KR20220122972A - 기분 장애의 치료 방법 - Google Patents

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푸데 후앙
웬안 왕
창핑 지아오
창데 후앙
티데 후앙
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지앙수 누오-베타 파마수티칼 테크놀로지 컴퍼니, 리미티드
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Abstract

본원에는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 억제제, 및 이 억제제를 사용하여 기분 장애를 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.

Description

기분 장애의 치료 방법
본 발명은 기분 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 그러한 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
기분 장애는 불안증, 우울증, 또는 양극성 장애로 대표되는 정신과 장애이고, 이는 최근 몇년 동안 증가하는 경향이 있고 주요 사회 문제가 된다. 불안증 및 우울증은 가장 흔한 정신과 장애이고, 다른 신경정신과 질환, 뇌졸중, 종양 등의 합병증이다. 치매를 가진 사람 중 70%가 넘는 사람들이 우울증 및/또는 불안증의 증상을 갖는다(Selbaek, G., K. Engedal and S. Bergh, The prevalence and course of neuropsychiatric symptoms in nursing home patients with dementia: a systematic review. J Am Med Dir Assoc, 2013. 14(3): p. 161-9).
현재, 항불안증 또는 항우울증에 대한 임상 약물은 일반적으로 만족스럽지 못한 효과를 갖고, 특히 중증 불안증 또는 우울증, 신경변성 질환 또는 뇌졸중에 의해 유발된 우울증, 및 악성 종양을 가진 환자의 불안증 또는 우울증에 대하여 불량한 효능을 갖거나 실질적으로 효능을 갖지 않고, 또한 작용의 느린 개시, 및 과도하고 심각한 부작용의 단점을 갖는다.
본 출원 전에, 일반적으로 포스포이노시티드(PI)의 감소된 수준 및 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K)의 감소된 활성은 우울증과 연관이 있는 것으로 간주되었다. PI3K 결핍은 마우스의 불안증의 수준을 증가시키고, 통상적인 항우울제의 몇몇 유형은 뇌에서 불안증 및 우울증과 연관된 PI의 재합성에 기여한다(문헌[Di Paolo, G. and P. De Camilli, Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature, 2006. 443(7112): p. 651-7; Saito, T., et al., Polymorphism screening of PIK4CA: possible candidate gene for chromosome 22q11-linked psychiatric disorders. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 2003. 116B(1): p. 77-83; Balla, A. and T. Balla, Phosphatidylinositol 4-kinases: old enzymes with emerging functions. Trends Cell Biol, 2006. 16(7): p. 351-61] 참조).
놀랍게도, 다양한 질환을 가진 마우스 모델에 있어서, 유전학적 방법 또는 PI4KIIIα 억제제의 적용에 의한 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 앵커링에 대한 PI4KIIIα의 발현 또는 Efr3a의 발현의 감소는 마우스의 불안증 또는 우울증의 정도를 감소시킬 수 있다는 것이 본 출원에 의하여 확인되었다. 따라서, 본 출원은 기분 장애를 치료하기 위한 잠재적인 항기분 장애 표적(즉, PI4KIIIα 단백질 복합체) 및 일련의 잠재적인 약물을 제공한다.
측면에 따라, 본 출원은 기분 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 그러한 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 소분자 화합물, 항체, RNAi 분자, 또는 안티센스 핵산이다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 EFR3-특이적 억제제이다.
일부 실시양태에서, EFR3-특이적 억제제는 EFR3a-특이적 억제제 또는 EFR3b-특이적 억제제이다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 PI4KIIIα-특이적 억제제이다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 소분자 화합물이다.
일부 실시양태에서, 소분자 화합물은 하기 화학식 (I)의 구조 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 갖는다.
Figure pct00001
화학식 (I)
상기 식에서,
R1은 독립적으로 (a) H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 알킬렌-NH2, C1-6 알킬렌-NH-C(O)H, -As(O), -N=NH, -NH-(C1-6 알킬), -N,N-(C1-6 알킬)2, -NH-C(O)H, -NH-S(O)2H, -C(O)OH, -OC(O)H, -SH, -S(O)2H, -S(O)2-NH, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되고, 이는 임의로 R2 또는 R3으로 치환되고, 여기서 R2 및 R3은 각각 독립적으로 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -NH-(C1-6 알킬), -NH-(6 내지 12원 아릴), -N,N-(C1-6 알킬)2, C3-6 사이클로알킬, 6 내지 12원 아릴, 또는 3 내지 12원 헤테로사이클릴로부터 선택되고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, -NH-C(O)-R5, -C(O)OR4, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환되고, R4는 C1-6 알킬이고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환되고, R5는 H, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, 또는 C1-6 할로알킬로부터 선택되고, 또는
(b) 2개의 인접한 탄소 원자 상의 R1은 5 내지 12원 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클릴을 형성하고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환되고,
n은 0 내지 5의 정수이다.
일부 실시양태에서, R1은 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), -NH-(C1-6 알킬), -N,N-(C1-6 알킬)2, 또는 -C(O)OR6로부터 선택되고, 여기서 n은 0 내지 2의 정수이고, R6은 C1-6 알킬이다.
일부 실시양태에서, R1은 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 또는 -As(O)로부터 선택되고, 여기서 n은 0 내지 2의 정수이다.
일부 실시양태에서, R1은 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 아미노, C1-6 알콕시, 또는 C1-6 할로알킬로부터 선택되고, 여기서 n은 1이다.
일부 실시양태에서, R1은 -As(O) 기의 오르토 위치 및/또는 파라 위치에 위치한다.
일부 실시양태에서, n은 0이다.
일부 실시양태에서, 소분자 화합물은 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, RNAi 분자는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 또는 마이크로RNA(miRNA)이다.
일부 실시양태에서, RNAi 분자는 18-100개의 염기 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, RNAi 분자는 이의 안정성을 향상시키기 위하여 변형된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 포유동물이다.
일부 실시양태에서, 기분 장애는 고조된 기분, 저하된 기분, 또는 고조된 기분과 저하된 기분의 순환이다.
일부 실시양태에서, 기분 장애는 불안증, 우울증, 정신분열증, 또는 조증이다.
일부 실시양태에서, 기분 장애는 신경변성 질환, 뇌졸중, 또는 악성 종양에 의해 유발된다.
일부 실시양태에서, 기분 장애는 신경변성 질환에 의해 유발된 불안증 또는 우울증이다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 경구, 피하, 근육내, 또는 정맥내 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 대상체에게 투여하기 전에 대상체를 기분 장애를 갖는 것으로 진단하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 이것이 필요한 대상체에게 제2 시약을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 시약은 기분 장애의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 제2 시약은 신경변성 질환, 뇌졸중, 또는 악성 종양의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 제2 시약 전에, 후에, 또는 동시에 투여된다.
또 다른 측면에 따라, 본 출원은 기분 장애의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에 따라, 본 출원은 기분 장애의 예방 또는 치료에서의 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 용도로서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 이것이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 용도를 제공한다.
도 1은 CUMS 모델링 및 투여 동안 각각의 군에서 래트의 체중의 변화를 도시한다.
도 2는 PIK4IIIα의 mRNA 발현 수준이 우울증의 정도와 선형적으로 양성 상관관계를 갖는다는 것을 도시한다.
도 3은 PI4KIIIα 억제제 PAO가 APP/PS1 마우스에서 불안증 행동을 예방하거나 완화할 수 있다는 것을 도시한다(WT는 야생형 마우스를 나타내고, "APP/PS1 0"은 PAO에 의한 처리가 없는 APP/PS1 마우스를 나타내고, "APP/PS1 0.3"은 용량이 0.3 mg/kg인 PAO에 의한 처리가 있는 마우스를 나타내고, "*"는 P<0.05를 나타낸다).
도 4는 모리스 수중 미로 실험에서 APP/PS1 마우스에 대한 PAO 및 아리셉트의 효과를 도시한다.
도 5는 새로운 환경에서의 섭식 억제 실험(Novelty suppressed feeding test)에서 APP/PS1 마우스에 대한 PAO 및 아리셉트의 효과를 도시한다.
도 6은 명암 이동 실험에서 APP/PS1 마우스에 대한 Efr3a의 mRNA 발현의 감소 효과를 도시한다.
도 7은 강제 수영 실험에서 ICR 마우스에 대한 PAO 유도체 PI04, PI05, 및 PI06의 효과를 도시한다. 흑색 및 회색 막대는 각각 마우스의 각각의 군에 있어서 제1 및 제2 강제 수영 실험에서 마지막 4분 내에 움직이지 않는 시간의 합이다.
도 8은 뉴런 손상에 의해 유발된 마우스에서 우울증의 예방 또는 완화에 대한 PAO의 효과를 도시한다.
도 9는 야생형 마우스에서 불안증 행동의 억제에 대한 PAO 및 이의 유도체의 효과를 도시한다.
도 10은 초파리에서 Hyccin(FAM126), RBO, TTC7, 및 P4KIIIα의 상호작용을 도시한다. 도 10a는 rbo-egfp 전이유전자 및 야생형(wt)의 성체 초파리 머리의 균질액으로부터 항-GFP 항체의 상호 면역침강물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 도시한다. RBO-GFP의 발현은 rbo 유전자 드라이버에 의해 구동된다. 도 10b는 상호 면역침강 웨스턴 블롯팅(WB)에 의해, 성체 wt 초파리에서 서로 내인성 Hyccin, RBO, 및 PI4KIIIα(PI4K)가 상호 면역침강된다는 것을 보여준다. 도 10c는 WB에 의해, wt 초파리 배아, 및 hyccin -/-, rbo -/-, 및 ttc7 */* 돌연변이 초파리 배아의 세포막 및 세포질에서 RBO 및 Hyccin의 발현 수준을 보여준다. RBO는 오직 세포막에서만 발현되고, 상기 3개의 동형접합 돌연변이의 배아에서는 발현되지 않는다. Hyccin은 주로 세포질에 존재하고, rbo -/- 및 ttc7 */* 돌연변이의 세포질에서 유의미한 변화가 없는 수준을 갖고, 이는 Hyccin의 발현은 RBO 및 TTC7의 발현과 독립적이라는 것을 나타낸다. 도 10d는 웨스턴 블롯팅(WB)에 의해, rbo -/+ 및 hyccin -/+ 성체 이종접합 돌연변이 초파리에서 Hyccin의 발현량을 보여주고, 이는 추가로 Hyccin의 발현이 RBO와 독립적이라는 것을 나타낸다. 도 10e: WB는 동일한 유전자 배경을 갖는 wt, rbo -/+, 및 hyccin -/+ 이종접합 돌연변이 성체 초파리, 및 ctrl 및 성체 초파리의 pi4kIIIα(pi4k FQ88/+, pi4k FY24/+, pi4k GJ86/+, 및 pi4k GS27/+)의 4개의 넌센스 돌연변이 이형접합체에서 PI4KIIIα 및 RBO의 총 수준을 도시한다. 여기서 pi4kIIIα의 4개의 넌센스 돌연변이는 유전자 돌연변이원 및 스크리닝에 의한 처리에 의해 ctrl 초파리로부터 수득된다.
본 발명의 하기 설명은 오직 본 발명의 다양한 실시양태를 설명하는 것만을 의도한다. 기재된 특정 실시양태는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 다양한 동등한 치환, 변화, 또는 변동은 본 발명의 취지 및 본질을 벗어나지 않고 당해 분야의 숙련가에 의해 만들어질 수 있고, 이러한 동등한 실시양태는 또한 여기에 포함된다는 것이 이해된다. 출판물, 특허, 특허 출원 등을 포함하는 본원에 기재된 모든 문서는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
측면에 따라, 본 출원은 기분 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 그러한 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제
본 출원에서, 용어 "PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체"는 3종의 단백질 PI4KIIIα, FAM126, 및 TTC7로 구성된 복합체를 지칭하고, 이는 세포질 막에 위치하고, 생체내에서 지질 인산화에 참여한다. EFR3a 또는 EFR3b는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체를 세포질 막에 앵커링하는 중요 분자이다.
본 출원에서, 용어 "PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제"는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 활성을 감소, 저하 및 제거할 수 있는 임의의 성분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 PI4KIIIα 또는 FAM126 또는 TTC7 또는 EFR3 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 억제제이다. 일부 다른 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 지질을 인산화하는 PI4KIIIα의 능력을 억제하는 억제제이다. 일부 다른 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 형성을 억제하는 억제제이다. 일부 다른 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체가 세포질 막에 앵커링되는 것을 억제하는 억제제이다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 활성을 적어도 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상만큼 감소시킬 수 있다.
본 출원에서, "활성"은, 증가 또는 감소와 함께 사용되는 경우, 변화된 함량 또는 변화하지 않은 함량을 갖는 변화된 기능적 활성으로 표현될 수 있는, 검출된 기능적 활성을 의미한다. 일부 실시양태에서, 활성은 지질 인산화와 연관된다. 일부 실시양태에서, 활성은 기분 장애와 연관된다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 소분자 화합물, 항체, RNAi 분자, 또는 안티센스 핵산이다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 소분자 화합물이다.
본 출원에서, 용어 "소분자 화합물"은 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 또는 500 돌턴 미만의 분자량을 갖는 천연 또는 화학 합성된 유기 화합물을 지칭한다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 항체이다.
본 출원에서, 용어 "항체"는 임의의 면역글로불린, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다가 항체, 이가 항체, 일가 항체, 또는 특이적 항원에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 본 출원에서, 용어 "항체"는 4개의 쇄를 갖는 통상적인 항체 및 4개의 쇄를 갖지 않는 통상적이지 않은 항체(예를 들면, 경쇄가 천연으로 결핍된 항체)를 광범위하게 포함하는 것을 의도한다.
통상적인 온전한 항체는 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 함유하는 헤테로테트라머이다. 5개 유형의 포유동물 중쇄가 존재한다: α, δ, ε, γ, 및 μ. 각각의 중쇄는 1개의 가변 도메인(VH) 및 제1, 제2, 및 제3 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)으로 구성된다. 2개 유형의 포유동물 경쇄가 존재한다: λ 및 κ. 각각의 경쇄는 1개의 가변 도메인(VL) 및 1개의 불변 도메인으로 구성된다. 통상적인 항체는 이황화 결합으로 연결된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인으로 구성된 목을 갖는 "Y"형 구조를 갖는다. "Y"형 구조의 각각의 아암(arm)은 1개의 경쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인과 연결되는 2개의 중쇄 중 1개의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 항원에 대한 결합을 결정한다. 각각의 쇄의 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 3개의 초가변 영역을 함유한다(경쇄의 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 중쇄의 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함한다). 본 출원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편의 CDR 경계는 카바트(Kabat), IMGT, 코티아(Chothia), 또는 알 라지카니(Al-Lazikani) 명명법에 의해 명명되거나 식별될 수 있다(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Maryland, Bethesda (1991); Marie-Paule Lefranc et al., Developmental and Comparative Immunology, 27: 55-77 (2003); Marie-Paule Lefranc et al., Immunome Research, 1(3), (2005); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (second edition), chapter 26, 481-514, (2015)). 여기서 3개의 CDR은 프레임워크 영역(FR)의 측면 인접 부분에 의해 분리되고, FR은 CDR보다 고도로 보존되고, 초가변 루프를 지지하는 스캐폴드를 형성한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원에 결합하는 것에는 관여하지 않지만, 다중 이펙터 기능을 갖는다.
항체는 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열을 기준으로 몇몇 분류로 분류될 수 있다. 중쇄 유형 α, δ, ε, γ, 및 μ는 항체의 5개의 주요 분류 또는 이소형을 생기게 한다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 주요 항체 분류는 하위 분류, 예를 들면, IgG1(γ1 중쇄), IgG2(γ2 중쇄), IgG3(γ3 중쇄), IgG4(γ4 중쇄), IgA1(α1 중쇄), 또는 IgA2(α2 중쇄) 등으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 전장 항체 또는 항원 결합 단편이다.
본 출원에서, 용어 "항원 결합 단편"은 전체 항체 구조는 없지만 1개 이상의 CDR을 포함하는 항체 단편에 의해 형성된 항체 단편을 지칭한다. 예를 들면, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), scFv 이량체, 낙타화 단일 도메인 항체, 및 나노바디를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 항원 결합 단편은 모 항체와 동일한 항원에 결합할 수 있다.
항체의 "Fab" 단편은 1개의 경쇄(가변 도메인 및 불변 도메인 포함) 및 1개의 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인으로 구성되는 항체의 부분을 지칭하고, 이는 이황화 결합에 의해 연결된다.
"Fab'" 단편은 경첩 영역의 부분을 함유하는 Fab 단편을 지칭한다.
"F(ab')2" 단편은 Fab'의 이량체를 지칭한다.
항체의 "Fv" 단편은 1개의 경쇄의 가변 도메인 및 1개의 중쇄의 가변 도메인으로 구성된다.
"단쇄 항체 분자" 또는 "scFv"는 직접적으로 또는 펩타이드 쇄에 의해 연결된 경쇄의 가변 도메인 및 중쇄의 가변 도메인으로 만들어진 조작된 항체를 지칭한다. 세부사항은 문헌[Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)]에서 찾을 수 있다.
"scFv 이량체"는 2개의 scFv에 의해 형성된 올리고머를 지칭한다.
"낙타화 단일 도메인 항체"(또한 "중쇄 항체" 또는 "중쇄 단독 항체(HCAb)"로 지칭됨)는 2개의 중쇄 가변 도메인을 함유하고 경쇄를 함유하지 않는 항체를 지칭한다(Riechmann L. and Muyldermans S., J Immunol Methods. Dec 10;231(1-2):25-38(1999); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302(2001); WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 제6,005,079호). 중쇄 항체는 원래 낙타과(낙타, 단봉낙타, 및 라마)로부터 유래된다. 경쇄의 결핍에도 불구하고, 낙타화 단일 도메인 항체는 항원에 결하합하는 모든 기능을 갖는다(문헌[Hamers-Casterman C. et al., Nature. 363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. et al., "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," Immunogenetics. 54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. et al., Immunology. 109(1):93-101 (2003)]을 참조하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다).
"나노바디"는 중쇄 항체로부터의 1개의 중쇄 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인 CH2 및 CH3으로 구성된다.
일부 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 뮤린 항체, 래빗 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체이다.
본 출원에서, 용어 "완전 인간"은, 항체 또는 항원 결합 단편에서 사용되는 경우, 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열이 인간 또는 인간 면역 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 라이브러리를 기반으로 형질전환 비인간 동물과 같은 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열, 또는 인간 항체를 인코딩하는 다른 서열에 상응한다는 것을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "인간화"는, 항체 또는 항원 결합 단편에서 사용되는 경우, 비인간 동물로부터 유래된 CDR, 인간으로부터 유래된 FR, 및, 적용되는 경우, 인간으로부터 유래된 불변 도메인을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다. 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 덜 면역원성이기 때문에 일부 실시양태에서 인간을 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비인간 동물은 포유동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 기니아 피그 또는 햄스터)이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 CDR 서열이 비인간인 경우를 제외하고, 본질적으로 인간 서열 전체로 구성된다.
본 출원에서, 용어 "키메라"는, 항체 또는 항원 결합 단편에서 사용되는 경우, 동일한 종으로부터 유래된 하나의 부분 및 상이한 종으로부터 유래된 다른 부분을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 도메인 및 비인간 동물(예를 들면, 마우스 또는 래빗)로부터 유래된 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 항체는 단일특이성 항체, 이중특이성 항체, 또는 다중특이성 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 항체는 추가로 표시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 항체는 PI4KIIIα 또는 FAM126 또는 TTC7 또는 EFR3에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 출원에서 항체는 PI4KIIIα 또는 EFR3에 특이적인 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 항체는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 형성을 억제하거나, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체가 세포질 막에 앵커링되는 것을 억제하거나, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 인산화 활성을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 RNAi 분자이다.
본 출원에서, 용어 "RNAi 분자"는 표적 RNA에 RNA 간섭을 지시하는데 서열에서 충분히 상보적인 RNA 또는 이의 아날로그를 지칭한다. 일부 실시양태에서, RNA를 생성하는데 사용될 수 있는 DNA가 또한 포함된다. RNAi는 표적 분자(예를 들면, 표적 유전자, 단백질, 또는 RNA)가 하향조절되는 서열 특이적 선택의 과정이다.
일부 실시양태에서, RNAi 분자는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 또는 마이크로RNA(miRNA)이다.
본 출원에서, 용어 "작은 간섭 RNA(siRNA)"는 약 10-50개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 15-25개의 뉴클레오타이드 길이, 더 바람직하게는 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 RNA 분자, 바람직하게는 이중 가닥 분자를 지칭한다. 임의로, 가닥은, 예를 들면, RNA의 분해를 지시하거나 매개할 수 있는 1개, 2개, 또는 3개의 돌출 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 아날로그)를 포함하는 돌출 말단을 갖는다. 천연 발생 siRNA는 세포의 RNAi 기계(예를 들면, 다이서(Dicer) 또는 이의 동족체)를 통해 더 긴 dsRNA(>25 뉴클레오타이드를 가짐)로부터 생성되고, RISC 복합체를 형성하여 mRNA를 분해한다.
본 출원에서, 용어 "짧은 헤어핀 RNA(shRNA)"은 서로 상보적인 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 스템 루프 구조를 갖는 RNA 분자를 지칭한다. 상보성의 정도 및 영역의 방향은 영역 사이에 발생하는 염기 쌍에 충분하다. 제1 영역 및 제2 영역은 루프 영역에 의해 연결된다. 루프는 루프 영역에서 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 아날로그) 사이의 염기 쌍의 부재로부터 야기된다.
본 출원에서, 용어 "마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 약 16-26개의 뉴클레오타이드(nt)(예를 들면, 약 16-29 nt, 19-22 nt, 20-25 nt, 또는 21-23 nt) 길이의 짧은 천연 발생 단일 가닥 비코딩 RNA 분자이고, 이는 일반적으로 생체내에서 유전자 발현의 조절에서 기능한다. 진핵 세포에서, miRNA 유전자는 DNA 전사효소 II에 의해 "1차 생성물"(pri-miRNA)로 전사되고, pri-miRNA는 리보뉴클레아제 III(드로샤)에 의해 miRNA "전구체"(pre-miRNA)로 빠르게 가공되고, pre-miRNA는 핵으로부터 세포질로 수송된 다음, 또 다른 리보뉴클레아제 III(다이서)에 의해 인식되고 성숙 miRNA로 절단된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 mRNA에 부분적으로 상보적이고, 단백질의 발현을 조절한다. 공지된 miRNA 서열은 miRNA 서열 정보, 기능 주석, 예측된 유전자 표적, 및 다른 정보를 제공하는 공용 데이터베이스, 예를 들면, miRBase 데이터베이스(www.mirbase.org)로부터 수득될 수 있다. 본 발명에서, miRNA는 또한 인공적으로 합성된 플라스미드에 의해 발현되는 천연 miRNA, 및 mRNA의 단백질로의 번역을 방지하는 천연 miRNA 분자와 유사한 표적 상응 mRNA와 유사한 구조 및 기능을 가진 RNA 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, RNAi 분자는, 예를 들면, PI4KA 유전자를 녹다운시킴으로써 PI4KIIIα의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, RNAi 분자는 서열 번호 1의 서열[5'-TGCTCATTAGCAGTAAAGA-3']을 갖는다.
일부 실시양태에서, RNAi 분자는 18-100개의 염기 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, RNAi 분자는 이의 안정성을 향상시키기 위하여 변형된다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 안티센스 핵산이다.
본 출원에서, 용어 "안티센스 핵산"은 안티센스 핵산이 표적 서열에 특이적으로 하이브리드할 수 있는 한, 표적 서열에 완전히 상보적인 뉴클레오타이드 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 미스매치를 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들면, 본 출원에서 안티센스 핵산은 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드 길이에서 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 표적 유전자의 전사 및/또는 표적 mRNA의 번역은 하이브리드의 형성으로 인하여 감소하거나 차단된다. 안티센스 기술을 포함하는 표준 방법이 기재된다(예를 들면, 문헌[Melani et al., Cancer Res.(1991)51:2897-2901] 참조).
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 EFR3-특이적 억제제이다.
본 출원에서, 용어 "EFR3-특이적 억제제"는 EFR3(즉, 효모 유래된 포밀-CoA 환원효소) 유전자의 전사 또는 번역 및/또는 EFR3 단백질의 활성을 특이적으로 감소, 저하, 및 제거할 수 있는 임의의 억제제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, EFR3-특이적 억제제는 EFR3의 활성을 적어도 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상만큼 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, EFR3의 활성은 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 세포질 막에 대한 앵커링의 활성을 지칭한다.
일부 실시양태에서, EFR3-특이적 억제제는 바람직하게는 복합체 혼합물로부터 EFR3 단백질을 인식할 수 있다. EFR3 단백질에 대한 억제제의 결합 상수는 또 다른 비특이적 결합 단백질에 대한 억제제의 결합 상수의 적어도 2배이다. 일부 실시양태에서, EFR3 단백질로부터의 EFR3-특이적 억제제의 평형 해리 상수는 10-5 M 또는 10-6 M 이하이다. 일부 실시양태에서, EFR3 단백질로부터의 EFR3-특이적 억제제의 평형 해리 상수는 10-6 M 또는 10-7 M 이하이다. 일부 실시양태에서, EFR3 단백질로부터의 EFR3-특이적 억제제의 평형 해리 상수는 10-7 M 또는 10-8 M 이하이다. 일부 실시양태에서, EFR3-특이적 억제제는 EFR3a-특이적 억제제 또는 EFR3b-특이적 억제제이다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 PI4KIIIα-특이적 억제제이다.
본 출원에서, 용어 "PI4KIIIα-특이적 억제제"는 PI4KIIIα 유전자의 전사 또는 번역 및/또는 PI4KIIIα 단백질의 활성을 특이적으로 감소, 저하 및 제거할 수 있는 임의의 성분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 PI4KIIIα의 활성을 적어도 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상만큼 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, PI4KIIIα의 활성은 지질(예를 들면, 포스포이노시티드(PI))을 인산화(예를 들면, 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트(PI4P)로의 전환)시키는 PI4KIIIα의 활성을 지칭한다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 바람직하게는 복합체 혼합물로부터 PI4KIIIα 단백질을 인식할 수 있다. PI4KIIIα 단백질에 대한 억제제의 결합 상수는 또 다른 비특이적 결합 단백질에 대한 억제제의 결합 상수의 적어도 2배이다. 일부 실시양태에서, PI4KIIIα 단백질로부터의 PI4KIIIα-특이적 억제제의 평형 해리 상수는 10-5 M 또는 10-6 M 이하이다. 일부 실시양태에서, PI4KIIIα 단백질로부터의 PI4KIIIα-특이적 억제제의 평형 해리 상수는 10-6 M 또는 10-7 M 이하이다. 일부 실시양태에서, PI4KIIIα 단백질로부터의 PI4KIIIα-특이적 억제제의 평형 해리 상수는 10-7 M 또는 10-8 M 이하이다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 PI4KII(예를 들면, PI4KIIα 또는 PI4KIIβ)를 억제하는 것보다 적어도 1배, 2배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배, 200배, 500배, 또는 10000배 더 PI4KIIIα를 억제한다. 일부 실시양태에서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 PI4KIIIβ를 억제하는 것보다 적어도 1배, 2배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배, 200배, 500배, 또는 10000배 더 PI4KIIIα를 억제한다. 일부 실시양태에서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 80 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 또는 500 μM 이상의 IC50로 PI4KII(예를 들면, PI4KIIα 또는 PI4KIIβ)를 실질적으로 억제하지 않는다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 100 μM, 80 μM, 50 μM, 30 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.2 μM, 0.1 μM, 0.05 μM, 0.02 μM, 0.01 μM, 0.005 μM, 0.002 μM, 또는 0.001 μM 이하의 IC50로 PI4KIIIα를 억제한다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 소분자 화합물이다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 소분자 화합물은 하기 화학식 (I)의 구조 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 갖는다.
Figure pct00005
화학식 (I)
상기 식에서,
R1은 독립적으로 (a) H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 알킬렌-NH2, C1-6 알킬렌-NH-C(O)H, -As(O), -N=NH, -NH-(C1-6 알킬), -N,N-(C1-6 알킬)2, -NH-C(O)H, -NH-S(O)2H, -C(O)OH, -OC(O)H, -SH, -S(O)2H, -S(O)2-NH, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되고, 이는 임의로 R2 또는 R3으로 치환되고, 여기서 R2 및 R3은 각각 독립적으로 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -NH-(C1-6 알킬), -NH-(6 내지 12원 아릴), -N,N-(C1-6 알킬)2, C3-6 사이클로알킬, 6 내지 12원 아릴, 또는 3 내지 12원 헤테로사이클릴로부터 선택되고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, -NH-C(O)-R5, -C(O)OR4, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환되고, R4는 C1-6 알킬이고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환되고, R5는 H, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, 또는 C1-6 할로알킬로부터 선택되고, 또는
(b) 2개의 인접한 탄소 원자 상의 R1은 5 내지 12원 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클릴을 형성하고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환된다.
일부 실시양태에서, n은 0, 1, 2, 또는 3이다. 일부 실시양태에서, n은 0, 1, 또는 2이다. 일부 실시양태에서, n은 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, R1은 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), -NH-(C1-6 알킬), -N,N-(C1-6 알킬)2, 또는 -C(O)OR6로부터 선택되고, 여기서 n은 0 내지 2의 정수이고, R6은 C1-6 알킬이다.
일부 실시양태에서, R1은 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 또는 -As(O)로부터 선택되고, 여기서 n은 0 내지 2의 정수이다.
일부 실시양태에서, R1은 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 아미노, C1-6 알콕시, 또는 C1-6 할로알킬로부터 선택되고, 여기서 n은 1이다.
일부 실시양태에서, R1은 -As(O) 기의 오르토 위치 또는 파라 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, R1은 H이다.
본 출원에서, 용어 "치환된"은 화학기의 하나 이상의 수소 원자가 제거되고 치환기로 치환된다는 것을 의미한다.
본 출원에서, 당해 분야에 공지된 이의 공통 의미를 갖는 용어 "치환기"는 공유적으로 결합되거나, 적절한 경우, 모 기에 융합된 화학 잔기를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "Cn-Cm"은 탄소 원자 갯수의 범위를 나타내고, 여기서 n 및 m은 정수이고, 탄소 갯수의 범위는 종점(즉, n 및 m) 및 그 사이의 정수 점을 포함한다. 예를 들면, C1-C6은 1 내지 6개의 탄소 원자의 범위를 나타내고, 이는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6개의 탄소 원자를 포함한다.
본 출원에서, 용어 "알킬"은, 또 다른 용어의 부분으로 사용되든 단독으로 사용되든, 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 포화 하이드로카빌기를 지칭한다. 용어 "Cn-Cm 알킬"은 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 알킬기는 1 내지 12개, 1 내지 8개, 1 내지 6개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 내지 2개의 탄소 원자를 함유한다. 예를 들면, 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 2-메틸-1-부틸, n-펜틸, 3-펜틸, n-헥실, 및 1,2,2-트리메틸프로필 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "알케닐"은, 또 다른 용어의 부분으로 사용되든 단독으로 사용되든, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 불포화 하이드로카빌기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 알케닐기는 2 내지 12개, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 또는 2 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 알케닐기는 또한 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 또는 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 함유할 수 있다. 예를 들면, 알케닐기는 비닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 및 sec-부테닐 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "알키닐"은, 또 다른 용어의 부분으로 사용되든 단독으로 사용되든, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 불포화 알키닐기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 알키닐기는 2 내지 12개, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 또는 2 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 알키닐기는 또한 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 또는 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유할 수 있다. 예를 들면, 알키닐기는 에티닐, 프로피닐, 및 부티닐 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "사이클로알킬"은 적어도 3개의 원자로 구성된 고리 알킬기를 지칭한다. 용어 "n 내지 m원 사이클로알킬"은 고리의 형성을 위하여 n 내지 m개의 구성원을 갖는 사이클로알킬기를 지칭한다. 추가로, 고리는 또한 완전히 컨쥬게이트된 시스템 없이 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사이클로알킬기는 고리를 형성하기 위하여 3 내지 8개, 3 내지 6개, 또는 4 내지 6개의 탄소 원자를 함유한다. 예를 들면, 사이클로알킬기는 사이클로프로판, 사이클로부탄, 및 사이클로펜틸 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "헤테로사이클릴"은 고리에서 적어도 하나의 원자가 헤테로원자이고 남은 원자가 탄소 원자인 고리기를 지칭한다. 용어 "n 내지 m원 헤테로사이클릴"은 고리의 형성을 위한 n 내지 m개의 구성원을 갖는 헤테로사이클릴기를 지칭한다. 본 출원에서, 용어 "헤테로사이클릴"은 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬을 포함한다. 추가로, 고리는 또한 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤테로사이클릴은 포화 헤테로사이클로알킬기이다. 예를 들면, 헤테로원자는 산소, 황, 질소, 및 인을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "헤테로사이클로알킬"은 고리에서 적어도 하나의 원자가 헤테로원자이고 남은 원자가 탄소 원자인 사이클로알킬기를 지칭한다. 용어 "n 내지 m원 헤테로사이클로알킬"은 고리의 형성을 위하여 n 내지 m개의 구성원을 갖는 헤테로사이클로알킬기를 지칭한다. 추가로, 고리는 또한 완전히 컨쥬게이트된 시스템 없이 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤테로사이클로알킬은 포화 헤테로사이클로알킬기이다. 예를 들면, 헤테로원자는 산소, 황, 질소, 및 인을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 헤테로사이클로알킬기는 고리의 형성을 위하여 3 내지 8개, 3 내지 6개, 또는 4 내지 6개의 탄소 원자를 함유한다. 예를 들면, 헤테로사이클로알킬기는 아제티딘, 아지리딘, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴린, 및 호모피페라진 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "아릴"은, 또 다른 용어의 부분으로 사용되든 단독으로 사용되든, 고리를 형성하는 탄소 원자 사이의 교차하는 이중 및 단일 결합을 갖는 단일 또는 다중 카보사이클릭 기를 지칭한다. 용어 "Cn-Cm 아릴"은 고리의 형성을 위하여 n 내지 m개의 탄소 원자를 갖는 아릴기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아릴 고리 시스템은 하나 이상의 고리에서 6 내지 12개, 6 내지 10개, 또는 6 내지 8개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 아릴 고리 시스템은 2개 이상의 융합된 고리를 함유한다. 예를 들면, 아릴기는 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 및 인데닐 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "헤테로아릴"은 적어도 하나의 고리 원자가 헤테로원자이고 남은 고리 원자가 탄소 원자인 아릴기를 지칭한다. 용어 "n 내지 m원 헤테로아릴"은 고리의 형성을 위하여 n 내지 m개의 구성원을 갖는 헤테로아릴기를 지칭한다. 예를 들면, 헤테로원자는 산소, 황, 질소, 및 인 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴기는 고리의 형성을 위하여 5 내지 10개, 5 내지 8개, 또는 5 내지 6개의 구성원을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴기는 5 또는 6원 헤테로아릴이다. 예를 들면, 헤테로아릴기는 푸릴, 티에닐, 피리딜, 퀴놀릴, 피롤릴, N-저급 알킬피롤릴, 피리딜-N-옥사이드, 피리미디닐, 피라지닐, 이미다졸릴, 및 인돌릴을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "알콕시"는, 또 다른 용어의 부분으로 사용되든 단독으로 사용되든, "-O-알킬"기를 지칭한다. 용어 "Cn-Cm 알콕시"는 알콕시기의 알킬 부분이 n 내지 m개의 탄소 원자를 함유한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 알킬 부분은 1 내지 6개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 예를 들면, 알콕시기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시(예를 들면, n-프로폭시 및 이소프로폭시), 및 t-부톡시 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "할로알킬"은, 또 다른 용어의 부분으로 사용되든 단독으로 사용되든, "-알킬-X"기를 지칭하고, 여기서 X는 플루오르, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된 할로겐이다. 용어 "Cn-Cm 할로알킬"은 할로알킬기의 알킬 부분이 n 내지 m개의 탄소 원자를 함유한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 알킬 부분은 1 내지 6개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 함유한다. 예를 들면, 할로알킬기는 할로메틸, 할로에틸, 할로프로필(예를 들면, n-할로프로필 및 이소할로프로필), 및 t-할로부틸 등과 같은 화학기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, n이 정수인 용어 "n원"은 일반적으로 고리 시스템과 함께 사용되어 고리를 형성하는 고리 시스템에서 원자의 갯수를 설명한다. 예를 들면, 피페리디닐은 6원 헤테로사이클로알킬기 중 하나이고, 피라졸릴은 5원 헤테로아릴기 중 하나이고, 피리딜은 6원 헤테로아릴기 중 하나이고, 1,2,3,4-테트라하이드로-나프탈렌은 10원 아릴기 중 하나이다.
본 출원에서, 용어 "할로겐"은 플루오르, 염소, 브롬 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된 원자를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "시아노"는 "-CN"기를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "하이드록실"은 "-OH"기를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "니트로"는 "-NO2"기를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "아미노"는 "-NH2"기를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "카바모일"은 "-HNCONH2"기를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "화합물"은 도시된 구조의 모든 입체이성질체(예를 들면, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체), 기하 이성질체, 호변이성질체, 및 동위원소를 포함하는 것을 의도한다.
본 출원에서, 본 출원에서 화합물은 비대칭일 수 있다(예를 들면, 하나 이상의 입체중심을 갖는). 달리 특정되지 않는 한, 모든 입체이성질체, 예를 들면, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체가 포함된다. 비대칭으로 치환된 탄소 원자를 함유하는 본 출원에서 화합물은 임의로 활성 또는 라세미 형태로 단리될 수 있다. 라세미 혼합물의 분할 또는 입체선택적 합성과 같은, 광학 활성 없는 초기 원료로부터 광학 활성 형태를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 본 출원에서 화합물은 또한 다양한 기하 이성질체, 예를 들면, 올레핀 및 탄소-탄소 이중 결합을 포함할 수 있고, 모든 이들 안정한 이성질체는 본 출원에 포함되었다. 본 출원에 기재된 화합물의 시스 및 트랜스 기하 이성질체는 이성질체의 혼합물 또는 개별적인 이성질체로서 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 화합물은 R 배열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 출원에서 화합물은 S 배열을 갖는다.
화합물의 라세미 혼합물은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 분할될 수 있다. 예를 들면, 방법은 키랄 분할 산에 의한 분별 결정, 광학 활성을 갖는 염 형성 유기 산을 포함한다. 분별 결정화를 위한 적절한 분할 시약은, 예를 들면, 광학 활성 산(예를 들면, 타르타르산, 디아세틸타르타르산, 디벤조일타르타르산, 만델산, 말산, 및 락트산의 D 및 L 형태) 또는 다양한 광학적으로 활성인 캄포르설폰산이다. 분별 결정화를 위한 다른 분할 시약은 입체이성질체적으로 순수한 형태, 예를 들면, N-메틸벤질아민, 2-페닐글리시놀, 노르에페드린, 에페드린, N-메틸에페드린, 사이클로헥실에틸아민, 및 1,2-디아미노사이클로헥산을 포함한다.
라세미 혼합물의 분할은 광학 활성 분할 시약(예를 들면, 디니트로벤조일페닐글리신)에 의한 크로마토그래피 컬럼 상에서 용리에 의해 수행될 수 있다. 용리를 위한 적절한 용매는 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본 출원에서 화합물은 또한 호변이성질의 형태를 포함한다. 호변이성질의 형태는 양성자의 이동에 수반되는 인접한 이중 결합과 단일 결합의 교환으로부터 야기된다. 호변이성질의 형태는 이성질체의 양성자 첨가 상태에서 양성자, 동일한 화학식 및 총 전하를 갖는 호변 이성질체를 포함한다. 예를 들면, 양성자를 갖는 호변이성질체는 케토-엔올 쌍, 아미드-이미드산 쌍, 락탐=락팀 쌍, 엔아민-이민 쌍, 및 환형 형태를 포함하고, 여기서 양성자는 헤테로사이클릭 시스템의 2개 이상의 위치를 점유할 수 있고, 예를 들면, 1H- 및 3H-이미다졸; 1H-, 2H- 및 4H-1,2,4-트리아졸; 1H- 및 2H-이소인돌; 및 1H- 및 2H-피라졸이다. 호변이성질의 형태는 적합한 치환에 의해 평형을 이루거나 하나의 형태로 입체구조적으로 잠길 수 있다.
본 출원에서 화합물은 또한 중간체 또는 최종 화합물에서 발생하는 원자의 모든 동위원소를 포함할 수 있다. 동위원소는 동일한 원자 번호를 갖지만 상이한 질량수를 갖는 원자를 포함한다. 예를 들면, 수소의 동위원소는 프로튬, 듀테륨, 및 트리튬을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 소분자 화합물은 유기적으로 합성될 수 있다. 임의의 공지된 유기 합성 기술 및 다양한 가능한 합성 경로는 본 출원에서 염, 에스테르, 수화물, 또는 용매화물을 포함하는 화합물을 제조하는데 사용될 수 있다.
본 출원에서 화합물은 유기 합성의 분야에서 숙련가에 의해 용이하게 선택될 수 있는 적절한 용매에 의해 제조될 수 있다. 적절한 용매는 반응 온도(예를 들면, 용매의 어는 온도 내지 용매의 끓는 온도의 온도 범위)에서 초기 원료(반응물), 중간체, 또는 생성물과 실질적으로 반응성이 없다. 주어진 반응은 하나의 용매 또는 하나 이상의 용매의 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 특정한 반응 단계를 위하여 적절한 용매를 선택할 수 있다.
본 출원에서 화합물의 제조는 다양한 화학기의 보호 및 탈보호를 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 보호 또는 탈보호가 필요한지 여부 및 적절한 보호기의 선택을 용이하게 결정할 수 있다. 화학에서 보호기에 있어서, 문헌[T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., Wiley & Sons, Inc., New York(1999)]을 참조하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
반응은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 따라 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 생성물의 형성은 분광학, 예를 들면, 핵 자기 공명 분광학(예를 들면, 1H 또는 13C), 적외선 분광학, 분광광도법(예를 들면, UV-Vis), 또는 질량 분석법, 또는 크로마토그래피, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LCMS), 또는 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(문헌["Preparative LC-MS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization" Karl F. Blom, Brian Glass, Richard Sparks, Andrew P. Combs J. Combi. Chem. 2004, 6(6), 874-883]을 참조하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다) 및 정상 상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 다양한 방법에 의해 화합물을 정제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 소분자 화합물은 상업적으로 이용 가능할 수 있다.
일부 실시양태에서, 소분자 화합물은 하기 화합물이다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
본 출원에서, 용어 "PAO"는 구체적으로 하기와 같은 기본 구조로서 산화비소기 및 벤젠 고리를 갖는 소분자 화합물을 지칭한다:
Figure pct00009
기분 장애
본 출원에서, 용어 "기분 장애"는 특정한 기간 동안 지속되고 일상 생활에 일종의 방해를 유발하는 비정상적인 기분(감정)으로 인한 곤란 상태를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 기분 장애는 고조된 기분, 저하된 기분, 또는 고조된 기분과 저하된 기분의 순환이다.
본 출원에서, 용어 "고조된 기분"은 환자에 의해 전형적으로 좋은 기분을 나타내고, 따라서 신나고 의기양양하고 근심이 없는 등으로 보이는 조증 삽화의 주요 일차 증상을 지칭한다. 이러한 활기찬 기분은 매우 전염성 있으며, 종종 주변 사람들로부터 웃음을 유발한다. 조증 삽화가 있는 일부 환자는 흥분의 주요 징후를 갖고, 이들은 언제나 이성을 잃을 것이고, 심지어 파괴적이고 공격적인 행동을 가질 수 있다.
본 출원에서, 용어 "저하된 기분"은 파괴적인 행동을 야기하는 슬픔 및 우울증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 감정의 정신 상태를 지칭한다. 환자는 낮고 우울한 분위기에서 우울함, 괴로움, 및 슬픔을 느낀다. 우울증 삽화의 저하된 기분은 2개의 상이한 특징을 갖는다: 첫째, "유의미하고 지속적이다"는 것이고, 이는 이러한 저하된 기분이 일반적으로 시무룩함부터 비통함까지 본인 및/또는 다른 사람들에 의해 분명하게 느껴지며 적어도 2주 동안 지속되는 것을 의미하고, 두번째, "실제 상황과 어울리지 않는다"는 것이고, 이는 이러한 저하된 기분이 왜곡되고 과장된 "우울함"이고, 객관적 실재로 설명하기 어렵다는 것을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "고조된 기분과 저하된 기분의 순환"은 고조된 기분이었다 저하된 기분이었다 하는 정신 상태를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 기분 장애는 불안증, 우울증, 정신분열증, 또는 조증이다.
본 출원에서, 용어 "불안증"은 광장공포증이 있거나 없는 공황 장애, 공황 장애의 병력이 없는 광장공포증, 특정 공포증, 사회 불안 장애, 강박 신경 장애, 외상후 스트레스 장애, 급성 스트레스 장애, 범불안 장애, 일반적인 의료적 병태가 원인인 불안 장애, 물질 유도성 불안 장애, 및 달리 열거되지 않은 불안 장애를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불안증"은 불안증의 진단 및 통계 열람(예를 들면, 문헌[Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, DSM-IV, 1994, American Psychiatric Association, Washington, D.C.] 참조)에 기재된 이와 관련된 장애를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 신경학과 및 정신과 장애, 특히 불안 장애는 대안적인 명명법 시스템, 질환 분류 시스템, 및 의학의 발전과 함께 발달한 분류 시스템을 포함하는 것을 알아야 한다. 따라서, 용어 "불안증"은 다른 진단 출처에 기재된 유사한 장애를 포함하는 것을 의도한다.
본 출원에서, 용어 "우울증"은, 예를 들면, 단일 또는 재발성 주요 우울 및 기분저하 장애, 우울 신경병증, 및 기능적 우울증을 포함한다. 본 출원에서 우울증은 식욕부진, 과도한 체중 감량, 불면증 및 조기 기상, 및 정신운동 지연을 포함하는 우울한 우울증; 식욕 증가, 졸음과다, 정신운동 초조 또는 흥분, 불안 장애, 및 공포증을 포함하는 비정형 우울증(또는 반응성 우울증); 및 계절성 정서 장애를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "우울증"은 DSM-IV에 기재된 관련 장애를 포함한다.
본 출원에서, 용어 "정신분열증"은 심각한 만성 외상을 특징으로 하는 정신 장애이고, 청년기에 나타나는 증상과 함께 사회성 장애의 기간이 뒤따른다. 정신분열증은 청각적 및 시각적 환각, 편집증, 망상(양성 증상), 감정적 둔감, 우울증, 무쾌감증, 운동성 실어증, 기억력 및 주의력 결핍, 사회적 위축(음성 증상) 등을 나타낸다.
본 출원에서, 용어 "조증"은 주로 상승된 감정 또는 흥분을 특징으로 하는 정신과 장애이고, 에너지 증가, 연설 증가, 과다활동, 및 심각한 경우에는, 환각, 망상, 및 스트레스를 동반한다. 조증 삽화는 일반적으로 삽화 과정에서 적어도 1주 동안 지속된다. 환자는 각각의 삽화 후 정상 정신 상태를 갖는 간헐적 차도를 시작한다. 대부분의 환자는 재발성 삽화를 갖는 경향이 있다.
일부 실시양태에서, 기분 장애는 신경변성 질환, 뇌졸중, 또는 악성 종양에 의해 유발된다.
일부 실시양태에서, 기분 장애는 신경변성 질환에 의해 유발된 불안증 또는 우울증, 예를 들면, 알츠하이머 질환에 의해 유발된 불안증 또는 우울증이다.
약물 투여 및 의약 용도
본 출원에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 현명한 의학적 판단의 범위 내에서, 적절한 이익/위험 비를 갖는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물 조직과 접촉하여 사용하는데 적합한 이러한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 제형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 제형은 동물(더 특히, 인간) 사용에 대하여 규제 기관(예를 들면, 미국 식품의약청, 중국 식품의약청, 또는 유럽 의약청)에 의해 승인된 것들, 또는 보편적으로 인정되는 약전(예를 들면, 미국 약전, 중국 약전, 또는 유럽 약전)에 열거된 것들을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함할 수 있다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들면, 포유동물 및 비포유동물을 포함한다. "대상체"는 가축(예를 들면, 소, 돼지, 양, 닭, 토끼, 또는 말), 또는 설치류(예를 들면, 래트 또는 마우스), 또는 영장류(예를 들면, 고릴라 또는 원숭이), 또는 길들여진 동물(예를 들면, 개 또는 고양이)일 수 있다. "대상체"는 숫컷 또는 암컷일 수 있고, 또한 상이한 연령일 수 있다. 인간 "대상체"는 백인, 아프리카인, 아시아인, 셈족, 또는 다른 인종, 또는 상이한 인종의 혼성일 수 있다. 인간 "대상체"는 노인, 성인, 청소년, 소아, 또는 유아일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원에서 대상체는 인간 또는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 본 출원에서 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다.
본 출원에 개시된 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 당해 분야의 공지된 투여 경로, 예를 들면, 주사(피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사(점적 또는 주입), 근육내 주사, 또는 피내 주사 포함), 또는 비주사(경구 투여, 비강 투여, 설하 투여, 직장 투여, 또는 국소 투여 포함)에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에서 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 경구, 피하, 근육내, 또는 정맥내 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 출원에서 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 경구 투여된다.
본 출원에서, 용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 질환 또는 증상을 완화시키거나 제거할 수 있거나, 질환 또는 증상의 발생을 예방적으로 억제하거나 예방할 수 있는 약물의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 대상체의 하나 이상의 질환 또는 증상을 특정한 정도로 완화시키는 약물의 양일 수 있고/거나; 질환 또는 증상의 원인과 연관된 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 파라미터를 정상으로 부분적으로 또는 완전히 복구시키는 약물의 양일 수 있고/거나; 질환 또는 증상의 가능성을 감소시키는 약물의 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 기분 장애(예를 들면, 불안증 또는 우울증)를 완화시키거나 제거할 수 있는 약물의 양을 지칭한다.
본 출원에 의해 제공된 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 치료적 유효량은 당해 분야의 공지된 다양한 인자, 예를 들면, 체중, 연령, 과거 병력, 현재 받고 있는 치료, 강도, 알레르기, 과민성, 및 건강 상태와 약물 사이의 상호작용의 부작용, 투여 경로, 및 질환 발달의 정도에 따라 좌우된다. 당해 분야의 숙련가(예를 들면, 의사 또는 수의사)는 이들 또는 다른 조건 또는 요건에 상응하게 용량을 감소시키거나 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 대상체에게 투여하기 전에 대상체가 기분 장애를 갖는 것으로 진단하는 단계를 추가로 포함한다. 대상체는 정신과 임상의에 의해 사용되는 통상적인 진단 방법 및 기준에 의해 기분 장애로 진단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료는 제2 시약을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 삼환계 항우울제, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI), 또는 세로토닌-노르에피네프린 재흡수 억제제(SNRI)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 제2 시약이 기분 장애의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 제2 시약은 신경변성 질환, 뇌졸중, 또는 악성 종양의 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 신경변성 질환의 치료에 사용되는 시약은 레보도파, 카르비도파, 셀레길린, 라사길린, 엔타카폰, 톨카폰, 아만타딘, 메만틴, 릴루졸, 브로모크립틴, 페르골리드, 아포모르핀, 로피니롤, 프라미펙솔, 아트로핀, 스코폴아민, 트리헥시페니딜, 벤자트로핀, 프로사이클리딘, 타크린, 도네페질 하이드로클로라이드, 칼란타민, 후페르진 A, 및 리바스티그민을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 뇌졸중의 치료에 사용되는 시약은 디피리다몰, 저분자량 덱스트란, 우로키나제, 헤파린, 및 아스피린을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 악성 종양을 치료하는데 사용되는 시약은 사이클로포스파미드, 티오테파, 카르무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 카페시타빈, 시타라빈, 젬시타빈, 팍클리탁셀, 도세탁셀, 및 빈트리스틴을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 제2 시약 전에, 후에, 또는 동시에 투여된다.
본 출원은 또한 기분 장애의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 용도, 및 기분 장애의 예방 또는 치료에서의 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 용도를 포함한다.
약물 스크리닝
본 출원은 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 스크리닝 방법으로서, 약물 후보를 PI4KIIIα, FAM126, TTC7, 또는 EFR3a 단백질 또는 핵산, 또는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체와 접촉하게 하는 단계, 및 약물 후보가 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 형성 또는 활성을 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
본 출원은 기분 장애의 예방 또는 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법으로서, 약물 후보를 PI4KIIIα, FAM126, TTC7, 또는 EFR3a 단백질 또는 핵산, 또는 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체와 접촉하게 하는 단계, 및 약물 후보가 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체의 형성 또는 활성을 억제할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
실시예
실시예 1: 래트에서 만성의 예측 불가능한 중등도 스트레스 모델에 대한 경구 투여된 PAO의 항우울제 효과
1.1 실험 원리
만성의 예측 불가능한 중등도 스트레스(CUMS) 모델은 카츠(Katz)에 의해 기재된 만성의 예측 불가능한 스트레스에 의해 영감을 받은 문헌[Willner et al. in 1987]에 의해 제안된 래트에서의 우울증 모델이고, 적절하게 변형되었다. 이는 현재 문헌에서 광범위하게 사용된다. 이 모델은 사람들이 이들의 일상 생활에서 접하는 "어려움"을 더 현실적으로 모방한다. 이 모델에서, 스트레스 요인의 가변성 및 예측 불가능성이 모델을 만드는데 핵심이다. 10개 이상의 스트레스 요인이 전체 실험 동안 무작위로 선택되고, 따라서 동물은 자극의 발생을 제외할 수 없다. 이 모델은 매우 효과적이고, 우울증 모델의 요건을 기본적으로 만족시키며, 다른 모델에 의해 해결될 수 없는 문제점을 다루는데 사용될 수 있다. 중등도 스트레스의 장기간 자극 후, 설탕물의 소비의 감소는 내인성 우울증의 중심 증상, 즉, 무쾌감증을 반영하고, 다른 주요 우울성 장애의 증상, 예를 들면, 운동 능력 및 사회적 상호작용 능력의 감소, 탐사 능력의 감소, 공격적 공격의 결핍, 및 성욕의 감소가 또한 모방된다. 만성 스트레스 매개된 행동 이상은 수 개월 동안 지속될 수 있고, 항우울제의 장기간 사용은 이들 이상을 교정할 수 있고, 다른 유형의 향정신성 약물은 효과적이지 않다.
1.2 실험 목적
이 실험의 목적은 만성의 예측 불가능한 중등도 스트레스 래트 모델에서 설탕물에 대한 선호도에 대한 PAO의 경구 투여의 효과를 관찰하여 PAO가 우수한 항우울제 효과를 갖는지 여부를 결정하는 것이다.
1.3. 실험 물질
1.3.1 실험 샘플
명칭: PAO
제조 방법: PAO의 필요한 양을 중량 측정하여 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 함께 30 mg/mL의 농도의 스톡 용액으로 제조한 다음, 스톡 용액을 물로 희석하였다.
위관영양법에 의한 경구 투여: 0.1-3.0 mg/kg 범위의 용량 및 중량 100 g당 0.5 mL의 부피.
1.3.2 양성 대조군
명칭: 벤라팍신 하이드로클로라이드 캡슐(Effexor XR)
사양: 150 mg/캡슐
제조 방법: 2개의 벤라팍신 하이드로클로라이드 캡슐(150 mg/캡슐)을 분쇄한 다음, 초음파하에 0.5% CMC-Na 중에 현탁하여 0.5% CMC-Na의 부피를 100 mL의 최종 부피로 정확하게 조절하였다.
1.3.3 실험 동물
종: 위스타(Wistar) 래트
마릿수 및 성별: 60, 숫컷
체중: 200-220 g(군 분류 전)
공급원: 상하이 실라이케 엑스페리먼트 애니멀 코 엘티디(Shanghai Silaike Experiment Animal Co., Ltd.)
1.4 실험 방법
1.4.1 동물 군 분류
5일 동안 환경에 순응시킨 후, 체중 220-250 g의 건강한 SD 래트를 실험을 위하여 선택하고, 하기 표 1에 따라 군으로 분류하였다.
Figure pct00010
1.4.2 동물 모델링 및 투여 방법
1.4.2.1 설탕물 선호도의 기본 검출
래트를 1주 동안 적응하게 사육한 다음, 설탕물 선호도의 기본 시험을 수행하였다. 처음 24시간 동안, 모든 래트에게 케이지 좌측 및 우측 구석에 위치한 2개의 병에 1% 설탕물을 제공하였다. 다음 24시간 동안, 모든 래트에게 1% 설탕물을 제공하고, 케이지의 좌측 및 우측 구석에 여전히 위치한 2개의 병에 각각 정상 식수를 제공하였다. 그 후, 모든 래트를 23시간 동안 고체 및 액체에 대하여 금식시킨 다음, 설탕물 선호도의 실험을 수행하였다: 모든 래트에게 1% 설탕물 및 정상 식수를 제공하였고, 병의 중량을 측정하여 1시간 내에 래트에 의해 소비된 설탕물 및 정상 식수의 양을 각각 측정하였다. 래트를 중량, 액체 소비, 및 설탕물 소비에 따라 표 1에 도시된 바와 같이 고르게 군으로 분류한 다음, 만성의 예측 불가능한 중등도 스트레스("CUMS")의 대상이 되도록 하였다.
1.4.2.2 CUMS 우울증 모델링
CUMS 우울증 모델링을 블랭크 군을 제외한 모든 군에서 수행하였다. 10개가 넘는 스트레스 요인을 매주 교대로 래트에게 제공하여, 래트가 스트레스 요인에 의한 각각의 자극의 기간 및 다음에 제공되는 자극을 예측할 수 없도록 하였다. 실험을 위한 스트레스 요인은 하기와 같다: 7시간 동안 플래시 2회; 17 시간 동안 더러운 쓰레기 환경(쓰레기에 물 150 mL 붓기) 1회; 3시간 동안 간헐적 소음 1회 및 5시간 동안 간헐적 소음 1회; 야간 조명(36시간 동안 지속) 1회; 7시간 동안 케이지 기울이기 1회 및 22시간 동안 케이지 기울이기 1회; 17시간 동안 군으로 사육(하나의 케이지에 래트 5마리) 1회; 17시간 동안 낯선 냄새가 있는 환경에서 사육 1회; 7시간 동안 이물질이 있는 환경에서 사육 1회; 각각의 금식 후 2시간 동안 제한된 먹이 공급과 함께, 각각 19시간, 22시간, 및 24시간 동안 고체에 대한 금식 3회; 각각의 금식 후 1시간 동안 위치한 빈 병과 함께, 각각 17시간, 19시간, 20시간, 및 21시간 동안 액체에 대한 금식 4회(표 2).
Figure pct00011
1.4.2.3 투여 방법
CUMS 모델링의 처음 2주 동안, PAO는 래트에 투여되지 않는다. CUMS 모델링 2주 후 제1 주에, PAO 또는 벤라팍신을 래트에 경구 투여하였다. 동시에, 식수를 블랭크 군 및 모델 군에서 래트에게 제공하였다. 투여는 CUMS 모델링의 종료까지 표 1에 나타낸 용량으로 1일 1회 수행하였다. CUMS 자극을 투여 동안 계속 수행하였다.
1.4.3 우울증 행동 지표-설탕물에 대한 선호도 검출
매주, 고체 및 액체에 대한 금식 후, 액체 소비를 측정하였고(금요일에), 각각의 래트에 대하여, 체중(목요일에 기록), 총 유체 섭취, 물 섭취, 및 설탕물 섭취를 기록하였다. 각각의 래트에 대하여, 설탕물에 대한 선호도의 퍼센트(하기와 같이 계산한다: [선호도 = (설탕물 섭취/총 유체 섭취) × 100%]) 및 체중 그램당 설탕물 소비를 계산하였다. 이 실험을 9주의 기간 동안 수행하였다.
1.4.4 통계적 방법
통계적 분석은 평균 ± 표준 표준 오차(± s.e.m.)로서 데이터가 표시되는 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 블랭크 군의 래트와 다른 군의 래트 사이의 체중 차이는 양방향 ANOVA로 통계적으로 분석하였다. 투여 1주 및 2주 후, 모델 군과 다른 사이의 설탕물에 대한 선호도 차이 및 블랭크 군과 다른 군 사이의 설탕물에 대한 선호도 차이를 비쌍성 t 시험으로 유의미성에 대하여 시험하였고, *는 P < 0.05를 나타내고 **는 P < 0.01을 나타낸다.
1.5 실험 결과
1.5.1 CUMS 모델링 및 투여 후 체중의 변화
초기 군 분류에서, 모든 군의 래트의 체중은 유의미한 차이 없이 유사하다. CUMS의 진행에 따라, 미처리 블랭크 군을 제외하고, 다른 군의 래트의 체중 증가는 CUMS 모델링로 인하여 유의미하게 느려진다(표 3, 도 1). 자극의 제1 주부터, CUMS에 의해 자극된 다른 군의 래트의 체중은 매주 측정에서 블랭크 군에서 래트의 체중보다 낮고(표 3, 도 1), 이는 이 실험에서 우울증 모델링에 대한 CUMS의 사용이 매우 효과적이고, 우울증의 개시 동안 체중 손실을 크게 자극한다는 것을 나타낸다.
Figure pct00012
1.5.2 PAO의 다중 투여의 항우울제 효과
초기 군 분류에서, 모든 군에서 래트는 설탕물에 대한 유사한 선호도를 갖는다. 투여 6주 후, 3 mg/kg 및 0.75 mg/kg의 용량의 PAO 및 벤라팍신 둘 다는 래트에서 설탕물에 대한 선호도를 증가시킬 수 있고, 모델 군과 유의미한 차이(P < 0.05 또는 P < 0.01)를 갖고, 블랭크 군(P > 0.05)의 것과 유사한 설탕물에 대한 선호도를 갖는다(표 4). 이 실험의 결과는, 래트의 CUMS 우울증 모델에서, PAO의 경구 투여가 유의미한 항우울제 효과를 갖고, 벤라팍신의 위관영양법에 의한 경구 투여보다 약간 늦은 개시 시간을 갖는다는 것을 보여준다.
Figure pct00013
1.6 결론
6주 동안 1일 1회 3 mg/kg 또는 0.75 mg/kg의 용량의 PAO 또는 양성 약물 벤라팍신의 경구 투여는 CUMS 우울증 래트 모델에서 설탕물에 대한 선호도를 정상 래트와 유사한 수준으로 증가시킬 수 있고, 이는 항우울제 효과를 반영한다. 1.5 mg/kg의 용량의 PAO의 경구 투여는 설탕물에 대한 선호도를 증가시킬 수 있다.
실시예 2: PAO의 항-불안증 및 항-우울증 효과의 추가의 입증 및 메커니즘 연구
2.1 마우스의 계통, 사육 및 번식
본 발명에서 사용된 마우스 계통은 C57/6B 및 ICR 야생형 마우스, Efr3a-/+ 마우스(Efr3a의 제2 엑손을 무조건적으로 녹아웃시킨 다음, 후속적인 유전자 코드 쉬프트를 야기한다), Pi4kaGt(RRO073)Byg/+(짧은 경우, Pi4k-/+) 마우스, 및 APP/PS1 마우스를 포함한다.
5 세대 이상 동안 뮤턴트 마우스 리소스 앤드 리서치 센터(Mutant Mouse Resource and Research Center)로부터의 C57/6B 마우스와 Pi4kaGt(RRO073)Byg/+ 마우스(MMRRC, Cat. #016351-UCD)를 역교배시켜 Pi4kaGt(RRO073)Byg/+ 마우스를 수득하였다. 이러한 종류의 마우스에서, 트랜스포존을 PI4KA 유전자(PI4KIIIα를 인코딩하는)에 삽입하고, polyA를 도입하여, PI4KA의 전사가 이르게 종료될 수 있게 한다. APP/PS1 마우스는 B6.Cg-Tg(APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/Mmjax(MMRRC ID 034832-JAX)의 유전형을 갖는 이중 형질전환 마우스이고, 이는 알츠하이머병(AD)의 모델에서 마우스이다.
본 출원에서, 마우스를 표준 크기 케이지에서 케이지당 5마리씩, 가끔 케이지당 4 또는 6마리씩 사육하였다. 달리 특정되지 않는 한, 마우스는 자유롭게 먹고 마시도록 허용하였다.
2.2 불안증 및 우울증의 호르몬 유도된 마우스 모델의 확립
ICR 마우스를 코르티코스테론(GC, 또한 11β,21-디하이드록시프로게스테론으로도 공지됨)과 함께 1개월 동안 경구 투여하여 마우스 우울증 모델을 수득하였다. 가용화제로서 0.45% 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(β-CD)과 함께 35 μg/mL의 GC 농도를 갖는 수성 용액을 제조하였다.
숫컷 C57B/6 WT 마우스 60마리를 각각의 군마다 10마리씩 6개의 군으로 나누었다. 마우스가 3개월 연령이 되었을 때, 마우스의 4개의 군의 식수를 수성 GC 용액으로 교체하고, 다른 2개의 군은 계속 정상 식수를 제공하였고, 마우스의 체중 변화 및 물 섭취를 매주 기록하였다. 1개월 후, 2개의 군을 GC 용액 및 물이 따로 공급된 마우스로부터 무작위로 선택하였고, 위관영양법으로 PAO 용액을 투여하였다. PAO를 위관영양법에 의해 매일 규칙적인 시간에 0.2 mg/kg 및 0.4 mg/kg의 용량으로 300 μL의 총 부피로 투여하였다. 투여 1개월 후, 즉, 마우스가 5개월 연령이 되었을 때, 마우스의 행동 실험 분석을 수행하였다.
2.3 PAO 또는 이의 유도체의 제조
PAO 스톡 용액의 제조: PAO ≤30 mg을 순수한 DMSO 용매 1.0 mL에 가한 다음, PAO가 완전히 용해될 때까지 초음파 처리하거나 진동시켰다. 그 다음, 혼합물을 물로 필요한 농도 및 0.1%의 최종 DMSO 농도로 희석하였다.
일부 실시예에서, PAO 또는 이의 유도체를 중쇄 트리글리세라이드 중에 용해시켜 1.0 mg/g의 농도의 스톡 용액을 수득하고, 스톡 용액을 중쇄 트리글리세라이드로 위관영양법을 위한 특정한 농도로 희석하였다.
2.4 마우스 행동 실험 방법
2.4.1 강제 수영 실험(FST)
강제 수영 실험에서, 실험 동물을 이들이 필사적으로 탈출하려고 몸부림치지만 탈출할 수 없고, 따라서 불가피한 억압적인 환경을 제공하는 국한된 환경(예를 들면, 물)에 넣는다. 일정 기간 후, 동물은 전형적인 "부동 상태"를 나타낸다. 이는 "행동 절망 상태"로 알려진 우울증 모델이다. 실험은 내부 직경 15 cm 및 높이 30 cm의 투명 플라스틱 실린더에서 수행된다. 물 주입의 높이는 15 cm이고, 이는 마우스의 꼬리가 바닥에 닿을 수 없고 마우스가 실린더로 뛰어오를 수 없는 높이로 적절하게 조절될 수 있다. 실험 동안, 물 온도는 22 내지 25℃로 유지되어야 한다. 강제 수영 이미지 획득 시스템은 물 속의 마우스의 사지의 움직임이 명확하게 기록될 수 있는 실린더로부터의 특정한 거리에서 FST 장치의 앞에 위치하여야 한다. 각각의 FST는 6분 동안 수행될 필요가 있다. 2분부터 6분까지 마우스의 부동 시간이 분석된다. 실험 후, 마우스를 제때에 꺼내고 건조시킨다. 마우스가 실험 동안 익사하는 경우, 이를 제때에 꺼내야 하고, FST 실험은 중단되어야 한다. 실험 동안, 완전한 침묵 환경이 생성 및 유지되어야 한다. 특정한 기간 동안 마우스가 더 오래 부동으로 남아 있을수록, 마우스는 더 우울한 것이다.
2.4.2 명암 상자(LDB) 시험
명암 상자 시험은 동물의 어두움 중독(암 상자) 및 탐색 특성(명 상자)을 기반으로 한 동물에서의 불안증 행동 평가의 시험이다. LDB는 동일한 크기의 9개의 칸을 명 상자(27×27 cm) 및 동일한 크기의 6개의 칸을 갖는 암 상자(18×27 cm)로 구성된 커버가 없는 전체 직사각형 상자(45×27×27 cm)을 사용하여 수행된다. 명 상자 및 암 상자를 작은 창(7.5×7.5 cm)이 있는 패널로 분리한다. 이미지 획득 시스템은 설정 시간 내에 명 상자와 암 상자 사이의 마우스의 거리 및 궤적, 명 상자 및 암 상자로 들어가고 나가는 횟수, 및 명 상자 또는 암 상자에서 소비된 시간을 상자 위에 직접적으로 기록되도록 위치한다. 마우스가 명 상자 및 암 상자를 더 자주 들어가고 나갈수록, 상자 사이의 거리가 더 길어지거나, 암 상자에서 소비되는 시간이 길어질수록, 마우스는 더 불안한 것이다. 실험 전에, 공기 교환을 위한 구멍이 있도록 케이지를 은박지로 싸야한다. 실험은 30분 동안 셰이딩 후 시작하여야 한다. 목적은 마우스를 사전에 어두운 환경에 적응하게 하고 마우스의 실험 공포 및 불안 상태를 제거하는 것이다. 마우스를 작은 창을 직면하고 명 상자 또는 암 상자의 중심에 놓는다. 5분 30초 내에, 명 상자 및 암 상자를 들어가고 나가는 횟수, 명 상자와 암 상자 사이의 거리, 및 각각의 상자에서 소비된 시간을 기록한다. 이미지 획득 후, 행동 분석을 수행한다. 예전 마우스의 냄새에 의한 다음 마우스의 행동에서 불필요한 오해 및 간섭을 피하기 위하여, 각각의 실험 후, 마우스가 명 및 암 상자에서 접촉한 영역을 70% 에탄올로 완전히 닦아내고, 에탄올 냄새가 완전히 소멸한 후 다음 마우스의 실험을 시작한다. 실험 동안, 완전한 침묵 환경이 생성 및 유지되어야 한다.
2.4.3 십자형 높은 미로(EPM) 시험
심자형 높은 미로는 설치류에서 불안 반응을 평가하기 위한 실험 방법 중 하나이다. 유해 자극(예를 들면, 전기 자극, 소음 자극, 식이 박탈, 및 포식자 냄새에 대한 노출 등)에 의해 유발된 마우스에서 불안증 행동의 검출과 비교하여, 이 실험은 단순한 작동 및 덜 유해함의 이점을 갖고, 마우스의 조건 반응을 직관적으로 반영할 수 있다. EPM은 십자형 형상으로 교차하는 2개의 개방 통로 및 2개의 폐쇄 통로로 구성되고, 교차로 부분은 땅에서 약 75 cm 높은 중심 부분이다. 원리는 마우스가 새로운 것(개방 통로)에 직면하여 탐색에 대한 호기심을 발달시킬 것이지만, 이들은 또한 어두움 중독 성질을 갖고, 탐색와 회피 사이의 갈등 행동은 불안증을 야기한다는 것이다. 실험 동안, 한 마리의 마우스를 폐쇄 통로를 마주한 중심 영역에 놓고, 5분 30초 내에, 개방 통로 및 폐쇄 통로에 들어가고 나간 횟수, 및 각각의 통로에서 소비된 시간을 기록한다. 마우스가 개방 통로 및 폐쇄 통로에 더 자주 들어가거나, 폐쇄 통로에서 소비된 시간이 더 길수록, 마우스는 더 불안한 것이다. 예전 마우스의 냄새에 의한 다음 마우스의 행동에서 불필요한 오해 및 간섭을 피하기 위하여, 각각의 실험 후, 마우스가 EPM에서 접촉한 영역을 70% 에탄올로 완전히 닦아내고, 에탄올 냄새가 완전히 소멸한 후 다음 마우스의 실험을 시작한다. 실험 동안, 완전한 침묵 환경이 생성 및 유지되어야 한다. 실험 동안, 완전한 침묵 환경이 생성 및 유지되어야 한다.
2.4.4 새로운 환경에서의 섭식 억제(NSF) 실험
새로운 환경에서의 섭식 억제 실험은 금식 및 굶주림 후, 설치류에서 새로운 환경에서의 섭식과 새로운 환경의 공포 사이의 갈등을 검출하는 것이다. 실험 장소는 30×30 정사각형, 높이 20 cm의 백색 불투명 플렉시글라스 상자이고, 상자의 바닥의 중심에 마우스를 위한 한 조각의 정상 음식이 있다. 24시간 동안 금식 후, 한 마리의 마우스를 머리를 상자의 구석을 향하게 하고 상자의 구석에 무작위로 놓는다. 상자에서 마우스의 활동을 마우스가 음식을 먹을 때까지 관찰한다. 그 다음, 마우스를 꺼내고, 상자에 놓은 시간부터 음식을 먹기 시작할 때까지의 시간(섭식 잠재기)을 기록한다. 달리 설계되거나 특정되지 않는 한, 마우스가 5분 내에 음식을 먹지 않는 경우, 마우스를 또한 꺼내고, 마우스의 섭식 잠재기는 5분으로 기록한다. 섭식 잠재기가 길수록, 마우스는 더 불안한 것이다.
2.4.5 만성의 예측 불가능한 중등도 스트레스(CUMS) 모델
실험은 8-10주 동안 지속된다. 다양한 스트레스 요인 중 2개를 무작위로 선택하여 마우스에게 매일 제공한다. 스트레스 요인은 15분 동안 꼬리 클립핑하기, 4시간 동안 강한 빛 자극, 10분 동안 소음, 24시간 동안 케이지 45°로 기울이기, 10분 동안 거꾸로 매달기, 4시간 동안 활동 공간 제약, 24시간 동안 더러운 쓰레기 환경(쓰레기에 물 150 mL 붓기), 야간 조명(36시간 동안), 7시간 동안 낯선 이물질이 있는 환경, 24시간 동안 고체에 대한 금식(금식 동안 쓰레기 제거), 및 24시간 동안 액체에 대한 금식(금식 동안 쓰레기 제거)를 포함한다. 그러나, 액체에 대한 금식은 1주에 오직 1회만 수행하고, 더러운 쓰레기 환경과 교차하지 않는다. 액체에 대한 금식 후, 각각의 마우스의 체중을 측정하고, 설탕물에 대한 선호도를 측정한다. 설탕물에 대한 선호도의 측정에 있어서, 한 마리의 마우스를 사전에 중량 측정한 2개의 병이 놓인 새로운 케이지에 넣고, 여기서 한 병은 순수한 물을 함유하고 다른 병은 1% 설탕물을 함유한다. 마우스가 15분 동안 마신 후, 2개의 병을 교환한 다음, 마우스는 45분 동안 마신다. 2개의 병을 꺼내고 따로 중량 측정한다. 실험 직후, 마우스에게 충분한 물과 음식을 제공한다.
2.4.6 모리스 수중 미로(MWM) 실험
모리스 수중 미로 실험 장치는 세 부분으로 구성된다: 수중 미로, 수중 미로 이미지 획득 시스템, 및 소프트웨어 분석 시스템. 수중 미로는 주로 수영장(직경 = 1.2 m) 및 높이가 조절 가능하고 제거 가능한 원형의 투명한 플랫폼(직경 = 5 cm)으로 구성된다. 수영장은 이산화티탄을 함유하고, 이는 마우스가 수영장에서 플랫폼을 직관적으로 찾을 수 없도록 각각의 실험의 출발 전에 교반되고 균일하게 혼합되어야 한다. 물 온도는 실험 동안 약 20℃로 유지한다. 수영장에서 마우스의 행동을 수중 미로 위에 위치한 카메라로 획득하고, 분석 및 온라인 또는 오프라인 저장을 위하여 카메라에 연결된 컴퓨터로 전송한다.
모리스 수중 미로 실험은 주로 세 단계로 구성된다: 적응 훈련, 획득 훈련, 탐색 훈련, 및 ‹š때로 역 획득 훈련. 간략한 단계는 하기와 같다:
적응 훈련: 획득 학습의 시작 전날, 물을 적절한 온도로 조절하고 균일하게 혼합하고, 수영장의 제3 사분면에 물 표면 0.5 cm 위에 플랫폼을 놓는다. 수영장 벽을 마주한 마우스를 수영장에 놓아 1분 동안 자유롭게 수영하도록 한 다음, 마우스를 꺼내서 물기를 닦는다. 마우스가 1분 내에 플랫폼에 오르는 경우, 마우스를 0.5분 동안 플랫폼 위에 머무르게 한다.
획득 훈련: 일반적으로 7일 동안 지속되지만 더 길거나 짧을 수 있다. 수영장은 4개의 사분면으로 나누고, 플랫폼을 제1 사분면의 중간에 놓는다. 수영장 벽을 마주한 마우스를 4개의 사분면 각각에 무작위로 물에 놓는다. 삼각형, 사각형, 4점 별, 및 원형의 4개의 상이한 표시를 수영장의 4개의 사분면의 벽에 각각 붙여 마우스의 기억 및 학습을 돕는다. 마우스가 수중에서 플랫폼을 찾는데 걸린 시간을 기록한다. 시간이 60초를 초과하는 경우, 마우스를 플랫폼으로 인도하고, 플랫폼에서 30초 동안 머무르게 한 다음, 꺼내서 물기를 닦는다. 마우스가 플롯폼을 60초 전에 찾는 경우, 시간을 기록하고, 플랫폼에서 30초 동안 머무르게 한 다음, 꺼내서 물기를 닦는다. 마우스가 학습 및 기억 능력을 갖는 경우, 플랫폼을 찾는데 걸린 시간은 매일 더 짧아질 것이다.
탐색 훈련: 마지막 획득 훈련 다음날, 플랫폼을 제1 사분면으로부터 제거하여 탐색 훈련 60초를 시작한다. 마우스를 제3 사분면 또는 제4 사분면(제1 사분면으로부터 가장 먼)으로부터 물에 놓고, 제1 사분면(플랫폼이 그 전에 위치했던 사분면)에서 마우스가 소비하는 시간의 퍼센트를 공간 기억의 검출 지표로서 기록한다. 실험이 종료한 후, 마우스는 제때에 꺼내서 물기를 닦는다. 일반적으로, 획득 훈련에서 플랫폼을 찾는데 각각의 사분면에서 최소 시간을 소비할 수 있거나 탐색 훈련에서 제1 사분면에서 소비한 시간의 높은 퍼센트를 갖는 마우스가 강한 학습 및 기억 능력을 갖는다. 실험 동안, 완전한 침묵 환경이 생성 및 유지되어야 한다.
역 획득 훈련: 탐색 단계 후, 플랫폼을 원래 위치에 반대측 사분면에 놓고, 4개의 사분면에서 각각의 마우스에 대하여, 횟수당 60초씩 일당 총 4회로 훈련을 수행한다. 마우스가 숨겨진 플랫폼을 찾은 후, 플랫폼 위에서 30초 동안 머무르게 한다. 마우스가 플랫폼을 찾지 못한 경우, 이를 플랫폼으로 안내하고, 플랫폼 위에서 30초 동안 머무르게 한다. 마우스 사이의 훈련 간격은 15-20분이다.
2.5 마우스 뇌에서 PIK4IIIα의 mRNA 수준의 정량적 PCR 분석
2.5.1 주요 장비 및 시약
Figure pct00014
2.5.2 프라이머 정보
Figure pct00015
2.5.3 실험 단계
RNA 추출: RNAiso Plus 1000 μL를 각각의 뇌 조직 샘플(뇌 절반)에 가한 다음, 조직 용해제와 함께 분쇄하고(10 r/s × 10 s/사이클 × 10 사이클), 실온에서 5분 동안 두고, 12000 g으로 4℃에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액 900 μL를 꺼내고, 새로운 1.5 mL EP 튜브에 가한 다음, 클로로포름 200 μL를 가하고, 균일하게 혼합하고, 실온에서 5분 동안 두고, 12000 g으로 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액 400 μL를 새로운 1.5 mL EP 튜브에 옮긴 다음, 이소프로판올 800 μL를 가하고, 실온에서 10분 동안 두고, 12000 g으로 4℃에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 제거하였다. 침전물을 75% 에탄올 1 mL를 함유한 튜브에 가하고, 균일하게 혼합한 다음, 7500 g으로 4℃에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 제거하였다. 침전물을 실온에서 건조시킨 다음, H2O 50 μL와 함께 용해시켰다.
역전사: 20 μL 시스템의 무-DNA 역전사 키트를 사용하였다. RNA 1 μg, 5×gDNA 이레이저 버퍼 2 μL, 및 gDNA 이레이저 1 μL를 200 μL PCR 튜브에 가한 다음, 10 μL가 될 때까지 H2O를 가하였다. DNA의 소화를 42℃에서 2분 동안 수행하였다. PrimeScript RT 효소 MIX I 1 μL, RT 프라이머 믹스 1 μL, 5×primeScript 버퍼2(실시간용) 4 μL, 및 무 RNase H2O 4 μL를 반응 용액에 가하였다. 역전사를 37℃에서 15분, 85℃에서 5초, 4℃의 과정에 따라 수행하였다. 수득된 cDNA를 즉시 사용하여 -20℃에서 사용을 위하여 저장하였다.
실시간 정량 PCR: cDNA를 무 RNase H2O로 10배로 희석하였다. 반응 시스템은 TB 그린 프리믹스(Green Premix) Ex Taq II 12.5 μL, 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM) 각각 1 μL, cDNA 주형 2 μL, 및 무 RNase H2O 8.5 μL이고, 총 25 μL이다. 반응 과정은 2개의 단계를 포함한다: 95℃에서 30초 동안 초기 변성; 95℃에서 5초 및 60℃에서 30초 동안의 PCR 반응, 총 40 사이클. 최종적으로, 용융 곡선의 플롯팅 과정을 수행하였다. 각각의 샘플은 3개의 기술적 복제를 겪었다.
2.5.4 데이터 분석: 상대적인 정량은 ΔCT 방법에 의해 표적 유전자에 대하여 수행하였다.
2.6 데이터 분석 및 통계
데이터의 비교 분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행한다. 항목에서 데이터 통계는 평균 ± 표준 오차의 형태로 표시된다. 유의미한 차이를 갖는 데이터에 대한 기준은 p < 0.05이다.
2.7 실험 결과
2.7.1 마우스에서 PIK4IIIα의 mRNA 수준은 우울증의 정도와 양성 상관관계가 있다
2개월 연령의 숫컷 ICR 마우스 35마리에 제1 강제 수영 실험을 수행하여 불가피한 억압을 경험하게 했다. 그 후 제7일에, 마우스에 두번째 강제 수영 실험을 수행하고, 각각의 제2 강제 수영 실험의 총 6분 중 마지막 4분 동안 각각의 마우스가 "부동 상태"였던 시간을 기록하였다. 그 다음, 각각의 마우스의 뇌를 빠르게 제거하고, 뇌 조직의 전체 RNA를 추출하고, 역전사하여 cDNA를 수득하였다. 각각의 마우스에 있어서, 정량 PCR을 PI4KIIIα의 cDNA 및 내부 기준 베타-액틴에 대하여 수행하고, 내부 기준 RNA에 상대적인 뇌 조직의 PI4KIIIα의 RNA의 양을 ΔCT 방법으로 계산하고 분석하였다. 10초 미만 또는 160초 초과의 "부동 상태"에 대한 시간 데이터를 제외한 후, "부동 상태"에 대한 남은 시간을 X축 값으로 하고 PI4KIIIα의 RNA의 상대적인 양을 Y축 값으로 하여 산점도를 만들었다(도 2). 결과는 마우스 뇌에서 PIK4IIIα의 mRNA 수준이 우울증의 정도와 선형적으로 양성 상관관계가 있다는 것을 보여준다. 이 실험 결론은 PI4KIIIα가 우울증 중증도의 조절 또는 매개에서 역할을 한다는 것을 나타낸다.
2.7.2 PI4KIIIα 억제제는 APP/PS1 마우스에서 불안증 및 우울증 행동을 완화시킨다
마우스의 2개의 군이 존재하였다: 6개월 연령의 숫컷 APP/PS1 마우스 9마리 및 숫컷 야생형 한배 새끼 9마리. 2개의 군의 마우스에 PAO 용액(0.3 mg/체중 kg의 용량으로)을 위관영양법으로 월요일부터 금요일까지 1일 1회 투여하고, 토요일 및 일요일은 건너뛰었다. 동시에 동일한 연령의 또 다른 숫컷 APP/PS1 마우스 9마리에게 PAO가 없는 용액을 위관영양법으로 투여하였다. 2개월 후, 3개의 군의 마우스는 MWM 훈련 9일 후, 다른 실험 목적을 위한 기억 시험 1일을 겪었다. 마우스가 10개월 연령이 되었을 때, 각각의 마우스를 길이, 너비, 및 높이가 15 cm이고 상자 바닥에 변형된 가정용 전기 모기채가 위치한, 불투명한 무커버 PMMA 상자로 옮겼다. 마우스가 전기채의 중심에 있을 때 마우스에게 1초 전기 충격을 주었다. 그 다음, 마우스를 집 케이지에 다시 놓았다. 7일 후, 마우스에 EPM 시험을 수행하고, 각각의 마우스의 개방 통로에서 소비된 시간을 기록하고, EPM에서 소비된 총 시간 중의 개방 통로에서 소비된 시간의 퍼센트를 계산하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, PAO 처리가 없는 APP/PS1 마우스의 개방 통로에서 소비된 시간의 퍼센트는 야생형 마우스의 것보다 유의미하게 작고, PAO 처리가 있는 APP/PS1 마우스의 개방 통로에서 소비된 시간의 퍼센트는 야생형 마우스의 것과 유의미하게 차이나지 않는다. 도 3에 도시된 바와 같이, PAO는 APP/PS1 마우스에서 불안증 증상을 예방하거나 완화시킬 수 있다.
APP/PS1 마우스에서 불안증 행동에 대한 약물의 치료 효과와 APP/PS1 마우스에서 학습 및 기억 장애에 대한 약물의 치료 효과 사이의 필요한 상호의존이 존재하는지 여부를 탐색하기 위하여, APP/PS1 마우스에서 불안 및 학습 및 기억 장애에 대한 PAO 및 아리셉트(도네페질 하이드로클로라이드)의 치료 효과를 시험하였다. C57B/6와 교배된 APP/PS1의 새끼인, 4개월 연령의 숫컷 APP/PS1 한배 새끼 마우스 32마리를 2개의 군으로 무작위로 나누고, 하나의 군의 마우스(APP/PS1 PAO 마우스로 지칭함)에 PAO(0.1 mg/체중 kg의 용량으로)를 위관영양법으로 월요일부터 토요일까지 1일 1회 투여하고, 다른 군의 마우스(APP/PS1 아리셉트 마우스로 지칭함)에 아리셉트(1.0 mg/체중 kg의 용량으로)를 위관영양법으로 월요일부터 토요일까지 1일 1회 투여하였다. 추가로, 4개월 연령의 숫컷 한배 새끼인 WT 마우스 16마리 및 APP/PS1 마우스 20마리에게 0.1% 수성 DMSO 용액을 위관영양법으로 투여하였다. 5주 후, MWM 시험을 수행하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 미처리 APP/PS1 마우스가 수중 미로에서 가장 불량하게 수행하고, WT 마우스가 가장 우수하게 수행한다. PAO로 처리된 마우스는 획득 훈련 및 역 획득 훈련 둘 다에서 미처리 APP/PS1 마우스보다 유의미하게 우수하게 수행하고, 이는 PAO가 APP/PS1 마우스의 학습 및 기억 능력을 유의미하게 개선시킨다는 것을 나타낸다. 아리셉트로 처리된 마우스는 획득 훈련에서 미처리 APP/PS1 마우스와 유의미한 차이 없이 수행하지만, 역 획득 훈련에서 PAO로 처리된 마우스만큼 잘 수행하고, 미처리 마우스보다 잘 수행하고, 이는 아리셉트가 APP/PS1 마우스의 학습 및 기억 능력을 유의미하게 개선시키지만, PAO만큼 우수한 처리 효과를 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
MWM 시험 1주 후, 마우스에 NSF 시험을 수행하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 미처리 APP/PS1 마우스는 WT 마우스보다 유의미하게 긴 섭식 잠재기를 갖고, PAO로 처리된 APP/PS1 마우스는 WT 마우스와 유의미한 차이가 없는 섭식 잠재기를 갖고, 이는 PAO가 APP/PS1 마우스의 불안증 수준을 유의미하게 감소시킬 수 잇다는 것을 나타내고; 하지만, 아리셉트로 처리된 APP/PS1 마우스는 미처리 APP/PS1 마우스와 유의미한 차이가 없거나 심지어 더 높은 불안증 수준을 갖고, 이는 아리셉트가 APP/PS1 마우스의 학습 및 기억 능력을 유의미하게 개선시킬 수 있지만, APP/PS1 마우스의 불안증 수준을 감소시킬 수 없다는 것을 나타낸다. 따라서, 학습 및 기억의 개선은 불안증 수준의 감소와 필수적으로 관련이 있지는 않다.
2.7.3 야생형 마우스에서 PI4KIIIα의 하향조절은 우울증 및 불안증 징후을 예방하거나 완화시킬 수 있다
2개월 연령의 WT 마우스 15마리, 및 C57/6B와 교배된 Pi4k-/+의 새끼인 2개월 연령의 Pi4k-/+ 마우스 15마리를 1주 동안 적응을 위하여 행동 실험실로 옮겼다. CUMS 실험을 제2 주에 시작하였다. CUMS의 제3 주부터, WT 마우스는 체중 증가가 중단되거나 심지어 체중이 감소되었고, Pi4k-/+ 마우스는 계속 체중이 증가하였다. CUMS의 제6 주부터, Pi4k-/+ 마우스는 WT 마우스와 유의미하게 차이가 난다(표 7). 설탕물에 대한 선호도에 있어서, CUMS 전 및 CUMS의 처음 2주 동안, 2개의 군의 마우스는 설탕물에 대한 유의미한 선호도를 가졌고, 서로 유의미한 차이는 없었다. CUMS의 제3 주부터, 2개의 군의 마우스는 매주 설탕물에 대한 선호도가 감소하였고, WT 마우스는 Pi4k-/+ 마우스보다 빠르게 설탕물에 대한 선호도가 감소하였고; CUMS의 제7 주에, WT 마우스는 Pi4k-/+ 마우스보다 유의미하게 낮은 설탕물에 대한 선호도를 갖는다(표 8). 실험 결과는 PI4KIIIα 발현의 하향조절이 우울증 증상을 예방하거나 완화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
CUMS 실험 다음 날에, 마우스에게 충분한 물과 음식을 제공하였다. 제2 일에, 고체에 대한 금식, 물 공급, 및 쓰레기 제거를 9:00 am에 시작하였다. 제3 일에, NSF 시험을 수행하였다. 결과는 WT 마우스가 Pi4k-/+ 마우스보다 유의미하게 긴 평균 섭식 잠재기를 갖는다는 것을 나타낸다(WT: 212±45초, Pi4k-/+: 154±27초, T-시험, P<0.05). 실험 결과는 PI4KIIIα 발현의 하향조절이 불안증 증상을 예방하거나 완화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00016
Figure pct00017
2.7.4 PI4KIIIα의 하향조절은 신경변성 질환 모델의 마우스에서 우울증 및 징후 불안증 징후를 예방하거나 완화시킬 수 있다
PI4KIIIα 발현의 하향조절이 다른 질환, 특히 신경계 질환과 연관된 불안증 및 우울증을 예방하거나 완화시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 4개월 연령의 "APP/PS1" 마우스 15마리, 및 C57/6B 유전자 배경의 APP/PS1와 교배된 Pi4k-/+의 새끼인 4개월 연령의 "APP/PS1; Pi4k-/+" 마우스 15마리에 CUMS 실험을 수행하고, 설탕물에 대한 선호도를 매주 2개의 군의 마우스에 대하여 측정하였다. 표 9에 나타낸 바와 같이, APP/PS1; Pi4k-/+ 마우스는 APP/PS1 마우스보다 유의미하게 느리게 설탕물에 대한 선호도가 감소하였고, 이는 PI4KIIIα 발현의 하향조절이 APP/PS1 마우스의 우울증 증상을 예방하거나 완화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00018
유사하게, CUMS 실험 다음 날에, 마우스에게 충분한 물과 음식을 제공하였다. 제2 일에, 고체에 대한 금식, 물 공급, 및 쓰레기 제거를 9:00 am에 시작하였다. 제3 일에, NSF 시험을 수행하였다. 결과는 APP/PS1; Pi4K-/+ 마우스가 APP/PS1 마우스보다 유의미하게 짧은 평균 섭식 잠재기를 갖는다는 것을 나타낸다(APP/PS1: 242초, Pi4k-/+: 183초, T-시험, P<0.05). 실험 결과는 PI4KIIIα 발현의 하향조절이 APP/PS1 마우스에서 불안증 증상을 예방하거나 완화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
2.7.5 Efr3a의 하향조절은 신경변성 질환 모델의 마우스에서 우울증 및 불안증 징후를 예방하거나 완화시킬 수 있다
WT 마우스 15마리, Efr3a-/+ 마우스 4마리, APP/PS1 마우스 14마리, 및 Efr3a-/+와 교배된 APP/PS1의 한배 새끼인 APP/PS1; Efr3a-/+ 마우스 9마리가 존재하였다. 마우스가 8개월 연령이 되었을 때, LDB 시험을 수행하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 8개월 연령의 APP/PS1 마우스는 WT 마우스와 비교하여 유의미하게 증가된, 마우스가 명 상자에서 보행한 칸의 양(보행 거리)을 갖고, 동일한 연령의 APP/PS1; Efr3a-/+ 마우스는 WT 마우스와 유의미한 차이를 갖지 않지만, APP/PS1 마우스와 비교하여 유의미하게 감소된 보행 거리를 갖는다. 이는 APP/PS1 마우스가 WT 마우스보다 유의미하게 높은 불안증 수준을 갖는다는 것을 나타내고, Efr3a 유전자의 하나의 카피의 녹아웃은 APP/PS1 마우스의 불안증 수준을 유의미하게 예방하거나 감소시킬 수 있다.
실시예 3: 마우스에서 불안증 및 우울증에 대한 PAO 및 이의 유도체의 억제 효과
이 실험에서, 명백한 다른 질환 증상 또는 신경 손상이 없는 야생형 마우스에서 불안증 및 우울증에 대한 PI4KIIIa 억제제 PAO 및 이의 유도체의 억제 효과를 시험하였다.
3.1 PAO 유도체는 야생형 마우스에서 우울증 행동을 억제한다
FST에서 ICR 마우스에 대한 PAO 유도체의 효과를 또한 시험하였다. 예를 들면, PAO 유도체는 PAO의 벤젠 고리의 파라 위치에서 -H를 -F로 치환하여 형성된 PI04, PAO의 벤젠 고리의 파라 위치에서 -H를 -CF3으로 치환하여 형성된 PI05, 및 PAO의 벤젠 고리의 파라 위치에서 -H를 -I로 치환하여 형성된 PI06을 포함한다. 이들 3종의 PAO 유도체 각각을 먼저 중쇄 트리글리세라이드-MIGLYOL 812N(IOI Oleo GmbH)과 함께 1.0 mg/g의 농도를 갖는 스톡 용액으로 제제화하였다. 마우스에게 동일한 중쇄 트리글리세라이드에 의해 0.033 mg/mL로 희석된 용액을 3 단계 구배로 위관영양법으로 매일 0.3 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 대조군(비히클)은 오직 중쇄 트리글리세라이드만을 투여하였다.
2개월 연령의 ICR 마우스 80마리를 무작위로 4개의 군으로 나누었다. 강제 수용 실험에서 적응 1주 후, 마우스에 제1 6분 강제 수영을 수행하고, 마지막 4분 내의 부동 시간을 기록하였다. 10초 미만이거나 160초 초과인 부동 시간 데이터를 제외한 후, 비히클(오직 중쇄 트리글리세라이드만 투여된) 마우스 16마리, PI04 마우스 14마리, PI05 마우스 17마리, 및 PI06 마우스 15마리가 남았다. 그 다음, 마우스의 각각의 군에 위관영양법으로 0.3 mg/kg의 용량으로 6일 동안 매일 1회 투여하였다. 제7 일에, 마우스에 제2 6분 강제 수영을 수행하였다. 각각의 마우스에게 동일한 용량으로 강제 수영 60분 전에 투여하였다. 각각의 마우스에 있어서, 마지막 4분 내의 부동 시간을 기록하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 오직 중쇄 트리글리세라이드만 투여된 마우스에서 제1 및 제2 강제 수영 실험 사이의 부동 시간의 유의미한 차이는 없고, PI04, PI05, 및 PI06 군의 마우스는 제2 강제 수영 실험에서의 부동 시간이 제1 강제 수영 실험과 비교하여 유의미하게 감소하였고, 이는 PAO 유도체 PI04, PI05, 및 PI06이 불안증 및 우울증의 행동 수행을 완화시킬 수 있다는 것응 나타낸다.
3.2 PAO는 뉴런 손상에 의해 유발된 불안증 및 우울증을 예방하거나 완화시킬 수 있다
소분자 화합물 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)을 모노아민 산화효소 B(MAO-B)에 의해 탈수소화시켜 MPP+ 이온을 생성한다. 이 이온은 미토콘드리아 복합체 I를 억제하여, 세포독성 및 심지어 세포 사멸을 야기한다. MPP+ 이온은 흑질에서 도파민 뉴런에 의해 다량으로 특이적으로 흡수된다. MPP+는 미토콘드리아 호흡 연쇄의 복합체 I를 차단하여, 도파민 뉴런에서 신경변성 변화를 야기한다.
4개월 연령의 숫컷 C57B6 마우스 50마리를 마우스 10마리를 포함하는 블랭크 군, 뉴런 손상이 있는 마우스 20마리를 포함하는 플라시보(PD-ctrl) 군, 및 뉴런 손상이 있는 마우스 20마리를 포함하는 PAO 처리(PD-PAO) 군으로 무작위로 나누었다. MPTP를 먼저 DMSO 중에 용해시킨 다음, 식염수로 희석하였다. 프로베네시드를 5% 수성 중탄산나트륨 용액 중에 용해시켰다. 먼저, PD-ctrl 군 및 PD-PAO 군에서 각각의 마우스에게 MPTP(공급사: CSN Pharm)를 5일 동안 1일 1회 25 mg/kg 용량으로 복강내 주사하고, 2일은 약물을 중단한 다음, 제1 주와 마찬가지로 5일 동안 주사하였다. 제3 주에, 5일 동안, 각각의 마우스에게 먼저 프로베네시드(250 mg/kg)를 1일 1회 복강내 주사한 다음, MPTP(25 mg/kg)를 1일 1회 주사하였다. 블랭크 군에서, 각각의 마우스에게 처음 3주 동안 오직 상응하는 용매만을 주사하였다. 제4 주에, 7일 동안, 블랭크 군 및 PD-ctrl 군에서 각각의 마우스에게 0.1% DMSO 용액을 위관영양법으로 매일 투여하고, PD-PAO 군에서 각각의 마우스에게 PAO를 0.3 mg/kg(PAO를 0.1% 수성 DMSO 용액 중에 용해시킴)의 용량으로 위관영양법으로 매일 투여하였다.
모든 마우스는 고체에 대한 금식을 겪었지만, 제4 주의 제6일에 물을 공급받았다. 제7일에, 설탕물에 대한 선호도 실험을 수행하였다. 도 8a에 도시된 바와 같이, 블랭크 군에서 마우스는 설탕물에 대한 분명한 선호도를 갖고, PD-ctrl 군에서 마우스는 유의미하게 감소된 설탕물에 대한 선호도를 갖고(일방향 ANOVA, p<0.05), PD-PAO 군에서 마우스는 여전히 설탕물에 대한 선호도를 갖고, 이는 블랭크 군과 유의미한 차이가 없다. 설탕물 선호도 실험 후, 주사 및 위관영양법에 의한 투여를 각각의 군에서 중단하였다. 모든 마우스는 고체에 대한 금식을 겪었지만, 제6 주의 제6일에 물을 공급받았다. 제7일에, 설탕물에 대한 선호도 실험을 수행하였다. 도 8b에 도시된 바와 같이, 3개의 군에서 모든 마우스는 서로 유의미한 차이가 없는 설탕물에 대한 분명한 선호도를 갖는다.
상기 실험 동안, 마우스 12마리가 PD-ctrl 군에서 사망하였고, 마우스 6마리가 PD-PAO 군에서 사망하였고, 블랭크 군에서 사망은 없었다.
3.3 PAO 및 이의 유도체는 야생형 마우스에서 불안증 행동을 억제한다
3개월 연령의 숫컷 ICR 마우스 42마리를 2개의 군으로 무작위로 나누었다. 제1 군의 마우스 22마리에게 12일 동안, 플라시보 군(비히클)과 마찬가지로, 플라시보(0.1% 수성 DMSO 용액)를 위관영양법으로 매일 투여하였다. 다른 제2 군에서 마우스에게 12일 동안, PAO 처리 군과 마찬가지로, PAO를 0.1% 수성 DMSO 용액과 함께 0.3 mg/kg 중량의 용량으로 위관영양법으로 매일 투여하였다. 제12일에, NSF 시험을 수행하였다. NSF 시험 24시간 전에, 모든 마우스는 고체에 대한 금식을 겪지만 물은 공급받았다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 새로운 환경에 들어간 후, 플라시보 군에서 마우스는 섭식 시작까지 평균 201.6±21.5초(n=22)가 필요하고, PAO 처리 군에서 마우스는 겨우 평균 159.6±20.3 s(n=20)만이 필요하고, 이는 플라시보 군(T 시험, p<0.05)보다 유의미하게 짧다. 따라서, PAO는 새로운 환경에서 야생형 마우스에서 불안증 행동을 억제할 수 있다.
또 다른 3개월 연령의 ICR 마우스 47마리를 3개의 군으로 무작위로 나누었다. 7일 동안, 플라시보 군(비히클)과 마찬가지로, 제1 군의 마우스 16마리에게 플라시보(0.1% 수성 DMSO 용액)를 위관영양법으로 매일 투여하였다. 7일 동안, PI05 처리 군과 마찬가지로, 제2 군의 마우스 15마리에게 PI05를 0.1% 수성 DMSO 용액과 함께 0.3 mg/체중 kg의 용량으로 위관영양법으로 매일 투여하였다. 7일 동안, PI06 처리 군과 마찬가지로, 제3 군의 마우스 16마리에게 PI06를 0.1% 수성 DMSO 용액과 함께 0.3 mg/체중 kg의 용량으로 위관영양법으로 매일 투여하였다. 제7일에, NSF 시험을 수행하였다. NSF 시험 24시간 전에, 모든 마우스는 고체에 대한 금식을 겪었지만, 물은 공급받았다. 도 9b에 도시된 바와 같이, 새로운 환경으로 들어간 후, 플라시보 군의 마우스는 섭식을 시작하는데 평균 216.6±21.2초(n=16)가 필요하고, PI05 처리 군 및 PI06 처리 군의 마우스는 각각 평균 194.6±21.7초(n=15) 및 평균 154.2±21.2초(n=16)가 필요하다. PI06 처리 군은 플라시보 군과 비교하여 유의미하게 감소한 섭식 잠재기를 갖고(일방향 ANOVA, p<0.05), PI05 처리 군은 감소된 섭식 잠재기의 경향을 보인다.
따라서, PAO 및 이의 유도체는 새로운 환경에서 야생형 마우스에서 불안증 행동을 억제할 수 있다.
실시예 4: PI4KIIIα 복합체의 발현에 대한 PI4KIIIα, TTC7, Hyccin, 및 RBO의 억제 효과
물질 및 방법
초파리 계통 및 유전학
신생 초파리 성체를 25℃에서 12/12시간 명암 사이클로 표준 초파리 배지에서 배양하였다.
사용된 초파리 계통은 하기를 포함한다: rbo 2/Cyo-GFP(rbo 2는 rbo 유전자의 녹아웃 돌연변이이고, Cyo-GFP는 녹색 형광 단백질(GFP)를 발현하는 평형기 염색체이고, rbo -/+ ), rbo 2 /rbo 2 ;rbo-egfp/rbo-egfp(rbo 2 돌연변이에 대한 동형접합체 및 rbo-egfp 전이유전자에 대한 동형접합체의 돌연변이, 초파리 계통은 요약해서 rbo-gfp로 지칭한다)(rbo-egfp 전이유전자는 완전한 rbo를 함유한 게놈 DNA 단편으로부터 구축된 재조합 DNA이고, 녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는 DNA 서열은 rbo의 종결 코돈의 앞에 삽입되고, 따라서 rbo-egfp 전이유전자는 RBO-GFP 융합 단백질을 발현한다), P[lacW]l(2)k14710 k15603/Cyo-GFP(트랜스포존 P[lacW]의 삽입에 의해 형성된 ttc7 유전자 돌연변이로, ttc7 -/+ 로도 지칭된다), 104577/Cyo-GFP(104577은 hyccin 유전자 및 이의 주변 DNA 분절의 결실로부터 야기된 염색체 돌연변이이고, hyccin -/+ 로 지칭된다), pi4k GS27/+ , pi4k FY24/+ , pi4k FQ88/+ , 및 pi4k GJ86/+ (PI4KIIIα 단백질을 인코딩하는 유전자의 넌센스 돌연변이에 대한 4개의 이형접합체로, 모두 평형기 염색체 FM7 및 GFP를 발현하는 Gr-GFP를 갖고, 미국 프린스턴 대학의 스쳅바치 실험실에 의해 구축된다).
웨스턴 블롯팅 및 상호 면역침강 실험
각각의 유전형의 초파리 머리 500개(상호 면역침강을 위한) 및 100개(웨스턴 블롯팅을 위한)를 수집하고, 균일하게 처리하였다. 초파리 머리를 얼음 위에 놓고, 1% NP40 및 프로테아제 억제제를 함유한 미리 식힌 트리스 버퍼로 용해시킨 다음, 균질화하였다. 상호 면역침강 실험은 피어스(Pierce)® 상호 면역침강(Co-IP) 키트(Thermo Scientific)의 설명서에 따라 수행하였다. 상호 면역침강 실험으로부터의 생성물을 SDS-PAGE 겔을 사용하여 분리하고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 사용된 1차 항체는 하기를 포함한다: 항-GFP(Casico), 항-RBO 및 PI4KIIIα(Zhang et al., J Neurosci., 2017, pp. 4928-4941), 항-Hyccin(항원으로서 FAM126 단편 RLPPIKNPRQ를 사용하여 아브마트(Abmart(Shanghai))에 의해 생성됨), 항-뉴로글린(DSHB, 클론 BP104), 항-β-액틴, 및 항-튜블린(Cell Signaling).
조직 용해물로부터의 PM 단편의 단리
초파리 뇌 조직을 얼음 위에 놓고, 미리 식힌 1% NP40 및 프로테아제 억제제를 함유한 미리 식힌 트리스 버퍼로 처리하였다. 그 다음, 용해물을 수집하고, 15000 g으로 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상청액을 새로운 EP 튜브로 옮기고, 침전물을 상기와 동일한 트리스 버퍼에 재현탁시켰다. 상청액 및 재현탁된 침전물 둘 다에 SDS-PAGE 겔에 의한 단리 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
통계적 분석
데이터 분석은 소프트웨어 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 수행하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내고, p<0.05(*p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001)에서 통계적으로 유의미하다.
결과
PI4KIIIα, TTC7, Hyccin, 및 RBO는 세포막과 상호작용하여 단백질 복합체-PI4KIIIα 복합체를 형성하고, 이는 PI4KIIIα 복합체의 모든 필수적인 부분이다
SDS-PAGE 겔 전기영동에서 쿠마시 브릴리언트 블루 염색(도 10a)으로부터, 항-GFP 항체는 RBO-GFP 융합 단백질(rbo-gfp)을 발현하는 초파리 머리의 균질액으로부터의 상호 면역침강물 PI4KIIIα, TTC7, Hyccin, 및 RBO-GFP 단백질일 수 있지만, RBO-GFP 융합 단백질을 발현하지 않는 초파리 머리의 균질액으로부터는 아니라는 것을 볼 수 있다. PI4KIIIα, TTC7, 및 Hyccin 단백질은 단백질 질량 분석에 의해 RBO-GFP 융합 단백질과 상호 면역침강된 단백질로부터 식별될 수 있다(표 10). 이와 일치하게, 항-RBO 항체가 야생형 초파리 머리의 균질액으로부터의 상호 면역침강물 PI4KIIIα, TTC7, Hyccin, 및 RBO 단백질일 수 있다는 것이 단백질 질량 분석에 의해 분석될 수 있고(표 11); SDS-PAGE 겔 전기영동에서 웨스턴 블롯팅으로부터 PI4KIIIα, Hyccin, 및 RBO 단백질이 서로 상호 면역침강된다는 것이 확인될 수 있다(도 10b).
SDS-PAGE 겔 전기영동에서 웨스턴 블롯팅(도 10c)로부터, RBO 단백질이 오직 세포막에서만 발현되고, Hyccin 단백질은 세포막 및 세포질 둘 다에서 발현되지만, 주로 세포질에 위치하고; hyccin, rbo, 또는 ttc7 유전자의 녹아웃은 RBO의 결실을 야기하고; rbo 또는 ttc7 유전자의 녹아웃은 또한 세포막에서 Hyccin 단백질의 결실 또는 유의미한 감소를 야기하지만, 세포질에서 Hyccin 단백질의 발현 수준을 유의미하게 변화시키지는 않는다는 것을 볼 수 있다. 이는 세포막 상의 PI4KIIIα, TTC7, Hyccin, 및 RBO 단백질이 발현과 상호의존적이고, PI4KIIIα 복합체의 모든 필수적인 부분이라는 것을 나타낸다. 그러나, 세포질에서 Hyccin 발현은 TTC7 및 RBO와 독립적이다.
SDS-PAGE 겔 전기영동에서 웨스턴 블롯팅(도 10d)로부터, hyccin의 하나의 카피의 녹아웃은 Hyccin의 총 발현 수준을 유의미하게 감소시킬 수 있지만, rbo의 하나의 카피의 녹아웃은 Hyccin의 총 발현 수준을 변화시키지 않는다는 것을 볼 수 있다.
SDS-PAGE 겔 전기영동에서 웨스턴 블롯팅(도 10e)로부터, PI4KIIIα의 하나의 카피의 녹아웃은 또한 RBO의 발현 수준을 유의미하게 감소시킬 수 있고, 이는 PI4KIIIα 복합체의 구성원들의 상호의존성을 추가로 나타낸다.
Figure pct00019
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU NUO-BETA PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO., LTD. <120> METHOD FOR TREATING MOOD DISORDERS <130> 074207-8002WO02 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 tgctcattag cagtaaaga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 gtaccaccat gtacccaggc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 aacgcagctc agtaacagtcc 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 cctagcctag cacctgaagc 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 cgtgtgcatc aacggtcca 19

Claims (31)

  1. 기분 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 그러한 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 소분자 화합물, 항체, RNAi 분자, 또는 안티센스 핵산인 방법.
  3. 제1항에 있어서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 EFR3-특이적 억제제인 방법.
  4. 제3항에 있어서, EFR3-특이적 억제제는 EFR3a-특이적 억제제 또는 EFR3b-특이적 억제제인 방법.
  5. 제1항에 있어서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 PI4KIIIα-특이적 억제제인 방법.
  6. 제5항에 있어서, PI4KIIIα-특이적 억제제는 소분자 화합물인 방법.
  7. 제2항 또는 제6항에 있어서, 소분자 화합물은 하기 화학식 (I) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 구조를 갖는 것인 방법.
    Figure pct00021

    화학식 (I)
    상기 식에서,
    R1은 독립적으로 (a) H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 알킬렌-NH2, C1-6 알킬렌-NH-C(O)H, -As(O), -N=NH, -NH-(C1-6 알킬), N,N-(C1-6 알킬)2, -NH-C(O)H, -NH-S(O)2H, -C(O)OH, -OC(O)H, -SH, -S(O)2H, -S(O)2-NH, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되고, 이는 임의로 R2 또는 R3으로 치환되고, 여기서 R2 및 R3은 각각 독립적으로 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -NH-(C1-6 알킬), -NH-(6 내지 12원 아릴), -N,N-(C1-6 알킬)2, C3-6 사이클로알킬, 6 내지 12원 아릴, 또는 3 내지 12원 헤테로사이클릴로부터 선택되고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, -NH-C(O)-R5, -C(O)OR4, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환되고, R4는 C1-6 알킬이고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환되고, R5는 H, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, 또는 C1-6 할로알킬로부터 선택되고, 또는
    (b) 2개의 인접한 탄소 원자 상의 R1은 5 내지 12원 사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클릴을 형성하고, 이는 임의로 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, 6 내지 12원 아릴, C1-6 알킬, C2-6 알키닐, C2-6 알케닐, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 3 내지 6원 헤테로사이클릴, C3-6 사이클로알킬, 또는 Bn-O- 중 하나 이상으로 치환되고,
    n은 0 내지 5의 정수이다.
  8. 제7항에 있어서, R1은 각각 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, 카바모일, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, -As(O), -NH-(C1-6 알킬), -N,N-(C1-6 알킬)2, 또는 -C(O)OR6로부터 선택되고, n은 0 내지 2의 정수이고, R6은 C1-6 알킬인 방법.
  9. 제7항에 있어서, R1은 각각 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 니트로, 시아노, 하이드록실, 아미노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, 또는 -As(O)로부터 선택되고, n은 0 내지 2의 정수인 방법.
  10. 제7항에 있어서, R1은 각각 독립적으로 H, 중수소, 할로겐, 아미노, C1-6 알콕시, 또는 C1-6 할로알킬로부터 선택되고, n은 1인 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 -As(O) 기의 오르토 위치 및/또는 파라 위치에 위치하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, n은 0인 방법.
  13. 제6항에 있어서, 소분자 화합물은 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    Figure pct00022

    Figure pct00023

    Figure pct00024
  14. 제2항에 있어서, 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체인 방법.
  15. 제2항 또는 제14항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체인 방법.
  16. 제2항에 있어서, RNAi 분자는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 또는 마이크로RNA(miRNA)인 방법.
  17. 제2항 또는 제16항에 있어서, RNAi 분자는 18 내지 100개의 염기 길이를 갖는 것인 방법.
  18. 제2항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 분자는 이의 안정성을 향상시키기 위하여 변형되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 대상체는 인간 또는 포유동물인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 기분 장애는 고조된 기분, 저하된 기분, 또는 고조된 기분과 저하된 기분의 순환인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 기분 장애는 불안증, 우울증, 정신분열증, 또는 조증인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 기분 장애는 신경변성 질환, 뇌졸중, 또는 악성 종양에 의해 유발되는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 기분 장애는 신경변성 질환에 의해 유발된 불안증 또는 우울증인 방법.
  24. 제1항에 있어서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 경구, 피하, 근육내, 또는 정맥내 투여되는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 대상체에게 투여하기 전에 대상체를 기분 장애를 갖는 것으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 제2 시약을 이것이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 제2 시약은 기분 장애를 치료하는 데 사용되는 시약인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 제2 시약은 신경변성 질환, 뇌졸중, 또는 악성 종양을 치료하는 데 사용되는 시약인 방법.
  29. 제26항에 있어서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제는 제2 시약 전에, 후에, 또는 동시에 투여되는 것인 방법.
  30. 기분 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서의 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 용도.
  31. 기분 장애의 예방 또는 치료에서의 PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 용도로서, PI4KIIIα/FAM126/TTC7 복합체 억제제의 유효량을 그러한 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 용도.
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