)
3) 서면 동의 획등한 입원 환자
○ 제외사항
(1) 경구 복용이 불가능한 자
(2) 임산부 또는 수유중인자
(3) 면역저하환자
(4) CCR < 30 mL/min의 신기능저하자
(5) ALT or AST > 5 times ULN 간질환 이상자
<2-2> 검출 특이도 및 민감도 분석
위의 3가지를 만족하는 환자를 대상으로 코로나바이러스 감염증-19 진단을 위한 real time RT-PCR 검사를 시행하였으며, 본 발명에서 최종 선택된 민감도와 특이도가 우수한 프라이머 및 프로브(nCoV_RdRp-126F/ nCoV_RdRp-226R/nCoV_RdRp-151P, nCoV_3a-63F/nCoV_3a-225R/nCoV_3a-100P)와 질병관리청에서 승인한 PowerChekTM 2019-nCoV Real-time PCR kit(kogenebiotech)를 각각 이용하여 real time RT-PCR을 수행하였다.
Real time RT-PCR 검사의 민감도 확인을 위해 2020년도 코로나바이러스 감염증-19 환자를 대상으로 실험을 진행하였으며, 환자 13명으로부터 93개의 객담, 비인두 및 구인두 도말물, 침 검체를 수집하여 real time RT-PCR을 수행하였다. Real time RT-PCR 검사의 특이도 확인을 위해 음성대조군으로 사용한 BEI에서 수집된 다른 바이러스 검체 및 균주, 코로나바이러스 감염증-19 검사에서 음성으로 확인된 객담, 비인두 및 구인두 도말물, 침 검체를 이용하여 real time RT-PCR을 수행하였으며, 상기 real time RT-PCR의 수행 조건은 하기 표 4에 기재된 바와 같다.
| no. | virus | RdRp (본 발명의 프라이머 및 프로브 사용) |
ORF3a (본 발명의 프라이머 및 프로브 사용) |
| 1 | Avian infectious bronchitis virus | Undetermined | Undetermined |
| 2 | Human Coronavirus NL63 | Undetermined | Undetermined |
| 3 | Canine coronavirus | Undetermined | Undetermined |
| 4 | MERS-Coronavirus | Undetermined | Undetermined |
| 5 | SARS-CoV | Undetermined | Undetermined |
| 6 | Human respiratory syncytial virus | Undetermined | Undetermined |
| 7 | Measles virus | Undetermined | Undetermined |
| 8 | Rhinovirus | Undetermined | Undetermined |
| 9 | Human astrovirus (HAstV) type 1 | Undetermined | Undetermined |
| 10 | Human astrovirus (HAstV) type 2 | Undetermined | Undetermined |
| 11 | Klebsiella pneumoniae Isolate 1 | Undetermined | Undetermined |
| 12 | Klebsiella oxytoca MIT 10-5244 | Undetermined | Undetermined |
| 13 | Leptospira interrogans | Undetermined | Undetermined |
| 14 | Mycobacterium abscessus | Undetermined | Undetermined |
| 15 | Mycobacterium avium | Undetermined | Undetermined |
| 16 | Mycobacterium intracellulare | Undetermined | Undetermined |
| 17 | Staphylococcus aureus MRSA | Undetermined | Undetermined |
| 18 | Staphylococcus aureus | Undetermined | Undetermined |
| 19 | Streptococcus pneumoniae | Undetermined | Undetermined |
| 20 | Pseudomonas aeruginosa | Undetermined | Undetermined |
| 21 | Influenza A virus | Undetermined | Undetermined |
| 22 | Influenza B virus | Undetermined | Undetermined |
| 23 | Influenza C virus | Undetermined | Undetermined |
| 24 | SARS-CoV2 | 31.52 | 32.19 |
| no. | lab no. | specimen | Kogene kit: cut off 35 | RdRp (본 발명) |
ORF3a (본 발명) |
|
| E gene | RdRP | |||||
| 1 | 2020-179 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 2 | 2020-180 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 3 | 2020-181 | Nasopharynx | NA | 40.00 | UD | UD |
| 4 | 2020-182 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 5 | 2020-195 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 6 | 2020-195 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 7 | 2020-201 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 8 | 2020-344 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 9 | 2020-344 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 10 | 2020-345 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 11 | 2020-348 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 12 | 2020-349 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 13 | 2020-380 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 14 | 2020-380 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 15 | 2020-381 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 16 | 2020-381 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 17 | 2020-382 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 18 | 2020-382 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 19 | 2020-383 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 20 | 2020-383 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 21 | 2020-384 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 22 | 2020-384 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 23 | 2020-385 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 24 | 2020-385 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 25 | 2020-387 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 26 | 2020-387 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 27 | 2020-388 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 28 | 2020-388 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 29 | 2020-389 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 30 | 2020-390 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 31 | 2020-390 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 32 | 2020-391 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 33 | 2020-391 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 34 | 2020-392 | Nasopharynx | NA | NA | UD | 43.90 |
| 35 | 2020-393 | Nasopharynx | NA | NA | UD | 40.08 |
| 36 | 2020-394 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 37 | 2020-395 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 38 | 2020-395 | sputum | NA | NA | UD | UD |
| 39 | 2020-745 | Nasopharynx | NA | NA | UD | 43.00 |
| 40 | 2020-746 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 41 | 2020-747 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 42 | 2020-748 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 43 | 2020-749 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 44 | 2020-750 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 45 | 2020-751 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 46 | 2020-917 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 47 | 2020-918 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 48 | 2020-919 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 49 | 2020-920 | saliva | NA | NA | UD | 40.71 |
| 50 | 2020-921 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 51 | 2020-922 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 52 | 2020N-01 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 53 | 2020N-02 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 54 | 2020N-03 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 55 | 2020N-04 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 56 | 2020N-05 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 57 | 2020N-06 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 58 | 2020N-07 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 59 | 2020N-08 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 60 | 2020N-10 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 61 | 2020-752 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 62 | 2020-753 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 63 | 2020-754 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 64 | 2020-755 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 65 | 2020-756 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 66 | 2020-757 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 67 | 2020-758 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 68 | 2020-759 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 69 | 2020-760 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 70 | 2020-761 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 71 | 2020-762 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 72 | 2020-763 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 73 | 2020-764 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 74 | 2020-765 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 75 | 2020-766 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 76 | 2020-767 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 77 | 2020-768 | Nasopharynx | NA | NA | UD | UD |
| 78 | 2020-895 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 79 | 2020-896 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 80 | 2020-897 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 81 | 2020-898 | saliva | NA | NA | UD | 40.68 |
| 82 | 2020-899 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 83 | 2020-900 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 84 | 2020-901 | saliva | NA | NA | UD | 41.28 |
| 85 | 2020-902 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 86 | 2020-903 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 87 | 2020-905 | saliva | NA | NA | UD | UD |
| 88 | 2020-907 | saliva | NA | NA | UD | UD |
UD= Undetermined, NA= Not available
그 결과, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 바이러스가 아닌 다른 종류의 바이러스에 대해서는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 분석에서 모두 음성으로 확인되었고, SARS-CoV-2 바이러스 만을 특이적으로 검출할 수 있는 것으로 나타났다.
뿐만 아니라, 상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 코로나바이러스 감염증-19 음성의 임상검체를 대상으로 수행한 분석에서도, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 경우, 모두 분석에서 음성으로 확인되었다.
한편, 2020년도 코로나바이러스 감염증-19 양성 환자들로부터 수득한 다양한 검체를 대상으로 PCR 분석을 수행한 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 모든 검체에서 SARS-CoV-2 바이러스 유전자가 검출되는 것으로 나타났다.
| Lab No. | 검체 | 2019-nCoV Kogene kit: cutoff 35 | 본 발명 | |||||
| IC | E | IC | RdRp | RdRp | ORF3a | |||
| 1 | 2020-107(CoV52) | saliva | 20.16 | 29.28 | 20.74 | 30.47 | 26.51 | 26.45 |
| 2 | 2020-108(CoV32) | sputum | 20.28 | UD | 20.29 | NA | UD | UD |
| 3 | 2020-108(CoV32) | saliva | 20.53 | 33.13 | 20.17 | 33.51 | 29.25 | 28.90 |
| 4 | 2020-111(CoV46) | naso | 19.73 | 20.44 | 20.51 | 21.70 | 18.49 | 18.05 |
| 5 | 2020-111(CoV46) | sputum | 19.90 | 30.36 | 20.48 | 30.12 | 27.50 | 28.39 |
| 6 | 2020-111(CoV46) | saliva | 19.93 | 36.46 | 20.83 | 38.99 | 34.52 | 34.49 |
| 7 | 2020-CoV01 | naso | 20.16 | 25.60 | 20.20 | 26.89 | 23.24 | 23.37 |
| 8 | 2020-CoV01 | oro | 20.27 | 34.30 | 20.22 | 34.96 | 30.46 | 30.48 |
| 9 | 2020-CoV01 | sputum | 20.45 | 32.84 | 20.28 | 33.25 | 29.21 | 29.20 |
| 10 | 2020-CoV02 | sputum | 20.68 | 36.96 | 20.41 | 37.33 | 31.18 | 32.37 |
| 11 | 2020-CoV03 | naso | 20.33 | 35.35 | 20.16 | 37.36 | 34.11 | 33.83 |
| 12 | 2020-CoV03 | sputum | 20.56 | UD | 20.13 | 39.77 | 32.70 | 34.72 |
| 13 | 2020-CoV04 | sputum | 20.31 | 35.70 | 20.18 | 36.38 | 31.63 | 31.74 |
| 14 | 2020-CoV05 | sputum | 20.47 | UD | 20.18 | 39.13 | 32.74 | 34.72 |
| 15 | 2020-CoV06 | sputum | 20.37 | UD | 20.30 | UD | 36.34 | 35.93 |
| 16 | 2020-CoV07 | oro | 20.28 | UD | 20.27 | UD | UD | UD |
| 17 | 2020-CoV08 | oro | 19.76 | UD | 19.47 | UD | UD | UD |
| 18 | 2020-CoV105 | sputum | 20.03 | UD | 19.95 | UD | UD | UD |
| 19 | 2020-CoV108 | naso | 20.46 | UD | 20.14 | UD | UD | UD |
| 20 | 2020-CoV111 | naso | 19.79 | 37.31 | 19.84 | 37.79 | 35.68 | 34.35 |
| 21 | 2020-CoV111 | oro | 20.33 | 32.99 | 19.06 | 32.50 | 30.00 | 27.29 |
| 22 | 2020-CoV111 | sputum | 20.05 | 38.38 | 19.72 | 36.90 | 29.92 | 32.90 |
| 23 | 2020-CoV120 | naso | 20.77 | 33.61 | 20.31 | 34.51 | 32.13 | 32.37 |
| 24 | 2020-CoV127 | sputum | 20.04 | 37.33 | 19.63 | 35.54 | 32.42 | 34.08 |
| 25 | 2020-CoV13 | naso | 20.14 | 28.03 | 20.75 | 29.02 | 25.18 | 25.21 |
| 26 | 2020-CoV13 | saliva | 20.17 | 33.01 | 20.81 | 34.19 | 29.56 | 29.66 |
| 27 | 2020-CoV14 | naso | 19.88 | 21.30 | 20.82 | 22.86 | 19.43 | 19.11 |
| 28 | 2020-CoV16 | naso | 20.45 | 30.84 | 20.33 | 31.60 | 27.52 | 27.75 |
| 29 | 2020-CoV16 | sputum | 20.35 | 33.61 | 20.13 | 34.88 | 31.36 | 31.05 |
| 30 | 2020-CoV17 | naso | 20.32 | 34.12 | 20.39 | 34.99 | 31.69 | 31.24 |
| 31 | 2020-CoV170 | naso | 19.80 | 38.24 | 19.59 | 39.47 | 36.90 | 37.22 |
| 32 | 2020-CoV170 | oro | 19.81 | 38.78 | 19.57 | UD | 36.19 | 35.64 |
| 33 | 2020-CoV170 | sputum | 20.25 | UD | 19.82 | 39.39 | 36.57 | UD |
| 34 | 2020-CoV18 | naso | 19.92 | 26.35 | 19.53 | 27.03 | 23.62 | 23.79 |
| 35 | 2020-CoV18 | sputum | 19.75 | 24.38 | 19.61 | 24.86 | 21.48 | 21.42 |
| 36 | 2020-COV193 | naso | 19.81 | 37.81 | 19.60 | 39.50 | 36.20 | 36.70 |
| 37 | 2020-COV193 | sputum | 20.02 | 31.34 | 19.78 | 30.41 | 26.21 | 26.37 |
| 38 | 2020-COV194 | naso | 20.31 | UD | 19.06 | 38.23 | 35.06 | 35.28 |
| 39 | 2020-COV194 | sputum | 21.05 | 39.55 | 21.00 | 36.52 | 31.46 | UD |
| 40 | 2020-COV224 | sputum | 20.27 | UD | 20.09 | 39.24 | 35.05 | 34.35 |
| 41 | 2020-CoV27 | sputum | 20.12 | 34.08 | 20.67 | 34.65 | 31.58 | 31.17 |
| 42 | 2020-COV287 | naso | 20.20 | 34.65 | 20.29 | 35.35 | 32.43 | 33.29 |
| 43 | 2020-COV287 | sputum | 20.73 | 36.96 | 20.53 | 36.93 | 33.87 | 36.10 |
| 44 | 2020-COV288 | sputum | 20.38 | 27.20 | 20.32 | 26.00 | 23.54 | 25.98 |
| 45 | 2020-COV300 | naso | 20.34 | UD | 20.23 | UD | UD | 37.35 |
| 46 | 2020-COV300 | sputum | 20.29 | 36.53 | 20.36 | 34.32 | 32.59 | 35.73 |
| 47 | 2020-COV329 | sputum | 20.31 | 35.88 | 20.19 | 37.70 | 35.31 | 34.04 |
| 48 | 2020-CoV33 | sputum | 20.60 | 39.76 | 20.47 | 39.25 | 36.97 | 43.81 |
| 49 | 2020-CoV33 | sputum | 20.36 | 24.65 | 20.19 | 25.21 | 21.08 | 21.39 |
| 50 | 2020-CoV34 | saliva | 20.64 | 35.39 | 20.33 | 37.40 | 33.05 | 33.13 |
| 51 | 2020-CoV36 | naso | 20.28 | 28.47 | 20.37 | 29.77 | 26.21 | 27.06 |
| 52 | 2020-COV376 | sputum | 20.34 | 38.43 | 20.21 | 39.12 | 39.24 | 36.69 |
| 53 | 2020-CoV38 | naso | 20.32 | 31.07 | 20.24 | 32.31 | 28.75 | 27.59 |
| 54 | 2020-CoV39 | sputum | 20.17 | 35.35 | 20.06 | 37.02 | 33.27 | 33.22 |
| 55 | 2020-CoV41 | naso | 20.30 | 37.34 | 20.31 | 36.57 | 32.82 | 33.61 |
| 56 | 2020-CoV47 | oro | 20.23 | 37.53 | 20.70 | 39.10 | 39.15 | 36.32 |
| 57 | 2020-CoV48 | naso | 20.42 | 37.15 | 20.59 | 37.51 | 34.63 | 34.39 |
| 58 | 2020-CoV48 | oro | 20.37 | 28.50 | 20.69 | 29.26 | 26.50 | 26.26 |
| 59 | 2020-CoV49 | naso | 20.04 | 38.33 | 20.46 | 39.36 | 35.85 | 35.54 |
| 60 | 2020-CoV51 | oro | 20.10 | 38.07 | 20.78 | 37.18 | 34.84 | 35.24 |
| 61 | 2020-CoV54 | saliva | 20.18 | 28.78 | 20.92 | 30.14 | 25.75 | 26.17 |
| 62 | 2020-CoV55 | naso | 20.16 | 27.13 | 21.04 | 28.69 | 24.92 | 24.77 |
| 63 | 2020-CoV55 | oro | 20.11 | 28.07 | 21.06 | 29.75 | 25.25 | 25.06 |
| 64 | 2020-CoV55 | saliva | 20.40 | 34.22 | 21.08 | 36.01 | 31.14 | 30.25 |
| 65 | 2020-CoV56 | sputum | 20.34 | 29.90 | 20.75 | 26.19 | 24.23 | 26.10 |
| 66 | 2020-CoV56 | saliva | 20.21 | 34.26 | 20.46 | 35.55 | 31.45 | 31.01 |
| 67 | 2020-CoV57 | naso | 20.00 | 29.35 | 20.51 | 30.53 | 25.39 | 25.56 |
| 68 | 2020-CoV57 | oro | 20.18 | 36.18 | 20.68 | 37.99 | 34.69 | 34.14 |
| 69 | 2020-CoV57 | sputum | 20.36 | 28.97 | 20.48 | 29.40 | 26.28 | 26.09 |
| 70 | 2020-CoV57 | saliva | 20.18 | 27.47 | 20.59 | 28.86 | 24.41 | 23.71 |
| 71 | 2020-CoV58 | sputum | 20.14 | 35.14 | 20.76 | 35.28 | 31.92 | 31.39 |
| 72 | 2020-CoV58 | saliva | 20.27 | 36.29 | 21.01 | UD | 35.00 | 33.94 |
| 73 | 2020-CoV61 | sputum | 20.07 | 34.88 | 20.77 | 33.91 | 31.14 | 31.34 |
| 74 | 2020-CoV64 | sputum | 20.01 | 29.13 | 19.45 | 28.78 | 24.53 | 24.47 |
| 75 | 2020-CoV88 | naso | 19.86 | 31.66 | 19.53 | 31.58 | 28.66 | 28.86 |
| 76 | 2020-CoV88 | sputum | 20.34 | 35.24 | 20.02 | 35.28 | 31.60 | 30.86 |
| 77 | 2020-CoV91 | naso | 20.04 | 18.73 | 20.10 | 19.83 | 16.75 | 17.21 |
| 78 | 2020-CoV92 | naso | 19.96 | 33.67 | 19.82 | 34.46 | 31.39 | 31.15 |
| 79 | 2020-CoV92 | sputum | 20.01 | 31.53 | 19.77 | 29.78 | 24.80 | 25.66 |
| 80 | 2020-CoV93 | naso | 19.79 | 33.40 | 19.70 | 34.68 | 31.48 | 30.56 |
| 81 | 2020-CoV93 | sputum | 20.41 | 34.38 | 20.02 | 34.79 | 31.27 | 30.51 |
| 82 | 2020-CoV93 | saliva | 20.01 | UD | 19.63 | UD | UD | 43.02 |
| 83 | 2020-CoV94 | sputum | 19.97 | 35.30 | 19.67 | 35.46 | 30.92 | 30.31 |
| 84 | 2020-CoV95 | naso | 19.77 | UD | 19.48 | UD | 36.12 | UD |
| 85 | 2020-CoV95 | sputum | 20.03 | UD | 19.89 | 39.31 | 36.14 | 35.09 |
| 86 | 2020-CoV96 | naso | 19.63 | 36.45 | 19.62 | 37.32 | 35.14 | 35.17 |
| 87 | 2020-CoV96 | oro | 19.88 | 38.97 | 19.67 | UD | 36.61 | UD |
| 88 | 2020-CoV97 | naso | 20.20 | 26.90 | 20.28 | 27.81 | 25.02 | 25.28 |
| 89 | 2020-CoV97 | sputum | 20.36 | 23.95 | 20.14 | 24.33 | 21.10 | 21.66 |
| 90 | 2020-CoV97 | naso | 19.88 | 25.20 | 19.67 | 24.48 | 21.13 | 22.37 |
| 91 | 2020-CoV97 | oro | 19.80 | 23.64 | 19.73 | 24.52 | 20.99 | 20.95 |
| 92 | 2020-CoV97 | sputum | 19.85 | 23.25 | 19.63 | 22.20 | 18.52 | 20.19 |
| 93 | 2020-CoV98 | sputum | 20.06 | 24.73 | 19.98 | 24.97 | 21.24 | 20.90 |
UD= Undetermined
상기의 결과들을 통해, 본 발명자들은 본 발명에서 고안한 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp, ORF3a 유전자를 타켓으로 하는 SARS-CoV-2 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브를 이용할 경우, SARS-CoV-2 바이러스를 높은 특이도로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 2020년도 코로나바이러스 감염증-19 환자의 시료를 대상으로 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 진단법에 대한 민감도를 분석하였다.
| cutoff ≤ 35 | cutoff ≤ 35 | cutoff ≤ 40 | cutoff ≤ 40 | cutoff ≤ 35 | cutoff ≤ 35 | |||||||
| 검출키트 | Kogene E | Kogene RdRp | 본 발명 키트lab RdRp | 본 발명 키트 lab ORF3a |
본 발명 키트 lab RdRp |
본 발명 키트 lab ORF3a |
||||||
| 양성 대조 |
음성 대조 |
양성 대조 |
음성 대조 |
양성 대조 |
음성 대조 |
양성 대조 |
음성 대조 |
양성 대조 |
음성 대조 |
양성 대조 |
음성 대조 |
|
| 양성 | 48 | 0 | 46 | 0 | 86 | 0 | 82 | 0 | 68 | 0 | 68 | 0 |
| 음성 | 45 | 88 | 47 | 88 | 7 | 88 | 11 | 88 | 25 | 88 | 25 | 88 |
| 민감도(%) | 51.6 | 49.5 | 92.5 | 88.2 | 73.1 | 73.1 | ||||||
| 신뢰구간(%) | 41.1-62.0 | 39.0-56.0 | 84.6-96.7 | 79.4-93.7 | 62.8-81.5 | 62.8-81.5 | ||||||
| 특이도(%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | ||||||
| 신뢰구간(%) | 94.8-100 | 94.8-100 | 94.8-100 | 94.8-100 | 94.8-100 | 94.8-100 | ||||||
그 결과, 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 대조군으로 사용한 종래 검출 키트보다 본 발명에서 고안한 프라이머 및 프로브의 검출 키트를 사용한 군이 월등히 우수한 검출 민감도를 보이는 것으로 나타났다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chosun University
<120> Detection composition of SARS-CoV-2 virus gene and COVID-19
diagnosis method using real-time RT-PCR
<130> NPDC92842
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nCoV_RdRp-126F primer sequence
<400> 1
gctggttttg ctaaattc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nCoV_RdRp-226R primer sequence
<400> 2
gtgtgtctct taactacaa 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nCoV_RdRp-151P probe sequence
<400> 3
ctaattgttg tcgcttccaa gaa 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nCoV_3a-63F primer sequence
<400> 4
ggatgctact ccttcaga 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nCoV_3a-225R primer sequence
<400> 5
cttggagagt gctagttg 18
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nCoV_3a-100P probe sequence
<400> 6
acgataccga tacaagcctc actc 24
<210> 7
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RdRp PCR product sequence
<400> 7
gctggttttg ctaaattcct aaaaactaat tgttgtcgct tccaagaaaa ggacgaagat 60
gacaatttaa ttgattctta ctttgtagtt aagagacaca c 101
<210> 8
<211> 163
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF3a PCR product sequence
<400> 8
ggatgctact ccttcagatt ttgttcgcgc tactgcaacg ataccgatac aagcctcact 60
ccctttcgga tggcttattg ttggcgttgc acttcttgct gtttttcaga gcgcttccaa 120
aatcataacc ctcaaaaaga gatggcaact agcactctcc aag 163
<210> 9
<211> 2795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 RdRp DNA sequence
<400> 9
tcagctgatg cacaatcgtt tttaaacggg tttgcggtgt aagtgcagcc cgtcttacac 60
cgtgcggcac aggcactagt actgatgtcg tatacagggc ttttgacatc tacaatgata 120
aagtagctgg ttttgctaaa ttcctaaaaa ctaattgttg tcgcttccaa gaaaaggacg 180
aagatgacaa tttaattgat tcttactttg tagttaagag acacactttc tctaactacc 240
aacatgaaga aacaatttat aatttactta aggattgtcc agctgttgct aaacatgact 300
tctttaagtt tagaatagac ggtgacatgg taccacatat atcacgtcaa cgtcttacta 360
aatacacaat ggcagacctc gtctatgctt taaggcattt tgatgaaggt aattgtgaca 420
cattaaaaga aatacttgtc acatacaatt gttgtgatga tgattatttc aataaaaagg 480
actggtatga ttttgtagaa aacccagata tattacgcgt atacgccaac ttaggtgaac 540
gtgtacgcca agctttgtta aaaacagtac aattctgtga tgccatgcga aatgctggta 600
ttgttggtgt actgacatta gataatcaag atctcaatgg taactggtat gatttcggtg 660
atttcataca aaccacgcca ggtagtggag ttcctgttgt agattcttat tattcattgt 720
taatgcctat attaaccttg accagggctt taactgcaga gtcacatgtt gacactgact 780
taacaaagcc ttacattaag tgggatttgt taaaatatga cttcacggaa gagaggttaa 840
aactctttga ccgttatttt aaatattggg atcagacata ccacccaaat tgtgttaact 900
gtttggatga cagatgcatt ctgcattgtg caaactttaa tgttttattc tctacagtgt 960
tcccacctac aagttttgga ccactagtga gaaaaatatt tgttgatggt gttccatttg 1020
tagtttcaac tggataccac ttcagagagc taggtgttgt acataatcag gatgtaaact 1080
tacatagctc tagacttagt tttaaggaat tacttgtgta tgctgctgac cctgctatgc 1140
acgctgcttc tggtaatcta ttactagata aacgcactac gtgcttttca gtagctgcac 1200
ttactaacaa tgttgctttt caaactgtca aacccggtaa ttttaacaaa gacttctatg 1260
actttgctgt gtctaagggt ttctttaagg aaggaagttc tgttgaatta aaacacttct 1320
tctttgctca ggatggtaat gctgctatca gcgattatga ctactatcgt tataatctac 1380
caacaatgtg tgatatcaga caactactat ttgtagttga agttgttgat aagtactttg 1440
attgttacga tggtggctgt attaatgcta accaagtcat cgtcaacaac ctagacaaat 1500
cagctggttt tccatttaat aaatggggta aggctagact ttattatgat tcaatgagtt 1560
atgaggatca agatgcactt ttcgcatata caaaacgtaa tgtcatccct actataactc 1620
aaatgaatct taagtatgcc attagtgcaa agaatagagc tcgcaccgta gctggtgtct 1680
ctatctgtag tactatgacc aatagacagt ttcatcaaaa attattgaaa tcaatagccg 1740
ccactagagg agctactgta gtaattggaa caagcaaatt ctatggtggt tggcacaaca 1800
tgttaaaaac tgtttatagt gatgtagaaa accctcacct tatgggttgg gattatccta 1860
aatgtgatag agccatgcct aacatgctta gaattatggc ctcacttgtt cttgctcgca 1920
aacatacaac gtgttgtagc ttgtcacacc gtttctatag attagctaat gagtgtgctc 1980
aagtattgag tgaaatggtc atgtgtggcg gttcactata tgttaaacca ggtggaacct 2040
catcaggaga tgccacaact gcttatgcta atagtgtttt taacatttgt caagctgtca 2100
cggccaatgt taatgcactt ttatctactg atggtaacaa aattgccgat aagtatgtcc 2160
gcaatttaca acacagactt tatgagtgtc tctatagaaa tagagatgtt gacacagact 2220
ttgtgaatga gttttacgca tatttgcgta aacatttctc aatgatgata ctctctgacg 2280
atgctgttgt gtgtttcaat agcacttatg catctcaagg tctagtggct agcataaaga 2340
actttaagtc agttctttat tatcaaaaca atgtttttat gtctgaagca aaatgttgga 2400
ctgagactga ccttactaaa ggacctcatg aattttgctc tcaacataca atgctagtta 2460
aacagggtga tgattatgtg taccttcctt acccagatcc atcaagaatc ctaggggccg 2520
gctgttttgt agatgatatc gtaaaaacag atggtacact tatgattgaa cggttcgtgt 2580
ctttagctat agatgcttac ccacttacta aacatcctaa tcaggagtat gctgatgtct 2640
ttcatttgta cttacaatac ataagaaagc tacatgatga gttaacagga cacatgttag 2700
acatgtattc tgttatgctt actaatgata acacttcaag gtattgggaa cctgagtttt 2760
atgaggctat gtacacaccg catacagtct tacag 2795
<210> 10
<211> 828
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 OFR3a DNA sequence
<400> 10
atggatttgt ttatgagaat cttcacaatt ggaactgtaa ctttgaagca aggtgaaatc 60
aaggatgcta ctccttcaga ttttgttcgc gctactgcaa cgataccgat acaagcctca 120
ctccctttcg gatggcttat tgttggcgtt gcacttcttg ctgtttttca gagcgcttcc 180
aaaatcataa ccctcaaaaa gagatggcaa ctagcactct ccaagggtgt tcactttgtt 240
tgcaacttgc tgttgttgtt tgtaacagtt tactcacacc ttttgctcgt tgctgctggc 300
cttgaagccc cttttctcta tctttatgct ttagtctact tcttgcagag tataaacttt 360
gtaagaataa taatgaggct ttggctttgc tggaaatgcc gttccaaaaa cccattactt 420
tatgatgcca actattttct ttgctggcat actaattgtt acgactattg tataccttac 480
aatagtgtaa cttcttcaat tgtcattact tcaggtgatg gcacaacaag tcctatttct 540
gaacatgact accagattgg tggttatact gaaaaatggg aatctggagt aaaagactgt 600
gttgtattac acagttactt cacttcagac tattaccagc tgtactcaac tcaattgagt 660
acagacactg gtgttgaaca tgttaccttc ttcatctaca ataaaattgt tgatgagcct 720
gaagaacatg tccaaattca cacaatcgac ggttcatccg gagttgttaa tccagtaatg 780
gaaccaattt atgatgaacc gacgacgact actagcgtgc ctttgtaa 828
Claims (9)
- 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브; 또는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브;를 포함하는,
SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브는 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브는 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF3a 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 바이러스 유전자 검출용 조성물. - 제1항의 조성물을 포함하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단용 키트.
- (1) 코로나바이러스 감염증-19가 의심되는 환자의 분리된 시료에서 핵산을 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 제4항의 키트를 사용하여 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
(3) 상기 단계 (2)를 통해 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 또는 ORF3a 유전자를 확인하는 단계;를 포함하는,
코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 정보 제공 방법. - 제5항에 있어서,
상기 단계 (1)의 시료는 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 소변 또는 대변인 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 정보 제공 방법. - 제5항에 있어서,
상기 PCR 증폭은 컨벤셔널 중합효소 연쇄반응(C-PCR:conventional PCR), 네스티드 중합효소 연쇄반응(N-PCR:nested PCR), 다중 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응 및 역전사 중합효소연쇄반응으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 정보 제공 방법. - 제5항에 있어서,
상기 (3) 단계의 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 유전자는 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 정보 제공 방법. - 제5항에 있어서,
상기 (3) 단계의 SARS-CoV-2 바이러스의 ORF3a 유전자는 서열번호 4의 프라이머, 서열번호 5의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19) 진단을 위한 정보 제공 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210032898A KR102621111B1 (ko) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 실시간 ＲＴ－ＰＣＲ을 이용한 ＣＯＶＩＤ－１９ 진단방법 |
| EP22161710.3A EP4056718A1 (en) | 2021-03-12 | 2022-03-11 | Composition for detection of sars-cov-2 virus gene and covid-19 diagnosismethod using real-time rt-pcr |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210032898A KR102621111B1 (ko) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 실시간 ＲＴ－ＰＣＲ을 이용한 ＣＯＶＩＤ－１９ 진단방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220128177A true KR20220128177A (ko) | 2022-09-20 |
| KR102621111B1 KR102621111B1 (ko) | 2024-01-03 |
Family
ID=80738747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210032898A KR102621111B1 (ko) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 실시간 ＲＴ－ＰＣＲ을 이용한 ＣＯＶＩＤ－１９ 진단방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4056718A1 (ko) |
| KR (1) | KR102621111B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102109196B1 (ko) | 2020-02-11 | 2020-05-11 | 대한민국 | 2019 신종코로나바이러스 검출용 lamp 조성물 및 이의 용도 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111270021B (zh) * | 2020-04-15 | 2024-02-02 | 齐永 | 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用 |
| CN112195275A (zh) * | 2020-10-14 | 2021-01-08 | 河南智泰生物科技有限公司 | Lamp联合检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒的引物组、试剂盒及方法 |
-
2021
- 2021-03-12 KR KR1020210032898A patent/KR102621111B1/ko active IP Right Grant
-
2022
- 2022-03-11 EP EP22161710.3A patent/EP4056718A1/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102109196B1 (ko) | 2020-02-11 | 2020-05-11 | 대한민국 | 2019 신종코로나바이러스 검출용 lamp 조성물 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Genbank Accession number: MN908947 (2020.03.18.)* * |
| Yu 등. Analytical Chemistry. Vol. 92, 페이지 14139-14144 (2020.09.24.)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102621111B1 (ko) | 2024-01-03 |
| EP4056718A1 (en) | 2022-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11649511B2 (en) | Multiplex PCR method for the detection of SARS-CoV-2 | |
| WO2021164050A1 (zh) | 多靶点双染料等温扩增快速检测方法和试剂盒 | |
| CN112410472B (zh) | 检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒 | |
| US20230374615A1 (en) | Compositions, kits, methods for detecting and identifying pathogens that cause respiratory tract infections and use thereof | |
| CN111206121A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒orflab和S基因的试剂盒 | |
| CN108315478A (zh) | Raa荧光法检测狂犬病病毒的探针及试剂盒 | |
| CN111088380A (zh) | 布鲁氏菌lf-rpa检测引物和探针及检测试剂盒 | |
| KR101857684B1 (ko) | 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법 | |
| KR102313941B1 (ko) | Covid-19 감염 진단을 위한 rt-lamp용 키트 및 방법 | |
| CN111471800B (zh) | 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物 | |
| KR102621111B1 (ko) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 실시간 ＲＴ－ＰＣＲ을 이용한 ＣＯＶＩＤ－１９ 진단방법 | |
| KR102417665B1 (ko) | 렙토스피라증 진단용 조성물 및 실시간 ｐｃｒ을 이용한 렙토스피라증 진단방법 | |
| KR102076343B1 (ko) | 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| EP3885455A1 (en) | Method and kit for the detection of sars-cov-2 virus in a sample based on reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) | |
| KR102274011B1 (ko) | 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 | |
| KR20220040834A (ko) | 분자 비콘 프로브를 포함하는 covid-19 진단 멀티플렉스 lamp 조성물 | |
| KR102545812B1 (ko) | 큐열 진단용 조성물 및 실시간 ｐｃｒ을 이용한 큐열 진단방법 | |
| KR20210073220A (ko) | 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| KR102572368B1 (ko) | 파라인플루엔자 바이러스 1형 및 3형 동시 감별 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR102306941B1 (ko) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 바이러스 유전자 검출용 조성물 및 이를 이용한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 기반 코로나바이러스 감염증－１９ 진단 | |
| JP7360752B2 (ja) | 重症熱性血小板減少症候群ウイルス遺伝子検出用組成物及びこれを用いた重症熱性血小板減少症候群の診断方法 | |
| KR102494777B1 (ko) | 다중 등온증폭 기반 뎅기바이러스 감염병 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 뎅기바이러스 감염병 진단용 조성물 및 이를 이용한 뎅기바이러스 감염병 육안진단방법 | |
| RU2744665C1 (ru) | Способ выявления рнк вируса луйо методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени | |
| US20220235399A1 (en) | Use of p44 as marker for diagnosing anaplasmosis | |
| KR102468964B1 (ko) | 뎅기, 지카 및 치쿤구니야를 포함한 다중 모기 매개 감염병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 동시다중 분자진단 방법과 랩온페이퍼 기반 진단 키트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |