KR20220115857A - 키트 및 플로우 셀 - Google Patents

키트 및 플로우 셀 Download PDF

Info

Publication number
KR20220115857A
KR20220115857A KR1020217031343A KR20217031343A KR20220115857A KR 20220115857 A KR20220115857 A KR 20220115857A KR 1020217031343 A KR1020217031343 A KR 1020217031343A KR 20217031343 A KR20217031343 A KR 20217031343A KR 20220115857 A KR20220115857 A KR 20220115857A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
catalyst
polymeric hydrogel
catalytic
group
flow cell
Prior art date
Application number
KR1020217031343A
Other languages
English (en)
Inventor
웨인 엔. 죠지
브라이언 디. 마더
앤드류 에이. 브라운
피에트로 가티 라프랑코니
마리아 칸델라리아 로저트 바시갈루포
앙투안 프랑세
샤오하이 리우
Original Assignee
일루미나, 인코포레이티드
일루미나 케임브리지 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일루미나, 인코포레이티드, 일루미나 케임브리지 리미티드 filed Critical 일루미나, 인코포레이티드
Publication of KR20220115857A publication Critical patent/KR20220115857A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/186—Modifications characterised by incorporating a non-extendable or blocking moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/125—Specific component of sample, medium or buffer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing

Abstract

키트의 예는 플로우 셀 및 절단 믹스(cleavage mix)를 포함한다. 예시적인 플로우 셀은 기재(substrate); 탈블로킹 촉매를 포함하는, 기재 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔; 및 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 증폭 프라이머를 포함한다. 탈블로킹 촉매는, 플로우 셀에 도입되고 증폭 프라이머에 부착된 주형 가닥 내로 혼입되는 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드의 블로킹 기의 절단을 가속화한다. 절단 믹스의 예는 블로킹 기의 절단을 개시하기 위한 성분을 포함한다.

Description

키트 및 플로우 셀
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/948,605호의 이득을 주장하며, 이의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
생물학적 또는 화학적 연구에서의 다양한 프로토콜은 국소 지지 표면 상에서 또는 사전에 정해진 반응 챔버 내에서 다수의 제어된 반응을 수행하는 것을 포함한다. 이어서, 지정된 반응을 관찰하거나 검출할 수 있으며, 후속 분석은 반응에 수반된 화학물질의 특성을 식별하거나 드러내는 것을 도울 수 있다. 일부 예에서, 제어된 반응은 형광을 발생시키며, 따라서 광학 시스템이 검출을 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 제어된 반응은 전하, 전도도, 또는 일부 다른 전기적 특성을 변화시키며, 따라서 전자 시스템이 검출을 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 제1 태양은 플로우 셀 및 절단 믹스(cleavage mix)를 포함하는 키트이며, 플로우 셀은 기재(substrate); 탈블로킹(deblocking) 촉매를 포함하는, 기재 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔; 및 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 증폭 프라이머를 포함하고; 촉매는, 플로우 셀에 도입되고 증폭 프라이머에 부착된 주형 가닥 내로 혼입되는 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드의 블로킹 기의 절단을 가속화하고; 절단 믹스는 블로킹 기의 절단을 개시하기 위한 성분을 포함한다.
제1 태양의 예에서, 탈블로킹 촉매는 산 촉매, 염기 촉매, 효소, 펩티드, DNA자임(DNAzyme), 유기 촉매, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1 태양의 예에서, 탈블로킹 촉매는 중합체성 하이드로겔에 부착된 금속-리간드 착물의 금속이다.
제1 태양의 예에서, 탈블로킹 촉매는 카르복실산, 포스폰산, 설폰산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산 촉매이다.
제1 태양의 예에서, 탈블로킹 촉매는 아민, 헤테로사이클릭 아민, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 촉매이다.
제1 태양의 예에서, 탈블로킹 촉매는 효소이다.
제1 태양의 예에서, 탈블로킹 촉매는 펩티드이다.
제1 태양의 예에서, 탈블로킹 촉매는 DNA자임이다.
본 명세서에 개시된 키트의 임의의 특징들은 예를 들어, 탈블로킹 동역학 향상을 비롯하여, 본 개시 내용에 기술된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 임의의 바람직한 방식 및/또는 구성으로 함께 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 제2 태양에서, 상기 방법은 기재; 탈블로킹 촉매를 포함하는, 기재 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔; 및 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 주형 가닥을 포함하는 플로우 셀에 혼입 믹스(incorporation mix)를 도입하는 단계; 이에 의해, 염기에 부착된 염료 표지; 및 당에 부착된 3' OH 블로킹 기를 포함하는 개별 뉴클레오티드를, 주형 가닥을 따라 각각의 초기(nascent) 가닥에 혼입하는 단계; 혼입 믹스를 제거하는 단계; 개별 뉴클레오티드의 혼입을 광학적으로 이미징하는 단계; 및 3' OH 블로킹 기의 절단을 개시하기 위한 성분을 포함하는 절단 믹스를 플로우 셀에 도입하여, 탈블로킹 촉매가 3' OH 블로킹 기의 절단을 가속화하는 단계를 포함한다.
제2 태양의 예에서, 촉매는 3' OH 블로킹 기의 외측 보호기의 제거를 가속화하고, 절단 믹스 내의 시약은 3' OH 블로킹 기의 내측 보호기를 제거한다.
본 방법의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 방법 및/또는 키트의 특징들의 임의의 조합은, 예를 들어 탈블로킹 동역학 향상을 비롯하여, 본 개시 내용에 기술된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 본 명세서에 개시된 임의의 예와 함께 사용될 수 있고/있거나 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 제3 태양은 플로우 셀이며, 상기 플로우 셀은 기재; 기재 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔로서, 촉매적 중합체성 하이드로겔은 포스폰산; 헤테로사이클릭 아민; 효소; 펩티드; DNA자임; 금속-리간드 착물의 금속; 우레아, 티오우레아, 이미다졸, 구아니딘, 1,8-다이아자바이사이클로(5.4.0)운데스-7-엔, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 촉매; 및 광산 발생제(photoacid generator)로 이루어진 군으로부터 선택되는 탈블로킹 촉매를 포함하는, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔; 및 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 증폭 프라이머를 포함한다.
제3 태양의 예에서, 촉매는 촉매적 중합체성 하이드로겔의 단량체 단위 내로 혼입된다.
제3 태양의 예에서, 촉매는 초기 중합체성 하이드로겔에 그래프팅된다.
제3 태양의 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔은 초기 중합체성 하이드로겔을 포함하고, 플로우 셀은 초기 중합체성 하이드로겔에 부착된 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 탈블로킹 촉매는 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 상보적 올리고뉴클레오티드 테더(tether)에 부착된다.
플로우 셀의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 플로우 셀의 특징들 및/또는 키트 및/또는 방법의 특징들의 임의의 조합은, 예를 들어 향상된 탈블로킹 동역학에 기여하는 중합체성 하이드로겔을 생성하는 것을 비롯하여, 본 개시 내용에 기술된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 본 명세서에 개시된 임의의 예와 함께 사용될 수 있고/있거나 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 제4 태양은 플로우 셀이며, 상기 플로우 셀은 기재; 수소 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는, 기재 상의 중합체성 하이드로겔; 수소 결합 쌍의 제2 구성원을 통해 중합체성 하이드로겔에 부착된 탈블로킹 촉매; 및 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 증폭 프라이머를 포함한다.
이러한 플로우 셀의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 이러한 플로우 셀 및/또는 다른 플로우 셀의 특징들 및/또는 키트 및/또는 방법의 특징들의 임의의 조합은, 예를 들어 탈블로킹 동역학 향상을 비롯하여, 본 개시 내용에 기술된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 본 명세서에 개시된 임의의 예와 함께 사용될 수 있고/있거나 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 제5 태양은 방법이며, 상기 방법은 촉매적 중합체성 하이드로겔을 플로우 셀 기재의 표면에 적용하는 단계로서, 촉매적 중합체성 하이드로겔은 포스폰산; 헤테로사이클릭 아민; 효소; 펩티드; DNA자임; 금속-리간드 착물의 금속; 우레아, 티오우레아, 이미다졸, 구아니딘, 1,8-다이아자바이사이클로(5.4.0)운데스-7-엔, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 촉매; 및 광산 발생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 탈블로킹 촉매를 포함하는, 상기 단계; 및 증폭 프라이머를 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착하는 단계를 포함한다.
제5 태양의 예는 탈블로킹 촉매를 포함하는 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
제5 태양의 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는 프라이머-그래프팅 작용기를 포함하는 제1 단량체를 탈블로킹 촉매를 포함하는 제2 단량체와 공중합하는 단계를 포함한다.
제5 태양의 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는 초기 중합체성 하이드로겔을 합성하는 단계; 및 촉매를 초기 중합체성 하이드로겔에 그래프팅하는 단계를 포함한다.
제5 태양의 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는 초기 중합체성 하이드로겔을 합성하는 단계; 초기 중합체성 하이드로겔에 올리고뉴클레오티드를 그래프팅하는 단계; 및 상보적 올리고뉴클레오티드 테더를 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 단계를 포함하며, 촉매는 상보적 올리고뉴클레오티드 테더에 부착된다.
제5 태양의 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는 초기 중합체성 하이드로겔을 합성하는 단계; 및 금속-리간드 착물을 초기 중합체성 하이드로겔에 부착하는 단계를 포함하며, 금속-리간드 착물의 금속은 촉매이다.
본 방법의 임의의 특징들은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 이러한 방법 및/또는 다른 방법의 특징들 및/또는 키트 및/또는 플로우 셀의 특징들의 임의의 조합은, 예를 들어 탈블로킹 동역학 향상을 비롯하여, 본 개시 내용에 기술된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 본 명세서에 개시된 임의의 예와 함께 사용될 수 있고/있거나 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 예의 특징은 동일한 도면 참조부호가 유사하지만 아마도 동일하지 않은 구성요소에 대응하는 하기의 상세한 설명 및 도면을 참조함으로써 명백해질 것이다. 간결함을 위해, 이전에 설명된 기능을 갖는 도면 참조부호 또는 특징부는 이들이 나타나는 다른 도면과 관련하여 설명되거나 설명되지 않을 수 있다.
도 1은 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드의 예를 탈블로킹하기 위한 다단계 공정을 예시하는 개략 흐름도이고;
도 2는 비공유 결합의 예를 통해 중합체성 하이드로겔의 예에 부착된 촉매의 예의 개략도이고;
도 3a는 플로우 셀의 예의 평면도이고;
도 3b는 유동 채널 내에 위치된 중합체성 하이드로겔의 예를 포함하는 플로우 셀의 유동 채널의 예의 확대 부분 절단면도이고;
도 3c는 유동 채널 내에 형성된 함몰부 내에 위치된 중합체성 하이드로겔의 예를 포함하는 플로우 셀의 유동 채널의 예의 확대 부분 절단면도이다.
일부 핵산 서열분석 기술은 뉴클레오티드 내의 당 분자의 산소 원자에 결합된 3' OH 블로킹 기를 이용한다. 3' OH 블로킹 기는 각각의 서열분석 사이클에서 단일-염기 혼입만 일어날 수 있게 하는 가역적 종결인자로서의 역할을 할 수 있다. 더욱 구체적으로, 일부 경우에, 다음 서열분석 사이클을 개시하기 위해 3' OH 블로킹 기가 제거되어야 한다. 뉴클레오티드 혼입의 일시적인 종결은, 몇 가지 작용을 말하자면, 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 세척해 내고 혼입된 뉴클레오티드에 부착된 검출가능한 표지(예를 들어, 형광 염료)를 여기시키고 여기된 검출가능한 표지를 이미징하는 시간을 허용한다.
촉매적 중합체성 하이드로겔이 본 명세서에 개시된다. 촉매적 중합체성 하이드로겔의 촉매는 반응성 분자 또는 그의 일부이며, 이는 혼입된 뉴클레오티드로부터 3' OH 블로킹 기의 절단을 가속화한다. 촉매는 혼입 이벤트 동안 활성이 없도록 선택될 수 있다. 촉매는 (혼입 및 이미징 후) 탈블로킹 동안 일어나는 반응을 위해 선택될 수 있으며, 따라서 임의의 3' OH 블로킹 기의 절단을 가속화할 수 있다. 소정 실시 형태에서, 촉매는, 수용액에서 더 안정하지만 더 느린 탈블로킹 동역학을 나타내는 경향이 있는 3' OH 블로킹 기에 유용할 수 있다. 이들 경우에, 촉매는, 몇 가지 이점을 말하자면, 각각의 서열분석 사이클의 시간을 감소시키는 데 도움을 줄 수 있고, 총 서열분석 턴-어라운드(turn-around) 시간을 감소시키는 데 도움을 줄 수 있고, 탈블로킹이 느릴 때 발생할 수 있는 페이징(phasing) 문제를 감소시키는 데 도움을 줄 수 있다.
3' OH 블로킹 기의 절단 동안, 일련의 반응이 일어날 수 있다. 도 1은 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)의 예에 대한 이러한 일련의 반응의 일례를 도시한다. 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)는 헤테로사이클릭 염기 B, 당(도 1에서 데옥시리보스로 도시됨), 하나 이상의 포스페이트 기 P, 및 당에 부착된 3' OH 블로킹 기(12)를 포함한다. 이러한 예에서, 3' OH 블로킹 기(12)는 아지도메틸이다. 도 1의 단계 1에서, 포스핀(PR3, 여기서, R은 H 또는 (CH2)nOH(n은 1 내지 3임)임)을 첨가하여 아지드와 반응시킨다. 이 반응은 질소의 손실 및 이미노포스포란의 형성을 유발한다. 단계 2에서, 이미노포스포란을 가수분해하여 헤미아민성 에테르를 형성하고, 단계 3에서, 헤미아민성 에테르를 가수분해하여 3' OH를 드러낸다. 도 1에 도시된 탈블로킹을 위해, 도 1의 단계 2 및/또는 3에서의 가수분해 단계를 가속화하는 임의의 촉매가 중합체성 하이드로겔 내에 또는 그 상에 혼입될 수 있거나, 또는 도 1의 단계 1에서의 반응을 가속화하는 임의의 촉매가 중합체성 하이드로겔 내에 또는 그 상에 혼입될 수 있다. 촉매가 도 1의 단계 1을 촉매하도록 특별히 선택되는 경우, 촉매는 3' OH 블로킹 기(12)의 외측 보호기(예를 들어, 도 1에 도시된 아지드 기)의 제거를 가속화하고, 절단 믹스 내의 시약은 3' OH 블로킹 기(12)의 내측 보호기(예를 들어, 도 1에 도시된 -CH2-)를 제거하는 데 사용될 수 있다.
도 1은 탈블로킹의 하나의 예를 예시하지만, 사용되는 촉매는 3' OH 블로킹 기 및 그러한 3' OH 블로킹 기의 절단에 사용되는 반응(들)에 따라 좌우될 수 있음이 이해되어야 한다.
정의
본 명세서에 사용되는 용어들은 달리 명시되지 않는 한 관련 기술 분야에서의 그들의 통상의 의미를 취할 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 몇몇 용어 및 그 의미가 이하에 제시되어 있다.
단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
용어 '포함하는', '비롯한', '함유하는' 및 이들 용어의 다양한 형태는 서로 동의어이며 동등하게 넓은 의미이다.
용어 '상부', '하부', '하측', '상측', '~ 상에' 등은 플로우 셀 및/또는 플로우 셀의 다양한 구성요소를 기술하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 이러한 방향 용어는 구체적인 배향을 의미하고자 하는 것이 아니라, 구성요소들 사이의 상대적인 배향을 지정하는 데 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 방향 용어의 사용이 본 명세서에 개시된 예를 임의의 구체적인 배향(들)으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
"아크릴아미드 단량체"는 구조
Figure pct00001
를 갖는 단량체 또는 그러한 구조를 갖는 아크릴아미드 기를 포함하는 단량체이다. 아크릴아미드 기를 포함하는 단량체의 예에는 아지도 아세트아미도 펜틸 아크릴아미드:
Figure pct00002
및 N-아이소프로필아크릴아미드:
Figure pct00003
가 포함된다. 다른 아크릴아미드 단량체가 사용될 수 있으며, 그의 일부 예가 본 명세서에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알킬"은 완전히 포화된(즉, 이중 또는 삼중 결합을 함유하지 않는) 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알킬 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예시적인 알킬 기에는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실 등이 포함된다. 예로서, 명칭 "C1-C6 알킬"은 알킬 사슬 내에 1 내지 6개의 탄소 원자가 존재함을 나타내며, 즉 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소부틸, sec-부틸, 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알케닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예시적인 알케닐 기에는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알킨" 또는 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알키닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아르알킬" 및 "아릴(알킬)"은 저급 알킬렌 기를 통해 치환체로서 연결된 아릴 기를 지칭한다. 아르알킬의 저급 알킬렌 및 아릴 기는 치환 또는 비치환될 수 있다. 예에는 벤질, 2-페닐알킬, 3-페닐알킬, 및 나프틸알킬이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아릴"은 고리 골격 내에 탄소만을 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 아릴이 고리 시스템일 때, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 아릴 기는 6 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 아릴 기의 예에는 페닐, 나프틸, 아줄레닐, 및 안트라세닐이 포함된다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, "아민" 또는 "아미노" 작용기는 -NRaRb 기를 지칭하며, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소(예컨대,
Figure pct00004
), C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카르보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 5원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "부착된"은 2개가 직접적으로 또는 간접적으로 서로 결합, 체결, 접착, 연결 또는 결속된 상태를 지칭한다. 예를 들어, 핵산은 중합체성 하이드로겔에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 부착될 수 있다. 공유 결합은 원자들 사이에 전자쌍을 공유하는 것을 특징으로 한다. 비공유 결합은 전자쌍의 공유를 수반하지 않는 물리적 결합이며, 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 친수성 상호작용 및 소수성 상호작용을 포함할 수 있다.
"아지드" 또는 "아지도" 작용기는 -N3을 지칭한다.
용어 "블록 공중합체" 및 "블록으로" 형성된 단량체 단위는 2개 이상의 단량체가 함께 클러스터링되어 반복 단위의 블록을 형성할 때 형성되는 공중합체를 지칭한다. 각각의 블록은 인접한 블록들에 존재하지 않는 적어도 하나의 특징부 및/또는 적어도 하나의 블록-특이적 작용기(예를 들어, 프라이머, 촉매 등을 부착하기 위한 아지드)를 가져야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "촉매적 중합체성 하이드로겔"은 단량체 단위들 중 하나에 혼입된 촉매를 갖는 공중합체를 지칭하거나, 또는 촉매가 부착된 초기 중합체성 하이드로겔을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "초기 중합체성 하이드로겔"은 촉매를 도입하기 위한 임의의 반응/상호작용 전의 중합된 하이드로겔을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "카르보사이클릴"은 고리 시스템 골격 내에 단지 탄소 원자만을 함유하는 비방향족 환형 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 카르보사이클릴이 고리 시스템인 경우에, 융합된, 가교된 또는 스피로-연결된 방식으로 2개 이상의 고리가 함께 결합될 수 있다. 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니라면, 카르보사이클릴은 임의의 포화도를 가질 수 있다. 따라서, 카르보사이클릴에는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 사이클로알키닐이 포함된다. 카르보사이클릴 기는 3 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 카르보사이클릴 고리의 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 2,3-다이하이드로-인덴, 바이사이클로[2.2.2]옥타닐, 아다만틸, 및 스피로[4.4]노나닐이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "카르복실산" 또는 "카르복실"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이 -COOH를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "사이클로알킬"은 완전히 포화된(이중 또는 삼중 결합이 없는) 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 고리 시스템을 지칭한다. 2개 이상의 고리로 구성되는 경우, 고리들은 융합된 방식으로 함께 결합될 수 있다. 사이클로알킬 기는 고리(들) 내에 3 내지 10개의 원자를 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 사이클로알킬 기는 고리(들) 내에 3 내지 8개의 원자를 함유할 수 있다. 사이클로알킬 기는 비치환 또는 치환될 수 있다. 예시적인 사이클로알킬 기에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "사이클로알케닐" 또는 "사이클로알켄"은 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미하며, 여기서 고리 시스템 내의 고리는 방향족이 아니다. 예에는 사이클로헥세닐 또는 사이클로헥센 및 노르보르네닐 또는 노르보르넨이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "사이클로알키닐" 또는 "사이클로알킨"은 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미하며, 여기서 고리 시스템 내의 고리는 방향족이 아니다. 예는 사이클로옥틴이다. 다른 예는 바이사이클로노닌이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "침착"은 수동 또는 자동일 수 있는 임의의 적합한 적용 기술을 지칭하며, 일부 경우에 표면 특성의 개질을 초래한다. 일반적으로, 침착은 증착 기술, 코팅 기술, 그래프팅 기술 등을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구체적인 예에는 화학 증착(CVD), 분무 코팅(예를 들어, 초음파 분무 코팅), 스핀 코팅, 덩크(dunk) 또는 딥(dip) 코팅, 닥터 블레이드 코팅, 퍼들 분배(puddle dispensing), 관류식(flow through) 코팅, 에어로졸 인쇄, 스크린 인쇄, 미세접촉 인쇄, 잉크젯 인쇄 등이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "함몰부"는 기재 또는 패턴화된 수지의 간극 영역(들)에 의해 적어도 부분적으로 둘러싸인 표면 개구를 갖는 기재 또는 패턴화된 수지 내의 별개의 오목한 특징부를 지칭한다. 함몰부는, 예로서 원형, 타원형, 정사각형, 다각형, 별 형상(임의의 개수의 꼭짓점을 가짐) 등을 비롯하여, 표면 내의 그의 개구에서 임의의 다양한 형상을 가질 수 있다. 표면과 직교하게 취해진 함몰부의 단면은 만곡형, 정사각형, 다각형, 쌍곡면, 원추형, 각진 형 등일 수 있다. 예로서, 함몰부는 웰(well) 또는 2개의 상호연결된 웰일 수 있다. 함몰부는 또한 리지(ridge), 스텝 특징부 등과 같은 더 복잡한 구조를 가질 수 있다.
용어 "각각"은 품목들의 집합과 관련하여 사용될 때, 집합 내의 개별 품목을 식별하도록 의도되지만, 반드시 집합 내의 모든 품목을 지칭하지는 않는다. 명시적 개시 또는 문맥이 명백히 달리 지시하면 예외들이 발생할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "플로우 셀"은 반응이 수행될 수 있는 챔버(예컨대, 유동 채널), 챔버로 시약(들)을 전달하기 위한 입구, 및 챔버로부터 시약(들)을 제거하기 위한 출구를 갖는 용기를 의미하고자 한다. 일부 예에서, 챔버는 챔버 내에서 일어나는 반응의 검출을 가능하게 한다. 예를 들어, 챔버는 어레이, 광학적으로 표지된 분자 등의 광학적 검출을 허용하는 하나 이상의 투명 표면을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유동 채널" 또는 "채널"은 액체 샘플을 선택적으로 수용할 수 있는 2개의 접합된 또는 달리 부착된 구성요소들 사이에 한정되는 영역일 수 있다. 일부 예에서, 유동 채널은 패턴화된 또는 패턴화되지 않은 기재와 덮개 사이에 한정될 수 있어서, 패턴화된 수지 내에 한정된 하나 이상의 함몰부와 유체 연통할 수 있다. 유동 채널은 또한 함께 접합되는 2개의 패턴화된 또는 패턴화되지 않은 기재 표면들 사이에 한정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클릭 아민"은 고리 골격 내의 하나의 또는 유일한 헤테로원자로서 아민 질소를 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로아릴"은 고리 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이로 한정되지 않는 탄소 이외의 원소를 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 헤테로아릴이 고리 시스템일 때, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴 기는 5 내지 18개의 고리 구성원(즉, 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 고리 골격 내에 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 비방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 헤테로사이클릴은 융합된, 가교된 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니라면, 헤테로사이클릴은 임의의 포화도를 가질 수 있다. 고리 시스템에서, 헤테로원자(들)는 비방향족 고리 또는 방향족 고리에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴기 는 3 내지 20개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 비롯한, 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있다. 일부 예에서, 헤테로원자(들)는 O, N, 또는 S이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "하이드라진" 또는 "하이드라지닐"은 -NHNH2 기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "하이드라존" 또는 "하이드라조닐"은
Figure pct00005
기를 지칭하며, 여기서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카르보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 5원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "하이드록시" 또는 "하이드록실"은 -OH 기를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "간극 영역"은, 예컨대, 함몰부를 분리하는 기재, 패턴화된 수지, 또는 다른 지지체의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 간극 영역은 어레이의 하나의 함몰부를 어레이의 다른 함몰부로부터 분리할 수 있다. 서로 분리된 2개의 함몰부는 별개의 것일 수 있으며, 즉 서로 물리적 접촉이 결여된 것일 수 있다. 다수의 예에서, 간극 영역은 연속적인 반면, 함몰부는, 예를 들어, 달리 연속적인 표면에서 한정된 복수의 함몰부의 경우와 같이 별개의 것이다. 다른 예에서, 간극 영역 및 특징부는, 예를 들어 각각의 간극 영역에 의해 분리된 복수의 트렌치의 경우와 같이 별개의 것이다. 간극 영역에 의해 제공되는 분리는 부분적인 또는 완전한 분리일 수 있다. 간극 영역은 표면에서 한정된 함몰부의 표면 재료와는 상이한 표면 재료를 가질 수 있다. 예를 들어, 함몰부는 중합체 및 그 안에 놓인 프라이머를 가질 수 있고, 간극 영역은 중합체도 그리고 그 상에 놓인 프라이머도 갖지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "니트릴 산화물"은 "RaC≡N+O-" 기를 의미하며, 여기서, Ra는 본 명세서에 정의되어 있다. 니트릴 산화물 제조의 예는 클로르아미드-T로 처리함으로써 또는 이미도일 클로라이드[RC(Cl)=NOH]에 대한 염기의 작용을 통해 또는 하이드록실아민과 알데하이드 사이의 반응에 의한 알독심으로부터의 원위치(in situ) 생성을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "니트론"은
Figure pct00006
기를 의미하며, 여기서, R1, R2, 및 R3은 본 명세서에 정의된 임의의 Ra 및 Rb 기 중 임의의 것일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산 서열의 단량체 단위이다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서, 당은 데옥시리보스, 즉 리보스의 2' 위치에 존재하는 하이드록실 기가 결여된 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기(즉, 핵염기)는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 그리고 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U), 그리고 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 핵산 유사체는 포스페이트 골격, 당, 또는 핵염기 중 임의의 것이 변경된 것일 수 있다. 핵산 유사체의 예에는, 예를 들어, 유니버설 염기 또는 포스페이트-당 골격 유사체, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)이 포함된다.
"패턴화된 수지"는 그 안에 한정된 함몰부를 가질 수 있는 임의의 중합체를 지칭한다. 수지 및 수지를 패턴화하기 위한 기술의 구체적인 예가 하기에서 추가로 설명될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포스폰산"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이 R-PO3H2를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프라이머"는 단일 가닥 핵산 서열(예컨대, 단일 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA)로서 정의된다. 본 명세서에서 증폭 프라이머로 지칭되는 일부 프라이머는 주형 증폭 및 클러스터 생성을 위한 시작점으로서의 역할을 한다. 본 명세서에서 서열분석 프라이머로 지칭되는 다른 프라이머는 DNA 또는 RNA 합성을 위한 시작점으로서의 역할을 한다. 프라이머의 5 '말단은 중합체의 작용기와의 커플링 반응을 허용하도록 변형될 수 있다. 프라이머 길이는 임의의 수의 염기 길이일 수 있으며, 다양한 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예에서, 서열분석 프라이머는 10 내지 60개의 염기, 또는 20 내지 40개의 염기의 범위의 짧은 가닥이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "스페이서 층"은 2개의 구성요소들을 함께 접합시키는 재료를 지칭한다. 일부 예에서, 스페이서 층은 접합에 도움이 되는 방사선-흡수 재료일 수 있거나, 접합에 도움이 되는 방사선-흡수 재료와 접촉하게 될 수 있다.
용어 "기재"는 플로우 셀의 다양한 성분(예를 들어, 촉매적 중합체성 하이드로겔, 프라이머(들) 등)이 첨가될 수 있는 구조체를 지칭한다. 기재는 웨이퍼, 패널, 직사각형 시트, 다이, 또는 임의의 다른 적합한 구성일 수 있다. 기재는 일반적으로 강성이고 수성 액체에 불용성이다. 기재는, 함몰부를 변형시키는 데 사용되거나 함몰부 내에 존재하는 화학 물질에 대해 불활성일 수 있다. 예를 들어, 기재는 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하거나, 프라이머(들)를 부착하는 등에 사용되는 화학 물질에 대해 불활성일 수 있다. 기재는 단층 구조 또는 다층 구조(예를 들어, 지지체 및 지지체 상의 패턴화된 수지를 포함함)일 수 있다. 적합한 기재의 예가 하기에서 추가로 설명될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "설폰산"은 본 명세서에 사용되는 바와 같이 -S(=O)₂-OH를 지칭한다.
"티올" 작용기는 -SH를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "테트라진" 및 "테트라지닐"은 4개의 질소 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴 기를 지칭한다. 테트라진은 선택적으로 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "테트라졸"은 4개의 질소 원자를 포함하는 5원 헤테로사이클릭 기를 지칭한다. 테트라졸은 선택적으로 치환될 수 있다.
촉매적 중합체성 하이드로겔
촉매적 중합체성 하이드로겔의 임의의 예의 중합체 골격은 액체 및 가스에 투과성인 반강성(semi-rigid) 중합체 재료일 수 있다. 일부 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔은 촉매가 부착되어 있는 초기 중합체성 하이드로겔을 포함한다. 이들 예에서, 촉매는 중합후 처리를 사용하여 초기 중합체성 하이드로겔에 첨가된다. 다른 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔은 그의 단량체 성분들 중 하나 내에 촉매를 포함하는 공중합체일 수 있다.
초기 중합체성 하이드로겔의 예에는 아크릴아미드 공중합체, 예를 들어 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드, PAZAM이 포함된다. PAZAM 및 일부 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 하기 화학식 I의 구조로 표시된다:
[화학식 I]
Figure pct00007
여기서,
RA는 아지도, 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알킨, 할로겐, 선택적으로 치환된 하이드라존, 선택적으로 치환된 하이드라진, 카르복실, 하이드록실, 선택적으로 치환된 테트라졸, 선택적으로 치환된 테트라진, 니트릴 옥사이드, 니트론, 설페이트, 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되고;
RB는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
RC, RD, 및 RE는 각각 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
-(CH2)p-의 각각은 선택적으로 치환될 수 있고;
p는 1 내지 50 범위의 정수이고;
n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고;
m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
당업자는 화학식 I의 구조에서 반복되는 "n" 및 "m" 특징부의 배열은 대표적인 것이며, 단량체 서브유닛은 중합체 구조 내에 임의의 순서로 (예를 들어, 랜덤, 블록, 패턴화 또는 이들의 조합으로) 존재할 수 있음을 이해할 것이다.
PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1500 kDa 또는 약 10 kDa 내지 약 1000 kDa의 범위일 수 있거나, 또는 특정 예에서 약 312 kDa일 수 있다.
일부 예에서, PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 선형 중합체이다. 일부 다른 예에서, PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 약하게 가교결합된 중합체이다.
다른 예에서, 초기 중합체성 하이드로겔은 화학식 I의 구조의 변형일 수 있다. 하나의 예에서, 아크릴아미드 단위는 N,N-다이메틸아크릴아미드(
Figure pct00008
)로 대체될 수 있다. 이러한 예에서, 화학식 I의 구조의 아크릴아미드 단위는
Figure pct00009
로 대체될 수 있으며, 여기서 RD, RE 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 (아크릴아미드의 경우에서와 같은 H 대신에) C1-C6 알킬이다. 이러한 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다. 다른 예에서, 아크릴아미드 단위에 더하여 N,N-다이메틸아크릴아미드가 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 화학식 I의 구조는 반복되는 "n" 및 "m" 특징부에 더하여
Figure pct00010
를 포함할 수 있으며, 여기서 RD, RE, 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 C1-C6 알킬이다. 이러한 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다.
초기 중합체성 하이드로겔의 다른 예로서, 화학식 I의 구조의 반복되는 "n" 특징부는 하기 화학식 II의 구조를 갖는 헤테로사이클릭 아지도 기를 포함하는 단량체로 대체될 수 있다:
[화학식 II]
Figure pct00011
(여기서, R1은 H 또는 C1-C6 알킬이고; R2는 H 또는 C1-C6 알킬이고; L은 탄소, 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 내지 20개의 원자를 갖는 선형 사슬, 및 사슬 내의 탄소 원자 및 임의의 질소 원자 상의 10개의 선택적인 치환체를 포함하는 연결기이고; E는 탄소, 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 원자를 포함하는 선형 사슬이며 사슬 내의 탄소 원자 및 임의의 질소 원자 상의 선택적인 치환체를 갖고; A는 N에 부착된 H 또는 C1-C4 알킬을 갖는 N 치환된 아미드이고; Z는 질소 함유 헤테로사이클이다. Z의 예에는 단일 환형 구조 또는 융합 구조로서 존재하는 5 내지 10개의 고리 구성원이 포함된다. Z의 일부 구체적인 예에는 피롤리디닐, 피리디닐, 또는 피리미디닐이 포함된다.
또 다른 예로서, 초기 중합체성 하이드로겔은 각각의 하기 화학식 III 및 화학식 IV의 구조의 반복 단위를 포함할 수 있다:
[화학식 III]
Figure pct00012
[화학식 IV]
Figure pct00013
.
여기서, R1a, R2a, R1b 및 R2b의 각각은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐로부터 선택되고; R3a 및 R3b의 각각은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 페닐, 또는 선택적으로 치환된 C7-C14 아르알킬로부터 선택되고; 각각의 L1 및 L2는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬렌 연결기 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌 연결기로부터 선택된다.
다른 분자가 올리고뉴클레오티드 프라이머를 그에 그래프팅하도록 작용화되는 한, 초기 중합체성 하이드로 겔을 형성하는 데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 적합한 중합체 층의 다른 예에는 콜로이드성 구조를 갖는 것들, 예를 들어 아가로스; 또는 중합체 메시 구조체, 예를 들어 젤라틴; 또는 가교결합된 중합체 구조체, 예를 들어 폴리아크릴아미드 중합체 및 공중합체, 실란 무함유 아크릴아미드(SFA), 또는 아지도 분해된(azidolyzed) 버전의 SFA가 포함된다. 적합한 폴리아크릴아미드 중합체의 예에는 아크릴아미드 및 아크릴산 또는 비닐 기를 함유하는 아크릴산으로부터, 또는 [2+2] 광-고리화 첨가 반응을 형성하는 단량체로부터 합성될 수 있다. 적합한 초기 중합체성 하이드로겔의 또 다른 예에는 아크릴아미드와 아크릴레이트의 혼합 공중합체가 포함된다. 아크릴 단량체(예를 들어, 아크릴아미드, 아크릴레이트 등)를 함유하는 다양한 중합체 구조체, 예를 들어 별형(star) 중합체, 별-형상 또는 별형-블록 중합체, 덴드리머(dendrimer) 등을 포함하는 분지형 중합체가 본 명세서에 개시된 예에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 단량체(예를 들어, 아크릴아미드, 촉매를 함유하는 아크릴아미드 등)는 랜덤하게 또는 블록으로 별-형상의 중합체의 분지(아암(arm)) 내에 혼입될 수 있다.
초기 중합체성 하이드로겔은 임의의 적합한 공중합 공정을 사용하여 형성될 수 있다. 이어서, 촉매가 초기 중합체성 하이드로겔에 부착되어 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성할 수 있다. 다양한 상이한 중합후 기술을 사용하여 초기 중합체성 하이드로겔에 촉매를 부착시킬 수 있다.
하나의 예에서, 촉매는 초기 중합체성 하이드로겔에 그래프팅될 수 있다. 이러한 예시적인 방법에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는 (촉매를 포함하지 않는) 초기 중합체성 하이드로겔을 합성하는 단계; 및 촉매를 초기 중합체성 하이드로겔에 그래프팅하는 단계를 포함한다. 하나의 예에서, 그래프팅하는 단계는 클릭 화학 반응, 예를 들어 구리 촉매 클릭 화학 반응을 포함하거나, 또는 바이사이클로[6.1.0] 논-4-인(BCN)과 같은 변형-촉진된(strain-promoted) 무촉매 클릭 화학 반응을 사용하는 것을 포함한다. 하나의 경우에, 클릭 화학 반응은 초기 중합체성 하이드로겔에 대한 촉매의 공유 부착을 야기한다. 일어나는 반응은 초기 중합체성 하이드로겔 및 촉매의 화학적 특성에 따라 좌우될 것임이 이해되어야 한다.
혼입된 뉴클레오티드로부터 3' OH 블로킹 기를 절단하는 화학 반응의 속도를 증가시키는 임의의 반응성 분자, 작용기 등이 촉매로서 사용될 수 있다. 임의의 산 촉매, 염기 촉매, 유기 촉매, 효소 촉매, 펩티드 촉매, 또는 DNA자임 촉매가 초기 중합체성 하이드로겔에 그래프팅될 수 있음이 이해되어야 한다. 열거된 촉매 중 일부는 열거된 촉매 카테고리 중 2가지에 속할 수 있다. 일부 구체적인 예에서, 탈블로킹 촉매는 포스폰산; 헤테로사이클릭 아민; 효소; 펩티드; DNA자임; 금속-리간드 착물의 금속; 우레아, 티오우레아, 이미다졸, 구아니딘, 1,8-다이아자바이사이클로(5.4.0)운데스-7-엔, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 촉매; 및 광산 발생제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 촉매는 카르복실산, 포스폰산, 설폰산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산 촉매이다. 산 촉매는 탈블로킹 동안 일어나는 가수분해 반응을 촉매할 수 있다.
다른 예에서, 촉매는 아민, 헤테로사이클릭 아민, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 촉매이다. 루이스 염기, 예를 들어 티오에테르, 트라이아졸, 이미다졸 등이 아지드 포스핀 반응(도 1의 단계 1)을 촉매하는 데 특히 적합할 수 있다. 염기 촉매는 탈블로킹 동안 일어나는 가수분해 반응을 촉매할 수 있다.
유기 촉매는 유기 화합물에서 발견되는 탄소, 수소, 황 및/또는 다른 비금속 원소로 이루어지며, 탈보호 화학 반응의 속도를 증가시킨다. 예시적인 유기 촉매는 우레아, 티오우레아, 이미다졸, 구아니딘, 1,8-다이아자바이사이클로(5.4.0)운데스-7-엔, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
효소 촉매는 가수분해효소일 수 있다. 적합한 가수분해효소의 예에는 포스파타제, 에스테라제(예를 들어, 아세틸콜린에스테라제, 리파제 등), 서열 특이적 프로테아제(예를 들어, TEV 프로테아제 또는 트롬빈), 및 글리코시다제(리보스를 분해하지 않음, 예를 들어, 셀룰로오스 또는 아밀라제)를 포함한다. 다른 적합한 가수분해효소는 탄산무수화효소이다. 다른 효소 촉매는 세린 프로테아제이며, 이는 단백질 내의 펩티드 결합을 절단하고 아미드 및 에스테르의 가수분해를 촉매할 수 있다.
다른 촉매에는 데옥시리보자임 또는 DNA 효소로도 지칭되는 DNA자임이 포함된다. 예시적인 DNA자임은 에스테라제와 같은 효소의 DNA-모방체와 같은 에스테르 기 가수분해를 표적으로 하는 것을 포함한다. 이러한 예에서, 탈보호 화학 반응은 DNA자임에 의해 촉매된다.
몇몇 예가 제공되었지만, 효소가 3' OH 블로킹 기의 탈보호를 촉매할 수 있는 한, 임의의 이용가능한 효소 또는 가공 효소(engineered enzyme)가 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.
펩티드 촉매의 예에는 소수성 외부 및 히스티딘-풍부 기공 내부를 갖는 초분자 β-배럴 에스테라제, 자가-조립된 펩티드 촉매, 및 다른 촉매적 펩티드 조립체가 포함된다. 이러한 예에서, 탈보호 화학 반응은 펩티드에 의해 촉매된다.
다른 예로서, 촉매는 초기 중합체성 하이드로겔의 표면에 비공유 부착을 통해 혼입될 수 있다. 비공유 부착에는, 예를 들어, 초기 중합체성 하이드로겔 표면 그래프팅된 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화, 수소 결합 어레이, 비오틴-스트렙타비딘 또는 다른 유사한 결합, 금속-리간드 착화 등이 포함될 수 있다.
도 2는 촉매의 비공유 부착의 하나의 예를 개략적으로 도시한다. 구체적으로, 도 2는 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 부착된 올리고뉴클레오티드(14)를 도시하며, 촉매(18)는 올리고뉴클레오티드(14)에 혼성화된 상보적 올리고뉴클레오티드 테더(20)에 부착된다. 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 부착된 올리고뉴클레오티드(14)는 증폭 프라이머에 대해 도 3a 내지 도 3c를 참조하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 말단 아지드에서의 클릭 화학을 통해) 그래프팅될 수 있다. 올리고뉴클레오티드(14)는 5 내지 20개의 뉴클레오티드(도 2에서 N으로 도시됨)를 가질 수 있고, 서열은 증폭 프라이머의 서열(하기에 논의됨)과 동일하거나 상이할 수 있다. 촉매(18)는 올리고뉴클레오티드(14)에 상보적인 서열을 갖는 테더(20)에 부착된다. 도 2에 도시된 예에 따라 부착될 수 있는 촉매(18)는 산 촉매, 염기 촉매, 유기 촉매(예를 들어, 이미다졸, 구아니딘 등), 구리 촉매, 효소 촉매, 펩티드 촉매, 또는 DNA자임 촉매 중 임의의 것을 포함한다.
적합한 구리 촉매에는 구리(I) 촉매, 예컨대 아세트산구리(I), 브롬화구리(I), 염화구리(I), 요오드화구리(I), 비스(1,3-비스(2,6-다이아이소프로필페닐)이미다졸-2-일리덴)구리(I) 테트라플루오로보레이트, 비스[(테트라부틸암모늄 요오다이드)구리(I) 요오다이드],[비스(트라이메틸실릴)아세틸렌](헥사플루오로아세틸아세토나토)구리(I), 브로모트리스(트라이페닐포스핀)구리(I), 클로로(1,5-사이클로옥타디엔)구리(I) 이량체, 구리(I) 3-메틸살리실레이트 등이 포함될 수 있다.
도 2에 도시된 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 형성하기 위한 방법의 예는 초기 중합체성 하이드로겔(16)(촉매(18)를 포함하지 않음)을 합성하는 단계; 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 올리고뉴클레오티드(14)를 그래프팅하는 단계; 및 상보적 올리고뉴클레오티드 테더(20)를 올리고뉴클레오티드(14)에 혼성화하는 단계를 포함하며, 촉매(18)는 상보적 올리고뉴클레오티드 테더(20)에 부착된다.
초기 중합체성 하이드로겔(16)에 대한 촉매(18)의 비공유 부착의 다른 예에는 수소 결합 어레이가 포함된다. 이러한 예에서, 촉매(18)는 중합체성 하이드로겔(16)에 수소 결합된다. 임의의 수소 결합 쌍이 사용될 수 있으며, 여기서 쌍의 하나의 성분은 초기 중합체성 하이드로겔에 공유적으로 부착되고, 쌍의 다른 성분은 촉매(18)에 부착된다. 수소 결합 쌍의 예에는, 몇 가지를 들자면, O···H, NH···N 및 CH···N이 포함된다.
초기 중합체성 하이드로겔(16)에 대한 촉매(18)의 비공유 부착의 또 다른 예에는 금속-리간드 착화가 포함한다. 하나의 예에서, 촉매(18)는 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 부착된 금속-리간드 착물의 금속이다. 촉매(18)는, 예를 들어 구리, 팔라듐, 루테늄 등과 같은 임의의 적합한 촉매 금속일 수 있다. 촉매 금속은 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 부착된 리간드와 착화된다. 금속-리간드 착물의 예에는 비스(2-피리딜메틸)-아민 또는 피리딘 작용화된 사이클로덱스트린과 같은 리간드를 갖는 구리(II) 착물이 포함된다.
촉매적 중합체성 하이드로겔(16')의 이러한 예를 형성하기 위한 방법의 예는 초기 중합체성 하이드로겔(16)을 합성하는 단계; 및 금속-리간드 착물을 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 부착하는 단계를 포함하며, 금속-리간드 착물의 금속은 촉매(18)이다.
초기 중합체성 하이드로겔(16)에 부착될 수 있는 또 다른 촉매(18)에는 광산 발생제가 포함된다. 광산 발생제가 촉매(18)로서 사용되는 경우, 촉매 활성은 특정 광산 발생제에 부합하는 파장의 광자와 같은 외부 자극에 노출 시에 개시되거나 향상될 수 있다.
광산 발생제 촉매는 게스트-호스트 화학을 통해 중합체성 하이드로겔(16')에 부착될 수 있으며, 여기서 촉매(18)는 게스트이고 호스트는 i) 중합체성 하이드로겔(16')에 부착할 수 있고, ii) 외부 자극에 의해 자극될 때까지 게스트를 유지할 수 있다. 예시적인 호스트 화합물에는 쿠커비투릴 및 사이클로덱스트린이 포함된다. 게스트 유형의 광산 발생제 촉매의 예는 청색/가시광-기반 광산 발생제이다. 광개시된 촉매(예를 들어, 광산 발생제)가 또한 게스트-호스트 예에서 게스트로서 사용될 수 있다.
게스트-호스트 분자는 본 명세서에 개시된 임의의 중합후 기술(예를 들어, 그래프팅, 비공유 부착)을 사용하여 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 부착될 수 있다.
몇몇 예가 제공되었지만, 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 부착된 촉매(18)는, 부분적으로는, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 도입되어야 하는 뉴클레오티드(10) 상에 포함된 블로킹 기(12)의 화학적 특성 및 초기 중합체성 하이드로겔(16)의 화학적 특성에 따라 좌우될 것이다.
본 명세서에 개시된 다른 예에서는, 초기 중합체성 하이드로겔(16)이 이용되지 않는다. 오히려, 공중합 생성물은 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')이다. 이들 예에서, 촉매(18)는 공중합 동안 사용되는 단량체 단위 내에 혼입된다.
이들 예에서, 촉매(18)는 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 대해 본 명세서에 기재된 아크릴아미드 단량체 단위 중 임의의 것의 일부일 수 있다. 하나의 예의 경우, 화학식 I의 구조의 RA는 카르복실 기일 수 있으며, 이는 산 촉매의 하나의 예이다. 다른 예의 경우, 화학식 II의 구조의 R2는 C1-C6 알킬일 수 있고, 촉매(18)는 C1-C6 알킬 사슬의 말단 기로서 혼입될 수 있다. 단량체 단위를 함유하는 촉매는, 단위들 중 하나가 프라이머-그래프팅 작용기를 포함하는 한, 본 명세서에 기재된 아크릴아미드 단량체 단위 중 임의의 것과 (랜덤하게 또는 블록으로) 공중합될 수 있다. 사용될 수 있는 아크릴아미드 단량체 단위를 함유하는 촉매의 하나의 예는 하기 화학식 V의 구조로 나타내어진다:
[화학식 V]
Figure pct00014
여기서, R4는 H 또는 CH3이고 X는 촉매로서 기능하는 작용기이다. 일부 예에서, 이러한 촉매(X)는 본 명세서에 개시된 산 촉매, 염기 촉매, 또는 유기 촉매의 임의의 예일 수 있다. 일부 예에서, 연결기(예를 들어, 알킬 기, 짧은 폴리(에틸렌 글리콜) 사슬 등)가 NH와 촉매(X) 사이에 위치될 수 있다.
사용될 수 있는 촉매 함유 단량체 단위의 다른 예에는 촉매(X)가 부착된 (메트)아크릴 단량체(예를 들어, 아크릴산, 메타크릴산)가 포함된다.
하나의 예시적인 방법에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 형성하는 단계는 프라이머-그래프팅 작용기(예를 들어, 아지드)를 포함하는 제1 단량체를, 촉매(18)를 포함하는 제2 단량체와 공중합하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 제3 아크릴아미드 단량체 단위가 또한 공중합 공정에 사용될 수 있다. 이러한 방법에 의해 형성된 공중합체의 하나의 예는 하기 화학식 VI의 구조로 나타내어진다:
[화학식 VI]
Figure pct00015
여기서, RA, RB, RC, RD, 및 RE, 및 p는 화학식 I의 구조에 대해 기술된 바와 같고, X는 화학식 V의 구조에 대해 기술된 바와 같고, n 및 r은 독립적으로 5 몰% 내지 30 몰%의 범위이고, m은 나머지 몰%이다.
예에서, 촉매(18)의 표면 농도는 중합체성 하이드로겔(16')의 반복 단위의 약 0.01% 내지 약 50%의 범위일 수 있다. 이러한 농도는 실제 촉매 용액 농도를 초과할 수 있 수 있으며, 이는 본 명세서에 개시된 예의 높은 효율에 기여한다.
또 다른 예에서, 친핵체-반응성 작용기는 촉매(18)를 위한 앵커로서 사용될 수 있거나, 또는 원위치에서 촉매를 생성한다. 일부 예에서, 친핵체-반응성 작용기는, 일부 경우에 pH 9 이상과 같은 염기성(높은 pH) 조건 하에서, 친핵체에 노출 시에 개환 반응을 겪을 수 있는 환형 설포네이트 에스테르(예를 들어, 설톤 고리)이다. 설톤의 개환 반응의 예는 다음과 같다:
Figure pct00016
하나의 예에서, 이러한 개환 반응은 산 또는 염기와 같은 촉매(18)가 원위치에서 생성되도록 탈블로킹 동안 수행될 수 있다. 친핵체-반응성 작용기는 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 부착된 촉매 전구체로 간주될 수 있다.
다른 예에서, "Nu"는 촉매(18)이고, 개환 반응은 이전에 설톤이었던 것에 대해 공유 결합을 생성한다. 탈블로킹이 수행될 때 촉매(18)가 존재하도록 이러한 반응은 서열분석 전에 형성될 수 있다.
친핵체-반응성 작용기의 다른 예는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00017
여기서, (a) Y는 SO2이고 Y'는 CH2이거나; 또는 (b) Y 및 Y'는 둘 모두 C(O)이다. 다른 태양에서, 친핵체-반응성 작용기는
Figure pct00018
또는
Figure pct00019
이다. 적합한 친핵체는 1차 알킬 아민 및 알킬 알코올을 포함한다.
일부 태양에서, 친핵체-반응성 작용기를 포함하는 단량체는:
Figure pct00020
이다.
특정 예에서, 단량체는:
Figure pct00021
또는
Figure pct00022
일 수 있다.
플로우 셀
중합체성 하이드로겔(16) 및 혼입된 촉매(18)는 플로우 셀(22)에 사용될 수 있으며, 그 예가 도 3a에 도시되어 있다. 플로우 셀(22)은 기재(24) 및 기재(24) 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 포함한다.
기재(24)는 단일 층/재료일 수 있다. 적합한 단일 층 기재의 예에는 에폭시 실록산, 유리 및 개질된 또는 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌(예컨대, 케무어스(Chemours)로부터의 테플론(TEFLON)(등록상표)), 환형 올레핀/사이클로-올레핀 중합체(COP)(예컨대, 제온(Zeon)으로부터의 제오노르(ZEONOR)(등록상표)), 폴리이미드 등을 포함), 나일론(폴리아미드), 세라믹/세라믹 산화물, 실리카, 용융 실리카, 또는 실리카계 재료, 규산알루미늄, 규소 및 개질된 규소(예컨대, 붕소 도핑된 p+ 규소), 질화규소(Si3N4), 산화규소(SiO2), 오산화탄탈럼(Ta2O5) 또는 다른 산화탄탈럼(들)(TaOx), 산화하프늄(HfO2), 탄소, 금속, 무기 유리 등이 포함된다. 기재(24)는 또한 다층 구조일 수 있다. 다층 구조의 일부 예는 산화탄탈럼 또는 다른 세라믹 산화물의 코팅 층이 표면에 있는 유리 또는 규소를 포함한다. 다층 구조의 다른 예는 패턴화된 수지가 상부에 있는 하부 지지체(예컨대, 유리 또는 규소)를 포함한다. 다층 기재의 또 다른 예는 SOI(silicon-on-insulator) 기재를 포함할 수 있다.
예에서, 기재(24)는 약 2 mm 내지 약 300 mm 범위의 직경, 또는 최대 약 10 피트(약 3 미터)의 최대 치수를 갖는 직사각형 시트 또는 패널을 가질 수 있다. 예에서, 기재(24)는 직경이 약 200 mm 내지 약 300 mm의 범위인 웨이퍼이다. 다른 예에서, 기재(24)는 폭이 약 0.1 mm 내지 약 10 mm인 다이이다. 예시적인 치수가 제공되었지만, 임의의 적합한 치수를 갖는 기재(24)가 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 다른 예의 경우, 300 mm 원형 웨이퍼보다 큰 표면적을 갖는 직사각형 지지체인 패널이 사용될 수 있다.
도 3a에 도시된 예에서, 플로우 셀(22)은 유동 채널(26)을 포함한다. 몇몇 유동 채널(26)이 도시되어 있지만, 임의의 개수의 채널(26)이 플로우 셀(22) 내에 포함될 수 있음이 이해되어야 한다(예컨대, 단일 채널(26), 4개의 채널(26) 등). 각각의 유동 채널(26)은 2개의 부착된 구성요소(예를 들어, 기재(24)와 덮개 또는 2개의 기재(24)) 사이에 한정되는 영역이며, 이는 그에 도입되고 그로부터 제거되는 유체(예컨대, 본 명세서에 기술된 것들)를 가질 수 있다. 각각의 유동 채널(26)은 임의의 특정 유동 채널(26) 내로 도입된 유체가 임의의 인접한 유동 채널(26) 내로 유동하지 않도록 각각의 다른 유동 채널(26)로부터 격리될 수 있다. 유동 채널(26) 내로 도입되는 유체의 일부 예는 반응 성분(예를 들어, 폴리머라제, 서열분석 프라이머, 뉴클레오티드 등), 세척 용액, 탈블로킹제(deblocking agent) 등을 도입할 수 있다.
유동 채널(26)은 부분적으로는 기재(24)의 재료(들)에 따라 좌우되는 임의의 적합한 기술을 사용하여 기재(24) 내에 한정될 수 있다. 하나의 예에서, 유동 채널(26)은 유리 기재(24) 내에 에칭된다. 다른 예에서, 유동 채널(26)은 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피 등을 사용하여 다층 기재(24)의 수지 내에 패턴화될 수 있다. 또 다른 예에서, 별도의 재료(도시되지 않음)를 기재(24)에 적용하여, 별도의 재료가 유동 채널(26)의 벽을 한정하고 기재(24)가 유동 채널(26)의 하부를 한정하도록 할 수 있다.
예에서, 유동 채널(26)은 직사각형 구성을 갖는다. 유동 채널(26)의 길이 및 폭은 각각, 기재(24)의 길이 및 폭보다 작을 수 있어서, 유동 채널(26)을 둘러싸는 기재 표면의 일부분은 덮개(도시되지 않음) 또는 다른 기재(24)에 대한 부착에 이용가능하다. 일부 경우에, 각각의 유동 채널(26)의 폭은 적어도 약 1 mm, 적어도 약 2.5 mm, 적어도 약 5 mm, 적어도 약 7 mm, 적어도 약 10 mm 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 각각의 레인(20)의 길이는 적어도 약 10 mm, 적어도 약 25 mm, 적어도 약 50 mm, 적어도 약 100 mm 또는 그 이상일 수 있다. 각각의 유동 채널(26)의 폭 및/또는 길이는 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다. 다른 예에서, 유동 채널(26)은 정사각형(예컨대, 10 mm × 10 mm)이다.
마이크로접촉, 에어로졸 또는 잉크젯 인쇄가 유동 채널 벽을 한정하는 별도의 재료를 침착하는데 사용되는 경우 각각의 유동 채널(26)의 깊이는 단층 두께만큼 작을 수 있다. 다른 예의 경우, 각각의 유동 채널(26)의 깊이는 약 1 μm, 약 10 μm, 약 50 μm, 약 100 μm 또는 그 이상일 수 있다. 예에서, 깊이는 약 10 μm 내지 약 100 μm의 범위일 수 있다. 다른 예에서, 깊이는 약 5 μm 이하이다. 각각의 유동 채널(26)의 깊이는 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있음이 이해되어야 한다.
플로우 셀(22)의 유동 채널(26) 내의 구조의 상이한 예가 도 3b 및 도 3c에 도시되어 있다.
도 3b에 도시된 예에서, 플로우 셀(22)은 단일 층 기재(24A), 및 단일 층 기재(24A) 내에 한정된 유동 채널(26)을 포함한다. 이러한 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')은 유동 채널(26) 내에 위치된다.
촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 유동 채널(26) 내로 도입하기 위해, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')의 혼합물을 생성하고 이어서 기재(24)(유동 채널(26)이 내부에 한정됨)에 적용할 수 있다. 하나의 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')은 (예컨대, 물과의, 또는 에탄올 및 물과의) 혼합물로 존재할 수 있다. 이어서, 스핀 코팅, 또는 침지 또는 딥 코팅, 또는 양압 또는 음압 하에서의 재료의 유동, 또는 다른 적합한 기술을 사용하여 혼합물을 (유동 채널(들)(26) 내부를 포함하여) 기재 표면에 적용할 수 있다. 이러한 유형의 기술은 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 기재(24) 상에 (예를 들어, 유동 채널(26) 내에 그리고 간극 영역(28) 상에) 전면적으로 침착한다. 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 간극 영역(28) 상에는 침착하지 않고 유동 채널(26) 내에 특이적으로 침착하도록 다른 선택적 침착 기술(예컨대, 마스크, 제어된 인쇄 기술 등을 포함함)이 사용될 수 있다.
일부 예에서, 기재 표면(유동 채널(26)에서 노출되는 부분을 포함함)을 활성화시킬 수 있고, 이어서 (촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 포함하는) 혼합물을 그에 적용할 수 있다. 하나의 예에서, 실란 또는 실란 유도체(예를 들어, 노르보르넨 실란)가 증착, 스핀 코팅 또는 다른 침착법을 사용하여 기재 표면 상에 침착될 수 있다. 다른 예에서, 기재 표면을 플라즈마 애싱(plasma ashing)에 노출시켜, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 부착할 수 있는 표면 활성화제(들)(예를 들어, -OH 기)를 생성할 수 있다.
촉매적 중합체성 하이드로겔(16')의 화학적 특성에 따라, 적용된 혼합물을 경화 공정에 노출시킬 수 있다. 예에서, 경화는 실온(예를 들어, 약 25℃) 내지 약 95℃ 범위의 온도에서 약 1 밀리초 내지 약 수일간의 범위의 시간 동안 일어날 수 있다.
이어서, 유동 채널(들)(26) 내의 표면 상에 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')은 적어도 실질적으로 온전하게 남겨두면서, 유동 채널(들)(26)의 주연부에서 간극 영역(28)으로부터 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 제거하기 위해 폴리싱을 수행할 수 있다.
일부 예에서, 침착된 그대로의 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 이미 촉매(18)가 부착되어 있으며, 따라서 촉매(18)를 유동 채널(들)(26) 내로 도입하기 위한 어떠한 추가적인 처리도 수행되지 않는다. 이의 하나의 예는 촉매(18)가 중합체성 하이드로겔 골격의 단량체 단위의 일부인 경우이다. 이의 다른 예는 촉매(18)가 중합 후에 부착된 경우이다. 이와 같이, 본 명세서에 개시된 하나의 예시적인 방법은 촉매(18)를 포함하는 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 형성하는 단계; 및 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 기재(24)의 표면에 적용하는 단계를 포함한다.
다른 예에서, 침착된 그대로의 중합체성 하이드로겔은 촉매(18)가 부착되어 있지 않은 초기 중합체성 하이드로겔(16)이다. 초기 중합체성 하이드로겔(16)이 촉매(18)를 포함하지 않기 때문에, 촉매(18)를 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 도입하여 유동 채널(들)(26) 내에 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')을 형성하기 위해 추가적인 처리가 수행된다. 이들 예에서, 초기 중합체성 하이드로겔(16)을 유동 채널(들)(26) 내에 침착하고 폴리싱하고, 이어서 본 명세서에 기술된 임의의 중합후 부착 기술을 사용하여 촉매(18)를 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 도입할 수 있다. 초기 중합체성 하이드로겔(16)이 유동 채널(들)(26) 내에는 존재하고 간극 영역(들)(28) 상에는 존재하지 않기 때문에, 촉매(18)는 유동 채널(들)(26) 내의 초기 중합체성 하이드로겔(16)에 우선적으로 부착될 것이다.
플로우 셀(22)은 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 부착된 증폭 프라이머(30)를 또한 포함한다. 프라이머 부착에 대한 하기의 논의는 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')과 관련된다. 초기 중합체성 하이드로겔(16)이 유동 채널(들)(26) 내로 도입될 때, 촉매(18)는 증폭 프라이머(30) 전에 또는 후에 도입될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이와 같이, 프라이머 부착에 대한 논의는 초기 중합체성 하이드로겔(16)에도 적합하다.
유동 채널(26) 내의 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 증폭 프라이머(30)를 그래프팅하기 위해 그래프팅 공정이 수행될 수 있다. 예에서, 증폭 프라이머(30)는 프라이머(30)의 5' 말단에서 또는 그 부근에서 단일점 공유 부착에 의해 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 고정될 수 있다. 이러한 부착은 i) 프라이머(30)의 어댑터-특이적 부분이 그의 동족 서열분석-준비된 핵산 단편에 자유롭게 어닐링하도록 하고, ii) 프라이머 연장(primer extension)을 위해 3' 하이드록실 기가 자유롭게 남아있게 한다. 임의의 적합한 공유 부착이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 종결된 프라이머의 예에는 알킨 종결된 프라이머(예를 들어, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')의 아지드 표면 모이어티에 부착될 수 있음), 포스포-티오에이트 종결된 프라이머(예를 들어, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')의 브롬 표면 모이어티에 부착될 수 있음) 또는 아지드 종결된 프라이머(예를 들어, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')의 알킨 표면 모이어티에 부착될 수 있음)가 포함된다.
적합한 프라이머(30)의 구체적인 예에는 하이세크(HiSeq)™, 하이세크엑스(HiSeqX)™, 마이세크(MiSeq)™, 마이세크디엑스(MiSeqDX)™, 미니세크(MiniSeq)™, 넥스트세크(NextSeq)™, 넥스트세크디엑스(NextSeqDX)™, 노바세크(NovaSeq)™, 게놈 애널라이저(Genome Analyzer)™, 아이세크(ISEQ)™ 및 다른 인스트루먼트 플랫폼(instrument platform)에서 서열분석하기 위해, 일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.)에서 판매되는 시판용 플로우 셀의 표면에 사용되는 P5 및 P7 프라이머가 포함된다.
예에서, 그래프팅은 관류식 침착(예를 들어, 일시적으로 결속되거나 영구적으로 결속된 덮개를 사용함), 덩크 코팅, 분무 코팅, 퍼들 분배, 또는 프라이머(들)(30)를 유동 채널(26) 내의 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 부착시킬 다른 적합한 방법을 포함할 수 있다. 이들 예시적인 기술의 각각은 프라이머(들)(30), 물, 완충제 및 촉매를 포함할 수 있는 프라이머 용액 또는 혼합물을 이용할 수 있다. 임의의 그래프팅 방법에 의해, 프라이머(30)는 유동 채널(26) 내의 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')의 반응성 기와 반응하며, 주위 기재(24)에 대해 친화성을 갖지 않는다. 이와 같이, 프라이머(30)는 유동 채널(26) 내의 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 선택적으로 그래프팅된다.
도 3c에 도시된 예에서, 플로우 셀(22)은 지지체(32) 및 지지체(32) 상에 위치된 패턴화된 재료(34)를 포함하는 다층 기재(24B)를 포함한다. 패턴화된 재료(34)는 간극 영역(28)에 의해 분리된 함몰부(36)를 형성한다. 함몰부(36)는 유동 채널(들)(26)의 각각 내에 위치된다.
도 3c에 도시된 예에서, 패턴화된 재료(34)는 지지체(32) 상에 위치된다. 함몰부(36) 및 간극 영역(28)을 형성하도록 선택적으로 침착되거나, 침착되고 패턴화될 수 있는 임의의 재료가 패턴화된 재료(34)에 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
패턴화된 재료(34)의 하나의 예로서, 무기 산화물이 증착, 에어로졸 인쇄, 또는 잉크젯 인쇄를 통해 지지체(32)에 선택적으로 적용될 수 있다. 적합한 무기 산화물의 예에는 산화탄탈럼(예컨대, Ta2O5), 산화알루미늄(예컨대, Al2O3), 산화규소(예컨대, SiO2), 산화하프늄(예컨대, HfO2) 등이 포함된다.
패턴화된 재료(34)의 다른 예로서, 수지가 지지체(32)에 적용되고 이어서 패턴화될 수 있다. 적합한 침착 기술에는 화학 증착, 딥 코팅, 덩크 코팅, 스핀 코팅, 분무 코팅, 퍼들 분배, 초음파 분무 코팅, 닥터 블레이드 코팅, 에어로졸 인쇄, 스크린 인쇄, 미세접촉 인쇄 등이 포함된다. 적합한 패턴화 기술에는 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피(NIL), 스탬핑 기술, 엠보싱 기술, 성형 기술, 미세에칭 기술, 인쇄 기술 등이 포함된다. 적합한 수지의 일부 예에는 다면체 올리고머성 실세스퀴옥산 수지(POSS)계 수지, 비-POSS 에폭시 수지, 폴리(에틸렌 글리콜) 수지, 폴리에테르 수지(예컨대, 개환된 에폭시), 아크릴 수지, 아크릴레이트 수지, 메타크릴레이트 수지, 무정형 플루오로중합체 수지(예컨대, 벨렉스(Bellex)로부터의 사이탑(CYTOP)(등록상표)), 및 이들의 조합이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다면체 올리고머성 실세스퀴옥산"(POSS)은 실리카(SiO2)와 실리콘(R2SiO) 사이의 하이브리드 중간체(예를 들어, RSiO1.5)인 화학 조성물을 지칭한다. POSS의 예는 전체적으로 참고로 포함된 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기술된 것일 수 있다. 예에서, 조성물은 화학식 [RSiO3/2]n을 갖는 유기규소 화합물이며, 여기서 R 기는 동일하거나 상이할 수 있다. POSS에 대해 예시적인 R 기는 에폭시, 아지드/아지도, 티올, 폴리(에틸렌 글리콜), 노르보르넨, 테트라진, 아크릴레이트, 및/또는 메타크릴레이트, 또는 추가로, 예를 들어, 알킬, 아릴, 알콕시, 및/또는 할로알킬 기를 포함한다. 본 명세서에 개시된 수지 조성물은 단량체 단위로서 하나 이상의 상이한 케이지 또는 코어 구조를 포함할 수 있다. 다면체 구조는
Figure pct00023
와 같은 T8 구조일 수 있으며
Figure pct00024
로 표시될 수 있다. 이러한 단량체 단위는 전형적으로 작용기 R1 내지 R8의 8개의 아암을 갖는다.
단량체 단위는,
Figure pct00025
와 같이, T10로 지칭되는, 10개의 규소 원자 및 10개의 R 기를 갖는 케이지 구조를 가질 수 있거나,
Figure pct00026
와 같이, T12로 지칭되는, 12개의 규소 원자 및 12개의 R 기를 갖는 케이지 구조를 가질 수 있다. POSS계 재료는 대안적으로 T6, T14, 또는 T16 케이지 구조를 포함할 수 있다. 평균 케이지 함량은 합성 동안 조정될 수 있고/있거나 정제 방법에 의해 제어될 수 있고, 단량체 유닛(들)의 케이지 크기의 분포가 본 명세서에 개시된 예에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 POSS 예의 일부에서, R1 내지 R8 또는 R10 또는 R12 중 적어도 하나는 에폭시를 포함한다. R1 내지 R8 또는 R10 또는 R12는 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있으며, 일부 예에서 R1 내지 R8 또는 R10 또는 R12 중 적어도 하나는 에폭시를 포함하고 R1 내지 R8 또는 R10 또는 R12 중 다른 적어도 하나는 비-에폭시 작용기이다. 비-에폭시 작용기는 (a) 수지를 증폭 프라이머, 중합체, 또는 중합제에 커플링시키기 위한 핸들로서 역할을 하는, 에폭시 기에 직교 반응성(orthogonally reactive)인(즉, 에폭시 기와는 상이한 조건 하에서 반응하는) 반응성 기일 수 있거나; 또는 (b) 수지의 기계적 또는 기능적 특성을 조정하는, 예컨대, 표면 에너지를 조정하는 기일 수 있다. 일부 예에서, 비-에폭시 작용기는 아지드/아지도, 티올, 폴리(에틸렌 글리콜), 노르보르넨, 테트라진, 아미노, 하이드록실, 알키닐, 케톤, 알데하이드, 에스테르 기, 알킬, 아릴, 알콕시, 및 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 3c에 도시된 바와 같이, 패턴화된 재료(34)는 내부에 한정된 함몰부(36), 및 인접한 함몰부(36)들을 분리하는 간극 영역(28)을 포함한다. 규칙적인 패턴, 반복 패턴 및 비규칙적인 패턴을 포함하여, 함몰부(36)의 많은 상이한 레이아웃이 예상될 수 있다. 예에서, 함몰부(36)는 최밀 충전(close packing) 및 밀도 개선을 위해 육각 격자에 배치된다. 다른 레이아웃에는, 예를 들어, 직선형(직사각형) 레이아웃, 삼각형 레이아웃 등이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 행(row) 및 열(column)로 있는 함몰부(36)의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(36) 및/또는 간극 영역(28)의 반복 배열일 수 있다. 또 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(36) 및/또는 간극 영역(28)의 랜덤 배열일 수 있다. 패턴은 스폿, 패드, 웰, 포스트, 줄무늬, 소용돌이, 선, 삼각형, 직사각형, 원, 호, 체크, 격자무늬, 대각선, 화살표, 정사각형, 및/또는 크로스-해치를 포함할 수 있다.
함몰부(36)의 레이아웃 또는 패턴은 한정된 영역 내의 함몰부(36)의 밀도(함몰부(36)의 개수)와 관련하여 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 함몰부(36)는 대략 2백만개/㎟의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는, 예를 들어, 약 100개/㎟, 약 1,000개/㎟, 약 십만개/㎟, 약 백만개/㎟, 약 2백만개/㎟, 약 5백만개/㎟, 약 천만개/㎟, 약 5천만개/㎟의 밀도, 또는 그 이상, 또는 그 이하를 포함하는 상이한 밀도로 조정될 수 있다. 패턴화된 재료(34) 내의 함몰부(36)의 밀도는 상기 범위로부터 선택되는 하부값 중 하나와 상부값 중 하나 사이에 있을 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다. 예로서, 고밀도 어레이는 함몰부(36)들이 약 100 nm 미만만큼 분리된 것을 특징으로 할 수 있고, 중간 밀도 어레이는 함몰부(36)들이 약 400 nm 내지 약 1 μm만큼 분리된 것을 특징으로 할 수 있고, 저밀도 어레이는 함몰부(36)들이 약 1 μm 초과만큼 분리된 것을 특징으로 할 수 있다. 예시적인 밀도가 제공되었지만, 임의의 적합한 밀도가 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 함몰부(36)의 밀도는 부분적으로는 함몰부(36)의 깊이에 따라 좌우될 수 있다. 일부 경우에, 함몰부(36)들 사이의 간격이 본 명세서에 열거된 예보다 훨씬 더 큰 것이 바람직할 수 있다.
함몰부(36)의 레이아웃 또는 패턴은 또한 또는 대안적으로 평균 피치, 또는 함몰부(36)의 중심으로부터 인접한 함몰부(36)의 중심까지의 간격(중심간 간격) 또는 하나의 함몰부(36)의 에지로부터 인접한 함몰부(36)의 에지까지의 간격(에지간 간격)의 관점에서 특징지어질 수 있다. 패턴은 규칙적일 수 있어서, 평균 피치 주위의 변동 계수가 작거나, 또는 패턴은 비규칙적일 수 있으며, 이 경우에 변동 계수는 비교적 클 수 있다. 어느 경우든, 평균 피치는, 예를 들어, 약 50 nm, 약 0.1 μm, 약 0.5 μm, 약 1 μm, 약 5 μm, 약 10 μm, 약 100 μm, 또는 그 이상 또는 그 이하일 수 있다. 특정 패턴의 함몰부(36)의 평균 피치는 상기 범위로부터 선택되는 하부값 중 하나와 상부값 중 하나 사이에 있을 수 있다. 예에서, 함몰부(36)는 약 1.5 μm의 피치(중심간 간격)를 갖는다. 예시적인 평균 피치 값이 제공되었지만, 다른 평균 피치 값이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
각각의 함몰부(36)의 크기는 그의 부피, 개구 면적, 깊이, 및/또는 직경에 의해 특징지어질 수 있다.
각각의 함몰부(36)는 유체를 가둘 수 있는 임의의 부피를 가질 수 있다. 최소 또는 최대 부피는 예를 들어 플로우 셀(22)의 하류측 사용에 대해 예상되는 처리량(예를 들어, 다중성(multiplexity)), 분해능, 뉴클레오티드(10), 또는 분석물 반응성을 수용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 부피는 적어도 약 1×10-3 μ㎥, 적어도 약 1×10-2 μ㎥, 적어도 약 0.1 μ㎥, 적어도 약 1 μ㎥, 적어도 약 10 μ㎥, 적어도 약 100 μ㎥, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 부피는 최대 약 1×104 μ㎥, 최대 약 1×103 μ㎥, 최대 약 100 μ㎥, 최대 약 10 μ㎥, 최대 약 1 μ㎥, 최대 약 0.1 μ㎥, 또는 그 이하일 수 있다.
각각의 함몰부 개구가 차지하는 면적은 부피에 대해 전술된 것과 유사한 기준에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각각의 함몰부 개구에 대한 면적은 적어도 약 1×10-3 μm2, 적어도 약 1×10-2 μm2, 적어도 약 0.1 μm2, 적어도 약 1 μm2, 적어도 약 10 μm2, 적어도 약 100 μm2, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 면적은 최대 약 1×103 μm2, 최대 약 100 μm2, 최대 약 10 μm2, 최대 약 1 μm2, 최대 약 0.1 μm2, 최대 약 1×10-2 μm2, 또는 그 이하일 수 있다. 각각의 함몰부 개구가 차지하는 면적은 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다.
각각의 함몰부(36)의 깊이는 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')의 일부를 수용하기에 충분히 클 수 있다. 예에서, 깊이는 적어도 약 0.1 μm, 적어도 약 0.5 μm, 적어도 약 1 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 100 μm, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 깊이는 최대 약 1×103 μm, 최대 약 100 μm, 최대 약 10 μm, 또는 그 이하일 수 있다. 일부 예에서, 깊이는 약 0.4 μm이다. 각각의 함몰부(36)의 깊이는 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다.
일부 경우에, 각각의 함몰부(36)의 직경 또는 길이 및 폭은 적어도 약 50 nm, 적어도 약 0.1 μm, 적어도 약 0.5 μm, 적어도 약 1 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 100 μm, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 직경 또는 길이 및 폭은 최대 약 1×103 μm, 최대 약 100 μm, 최대 약 10 μm, 최대 약 1 μm, 최대 약 0.5 μm, 최대 약 0.1 μm, 또는 그 이하(예컨대, 약 50 nm)일 수 있다. 일부 예에서, 직경 또는 길이 및 폭은 약 0.4 μm이다. 각각의 함몰부(36)의 직경 또는 길이 및 폭은 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다.
도 3c에 도시된 예에서, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')은 각각의 함몰부(36) 내에 위치된다. 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')은, 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')이 함몰부(36) 내에 존재하고 주위 간극 영역(28) 상에는 존재하지 않도록, 도 3b를 참조하여 기술된 바와 같이 적용될 수 있다.
도 3c에 도시된 예에서, 프라이머(30)는 각각의 함몰부(36) 내의 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 그래프팅될 수 있다. 프라이머(30)는 도 3b를 참조하여 기술된 바와 같이 적용될 수 있으며, 따라서 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에는 그래프팅될 것이고 주위 간극 영역(28)에는 그래프팅되지 않을 것이다.
도 3a, 도 3b, 또는 도 3c에 도시되지는 않았지만, 플로우 셀(22)은 또한 기재(24)에 부착된 덮개를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예에서, 덮개는 기재(24)의 적어도 일부분에, 예를 들어 간극 영역(28) 중 일부에 접합될 수 있다. 덮개와 기재(24) 사이에 형성되는 접합은 화학적 접합, 또는 기계적 접합(예를 들어, 체결구 등을 사용함)일 수 있다.
덮개는 기재(24)를 향해 지향되는 여기광을 투과시키는 임의의 재료일 수 있다. 예로서, 덮개는 유리(예를 들어, 붕규산염, 용융 실리카 등), 플라스틱 등일 수 있다. 적합한 붕규산염 유리의 구매가능한 예는 스콧 노스 아메리카 인코포레이티드(Schott North America, Inc.)로부터 입수가능한 D 263(등록상표)이다. 적합한 플라스틱 재료, 즉, 사이클로올레핀 중합체의 구매가능한 예는 제온 케미칼즈 엘.피.(Zeon Chemicals L.P.)로부터 입수가능한 제오노르(등록상표) 제품이다.
덮개는 레이저 접합, 확산 접합, 양극 접합, 공정 접합(eutectic bonding), 플라즈마 활성화 접합, 유리 프릿 접합 또는 당업계에 공지된 다른 방법과 같은 임의의 적합한 기술을 사용하여 기재(24)에 접합될 수 있다. 예에서, 덮개를 기재(24)에 접합시키기 위해 스페이서 층이 사용될 수 있다. 스페이서 층은 기재(24)와 덮개의 적어도 일부를 함께 밀봉할 임의의 재료일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서 층은 기재(24)와 덮개의 접합에 도움이 되는 방사선-흡수 재료일 수 있다.
다른 예에서, 플로우 셀(22)은 또한 기재(24)에 부착된 추가적인 패턴화된 또는 패턴화되지 않은 기재(24)를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드
플로우 셀(22)의 예와 함께 사용되는 뉴클레오티드는 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)(도 1 참조)이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)는 뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드의 당에 부착된 3' OH 블로킹 기(12)를 포함한다. 뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 예 중 임의의 것일 수 있다.
3' OH 블로킹 기(12)는 뉴클레오티드 내의 당 분자의 산소 원자에 결합될 수 있다. 3' OH 블로킹 기(12)는 각각의 서열분석 사이클에서 단일-염기 혼입만 일어날 수 있게 하는 가역적 종결인자일 수 있다. 가역적 종결인자는 추가 염기가 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에 상보적인 초기 가닥 내에 혼입되는 것을 중단시킨다. 이는 단일의 혼입된 염기의 검출 및 식별을 가능하게 한다. 후속하여, 3' OH 블로킹 기(12)를 제거하여, 각각의 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에서 추가 서열분석 사이클이 일어날 수 있게 한다. 3' OH 블로킹 기(12)를 제거하기 위한 절단 반응은 촉매(18)에 의해 촉매된다.
상이한 3' OH 블로킹 기(12)의 예에는 3'-ONH2 가역적 종결인자, 3'-O-알릴 가역적 종결인자(-CH=CHCH2), 및 3'-O-아지도메틸 가역적 종결인자(-CH2N3)가 포함된다. 다른 적합한 가역적 종결인자에는 o-니트로벤질 에테르, 알킬 o-니트로벤질 카르보네이트, 에스테르 모이어티, 다른 알릴-모이어티, 아세탈(예를 들어, tert-부톡시-에톡시), MOM(-CH2OCH3) 모이어티, 2,4-다이니트로벤젠 설페닐, 테트라하이드로푸라닐 에테르, 3' 포스페이트, 에테르, -F, - H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3, 및 2-니트로벤젠 카르보네이트가 포함된다. 알릴 가역적 종결인자의 경우, 중합체성 하이드로겔(16')의 표면 상의 리간드는 팔라듐(Pd(0)) 촉매, 루테늄 촉매에 결합할 수 있다. 에스테르 및 아세탈의 경우, 본 명세서에 기술된 산 및/또는 염기 촉매 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)는 뉴클레오티드의 염기 B에 부착된 검출가능한 표지를 또한 포함할 수 있는 완전 작용성 뉴클레오티드이다. 검출가능한 표지는 발광성, 화학발광성, 형광성, 형광원성(fluorogenic), 발색성(chromophoric) 및/또는 색원체성(chromogenic) 모이어티를 포함하는 임의의 광학적으로 검출가능한 모이어티일 수 있다. 적합한 광학적으로 검출가능한 모이어티의 일부 예에는 플루오레세인 표지, 로다민 표지, 시아닌 표지(예를 들어, Cy3, Cy5 등), 및 알렉사(Alexa) 계열의 형광성 염료 및 다른 형광성 및 형광원성 염료)가 포함된다.
임의의 적합한 연결 분자를 사용하여 검출가능한 표지를 뉴클레오티드의 염기 B에 부착시킬 수 있다. 연결 분자는 절단가능하며, 탈블로킹 기(12)를 제거하기 위해 일어나는 유사한 일련의 반응을 겪을 수 있다. 하나의 예에서, 연결 분자는 화학식 -((CH2)2O)n-의 스페이서 기이며, 여기서 n은 2 내지 50의 정수이다.
일부 응용에서, 상이한 염기, 예를 들어 A, T, G, C(및 U 또는 I)를 포함하는 각각의 뉴클레오티드(10)에 대해 상이한 유형의 검출가능한 표지를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 형광성 또는 형광원성 표지는 각각의 표지가 다른 표지 그룹과 구별가능한 파장에서 여기 방사선을 흡수하고/하거나 형광을 방출하도록 선택될 수 있다. 그러한 구별가능한 유사체는 동일한 반응 혼합물에서 상이한 표지들의 존재를 동시에 모니터링하는 능력을 제공한다. 일부 예에서, 서열인 4개의 뉴클레오티드 중 하나는 표지를 포함하지 않을 수 있는 반면, 다른 3개의 뉴클레오티드는 상이한 표지를 포함한다.
서열분석 방법
플로우 셀(22)의 예는 합성(SBS)에 의한 서열분석과 같은 앙상블(ensemble) 서열분석 기술에 사용될 수 있다. 앙상블 서열분석에서, 증폭 프라이머(30)를 사용하여 플로우 셀(22) 상에 서열분석될 주형 폴리뉴클레오티드 사슬(도시되지 않음)을 형성할 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드 사슬 형성의 초기에, 임의의 핵산 샘플(예컨대, DNA 샘플 또는 RNA 샘플)로부터 라이브러리 주형을 제조할 수 있다. 핵산 샘플을 단일-가닥의 유사한 크기(예를 들어, 1000 bp 미만)의 DNA 또는 RNA 단편으로 단편화할 수 있다. 제조 동안, 어댑터가 이들 단편의 말단에 부가될 수 있다. 감소된 사이클 증폭을 통해, 다양한 모티프가 어댑터, 예를 들어 서열분석 결합 부위, 인덱스, 및 함몰부(36) 내의 프라이머(30)에 상보적인 영역에서 도입될 수 있다. 최종 라이브러리 주형은 양측 말단에 DNA 또는 RNA 단편 및 어댑터를 포함한다. 일부 예에서, 단일 핵산 샘플로부터의 단편은 그에 부가된 동일한 어댑터를 갖는다.
복수의 라이브러리 주형이 플로우 셀(22)에 도입될 수 있다. 다수의 라이브러리 주형이, 예를 들어, 유동 채널(들)(26) 내에 또는 유동 채널(들)(26) 내의 함몰부(36) 내에 고정된 2가지 유형의 프라이머(30) 중 하나에 혼성화된다.
이어서 클러스터 생성이 수행될 수 있다. 클러스터 생성의 하나의 예에서, 라이브러리 주형은 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 3' 연장에 의해 혼성화 프라이머로부터 카피(copy)된다. 원래의 라이브러리 주형은 변성되어, 카피가 유동 채널(26) 내에 또는 함몰부(36) 내에 고정된 채로 남는다. 등온 브리지 증폭 또는 일부 다른 증폭 형태를 사용하여 고정된 카피를 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 카피된 주형은 인접한 상보적 프라이머(30)에 루프되어 혼성화되고, 폴리머라제는 카피된 주형을 카피하여 이중 가닥 브리지를 형성하고, 이는 변성되어 2개의 단일 가닥으로 된 가닥을 형성한다. 이들 2개의 가닥은 인접한 상보적 프라이머(30)에 루프되어 혼성화되고, 다시 연장되어 2개의 새로운 이중 가닥 루프를 형성한다. 이 프로세스는 밀도가 높은 클론 클러스터를 생성하기 위해 등온 변성 및 증폭의 사이클에 의해 각각의 주형 카피에서 반복된다. 이중 가닥 브리지의 각각의 클러스터는 변성된다. 예에서, 역방향 가닥은 특정 염기 절단에 의해 제거되어, 정방향 주형 폴리뉴클레오티드 가닥을 남긴다. 클러스터링은 유동 채널(26)에서 또는 각각의 함몰부(36)에서 몇몇 주형 폴리뉴클레오티드 사슬의 형성을 야기한다. 클러스터링의 이러한 예는 브리지 증폭이며, 수행될 수 있는 증폭의 하나의 예이다. 배제 증폭(Examp) 작업 흐름(일루미나 인코포레이티드)과 같은 다른 증폭 기술이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
주형 폴리뉴클레오티드 사슬 상의 상보적 서열에 혼성화되는 서열분석 프라이머가 도입될 수 있다. 이러한 서열분석 프라이머는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬을 서열분석할 준비가 되게 한다.
서열분석을 개시하기 위해, 혼입 믹스(incorporation mix)가 플로우 셀(22)에 첨가될 수 있다. 하나의 예에서, 혼입 믹스는 액체 담체, 폴리머라제, 및 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)를 포함한다. 일부 예에서, 혼입 및 이미징 전에 블로킹 기(12)의 절단을 개시하는 것은 바람직하지 않기 때문에, 혼입 믹스는 촉매(18)를 활성화시키지 않도록 선택되는 것으로 이해되어야 한다. 게스트-호스트 예에서, 혼입 믹스는 비활성화된 상태의 게스트 촉매(예를 들어, 금속)를 포함할 수 있다. 게스트 촉매는 초기 중합체성 하이드로겔(16')에 (예를 들어, 리간드를 통해) 결합될 수 있고, 후속적으로, 탈블로킹 동안 직교 수단(예를 들어, 특정 파장에의 노출)에 의해 자극되어 게스트 촉매를 활성화된 형태로 전환시킬 수 있다.
혼입 믹스가 플로우 셀(22) 내로 도입될 때, 유체는 유동 채널(26) 및/또는 함몰부(36)(주형 폴리뉴클레오티드 사슬이 존재함)로 들어간다.
3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)를 주형 의존 방식으로 서열분석 프라이머에 첨가하여(그에 의해 서열분석 프라이머를 연장시켜), 서열분석 프라이머에 첨가된 뉴클레오티드의 순서 및 유형의 검출을 사용하여 주형의 서열을 결정할 수 있다. 더 구체적으로, 뉴클레오티드들 중 하나는 각각의 폴리머라제에 의해, 서열분석 프라이머를 연장시키며 주형 폴리뉴클레오티드 사슬에 상보적인 초기 가닥에 혼입된다. 다시 말해, 플로우 셀(22)을 가로지르는 주형 폴리뉴클레오티드 사슬의 적어도 일부에서, 각각의 폴리머라제는 혼입 믹스 내의 뉴클레오티드 중 하나에 의해 혼성화된 서열분석 프라이머를 연장시킨다.
이러한 예시적인 방법에서, 초기 가닥에 뉴클레오티드 염기를 혼입한 후에, 임의의 혼입되지 않은 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)를 포함하는 혼입 믹스를 플로우 셀(22)로부터 제거할 수 있다. 이는 세척 용액(예를 들어, 완충제)을 사용하여 달성될 수 있다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)는, 일단 뉴클레오티드가 서열분석 프라이머에 부가되면, 추가의 프라이머 연장을 종결시키는 가역적 종결 특성(예를 들어, 3' OH 블로킹 기(12))을 포함한다. 추가의 혼입이 일어나지 않고서, 가장 최근에 혼입된 뉴클레오티드(10)가 이미징 이벤트를 통해 검출될 수 있다. 이미징 이벤트 동안, 조명 시스템(도시되지 않음)은 유동 채널(26) 및/또는 함몰부(36)에 여기광을 제공할 수 있다.
이어서, 절단 믹스가 플로우 셀(22) 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에 개시된 예에서, 절단 믹스는 i) 혼입된 뉴클레오티드로부터 3' OH 블로킹 기(12)를 제거할 수 있고, ii) 혼입된 뉴클레오티드로부터 임의의 검출가능한 표지를 절단할 수 있다. 중합체성 하이드로겔(16') 상에 존재하는 촉매는 3' OH 블로킹 기의 제거 동안 일어나는 반응을 가속화할 수 있다. 3' OH 블로킹 기(12)의 제거는 후속 서열분석 사이클이 수행될 수 있게 하고, 촉매(18)와의 이러한 반응을 가속화하는 것은 전체 서열분석 프로세스를 더욱 효율적으로 만들 수 있다.
촉매의 일부 예는 탈블로킹 반응 동안 중간 단계를 가속화한다. 이와 같이, 절단 믹스의 혼입 및 탈블로킹 반응의 개시 시에, 촉매가 그의 기능을 수행한다. 광산 발생제가 촉매(18)로서 사용되는 경우, 촉매 활성을 개시하기 위해 추가적인 광 노출이 사용될 수 있다.
절단 믹스 내의 3' OH 블로킹 기 및 적합한 블로킹 방지제/성분의 예에는 염기 가수분해에 의해 제거될 수 있는 에스테르 모이어티; Nal, 클로로트라이메틸실란 및 Na2S2O3에 의해 또는 아세톤/물 중 Hg(II)에 의해 제거될 수 있는 알릴-모이어티; 포스핀, 예를 들어 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 트라이(하이드록시프로필)포스핀(THP)에 의해 절단될 수 있는 아지도메틸; 산성 조건에 의해 절단될 수 있는 아세탈, 예를 들어, tert-부톡시-에톡시; LiBF4 및 CH3CN/H2O에 의해 절단될 수 있는 MOM (-CH2OCH3) 모이어티; 티오페놀 및 티오설페이트와 같은 친핵체에 의해 절단될 수 있는 2,4-다이니트로벤젠 설페닐; Ag(I) 또는 Hg(II)에 의해 절단될 수 있는 테트라하이드로푸라닐 에테르; 및 포스파타제 효소(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 키나제)에 의해 절단될 수 있는 3' 포스페이트가 포함될 수 있다.
다양한 유체 전달 단계들 사이에서 세척(들)이 일어날 수 있다. 이어서, n개의 뉴클레오티드에 의해 서열분석 프라이머를 연장시키도록 SBS 사이클을 n회 반복하여, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 일부 예에서, 순방향 가닥이 서열분석되고 제거된 다음, 역방향 가닥이 구성되고 서열분석되는, 페어드-엔드(paired-end) 서열분석이 사용될 수 있다.
SBS가 상세히 설명되었지만, 본 명세서에 기술된 플로우 셀(22)은 다른 서열분석 프로토콜과 함께, 유전자형 결정을 위해, 또는 다른 화학적 및/또는 생물학적 응용에서 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 경우에, 플로우 셀의 프라이머는, 순방향 및 역방향 가닥 둘 모두가 촉매적 중합체성 하이드로겔(16') 상에 존재하여, 각각의 판독의 동시 염기 콜링(base calling)을 가능하게 하는 동시 페어드-엔드 서열분석을 가능하게 하도록 선택될 수 있다. 순차적 및 동시 페어드-엔드 서열분석은 게놈 재배열 및 반복적 서열 요소뿐만 아니라 유전자 융합 및 신규 전사체의 검출을 용이하게 한다. 다른 예에서, 본 명세서에 개시된 플로우 셀(10)은 온-플로우 셀(on-flow cell) 라이브러리 생성에 사용될 수 있다.
키트
본 명세서에 기술된 플로우 셀(22)의 임의의 예는 키트의 일부일 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에 개시된 중합체성 하이드로겔(16')의 임의의 예는 키트의 일부일 수 있다. 키트의 일부 예는 플로우 셀(22) 및 절단 믹스를 포함하며, 플로우 셀(22)은 기재(24); 촉매(18)를 포함하는, 기재(24) 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔(16'); 및 촉매적 중합체성 하이드로겔(16')에 부착된 증폭 프라이머(30)를 포함하고; 촉매(18)는, 플로우 셀(22)에 도입되고 증폭 프라이머(30)에 부착된 주형 가닥 내로 혼입되는 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드(10)의 블로킹 기(12)의 절단을 가속화하기 위한 것이고; 절단 믹스는 블로킹 기(12)의 절단을 개시하기 위한 성분을 포함한다.
추가적인 주석
하기에 더 상세히 논의되는 전술한 개념들 및 추가의 개념들의 모든 조합은 (그러한 개념들이 상호 불일치하지 않는다면) 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려됨이 이해되어야 한다. 특히, 본 명세서의 끝부분에 나타나는 청구된 발명 요지의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려된다. 참고로 포함된 임의의 개시내용에서 또한 나타날 수 있는 본 명세서에서 명시적으로 사용된 용어는 본 명세서에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미가 부여되어야 함이 또한 이해되어야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 "하나의 예", "다른 예", "예" 등에 대한 언급은 그 예와 관련하여 설명된 특정 요소(예를 들어, 특징, 구조, 및/또는 특성)가 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 예에 포함되고, 다른 예에 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 의미한다. 게다가, 임의의 예에 대해 설명된 요소는 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 다양한 예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 명세서에 제공된 범위는 언급된 범위 및 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위를, 그러한 값 또는 하위 범위가 명시적으로 언급된 것처럼, 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 약 2 mm 내지 약 300 mm의 범위는 약 2 mm 내지 약 300 mm의 명시적으로 언급된 한계뿐만 아니라, 약 40 mm, 약 250.5 mm 등과 같은 개별 값, 및 약 25 mm 내지 약 175 mm 등과 같은 하위 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, "약" 및/또는 "실질적으로"가 값을 설명하는 데 이용되는 경우, 이들은 언급된 값으로부터 작은 변동(최대 +/- 10%)을 포함하는 것을 의미한다.
몇몇 예가 상세하게 설명되었지만, 개시된 예는 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 전술한 설명은 비제한적인 것으로 여겨져야 한다.

Claims (21)

  1. 키트로서,
    플로우 셀로서,
    기재(substrate);
    탈블로킹(deblocking) 촉매를 포함하는, 상기 기재 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔; 및
    상기 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 증폭 프라이머를 포함하며,
    상기 촉매는, 상기 플로우 셀에 도입되고 상기 증폭 프라이머에 부착된 주형 가닥 내로 혼입되는 3' OH 블로킹된 뉴클레오티드의 블로킹 기의 절단을 가속화하는, 상기 플로우 셀; 및
    상기 블로킹 기의 절단을 개시하기 위한 성분을 포함하는 절단 믹스(cleavage mix)를 포함하는, 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 탈블로킹 촉매는 산 촉매, 염기 촉매, 효소, 펩티드, DNA자임(DNAzyme), 유기 촉매, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 탈블로킹 촉매는 상기 중합체성 하이드로겔에 부착된 금속-리간드 착물의 금속인, 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 탈블로킹 촉매는 카르복실산, 포스폰산, 설폰산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산 촉매인, 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 탈블로킹 촉매는 아민, 헤테로사이클릭 아민, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기 촉매인, 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 탈블로킹 촉매는 효소인, 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 탈블로킹 촉매는 펩티드인, 키트.
  8. 제1항에 있어서, 상기 탈블로킹 촉매는 DNA자임인, 키트.
  9. 방법으로서,
    기재;
    탈블로킹 촉매를 포함하는, 상기 기재 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔; 및
    상기 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 주형 가닥을 포함하는 플로우 셀에 혼입 믹스(incorporation mix)를 도입하는 단계;
    이에 의해,
    염기에 부착된 염료 표지; 및
    당에 부착된 3' OH 블로킹 기를 포함하는 개별 뉴클레오티드를 상기 주형 가닥을 따라 각각의 초기(nascent) 가닥에 혼입하는 단계;
    상기 혼입 믹스를 제거하는 단계;
    개별 뉴클레오티드의 혼입을 광학적으로 이미징하는 단계; 및
    상기 3' OH 블로킹 기의 절단을 개시하기 위한 성분을 포함하는 절단 믹스를 상기 플로우 셀에 도입하여, 상기 탈블로킹 촉매가 상기 3' OH 블로킹 기의 절단을 가속화하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 촉매는 상기 3' OH 블로킹 기의 외측 보호기의 제거를 가속화하고, 상기 절단 믹스 내의 시약은 상기 3' OH 블로킹 기의 내측 보호기를 제거하는, 방법.
  11. 플로우 셀로서,
    기재;
    상기 기재 상의 촉매적 중합체성 하이드로겔로서, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔은
    포스폰산;
    헤테로사이클릭 아민;
    효소;
    펩티드;
    DNA자임;
    금속-리간드 착물의 금속;
    우레아, 티오우레아, 이미다졸, 구아니딘, 1,8-다이아자바이사이클로(5.4.0)운데스-7-엔, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 촉매; 및
    광산 발생제(photoacid generator)로 이루어진 군으로부터 선택되는 탈블로킹 촉매를 포함하는, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔; 및
    상기 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 증폭 프라이머를 포함하는, 플로우 셀.
  12. 제11항에 있어서, 상기 촉매는 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔의 단량체 단위 내로 혼입되는, 플로우 셀.
  13. 제11항에 있어서, 상기 촉매는 초기 중합체성 하이드로겔에 그래프팅되는, 플로우 셀.
  14. 제11항에 있어서, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔은 초기 중합체성 하이드로겔을 포함하고, 상기 플로우 셀은 상기 초기 중합체성 하이드로겔에 부착된 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 탈블로킹 촉매는 상기 올리고뉴클레오티드에 혼성화된 상보적 올리고뉴클레오티드 테더(tether)에 부착되는, 플로우 셀.
  15. 플로우 셀로서,
    기재;
    수소 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하는, 상기 기재 상의 중합체성 하이드로겔;
    상기 수소 결합 쌍의 제2 구성원을 통해 상기 중합체성 하이드로겔에 부착된 탈블로킹 촉매; 및
    상기 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착된 증폭 프라이머를 포함하는, 플로우 셀.
  16. 방법으로서,
    촉매적 중합체성 하이드로겔을 플로우 셀 기재의 표면에 적용하는 단계로서, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔은
    포스폰산;
    헤테로사이클릭 아민;
    효소;
    펩티드;
    DNA자임;
    금속-리간드 착물의 금속;
    우레아, 티오우레아, 이미다졸, 구아니딘, 1,8-다이아자바이사이클로(5.4.0)운데스-7-엔, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 촉매; 및
    광산 발생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 탈블로킹 촉매를 포함하는, 상기 단계; 및
    증폭 프라이머를 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔에 부착하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 탈블로킹 촉매를 포함하는 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는 프라이머-그래프팅 작용기를 포함하는 제1 단량체를 상기 탈블로킹 촉매를 포함하는 제2 단량체와 공중합하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는
    초기 중합체성 하이드로겔을 합성하는 단계; 및
    상기 촉매를 상기 초기 중합체성 하이드로겔에 그래프팅하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는
    초기 중합체성 하이드로겔을 합성하는 단계;
    상기 초기 중합체성 하이드로겔에 올리고뉴클레오티드를 그래프팅하는 단계; 및
    상보적 올리고뉴클레오티드 테더를 상기 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 단계를 포함하며, 상기 촉매는 상기 상보적 올리고뉴클레오티드 테더에 부착되는, 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 촉매적 중합체성 하이드로겔을 형성하는 단계는
    초기 중합체성 하이드로겔을 합성하는 단계; 및
    금속-리간드 착물을 상기 초기 중합체성 하이드로겔에 부착하는 단계를 포함하며, 상기 금속-리간드 착물의 금속은 상기 촉매인, 방법.
KR1020217031343A 2019-12-16 2020-11-25 키트 및 플로우 셀 KR20220115857A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962948605P 2019-12-16 2019-12-16
US62/948,605 2019-12-16
PCT/US2020/062279 WO2021126503A1 (en) 2019-12-16 2020-11-25 Kits and flow cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220115857A true KR20220115857A (ko) 2022-08-19

Family

ID=73839126

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217031343A KR20220115857A (ko) 2019-12-16 2020-11-25 키트 및 플로우 셀

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220145379A1 (ko)
EP (1) EP4077726A1 (ko)
JP (1) JP2023506103A (ko)
KR (1) KR20220115857A (ko)
CN (1) CN113853442A (ko)
AU (1) AU2020407967A1 (ko)
BR (1) BR112021019641A2 (ko)
CA (1) CA3135280A1 (ko)
IL (1) IL286668A (ko)
MX (1) MX2021010496A (ko)
WO (1) WO2021126503A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020005503A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 Illumina, Inc. Flow cells
EP4363615A1 (en) * 2021-07-02 2024-05-08 Illumina, Inc. Flow cells
WO2023052391A1 (en) * 2021-09-29 2023-04-06 Illumina Cambridge Limited Flow cells with dark quencher
WO2024073506A1 (en) * 2022-09-29 2024-04-04 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing components including a glycolipid bi-layer

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2789383B1 (en) * 2004-01-07 2023-05-03 Illumina Cambridge Limited Molecular arrays
US20060210996A1 (en) * 2005-03-15 2006-09-21 Eric Leproust Methods for in situ generation of chemical arrays
US8715932B2 (en) * 2010-08-20 2014-05-06 Intel Corporation Nucleic acid sequencing
US9540688B2 (en) * 2014-02-19 2017-01-10 Personal Genomics, Inc. Real-time sequencing method for single molecule
US20170240961A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-24 Complete Genomics, Inc. Affinity tag labeled nucleosides and uses
WO2017185026A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 Complete Genomics, Inc. Reversibly blocked nucleoside analogues and their use
EP4112741A1 (en) * 2017-01-04 2023-01-04 MGI Tech Co., Ltd. Stepwise sequencing by non-labeled reversible terminators or natural nucleotides
JP7087010B2 (ja) * 2017-12-21 2022-06-20 イラミーナ インコーポレーテッド ヒドロゲルコーティングを有するフローセル
WO2019173515A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 Illumina Cambridge Limited Generalized stochastic super-resolution sequencing

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021019641A2 (pt) 2022-06-21
JP2023506103A (ja) 2023-02-15
US20220145379A1 (en) 2022-05-12
IL286668A (en) 2021-12-01
CN113853442A (zh) 2021-12-28
AU2020407967A1 (en) 2021-09-23
MX2021010496A (es) 2022-01-18
WO2021126503A1 (en) 2021-06-24
CA3135280A1 (en) 2021-06-24
EP4077726A1 (en) 2022-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102313291B1 (ko) 하이드로겔 코팅을 가진 플로우 셀
US20220145379A1 (en) Kits and flow cells
KR20200017430A (ko) 플로우 셀
US20210010080A1 (en) Selective surface patterning via nanoimprinting
KR20210033446A (ko) 수지 조성물 및 이를 혼입한 유동셀
JP2023550676A (ja) フローセル信号の変更
KR102323910B1 (ko) 촉매 활성 물질
US20230101095A1 (en) Flow cells with dark quencher
TW202043307A (zh) 包括雜聚物的流體槽
US20220154273A1 (en) Incorporation and imaging mixes
US20230416435A1 (en) Enhancing clustering efficiency and kinetics
US20240091782A1 (en) Flow cells
AU2022382968A1 (en) Primer sets and methods and kits incorporating the primer sets
TW202335739A (zh) 流體槽表面圖案化
TW202334385A (zh) 流體槽表面圖案化
KR20220107934A (ko) 게놈 dna의 증폭된 인접성 보존 라이브러리 단편들의 시간-기반 클러스터 이미징