KR20130094808A - 당류 및 글리코시다아제를 사용하여 아크릴레이트 유도체의 글리코시드를 제조하는 방법 - Google Patents

당류 및 글리코시다아제를 사용하여 아크릴레이트 유도체의 글리코시드를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

하기 화학식 I의 에틸렌계 불포화 글리코시드는,
(i) 하기 화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올 대 하기 화학식 III의 당류의 몰비 2:1 내지 30:1로;
(ii) 물 대 유기 용매의 중량비가 0.1:1 내지 9:1인 물, 및 1차 또는 2차 알코올이 아닌 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 아세톤, 아세토니트릴, t-펜탄올, t-부탄올, 1,4-디옥산 및 테트로히드로푸란의 용매 혼합물의 존재 하에; 그리고
(iii) 용매 혼합물 대 당류의 중량비 3:1 내지 30:1로,
글리코시다아제, 예를 들어 아밀라아제, 셀룰라아제, 글루코시다아제 또는 갈락토시다아제의 존재 하에 하기 화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올을 하기 화학식 III의 당류와 반응시켜 제조된다.
<화학식 I>
Figure pct00012

<화학식 II>
Figure pct00013

<화학식 III>

상기 식 중, n, A, X, R3 및 R4는 명세서에 제시된 의미를 갖는다.

Description

당류 및 글리코시다아제를 사용하여 아크릴레이트 유도체의 글리코시드를 제조하는 방법 {PROCESS FOR PRODUCING GLYCOSIDES OF ACRYLATE DERIVATIVES EMPLOYING SACCHARIDES AND GLYCOSIDASES}
본 발명은 글리코시다아제의 존재 하에 에틸렌계 불포화 알코올을 당류와 반응시켜 에틸렌계 불포화 글리코시드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
당 잔기를 포함하는 중합체 (당류 공중합체)는 당류의 전형적인 특성, 예를 들어 양호한 수용해도, 높은 전해질 안정성, 뜨거운 물에서의 콜로이드 안정성, 목화와 같은 표면과의 강한 상호작용 및 비-독성을 공유할 수 있다. 이러한 구체적인 특성은 이러한 중합체에 대해 다양한 응용 분야를 열어준다. 따라서, 잘 정의된 당류 공중합체 및 그의 각각의 단량체의 비용 효과적인 제조 방법을 개발하는 것이 큰 관심사이다. 이러한 단량체는 글리코시드 커플링에 의해 당류 및 에틸렌계 불포화 알코올이 발생하는 중합성 에틸렌계 불포화 글리코시드일 수 있다. 이러한 글리코시드의 합성은 많은 도전 과제들을 포함한다. 당류의 상이한 히드록시 기가 결합 형성에 관여하게 되는 위치 이성질체의 형성에 대한 많은 가능성이 존재한다. 또한, 상이한 아노머 형태의 형성 가능성이 있다. 따라서, 당 잔기를 갖는 대부분의 단량체의 화학적 합성은 일반적으로 실현 가능하지 않고 목적 단량체를 낮은 수율로 얻게 된다.
효소의 이용은 글리코시드 단량체를 제조하기 위한 별도의 접근법으로서 고려되어 왔다. 화학적 합성과는 대조적으로, 보통 비보호된 당의 효소-촉매화 반응은 그의 높은 입체선택성으로 인해 훨씬 더 구조적으로 균일한 생성물을 산출한다.
일반적으로, 글리코시드의 효소적 합성을 위해서 사용되는 두 가지 접근법이 있다: 열역학적으로 제어된 역 가수분해 및 동역학적으로 제어된 글리코실 전달 반응 (transglycosylation). 글리코실 단위를 효소적 촉매화 글리코실 전달 반응에 의해 1차 히드록시 기를 갖는 당이 아닌 화합물에 전달하는 것은, 예를 들어 문헌 [S. Matsumura et al., Makromol. Chem., Rapid Commun. 14:55-58, 1993]에 제시되어 있다. 또한, 역 가수분해에 의한 글리코시드 합성을 위한, 생체내 글리코시드 가수분해를 촉매화하는 글리코시다아제를 사용하는 접근법이 있다 (예를 들어, 문헌 [I. Gill and R. Valivety, Angew. Chem. Int. Ed. 39(21):3804-3808, 2000] 참조).
글리코시드의 글리코시다아제 촉매화 합성 방법을 개발하면서, 최적의 용매 조건을 발견하는데 어려움을 접하였다. 반면, 열역학적으로 제어된 역 가수분해를 촉진하려면 물 함량, 또는 열역학적 수분 활성 aw을 최소화해야 한다. 다른 한편으로는, 일반적으로 쉽게 수용성인 당류는 종종 유기 매질에는 거의 가용성이 아니다. 물을 중간 극성의 무수 용매로 대체하는 것이 두 요구 모두를 충족시키는 방식으로서 제안되었다. 그러나, 통상적으로 적용되는 글리코시다아제는 활성을 유지하기 위해서 적어도 어느 정도의 물이 분명히 필요하다는 것이 제시되었다 (문헌 [F. van Rantwijk et al., J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 6:511-532, 1999]). 이러한 여러 용매 요건을 충족시키는 것은 어렵다. 이것은 효소적 글리코시드 합성에 대한 공지된 방법이 일반적으로 요구하는 승온 및 긴 반응 시간에 반영된다.
따라서, 에틸렌계 불포화 글리코시드의 효소적 제조를 위한 보다 효과적인 방법을 개발하는 것이 본 발명의 목적이다. 상기 목적은 반응 속도를 증가시키고/거나 반응 평형을 글리코시드 합성에 유리한 쪽으로 이동시켜 달성할 수 있다. 따라서, 특정 반응 시간 후 및/또는 평형에 도달되면 더 많은 양의 생성물이 얻어진다.
본 발명자들은 뜻밖에 비-반응성의 수혼화성 유기 용매를 당류, 에틸렌계 불포화 알코올, 글리코시다아제 및 물을 포함하는 반응 혼합물에 첨가하면 특정 반응 시간 후 얻어지는 에틸렌계 불포화 글리코시드의 양을 유의하게 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은
(i) 하기 화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올 대 하기 화학식 III의 당류의 최초 몰비 2:1 내지 30:1, 예를 들어 15:1 내지 25:1로;
(ii) 물 대 유기 용매의 중량비가 0.1:1 내지 9:1, 예를 들어 1:1 내지 3:1인 물, 및 1차 또는 2차 알코올이 아닌 수혼화성 유기 용매의 용매 혼합물의 존재 하에; 그리고
(iii) 용매 혼합물 대 당류의 초기 중량비 3:1 내지 30:1, 예를 들어 10:1 내지 20:1로,
글리코시다아제의 존재 하에 하기 화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올을 하기 화학식 III의 당류와 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 I의 에틸렌계 불포화 글리코시드의 제조 방법을 제공한다.
<화학식 I>
Figure pct00001
<화학식 II>
Figure pct00002
<화학식 III>
Figure pct00003
상기 식 중,
n은 1, 2 또는 3이고;
A는 C2 -20 알킬렌 또는 -R6-O-[-R6-O-]x-C2 -20 알킬렌이며;
X는 -O-, -NH- 및 -NR5-로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R3은 -H 및 C1 -10 알킬로 구성되는 군으로부터 선택되며;
R4는 -H, -COOH 및 -COO-M+로 구성되는 군으로부터 선택되고;
R5는 C1-10 알킬이며;
R6은 -H 또는 -CH3이고;
M+은 Li+, Na+, K+ 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택되며;
x는 0 내지 200의 정수이다.
정의
본원에서 사용된 용어 "단당류"는 5개의 탄소 원자 및 1개의 산소 원자의 6-원 고리를 포함하는 구조의 분자내 헤미아세탈을 형성하는 폴리히드록시알데히드의 단일 단위를 가리킨다. 단당류는 상이한 부분입체이성질체 형태, 예를 들어 α 또는 β 아노머, 및 D 또는 L 이성질체로 존재할 수 있다. "올리고당류"는 공유결합으로 연결된 단쇄의 단당류 단위로 구성된다. 올리고당류는 2개의 단당류 단위를 포함하는 이당류뿐만 아니라 3개의 단당류 단위를 포함하는 삼당류를 포함한다. "다당류"는 공유결합으로 연결된 장쇄의 단당류 단위로 구성된다.
용어 "글리코시드 결합" 또는 "글리코시드 연결 (linkage)"은 당류 또는 당류 유도체 (글리콘 (glycone))의 아노머 히드록시 기 및 또다른 당류 또는 비-당류 유기 화합물 (아글리콘 (aglycone)), 예를 들어 알코올의 히드록시 기 사이에 형성되는 일종의 화학 결합 또는 연결이다. 이당류 또는 다당류의 환원 말단은 구조의 마지막 아노머 탄소를 향해 놓이고, 종결 말단은 그 반대 방향에 있는다.
본원에서 사용된 "효소적 촉매화" 또는 "생촉매 (biocatalytic)" 방법은 상기 방법이 효소의 촉매 작용, 특히 글리코시다아제의 촉매 작용 하에 실시되는 것을 의미한다. 단리된 형태 (정제된 형태, 농축된 형태) 또는 조질 형태의 상기 글리코시다아제의 존재 하에 상기 방법을 실시할 수 있다.
또한, 용어 "글리코시다아제"는 글리코시다아제의 변이체, 돌연변이체 및 효소적 활성 부분을 포함한다.
효소의 촉매량은 "U" ("유닛 (unit)")로 표현되고, 여기서 1 U는 특정 조건 (보통 37℃ 및 pH 7.5) 하에서 1분 당 기질 1 μmol의 반응을 촉매화하는 효소의 양과 동일하다. 따라서, 글리코시다아제 10 U는 1분 당 당류 기질 10 μmol의 반응을 위해서 필요한 효소의 촉매량과 동일하다. 말토게닉 아밀라아제의 촉매량은 "MANU" (말토게닉 아밀라아제 노보 유닛 (Maltogenic Amylase Novo Unit))로 표현할 수 있고, 여기서 1 MANU는 표준 조건 (말토트리오스 10 mg/ml, 37℃, pH 5.0, 반응 시간 30분) 하에서 1분 당 말토트리오스 1 μmol의 반응을 위해서 필요한 효소의 촉매량과 동일하다. 당업계에 널리 공지된 방법으로 효소의 촉매량을 측정할 수 있다.
용어 "알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 라디칼인 C1-10 알킬 라디칼을 포함한다. 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 헥실, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,2,2-트리메틸프로필, 1-에틸-1-메틸프로필, 1-에틸-2-메틸프로필, 헵틸, 옥틸, 노닐 및 데실뿐만 아니라 이들의 구조 이성질체, 예를 들어 2-에틸헥실이 있다.
용어 "알킬렌"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 디라디칼 (diradical)인 C2 -20 알킬렌 디라디칼을 포함한다.
용어 "에틸렌계 불포화"는 비-방향족 C=C 이중 결합을 포함하는 화합물을 가리킨다. 구체적으로는, 본원에서 사용된 "에틸렌계 불포화 글리코시드"는 에틸렌계 불포화 알코올에 글리코시드로 연결된 당류로 구성되는 글리코시드를 가리킨다.
"수혼화성 유기 용매"는 물 대 유기 용매의 사용 중량비에서 물과 균일한 혼합물을 형성하는 유기 용매를 의미하는 것으로 해석된다.
유기 용매는 1차 또는 2차 알코올이 아니고, 따라서 당류에 비반응성이다. 일반적으로, 유기 용매는 알칸온, 알킬니트릴, 3차 알코올 및 시클릭 에테르, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
바람직한 용매는 아세톤, 아세토니트릴, t-펜탄올, t-부탄올, 1,4-디옥산 및 테트라히드로푸란, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 1,4-디옥산이 특히 바람직하다.
화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올은 히드록시알킬 (메트)아크릴레이트, N-히드록시알킬 (메트)아크릴아미드 또는 말레산의 모노(히드록시알킬) 에스테르 또는 그의 염으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올은 상기 에틸렌계 불포화 알코올의 에톡시화 유도체, 프로폭시화 유도체, 또는 에톡시화되고 프로폭시화된 유도체이다.
바람직한 화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올은 2-히드록시에틸 아크릴레이트, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 3-히드록시프로필 아크릴레이트, 3-히드록시프로필 메타크릴레이트, N-(2-히드록시에틸) 아크릴아미드, N-(2-히드록시에틸) 메타크릴아미드, N-(3-히드록시프로필) 아크릴아미드, N-(3-히드록시프로필 메타크릴아미드, (2-히드록시에틸) 하이드로젠 말레에이트로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, n은 1이고, A는 C2 -6 알킬렌이며, X는 -O-이고, R3은 -H 또는 -CH3이다.
당류는 단당류, 예를 들어 글루코스, 갈락토스 또는 만노스, 이당류, 예를 들어 말토스, 락토스 또는 셀로비오스, 삼당류, 예를 들어 말토트리오스, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 방법은, 예를 들어 당류의 1번 위치의 탄소 원자 (C-1)에 에테르 결합으로 연결된 o-니트로페닐 기 또는 알킬 기의 존재에 의해, 당류가 활성화되는 것을 요구하지 않는다. 적합하게는, 당류는 D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에서, 당류와 에틸렌계 불포화 알코올의 반응은 글리코시드 히드롤라아제로도 공지된 유형의 효소인 글리코시다아제에 의해 촉매화된다. 전형적으로, 효소는 효소가 촉매화하는 반응, 이러한 반응에 관여하는 기질에 대한 높은 특이성을 나타낸다. 글리코시다아제는 O- 및 S-글리코시드 화합물의 가수분해를 촉매화할 수 있는 효소이다. 또한, 반응 평형 위치가 역전되는 역 가수분해 또는 글리코시드 모이어티 (moiety)가 하나의 글리코시드, 즉 공급체 (donor) 글리코시드로부터 또다른 글리코시드, 즉 수용체 (acceptor) 글리코시드로 전달되어 새로운 글리코시드를 형성하는 글리코실 전달 반응을 통해 글리코시드 결합의 형성을 촉매화하기 위해서 글리코시다아제를 사용할 수 있다. 글리코시다아제에는 효소 분류 번호 EC 3.2.1.x가 부여되어 있다.
글리코시다아제는 정제된 형태로, 농축된 농축물로서 또는 조질 효소 제제로서 사용될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 방법에 존재하는 글리코시다아제는 아밀라아제, 셀룰라아제, 글루코시다아제 및 갈락토시다아제로 구성되는 군으로부터 선택된다.
α-아밀라아제는 효소 분류 번호 EC 3.2.1.1이 부여된 효소이며, 또한 글리코게나아제, 엔도아밀라아제, 타카 (Taka)-아밀라아제 A 또는 1,4-α-D-글루칸 글루카노히드롤라아제로도 공지되어 있다. α-아밀라아제는 3개 이상의 (1→4)-α-연결된 D-글루코스 단위를 함유하는 다당류, 예를 들어 전분 및 글리코겐에서 (1→4)-α-D-글루코시드 연결의 엔도가수분해 (endohydrolysis)를 촉매화함으로써 α-배열에서 환원성 기를 방출할 수 있다.
β-아밀라아제는 효소 분류 번호 EC 3.2.1.2가 부여된 효소이며, 또한 당생성 (saccharogen) 아밀라아제, 글리코게나아제 또는 1,4-α-D-글루칸 말토히드롤라아제로도 공지되어 있다. β-아밀라아제는 다당류, 예를 들어 전분 및 글리코겐에서 (1→4)-α-D-글루코시드 연결의 가수분해를 촉매화함으로써 다당류 쇄의 비-환원 말단으로부터 연속적인 β-말토스 단위를 방출할 수 있다.
셀룰라아제는 효소 분류 번호 EC 3.2.1.4가 부여된 효소이며, 또한 엔도-1,4-β-D-글루카나아제, β-1,4-글루카나아제, β-1,4-엔도글루칸 히드롤라아제, 셀루아제 (celluase) A, 셀룰로신 (cellulosin) AP, 엔도글루카나아제 D, 알칼리 셀룰라아제, 셀룰라아제 A 3, 셀루덱스트리나아제, 9.5 셀룰라아제, 아비셀라아제 (avicelase), 판셀라아제 (pancellase) SS 또는 1,4-(1,3;1,4)-β-D-글루칸 4-글루카노히드롤라아제로도 공지되어 있다. 셀룰라아제는 셀룰로스, 리케닌 및 곡류 β-D-글루칸에서 (1→4)-β-D-글루코시드 연결의 엔도가수분해뿐만 아니라 1,3-연결도 함유하는 β-D-글루칸에서의 1,4-연결의 엔도가수분해를 촉매화할 수 있다.
α-글루코시다아제는 효소 분류 번호 EC 3.2.1.20이 부여된 효소이며, 또한 말타아제, 글루코인베르타아제, 글루코시도수크라아제, 말타아제-글루코아밀라아제, α-글루코피라노시다아제, 글루코시도인베르타아제, α-D-글루코시다아제, α-글루코시드 히드롤라아제 또는 α-1,4-글루코시다아제로도 공지되어 있다. α-글루코시다아제는 종결 비-환원 (1→4)-연결된 α-D-글루코스 잔기의 가수분해를 촉매화함으로써 α-D-글루코스를 방출할 수 있다.
β-글루코시다아제는 효소 분류 번호 EC 3.2.1.21이 부여된 효소이며, 또한 젠티오비아제, 셀로비아제, 에멀신, 엘라터라아제, 아릴-β-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, β-글루코시드 글루코히드롤라아제, 아르부티나아제, 아미그달리나아제, p-니트로페닐 β-글루코시다아제, 프리메베로시다아제, 아미그달라아제, 리마라아제, 살리실리나아제 또는 β-1,6-글루코시다아제로도 공지되어 있다. β-글루코시다아제는 종결 비-환원 β-D-글루코실 잔기의 가수분해를 촉매화함으로써 β-D-글루코스를 방출할 수 있다.
α-갈락토시다아제는 효소 분류 번호 EC 3.2.1.22가 부여된 효소이며, 또한 멜리비아제, α-D-갈락토시다아제, α-갈락토시다아제 A 또는 α-갈락토시드 갈락토히드롤라아제로도 공지되어 있다. α-갈락토시다아제는 갈락토스 올리고당류 및 갈락토만난을 포함하는 α-D-갈락토시드의 종결 비-환원 α-D-갈락토스 잔기의 가수분해를 촉매화할 수 있다.
β-갈락토시다아제는 효소 분류 번호 EC 3.2.1.23이 부여된 효소이며, 또한 락타아제, β-락토시다아제, 막시락트 (maxilact), 히드롤락트 (hydrolact), β-D-락토시다아제, S 2107, 락토짐 (lactozym), 트리락타아제, β-D-갈락타나아제, 오리자팀 (oryzatym) 또는 수미클라트 (sumiklat)로도 공지되어 있다. β-갈락토시다아제는 β-D-갈락토시드의 종결 비-환원 β-D-갈락토스 잔기의 가수분해를 촉매화할 수 있다.
본 발명의 방법에 적합한 글리코시다아제의 조질 형태는 과일 씨 미일 (fruit seed meal)이다. 과일 씨 미일은 비용 효과적인 방식으로 쉽게 제조할 수 있는 강력하고 재생가능한 촉매이다. 과일 씨 미일의 제조 및 구체적인 촉매 활성은 문헌 [Lu et al., Practical methods for Biocatalysts, Whittall and Satton (eds.), Wiley, 2010, chapter 7.3, pages 236-239]에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 과일 씨 미일은 프루누스 둘시스 (Prunus dulcis) (아몬드) 커널 (kernel) 미일, 프루누스 페르시카 (Prunus persica) (복숭아) 커널 미일, 프루누스 아르메니아카 (Prunus armeniaca) (살구) 커널 미일, 말루스 푸밀라 (Malus pumila) (사과) 씨 미일 및 에리오보트리아 자포니카 (Eriobotrya japonica) (비파) 씨 미일을 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 과일 씨 미일은 프루누스 둘시스 커널 미일, 프루누스 페르시카 커널 미일 및 말루스 푸밀라 씨 미일로 구성되는 군으로부터 선택된다.
효소는 반응 혼합물에 용해되거나 또는 반응 혼합물과 접촉하는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 효소가 고정되는 경우, 효소는 불활성 운반체에 부착된다. 적합한 운반체 물질은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 운반체 물질의 예로는 점토, 점토 광물, 예를 들어 고령토, 규조토, 펄라이트 (perlite), 실리카, 알루미나, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 셀룰로스 분말, 음이온 교환 물질, 합성 중합체, 예를 들어 폴리스티렌, 아크릴 수지, 페놀 포름알데히드 수지, 폴리우레탄 및 폴리올레핀, 예를 들어 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌이 있다. 운반체-결합된 효소를 제조하기 위해서, 운반체 물질은 보통 미세 분말의 형태로 사용되고, 다공성 형태가 바람직하다. 운반체 물질의 입자 크기는 보통 5 mm, 특히 2 mm를 초과하지 않는다. 또한, 적합한 운반체 물질은 칼슘 알기네이트 및 카라기닌이다. 효소는 글루타르알데히드에 의해 직접적으로 연결될 수 있다. 광범위한 고정화 방법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim]).
효소적 촉매화 반응을 배치식, 반배치식 또는 연속식으로 실시할 수 있다. 반응물을 반응 초기에 공급할 수 있거나 또는 그 후에, 반연속식으로 또는 연속식으로 공급할 수 있다. 본 발명의 방법을 위해서 요구되는 글리코시다아제의 촉매량은 반응 조건, 예를 들어 온도, 용매 및 기질의 양에 좌우된다.
물과 상기 기재된 수혼화성 유기 용매의 용매 혼합물에서 반응을 실시한다. 반응 혼합물은 pH를 6.0 내지 9.0의 값, 예를 들어 6.5 내지 8.0의 범위, 예를 들어 7.0 내지 7.8의 범위로 조정하기 위해서 적합한 완충액을 추가로 포함할 수 있으나, 반드시 포함해야 하는 것은 아니다. 적합한 완충액은 나트륨 아세테이트, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 ("트리스") 및 포스페이트 완충액을 포함하나, 여기에 제한되는 것은 아니다.
반응물, 즉 당류 및 에틸렌계 불포화 화합물의 농도는 최적 반응 조건에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 초기 당류 농도는 100 mM 내지 3000 mM, 예를 들어 200 mM 내지 500 mM일 수 있다. 하나의 반응물, 즉 에틸렌계 불포화 알코올을 몰 과량으로 사용하여 반응 평형을 생성물 쪽으로 이동시킨다.
적용되는 특정 효소에 따라 결정될 수 있는 최적 반응 조건에 반응 온도를 맞출 수 있다. 반응은 편의상 반응 혼합물의 어는점과 효소의 변성 온도 사이의 온도에서 수행할 수 있다. 변성 온도에 도달하면 효소의 촉매 활성이 사라진다. 예를 들어, 0℃ 내지 80℃, 예를 들어 40℃ 내지 60℃ 범위, 또는 약 50℃의 온도에서 반응을 실시할 수 있다.
반응물과 생성물간 평형이 달성될 때까지 공정을 진행할 수 있으나, 이보다 조기에 중단할 수도 있다. 공정 시간은 보통 6시간 내지 96시간 범위, 예를 들어 약 24시간이다.
또한, 본 발명의 방법은 생산된 에틸렌계 불포화 글리코시드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 용어 "회수"는 반응 혼합물로부터 화합물을 추출, 수확, 단리 또는 정제하는 것을 포함한다. 화합물의 회수는 통상의 수지 (예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비-이온성 흡착 수지 등)로의 처리, 통상의 흡착제 (예를 들어, 활성탄, 규산, 실리카 겔, 셀룰로스, 알루미나 등)로의 처리, pH의 변경, 용매 추출 (예를 들어, 통상의 용매, 예를 들어 알코올, 에틸 아세테이트, 헥산 등 사용), 증류, 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정, 동결건조 등을 비롯한, 그러나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 통상의 단리 또는 정제 방법에 따라 실시할 수 있다.
단리된 생성물의 정체성 및 순도는 박층 크로마토그래피 (TLC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 가스 크로마토그래피 (GC), 분광법 (예를 들어, IR, UV, NMR 분광법), 착색 방법, NIRS 또는 효소적 검정과 같은 공지의 기술로 측정할 수 있다.
하기 기재한 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명을 설명하기 위한 것이다.
실시예 1: D-글루코스로부터의 2-(β-글루코실옥시)-에틸 아크릴레이트의 β-글루코시다아제 촉매화 합성
D(+)-글루코스 1.0 g을 물 2 ml에 용해시켰다. 2-히드록시에틸 아크릴레이트 (MEHQ 200 ppm 함유) 12 ml 및 1,4-디옥산 1 ml를 글루코스 용액에 첨가하였다. 아몬드로부터의 β-글루코시다아제 0.070 g (364 U)을 첨가하여 반응을 개시하였다. 50℃에서 24시간 동안 반응 혼합물을 교반하였다. 박층 크로마토그래피 (TLC) (클로로포름/메탄올 4/1 (v/v), Rf 0.55)로 생성물을 검출하고, 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 용리제: 클로로포름/메탄올 7/1 (v/v))로 생성물을 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 모으고 회전 증발에 의해 용매를 제거하였다.
수율: 0.459 g (46%). 순도: 99%.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 2: D-글루코스로부터의 2-(β-글루코실옥시)-에틸 메타크릴레이트의 β-글루코시다아제 촉매화 합성
D(+)-글루코스 1.0 g을 물 2 ml에 용해시켰다. 2-히드록시에틸 메타크릴레이트 (MEHQ 200 ppm 함유) 12 ml 및 1,4-디옥산 1 ml를 글루코스 용액에 첨가하였다. 아몬드로부터의 β-글루코시다아제 0.070 g (364 U)을 첨가하여 반응을 개시하였다. 50℃에서 24시간 동안 반응 혼합물을 교반하였다. TLC (클로로포름/메탄올 4/1 (v/v), Rf 0.59)로 생성물을 검출하고, 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 용리제: 클로로포름/메탄올 7/1 (v/v))로 생성물을 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 모으고 회전 증발에 의해 용매를 제거하였다.
수율: 0.514 g (51%). 순도: 97%
Figure pct00006
실시예 3: D-글루코스로부터의 4-(β-글루코실옥시)-부틸 아크릴레이트의 β-글루코시다아제 촉매화 합성
D(+)-글루코스 1.0 g을 물 2 ml에 용해시켰다. 4-히드록시부틸 아크릴레이트 (MEHQ 200 ppm 함유) 12 ml 및 1,4-디옥산 1 ml를 글루코스 용액에 첨가하였다. 아몬드로부터의 β-글루코시다아제 0.070 g (364 U)을 첨가하여 반응을 개시하였다. 50℃에서 24시간 동안 반응 혼합물을 교반하였다. TLC (클로로포름/메탄올 4/1 (v/v), Rf 0.69)로 생성물을 검출하고, 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 용리제: 클로로포름/메탄올 7/1 (v/v))로 생성물을 정제하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 모으고 회전 증발에 의해 용매를 제거하였다.
수율: 0.310 g (31%). 순도 (85% 초과)
Figure pct00007
Figure pct00008

Claims (6)

  1. (i) 하기 화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올 대 하기 화학식 III의 당류의 몰비 2:1 내지 30:1로;
    (ii) 물 대 유기 용매의 중량비가 0.1:1 내지 9:1인 물, 및 1차 또는 2차 알코올이 아닌 수혼화성 유기 용매의 용매 혼합물의 존재 하에; 그리고
    (iii) 용매 혼합물 대 당류의 중량비 3:1 내지 30:1로,
    글리코시다아제의 존재 하에 하기 화학식 II의 에틸렌계 불포화 알코올을 하기 화학식 III의 당류와 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 I의 에틸렌계 불포화 글리코시드의 제조 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00009

    <화학식 II>
    Figure pct00010

    <화학식 III>
    Figure pct00011

    상기 식 중,
    n은 1, 2 또는 3이고;
    A는 C2 -20 알킬렌 또는 -R6-O-[-R6-O-]x-C2 -20 알킬렌이며;
    X는 -O-, -NH- 및 -NR5-로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    R3은 -H 및 C1 -10 알킬로 구성되는 군으로부터 선택되며;
    R4는 -H, -COOH 및 -COO-M+로 구성되는 군으로부터 선택되고;
    R5는 C1 -10 알킬이며;
    R6은 -C2H4- 또는 -C3H6-이고;
    M+은 Li+, Na+, K+ 및 NH4 +로 구성되는 군으로부터 선택되며;
    x는 0 내지 200의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 유기 용매가 알칸온, 알킬니트릴, 3차 알코올 및 시클릭 에테르, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 용매가 아세톤, 아세토니트릴, t-펜탄올, t-부탄올, 1,4-디옥산 및 테트라히드로푸란, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, A가 C2 -6 알킬렌이고, X가 -O-이며, R3이 -H 또는 -CH3인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 당류가 D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스, 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코시다아제가 아밀라아제, 셀룰라아제, 글루코시다아제 및 갈락토시다아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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