JP2023511505A - オリゴ糖及び／又は多糖からのフルクトースの生産 - Google Patents

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Abstract

本発明は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法に関し、本方法は、ａ）水、リン酸塩、及び少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含む組成物に、少なくとも４種の酵素を添加する工程と、ｂ）続いて、前記少なくとも４種の酵素の存在下で、前記少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに酵素的に変換する工程とを含み、工程ａ）において、少なくとも１種の追加の糖が添加され、前記少なくとも１種の追加の糖は、２０以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせを含む糖からなる群から選択され；工程ａ）において、前記少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素は、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び工程ａ）の少なくとも１種の酵素はホスファターゼである。

Description

本発明は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換するための組成物、及びフルクトースを含む水性組成物に関する。さらに本発明は、ホスファターゼ、及び少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖の変換におけるホスファターゼの使用に関する。
Ｄ－フルクトースの現在の工業生産プロセスは、特に２段階のプロセスに基づいている。最初の工程では、多糖又はオリゴ糖、たとえばデンプンが、加水分解によって単糖に切断される。第２段階では、異性化が行われ、それによって約４２％の収率（パーセントに対応する）でＤ－フルクトースが得られる。純粋なＤ－フルクトースを調製するためのその後処理は、費用のかかるクロマトグラフィー精製技術によって行われる。
別の工業プロセスは、酵素インベルターゼを用いるスクロースの加水分解である。これにより、Ｄ－グルコースとＤ－フルクトースの等モル混合物が得られる。Ｄ－フルクトースを濃縮するには、これを費用のかかるクロマトグラフィー操作で再度精製する必要がある。
工業プロセスには、溶液中に存在する糖類の最大５０％を占めるＤ－フルクトースの溶液のみが生成されるため、重大な欠点がある。より高いＤ－フルクトース溶液を得るには、費用のかかるクロマトグラフィー精製を行うか、５５％フルクトース含有量の高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ５５）などの高価な純粋なＤ－フルクトースを添加する必要がある。
基質としてＤ－グルコースを使用して純粋なＤ－フルクトースを生産するための代替プロセスが知られており、ＥＰ００２８１３６Ｂ１及びＡＴ５１３９２８Ｂ１に詳細に記載されている。この場合、Ｄ－グルコースはピラノース－２－オキシダーゼで酸化されてＤ－グルコソンになり、次に還元されてＤ－フルクトースになる。還元は、化学的手段、すなわち均一又は不均一触媒作用によって、又は生体触媒を使用することによって実施することができる。
このプロセスはまだ技術的に実現されていない。これは、酸化と還元を互いに別々に実施しなければならないという欠点があるため、追加のプロセス工程が必要になる。さらに、還元が化学的に行われる場合、高純度の基質が必要で、かつ高圧及び高温が必要となり、これは、望ましくない副産物の生成につながる可能性がある。還元が酵素的に行われる場合、使用される還元剤及び不安定な補酵素（例えばＮＡＤＨ）に非常に高い費用が発生する。
Ｄ－フルクトースの製造のための既知のプロセスには、さまざまな欠点がある。基質を効率的に変換するには、部分的に高圧と高温が必要である。あるいは、基質に応じて最大５０％の収率しか達成できないか、副産物を減少させるためにきれいな基質を使用する必要がある。さらに濃縮するには、クロマトグラフィー装置の再利用を確実にするために非常にクリーンなプロセス流が必要である。
高価な補因子の使用、又はさらなるクロマトグラフィー精製及び濃縮工程を必要とする好ましくない平衡などの上記の欠点を克服して、オリゴ糖及び／又は多糖をＤ－フルクトースに変換する方法が必要とされている。
本発明の目的は、基質に対して高収率でかつ副産物が無いか又は少ない、Ｄ－フルクトース生産を可能にする方法を提供することである。さらに、後処理が単純化され、有機補酵素の使用を不要にすべきである。
前記目的は、請求項１に記載の少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法によって、請求項８に記載の少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換するための組成物によって、及び請求項１０に記載のフルクトースを含む水性組成物によって解決される。さらに、前記目的は、請求項１３に記載のホスファターゼによって、及び請求項１５に記載の少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖の変換における前記ホスファターゼの使用によって解決される。
第１の態様において、本発明は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法に関し、本方法は、
ａ）水、リン酸塩、及び少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含む組成物に、少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素を添加する工程と、
ｂ）続いて、前記少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素の存在下で、前記少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに酵素的に変換する工程とを含み、
工程ａ）において、少なくとも１種の追加の糖が添加され、前記少なくとも１種の追加の糖は、２０以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせ、好ましくは１７以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせを含む糖からなる群から選択され；
工程ａ）において、前記少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素は、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び
工程ａ）の少なくとも１種の酵素はホスファターゼである。
さらに好適な実施態様は、従属請求項ならびに明細書に記載されている。
本発明においてフルクトースへの言及は、Ｄ－フルクトースへの言及として理解されるべきである。
本発明によるオリゴ糖は、少なくとも２つの単糖残基を含む糖であり、これらの単糖残基は同一でも異なっていてもよい。
ホスファターゼは、分類ＥＣ３．１．３に該当する任意の酵素であると理解されるべきである。トランスフェラーゼは、分類ＥＣ２．４に該当する任意の酵素であると理解されるべきである。ホスホリラーゼは、分類ＥＣ２．４．１に該当する任意の酵素であると理解されるべきである。ムターゼは、分類ＥＣ５．４．２に該当する任意の酵素であると理解されるべきである。イソメラーゼは、分類ＥＣ５．３．１に該当する任意の酵素であると理解されるべきである。ヒドロラーゼは、分類ＥＣ３．２に該当する任意の酵素であると理解されるべきである。
本発明による基質として、オリゴ糖及び多糖を使用することができる。改善された収率は、糖、及びおそらく糖にすでに存在するフルクトース単位の開裂によって調製することができる糖リン酸から得られる。
驚くべきことに、Ｄ－フルクトースの製造方法が見つかり、これは、高圧や高温がなくても機能し、プロセス内の汚染物質の存在をよりよく許容する。触媒の選択は、中間体の糖リン酸を生成することにより、プロセス中で高収率のＤ－フルクトースを得ることが可能にする。その結果、現在使用されている工業生産方法よりも基質（糖類）に基づく比率を高くすることができ、後処理が不要になる。これにより、費用のかかるクリーニング操作が不要になる。糖は、オリゴ糖及び／又は多糖であり得る。
好ましくは工程ａ）の組成物は、乾燥重量ベースで３５％以下の少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含む。好ましくは組成物は、乾燥重量ベースで、０．５％～３５％の少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含む。
さらに好ましくはオリゴ糖及び／又は多糖は、グルコースベースのオリゴ糖及び／又は多糖、好ましくはデンプン及びその誘導体、ヘミセルロース及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、及び／又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。
それぞれのオリゴ糖及び／又は多糖は、デンプン生産を介して、又はバイオマスの加水分解によって、例えばパルプ生産又はわらの加工において得ることができる。
好ましくは工程ａ）において、少なくとも１種の追加の糖は、十四糖、十三糖、十二糖、十一糖、十糖、九糖、八糖、七糖、六糖、五糖、四糖、三糖、二糖、及び／又はこれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、四糖、三糖、二糖、及びこれらの組み合わせ、さらにより好ましくはマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びこれらの組み合わせから選択される。
さらに好ましくは工程ａ）において、少なくとも１種の追加の糖はマルトデキストリンである。マルトデキストリンはＤ－グルコース単位からなる糖類であり、主にα－１，４－グリコシド結合で結合し、可変長の鎖で接続されている。通常マルトデキストリンは、３～１７グルコース単位の長さの鎖の混合物で構成されている。マルトデキストリンはＤＥ（ブドウ糖当量）によって分類され、ＤＥは３～２０である。ＤＥ値が高いほど、グルコース鎖は短くなる。
さらに好ましくは、少なくとも１種の追加の糖は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖と少なくとも部分的に同じグリコシド結合を有する。
好ましくはホスファターゼは、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、及びさらにより好ましくは少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
好適な実施態様においてホスファターゼは、配列番号４１の配列と少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９８．５％、より好ましくは少なくとも９９％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
好適な実施態様においてホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有するホスファターゼの群から選択される。
さらに工程ａ）において、好ましくは少なくとも６種の酵素が組成物に添加される。
好ましくは少なくとも４種の酵素、より好ましくは５種の酵素、さらにより好ましくは６種の酵素は、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、及び／又はヒドロラーゼからなる群から選択される。
好ましくは工程ａ）において、少なくとも１種のトランスフェラーゼ、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ、より好ましくはグルカノトランスフェラーゼ、さらにより好ましくはアルファ－グルカノトランスフェラーゼが添加され；及び／又は
好ましくは工程ａ）において、少なくとも１種のホスホリラーゼ、好ましくはグルカンホスホリラーゼが添加され；及び／又は
好ましくは工程ａ）において、少なくとも１種のムターゼ、好ましくはホスホグルコムターゼが添加され；及び／又は
好ましくは工程ａ）において、少なくとも１種のイソメラーゼ、好ましくはホスホグルコイソメラーゼが添加され；及び／又は
好ましくは工程ａ）において、少なくとも１種のヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼ、より好ましくはプルラナーゼが添加される。
少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法の好適な実施態様によれば、工程ａ）において少なくとも１種の追加の糖は、四糖、三糖、二糖、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくはマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びこれらの組み合わせから選択され；及び／又は工程ａ）の組成物は、乾燥重量ベースで３５％以下の少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含み、好ましくは組成物は、乾燥重量ベースで０．５％～３５％の少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含み；及び／又は少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖は、グルコースベースのオリゴ糖及び／又は多糖、好ましくはデンプン及びその誘導体、ヘミセルロース及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、及び／又はこれらの組み合わせからなる群から選択され；及び／又は工程ａ）において、少なくとも６種の酵素が組成物に添加され；及び／又は少なくとも１種の追加の糖は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖と少なくとも部分的に同じグリコシド結合を有する。
好ましくは工程ｂ）において、糖リン酸が中間的に生成される。
さらに好ましくは工程ｂ）において、酵素的変換はワンポット反応である。
工程ｂ）の好適な実施態様によれば、糖リン酸は中間的に生成され、酵素的変換はワンポット反応である。
本発明の方法は、いくつかの触媒工程により、オリゴ糖及び多糖からＤフルクトースへの変換を可能にする。これにより、糖リン酸の形の中間体が生成され、最終的にＤ－フルクトースとリン酸に切断される。
好ましくは工程ａ）で添加されるオリゴ糖及び／又は多糖は、複数のグルコース単位、より好ましくはＤ－グルコース単位を含む。さらにより好ましくは、工程ａ）で添加されるオリゴ糖及び／又は多糖は、複数のグルコース単位、より好ましくはＤ－グルコース単位からなる。
１つの実施態様において本発明の方法は、反応シーケンスが適用される酵素プロセスであり、個々のＤ－グルコース分子をＤ－グルコース－１－リン酸の形に切断することを可能にする。続いて、これらの放出されたＤ－グルコース－１－リン酸分子は、さらなる糖リン酸中間体を介してＤ－フルクトース－６－リン酸に変換される。続いてＤ－フルクトース－６－リン酸は分割され、Ｄ－フルクトースとリン酸が得られる。
この変換中の反応工程は、次の工程を含む：糖分子は酵素的にＤ－グルコース－１－リン酸に切断され、Ｄ－グルコース－１－リン酸は酵素的にＤ－グルコース－６－リン酸に変換され、Ｄ－グルコース－６－リン酸は酵素的にＤ－フルクトース－６－リン酸に変換され、そしてＤ－フルクトース－６－リン酸は酵素的に切断されてＤ－フルクトースとリン酸になる。
リン酸塩は、少量の触媒量でのみ使用されて、例えばＤ－グルコース－１－リン酸、Ｄ－グルコース－６－リン酸、Ｄ－フルクトース－６－リン酸などの糖リン酸を中間的に形成する。最初の工程でリン酸塩は、Ｄ－グルコース単位含有混合物に添加され、最後の工程でリン酸塩が切断除去され、最初の工程で再び利用できるようになる。
本発明のこの方法は、当技術分野で知られているようなＤ－フルクトースの生産の酵素的代替法を提供し、これは、残留中間体を分離及び精製する必要性を大幅に単純化する。従って本発明は、現在使用されている技術に比べて、糖からのＤ－フルクトースの生産における顕著な改善を表す。既存の方法とは対照的に、使用される生体触媒システムは、製品Ｄ－フルクトースの強化された濃縮を実現する。
この方法は、基本的にオリゴ糖及び多糖の使用に適している。
好ましくは、セロビオース、マルトース、又はデンプンから、Ｄ－フルクトースに富む加水分解物を生成することができる。この場合、最初の工程は、セロビオースホスホリラーゼ、マルトースホスホリラーゼ、又はデンプンホスホリラーゼを使用して実行され、その後いくつかの触媒工程が続く。この方法は、甜菜又はサトウキビから得ることができるスクロースの基質としての使用において特に有用である。この場合、最初の工程はスクロースホスホリラーゼを使用して実行される。この特定のケースでは、５３％を超える収率（質量に基づく）をするＤ－フルクトース、又は１ｍｏｌのスクロースあたり１ｍｏｌを超えるＤ－フルクトースが得られる。
本発明の方法は、様々な溶媒系で実施することができる。好ましくは、これは水性溶媒系で実施される。
緩衝系によって水性システムを補うことも可能である。適切な緩衝液（システム）は既知であり、従来の緩衝液（システム）、例えば酢酸塩、リン酸カリウム、トリス－ＨＣｌ、グリシルグリシン、及びグリシン緩衝液、又はこれらの混合物が含まれる。
好ましくは、本発明の方法で使用される緩衝液は、ｐH３～１２、好ましくはｐＨ４～１２、より好ましくはｐＨ４～１１を有する。生体触媒の最適活性のために、イオン、例えばＭｇ２＋が添加される。安定剤、グリセロールなどを使用すると、生体触媒をより長く使用できる場合がある。
本発明の方法では、リン酸塩が必要である。プロセスにおいて十分量のリン酸塩を確保するために、リン酸、リン酸の塩、ポリリン酸塩、又はこれらの組み合わせの形の外部添加が必要である。
好ましくは本発明の方法は、適切な温度、例えば使用する酵素によって異なる温度で実施される。適切な温度には、１０～１００℃、好ましくは１０～９０℃、より好ましくは２０～９０℃、さらにより好ましくは２０～８０℃が含まれる。
好ましくは工程ｂ）の温度は、１０～１００℃、より好ましくは２０～９０℃、及びさらにより好ましくは２０～８０℃である。
さらに好ましくは組成物のｐＨは、３～１２であり、及びより好ましくは４～１０である。
本発明の方法の利点は、中間体を単離する必要なしに、同じ反応バッチですべての触媒工程を実行することである。この方法は、バッチ式で又は連続的に操作することができる。この場合、関与するすべての酵素を同時に添加するか、酵素の一部のみを添加することができ、例えば酵素は、工程ｂ）の間に追加することができ、時間的又は局所的な遅延を伴って、酵素の別の部分を後で追加することができる。
酵素の第２の部分を加える前に、反応混合物中にすでに存在する酵素を、例えば物理的に（濾過又は固定化によって）除去するか、又は不活化することができる。後者は、例えば８０℃までの１０分間の短期間の温度上昇によって行うことができる。あるいは、反応溶液を反応混合物に通して、変換率を高め、収率を数倍上げることもできる。
本発明の方法における糖のＤ－グルコース－１－リン酸への開裂は、酵素的、すなわち酵素触媒作用によるものであり、既知の方法に従って実施することができる。切断は、好ましくは、ホスホリラーゼを用いる触媒作用によって実施される。
好ましくは工程ａ）の組成物中に存在する糖の少なくとも５０％は、２４時間の酵素的変換後にフルクトースに変換される。
また、好ましくは工程ａ）の組成物中に存在する糖の少なくとも７０％は、４８時間の酵素的変換後にフルクトースに変換される。
本発明の方法は、高濃度のオリゴ糖及び／又は多糖、例えば膨潤したデンプンの取り扱いをさらに改善することを可能にする。例えば、３５％の乾燥物質デンプンの開始濃度で本発明の方法を実行することが可能である。
好ましくは工程ｂ）は、室温（２５℃）で少なくとも２４時間実施される。
別の態様において、本発明は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法に関し、この方法は、ａ）水、リン酸塩、及び少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含む組成物に少なくとも１種の酵素を添加する工程、及びｂ）続いて、少なくとも１種の酵素の存在下で、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに酵素的に変換する工程を含み、工程ａ）において少なくとも１種の追加の糖が添加され、少なくとも１種の追加の糖は、２０以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせ、好ましくは１７以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせを含む糖からなる群から選択される。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、この方法にも当てはまる。
好ましくは工程ａ）における少なくとも１種の酵素はホスファターゼである。
さらに、工程ａ）において、好ましくは少なくとも４種の酵素、より好ましくは少なくとも５種の酵素、さらにより好ましくは少なくとも６つの酵素が組成物に添加される。
第２の態様において本発明は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換するための組成物に関し、本組成物は、
－ 水、
－ リン酸塩、
－ 少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素（ここで少なくとも１種の酵素はホスファターゼである）、
－ 少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含み、
ここで、少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素は、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び
本組成物は、少なくとも１種の追加の糖をさらに含み、少なくとも１種の追加の糖は、２０以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせ、好ましくは１７以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせを含む糖からなる群から選択される。
少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法に関するすべての説明、特に前述の酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を変換するための組成物にも当てはまる。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、及びさらにより好ましくは少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号４１の配列と少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９８．５％、より好ましくは少なくとも９９％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有するホスファターゼの群から選択される。
好ましくは、少なくとも４種の酵素、より好ましくは５種の酵素、及びさらにより好ましくは６種の酵素は、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、及び／又はヒドロラーゼからなる群から選択される。
好適な実施態様によれば、組成物は、トランスフェラーゼ、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ、より好ましくはグルカノトランスフェラーゼ、さらにより好ましくはアルファ－グルカノトランスフェラーゼを含み；及び／又は
組成物は、さらにホスホリラーゼを含み、好ましくはグルカンホスホリラーゼが添加され；及び／又は
組成物は、ムターゼ、好ましくはホスホグルコムターゼを含み；及び／又は
組成物は、イソメラーゼ、好ましくはホスホグルコイソメラーゼを含み；及び／又は
組成物は、ヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼ、より好ましくはプルラナーゼを含む。
別の態様において本発明は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換するための組成物であって、水、リン酸塩、少なくとも５種の酵素（ここで少なくとも１種の酵素はホスファターゼである）を含む組成物に関し、ここで、ホスファターゼは、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、及びさらにより好ましくは少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素、及びオリゴ糖及び／又は多糖、及び少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換するための組成物に関するすべての説明は、該当する場合、この態様にも当てはまる。
好ましくは、少なくとも５種の酵素は、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、及び／又はヒドロラーゼからなる群から選択される。
第３の態様において、本発明は、
－ 乾燥重量ベースで少なくとも５０％のフルクトース、
－ 乾燥重量ベースで０．００１～２５％のグルコース、好ましくは０．００５～２０％のグルコース、
－ 乾燥重量ベースで０．０１～２２％のホスフェート、好ましくは０．０５～２０％のホスフェート、及び
－ 乾燥重量ベースで、０．００１～２％の少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素、好ましくは０．００５～１％の少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素、を含む水性組成物に関し、
ここで、少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素は、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び
ここで、少なくとも１種の酵素はホスファターゼである。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、水性組成物にも当てはまる。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、及びさらにより好ましくは少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号４１の配列と少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９８．５％、より好ましくは少なくとも９９％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有するホスファターゼの群から選択される。
好ましくは、少なくとも４種の酵素、より好ましくは５種の酵素、及びさらにより好ましくは６種の酵素は、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、及び／又はヒドロラーゼからなる群から選択される。
好適な実施態様によれば、組成物は、トランスフェラーゼ、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ、より好ましくはグルカノトランスフェラーゼ、さらにより好ましくはアルファ－グルカノトランスフェラーゼを含み；及び／又は
組成物は、さらにホスホリラーゼを含み、好ましくはグルカンホスホリラーゼが添加され；及び／又は
組成物は、ムターゼ、好ましくはホスホグルコムターゼを含み；及び／又は
組成物は、イソメラーゼ、好ましくはホスホグルコイソメラーゼを含み；及び／又は
組成物は、ヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼ、より好ましくはプルラナーゼを含む。
第４の態様において、本発明は、
－ 乾燥重量ベースで少なくとも５０％のフルクトース
－ 乾燥重量ベースで０．００１～２５％のグルコース、好ましくは０．００５～２０％のグルコース、
－ 乾燥重量ベースで０．０１～２２％のホスフェート、好ましくは０．０５～２０％のホスフェート、及び
－ 乾燥重量ベースで、０．００１～２％の少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素、好ましくは０．００５～１％の少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素、を含む水性組成物に関し、
ここで、少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素は、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び
ここで、少なくとも１種の酵素はホスファターゼであり、
これは、上記の本発明の方法によって得られる。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、本発明の方法によって得られる水性組成物にも当てはまる。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、及びさらにより好ましくは少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号４１の配列と少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９８．５％、より好ましくは少なくとも９９％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有するホスファターゼの群から選択される。
好ましくは、少なくとも４種の酵素、より好ましくは５種の酵素、及びさらにより好ましくは６種の酵素は、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、及び／又はヒドロラーゼからなる群から選択される。
好適な実施態様によれば、組成物は、トランスフェラーゼ、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ、より好ましくはグルカノトランスフェラーゼ、さらにより好ましくはアルファ－グルカノトランスフェラーゼを含み；及び／又は
組成物は、さらにホスホリラーゼを含み、好ましくはグルカンホスホリラーゼが添加され；及び／又は
組成物は、ムターゼ、好ましくはホスホグルコムターゼを含み；及び／又は
組成物は、イソメラーゼ、好ましくはホスホグルコイソメラーゼを含み；及び／又は
組成物は、ヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼ、より好ましくはプルラナーゼを含む。
別の態様において、本発明は、乾燥重量ベースで少なくとも５０％のフルクトース、乾燥重量ベースで２５％未満のグルコース、好ましくは２０％未満のグルコース、乾燥重量ベースで２２％未満のホスフェート、好ましくは２０％未満のホスフェート、乾燥重量ベースで２％未満の少なくとも４種の酵素、好ましくは１％未満の少なくとも４種の酵素を含む水性組成物に関し、ここで、１種の酵素はホスファターゼである。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、水性組成物にも当てはまる。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、及びさらにより好ましくは少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有するホスファターゼの群から選択される。
好適な実施態様によれば、組成物は、トランスフェラーゼ、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ、より好ましくはグルカノトランスフェラーゼ、さらにより好ましくはアルファ－グルカノトランスフェラーゼを含み、及び／又は組成物は、ホスホリラーゼをさらに含み、好ましくはグルカンホスホリラーゼが添加され、及び／又は組成物は、ムターゼ、好ましくはホスホグルコムターゼを含み、及び／又は組成物は、イソメラーゼ、好ましくはホスホグルコイソメラーゼを含み、及び／又は組成物は、ヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼ、より好ましくはプルラナーゼを含む。
別の態様において、本発明は、乾燥重量ベースで少なくとも５０％のフルクトース、乾燥重量ベースで２５％未満のグルコース、好ましくは２０％未満のグルコース、乾燥重量ベースで２２％未満のホスフェート酸塩、好ましくは２０％未満のホスフェート、及び、乾燥重量ベースで２％未満の少なくとも４種の酵素、好ましくは１％未満の少なくとも４種の酵素を含む水性組成物に関し、ここで、１種の酵素は、上記の本発明の方法によって得られるホスファターゼである。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、本発明の方法によって得られる水性組成物にも当てはまる。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、及びさらにより好ましくは少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
好適な実施態様によれば、ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有するホスファターゼの群から選択される。
好適な実施態様によれば、組成物は、トランスフェラーゼ、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ、より好ましくはグルカノトランスフェラーゼ、さらにより好ましくはアルファ－グルカノトランスフェラーゼを含み；及び／又は組成物はホスホリラーゼをさらに含み、好ましくはグルカンホスホリラーゼが添加され；及び／又は組成物は、ムターゼ、好ましくはホスホグルコムターゼを含み；及び／又は組成物は、イソメラーゼ、好ましくはホスホグルコイソメラーゼを含み；及び／又は組成物は、ヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼ、より好ましくはプルラナーゼを含む。
別の態様において、本発明は、上記の本発明の方法によって得られるフルクトースに関する。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、本発明の方法によって得られるフルクトースにも当てはまる。
第５の態様において、本発明は、配列番号４１の配列と少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９８．５％、より好ましくは少なくとも９９％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むホスファターゼに関する。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、ホスファターゼにも当てはまる。
好ましくは、ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有する。
これらのホスファターゼは、Ｄ－フルクトースのより高い収量を提供する。本発明のホスファターゼは、フルクトース－６－リン酸に関して改善された選択性を提供する。これらのより高い活性のために、適用される酵素の量を減少させることが可能である。従って、これらのホスファターゼは特に工業プロセスに適している。
別の態様において、本発明は、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、及びさらにより好ましくは少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列を含むホスファターゼに関する。
好ましくは、ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有する。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、ホスファターゼにも当てはまる。
第６の態様において、本発明は、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する際の本発明のホスファターゼの使用に関する。
前述の、少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法、特に酵素及びオリゴ糖及び／又は多糖に関するすべての説明は、該当する場合、本発明のホスファターゼの使用にも当てはまる。
デンプンから始まりフルクトースをもたらす本発明のプロセスの概略図。 図１に示されるプロセスの中間工程。無機リン酸（Ｇ）を使用してポリマーの末端グルコース残基と残りの部分（Ｂ－Ａ）の間のα－１，４結合を切断して、グルコース－１－リン酸（Ｃ）を放出するグルカンホスホリラーゼ（３）。 図１に示されるプロセスの中間工程。グルコース－１－リン酸（Ｃ）は、ホスホグルコムターゼ（４）の作用によりグルコース－６－リン酸（Ｄ）に変換される。 図１に示されるプロセスの中間工程。グルコース－６－リン酸は、ホスホグルコイソメラーゼ（５）を使用してフルクトース－６－リン酸（Ｅ）に変換される。 図１に示されるプロセスの中間工程。フルクトース－６－リン酸は、ホスファターゼ（６）の作用により、フルクトース（Ｆ）とリン酸（Ｇ）に切断される。 図１に示されるプロセスの中間工程。デンプン（Ａ－アミロース（Ｂ）とアミロペクチン（Ｈ）の混合物）に含まれるすべてのα－１，６結合は、プルラナーゼを使用して切断される。 図１に示されるプロセスの中間工程。α－グルカノトランスフェラーゼは、アクセプター炭水化物（Ｂ）の新しい位置への１，４－α－Ｄ－グルカン（Ｂ）のセグメントの移動を触媒し、新しいα－１，４結合を生成する。 改良されたホスファターゼ、すなわちＰ４６Ｔとマルトース（０．１ｍＭ）を使用して、４８時間以内に天然デンプンをより速く変換するための最適化されたプロセスの進行状況を示す図。 プルラナーゼ、α－グルカノトランスフェラーゼ、及びグルカンホスホリラーゼを使用する天然デンプンの分解、及び生成されたＧ１Ｐの検出のための、短いオリゴ糖の有益な影響を証明する実験設定の結果を示す図。 プロセスで発生する3種の異なる糖－リン酸（Ｇ６Ｐ及びＦ６Ｐ）における触媒性能の改善について、野生型ホスファターゼと９つの変種（Ｐ４６Ｔ、Ｐ４６ＴＥ４７Ｙ、Ｐ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ、Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７Ｙ、Ｐ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｉ、Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ、Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｉ、Ｙ２３ＳＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ、Ｙ２３ＳＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０ＩＬ）の比較を示す図。 プロセスで発生する３種の異なる糖－リン酸（Ｇ６Ｐ及びＦ６Ｐ）における触媒性能の改善について、野生型ホスファターゼと６つの変種（ＨＴＹＬ、Ｙ４７Ｔ、Ｙ４７Ｆ、Ｖ４５Ｍ、Ｖ４５Ｑ、及びＶ４５Ｒ）の比較を示す図。 プロセスで発生する３種の異なる糖－リン酸（Ｇ６Ｐ及びＦ６Ｐ）における触媒性能の改善について、６つの変種（Ｖ４５Ｒ、ＨＴＦＬ、ＨＴＬＶ４５Ｒ、ＨＴＦＬＶ４５Ｒ、ＨＴＦＬＶ４５Ｍ、及びＨＴＦＬＶ４５Ｑ）の比較を示す図。 スクロースからフルクトースへの変換における触媒性能の改善について、野生型ホスファターゼと２つの変種（ＴＹ及びＨＴＹＬ）の比較を示す。
以下において、図及び／又は表で使用されている略語と酵素について説明する。
１ プルラナーゼ
２ α－グルカノトランスフェラーゼ
３ グルカンホスホリラーゼ
４ ホスホグルコムターゼ
５ ホスホグルコイソメラーゼ
６ ホスファターゼ
Ａ でんぷん
Ｂ アミロース
Ｂ－Ａ アミロースから１グルコース単位を除いたもの
Ｃ グルコース－１－リン酸（Ｇ１Ｐ）
Ｄ グルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）
Ｅ フルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）
Ｆ フルクトース
Ｇ リン酸塩
Ｈ アミロペクチン
ＷＴ 野生型；配列番号１３
Ｔ ４６位でプロリンからスレオニンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｐ４６Ｔ）；配列番号１５；
ＴＹ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの追加のアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｐ４６ＴＥ４７Ｙ）；配列番号１７；
ＴＹＬ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｐ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ）；配列番号１９；
ＨＴＹ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７Ｙ）；配列番号２３；
ＴＹＩ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び５０位でグリシンからイソロイシンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｐ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｉ）；配列番号２１；
ＨＴＹＬ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ）；配列番号２５；
ＨＴＹＩ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び５０位でグリシンからイソロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｉ）；配列番号２７；
ＳＴＹＬ ４６位でプロリンからスレオニンへの、４７位でグルタミン酸からチロシンへの、５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからセリンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＳＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ）；配列番号２９；
ＳＴＹＩ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び５０位でグリシンからイソロイシンへの、及び２３位でチロシンからセリンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＳＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｉ）；配列番号３１；
Ｙ４７Ｔ／ＨＴＴＬ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からスレオニンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへのにアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ）；配列番号３３；
Ｙ４７Ｆ／ＨＴＦＬ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からフェニルアラニンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへのでアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＦＧ５０Ｌ）；配列番号３５；
Ｖ４５Ｍ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへの、及び４５位でバリンからメチオニンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＶ４５ＭＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ）；配列番号３７；
Ｖ４５Ｑ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへの、及び４５位でバリンからグルタミンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＶ４５ＱＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ）；配列番号３９；
Ｖ４５Ｒ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からチロシンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへの、及び４５位でバリンからアルギニンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＶ４５ＲＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ）；配列番号４１；
ＨＴＴＬＶ４５Ｒ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からスレオニンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへの、及び４５位でバリンからアルギニンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＶ４５ＲＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ）；配列番号４３；
ＨＴＦＬＶ４５Ｒ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からフェニルアラニンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへの、及び４５位でバリンからアルギニンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＶ４５ＲＰ４６ＴＥ４７ＦＧ５０Ｌ）；配列番号４５；
ＨＴＦＬＶ４５Ｍ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からフェニルアラニンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへの、及び４５位でバリンからメチオニンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＶ４５ＭＰ４６ＴＥ４７ＦＧ５０Ｌ）；配列番号４７；
ＨＴＦＬＶ４５Ｑ ４６位でプロリンからスレオニンへの、及び４７位でグルタミン酸からフェニルアラニンへの、及び５０位でグリシンからロイシンへの、及び２３位でチロシンからヒスチジンへの、及び４５位でバリンからグルタミンへのアミノ酸交換を有するホスファターゼ変種（Ｙ２３ＨＶ４５ＱＰ４６ＴＥ４７ＦＧ５０Ｌ）；配列番号４９。
図１は本発明のプロセスの概略図を示し、これは、デンプン（Ａ－アミロースとアミロペクチンの混合物）がプルラナーゼ（１）とα－グルカノトランスフェラーゼ（２）を使用してアミロース（Ｂ）に変換されることから始まり、次の工程では、無機リン酸（Ｇ）を使用してホスホリラーゼ（グルカンホスホリラーゼ（３））によって触媒されて、ポリマーの末端グルコース残基と残りの部分の間のα－１，４結合が切断されてグルコース－１－リン酸（Ｃ）が放出され、Ｃはホスホグルコムターゼ（４）の作用によりグルコース－６－リン酸（Ｄ）に変換され、グルコース－６－リン酸はホスホグルコイソメラーゼ（５）を使用してフルクトース－６－リン酸（Ｅ）に変換され、最後の工程でフルクトース－６－リン酸はホスファターゼ（６）の作用によりフルクコース（Ｆ）とリン酸（Ｇ）に切断される。
図２は、図１に示す全般的なプロセスの中間プロセス工程を示す。グルカンホスホリラーゼ（３）と無機リン酸（Ｇ）を使用して、末端のグルコース残基とポリマーの残り（Ｂ－Ａ）の間のα－１，４結合が切断され、グルコース－１－リン酸（Ｃ）が放出される。
図３～図７は、図１に示されるプロセスのさらなる中間工程を示す。
図８～１３は、以下の実験セクションでさらに議論される実験データの図を提示する。
本発明は、特定の好適な実施態様を参照して説明されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、同等物はその要素で置き換えることができることは、当業者によって理解されるであろう。さらに、その本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況又は材料を本発明の教示に適合させるために多くの修正を行うことができる。従って、本発明は特定の実施態様に限定されるものではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲に含まれるすべての実施態様を含むことが意図されている。
実験セクション
１．材料
すべての化学物質は分析グレード以上の品質であり、Sigma-Aldrich、Carbosynth、又はVWRから購入し、さらに精製することなく使用した。
Glucidex 12及びGlucidex 19は、Roquette Freres（フランス）から入手したマルトデキストリン化合物である。
グルコースポリマーの分子量は、式（１８０×ｎ－１８×（ｎ－１））を使用して計算でき，ｎはグルコースポリマーのＤＰ（重合度）である。ＤＥ（デキストロース当量）は１００×（１８０／分子量（グルコースポリマー））として計算できる。ＤＰは、式ＤＰ＝１１１／ＤＥを使用して計算できる（Balto, Amy S., et al. "On the use of differential solubility in aqueous ethanol solutions to narrow the DP range of food-grade starch hydrolysis products." Food chemistry 197 (2016): 872-880）。ＤＥが１１～１４のGlucidex 12は、平均ＤＰが８～１０であると想定される。ＤＥが１８～２０のGlucidex 19は、平均ＤＰが５～６であると想定される。しかし、これらの調製物は酵素処理によって得られるため、より小さナ及びより大きなマルトデキストリンも含まれる。
この試験では次の菌株を使用した：大腸菌（E. coli）ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）、すべての構築物は３７℃で自己誘導培地を使用して正常に発現された。
２．方法
分析
図１に示す完全なプロセスの分析は、オートサンプラー（WPS 3000TRS）、カラムコンパートメント（TCC3000RS）、及び光散乱検出器を備えたHPLC DionexUltimate3000システムを使用して実行された。７℃のYMC Triart Diol Hilicカラム（１００×２ｍｍ、１．９μｍ、１２ｎｍ）を使用して、移動相として０．１％ギ酸（ｐＨ４．５）及びＡＣＮ中の０．１％ギ酸を０．４５ｍｌ／分で使用して勾配溶出（１５～8５％）による分離を行った。試料を水／アセトニトリルで３：７の比率で希釈した。データは、Dionex Chromeleonソフトウェアを使用して分析した。
ケトース全体（フルクトースとフルクトース－６－リン酸）の検出は、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）に基づくアッセイを使用して行った。検出方法は、アルドースとケトースの還元速度の差に基づく。２ｍｌの試験管に、０．０５ｍｌの試料、０．０１ｍｌの１％水性ＴＴＣ、及び０．０４ｍｌの６Ｎ ＮａＯＨを加える。正確に５分後、１．５ｍｌの酢酸：エタノール（１：９）を加え、試験管の内容物をボルテックス混合する。水をブランクとして使用し、分光光度計（Multiskan GO, Thermo Fisher）を使用して４８０ｎｍで吸光度を測定する。グルコースとグルコース－６－リン酸は、ＴＴＣを赤色の色素（トリフェニルホルマザン）に還元する。これは、同等量のフルクトースより約１００倍遅い。
グルコースは、グルコースオキシダーゼに基づくアッセイを使用して検出される。５０μｌの試料又は希釈試料を５０μｌのマスターミックス（０．７５ｍＭ ＡＢＴＳ、２Ｕ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、０．１Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ、２０ｍＭ ＫＰｉ、ｐＨ６．０）と混合し、３０℃で３０分間インキュベートし、次に分光光度計（Multiskan GO, Thermo Fisher）を使用して４１８ｎｍで測定する。
タンパク質発現
最適化されたタンパク質発現は１つの酵素について例示的に説明されており、同じ操作をすべてのタンパク質に対して行った。
目的のプラスミド（プロセスに記載されている酵素の１つをコードする１つの遺伝子を有するｐＥＴ２８誘導体）を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、２５０ｍｌの自己誘導培地（Studier, F. William. "Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures." Protein expression and purification 41.1 (2005): 207-234）で増殖させた。前培養物を、１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含む４ｍｌのＬＢ培地で、ロータリーシェーカー（１８０ｒｐｍ）で３７℃で一晩インキュベートした。発現培養物に、一晩培養物の１：１００希釈物を接種した。インキュベーションは３７℃で２４時間行った。遠心分離により細胞を回収し、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に再懸濁した。粗抽出物は、Basic-Z 細胞破壊器（IUL Constant Systems）又は超音波装置を使用し、続いてＤＮａｓｅＩ（１μｇ／ｍｌ）と組み合わせてＭｇＣｌ２を最終濃度２．５ｍＭになるように添加し、その後室温（２５℃）で２０分間インキュベートしてＤＮＡを分解することにより調製した。次に、すべての粗抽出物を７０℃で３０分間熱処理した。溶解物の不溶性画分を遠心分離（２０，０００ｒｐｍ、４℃で４０分間）により除去した。上清を０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し、精製した酵素調製物として使用した。各精製物のアリコートを、Laemmli Ulrich K. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." nature 227.5259 (1970): 680に記載された１２％ＳＤＳ－Ｐａｇｅに供した。
酵素は以下の配列に対応する：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号：３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９。
酵素の活性試験
バチルス・フラボカルダリウス（Bacillus flavocaldarius）のプルラナーゼ（配列番号１）の活性を、基質としてのプルランと検出用の３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）を使用して試験した。
プルラナーゼを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の１％（ｗ／ｖ）プルラン、及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２とともに６５℃でインキュベートした。さまざまな時点で、２４μｌのアリコートを９６μｌのＤＮＳ試薬（１リットルにつき１０ｇの３，５－ジニトロサリチル酸、３００ｇの酒石酸カリウムナトリウム、１６ｇの水酸化ナトリウム）に移した。９５℃まで５分間加熱し、その後１００μｌを平底マイクロタイタープレートに移し、分光光度計（Multiskan GO, Thermo Fisher）で５４０ｎｍで測定した。
メイオサームス・ルーバー（Meiothermus ruber）のα－グルカノトランスフェラーゼ（配列番号３）を、活性について基質としてマルトトリオースを使用して、そしてより大きなオリゴ糖を構築する能力について試験した。活性の検出は、ＴＬＣ（イソプロパノール：酢酸エチル：水（３：１：１））及びチモール噴霧試薬（０．５ｇチモール、９５ｍｌエタノール、５ｍｌ硫酸９７％）を使用して行った。メイオサームス・ルーバーのα－グルカノトランスフェラーゼを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の５０ｍＭマルトトリオース、及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２とともに６５℃でインキュベートした。
サーモトガ・ナフトフィラ（Thermotoga naphthophila）のα－グルカンホスホリラーゼ（配列番号５）を、活性について酵素の組み合わせを使用して試験して、生成物α－Ｄ－グルコース－１－リン酸を検出した。α－Ｄ－グルコース－１－リン酸はα－Ｄ－グルコース－６－リン酸に変換され、続いてα－Ｄ－グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼによってα－Ｄ－グルコン酸－６－リン酸に酸化された。生成されたＮＡＤＨは、電子メディエーターとして１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（ＰＭＳ）を使用してＷＳＴ－１を変換するために使用された。α－グルカンホスホリラーゼを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の１％（ｗ／ｖ）可溶性デンプン、及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び０．１ｍＭピリドキサール－５－リン酸とともに６５℃でインキュベートした。さまざまな時点で、１０μｌのアリコートを、ホスホグルコムターゼ０．１Ｕ、α－Ｄ－グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ０．１Ｕ、０．１ｍＭ ＷＳＴ－１、０．００５ｍＭ ＰＭＳを含む１９０μｌの検出溶液に移した。混合物を３０分間インキュベートし、分光光度計（Multiskan GO, ThermoFisher）で４４０ｎｍで測定した。
ビフィドバクテリウム・アドルセンティス（Bifidobacterium adolescentis）のスクロースホスホリラーゼ（配列番号５１）を、活性について、基質としてスクロース及び検出用の３，５－ジニトロサリチル酸を使用して試験した。検出に３，５－ジニトロサリチル酸を使用するアッセイでは、生成物のフルクトースのみがシグナルを生成する。スクロースホスホリラーゼは、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の１００ｍＭスクロース、及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２とともに５０℃でインキュベートされた。さまざまな時点で、２４μｌのアリコートを９６μｌのＤＮＳ試薬（１リットルにつき１０ｇの３，５－ジニトロサリチル酸、３００ｇの酒石酸カリウムナトリウム、１６ｇの水酸化ナトリウム）に移した。９５℃まで５分間加熱し、その後１００μｌを平底マイクロタイタープレートに移し、分光光度計（Multiskan GO, Thermo Fisher）で５４０ｎｍで測定した。
サッカロロブス・スフファタリクス（Saccharolobus sulfataricus）Ｐ２のホスホグルコムターゼ（配列番号７）又はクロストリジウム・サーモセラム（Chlostridium thermocellum）のホスホグルコムターゼ（配列番号９）を、活性について、基質としてα－Ｄ－グルコース－１－リン酸及び検出用の３，５－ジニトロサリチル酸を使用して試験した。検出用に３，５－ジニトロサリチル酸を使用するアッセイでは、生成物のα－Ｄ－グルコース－６－リン酸のみがシグナルを生成する。ホスホグルコムターゼを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の５０ｍＭ α－Ｄ－グルコース－１－リン酸及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２とともに６５℃でインキュベートした。さまざまな時点で、２４μｌのアリコートを９６μｌのＤＮＳ試薬（１リットルにつき１０ｇの３，５－ジニトロサリチル酸、３００ｇの酒石酸カリウムナトリウム、１６ｇの水酸化ナトリウム）に移した。９５℃まで５分間加熱し、その後１００μｌを平底マイクロタイタープレートに移し、分光光度計（Multiskan GO, Thermo Fisher）で５４０ｎｍで測定した。
サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）のホスホグルコイソメラーゼ（配列番号１１）を、活性について、基質としてフルクトース－６－リン酸を使用し、検出用にα－Ｄ－グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼを使用して試験した。生成されたＮＡＤＨは、電子メディエーターとして１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（ＰＭＳ）を使用してＷＳＴ－１を変換するために使用された。ホスホグルコイソメラーゼを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の５０ｍＭフルクトース－６－リン酸、及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２とともに６５℃でインキュベートした。さまざまな時点で、１０μｌのアリコートをα－Ｄ－グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ０．１Ｕ、０．１ｍＭ ＷＳＴ－１、０．００５ｍＭ ＰＭＳを含む１９０μｌの検出溶液に移した。混合物を３０分間インキュベートし、分光光度計（Multiskan GO, ThermoFisher）で４４０ｎｍで測定した。
サーモトガ・ナフトフィラのホスファターゼ（配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９）を、活性について、基質としてフルクトース－６－リン酸を使用して、リン酸アッセイで試験した。リン酸アッセイは、溶液Ａ（１Ｎ ＨＣｌ溶液中の１２％（ｗ／ｖ）ｌ－アスコルビン酸）、溶液Ｂ（ｄｄＨ２Ｏ中の２％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ）、溶液Ｆ（ｄｄＨ２Ｏ中の２％（ｗ／ｖ）クエン酸及び２％（ｗ／ｖ）酢酸）の３つの溶液からなる。溶液Ｄは溶液Ａと溶液Ｂの２：１混合物であり、測定前に新たに調製される。７５μｌの溶液Ｄを、平底マイクロタイタープレートの必要なウェルにピペットで入れる。次の工程で、２５μｌの試料又は定義された濃度の標準物質を加え、室温で５分間インキュベートする。最後の工程で、７５μｌの溶液Ｆを添加し、室温で１５分間のインキュベーション工程を追加して反応を停止させる。試料は、分光光度計（Multiskan GO, Thermo Fisher）で６５５ｎｍで測定される。
試験されたすべての酵素は、プロセス内の工程の１つを触媒する要件を満たし、プロセス条件下（６５℃、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５ｍＭ ＰＬＰ）で安定している。
３．デンプンからフルクトースへの変換（本発明の実施例１；ＩＥ１）
変換実験は、７ｇの天然デンプンを含む５０ｍｌのファルコンチューブを使用して１５ｍｌのスケールで実施した。天然デンプンを６ｍｌの水と緩衝液で前処理し、９５℃まで３０分間加熱して、ほぼ完全に膨潤させた。その後、膨潤したデンプンを６５℃に冷却し、酵素を加えた。７ｇの天然デンプンに、１０．５ｍｌの量の緩衝液、塩、及び酵素を加えた。さらに、マルトースを最終濃度が１０ｍＭになるように添加した。最終混合物には、５０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＰＬＰ、１０ｍＭマルトース、０．４ｍｇプルラナーゼ、１．５ｍｇ α－グルカノトランスフェラーゼ、３０ｍｇ α－グルカンホスホリラーゼ、１．４ｍｇホスホグルコムターゼ、１．２ｍｇのホスホグルコイソメラーゼ、及び１４ｍｇのホスファターゼを含有した。バチルス・フラボカルダリウス、メイオサームス・ルーバー、サーモトガ・ナフトフィラ（ホスホリラーゼ及びホスファターゼ）、クロストリジウム・サーモセラム、及びサーモトガ・マリティマの酵素を使用した。０時間のインキュベーションから始めて、定期的に試料を採取し、１０ｋＤａスピンフィルター（VWR ８２０３１－３５０）を使用してろ過した。必要に応じて、更なる分析のために、試料を３：７の比率の水／アセトニトリルで希釈した。
本発明の実施例１（ＩＥ１）によるデンプンからフルクトースへの変換の結果（３５％乾燥物質デンプンは、単糖の２１５３．５ｍＭ濃度に相当する）を表１及び図８に示す。
Figure 2023511505000002
表１から、４８時間後に約７０％の収率でフルクトースが得られることがわかる。
４．マルトース（ＩＥ２～ＩＥ５）、マルトトリオース（ＩＥ６～ＩＥ９）、マルトテトラオース（ＩＥ１０～ＩＥ１２）、マルトデキストリンGlucidex 12（ＩＥ１３～ＩＥ１５）、又はマルトデキストリンGlucidex 19（ＩＥ１６～ＩＥ１８）の存在下のデンプンからフルクトースへの変換
リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．０）、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＰＬＰ ０．００５ｍＭ、膨潤天然デンプン１％（ｗ／ｖ）、マルトース（０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１．０ｍＭ、又は１０ｍＭ；ＩＥ２～ＩＥ５）、又はマルトトリオース（０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１．０ｍＭ、又は１０ｍＭ；ＩＥ６～ＩＥ９）、又はマルトテトラオース（０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、又は１．０ｍＭ；ＩＥ１０～ＩＥ１２）、又はマルトデキストリンGlucidex 12（０．０３４２％（ｗ／ｖ）、０．００３４２％（ｗ／ｖ）、又は０．０００３４２％（ｗ／ｖ）；ＩＥ１３～ＩＥ１５）、又はマルトデキストリンGlucidex 19（０．０３４２％（ｗ／ｖ）、０．００３４２％（ｗ／ｖ）、又は０．０００３４２％（ｗ／ｖ）；ＩＥ１６～ＩＥ１８）、グルカンホスホリラーゼ（０．００２５ｍｇ／ｍｌ）、アルファ－グルカノトランスフェラーゼ（０．０７５ｍｇ／ｍｌ）、プルラナーゼ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）の総量５ｍｌを６５℃で１時間インキュベートし、アリコートを取り出してグルコース－１－リン酸についてチェックした。グルコース－１－リン酸アッセイは、上記の酵素の活性試験に記載されている。
比較例１～５（ＣＥ１～ＣＥ５）は、それぞれ１ｍＭのマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、Glucidex 12、又はGlucidex 19のみを添加し、デンプンを添加せずに実施した。比較実施例６は、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、Glucidex 12、又はGlucidex 19などの追加の糖類を添加せずに実施した。
グルコース－１－リン酸への変換率に対する追加の糖、例えばマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、Glucidex 12、又はGlucidex 19などの短いオリゴ糖の影響に関する試験の結果を表２に示す。それぞれの図は図９に示される。
Figure 2023511505000003
プロセス内のデンプン又はセルロースのような同等の基質などの大きな多糖類の変換は、１つの主要な律速段階、例えばグルカンホスホリラーゼによって触媒されるグルコース－１－リン酸分子の生成を含む。ホスホリラーゼは、無機リン酸を使用してポリマーの末端グルコース残基と残りの部分の間のα－１，４結合の切断を触媒してグルコース－１－リン酸を放出するために、多糖のアクセス可能な末端を必要とする。プルラナーゼ、α－グルカノトランスフェラーゼ、及び短いオリゴ糖、例えばマルトース（ＩＥ２～ＩＥ５）、マルトトリオース（ＩＥ６～ＩＥ９）、マルトテトラオース（ＩＥ１０～ＩＥ１２）、マルトデキストリンGlucidex 12（ＩＥ１３～ＩＥ１５）、又はマルトデキストリンGlucidex 19（ＩＥ１６～ＩＥ１８）（表２参照）の組合わせ作用は、短いオリゴ糖を添加すると変換率が向上することを示している。これは、グルコース－１－リン酸のより高い生産をもたらし、従って、本発明のプロセス内でデンプンからフルクトースへのより迅速な変換を可能にする。
すべての比較例１～６の変換率は、本発明の実施例２～１８と比較して低い。
５．リン酸アッセイ
プロセスに存在する異なるホスファターゼ及び２つの糖リン酸中間体の変種の異なる活性を追跡するために、リン酸アッセイを実施した。
反応混合物は、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＧ１Ｐ、Ｇ６Ｐ、又はＦ６Ｐ、及び１つのホスファターゼ（０．００３ｍｇ／ｍｌ）を総量１ｍｌ中に含有した。混合物を６５℃でインキュベートし、一定の時間間隔でアリコートを取り出し、放出されたリン酸塩について試験した。リン酸アッセイは、上記でさらに詳細に記載されている。
リン酸アッセイの結果を表３と図１０に示す。Ｇ６ＰとＦ６Ｐの量を検出し、Ｆ６Ｐ／Ｇ６Ｐの比率を決定した。Ｆ６Ｐ／Ｇ６Ｐの比率は、試験されたホスファターゼの選択性を示す。
Figure 2023511505000004
サーモトガ・ナフトフィラのホスファターゼへの変異Ｐ４６Ｔ（ＩＥ１９（Ｔ））の導入は、酵素の全体的な活性を上昇させ、グルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に対する酵素の活性を低下させることが、表３と図１０からわかる。これにより、酵素量の減少と全体的なフルクトース生産の向上という観点から、プロセスの経済性が向上している。Ｐ４６ＴＥ４７Ｙ（ＩＥ２０（ＴＹ））は、野生型（ＣＥ７（ＷＴ））と比較してＦ６Ｐに対してわずかに改善された活性を有し、Ｇ６Ｐに対してほぼ同じ活性を示し、グルコースなどの不要な副産物が減少している。Ｐ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ（ＩＥ２１（ＴＹＬ））は、野生型（ＣＥ７（ＷＴ））と比較してＦ６Ｐに対する改善された活性を有し、Ｇ６Ｐに対する活性が低下し、グルコースなどの不要な副産物も減少する。Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７Ｙ（ＩＥ２３（ＨＴＹ））もまた、ＣＥ７（ＷＴ）と比較してＦ６Ｐに対して改善された活性を有し、Ｇ６Ｐに対する活性がわずかに増加している。しかし、両方の活性に関連して、この変種はまた本発明のプロセスの改善された性能を示し、グルコースのような望ましくない副産物を減少させる改善されたプロセスを可能にする。Ｐ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｉ（ＩＥ２２（ＴＹＩ））は、Ｆ６Ｐに対する選択性が向上している。Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ（ＩＥ２４（ＨＴＹＬ））は、ＣＥ７（ＷＴ）と比較してＦ６Ｐに対して改善された活性を有し、全体的な活性が上昇している状況でＧ６Ｐに対する活性が低下している。Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｉ（ＩＥ２５（ＨＴＹＩ））は、Ｆ６Ｐに対して改善された活性を有し、全体的な活性が上昇している状況でＧ６Ｐに対する活性が低下している。Ｙ２３ＳＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ（ＩＥ２６（ＳＴＹＬ））は、ＣＥ７（ＷＴ）と比較してＦ６Ｐに対して改善された活性を有し、全体的な活性が上昇している状況でＧ６Ｐに対する活性が低下している。Ｙ２３ＳＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｉ（ＩＥ２７（ＳＴＹＩ））は、Ｆ６Ｐに対する選択性が向上している。
本発明のホスファターゼ（表３と図１０を参照）は、改善された活性、選択性の向上、又はその両方を示している。
野生型ホスファターゼと比較して、追加のホスファターゼを試験するさらなるリン酸アッセイの結果を表４及び図１１に示す。使用したホスファターゼが改善された活性を示したため、測定にかかる時間間隔が短縮された。
Figure 2023511505000005
Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＹＧ５０Ｌ（ＨＴＹＬ）は、野生型と比較してＦ６Ｐに対して改善された活性を有し、全体的な活性が上昇している状況でＧ６Ｐに対する活性が低下している。このため、酵素は改善されたプロセスを可能にし、グルコースのような望ましくない副産物を減少させる。同じことが変種Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ（Ｙ４７Ｔ）、Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ（Ｙ４７Ｆ）、Ｙ２３ＨＶ４５ＭＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ（Ｖ４５Ｍ）、Ｙ２３ＨＶ４５ＱＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ（Ｖ４５Ｑ）、Ｙ２３ＨＶ４５ＲＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ（Ｖ４５Ｒ）にも当てはまる。
追加のホスファターゼを試験する別のリン酸アッセイの結果を表５及び図１２に示す。使用したホスファターゼが改善された活性を示したため、測定にかかる時間間隔も短縮された。
Figure 2023511505000006
変種Ｙ２３ＨＶ４５ＲＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ（Ｖ４５Ｒ）、Ｙ２３ＨＰ４６ＴＥ４７ＦＧ５０Ｌ（ＨＴＦＬ）、Ｙ２３ＨＶ４５ＲＰ４６ＴＥ４７ＴＧ５０Ｌ（ＨＴＴＬＶ４５Ｒ）、Ｙ２３ＨＶ４５ＭＰ４６ＴＥ４７ＦＧ５０Ｌ（Ｖ４５Ｍ）、及びＹ２３ＨＶ４５ＱＰ４６ＴＥ４７ＦＧ５０Ｌ（Ｖ４５Ｑ）はすべて、Ｆ６Ｐに対して改善された活性を有し、全体的な活性が上昇している状況でＧ６Ｐに対する活性が低下している。このため、酵素はグルコースのような望ましくない副産物を減少させる改善されたプロセスを可能にする。
６．改善されたホスファターゼ酵素を使用するスクロースからフルクトースへの変換
リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．０）、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、スクロース１０００ｍＭ、スクロースホスホリラーゼ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、ホスホグルコムターゼ（０．０４ｍｇ／ｍｌ）、ホスホグルコイソメラーゼ（０．０７５ｍｇ／ｍｌ）、及びホスファターゼ（０．１８ｍｇ／ｍｌ）を総量１０ｍｌで、５０℃で４８時間インキュベートし、アリコートを取り出してグルコースとフルクトースの濃度をチェックした。ビフィドバクテリウム・アドルセンティス（スクロースホスホリラーゼ）、サーモトガ・ナフトフィラ（ホスファターゼ）、クロストリジウム・サーモセラム（ホスホグルコムターゼ）、及びサーモトガ・マリティマ（ホスホグルコイソメラーゼ）からの酵素を使用した。フルクトースは、方法に記載されているように決定された。
表６及び図１３に、３つの異なるホスファターゼ酵素を使用したスクロースからフルクトースへの変換の結果を示す。
Figure 2023511505000007
表６から明らかなように、本発明のホスファターゼＴＹ（ＩＥ４０）及びＨＴＹＬ（ＩＥ４１）の変換率は、野生型ホスファターゼＷＴ（ＣＥ９）と比較して、より高い。

Claims (15)

  1. 少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換する方法であって、
    ａ）水、リン酸塩、及び少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖を含む組成物に、少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素を添加する工程と、
    ｂ）続いて、前記少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素の存在下で、前記少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに酵素的に変換する工程とを含み、
    工程ａ）において、少なくとも１種の追加の糖が添加され、前記少なくとも１種の追加の糖は、２０以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせ、好ましくは１７以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせを含む糖からなる群から選択され；
    工程ａ）において、前記少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素は、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び、
    工程ａ）の少なくとも１種の酵素はホスファターゼである方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    工程ａ）において、前記少なくとも１種の追加の糖は、十四糖、十三糖、十二糖、十一糖、十糖、九糖、八糖、七糖、六糖、五糖、四糖、三糖、二糖、及び／又はこれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、四糖、三糖、二糖、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、さらにより好ましくはマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びこれらの組み合わせから選択され、及び／又は、
    工程ａ）の前記組成物は、乾燥重量ベースで前記少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖の３５％以下を含み、及び／又は、
    工程ａ）の前記オリゴ糖及び／又は多糖は、グルコースベースのオリゴ糖及び／又は多糖から選択され、好ましくはデンプン及びその誘導体、ヘミセルロース及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、及び／又はこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び／又は、
    工程ａ）において、少なくとも６種の酵素が前記組成物に添加され、及び／又は、
    前記少なくとも１種の追加の糖は、前記少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖と少なくとも部分的に同じグリコシド結合を有する方法。
  3. 請求項１又は請求項２に記載の方法であって、
    好ましくは工程ｂ）において、糖リン酸が中間的に生成され、及び／又は、
    工程ｂ）において、前記酵素的変換はワンポット反応であり、及び／又は、
    前記ホスファターゼは、配列番号１３の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、及びより好ましくは少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む方法。
  4. 前記請求項のいずれかに記載の方法であって、
    工程ａ）において、少なくとも１種のトランスフェラーゼ、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ、より好ましくはグルカノトランスフェラーゼ、さらにより好ましくはアルファ－グルカノトランスフェラーゼが添加され、及び／又は、
    工程ａ）において、少なくとも１種のホスホリラーゼ、好ましくはグルカンホスホリラーゼが添加され、及び／又は、
    工程ａ）において、少なくとも１種のムターゼ、好ましくはホスホグルコムターゼが添加され、及び／又は、
    工程ａ）において、少なくとも１種のイソメラーゼ、好ましくはホスホグルコイソメラーゼが添加され、及び／又は、
    工程ａ）において、少なくとも１種のヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼ、より好ましくはプルラナーゼが添加される方法。
  5. 工程ｂ）は室温（２５℃）で少なくとも２４時間実施される。前記請求項のいずれかに記載の方法。
  6. 前記請求項のいずれかに記載の方法であって、
    工程ａ）の組成物中に存在する糖の少なくとも５０％は、２４時間の酵素的変換後にフルクトースに変換され、及び／又は、
    工程ａ）の組成物中に存在する糖の少なくとも７０％は、４８時間の酵素的変換後にフルクトースに変換される方法。
  7. 前記請求項のいずれかに記載の方法であって、
    工程ｂ）の温度は、１０～１００℃、好ましくは２０～９０℃であり、及び／又は、
    前記組成物のｐＨは、３～１２、好ましくは４～１０である方法。
  8. 少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖をフルクトースに変換するための組成物であって、
    － 水、
    － リン酸塩、
    － 少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素（ここで少なくとも１種の酵素はホスファターゼである）、
    － 少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖、を含み、
    前記少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素は、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び
    前記組成物は、少なくとも１種の追加の糖をさらに含み、前記少なくとも１種の追加の糖は、２０以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせ、好ましくは１７以下の単糖残基及び／又はこれらの組み合わせを含む糖からなる群から選択される組成物。
  9. 請求項８に記載の組成物であって、
    前記ホスファターゼは、配列番号４１の配列と少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９８．５％、及びより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、又は
    前記ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有する組成物。
  10. － 乾燥重量ベースで少なくとも５０％のフルクトース、
    － 乾燥重量ベースで０．００１～２５％のグルコース、
    － 乾燥重量ベースで０．０１～２２％のリン酸塩、及び
    － 乾燥重量ベースで、０．００１～２％の少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素を含む水性組成物であって、
    前記少なくとも４種の酵素、好ましくは少なくとも５種の酵素は、トランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ムターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、及び
    少なくとも１種の酵素はホスファターゼである水性組成物。
  11. 請求項１０に記載の水性組成物であって、
    前記ホスファターゼは、配列番号４１の配列と少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９８．５％、及びより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、又は
    前記ホスファターゼは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有する水性組成物。
  12. 請求項１～７に記載の方法により得られる、請求項１０又は１１に記載の水性組成物。
  13. 配列番号４１の配列と少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８．５％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むホスファターゼ。
  14. 配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、又は配列番号４９のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のホスファターゼ。
  15. 少なくとも１種のオリゴ糖及び／又は多糖からフルクトースへの変換における、請求項１３又は１４に記載のホスファターゼの使用。
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