KR20220121836A - 올리고-/ 및/또는 다당류로부터 과당의 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 a) 물, 포스페이트 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하는 조성물에 적어도 4개의 효소를 첨가하는 단계, 및 b) 후속적으로 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 적어도 4개의 효소의 존재 하에 과당으로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하는 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법에 관한 것이며, 단계 a)에서 적어도 하나의 추가적인 당류가 첨가되고, 적어도 하나의 추가적인 당류는 20개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합을 포함하는 당류로 이루어지는 군으로부터 선택되며; 단계 a)에서 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소는 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소, 가수분해효소, 포스파타제 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 단계 a)에서 적어도 하나의 효소는 포스파타제이다.

Description

올리고-/ 및/또는 다당류로부터 과당의 제조
본 발명은 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법, 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물, 및 과당을 포함하는 수성 조성물에 관한 것이다. 더불어, 본 발명은 포스파타제 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류의 전환에서의 포스파타제의 용도에 관한 것이다.
현재 D-과당의 산업적 제조 공정은 특히 2-단계 공정을 기반으로 한다. 제1 단계에서, 다당류 또는 올리고당류, 예를 들어 전분은 가수분해에 의해 단당류로 절단된다. 제2 단계에서, 이성질화가 수행되어 D-과당이 약 42%의 수율(백분율에 상응함)로 얻어진다. 순수한 D-과당의 제조를 위한 후속 작업이 값비싼 크로마토그래피 정제 기법에 의해 수행된다.
대체 산업 공정은 효소 전화효소를 사용한 수크로스의 가수분해이다. 그로 인해 D-글루코스와 D-과당의 등몰량 혼합물이 얻어진다. D-과당을 풍부하게 하기 위해서 이것은 다시 값비싼 크로마토그래피 절차에 의해 세정되어야 한다.
산업 공정은 상당한 단점을 가지는데, D-과당의 용액만이 형성되고 D-과당이 용액에 존재하는 당류의 최대 50%를 구성하기 때문이다. 더 높은 D-과당 용액을 얻기 위해서는, 값비싼 크로마토그래피 정제가 실시되거나 55%의 과당 함량을 가지는 고 과당 옥수수 시럽(HFCS55)과 같은 값비싼 순수한 D-과당이 첨가되어야 한다.
기질로서 D-글루코스를 사용하는 순수한 D-과당의 생산을 위한 대체 공정이 알려져 있고 EP0028136B1 및 AT513928B1에서 상세하게 기재된다. 이 경우, D-글루코스는 피라노스-2-산화효소로 D-글루코손으로 산화된 후 D-과당으로 환원된다. 환원은 화학적 수단, 즉 균일 또는 불균일 촉매에 의해, 또는 생체촉매를 사용함으로써 수행될 수 있다.
이 공정은 아직 기술적으로는 실현되지 않았다. 그것은 산화 및 환원이 서로 별도로 작동되어야 하고 그래서 추가적인 공정 단계가 필요하다는 단점이 있다. 더불어, 환원이 화학적으로 일어나는 경우에 고순도의 기질이 필요하며 온도뿐만 아니라 고압이 필요하며, 그것은 바람직하지 못한 부산물의 형성으로 이어질 수 있다. 환원이 효소적으로 수행되는 경우에, 환원제 및 사용되는 불안정한 조효소, 예컨대 NADH에 대해 매우 높은 비용이 발생한다.
D-과당의 제조를 위한 공지된 공정은 다양한 단점을 가진다. 기질의 효율적인 전환을 위해 부분적으로 고압 및 온도가 필요하다. 대안으로, 기질에 따라 최대 50%의 수율만이 달성되거나 부산물을 감소시키기 위해 깨끗한 기질의 사용이 필요하다. 추가의 농축은 크로마토그래피 장비의 재사용을 보장하기 위해 매우 깨끗한 공정 스트림을 필요로 한다.
값비싼 조효소의 사용 또는 추가의 크로마토그래피 정제 및 농축 단계를 필요로 하는 불리한 평형과 같은 상기 단점들을 극복하는, 올리고- 및/또는 다당류를 D-과당으로 전환하는 방법이 필요하다.
본 발명의 목적은 기질과 관련하여 고수율로 및 부산물이 없거나 더 적게 D-과당 제조를 허용하는 방법을 제공하는 것이다. 그 외에도, 작업은 단순화되어야 하고 유기 조효소의 사용은 필요하지 않아야 한다.
상기 목적은 청구항 제1항에 따르는 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법, 청구항 제8항에 따르는 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물, 및 청구항 제10항에 따르는 과당을 포함하는 수성 조성물에 의해 해결된다. 더불어, 목적은 청구항 제13항에 따르는 포스파타제 및 청구항 제15항에 따르는 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류의 전환에서의 포스파타제의 용도에 의해 해결된다.
제1 측면으로 본 발명은
a) 물, 포스페이트 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하는 조성물에 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소를 첨가하는 단계, 및
b) 후속적으로 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소의 존재 하에 과당으로 효소적으로 전환시키는 단계
를 포함하는, 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법에 관한 것이며,
여기서 단계 a)에서 적어도 하나의 추가적인 당류가 첨가되고, 적어도 하나의 추가적인 당류는 20개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합, 바람직하게는 17개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합을 포함하는 당류로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
단계 a)에서 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소는 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소, 가수분해효소, 포스파타제 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 단계 a)에서 적어도 하나의 효소는 포스파타제이다.
추가로 바람직한 구현예는 설명에서뿐만 아니라 종속 청구항에서 기술된다.
본 발명의 맥락에서 과당에 대한 언급은 D-과당에 대한 언급으로서 이해되어야 한다.
발명에 따르는 올리고당류는 적어도 2개의 단당류 잔기를 포함하는 당류이며 여기서 이들 단당류 잔기는 동일하거나 상이할 수 있다.
포스파타제 하에 분류 EC 3.1.3.에 속하는 모든 효소가 있는 것으로 이해되어야 한다. 트랜스퍼라제 하에 분류 EC 2.4.에 속하는 모든 효소가 있는 것으로 이해되어야 한다. 포스포릴라제 하에 분류 EC 2.4.1.에 속하는 모든 효소가 있는 것으로 이해되어야 한다. 뮤타제 하에 분류 EC 5.4.2.에 속하는 모든 효소가 있는 것으로 이해되어야 한다. 이성질화효소 하에 분류 EC 5.3.1.에 속하는 모든 효소가 있는 것으로 이해되어야 한다. 가수분해효소 하에 분류 EC 3.2.에 속하는 모든 효소가 있는 것으로 이해되어야 한다.
발명에 따르는 기질로서 올리고- 및 다당류가 사용될 수 있다. 개선된 수율은 당류 및 이미 당류에 존재할 가능성이 있는 과당 단위의 절단에 의해 제조될 수 있는 당 포스페이트로 인한 것이다.
놀랍게도, 고압 및 온도 없이 작동되고 공정 중 오염물의 존재를 더 잘 견디는 D-과당의 제조 방법이 발견되었다. 촉매의 선택은 중간체 당-포스페이트를 형성함으로써 공정에서 고수율의 D-과당을 얻는 것을 가능하게 한다. 그 결과로서, 현재 사용되는 산업 제조 방법에서보다 기질(당류)을 토대로 더 높은 비율이 달성될 수 있고 후속 작업이 불필요하다. 이것은 값비싼 세정 절차를 제거한다. 당류는 올리고- 및/또는 다당류일 수 있다.
바람직하게는 단계 a)의 조성물은 건조 중량 기준으로 35% 이하의 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함한다. 바람직하게는 조성물은 건조 중량 기준으로 0.5% 내지 35%의 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함한다.
추가로 바람직하게는 올리고- 및/또는 다당류는 글루코스 기반 올리고- 및/또는 다당류로부터, 바람직하게는 전분 및 그것의 유도체, 헤미셀룰로스 및 그것의 유도체, 셀룰로스 및 그것의 유도체 및/또는 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
각각의 올리고- 및/또는 다당류는 전분 제조를 통해 또는 바이오매스(biomass)의 가수분해에 의해, 예를 들어 펄프 제조에서 또는 밀짚의 가공에서 얻어질 수 있다.
바람직하게는 단계 a)에서 적어도 하나의 추가적인 당류는 십사당류, 십삼당류, 십이당류, 십일당류, 십당류, 구당류, 팔당류, 칠당류, 육당류, 오당류, 사당류, 삼당류, 이당류 및/또는 이것들의 조합, 보다 바람직하게는 사당류, 삼당류, 이당류 및/또는 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 보다 더 바람직하게는 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스 및 이것들의 조합으로부터 선택된다.
추가로 바람직하게는 단계 a)에서 적어도 하나의 추가적인 당류는 말토덱스트린이다. 말토덱스트린은 가변 길이의 사슬에서 연결된, 주로 α-1,4-글리코시드 결합으로 결합된 D-글루코스 단위로 이루어지는 당류이다. 전형적으로, 말토덱스트린은 3 내지 17개 글루코스 단위 길이로 다양한 사슬들의 혼합물로 구성된다. 말토덱스트린은 DE(덱스트로스 동등물)에 의해 분류되고 3 내지 20의 DE를 가진다. DE 값이 높을수록 글루코스 사슬은 더 짧다.
추가로 바람직하게는 적어도 하나의 추가적인 당류는 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류와 적어도 부분적으로 동일한 글리코시드 결합을 가진다.
바람직하게는 포스파타제는 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 98.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서 포스파타제는 서열번호: 41에 따르는 서열과 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 98.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 서열을 가지는 포스파타제 군으로부터 선택된다.
나아가, 단계 a)에서 바람직하게는 적어도 6개의 효소가 조성물에 첨가된다.
바람직하게는 적어도 4개의 효소, 보다 바람직하게는 5개의 효소 및 보다 더 바람직하게는 6개의 효소는 포스파타제, 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소 및/또는 가수분해효소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 단계 a)에서 적어도 하나의 트랜스퍼라제, 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 글루카노트랜스퍼라제, 보다 더 바람직하게는 알파-글루카노트랜스퍼라제가 첨가되고/거나;
바람직하게는 단계 a)에서 적어도 하나의 포스포릴라제, 바람직하게는 글루칸포스포릴라제가 첨가되고/거나;
바람직하게는 단계 a)에서 적어도 하나의 뮤타제, 바람직하게는 포스포글루코뮤타제가 첨가되고/거나;
바람직하게는 단계 a)에서 적어도 하나의 이성질화효소, 바람직하게는 포스포글루코이성질화효소가 첨가되고/거나;
바람직하게는 단계 a)에서 적어도 하나의 가수분해효소, 바람직하게는 글루카노가수분해효소, 보다 바람직하게는 풀루라나제(pullulanase)가 첨가된다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류의 과당으로의 전환 방법의 바람직한 구현예에 따르면 단계 a)에서 적어도 하나의 추가적인 당류는 사당류, 삼당류, 이당류, 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스 및 이것들의 조합으로부터 선택되고/거나; 조성물은 단계 a)에서 건조 중량 기준으로 35% 이하의 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하며, 바람직하게는 조성물은 건조 중량 기준으로 0.5% 내지 35%의 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하고/거나; 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류는 글루코스 기반 올리고- 및/또는 다당류로부터, 바람직하게는 전분 및 그것의 유도체, 헤미셀룰로스 및 그것의 유도체, 셀룰로스 및 그것의 유도체 및/또는 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고/거나; 단계 a)에서 적어도 6개의 효소가 조성물에 첨가되고/거나; 적어도 하나의 추가적인 당류는 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류와 적어도 부분적으로 동일한 글리코시드 결합을 가진다.
바람직하게는 단계 b)에서 당 포스페이트는 중간에 생성된다.
추가로 바람직하게는 단계 b)에서 효소적 전환은 원 포트 반응(one-pot reaction)이다.
바람직한 구현예에 따르면 단계 b)에서 당 포스페이트는 중간에 생성되며 효소적 전환은 원 포트 반응이다.
발명의 방법은 여러 촉매적 단계에 의해 올리고- 및 다당류의 D-과당으로의 전환을 허용한다. 이것은 당 포스페이트의 형태의 중간체를 초래하고, 그것은 결국 D-과당 및 포스페이트로 절단된다.
바람직하게는 단계 a)에서 첨가된 올리고- 및/또는 다당류는 복수의 글루코스 단위, 보다 바람직하게는 D-글루코스 단위를 포함한다. 보다 더 바람직하게는 단계 a)에서 첨가된 올리고- 및/또는 다당류는 복수의 글루코스 단위, 보다 바람직하게는 D-글루코스 단위로 이루어진다.
한 구현예에 따르는 발명의 방법은 효소적 공정이고 D-글루코스-1-포스페이트의 형태로 개별 D-글루코스 분자의 절단을 가능하게 하는 반응 순서가 적용된다. 후속적으로, 이들 방출된 D-글루코스-1-포스페이트 분자는 추가의 당-포스페이트 중간체를 통해 D-과당-6-포스페이트로 전환된다. D-과당-6-포스페이트 후속적으로 분열되고, D-과당 및 포스페이트가 얻어진다.
이 전환 중에 반응 단계는 다음 단계를 포함한다: 당 분자는 효소적으로 D-글루코스-1-포스페이트를 절단하고, D-글루코스-1-포스페이트는 효소적으로 D-글루코스-6-포스페이트로 전환되며, D-글루코스-6-포스페이트는 효소적으로 D-과당-6-포스페이트로 전환되고, D-과당-6-포스페이트는 효소적으로 D-과당 및 포스페이트로 절단된다.
포스페이트는 예를 들어 D-글루코스-1-포스페이트, D-글루코스-6-포스페이트, D-과당-6-포스페이트와 같은 당 포스페이트를 중간에 형성하기 위하여 적은 촉매량으로만 사용된다. 초기 단계에서 포스페이트는 혼합물을 함유하고 있는 D-글루코스 단위에 첨가되고 최종 단계에서 포스페이트는 절단되어 초기 단계를 위해 다시 이용할 수 있게 만들어진다.
본 발명의 이런 방법은 기술분야에 알려져 있는 것과 같은 D-과당의 제조에 대한 효소적 대체물을 제공하며 잔류 중간체를 분리 및 정제할 필요성을 크게 단순화시킨다. 그러므로, 본 발명은 당류로부터 D-과당의 제조에서 현재 사용되는 기법보다 상당한 개선점을 나타낸다. 기존 방법과 대조적으로, 사용된 생체촉매 시스템은 생성물 D-과당의 향상된 풍부화를 달성한다.
방법은 기본적으로 올리고- 및 다당류의 사용에 적합하다.
바람직하게는 셀로비오스, 말토스 또는 전분으로부터, D-과당이 풍부한 가수분해물이 생성될 수 있다. 이런 경우, 초기 단계는 셀로비오스 포스포릴라제, 말토스 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제를 사용하고 이어서 여러 촉매적 단계를 사용하여 수행된다. 방법은 특히 기질로서 수크로스의 사용에 유용한데, 그것은 사탕무 또는 케인(cane)으로부터 얻어질 수 있다. 이 경우, 초기 단계는 수크로스 포스포릴라제를 사용하여 수행된다. 이 특별한 경우에, 수크로스의 몰당 > 53%(질량 기준)의 수율을 가지는 D-과당 또는 > 1 몰 D-과당이 얻어진다.
본 발명의 방법은 다양한 용매 시스템으로 수행될 수 있다. 바람직하게는 그것은 수성 용매 시스템으로 수행된다.
또한 수성 시스템을 완충 시스템으로 보충하는 것이 가능하다. 적합한 완충제(시스템)는 알려져 있고, 종래의 완충제(시스템), 예를 들어, 아세테이트, 칼륨 포스페이트, Tris-HCl, 글리실글리신 및 글리신 완충제, 또는 이것들의 혼합물을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용된 완충제는 3 내지 12, 바람직하게는 4 내지 12, 보다 바람직하게는 4 내지 11의 pH를 가진다. 첨가될 생체촉매 이온, 예컨대 Mg2+의 최적 활성을 위해, 안정화제, 글리세롤 등의 사용이 생체촉매의 더 긴 사용을 허용할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 포스페이트가 필요하다. 공정에 충분한 양의 포스페이트를 보장하기 위해서, 인산, 인산 염, 폴리포스테이트 또는 이것들의 조합의 형태의 외부 첨가가 필요하다.
바람직하게는 발명의 방법은 적합한 온도에서 수행되며, 예컨대 사용된 효소에 따라 달라질 수 있다. 적합한 온도로는 10 내지 100℃, 바람직하게는 10 내지 90℃, 보다 바람직하게는 20 내지 90℃, 보다 더 바람직하게는 20 내지 80℃를 들 수 있다.
바람직하게는 단계 b)의 온도는 10 내지 100℃, 보다 바람직하게는 20 내지 90℃ 및 보다 더 바람직하게는 20 내지 80℃이다.
추가로 바람직하게는 조성물의 pH는 3 내지 12 및 보다 바람직하게는 4 내지 10이다.
발명의 방법의 장점은 모든 촉매 단계를 중간체를 분리할 필요 없이 동일한 반응 배치에서 수행한다는 것이다. 방법은 배치식으로 또는 연속식으로 작동될 수 있다. 이 경우에, 포함된 모든 효소는 동시에 첨가되거나 또는 효소의 일부만이 첨가되고, 예컨대 효소(들)가 단계 b) 중에 첨가될 수 있고, 일시적으로 또는 국소적으로 지연된 후, 또 다른 부분의 효소가 나중에 첨가될 수 있다.
제2 파트의 효소가 첨가되기 전에, 이미 반응 혼합물에 존재하는 효소는, 예를 들어, 물리적으로(여과 또는 고정화를 통해) 제거되거나 비활성화될 수 있다. 후자는 온도의 단기, 예를 들어, 10분 동안 80℃로의 증가에 의해 실시될 수 있다. 대안으로, 반응 용액은 또한 증가된 전환율 및 수율을 위해 여러번 반응 혼합물을 통과할 수 있다.
발명의 방법에서 당류의 D-글루코스-1-포스페이트로의 절단은 효소적, 즉 효소 촉매에 의한 것이고, 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 절단은 바람직하게는 포스포릴라제를 사용한 촉매작용에 의해 수행된다.
바람직하게는 단계 a)의 조성물에 존재하는 당류의 적어도 50%가 24시간의 효소적 전환 후 과당으로 전환된다.
또한 바람직하게는 단계 a)의 조성물에 존재하는 당류의 적어도 70%가 48시간의 효소적 전환 후 과당으로 전환된다.
발명의 방법은 추가로 팽창된 전분과 같은 고농축 올리고- 및/또는 다당류의 개선된 취급을 허용한다. 예를 들어 35% 건조 물질의 전분의 출발 농도로 발명의 방법을 실행하는 것이 가능하다.
바람직하게는 단계 b)는 실온(25℃)에서 적어도 24시간 동안 수행된다.
또 다른 측면으로 본 발명은 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환하는 방법에 관한 것이며 방법은: a) 물, 포스페이트 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하는 조성물에 적어도 하나의 효소를 첨가하는 단계, 및 b) 후속적으로 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 적어도 하나의 효소의 존재 하에 과당으로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하며, 단계 a)에서 적어도 하나의 추가적인 당류가 첨가되고, 적어도 하나의 추가적인 당류는 20개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합, 바람직하게는 17개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합을 포함하는 당류로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류와 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 본 방법에 적용된다.
바람직하게는 단계 a)의 적어도 하나의 효소는 포스파타제이다.
나아가, 단계 a)에서 바람직하게는 적어도 4개의 효소, 보다 바람직하게는 적어도 5개의 효소, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 6개의 효소가 조성물에 첨가된다.
제2 측면으로 발명은 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물에 관한 것으로, 조성물은
- 물;
- 포스페이트;
- 적어도 하나의 효소가 포스파타제인 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소;
- 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하며;
적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소는 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소, 가수분해효소, 포스파타제 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 그리고
조성물은 추가로 적어도 하나의 추가적인 당류를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 당류는 20개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합, 바람직하게는 17개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합을 포함하는 당류로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류와 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물에 적용된다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 98.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 41에 따르는 서열과 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 98.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가지는 포스파타제의 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 적어도 4개의 효소, 보다 바람직하게는 5개의 효소 및 보다 더 바람직하게는 6개의 효소는 포스파타제, 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소 및/또는 가수분해효소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면 조성물은 트랜스퍼라제, 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 글루카노트랜스퍼라제, 보다 더 바람직하게는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 포함하고/거나;
조성물은 추가로 포스포릴라제를 포함하며, 바람직하게는 글루칸포스포릴라제가 첨가되고/거나;
조성물은 뮤타제, 바람직하게는 포스포글루코뮤타제를 포함하고/거나;
조성물은 이성질화효소, 바람직하게는 포스포글루코이성질화효소를 포함하고/거나;
조성물은 가수분해효소, 바람직하게는 글루카노가수분해효소, 보다 바람직하게는 풀루라나제를 포함한다.
또 다른 측면으로 발명은 물; 포스페이트; 적어도 하나의 효소가 포스파타제인 적어도 5개의 효소; 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하는, 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물에 관한 것이며; 여기서 포스파타제는 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 98.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물과 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 이 측면에 적용된다.
바람직하게는 적어도 5개의 효소는 포스파타제, 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소 및/또는 가수분해효소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
제3 측면으로 발명은
- 건조 중량 기준으로 적어도 50%의 과당;
- 건조 중량 기준으로 0.001 내지 25%의 글루코스, 바람직하게는 0.005 내지 20%의 글루코스;
- 건조 중량 기준으로 0.01 내지 22%의 포스페이트, 바람직하게는 0.05 내지 20%의 포스페이트; 및
- 건조 중량 기준으로 0.001 내지 2%의 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소, 바람직하게는 0.005 내지 1%의 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이며,
여기서 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소는 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소, 가수분해효소, 포스파타제 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 그리고
적어도 하나의 효소는 포스파타제이다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류와 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 수성 조성물에 적용된다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 98.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 41에 따르는 서열과 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 98.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가지는 포스파타제의 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 적어도 4개의 효소, 보다 바람직하게는 5개의 효소 및 보다 더 바람직하게는 6개의 효소는 포스파타제, 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소 및/또는 가수분해효소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면 조성물은 트랜스퍼라제, 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 글루카노트랜스퍼라제, 보다 더 바람직하게는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 포함하고/거나;
조성물은 추가로 포스포릴라제를 포함하며, 바람직하게는 글루칸포스포릴라제가 첨가되고/거나;
조성물은 뮤타제, 바람직하게는 포스포글루코뮤타제를 포함하고/거나;
조성물은 이성질화효소, 바람직하게는 포스포글루코이성질화효소를 포함하고/거나;
조성물은 가수분해효소, 바람직하게는 글루카노가수분해효소, 보다 바람직하게는 풀루라나제를 포함한다.
제4 측면으로 발명은
- 건조 중량 기준으로 적어도 50% 과당;
- 건조 중량 기준으로 0.001 내지 25%의 글루코스, 바람직하게는 0.005 내지 20%의 글루코스;
- 건조 중량 기준으로 0.01 내지 22%의 포스페이트, 바람직하게는 0.05 내지 20%의 포스페이트; 및
- 건조 중량 기준으로 0.001 내지 2%의 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소, 바람직하게는 0.005 내지 1%의 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이며,
여기서 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소는 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소, 가수분해효소, 포스파타제 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 그리고
적어도 하나의 효소는 포스파타제이며,
조성물은 상기 기술된 발명의 방법에 의해 얻을 수 있다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류와 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 수성 조성물에 적용된다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 98.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 41에 따르는 서열과 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 98.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가지는 포스파타제의 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 적어도 4개의 효소, 보다 바람직하게는 5개의 효소 및 보다 더 바람직하게는 6개의 효소는 포스파타제, 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소 및/또는 가수분해효소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면 조성물은 트랜스퍼라제, 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 글루카노트랜스퍼라제, 보다 더 바람직하게는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 포함하고/거나;
조성물은 추가로 포스포릴라제를 포함하며, 바람직하게는 글루칸포스포릴라제가 첨가되고/거나;
조성물은 뮤타제, 바람직하게는 포스포글루코뮤타제를 포함하고/거나;
조성물은 이성질화효소, 바람직하게는 포스포글루코이성질화효소를 포함하고/거나;
조성물은 가수분해효소, 바람직하게는 글루카노가수분해효소, 보다 바람직하게는 풀루라나제를 포함한다.
또 다른 측면으로 발명은 건조 중량 기준으로 적어도 50%의 과당; 건조 중량 기준으로 25% 미만의 글루코스, 바람직하게는 20% 미만의 글루코스; 건조 중량 기준으로 22% 미만의 포스페이트, 바람직하게는 20% 미만의 포스페이트; 및 건조 중량 기준으로 2% 미만의 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 1% 미만의 적어도 4개의 효소를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이며, 여기서 하나의 효소는 포스파타제이다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류와 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 수성 조성물에 적용된다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 98.5% 동일한 아미노산을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가지는 포스파타제의 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면 조성물은 트랜스퍼라제, 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 글루카노트랜스퍼라제, 보다 더 바람직하게는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 포함하고/거나; 조성물은 추가로 포스포릴라제를 포함하며, 바람직하게는 글루칸포스포릴라제가 첨가되고/거나; 조성물은 뮤타제, 바람직하게는 포스포글루코뮤타제를 포함하고/거나; 조성물은 이성질화효소, 바람직하게는 포스포글루코이성질화효소를 포함하고/거나; 조성물은 가수분해효소, 바람직하게는 글루카노가수분해효소, 보다 바람직하게는 풀루라나제를 포함한다.
또 다른 측면으로 발명은 건조 중량 기준으로 적어도 50%의 과당; 건조 중량 기준으로 25% 미만의 글루코스, 바람직하게는 20% 미만의 글루코스; 건조 중량 기준으로 22% 미만의 포스페이트, 바람직하게는 20% 미만의 포스페이트; 및 건조 중량 기준으로 2% 미만의 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 1% 미만의 적어도 4개의 효소를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이며, 여기서 하나의 효소는 포스파타제이고, 조성물은 상기 기술된 발명의 방법에 의해 얻을 수 있다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물과 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 수성 조성물에 적용된다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 98.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면 포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가지는 포스파타제의 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면 조성물은 트랜스퍼라제, 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 글루카노트랜스퍼라제, 보다 더 바람직하게는 알파-글루카노트랜스퍼라제를 포함하고/거나; 조성물은 추가로 포스포릴라제를 포함하며, 바람직하게는 글루칸포스포릴라제가 첨가되고/거나; 조성물은 뮤타제, 바람직하게는 포스포글루코뮤타제를 포함하고/거나; 조성물은 이성질화효소, 바람직하게는 포스포글루코이성질화효소를 포함하고/거나; 조성물은 가수분해효소, 바람직하게는 글루카노가수분해효소, 보다 바람직하게는 풀루라나제를 포함한다.
또 다른 측면으로 발명은 상기 기술된 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 과당에 관한 것이다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물과 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 과당에 적용된다.
제5 측면으로 발명은 서열번호: 41에 따르는 서열과 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 98.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 포스파타제에 관한 것이다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물과 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 포스파타제에 적용된다.
바람직하게는 포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가진다.
그런 포스파타제는 D-과당의 더 높은 수율을 제공한다. 발명의 포스파타제는 과당-6-포스페이트와 관련하여 개선된 선택성을 제공한다. 더 높은 활성으로 인해 적용될 효소의 양을 적게 하는 것이 가능하다. 그러므로, 이들 포스파타제는 특히 산업적 공정에 적합하다.
또 다른 측면으로 발명은 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 98.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 포스파타제에 관한 것이다.
바람직하게는 포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가진다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류와 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 포스파타제에 적용된다.
제6 측면으로 발명은 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류의 과당으로의 전환에서 발명의 포스파타제의 용도에 관한 것이다.
적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키는 방법과 관련하여, 특히 지금까지 언급된 효소 및 올리고- 및/또는 다당류와 관련하여 모든 언급은 또한 적용 가능한 경우 발명의 포스파타제의 용도에 적용된다.
도 1은 전분으로 시작하여 결과적으로 과당을 생성하는 발명의 공정의 개략도이다;
도 2는 도 1에 도시된 공정의 중간 단계를 도시한다; 글루칸 포스포릴라제(3)가 무기 포스페이트(G)를 사용하여 중합체(B-A)의 말단 글루코스 잔기와 나머지 사이의 α-1,4 결합을 절단하여 글루코스-1-포스페이트(C)가 방출된다;
도 3은 도 1에 도시된 공정의 중간 단계를 도시한다; 글루코스-1-포스페이트(C)가 포스포글루코뮤타제(4)의 작용에 의해 글루코스-6-포스페이트(D)로 전환된다;
도 4는 도 1에 도시된 공정의 중간 단계를 도시한다; 글루코스-6-포스페이트가 포스포글루코이성질화효소(5)를 사용하여 과당-6-포스페이트(E)로 전환된다;
도 5는 도 1에 도시된 공정의 중간 단계를 도시한다; 과당-6-포스페이트가 포스파타제(6)의 작용에 의해 과당(F) 및 포스페이트(G)로 절단된다;
도 6은 도 1에 도시된 공정의 중간 단계를 도시한다; 전분(A - 아밀로스(B) 및 아밀로펙틴(H)의 혼합물)에 함유된 모든 α-1,6 결합이 풀루라나제의 작용에 의해 절단된다;
도 7은 도 1에 도시된 공정의 중간 단계를 도시한다; α-글루카노트랜스퍼라제가 1,4-α-D-글루칸(B)의 분절의 억셉터 탄수화물(B)에서의 새로운 위치로의 전달을 촉매하여 새로운 α-1,4 결합이 생성된다;
도 8은 48시간 내에 천연 전분의 보다 빠른 전환을 위해 개선된 포스파타제, 즉 P46T, 및 말토스(0.1 mM)를 사용하는 최적화된 공정의 진행을 보여주는 도표이다;
도 9는 풀루라나제, α-글루카노트랜스퍼라제 및 글루칸 포스포릴라제를 사용하는 천연 전분의 붕괴를 위한 짧은 올리고당류의 유익한 영향을 증명하는 실험 환경의 결과 및 생성된 G1P의 검출을 보여주는 도표이다;
도 10은 공정에서 발생하는 3개의 상이한 당-포스페이트(G6P 및 F6P)의 맥락에서 개선된 촉매 성능에 대해 야생형 포스파타제와 9개의 변이체(P46T, P46TE47Y, P46TE47YG50L, Y23HP46TE47Y, P46TE47YG50I, Y23HP46TE47YG50L, Y23HP46TE47YG50I, Y23SP46TE47YG50L, Y23SP46TE47YG50I) 사이의 비교를 보여주는 도표이다;
도 11은 공정에서 발생하는 3개의 상이한 당-포스페이트(G6P 및 F6P)의 맥락에서 개선된 촉매 성능에 대해 야생형 포스파타제와 6개의 변이체(HTYL, Y47T, Y47F, V45M, V45Q 및 V45R) 사이의 비교를 보여주는 도표이다;
도 12는 공정에서 발생하는 3개의 상이한 당-포스페이트(G6P 및 F6P)의 맥락에서 개선된 촉매 성능에 대해 6개의 포스파타제 변이체(V45R, HTFL, HTTLV45R, HTFLV45R, HTFLV45M 및 HTFLV45Q) 사이의 비교를 보여주는 도표이다;
도 13은 수크로스의 과당으로의 전환의 맥락에서 개선된 촉매 성능에 대해 야생형 포스파타제와 2개의 변이체(TY 및 HTYL) 사이의 비교를 보여주는 도표이다.
다음에서 도면 및/또는 표에 사용된 약어 및 효소가 설명된다:
1 풀루라나제
2 α-글루카노트랜스퍼라제
3 글루칸 포스포릴라제
4 포스포글루코뮤타제
5 포스포글루코이성질화효소
6 포스파타제
A 전분
B 아밀로스
B-A 아밀로스 마이너스 1 글루코스 단위
C 글루코스-1-포스페이트(G1P)
D 글루코스-6-포스페이트(G6P)
E 과당-6-포스페이트(F6P)
F 과당
G 포스페이트
H 아밀로펙틴
WT 야생형; 서열번호: 13;
T 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(P46T); 서열번호: 15;
TY 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 추가적인 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(P46TE47Y); 서열번호: 17;
TYL 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(P46TE47YG50L); 서열번호: 19;
HTY 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HP46TE47Y); 서열번호: 23;
TYI 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 아이소류신으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(P46TE47YG50I); 서열번호: 21;
HTYL 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HP46TE47YG50L); 서열번호: 25;
HTYI 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 아이소류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HP46TE47YG50I); 서열번호: 27;
STYL 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 세린으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23SP46TE47YG50L); 서열번호: 29;
STYI 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 아이소류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 세린으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23SP46TE47YG50I); 서열번호: 31;
Y47T/HTTL 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 트레오닌으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HP46TE47TG50L); 서열번호: 33;
Y47F/HTFL 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 페닐알라닌으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HP46TE47FG50L); 서열번호: 35;
V45M 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 및 위치 45에서 발린으로부터 메티오닌으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HV45MP46TE47YG50L); 서열번호: 37;
V45Q 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 및 위치 45에서 발린으로부터 글루타민으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HV45QP46TE47YG50L); 서열번호: 39;
V45R 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 티로신으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 및 위치 45에서 발린으로부터 아르기닌으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HV45RP46TE47YG50L); 서열번호: 41;
HTTLV45R 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 트레오닌으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 및 위치 45에서 발린으로부터 아르기닌으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HV45RP46TE47TG50L); 서열번호: 43;
HTFLV45R 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 페닐알라닌으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 및 위치 45에서 발린으로부터 아르기닌으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HV45RP46TE47FG50L); 서열번호: 45;
HTFLV45M 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 페닐알라닌으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 및 위치 45에서 발린으로부터 메티오닌으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HV45MP46TE47FG50L); 서열번호: 47;
HTFLV45Q 위치 46에서 프롤린으로부터 트레오닌으로 및 위치 47에서 글루타메이트로부터 페닐알라닌으로 및 위치 50에서 글리신으로부터 류신으로 및 위치 23에서 티로신으로부터 히스티딘으로 및 위치 45에서 발린으로부터 글루타민으로 아미노산 교환이 있는 포스파타제 변이체(Y23HV45QP46TE47FG50L); 서열번호: 49.
도 1은 풀루라나제(1) 및 α-글루카노트랜스퍼라제(2)의 사용에 의해 아밀로스(B)로 전환되는 전분(A - 아밀로스 및 아밀로펙틴의 혼합물)으로 시작하는 발명의 공정의 개략도를 도시하며, 다음 단계는 무기 포스페이트(G)를 사용하여 포스포릴라제(글루칸 포스포릴라제(3))에 의해 촉매되어 중합체의 말단 글루코스 잔기와 나머지 사이의 α-1,4 결합이 절단되어 글루코스-1-포스페이트(C)가 방출되며, C는 포스포글루코뮤타제(4)의 작용에 의해 글루코스-6-포스페이트(D)로 전환되고, 글루코스-6-포스페이트는 포스포글루코이성질화효소(5)를 사용하여 과당-6-포스페이트(E)로 전환되며 마지막 단계에서 단계 과당-6-포스페이트는 포스파타제(6)의 작용에 의해 과당(F) 및 포스페이트(G)로 전환된다.
도 2는 도 1에 도시된 일반 공정의 중간 공정 단계를 도시한다. 글루칸 포스포릴라제(3) 및 무기 포스페이트(G)가 사용되어 중합체(B-A)의 말단 글루코스 잔기와 나머지 사이의 α-1,4 결합이 절단되어 글루코스-1-포스페이트(C)가 방출된다.
도 3 내지 도 7은 도 1에 도시된 공정의 추가의 중간 단계를 도시한다.
도 8 내지 13은 하기 실험 단원에서 한층 더 논의되는 시험 데이터의 도표를 제공한다.
발명이 특정 바람직한 구현예를 참조로 기술되었지만, 기술분야에 숙련된 사람들은 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 만들어질 수 있고 동등물이 요소에 대해 대체될 수 있음을 이해할 것이다. 더불어, 특정 상황 또는 물질을 발명의 필수 범주로부터 벗어나지 않으면서 발명의 교시에 적응하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 그러므로, 발명이 특정 구현예에 한정되지 않지만, 발명은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 모든 구현예를 포함할 것으로 의도된다.
실험 섹션
1. 물질
모든 화학물질은 분석 등급 이상의 것이었고 Sigma-Aldrich, Carbosynth 또는 VWR사로부터 구입하였으며 추가의 정제 없이 사용하였다.
글루시덱스 12 및 글루시덱스 19는 말토덱스트린 화합물로, Roquette Freres사(France)로부터 얻었다.
글루코스 중합체의 분자 질량은 식(180*n - 18*(n-1))을 사용함으로써 계산할 수 있고 이때 n은 글루코스 중합체의 DP(중합도)이다. DE(덱스트로스 동등물)는 100*(180 / 분자 질량(글루코스 중합체))으로서 계산할 수 있다. DP는 식 DP = 111/DE를 사용하여 계산할 수 있다(Balto, Amy S., 등 "On the use of differential solubility in aqueous ethanolsolutions to narrow the DP range of food-grade starch hydrolysis products." Food chemistry 197(2016): 872-880.). DE가 11 내지 14인 글루시덱스 12는 평균 DP가 8 내지 10인 것으로 가정한다. DE가 18 내지 20인 글루시덱스 19는 평균 DP가 5 내지 6인 것으로 가정한다. 그러나 이들 제제가 효소적 처리에 의해 유도되므로 더 작거나 더 큰 말토덱스트린이 또한 포함된다.
다음의 스트레인을 이 작업 중에 사용하였다: 대장균 XL1 블루, 대장균 BL21(DE3), 모든 구성물은 37℃에서 자가유도 배지를 사용하여 성공적으로 발현되었다.
2. 방법
분석학
도1에 도시한 완전한 공정에 대한 분석학을 오토샘플러(WPS 3000TRS), 칼럼 구획(TCC3000RS) 및 광 산란 검출기가 장착된 HPLC Dionex Ultimate 3000 시스템을 사용하여 수행하였다. 7℃에서 YMC Triart Diol Hilic 칼럼(100 * 2 mm, 1.9 μm, 12 nm)을 0.1% 포름산 pH 4.5, 및 0.45 ml/분에서 이동상으로서 ACN 중의 0.1% 포름산으로의 구배 용출(15-85%)에 의한 분리에 사용하였다. 샘플을 3:7 비율의 물/아세토니트릴로 희석하였다. 데이터를 Dionex Chromeleon 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
전체 케토스(과당 및 과당-6-포스페이트)의 검출을 트라이페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)를 토대로 한 검정을 사용하여 실시하였다. 검출 방법은 알도스와 케토스 사이의 차등 환원 속도를 토대로 한다. 2 ml의 시험관에 0.05 ml의 샘플, 플러스 0.01 ml 1% 수성 TTC, 플러스 0.04 ml 6 N NaOH를 첨가한다. 정확히 5분 후에, 1.5 ml 아세트산:에탄올(1:9)을 첨가하고 시험관 내용물을 와류 혼합한다. 블랭크로서 물을 사용하고, 흡광도를 분광광도계(Multiskan GO, Thermo Fisher)를 사용하여 480 nm에서 측정한다. 글루코스 및 글루코스-6-포스페이트는 동등한 양의 과당보다 약 100배 더 느리게 TTC를 적색 안료 - 트라이페닐포르마잔 -로 환원시킨다.
글루코스를 글루코스 산화효소를 토대로 한 검정을 사용하여 검출한다. 50 μl의 샘플 또는 희석된 샘플을 50 μl의 마스터 혼합물(0.75 mM ABTS, 2 U/ml 글루코스 산화효소, 0.1 U/ml 과산화효소, 20 mM KPi pH 6.0)과 혼합하고 30분 동안 30℃에서 인큐베이션한 후 분광광도계(Multiskan GO, Thermo Fisher)를 사용하여 480 nm에서 측정한다.
단백질 발현
최적화된 단백질 발현을 하나의 효소에 대해 예시적으로 기술하며 동일한 과정에 의해 모든 단백질에 대해 수행하였다.
관심 있는 플라스미드(공정에 대해 기술된 효소 중 하나를 암호화하는 하나의 유전자를 가진 pET28 유도체)를 함유한 대장균 BL21(DE3)을 250 ml의 자가유도 배지에서 성장시켰다(Studier, F. William. "Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures." Protein expression and purification 41.1(2005): 207-234.). 사전배양을 100 μg/ml의 카나마이신을 함유하고 있는 4 ml의 LB 배지에서 37℃에서 밤새 회전 쉐이커(180 rpm) 상에서 인큐베이션하였다. 발현 배양을 1:100 희석의 밤새 배양으로 접종하였다. 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리에 의해 수득하고 50 mM TRIS-HCl(pH　8.0)에 재현탁하였다. 미정제 추출물을 베이직-Z 세포 파괴기(IUL Constant Systems) 또는 초음파 장치를 사용함으로써 제조하고 후속적으로 MgCl2를 2.5 mM의 최종 농도로 DNaseI(1　μg/ml)과 함께 첨가하고 이어서 20분 동안 실온(25℃)에서 인큐베이션하여 DNA를 분해하였다. 그런 다음 모든 미정제 추출물을 30분 동안 70℃에서 열 처리하였다. 용해물의 불용성 분획을 원심분리(40분 동안 4℃에서 20,000　rpm)에 의해 제거하였다. 상층액을 0.45　μm 주사기 필터를 통해 여과하여 정제된 효소 제제로서 사용하였다. 각각의 정제물의 부분표본에 대해 Laemmli Ulrich K.에 의해 기술된 12% SDS-Page를 적용하였다("Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." nature 227.5259(1970): 680.)).
효소는 다음의 서열 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 9, 서열번호: 11, 서열번호: 13, 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 서열번호: 49에 상응한다.
효소의 활성 테스트
바실러스 플라보칼다리우스(Bacillus flavocaldarius)의 풀루라나제(서열번호: 1)를 기질로서 풀루란 및 검출을 위해 3,5-다이니트로살리실산(DNS)을 사용하여 활성에 대해 테스트하였다.
풀루라나제를 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 및 5 mM MgCl2 중의 1%(중량/부피) 풀루란과 함께 65℃에서 인큐베이션하였다. 상이한 시점에 24 μl의 부분표본을 96 μl의 DNS 시약(1 리터에 대해 10 g 3,5-다이니트로살리실산, 300 g 타르타르산 나트륨 칼륨, 16 g 수산화 나트륨)에 전달하였다. 95℃에서 5분 동안 가열한 후 100 μl를 평평한 바닥 미세역가 플레이트에 옮기고 분광광도계(Multiskan GO, Thermo Fisher)에서 540 nm에서 측정하였다.
마이오테르무스 루버(Meiothermus ruber)의 α-글루카노트랜스퍼라제(서열번호:3)를 기질로서 말토트리오스를 사용하여 활성에 대해 및 더 큰 올리고당류를 구성하는 능력에 대해 테스트하였다. 활성의 검출을 TLC(이소프로판올:에틸아세테이트:물(3:1:1)) 및 티몰 스프레이 시약(0.5 g 티몰, 95 ml 에탄올, 5 ml 황산 97%)을 사용하여 실시하였다. 마이오테르무스 루버의 α-글루카노트랜스퍼라제를 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 및 5 mM MgCl2 중의 50 mM 말토트리오스와 함께 65℃에서 인큐베이션하였다.
써모토가 나프토필라(Thermotoga naphthophila)의 α-글루칸 포스포릴라제(서열번호: 5)를 효소의 조합을 사용하여 활성에 대해 테스트하여 생성물 α-D-글루코스-1-포스페이트를 검출하였다. α-D-글루코스-1-포스페이트는 α-D-글루코스-6-포스페이트로 전환되고 그것은 후속적으로 α-D-글루코스-6-포스페이트 탈수소효소에 의해 α-D-글루코네이트-6-포스페이트로 산화되었다. 생성된 NADH를 사용하여 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸 설페이트(PMS)를 전자 매개체로서 사용함으로써 WST-1을 전환시켰다. α-글루칸 포스포릴라제를 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 및 5 mM MgCl2 중의 1%(중량/부피) 가용성 전분 및 0.1 mM 피리독살-5-포스페이트와 함께 65℃에서 인큐베이션하였다. 상이한 시점에 24 μl의 부분표본을 포스포글루코뮤타제 0.1 U, α-D-글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 0.1 U, 0.1 mM WST-1, 0.005 mM PMS를 함유하고 있는 190 μl의 검출 용액에 전달하였다. 혼합물을 30분 동안 인큐베이션한 후 분광광도계(Multiskan GO, Thermo Fisher)에서 440 nm에서 측정하였다.
비피도박테리움 아데레날리스(Bifidobacterium adolescentis)의 수크로스 포스포릴라제(서열번호: 51)를 기질로서 수크로스 및 검출을 위해 3,5-다이니트로살리실산을 사용하여 활성에 대해 테스트하였다. 검출을 위해 3,5-다이니트로살리실산을 사용하는 검정에서 생성물 과당만이 신호를 생성한다. 수크로스 포스포릴라제를 100 mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 및 5 mM MgCl2 중의 100 mM 수크로스와 함께 50℃에서 인큐베이션하였다. 상이한 시점에 24 μl의 부분표본을 96 μl의 DNS 시약(1 리터에 대해 10 g 3,5-다이니트로살리실산, 300 g 타르타르산 나트륨 칼륨, 16 g 수산화 나트륨)에 전달하였다. 95℃에서 5분 동안 가열한 후 100 μl를 평평한 바닥 미세역가 플레이트에 옮기고 분광광도계(Multiskan GO, Thermo Fisher)에서 540 nm에서 측정하였다.
사카로부스 설파타리쿠스(Saccharolobus sulfataricus) P2(서열번호: 7) 또는 클로스트리디움 써모셀룸(Chlostridium thermocellum)(서열번호: 9)의 포스포글루코뮤타제를 기질로서 α-D-글루코스-1-포스페이 및 검출을 위해 3,5-다이니트로살리실산을 사용하여 활성에 대해 테스트하였다. 검출을 위해 3,5-다이니트로살리실산을 사용하는 검정에서 생성물 α-D-글루코스-6-포스페이트만이 신호를 생성한다. 포스포글루코뮤타제를 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 및 5 mM MgCl2 중의 50 mM α-D-글루코스-1-포스페이트와 함께 65℃에서 인큐베이션하였다. 상이한 시점에 24 μl의 부분표본을 96 μl의 DNS 시약(1 리터에 대해 10 g 3,5-다이니트로살리실산, 300 g 타르타르산 나트륨 칼륨, 16 g 수산화 나트륨)에 전달하였다. 95℃에서 5분 동안 가열한 후 100 μl를 평평한 바닥 미세역가 플레이트에 옮기고 분광광도계(Multiskan GO, Thermo Fisher)에서 540 nm에서 측정하였다.
써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)의 포스포글루코이성질화효소(서열번호: 11)를 기질로서 과당-6-포스페이트 및 검출을 위해 α-D-글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 사용하여 활성에 대해 테스트하였다. 생성된 NADH를 사용하여 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸 설페이트(PMS)를 전자 매개체로서 사용함으로써 WST-1을 전환시켰다. 포스포글루코이성질화효소를 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 및 5 mM MgCl2 중의 50 mM 과당-6-포스페이트와 함께 65℃에서 인큐베이션하였다. 상이한 시점에 10 μl의 부분표본을 α-D-글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 0.1 U, 0.1 mM WST-1, 0.005 mM PMS를 함유하고 있는 190 μl의 검출 용액에 전달하였다. 혼합물을 30분 동안 인큐베이션한 후 분광광도계(Multiskan GO, Thermo Fisher)에서 440 nm에서 측정하였다.
써모토가 나프토필라(Thermotoga naphthophila)의 포스파타제(서열번호: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49)를 기질로서 과당-6-포스페이트 및 포스페이트 검정을 사용하여 활성에 대해 테스트하였다. 포스페이트 검정은 3가지 용액, 용액 A(1 N HCl 용액 중의 12%(중량/부피) 1-아스코르브산), 용액 B(ddH2O 중의 2%(중량/부피) Na2MoO4 x 2H2O), 용액 F(ddH2O 중의 2%(중량/부피) 시트르산 및 2%(중량/부피) 아세트산)로 이루어진다. 용액 D는 용액 A 및 용액 B의 2:1 혼합물이고 측정 전에 새롭제 제조한다. 75 μl의 용액 D를 평평-바닥 미세역가 플레이트의 필요한 웰에 피펫팅한다. 다음 단계로 25 μl의 샘플 또는 규정된 농도의 표준을 첨가하고 5분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 마지막 단계로 반응을 75 μl의 용액 F를 첨가하고 추가적으로 15분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 중단한다. 샘플을 분광광도계(Multiskan GO, Thermo Fisher)에서 655 nm에서 측정한다.
모든 테스트된 효소는 공정 내 단계들 중 하나를 촉매하기 위한 요구조건을 충족하며 공정 조건 하에서 안정적이다(65℃, 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.0, 5 mM MgCl2 0.005 mM PLP).
3. 전분의 과당으로의 전환(발명의 실시예 1; IE1)
전환 실험을 7 g의 천연 전분이 들어 있는 50 ml 팔콘 튜브를 사용하여 15 ml 규모로 수행하였다. 천연 전분을 6 ml 부피의 물 및 완충액으로 사전 처리하고 최대 95℃로 30분 동안 가열하여 거의 완전히 팽창되게 하였다. 그런 후, 팽창된 전분을 65℃로 냉각시키고 효소를 첨가하였다. 7 그램의 천연 전분에 10.5 ml 부피의 완충액, 염 및 효소를 첨가하였다. 추가적으로, 말토스를 10 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 최종 혼합물은 50 mM KPi pH 7.0, 5 mM MgCl2, 0.1 mM PLP, 10 mM 말토스, 0.4 mg 풀루라나제, 1.5 mg α-글루카노트랜스퍼라제, 30 mg α-글루칸 포스포릴라제, 1.4 mg 포스포글루코뮤타제, 1.2 mg 포스포글루코이성질화효소 및 14 mg 포스파타제를 함유하였다. 바실러스 플라보칼다리우스, 마이오테르무스 루버, 써모토가 나프토필라의 효소(포스포릴라제 및 포스파타제), 클로스트리디움 써모셀룸 및 써모토가 마리티마의 효소를 사용하였다. 0시간 인큐베이션으로 시작하여 정기적으로 샘플을 취하고 10 kDa 스핀 필터(VWR 82031-350)를 사용하여 여과하였다. 필요하다면, 샘플을 추후 분석을 위해 3:7 비율의 물/아세토니트릴로 희석하였다.
발명의 실시예 1(IE1)에 따르는 전분의 과당으로의 전환의 결과(35% 건조 물질 전분이 2153.5 mM 농도의 단당류에 상응함)를 표 1뿐만 아니라 도 8에 제시한다.
발명의 실시예 1
시간[시] 과당[mM] 덱스트로스[mM] 나머지[mM]
0 0 0 2153.5
2 194 16 1943.5
4 312 18 1823.5
6 349 22 1782.5
8 464 40 1649.5
24 1059 186 908.5
48 1511 317 325.5
표 1로부터 48시간 후에 과당이 약 70%의 수율로 얻어진 것을 유추할 수 있다.
4. 말토스(IE2 내지 IE5), 말토트리오스(IE6 내지 IE9), 말토테트라오스(IE10 내지 IE12), 말토덱스트린 글루시덱스 12(IE13 내지 IE15) 또는 말토덱스트린 글루시덱스 19(IE16 내지 IE18)의 존재 하에 전분의 과당으로의 전환
총 부피 5 ml 중의 칼륨 포스페이트 완충액 50 mM pH 7.0, MgCl2 5 mM, PLP 0.005 mM, 팽창된 천연 전분 1%(중량/부피), 말토스(0.01 mM, 0.1 mM, 1.0 mM 또는 10 mM; IE2 내지 IE5) 또는 말토트리오스(0.01 mM, 0.1 mM, 1.0 mM 또는 10 mM; IE6 내지 IE9) 또는 말토테트라오스(0.01 mM, 0.1 mM 또는 1.0 mM; IE10 내지 IE12) 또는 말토덱스트린 글루시덱스 12(0.0342%(중량/부피), 0.00342%(중량/부피) 또는 0.000342%(중량/부피); IE13 내지 IE15) 또는 말토덱스트린 글루시덱스 19(0.0342%(중량/부피), 0.00342%(중량/부피) 또는 0.000342%(중량/부피); IE16 내지 IE18), 글루칸 포스포릴라제(0.0025 mg/ml), 알파-글루카노트랜스퍼라제(0.075 mg/ml), 풀루라나제(0.02 mg/ml)를 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 부분표본을 제거하여 글루코스-1-포스페이트에 대해 확인하였다. 글루코스-1-포스페이트 검정은 상기 효소의 활성 테스트에서 기술된다.
비교예 1 내지 5(CE1 내지 CE5)를 전분의 첨가 없이 각각 1 mM의 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 글루시덱스 12 또는 글루시덱스 19만을 첨가함으로써 수행하였다. 비교예 6을 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 글루시덱스 12 또는 글루시덱스 19와 같은 추가적인 당류의 첨가 없이 수행하였다.
추가적인 당류, 예컨대 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 글루시덱스 12 또는 글루시덱스 19와 같은 짧은 올리고당류의 글루코스-1-포스페이트로의 전환율에 미치는 영향에 대한 테스트 결과를 표 2에 제시한다. 각각의 다이아그램은 도 9에 도시한다.
실시예(당류 잔기) 440 nm에서의 흡광도(G1P의 검출)
0[분]에서 15[분]에서 30[분]에서
IE 2(말토스 10 mM) 0.147 1.351 1.966
IE 3(말토스 1 mM) 0.125 1.138 1.857
IE 4(말토스 0.1 mM) 0.096 0.694 1.288
IE 5(말토스 0.01 mM) 0.095 0.678 1.286
IE 6(말토트리오스 10 mM) 0.134 1.222 1.793
IE 7(말토트리오스 1 mM) 0.120 1.148 1.748
IE 8(말토트리오스 0.1 mM) 0.087 0.681 1.323
IE 9(말토트리오스 0.01 mM) 0.094 0.713 1.352
IE 10(말토테트라오스 1 mM) 0.101 0.832 1.369
IE 11(말토테트라오스 0.1 mM) 0.097 0.784 1.383
IE 12(말토테트라오스 0.01 mM) 0.097 0.629 1.184
IE 13(글루시덱스 12 0.0342%(중량/부피)) 0.092 0.689 1.226
IE 14(글루시덱스 12 0.00342%(중량/부피)) 0.093 0.652 1.042
IE 15(글루시덱스 12 0.000342%(중량/부피)) 0.094 0.679 1.159
IE 16(글루시덱스 19 0.0342%(중량/부피)) 0.099 0.720 1.254
IE 17(글루시덱스 19 0.00342%(중량/부피)) 0.093 0.595 1.106
IE 18(글루시덱스 19 0.000342%(중량/부피)) 0.095 0.643 1.212
CE 1(말토스 단독(1 mM)) 0.053 0.144 0.228
CE 2(말토트리오스 단독(1 mM)) 0.068 0.364 0.569
CE 3(말토테트라오스 단독(1 mM)) 0.079 0.446 0.728
CE 4(글루시덱스 단독 12 0.0342%(중량/부피)) 0.063 0.237 0.413
CE 5(글루시덱스 단독 19 0.0342%(중량/부피)) 0.065 0.255 0.418
CE 6(천연 전분) 0.092 0.500 0.905
전분과 같은 큰 다당류 또는 공정 내에서 셀룰로스, 등과 같은 비슷한 기질의 전환은 한 가지 주요 속도 제한 단계, 예를 들어 글루칸 포스포릴라제에 의해 촉매된 글루코스-1-포스페이트 분자의 생성을 포함한다. 포스포릴라제는 중합체의 말단 글루코스 잔기와 나머지 사이의 무기 포스페이트를 사용하여 α-1,4 결합의 절단을 촉매하여 글루코스-1-포스페이트를 방출하기 위하여 다당류의 접근 가능한 단부를 필요로 한다. 풀루라나제, α-글루카노트랜스퍼라제 및 짧은 올리고당류, 예컨대 말토스(IE2 내지 IE5), 말토트리오스(IE6 내지 IE9), 말토테트라오스(IE10 내지 IE12), 말토덱스트린 글루시덱스 12(IE13 내지 IE15) 또는 말토덱스트린 글루시덱스 19(IE16 내지 IE18)(표 2 참조)의 조합된 작용은 전환율이 짧은 올리고당류의 첨가에 의해 증가되는 것을 보여준다. 이것은 더 높은 글루코스-1-포스페이트 생성으로 이어지며 따라서 발명의 공정 내에서 전분의 과당으로의 더 빠른 전환이 허용된다.
모든 비교예 1 내지 6에 대한 전환율은 발명의 실시예 2 내지 18과 비교하여 더 느리다.
5. 포스페이트 검정
상이한 포스파타제 및 공정에서 발생하는 2개의 당-포스페이트 중간체에 대한 변이체의 상이한 활성을 모니터링하기 위하여 포스페이트 검정을 수행하였다.
반응 혼합물은 총 1 ml의 부피에 50 mM TRIS-HCl 완충액 pH 7.0, 2.5 mM MgCl2, 10 mM of G1P, G6P 또는 F6P 및 하나의 포스파타제(0.003 mg/ml)를 함유하였다. 혼합물을 65℃에서 인큐베이션하고 정기적인 간격으로 부분표본을 제거하여 방출된 포스페이트에 대해 테스트하였다. 포스페이트 검정은 상기에서 더 상세하게 기술된다.
포스페이트 검정의 결과를 표 3 및 도 10에 제시한다. G6P 및 F6P의 양을 검출하였고 F6P/G6P의 비율을 측정하였다. F6P/G6P 비율은 테스트된 포스파타제의 선택성을 나타낸다.
실시예
(포스파타제)		 시간[분] 방출된 포스페이트
G6P[nmol] F6P[nmol] F6P/G6P 비율
CE7(WT) 10 12.165 194.647 16
20 20.276 347.584 17.143
30 25.490 476.191 18.682
IE19(T) 10 12.745 358.591 28.136
20 31.862 652.879 20.491
30 50.400 958.753 19.023
IE20(TY) 10 6.952 216.082 31.083
20 15.641 400.301 25.593
30 23.752 590.314 24.854
IE21(TYL) 10 5.793 363.226 62.700
20 11.296 547.735 48.487
30 15.062 717.182 47.615
IE22(TYI) 10 8.110 151.199 18.643
20 9.848 300.660 30.529
30 17.959 442.011 24.613
IE23(HTY) 10 15.641 387.557 24.778
20 31.862 729.348 22.891
30 48.082 1027.691 21.373
IE24(HTYL) 10 17.959 714.865 39.806
20 37.945 1357.896 35.786
30 62.565 1993.975 31.870
IE25(HTYI) 10 12.745 379.446 29.773
20 25.490 832.464 32.659
30 39.393 1256.517 31.897
IE26(STYL) 10 5.214 213.185 40.889
20 9.848 426.949 43.353
30 13.324 637.238 47.826
IE27(STYI) 10 7.531 155.834 20.692
20 6.372 313.405 49.182
30 13.324 448.963 33.696
표 3뿐만 아니라 도 10에서 알 수 있는 것과 같이 써모토가 나프토필라의 포스파타제로 돌연변이 P46T(IE19(T))의 도입은 효소의 전체 활성을 증가시키고 글루코스-6-포스페이트(G6P)를 향한 효소의 활성을 감소시킨다. 이것은 감소된 효소량 및 더 나은 전체적인 과당 생성의 맥락에서 더 나은 공정 경제를 허용한다. P46TE47Y(IE20(TY))는 야생형(CE7(WT))과 비교하여 F6P를 향한 약간 개선된 활성을 가지며 글루코스와 같은 원치 않는 부산물을 감소시키는 G6P를 향한 거의 동일한 활성을 가진다. P46TE47YG50L(IE21(TYL))은 야생형(CE7(WT))과 비교하여 F6P에 대해 개선된 활성 및 또한 글루코스와 같은 원치 않는 부산물을 감소시키는 G6P를 향한 감소된 활성을 가진다. Y23HP46TE47Y(IE23(HTY))는 또한 CE7(WT)과 비교하여 F6P에 대한 개선된 활성 및 G6P를 향한 약간 증가된 활성을 가진다. 그러나 두 활성과 관련하여 이 변이체는 또한 발명의 공정에 대해 개선된 성능을 보여 글루코스와 같은 원치 않는 부산물을 감소시키는 개선된 공정을 허용한다. P46TE47YG50I(IE22(TYI))는 F6P를 향한 개선된 선택성을 가진다. Y23HP46TE47YG50L(IE24(HTYL))은 전체적인 증가된 활성의 맥락에서 CE7(WT)과 비교하여 F6P에 대한 개선된 활성 및 G6P를 향한 감소된 활성을 가진다. Y23HP46TE47YG50I(IE25(HTYI))는 전체적인 증가된 활성의 맥락에서 F6P에 대한 개선된 활성 및 G6P를 향한 감소된 활성을 가진다. Y23SP46TE47YG50L(IE26(STYL))은 전체적인 증가된 활성의 맥락에서 CE7(WT)과 비교하여 F6P에 대한 개선된 활성 및 G6P를 향한 감소된 활성을 가진다. Y23SP46TE47YG50I(IE27(STYI))는 F6P를 향한 개선된 선택성을 가진다.
발명의 포스파타제(표 3 및 도 10 참조)는 증가된 활성, 증가된 선택성 또는 둘 다를 나타낸다.
야생형 포스파타제와 비교하여 추가적인 포스파타제를 테스트하는 추가의 포스페이트 검정의 결과를 표 4 및 도 11에 제시한다. 사용된 포스파타제가 개선된 활성을 보였기 때문에 측정에 걸린 시간 간격은 짧아졌다.
실시예
(포스파타제)		 시간[분] 방출된 포스페이트
G6P[nmol] F6P[nmol] F6P/G6P 비율
CE8(WT)

6 1.30 30.34 23.33
12 5.75 58.71 10.19
18 4.36 76.96 17.63
IE28(HTYL)

6 1.08 86.67 80.05
12 31.15 298.15 9.57
18 22.02 341.79 15.51
IE29(Y47T)

6 1.29 194.18 149.64
12 22.42 526.27 23.46
18 37.10 659.17 17.76
IE30(Y47F)

6 2.27 354.07 155.77
12 31.94 893.24 27.96
18 43.05 1129.69 26.23
IE31(V45M)

6 1.97 335.33 170.03
12 17.76 735.26 41.38
18 30.47 1064.51 34.92
IE32(V45Q)

6 1.97 267.81 135.80
12 23.72 602.21 25.38
18 40.80 881.02 21.59
IE33(V45R)

6 17.46 792.46 45.38
12 55.09 1415.99 25.69
18 83.29 1778.20 21.34
Y23HP46TE47YG50L(HTYL)은 전체적인 증가된 활성의 맥락에서 야생형과 비교하여 F6P에 대한 개선된 활성 및 G6P를 향한 감소된 활성을 가진다. 이런 이유로, 효소는 글루코스와 같은 원치 않는 부산물을 감소시키는 개선된 공정을 허용한다. 동일한 내용이 변이체 Y23HP46TE47TG50L(Y47T) Y23HP46TE47TG50L(Y47F), Y23HV45MP46TE47TG50L(V45M), Y23HV45QP46TE47TG50L(V45Q), Y23HV45RP46TE47TG50L(V45R)에 적용된다.
추가적인 포스파타제를 테스트하는 또 다른 포스페이트 검정의 결과를 표 5 및 도 12에 제시한다. 사용된 포스파타제가 개선된 활성을 보였기 때문에 측정에 걸린 시간 간격은 또한 짧아졌다.
실시예
(포스파타제)		 시간[분] 방출된 포스페이트
G6P[nmol] F6P[nmol] F6P/G6P 비율
IE34(V45R)

6 19.71 666.26 33.79
12 95.16 1339.62 14.07
18 119.81 1928.61 16.09
IE35(HTFL)

6 6.58 324.47 49.27
12 21.98 648.58 29.49
18 36.96 985.68 26.66
IE36(HTTLV45R)

6 33.29 639.46 19.20
12 119.11 1278.51 10.73
18 161.27 1811.74 11.23
IE 37(HTFLV45R)

6 32.58 743.82 22.82
12 120.89 1441.85 11.92
18 190.58 2056.57 10.79
IE38(HTFLV45M)

6 10.78 483.30 44.82
12 28.63 945.95 33.03
18 49.90 1414.95 28.35
IE39(HTFLV45Q)

6 1.68 129.95 77.05
12 9.04 281.23 31.09
18 13.87 436.05 31.43
변이체 Y23HV45RP46TE47TG50L(V45R), Y23HP46TE47FG50L(HTFL), Y23HV45RP46TE47TG50L(HTTLV45R), Y23HV45MP46TE47FG50L(V45M) 및 Y23HV45QP46TE47FG50L(V45Q)은 모두 전체적인 증가된 활성의 맥락에서 F6P에 대한 개선된 활성 및 G6P를 향한 감소된 활성을 가진다. 이런 이유로, 효소는 글루코스와 같은 원치 않는 부산물을 감소시키는 개선된 공정을 허용한다.
6. 개선된 포스파타제 효소를 사용하는 수크로스의 과당으로의 전환
총 10 ml의 부피 중의 칼륨 포스페이트 완충액 50 mM pH 7.0, MgCl2 5 mM, 수크로스 1000 mM, 수크로스 포스포릴라제(0.25 mg/ml), 포스포글루코뮤타제(0.04 mg/ml), 포스포글루코이성질화효소(0.075 mg/ml) 및 포스파타제(0.18 mg/ml)를 50℃에서 48시간 동안 인큐베이션하고 부분표본을 제거하여 글루코스 및 과당 농도를 확인하였다. 비피도박테리움 아데레날리스(수크로스 포스포릴라제), 써모토가 나프토필라(포스파타제), 클로스트리디움 써모셀룸(포스포글루코뮤타제) 및 서모토가 마리티마(포스포글루코이성질화효소)로부터의 효소를 사용하였다. 과당을 방법에서 기술한 것과 같이 측정하였다.
표 6 및 도 13에서 3가지의 상이한 포스파타제 효소를 사용하는 수크로스의 과당으로의 전환의 결과가 제시된다.
시간[시] 과당 농도[mM]
CE9(WT) IE40(TY) IE41(HTYL)
0 88.325 88.325 85.077
1 119.436 126.615 160.462
2 157.385 169.692 241.145
3 230.034 262.855 344.393
20 984.103 1127.692 1484.957
48 1317.436 1628.547 1741.368
표 6으로부터 알 수 있는 것과 같이 발명의 포스파타제 TY(IE40) 및 HTYL(IE41)의 전환율은 야생형 포스파타제 WT(CE9)와 비교하여 더 높다.
SEQUENCE LISTING <110> CASCAT GmbH <120> Production of fructose from oligo- and/or polysaccharides <130> K 68 541 <160> 52 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 475 <212> PRT <213> Bacillus flavocaldarius KP 1228 <220> <223> Pullulanase <400> 1 Met Ala Trp Tyr Glu Gly Ala Phe Phe Tyr Gln Ile Phe Pro Asp Arg 1 5 10 15 Phe Phe Arg Ala Gly Pro Pro Gly Arg Pro Ala Pro Ala Gly Pro Phe 20 25 30 Glu Pro Trp Glu Asp Pro Pro Thr Leu Arg Gly Phe Lys Gly Gly Thr 35 40 45 Leu Trp Gly Val Ala Glu Lys Leu Pro Tyr Leu Leu Asp Leu Gly Val 50 55 60 Glu Ala Ile Tyr Leu Asn Pro Val Phe Ala Ser Thr Ala Asn His Arg 65 70 75 80 Tyr His Thr Val Asp Tyr Phe Gln Val Asp Pro Ile Leu Gly Gly Asn 85 90 95 Glu Ala Leu Arg Tyr Leu Leu Glu Val Ala His Ala His Gly Val Arg 100 105 110 Val Ile Leu Asp Gly Val Phe Asn His Thr Gly Arg Gly Phe Phe Ala 115 120 125 Phe Gln His Leu Met Glu Asn Gly Glu Gln Ser Pro Tyr Arg Asp Trp 130 135 140 Tyr His Val Lys Gly Phe Pro Leu Lys Ala Tyr Thr Ala His Pro Asn 145 150 155 160 Tyr Glu Ala Trp Trp Gly Asn Pro Glu Leu Pro Lys Leu Lys Val Glu 165 170 175 Thr Pro Ala Val Arg Glu Tyr Leu Leu Ala Val Ala Glu His Trp Ile 180 185 190 Arg Phe Gly Val Asp Gly Trp Arg Leu Asp Val Pro Asn Glu Ile Pro 195 200 205 Asp Pro Thr Phe Trp Arg Glu Phe Arg Gln Arg Val Lys Gly Ala Asn 210 215 220 Pro Glu Ala Tyr Ile Val Gly Glu Ile Trp Glu Glu Ala Asp Phe Trp 225 230 235 240 Leu Gln Gly Asp Met Phe Asp Ala Val Met Asn Tyr Pro Leu Ala Arg 245 250 255 Ala Val Leu Gly Phe Val Gly Gly Glu Ala Leu Asp Arg Asp Leu Ala 260 265 270 Ala Gln Thr Gly Leu Gly Arg Ile Glu Pro Leu Gln Ala Leu Ala Phe 275 280 285 Ser His Arg Leu Glu Asp Leu Phe Gly Arg Tyr Arg Pro Glu Val Val 290 295 300 Arg Ala Gln Met Asn Leu Leu Thr Ser His Asp Thr Pro Arg Leu Leu 305 310 315 320 Ser Leu Met Arg Gly Ser Val Glu Arg Ala Arg Leu Ala Leu Ala Leu 325 330 335 Leu Phe Leu Leu Pro Gly Asn Pro Thr Val Tyr Tyr Gly Glu Glu Val 340 345 350 Gly Met Ala Gly Gly Lys Asp Pro Glu Asn Arg Gly Gly Met Val Trp 355 360 365 Glu Glu Ala Arg Trp Gln Lys Asp Leu Arg Glu Thr Val Lys Arg Leu 370 375 380 Ala Arg Leu Arg Lys Glu His Pro Ala Leu Arg Thr Ala Pro Tyr Leu 385 390 395 400 Arg Ile Tyr Ala Gln Asp Gly His Leu Ala Phe Ala Arg Gly Pro Tyr 405 410 415 Leu Val Val Val Asn Ala Ser Pro His Pro Phe Arg Gln Asp Phe Pro 420 425 430 Leu His Gly Val Phe Pro Arg Gly Gly Arg Ala Val Asp Leu Leu Ser 435 440 445 Gly Glu Val Cys Thr Pro Gln Gly Gly Arg Leu Cys Gly Pro Val Leu 450 455 460 Pro Pro Phe Ser Leu Ala Leu Trp Arg Glu Ala 465 470 475 <210> 2 <211> 1428 <212> DNA <213> Bacillus flavocaldarius KP 1228 <220> <223> coding for Pullulanase <400> 2 atggcatggt atgaaggtgc ctttttctat cagatttttc cggatcgttt ttttcgtgca 60 ggtccgcctg gtcgtccggc accggcaggt ccgtttgaac cgtgggaaga tccgcctaca 120 ctgcgtggtt ttaaaggtgg caccctgtgg ggtgttgcag aaaaactgcc gtatctgctg 180 gatctgggtg ttgaagcaat ttatctgaat ccggtttttg caagcaccgc caatcatcgt 240 tatcataccg ttgattattt tcaggtggac ccgattcttg gtggtaatga agcactgcgt 300 tacctgctgg aagttgcaca tgcacatggt gttcgtgtta ttctggatgg tgtttttaat 360 cataccggtc gtggtttttt tgcctttcag catctgatgg aaaatggtga acagagcccg 420 tatcgtgatt ggtatcatgt taaaggtttt ccgctgaaag catataccgc acatccgaat 480 tatgaagcat ggtggggtaa tccggaactg ccgaaactga aagttgaaac accggcagtt 540 cgtgaatatt tactggcagt tgcagaacat tggattcgtt ttggtgttga tggttggcgt 600 ctggatgttc cgaatgaaat tcctgatccg accttttggc gtgaatttcg tcagcgtgtg 660 aaaggtgcaa atccggaagc atatattgtt ggcgaaattt gggaagaagc agatttttgg 720 ctgcagggtg atatgtttga tgccgttatg aattatccgc tggcacgtgc agttctgggt 780 tttgttggtg gtgaagccct ggatcgtgat ctggcagcac agacaggtct gggtcgtatt 840 gaaccgctgc aggcactggc atttagccat cgtctggaag atttatttgg tcgttatcgt 900 ccggaagttg ttcgtgcaca gatgaatctg ctgaccagcc atgatacacc gcgtctgctg 960 agcctgatgc gtggtagcgt tgaacgtgcc cgtctggcac tggccctgct gtttctgctg 1020 cctggtaatc cgaccgttta ttatggtgaa gaggttggta tggcaggcgg taaagatcct 1080 gaaaatcgtg gtggtatggt gtgggaagaa gcccgttggc agaaagatct gcgtgaaacc 1140 gttaaacgcc tggcacgtct gcgtaaagaa catccggcac tgcgtaccgc accttatctg 1200 cgtatttatg cacaggatgg tcatctggca tttgcacgtg gtccgtatct ggttgttgtt 1260 aatgcaagtc cgcatccgtt tcgtcaggat tttcctctgc atggtgtgtt tccgcgtggt 1320 ggtcgtgcag ttgatctgct gagtggtgaa gtttgtacac cgcaaggtgg tcgtctgtgt 1380 ggtccggttc tgcctccgtt tagcctggca ctgtggcgtg aagcataa 1428 <210> 3 <211> 501 <212> PRT <213> Meiothermus ruber DSM 1279 <220> <223> alpha-Glucanotransferase <400> 3 Met Gln Leu Gln Arg Ala Phe Gly Ile Leu Leu His Pro Thr Ser Phe 1 5 10 15 Pro Gly Arg Trp Gly Ile Gly Ala Leu Gly Arg Glu Ala Glu Arg Phe 20 25 30 Leu Asp Trp Leu Ala Asp Ala Gly Ala Arg Trp Trp Gln Val Leu Pro 35 40 45 Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Val Asp Pro Glu Met Leu Ile Glu Lys 65 70 75 80 Gly Trp Leu Glu Gln Ser Glu Ala Pro Pro Pro Tyr Pro Thr Gln Arg 85 90 95 Val Asp Tyr Gly Trp Leu Tyr Gln Thr Arg Trp Pro Leu Leu Arg Arg 100 105 110 Ala Phe Ala Gly Phe Arg Ala Arg Ala Ser Ala Gln Asp Lys Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Ala Phe Ile Glu Ala Glu Arg Phe Trp Leu Glu Asp Tyr Ala 130 135 140 Leu Phe Met Ala Leu Lys Thr Arg Phe Asp Gly Lys Pro Trp Asn Glu 145 150 155 160 Trp Ser Pro Glu Leu Arg Asp Arg Glu Pro Ala Ala Leu Ala Arg Ala 165 170 175 Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Val Ala Leu Tyr Glu Trp Ile Gln Trp 180 185 190 Leu Phe Tyr Leu Glu Trp Gly Gln Thr Lys Ala Tyr Ala Glu Ser Lys 195 200 205 Gly Ile Gln Ile Ile Gly Asp Met Pro Ile Phe Val Ala Phe Asp Ser 210 215 220 Ser Asp Val Trp Ala Asn Pro Gln Tyr Phe Tyr Leu Glu Ala Asp Gly 225 230 235 240 Asn Pro Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Glu Thr 245 250 255 Gly Gln Leu Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Asp Val Met Glu Arg 260 265 270 Asp Asn Phe Ala Trp Trp Ile Ala Arg Ile Arg Gln Ser Leu Lys Gln 275 280 285 Cys His Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp 290 295 300 Glu Val Pro Phe Gly Arg Pro Asn Ala Val Glu Gly Arg Trp Val Lys 305 310 315 320 Ala Pro Gly Glu Lys Leu Phe Ala Ala Val Arg Ala Gln Leu Ser Asp 325 330 335 Ala Pro Ile Ile Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu 340 345 350 Ala Leu Arg Asp Gly Phe Gly Phe Pro Gly Met Lys Ile Leu Gln Phe 355 360 365 Ala Phe Ser Gly Glu Asp Asn Ala Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Ala 370 375 380 His Gly Asn Val Val Val Tyr Ser Gly Thr His Asp Asn Asp Thr Thr 385 390 395 400 Leu Gly Trp Phe Arg Thr Ala Pro Glu Ala Glu Arg Ala Phe Met Arg 405 410 415 Ala Tyr Leu Ala Arg Tyr Gly Ile Arg Cys Leu Ser Glu Tyr Glu Val 420 425 430 Ala Gly Ala Leu Ile Glu Leu Ala Phe Lys Ser Pro Ala Lys Leu Ala 435 440 445 Ile Val Pro Leu Gln Asp Val Leu Gly Leu Gly Pro Glu Ala Arg Met 450 455 460 Asn Phe Pro Gly Arg Leu Gly Asp Asn Trp Ala Trp Arg Tyr Ala Glu 465 470 475 480 Gly Asp Leu Glu Pro Gly Leu Ala Ala Gly Leu Arg Ala Leu Ala Glu 485 490 495 Ala Ser Gln Arg Ala 500 <210> 4 <211> 1506 <212> DNA <213> Meiothermus ruber DSM 1279 <220> <223> coding for alpha-Glucanotransferase <400> 4 atgcaactcc aacgcgcttt tggaattttg ctccacccca ccagttttcc gggtcgctgg 60 gggattgggg ctctgggccg cgaggccgag cggtttttgg actggctggc cgatgcggga 120 gcccgctggt ggcaggtctt accgctgggc cctaccagtt acggcgactc gccgtaccag 180 tccttctcgg cttttgccgg taacccgtat ttggttgacc ccgagatgct gattgaaaaa 240 ggctggctgg aacaaagcga agcgcccccg ccgtatccga cccagcgcgt ggattatggc 300 tggctttacc agacccgctg gcccctgttg cggcgggctt tcgcggggtt tcgggcaagg 360 gcttcggccc aggataagac ccgactggaa gcctttatcg aggccgagcg cttctggctg 420 gaagactatg cgctctttat ggccctcaag acccggtttg acggcaagcc ctggaacgag 480 tggagccccg agctgcgcga ccgtgaaccg gctgccctgg ccagggcccg tgaggagctg 540 gccgaggagg tggcccttta cgagtggatt cagtggcttt tttatctgga atggggccag 600 accaaggcct atgccgaatc caaggggatt cagattatcg gcgatatgcc catctttgtg 660 gccttcgatt cctcagatgt ctgggccaac ccgcagtact tctacctcga ggccgatggc 720 aaccccacgg tggtggcggg cgttccgccg gactacttct ccgaaaccgg ccagctctgg 780 ggcaatccgc tctatcgctg ggatgtgatg gaaagggaca actttgcctg gtggattgcc 840 cgcataaggc agtcgctcaa gcagtgccac ctggtgcgca tcgaccactt ccgcgggttt 900 gaagcctact gggaggttcc gtttggccgg cccaatgctg tggaggggcg ctgggtcaaa 960 gccccagggg agaagctgtt tgctgcggtg cgggcccaac tgagcgatgc gcccatcatt 1020 gccgaagacc tgggggtgat cacccccgag gtggaggctt tgcgcgatgg cttcgggttc 1080 cccggcatga agattttgca gtttgctttt tccggtgagg acaacgcctt tttgccccac 1140 aactaccccg cgcacggcaa tgtggtggtg tacagcggaa cccacgacaa cgacaccacc 1200 ctgggatggt tccgcaccgc gccggaggcc gagcgggcct tcatgcgggc ctacctggcc 1260 cgctatggca tccgttgttt gtcggaatac gaggtcgcgg gcgctttgat cgagctggcc 1320 ttcaaaagcc cggccaagct ggctattgtg cctttgcagg acgtgctggg gctgggcccc 1380 gaggcccgca tgaacttccc cggacggctg ggggacaact gggcgtggcg ctacgccgaa 1440 ggcgacctcg agcccggtct ggccgcggga ctgcgggccc tggccgaggc cagccagcgc 1500 gcttga 1506 <210> 5 <211> 822 <212> PRT <213> Thermotoga naphthophila DSM 13996 <220> <223> alpha-Glucan Phosphorylase <400> 5 Met Leu Glu Lys Leu Pro Glu Asn Leu Lys Glu Leu Glu Ser Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Leu Trp Trp Ser Trp Ser Arg Pro Ala Gln Arg Leu Trp Arg 20 25 30 Met Ile Asp Ser Glu Lys Trp Glu Glu His Arg Asn Pro Val Lys Ile 35 40 45 Leu Arg Glu Val Ser Lys Glu Arg Leu Glu Glu Leu Ser Lys Asp Glu 50 55 60 Asp Phe Ile Ala Leu Tyr Glu Leu Thr Leu Glu Arg Phe Thr Asp Tyr 65 70 75 80 Met Glu Arg Glu Asp Thr Trp Phe Asn Val Asn Tyr Pro Glu Trp Asp 85 90 95 Glu Lys Ile Val Tyr Met Cys Met Glu Tyr Gly Leu Thr Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys 115 120 125 Ser Ala Ser Asp Leu Gly Leu Pro Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Tyr 130 135 140 Lys His Gly Tyr Phe Thr Gln Gln Ile Asp Ser Asp Gly Arg Gln Ile 145 150 155 160 Glu Ile Phe Pro Glu Tyr Asp Ile Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Leu 165 170 175 Arg Asp Glu Asp Gly Asn Gln Val Ile Val Glu Val Pro Ile Asp Asn 180 185 190 Asp Thr Val Lys Ala Arg Val Phe Glu Val Gln Val Gly Arg Val Lys 195 200 205 Leu Tyr Leu Leu Asp Thr Asp Phe Glu Glu Asn Glu Asp Arg Phe Arg 210 215 220 Lys Ile Cys Asp Tyr Leu Tyr Asn Pro Glu Pro Asp Val Arg Val Ser 225 230 235 240 Gln Glu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Gly Met Lys Leu Leu Lys Thr Leu 245 250 255 Lys Ile Lys Pro Gly Val Ile His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe 260 265 270 Ser Ser Leu Glu Arg Ile Lys Ser Tyr Met Glu Glu Gly Tyr Ser Phe 275 280 285 Thr Glu Ala Leu Glu Ile Val Arg Gln Thr Thr Val Phe Thr Thr His 290 295 300 Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp Arg Phe Pro Phe Asp Phe Val Glu 305 310 315 320 Lys Lys Leu Thr Lys Phe Phe Glu Gly Phe Glu Ser Lys Glu Leu Leu 325 330 335 Met Asn Leu Gly Lys Asp Glu Asp Gly Asn Phe Asn Met Thr Tyr Leu 340 345 350 Ala Leu Arg Thr Ser Ser Phe Ile Asn Gly Val Ser Lys Leu His Ala 355 360 365 Asp Val Ser Arg Arg Met Phe Lys Asn Val Trp Lys Gly Val Pro Val 370 375 380 Glu Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile Thr Asn Gly Val His Met Gly Thr 385 390 395 400 Trp Ile Asn Arg Glu Met Arg Lys Leu Phe Asp Arg Tyr Leu Gly Arg 405 410 415 Val Trp Arg Glu His Thr Asp Leu Glu Gly Ile Trp Tyr Gly Val Asp 420 425 430 Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp Glu Ala His Leu Asn Ala Lys Lys 435 440 445 Arg Phe Ile Asp Tyr Ile Arg Glu Ser Ile Lys Arg Arg Asn Glu Arg 450 455 460 Leu Gly Ile Asn Glu Pro Leu Pro Glu Ile Ser Glu Asn Val Leu Ile 465 470 475 480 Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr Tyr Lys Arg Ala Val Leu Leu 485 490 495 Phe Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Arg Ile Val Asn Asn Ser Glu Arg 500 505 510 Pro Val Tyr Ile Val Tyr Ala Gly Lys Ala His Pro Arg Asp Glu Gly 515 520 525 Gly Lys Glu Phe Leu Arg Arg Ile Tyr Glu Val Ser Gln Met Pro Asp 530 535 540 Phe Lys Asn Lys Ile Ile Val Leu Glu Asn Tyr Asp Ile Gly Met Ala 545 550 555 560 Arg Leu Met Val Ser Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg 565 570 575 Pro Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ala Ala Asn Gly 580 585 590 Val Leu Asn Ala Ser Val Tyr Asp Gly Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn 595 600 605 Gly Arg Asn Gly Trp Val Ile Gly Asp Glu Ser Val Leu Pro Glu Thr 610 615 620 Glu Ala Asp Asp Pro Lys Asp Ala Glu Ala Leu Tyr Glu Leu Leu Glu 625 630 635 640 Asn Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr Glu Asn Arg Glu Lys Trp Ile Phe 645 650 655 Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser Val Ala Pro Lys Phe Ser Thr Thr 660 665 670 Arg Met Leu Lys Glu Tyr Thr Glu Lys Phe Tyr Ile Lys Gly Leu Val 675 680 685 Asn Arg Glu Trp Leu Glu Arg Arg Glu Asn Val Glu Lys Ile Gly Ala 690 695 700 Trp Lys Glu Arg Ile Leu Lys Asn Trp Glu Asn Val Ser Ile Glu Arg 705 710 715 720 Ile Val Leu Glu Asp Ser Lys Ser Val Glu Val Thr Val Lys Leu Gly 725 730 735 Asp Leu Thr Pro Asn Asp Val Ile Val Glu Leu Val Ala Gly Arg Gly 740 745 750 Glu Gly Met Glu Asp Leu Glu Val Trp Lys Val Ile His Ile Arg Arg 755 760 765 Tyr Arg Lys Glu Asn Asp Leu Phe Val Tyr Thr Tyr Thr Asn Gly Val 770 775 780 Leu Gly His Leu Gly Ser Pro Gly Trp Phe Tyr Ala Val Arg Val Ile 785 790 795 800 Pro Tyr His Pro Arg Leu Pro Ile Lys Phe Leu Pro Glu Val Pro Val 805 810 815 Val Trp Lys Lys Val Leu 820 <210> 6 <211> 2469 <212> DNA <213> Thermotoga naphthophila DSM 13996 <220> <223> coding for alpha-Glucan Phosphorylase <400> 6 atgctggaga aacttcccga gaacctgaaa gagctcgaga gccttgccta caacctctgg 60 tggagctggt ccagacctgc tcagagactc tggagaatga tcgattcaga aaagtgggag 120 gaacacagaa atcccgtcaa aatactgaga gaagtctcaa aggaaagact ggaagaacta 180 tcgaaagacg aggacttcat cgctctctac gaactgacgc tcgagagatt cacagactac 240 atggaaaggg aagacacctg gttcaacgtg aactatcccg aatgggacga aaagatagtt 300 tacatgtgta tggaatacgg actgacgaaa gcacttccga tctactctgg aggactcggt 360 atccttgccg gagaccacct caaatcagcc agtgatcttg gccttcctct catagccgta 420 ggtcttcttt acaaacacgg gtatttcact caacagatag acagtgacgg aagacagatc 480 gagatctttc cagaatacga catcgaagaa ctcccgatga aacctctcag ggatgaagac 540 ggaaaccagg tgatcgtaga agtacccata gacaacgata ctgtaaaagc gcgtgtgttc 600 gaggtacagg tcggaagggt gaaactgtat cttctcgaca ctgacttcga ggaaaacgag 660 gatagattca gaaagatctg cgactatctc tacaatcccg agcctgatgt gagagtttcc 720 caggaaattc tgctcggcat tggtggaatg aaactcctga agactctcaa gataaaacct 780 ggagtcatcc acctgaacga aggtcatccc gctttttcat ccctcgaaag gataaagagc 840 tacatggaag aaggatattc cttcaccgag gcccttgaga tcgtcagaca gaccacagtt 900 ttcacgacac acacccccgt ccccgcaggt cacgacaggt tcccgttcga tttcgtggaa 960 aagaagctga caaagttctt cgaaggattc gaatccaaag aactgcttat gaaccttgga 1020 aaagacgaag acggaaattt caacatgacg tatcttgctt tgagaacctc ctcctttata 1080 aacggagtga gcaaacttca cgctgacgta tcgagaagga tgttcaaaaa tgtctggaag 1140 ggagttccgg tggaggagat ccccattgaa ggcatcacga atggtgtcca catgggaacc 1200 tggatcaacc gcgagatgag aaaactgttc gacaggtacc tcggtagagt ctggagggaa 1260 cacactgacc tcgaaggaat atggtacgga gttgacagaa tacccgatga agaactctgg 1320 gaagcgcatc tgaacgcaaa gaaacgattc atagattaca taagagaatc catcaaaagg 1380 agaaacgaaa ggcttggaat caacgaacca ctgccggaga tcagtgaaaa cgtgctcatc 1440 ataggttttg ccagaaggtt cgcaacttac aagagagccg tcctgctctt cagcgatctg 1500 gaaagactca agagaattgt caataattcc gagaggccgg tttacattgt gtacgctgga 1560 aaggcccacc cgagagacga aggtggaaag gagtttctca gaaggatcta cgaagtttca 1620 cagatgcccg atttcaagaa caaaatcatc gtactcgaaa actatgacat cggaatggct 1680 cgactcatgg tgtcgggtgt tgacgtgtgg ttgaacaatc caaggaggcc catggaggca 1740 agcgggacaa gtggtatgaa agctgcagcg aacggtgttc tgaacgcgag tgtatacgat 1800 ggctggtggg ttgagggata caacggcaga aacggatggg tgataggtga tgaaagcgtg 1860 cttccagaaa cagaagcgga tgatccaaag gatgccgagg ctctgtatga gcttctcgaa 1920 aacgaaataa tccccaccta ctacgaaaac agagaaaagt ggatcttcat gatgaaagaa 1980 agcataaaga gcgtggctcc aaaattcagc accacccgca tgctcaaaga gtacacggag 2040 aaattctaca taaagggact tgtgaacagg gaatggctgg agagaagaga aaacgtcgaa 2100 aaaatcggag cctggaaaga aagaatcctc aagaactggg agaatgtttc catagagcgc 2160 atcgttcttg aagattcgaa gagcgtagaa gtaactgtaa aactgggcga tctcacaccg 2220 aacgacgtga tagtcgaact tgtggctgga agaggagagg gaatggaaga tctcgaagtg 2280 tggaaagtga tacacatcag aaggtacagg aaagagaacg atctattcgt ttacacttac 2340 accaatggtg ttcttggtca tcttggatct cccggatggt tctacgcggt gagagtcata 2400 ccgtaccatc ccaggcttcc catcaagttc ctgcccgaag taccggttgt ctggaagaag 2460 gttctctga 2469 <210> 7 <211> 455 <212> PRT <213> Saccharolobus solfataricus <220> <223> Phosphoglucomutase <400> 7 Met Gly Lys Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Val Thr Asn Thr 1 5 10 15 Glu Leu Gln Pro Glu Phe Ala Leu Lys Ile 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720 gatggtgatg cagatagggc aatttttata gattccatgg gtagggtcca atggggtgat 780 aggagcggta ctctattatc atattgggcc tcggttaaag ctccaaattt acctagacgc 840 atatttactg cagtttctag ctctagcttg gttgaggagt atctgaaaaa gtataatata 900 gaggttaagt ggactaaggt aggtagcata gatattgcgc atatgttatt taaagaaaaa 960 ggagtagctg gatttgagga aaatggtggg ttcatgtatc cccctcatca gacggtaaga 1020 gatggcgcaa tgtcgttcgc cttaatgctg gatatgatgg catctgagaa cgaaagttct 1080 gctgagctat ttaatagact ccccgtttat tatttggtaa aaacgaaagt tagagttacg 1140 gaaaagagtg atataaagaa gatttatgat gaagtaatga ataagtacgg aaattacggg 1200 aatactgtta caatagatgg tgttaagatt ataggtagtg atttctggct cttggttagg 1260 aaaagtggta cggagccgat aataagaata ctagttgagg caaaagatga gaataaatct 1320 aaagaattag ctaaagaatt ggaaaagtta gtgagtgaac tagtatga 1368 <210> 9 <211> 578 <212> PRT <213> Clostridium thermocellum <220> <223> Phosphoglucomutase <400> 9 Met Arg Ser Ser Ala Leu Tyr Lys Phe Trp Val Glu Asn Asp Tyr Phe 1 5 10 15 Asp Ala Glu Thr Lys Lys Glu Leu Leu Ser Ile Lys Asp Asn Pro 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gagtcttgga 240 ttgcaagaca ggggaatagc aattgcttat gattcccgtt acaaatcccc ggaatttgct 300 ttggaagctg ccaaggtttt tgcgggaaac ggcataaaag cgtttctttt tgatgaattg 360 agaccaacac cggaactttc ttttaccgta aggcatttaa atgcagctgc cggtgtggtt 420 attacggcga gccataatcc caaggagtat aatggataca aagtttatgg agaagacggg 480 ggacaacttc ctgtagaggc atcaaacaaa gttatatcct atataaataa aattgaggat 540 ataactcagg ttaaggttat ggaaaaggac gaagcgatag agaagggttt gctcaggatt 600 ataggcaagg aaattgacga tgagtatata tcgaaattaa aaactctttc tgcaaaccct 660 gaactggctg cagaaatagg caaaactttc aaaatagtgt acacgccgtt gcatggcgca 720 ggaaacaaac ctgtaagaag aatacttgac gaaattggat ttaaaaatgt acttgtggtc 780 aaagaacagg agcttccgga cagcgaattt tccacggtaa aatcacccaa tccggaggaa 840 agggaagcgt ttgagcttgc cattgagctg gcaaaaaaag aaaatgttga ccttatcata 900 ggtaccgacc ctgactgtga cagagtgggt attgtcgtaa gaaacaaaga aggcgagtat 960 gtgcctctta cgggtaatca gacgggttgt ttgctgcttg agtacatact gtctcaaaag 1020 aagcaaagag gagagcttcc tgaaaacgga tttgtcgtaa agacaatagt tacaacggag 1080 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atcaggtgaa gaacggaaag 420 cctgatccag agatatacct tctcgttctg gaaaggttga atgtggtccc agagaaggtt 480 gtggtcttcg aagactcaaa gagcggtgtt gaagccgcaa aaagcgccgg catagaaaga 540 atctatggag tcgttcactc tttgaacgac ggtaaagcgc ttcttgaagc gggtgcggtt 600 gctctggtga aacccgagga aatcctgaac gttctcaaag aggttcttta a 651 <210> 41 <211> 216 <212> PRT <213> Thermotoga naphthophila DSM 13996 <220> <223> Phosphatase-variant Y23HV45RP46TE47YG50L <400> 41 Met Glu Ala Val Ile Phe Asp Met Asp Gly Val Leu Met Asp Thr Glu 1 5 10 15 Pro Leu Tyr Phe Glu Ala His Arg Arg Val Ala Glu Ser Tyr Gly Lys 20 25 30 Pro Tyr Thr Glu Asp Leu His Arg Arg Ile Met Gly Arg Thr Tyr Arg 35 40 45 Glu Leu Leu Pro Ile Leu Met Glu Ala Leu Glu Ile Lys Asp Ser Leu 50 55 60 Glu Asn Phe Lys Lys Arg Val His Glu Glu Lys Lys Arg Val Phe Ser 65 70 75 80 Glu Leu Leu Lys Glu Asn Pro Gly Val Arg Glu Ala Leu Glu Phe Val 85 90 95 Lys Ser Lys Arg Ile Lys Leu Ala Leu Ala Thr Ser Thr Pro Gln Arg 100 105 110 Glu Ala Leu Glu Arg Leu Arg Arg Leu Asp Leu Glu Lys 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attgagaaga 360 ctcgatctcg aaaagtactt cgacgtcatg gtgttcggtg atcaggtgaa gaacggaaag 420 cctgatccag agatatacct tctcgttctg gaaaggttga atgtggtccc agagaaggtt 480 gtggtcttcg aagactcaaa gagcggtgtt gaagccgcaa aaagcgccgg catagaaaga 540 atctatggag tcgttcactc tttgaacgac ggtaaagcgc ttcttgaagc gggtgcggtt 600 gctctggtga aacccgagga aatcctgaac gttctcaaag aggttcttta a 651 <210> 43 <211> 216 <212> PRT <213> Thermotoga naphthophila DSM 13996 <220> <223> Phosphatase-variant Y23HV45RP46TE47TG50L <400> 43 Met Glu Ala Val Ile Phe Asp Met Asp Gly Val Leu Met Asp Thr Glu 1 5 10 15 Pro Leu Tyr Phe Glu Ala His Arg Arg Val Ala Glu Ser Tyr Gly Lys 20 25 30 Pro Tyr Thr Glu Asp Leu His Arg Arg Ile Met Gly Arg Thr Thr Arg 35 40 45 Glu Leu Leu Pro Ile Leu Met Glu Ala Leu Glu Ile Lys Asp Ser Leu 50 55 60 Glu Asn Phe Lys Lys Arg Val His Glu Glu Lys Lys Arg Val Phe Ser 65 70 75 80 Glu Leu Leu Lys Glu Asn Pro Gly Val Arg Glu Ala Leu Glu Phe Val 85 90 95 Lys Ser Lys Arg Ile Lys Leu Ala Leu Ala Thr Ser Thr Pro Gln Arg 100 105 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Gly Val Arg Glu Ala Leu Glu Phe Val 85 90 95 Lys Ser Lys Arg Ile Lys Leu Ala Leu Ala Thr Ser Thr Pro Gln Arg 100 105 110 Glu Ala Leu Glu Arg Leu Arg Arg Leu Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Met Val Phe Gly Asp Gln Val Lys Asn Gly Lys Pro Asp Pro Glu 130 135 140 Ile Tyr Leu Leu Val Leu Glu Arg Leu Asn Val Val Pro Glu Lys Val 145 150 155 160 Val Val Phe Glu Asp Ser Lys Ser Gly Val Glu Ala Ala Lys Ser Ala 165 170 175 Gly Ile Glu Arg Ile Tyr Gly Val Val His Ser Leu Asn Asp Gly Lys 180 185 190 Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ala Val Ala Leu Val Lys Pro Glu Glu Ile 195 200 205 Leu Asn Val Leu Lys Glu Val Leu 210 215 <210> 48 <211> 651 <212> DNA <213> Thermotoga naphthophila DSM 13996 <220> <223> coding for Phosphatase-variant Y23HV45MP46TE47FG50L <400> 48 atggaagcgg tgattttcga catggatgga gtgctcatgg acacagagcc tctctacttc 60 gaagctcaca gaagagtcgc ggaaagctat ggaaaacctt acacggagga tctccacagg 120 agaataatgg gaagtacttt cagagaattg cttcccatcc tcatggaagc tctggagata 180 aaagattctc tggagaactt caaaaagagg gtccacgaag aaaaaaagcg cgttttctct 240 gagcttctca aggaaaatcc gggtgtaaga gaggcgctcg agttcgtaaa gagcaaaaga 300 ataaaactcg cgctcgcaac ctccacacca cagcgagaag cgctggagag attgagaaga 360 ctcgatctcg aaaagtactt cgacgtcatg gtgttcggtg atcaggtgaa gaacggaaag 420 cctgatccag agatatacct tctcgttctg gaaaggttga atgtggtccc agagaaggtt 480 gtggtcttcg aagactcaaa gagcggtgtt gaagccgcaa aaagcgccgg catagaaaga 540 atctatggag tcgttcactc tttgaacgac ggtaaagcgc ttcttgaagc gggtgcggtt 600 gctctggtga aacccgagga aatcctgaac gttctcaaag aggttcttta a 651 <210> 49 <211> 216 <212> PRT <213> Thermotoga naphthophila DSM 13996 <220> <223> Phosphatase-variant Y23HV45QP46TE47FG50L <400> 49 Met Glu Ala Val Ile Phe Asp Met Asp Gly Val Leu Met Asp Thr Glu 1 5 10 15 Pro Leu Tyr Phe Glu Ala His Arg Arg Val Ala Glu Ser Tyr Gly Lys 20 25 30 Pro Tyr Thr Glu Asp Leu His Arg Arg Ile Met Gly Val Thr Tyr Arg 35 40 45 Glu Leu Leu Pro Ile Leu Met Glu Ala Leu Glu Ile Lys Asp Ser Leu 50 55 60 Glu Asn Phe Lys Lys Arg Val His Glu Glu Lys Lys Arg Val Phe Ser 65 70 75 80 Glu Leu Leu Lys Glu Asn Pro Gly Val Arg Glu Ala Leu Glu Phe Val 85 90 95 Lys Ser Lys Arg Ile Lys Leu Ala Leu Ala Thr Ser Thr Pro Gln Arg 100 105 110 Glu Ala Leu Glu Arg Leu Arg Arg Leu Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Met Val Phe Gly Asp Gln Val Lys Asn Gly Lys Pro Asp Pro Glu 130 135 140 Ile Tyr Leu Leu Val Leu Glu Arg Leu Asn Val Val Pro Glu Lys Val 145 150 155 160 Val Val Phe Glu Asp Ser Lys Ser Gly Val Glu Ala Ala Lys Ser Ala 165 170 175 Gly Ile Glu Arg Ile Tyr Gly Val Val His Ser Leu Asn Asp Gly Lys 180 185 190 Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ala Val Ala Leu Val Lys Pro Glu Glu Ile 195 200 205 Leu Asn Val Leu Lys Glu Val Leu 210 215 <210> 50 <211> 651 <212> DNA <213> Thermotoga naphthophila DSM 13996 <220> <223> coding for Phosphatase-variant Y23HV45QP46TE47FG50L <400> 50 atggaagcgg tgattttcga catggatgga gtgctcatgg acacagagcc tctctacttc 60 gaagctcaca gaagagtcgc ggaaagctat ggaaaacctt acacggagga tctccacagg 120 agaataatgg gacagacttt cagagaattg cttcccatcc tcatggaagc tctggagata 180 aaagattctc tggagaactt caaaaagagg gtccacgaag aaaaaaagcg cgttttctct 240 gagcttctca aggaaaatcc gggtgtaaga gaggcgctcg agttcgtaaa gagcaaaaga 300 ataaaactcg cgctcgcaac ctccacacca cagcgagaag cgctggagag attgagaaga 360 ctcgatctcg aaaagtactt cgacgtcatg gtgttcggtg atcaggtgaa gaacggaaag 420 cctgatccag agatatacct tctcgttctg gaaaggttga atgtggtccc agagaaggtt 480 gtggtcttcg aagactcaaa gagcggtgtt gaagccgcaa aaagcgccgg catagaaaga 540 atctatggag tcgttcactc tttgaacgac ggtaaagcgc ttcttgaagc gggtgcggtt 600 gctctggtga aacccgagga aatcctgaac gttctcaaag aggttcttta a 651 <210> 51 <211> 504 <212> PRT <213> Bifidobacterium adolescentis <220> <223> Sucrose Phosphorylase variant Q331ER393ND445PD446TQ460EE485H <400> 51 Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Thr Ile Lys Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly 20 25 30 Val Tyr Asp Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Glu Arg 50 55 60 Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Lys Thr His Asn Ile 65 70 75 80 Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Lys Gln Phe 85 90 95 Gln Asp Val Leu Ala Lys Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 100 105 110 Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu 115 120 125 Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys 130 135 140 Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln 145 150 155 160 Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Asp Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser 165 170 175 Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Ser Tyr Ile Arg Leu Asp 180 185 190 Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr 195 200 205 Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys 210 215 220 Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln 225 230 235 240 Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro 245 250 255 Pro Leu Leu Leu His Ala Leu Ser Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala 260 265 270 His Trp Thr Asp Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr 275 280 285 His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg 290 295 300 Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Val Asp Asn Leu Val Asn 305 310 315 320 Thr Ile His Ala Asn Thr His Gly Glu Ser Glu Ala Ala Thr Gly Ala 325 330 335 Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser 340 345 350 Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Ile Ala Ala Arg Ala Val Gln 355 360 365 Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala 370 375 380 Gly Lys Asn Asp Met Glu Leu Leu Asn Lys Thr Asn Asn Gly Arg Asp 385 390 395 400 Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Thr Ala Glu Ile Asp Glu Asn Leu Lys 405 410 415 Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Lys Phe Arg Asn Glu 420 425 430 Leu Asp Ala Phe Asp Gly Thr Phe Ser Tyr Thr Thr Pro Thr Asp Thr 435 440 445 Ser Ile Ser Phe Thr Trp Arg Gly Glu Thr Ser Glu Ala Thr Leu Thr 450 455 460 Phe Glu Pro Lys Arg Gly Leu Gly Val Asp Asn Thr Thr Pro Val Ala 465 470 475 480 Met Leu Glu Trp His Asp Ser Ala Gly Asp His Arg Ser Asp Asp Leu 485 490 495 Ile Ala Asn Pro Pro Val Val Ala 500 <210> 52 <211> 1515 <212> DNA <213> Bifidobacterium adolescentis <220> <223> coding for Sucrose Phosphorylase variant Q331ER393ND445PD446TQ460EE485H <400> 52 atgaagaaca aagtgcagct gattacctat gcagatcgtt taggtgatgg caccattaaa 60 agcatgaccg atattctgcg tacccgtttt gatggtgtgt atgatggtgt tcatatcctg 120 ccgtttttta ccccgtttga tggcgcagat gcaggttttg atccgattga tcataccaaa 180 gtggatgaac gtttaggtag ctgggatgat gttgcagaac tgagcaaaac ccataacatt 240 atggttgatg ccattgtgaa tcacatgagc tgggaaagca aacagtttca ggatgttctg 300 gcaaaaggtg aagaaagcga atattatccg atgtttctga ccatgagcag cgtttttccg 360 aatggtgcaa ccgaagaaga tctggcaggt atttatcgtc cgcgtccggg tctgccgttt 420 acacattaca aatttgcagg taaaacccgt ctggtttggg ttagctttac accgcagcag 480 gttgatattg ataccgatag cgataaaggt tgggaatatc tgatgagcat ctttgatcag 540 atggcagcaa gccatgttag ctatattcgt ctggatgcag ttggttatgg tgcaaaagaa 600 gcaggcacca gctgttttat gaccccgaaa acctttaaac tgattagccg tctgcgtgaa 660 gaaggtgtta aacgcggtct ggaaattctg attgaagtgc acagctacta caagaaacag 720 gttgaaattg ccagcaaagt tgatcgcgtt tatgattttg cactgcctcc gctgctgctg 780 catgcactga gcaccggtca tgttgaaccg gttgcacatt ggacagatat tcgtccgaat 840 aatgcagtta ccgttctgga tacccatgat ggtattggtg ttattgatat tggtagcgat 900 cagctggatc gtagcctgaa aggtctggtt ccggatgaag atgttgataa tctggtgaat 960 accattcatg ccaatacaca tggtgaaagc gaggcagcaa ccggtgcagc agccagcaat 1020 ctggatctgt atcaggttaa tagcacctat tatagcgcac tgggttgtaa cgatcagcat 1080 tatattgcag cacgtgccgt tcagtttttt ctgcctggtg ttccgcaggt ttattatgtt 1140 ggtgcactgg caggcaaaaa tgatatggaa ctgctgaata aaaccaataa cggtcgtgat 1200 attaaccgcc attattacag caccgcagaa attgatgaaa atctgaaacg tccggttgtg 1260 aaagcactga atgcactggc caaatttcgc aatgaactgg atgcatttga tggcacattt 1320 agctatacca cccctactga taccagcatt tcatttacct ggcgtggtga aaccagcgag 1380 gcgaccctga cctttgaacc gaaacgtggt ctgggcgttg ataataccac accggtggca 1440 atgctggaat ggcacgatag tgccggtgat catcgtagtg atgatctgat tgcaaatccg 1500 cctgttgttg cataa 1515

Claims (15)

  1. 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류(polysaccharide)를 과당(fructose)으로 전환시키는 방법으로서,
    a) 물, 포스페이트 및 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하는 조성물에 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소를 첨가하는 단계, 및
    b) 후속적으로 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소의 존재 하에 과당으로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하며,
    단계 a)에서 적어도 하나의 추가적인 당류가 첨가되고, 적어도 하나의 추가적인 당류는 20개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합, 바람직하게는 17개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합을 포함하는 당류로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
    단계 a)에서 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소는 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소, 가수분해효소, 포스파타제 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 그리고
    단계 a)에서 적어도 하나의 효소는 포스파타제인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 a)에서 적어도 하나의 추가적인 당류는 십사당류, 십삼당류, 십이당류, 십일당류, 십당류, 구당류, 팔당류, 칠당류, 육당류, 오당류, 사당류, 삼당류, 이당류 및/또는 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 사당류, 삼당류, 이당류 및/또는 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스 및 이것들의 조합으로부터 선택되고/거나;
    단계 a)에서 조성물은 건조 중량 기준으로 35% 이하의 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하고/거나;
    적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류는 글루코스 기반 올리고- 및/또는 다당류로부터, 바람직하게는 전분 및 그것의 유도체, 헤미셀룰로스 및 그것의 유도체, 셀룰로스 및 그것의 유도체 및/또는 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고/거나;
    단계 a)에서 적어도 6개의 효소가 조성물에 첨가되고/거나;
    적어도 하나의 추가적인 당류는 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류와 적어도 부분적으로 동일한 글리코시드 결합을 가지는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    바람직하게는 단계 b)에서 당 포스페이트는 중간에 생성되고/거나;
    단계 b)에서 효소적 전환은 원 포트(one-pot) 반응이고/거나;
    포스파타제는 서열번호: 13에 따르는 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 보다 바람직하게는 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)에서 적어도 하나의 트랜스퍼라제, 바람직하게는 글리코실트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 글루카노트랜스퍼라제, 보다 더 바람직하게는 알파-글루카노트랜스퍼라제가 첨가되고/거나;
    단계 a)에서 적어도 하나의 포스포릴라제, 바람직하게는 글루칸포스포릴라제가 첨가되고/거나;
    단계 a)에서 적어도 하나의 뮤타제, 바람직하게는 포스포글루코뮤타제가 첨가되고/거나;
    단계 a)에서 적어도 하나의 이성질화효소, 바람직하게는 포스포글루코이성질화효소가 첨가되고/거나;
    단계 a)에서 적어도 하나의 가수분해효소, 바람직하게는 글루카노가수분해효소, 보다 바람직하게는 풀루라나제가 첨가되는 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)는 적어도 24시간 동안 실온(25℃)에서 수행되는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)의 조성물에 존재하는 당류의 적어도 50%는 24시간의 효소적 전환 후에 과당으로 전환되고/거나;
    단계 a)의 조성물에 존재하는 당류의 적어도 70%는 48시간의 효소적 전환 후에 과당으로 전환되는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)에서 온도는 10 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 90℃이고/거나;
    조성물의 pH는 3 내지 12, 바람직하게는 4 내지 10인 것인, 방법.
  8. 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 과당으로 전환시키기 위한 조성물로서,
    - 물;
    - 포스페이트;
    - 적어도 하나의 효소는 포스파타제인, 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소;
    - 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류를 포함하며;
    적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소는 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소, 가수분해효소, 포스파타제 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 그리고
    조성물은 추가로 적어도 하나의 추가적인 당류를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 당류는 20개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합, 바람직하게는 17개 이하의 단당류 잔기 및/또는 이것들의 조합을 포함하는 당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    포스파타제는 서열번호: 41에 따르는 서열과 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 98.5% 및 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가지는 것인, 조성물.
  10. 수성 조성물로서,
    - 건조 중량 기준으로 적어도 50%의 과당;
    - 건조 중량 기준으로 0.001 내지 25%의 글루코스;
    - 건조 중량 기준으로 0.01 내지 22%의 포스페이트; 및
    - 건조 중량 기준으로 0.001 내지 2%의 적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소를 포함하며,
    적어도 4개의 효소, 바람직하게는 적어도 5개의 효소는 트랜스퍼라제, 포스포릴라제, 뮤타제, 이성질화효소, 가수분해효소, 포스파타제 및 이것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 그리고
    적어도 하나의 효소는 포스파타제인, 수성 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    포스파타제는 서열번호: 41에 따르는 서열과 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 98.5% 및 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    포스파타제는 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가지는 것인, 수성 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 제1항 내지 제7항에 따르는 방법에 의해 얻을 수 있는 것인 수성 조성물.
  13. 서열번호: 41에 따르는 서열과 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98.5% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 포스파타제.
  14. 제13항에 있어서, 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 35, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 47, 또는 서열번호: 49에 따르는 아미노산 서열을 가지는 것인, 포스파타제.
  15. 적어도 하나의 올리고- 및/또는 다당류의 과당으로의 전환에서 제13항 또는 제14항에 따르는, 포스파타제의 용도.
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