KR20220107934A - 게놈 dna의 증폭된 인접성 보존 라이브러리 단편들의 시간-기반 클러스터 이미징 - Google Patents

게놈 dna의 증폭된 인접성 보존 라이브러리 단편들의 시간-기반 클러스터 이미징 Download PDF

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KR20220107934A
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나탈리 모렐
앤드류 슬래터
빅키 톰슨
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일루미나 케임브리지 리미티드
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Abstract

예시적인 방법에서, 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들이 게놈 샘플로부터의 복수의 라이브러리 단편들에 대해 생성된다. 일련의 이미지들 중 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지는 순차적으로 생성된다. 일련의 이미지들 중 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지를 생성하기 위해, i) 각각의 샘플을 플로우 셀로 도입하고(각각의 샘플은 복수의 라이브러리 단편들의 인접성 보존 라이브러리 단편들을 포함하고, 인접성 보존 라이브러리 단편들은 고체 지지체에 부착되어 있거나 서로 부착되어 있음); ii) 인접성 보존 라이브러리 단편들을 고체 지지체로부터 또는 서로로부터 방출시키고; iii) 인접성 보존 라이브러리 단편들을 증폭시켜 복수의 각각의 주형 가닥을 생성하고; iv) 각각의 주형 가닥을 염색하고; v) 각각의 주형 가닥을 이미징한다.

Description

게놈 DNA의 증폭된 인접성 보존 라이브러리 단편들의 시간-기반 클러스터 이미징
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 2일자로 출원된 미국 가출원 제62/942,563호의 이익을 주장하며, 그 내용은 전체적으로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
이중 가닥 DNA(dsDNA) 분자로부터 단편화되고 태그된 데옥시리보핵산(DNA) 분자의 라이브러리를 생성하는 것이 바람직한 다양한 방법 및 응용이 있다. 종종, DNA 시퀀싱 반응에서 주형으로 사용하기 위해 더 큰 dsDNA 분자로부터 더 작은 DNA 분자(예를 들어, DNA 단편)를 생성하는 것이 그 목적이다. 주형은 짧은 리드(read) 길이가 얻어질 수 있게 할 수 있다. 짧은 서열 리드들은 전형적으로 더 긴 전체 서열의 다양한 부분에 걸쳐 중복 커버리지(redundant coverage)를 제공하기 위해 다수의 다른 짧은 서열 리드와 중첩된다. 데이터 분석 동안, 많은 리드로부터의 중첩 서열들은 더 긴 서열 정보를 이어 맞추기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이, 중복되는 짧은 서열 리드들은 더 긴 핵산 서열을 재구성하기 위해 정렬될 수 있다. 일부 경우에는, 데이터 분석을 단순화하기 위해 사전 시퀀싱 단계(예컨대, 특정 핵산 분자의 바코딩)가 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 제1 태양은 게놈 샘플로부터의 복수의 인접성 보존(contiguity preserved) 라이브러리 단편들에 대한 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성하는 단계를 포함하는 방법이며, 이때 일련의 이미지들 중 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지는 하기 단계들에 의해 순차적으로 생성된다: 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 포함하는 각각의 샘플을 플로우 셀(flow cell)로 도입하는 단계로서, 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부는 고체 지지체에 부착되거나 서로 부착되어 있는, 단계; 고체 지지체로부터 또는 서로로부터 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부의 방출을 개시하는 단계; 복수의 각각의 주형 가닥을 생성하기 위해 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 증폭시키는 단계; 각각의 주형 가닥을 염색하는 단계; 및 각각의 주형 가닥을 이미징하는 단계.
본 명세서에 개시된 제2 태양은, 게놈 샘플의 복수의 인접성 보존 라이브러리 단편을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계로서, 복수의 인접성 보존 라이브러리 단편은 고체 지지체에 부착되거나 서로 부착되어 있는, 단계; 혼합물을 희석함으로써 플로우 셀로 도입하려는 미리 결정된 수의 희석 샘플을 생성하는 단계; 및 인접성 보존 라이브러리 단편들의 적어도 하나에 대해 시간-기반 클러스터링 이미지를 생성하는 단계를 포함하는 방법이며, 시간-기반 클러스터링 이미지는 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 포함하는 희석 샘플들 중 제1 희석 샘플을 플로우 셀로 도입하는 단계; 고체 지지체로부터 또는 서로로부터 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부의 방출을 개시하는 단계; 복수의 주형 가닥을 생성하기 위해 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 증폭시키는 단계; 복수의 주형 가닥을 염색하는 단계; 및 복수의 주형 가닥을 이미징하는 단계에 의해 생성된다.
본 명세서에 개시된 제3 태양은, 플로우 셀 리셉터클; 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀로 희석 샘플 및 염료를 각각 전달하기 위한 전달 플루이딕스(fluidics)를 포함하는 플루이딕 제어 시스템; 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀을 조명하도록 위치한 조명 시스템; 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀의 이미지를 캡처하도록 위치한 검출 시스템; 및 플루이딕 제어 시스템, 조명 시스템, 및 검출 시스템과 작동적으로 소통하는 컨트롤러를 포함하는 시스템이며, 컨트롤러는 전달 플루이딕스가 희석 샘플을 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀로 도입하게 하고; 희석 샘플에 존재하는 인접성 보존 라이브러리 단편들로부터 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀 내에 주형 가닥이 생성된 후에, 전달 플루이딕스가 염료를 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀로 도입하게 하고; 조명 시스템이 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀 내의 염색된 주형 가닥을 조명하게 하고; 검출 시스템이 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀 내의 조명되고 염색된 주형 가닥을 이미징하게 한다.
본 명세서에 개시된 제1 방법 및/또는 제2 방법 및/또는 시스템의 임의의 특징들은, 예를 들어, 분해된 클러스터 이미지를 사용한 특정 그룹의 주형 가닥들의 확인을 포함하는, 본 발명에 기술된 바와 같은 이익을 달성하기 위해 임의의 바람직한 방식 및/또는 구성으로 및/또는 본 명세서에 개시된 예들 중 임의의 것과 함께 조합될 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명의 실시예의 특징은 유사한 참조 부호가 유사하지만 아마도 동일하지 않은 구성요소에 대응하는 하기의 상세한 설명 및 도면을 참조함으로써 명백해질 것이다. 간결함을 위해, 이전에 설명된 기능을 갖는 참조 부호 또는 특징부는 이것이 나타나는 다른 도면과 관련하여 설명되거나 설명되지 않을 수 있다.
도 1은 고체 지지체에 부착된 인접성 보존 라이브러리 단편들을 포함하는 복합체의 일례를 제조하기 위한 방법의 일례의 개략도이고;
도 2a 내지 도 2c는 고체 지지체에 부착된 인접성 보존 라이브러리 단편들을 포함하는 복합체의 다른 예를 제조하는 방법의 다른 예를 함께 도시하는 개략도이고;
도 3은 단일 원 포트(one pot) 반응으로 수행되는 도 2a 내지 도 2c의 방법의 라이게이션 및 분해의 개략도이고;
도 4는 부착된 인접성 보존 라이브러리 단편들을 생성하는 라이브러리 제조 공정의 일부의 일례의 개략도이고;
도 5a는 플로우 셀의 일례의 평면도이고;
도 5b는 플로우 셀의 플로우 채널(flow channel)의 일례의 확대 부분 절개도이고;
도 5c는 플로우 셀의 플로우 채널의 다른 예의 확대 부분 절개도이고;
도 6a 내지 도 6d는 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성하는 방법에서의 몇몇 단계의 개략도이고;
도 7은 다양한 샘플에 대해 클러스터 생성이 수행된 후에 취해진 (도 7의 좌측에 있는) 이미지들, 및 샘플 각각에 대해 생성된 (도 7의 우측에 있는) 분해된 클러스터 이미지들의 개략도이고;
도 8은 도 4의 부착된 인접성 보존 라이브러리 단편들을 이용하는 플로우 셀 상에서 수행되는 라이브러리 제조 공정의 일부의 일례의 개략도이고;
도 9a 내지 도 9c는 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성하는 방법에서의 몇몇 단계의 개략도이고;
도 10은, 비-전이(non-transferred) 가닥이 열 변성을 이용하여 제거된 경우 및 비-전이 가닥이 T7 엑소뉴클레아제 조건을 이용하여 제거된 경우, INTS4P1 유전자의 AT 풍부 영역에 대한 결과를 도시하는 인터그레이티브 게노믹스 뷰어(INTEGRATIVE Genomics Viewer, IGV) 브라우저로부터의 흑백으로 재현된 원래 컬러인 스크린샷이고;
도 11은 도 2a 내지 도 2c 및 도 3에 도시된 방법에 의해 생성된 PCR-증폭 라이브러리 단편들의 크기(X-축, 염기쌍)에 대한 형광(Y-축, 형광 단위)을 도시하는 그래프이다.
라이브러리 단편들은 더 큰 또는 더 긴 DNA 단편의 유사한 크기(예를 들어, 1000 bp 미만)의 데옥시리보핵산(DNA) 조각들이다. 라이브러리 단편들은, 긴 DNA 단편이 유래되는 공통 유래 구획이 확인될 수 있는 경우, 시퀀싱 데이터에서 함께 그룹화될 수 있다. 합성의 긴 리드들에 대한 각각의 구획 내에서 서브-하플로이드(sub-haploid) 게놈 함량을 달성하기 위해 다양한 긴 DNA 단편들의 구획화가 바람직할 수 있다. 합성의 긴 리드들(또는 연결된 짧은 리드들)은 긴 DNA 단편이 유래되는 구획의 확인에 기초하여 복수의 짧은 단편들이 함께 그룹화될 수 있는 경우 가능해진다. 구획화는, 예를 들어 웰(well), 비드(bead), 소적(droplet), 또는 다른 물리적 구획을 사용하여 물리적으로 달성되었다.
이러한 구획화 접근법들 모두에 공통적인 것은 긴 DNA 단편이 유래되는 구획을 확인하기 위해 바코드(barcode) 서열 또는 인덱스(index) 서열이 사용된다는 원칙이다. 더 짧은 단편들 각각에 부착된 바코드 서열은 특정한 긴 DNA 단편에 독특할 수 있으며, 그에 따라 라이브러리 제조 동안 다양한 구획을 마킹하는 것을 도울 수 있다. 짧은 리드들이 모두 동일한 구획으로부터 유래된다는 가정에 기초하여 짧은 리드들을 함께 그룹화하여 합성의 긴 리드들을 형성하기 위해 사용되는 것이 바코드 서열이다.
본 명세서에 개시된 예시적인 방법들은 독특한 바코드 서열을 통합할 필요 없이 다양한 라이브러리 단편의 구획화를 달성한다. 방법은 인접성 보존 라이브러리 단편들 및 이미징을 이용하여 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성한다. 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지는 특정 세트의 주형 가닥들이 생성된 샘플(구획)을 확인하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 각각의 시퀀싱된 리드는 시간-기반 클러스터링 이미지들을 사용하여 그룹화될 수 있다. 이러한 그룹화는 리드들이 연결될 수 있게 하여, 긴 DNA 단편의 재구성을 가능하게 한다.
정의
본 명세서에 사용되는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술 분야에서 그의 통상적인 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에 사용되는 몇몇 용어 및 그 의미는 다음과 같다.
본 명세서에 사용되는 단수형은, 문맥 상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 "구비하는", "함유하는", 또는 "특징으로 하는"과 동의어이며, 포괄적 또는 개방형(open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "하나의 예", "다른 예", "일례" 등에 대한 언급은 상기 예와 관련하여 기재된 특정 요소(예를 들어, 특징부, 구조, 조성, 구성 및/또는 특성)가 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 예에 포함되며, 다른 예들에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 게다가, 임의의 예에 대해 설명된 요소들은 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 다양한 예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있음을 이해하여야 한다.
청구범위를 포함하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "실질적으로" 및 "약"은, 예를 들어 처리 시 편차로 인한 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 이러한 용어는 명시된 값에서 ±5% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±2% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±1% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±0.5% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±0.2% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±0.1% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
어댑터: 예를 들어, 라이게이션 또는 태그멘테이션(tagmentation)에 의해 핵산 분자에 융합될 수 있는 선형 올리고뉴클레오타이드 서열. 적절한 어댑터 길이는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 또는 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다. 어댑터는 뉴클레오타이드들 및/또는 핵산들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 어댑터는 프라이머, 예를 들어 유니버셜(universal) 뉴클레오타이드 서열(예컨대, P5 또는 P7 서열)을 포함하는 프라이머의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일례로서, 단편의 한쪽 말단에 있는 어댑터는 제1 플로우 셀 프라이머의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함하고, 단편의 다른쪽 말단에 있는 어댑터는 제2 플로우 셀 프라이머의 적어도 일부와 동일한 서열을 포함한다. 상보적 어댑터는 제1 플로우 셀 프라이머에 하이브리드화될 수 있고, 동일한 어댑터는 그의 상보적 카피에 대한 주형이며, 이는 클러스터링 동안 제2 플로우 셀 프라이머에 하이브리드화될 수 있다. 일부 예에서, 어댑터는 시퀀싱 프라이머 서열 또는 시퀀싱 결합 부위를 포함할 수 있다. 다양한 어댑터의 조합이 DNA 단편과 같은 핵산 분자 내로 통합될 수 있다.
포획 부위: 복합체의 국소화를 가능하게 하는 물리적으로 변형되고/변형되거나 화학적 특성을 이용하여 변형된 플로우 셀 표면의 일부. 일례에서, 포획 부위는 화학적 포획제(즉, 표적 분자(예를 들어, 복합체)에 부착하거나, 이를 보유하거나, 이에 결합할 수 있는 물질, 분자 또는 모이어티)를 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 화학적 포획제는 표적 분자에 (또는 표적 분자에 부착된 연결 모이어티에) 결합할 수 있는 수용체-리간드 결합쌍의 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등)을 포함한다. 화학적 포획제의 또 다른 예는 복합체와 정전기적 상호작용, 수소 결합, 또는 공유 결합(예를 들어, 티올-다이설파이드 교환, 클릭 화학, 딜스-알더(Diels-Alder) 등)을 형성할 수 있는 화학 시약이다.
복합체: 캐리어(carrier), 예를 들어 고체 지지체, 및 캐리어에 부착된 시퀀싱-레디(sequencing-ready) 핵산 단편. 캐리어는 다른 구성원이 포획 부위의 일부인 결합쌍의 하나의 구성원을 또한 포함할 수 있다.
단편: 유전 물질(예를 들어, DNA, RNA 등)의 일부 또는 조각. 인접성 보존 라이브러리 단편들은 단편화된 더 긴 핵산 샘플의 더 작은 조각들이며, 여기서 더 작은 단편들은 어떤 방식(예를 들어, 비드에 의한 방식, 트랜스포좀(transposome)을 이용한 방식 등)으로든 함께 유지된다.
핵산 분자 또는 샘플: 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 고분자 형태이며, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 이들의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 수 있다.
"주형" 핵산 분자(또는 가닥)는 분석하고자 하는 서열을 지칭할 수 있다.
핵산 샘플 내의 뉴클레오타이드는 자연 발생적 핵산 및 이의 기능적 유사체를 포함할 수 있다. 기능적 유사체의 예는 서열 특이적인 방식으로 핵산에 하이브리드화될 수 있거나, 특정 뉴클레오타이드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 자연 발생적 뉴클레오타이드는 일반적으로 포스포다이에스테르 결합을 포함하는 골격을 갖는다. 유사체 구조는 당업계에 공지된 다양한 것 중 임의의 것을 포함하는 대체 골격 결합을 가질 수 있다. 자연 발생적 뉴클레오타이드는 일반적으로 데옥시리보스 당(예를 들어, DNA에서 발견됨) 또는 리보스 당(예를 들어, RNA에서 발견됨)을 갖는다. 유사체 구조는 당업계에 공지된 다양한 것 중 임의의 것을 포함하는 대체 당 모이어티를 가질 수 있다. 뉴클레오타이드는 천연 또는 비천연 염기를 포함할 수 있다. 천연 DNA는 아데닌, 티민, 시토신 및/또는 구아닌 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 천연 RNA는 아데닌, 우라실, 시토신 및/또는 구아닌 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA) 및 가교 핵산(bridged nucleic acid, BNA)과 같은 임의의 비천연 염기가 사용될 수 있다.
프라이머: 인접성 보존 라이브러리 단편에 부착된 어댑터와 같은 표적 서열에 하이브리드화될 수 있는 핵산 분자. 하나의 예로서, 증폭 프라이머는 주형 증폭 및 클러스터 생성을 위한 개시점으로서의 역할을 할 수 있다. 다른 예로서, 합성된 핵산(주형) 가닥은 합성된 핵산(주형) 가닥에 상보적인 새로운 가닥의 합성을 프라이밍하기 위해 프라이머(예를 들어, 시퀀싱 프라이머)가 하이브리드화될 수 있는 부위를 포함할 수 있다. 임의의 프라이머는 뉴클레오타이드들 또는 이들의 유사체들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 프라이머는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 프라이머 길이는 임의의 수의 염기 길이일 수 있으며, 다양한 천연 및/또는 비-천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일례에서, 시퀀싱 프라이머는 10개 내지 60개의 염기, 또는 20개 내지 40개의 염기 범위인 짧은 가닥이다.
시퀀싱-레디 핵산 단편: 3' 및 5' 말단에 어댑터를 갖는 유전 물질의 일부(예를 들어, 인접성 보존 라이브러리 단편). 시퀀싱-레디 핵산 단편에서, 각각의 어댑터는 (예를 들어, 플로우 셀 상의 프라이머의 적어도 일부에 상보적인) 공지된 유니버셜 서열 및 시퀀싱 프라이머 서열을 포함한다. 시퀀싱-레디 핵산 단편은 고체 지지체(예를 들어, 비드)의 표면에 결합된 트랜스포존(transposon)의 삽입을 통해 결합되거나, 결합쌍 또는 다른 절단 가능 링커를 통해 직접 고정될 수 있다.
고체 지지체: 예를 들어, 규칙적인 치수를 갖든지 불규칙적인 치수를 갖든지 간에 구형, 타원형, 미소구체 또는 다른 인식된 입자 형상으로 특징지어지는 형상을 갖는 강성 또는 반강성 재료로 제조된 소체. 고체 지지체에는 시퀀싱 라이브러리가 부착될 수 있다. 고체 지지체에 유용한 예시적인 재료에는 유리; 플라스틱, 예컨대 아크릴, 폴리스티렌 또는 스티렌과 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(The Chemours Co로부터의 테플론(Teflon)®); 다당류 또는 가교결합된 다당류, 예컨대 아가로스 또는 세파로스; 나일론; 니트로셀룰로스; 수지; 규소 및 개질된 규소를 포함하는 실리카 또는 실리카계 재료; 탄소 섬유, 금속; 무기 유리; 광섬유 다발, 또는 다양한 다른 중합체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 고체 지지체에는 제어된 기공 유리 비드, 상자성 비드, 토리아 졸(thoria sol), SEPHAROSE® 비드(Cytivia로부터 입수 가능한 아가로스의 가교결합된 비드화 형태(beaded form)), 나노결정 및 예를 들어, 미국 인디애나주 피셔스 소재의 Bangs Laboratories의 Microsphere Detection Guide에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 다른 것들이 포함된다.
트랜스포좀: 인테그레이션(integration) 효소(예를 들어, 인테그라제(integrase) 또는 트랜스포사제(transposase))와, 전이 가능(transferrable) 가닥, 비-전이 가능 가닥, 또는 전이 가능 가닥 및 비-전이 가능 가닥 모두 사이에 형성된 복합체.
인접성 보존 라이브러리 단편
본 명세서에 개시된 예들에서, 플로우 셀로 도입된 라이브러리 단편들은 인접성 보존 라이브러리 단편들이다. 인접성 보존 라이브러리 단편들은 단편화된 더 긴 핵산 샘플의 더 작은 조각들이며, 여기서 더 작은 조각들은 어떤 방식으로든 물리적으로 함께 유지된다. 본 명세서에 개시된 일부 예에서, 인접성은 라이브러리 제조에서 고체 지지체를 사용하여 보존될 수 있다. 본 명세서에 개시된 다른 예들에서, 결합된 트랜스포좀(transposome)들을 통해 초기 라이브러리 제조 동안 서로 부착된 단편들을 생성하고, 부착된 단편들을 플로우 셀로 도입하고, 이어서 플로우 셀 상에서 라이브러리 제조를 완료함으로써 인접성이 보존될 수 있다.
도 1은 더 큰 핵산 샘플로부터의 단편들(14)을 포함하는 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12)을 포함하는 복합체(10)를 형성하는 방법의 일례를 도시하며, 샘플의 인접성은 고체 지지체(16) 상에서 보존된다.
도 1에 도시된 복합체(10)를 형성하는 하나의 예시적인 방법에서, 어댑터 서열(18)은 결합쌍의 하나의 구성원(20)을 통해 고체 지지체(16)에 결합된다. 일례에서, 이러한 어댑터 서열(18)은 제1 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 1 시퀀싱 프라이머 서열) 및 (도 5a 및 도 5b에 도시된) 플로우 셀 상의 증폭 프라이머들 중 하나(예를 들어, P5)의 적어도 일부에 상보적인 제1 서열(P5')을 포함할 수 있다. 어댑터 서열(18)은 결합쌍의 하나의 구성원(20)(예를 들어, 바이오틴)에 결합되어, 결합쌍의 다른 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘 등)을 포함하는 고체 지지체(16)의 표면에 결합될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 트랜스포좀 복합체(24")가 또한 고체 지지체(16)에 결합될 수 있다. 트랜스포좀 복합체(24")를 고체 지지체(16) 상에 로딩하기 전에, 부분 Y-어댑터(25')가 트랜스포사제 효소(32)(도시되어 있지는 않지만 2개의 Tn5 분자를 포함할 수 있음)와 혼합되어 트랜스포좀 복합체(24")의 일례를 형성할 수 있다. 부분 Y-어댑터(25')는 서로 하이브리드화되는 2개의 모자이크 단부 서열인 M1, M2를 포함할 수 있다. 모자이크 단부 서열 중 하나인 M1 은 태그멘테이션 동안 단편화된 DNA 가닥에 부착될 수 있는 유리 말단을 가지며, 그에 따라 도 2a 내지 도 2c의 전이(transferred) 가닥(26)과 유사하다. 나머지 모자이크 단부 서열인 M2는 제2 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 2 시퀀싱 프라이머 서열), 및 플로우 셀 상의 다른 증폭 프라이머(P7)의 적어도 일부와 동일한 서열을 가져 카피가 증폭 프라이머(P7)에 상보적(예를 들어, P7')이 되는 제2 서열(P7)에 부착될 수 있다. 이러한 예에서, 나머지 모자이크 단부 서열인 M2, 제2 시퀀싱 프라이머 서열 및 제2 서열은 어댑터 서열(22)을 구성한다. 어댑터 서열(22)은 태그멘테이션 동안 단편화된 DNA 가닥에 부착되지 않으며, 그에 따라 도 2a 내지 도 2c의 비-전이 가닥(28)과 유사하다.
트랜스포좀 복합체(24")를 고체 지지체(16) 상에 로딩하는 것은 트랜스포좀 복합체(24")를 고체 지지체(16)와 혼합하는 단계, 및 부분 Y-어댑터(25')의 모자이크 단부(M1)를 어댑터 서열(18)의 3'-말단에 라이게이션시키는 데 적합한 조건에 혼합물을 노출시키는 단계를 수반할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 개별 트랜스포좀 복합체(24")는 고체 지지체(16) 상의 어댑터 서열(18)들 각각에 부착될 수 있다.
복합체(10)를 형성하는 이러한 예시적인 방법에서, 테그멘테이션 공정이 이어서 수행될 수 있다. 더 긴 핵산 샘플(30)(예를 들어, DNA)을 포함하는 유체(예를 들어, 태그멘테이션 완충액)가 어댑터 서열(18) 및 이에 결합된 트랜스포좀 복합체(24")를 갖는 고체 지지체(16)에 첨가될 수 있다. 샘플이 트랜스포좀 복합체(24")와 접촉함에 따라, 더 긴 핵산 샘플이 태그멘테이션된다. 태그멘테이션의 이러한 예 동안, 샘플(30)은 단편들(14, 14')로 단편화되고, 단편들(14, 14') 각각은 그의 5' 말단에서 부분 Y-어댑터(25')의 모자이크 단부(M1)의 유리 말단으로 태그된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 더 긴 핵산 샘플(30)의 태그멘테이션은 트랜스포좀 복합체(24")들 사이에 복수의 가교된 분자를 생성한다. 가교된 분자들은 고체 지지체(16) 주위를 둘러싼다. 트랜스포좀 복합체(24")들 및 어댑터 서열(18)들은 가교된 분자들로서 핵산 샘플(30)의 인접성을 유지하며, 그에 따라 가교된 분자들은 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')이다.
이어서, 트랜스포사제 효소는 도데실황산나트륨(SDS) 처리 또는 가열 또는 프로테이나아제 K 분해를 통해 제거될 수 있다. 트랜스포사제 효소를 제거하면 고체 지지체(16)에 부착된 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')이 남는다.
시퀀싱 레디 단편들을 완료하기 위하여, 단편들(14, 14')이 서열(22)들에 부착되는 것을 보장하기 위해 추가의 신장 및 라이게이션(도 1에서 별 모양으로 표시됨)이 수행된다. 생성된 복합체(10)는 도 1에 도시되어 있다.
각각의 인접성 보존 라이브러리 단편(14, 14')은 각각의 시퀀싱-레디 핵산 단편(12, 12')의 일부이며, 이들 각각은 또한 어느 한쪽 말단에 부착된 각각의 어댑터 서열(18, 22)을 포함한다. 어댑터 서열(18)들은 고체 지지체(16)에 초기에 결합된 것들이며, 제1 시퀀싱 프라이머 서열 및 플로우 셀 프라이머들 중 하나에 상보적인 제1 서열을 포함한다. 어댑터 서열(18)은 결합쌍의 하나의 구성원(20)에 부착된다. 어댑터 서열(22)들은 부분 Y-어댑터(25')로부터의 것들이며, 다른 플로우 셀 프라이머와 동일한 제2 서열 및 제2 시퀀싱 프라이머 서열을 포함한다. 각각의 시퀀싱-레디 핵산 단편(14, 14')은 브리지(bridge) 증폭 및 시퀀싱에 적합한 어댑터를 포함하기 때문에, PCR 증폭은 수행되지 않는다. 따라서, 이들 단편(12, 12')은 시퀀싱-레디 상태이다. 더욱이, 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')이 동일한 더 긴 핵산 샘플(30)로부터의 것들이기 때문에, 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')은 본 명세서에 개시된 연결된 긴 리드 적용에 적합할 수 있다.
다른 예시적인 복합체(10')(도 2c)를 형성하기 위한 다른 예시적인 방법이 도 2a 내지 도 2c에 도시되어 있다.
이러한 예시적인 방법에서, 어댑터 서열(18')이 결합쌍의 하나의 구성원(20)을 통해 고체 지지체(16)에 결합된다. 일례에서, 이러한 어댑터 서열(18')은 하이브리드화 가능 서열 H, 제1 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 1 시퀀싱 프라이머 서열) 및 플로우 셀 상의 증폭 프라이머들 중 하나(예를 들어, P5)의 적어도 일부와 동일하여 카피가 증폭 프라이머(P5)에 상보적(예를 들어, P5')이 되는 제1 서열(예를 들어, P5)을 포함할 수 있다. 어댑터 서열(18')은 결합쌍의 하나의 구성원(20)(예를 들어, 바이오틴)에 결합되어, 결합쌍의 다른 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘 등)을 포함하는 고체 지지체(16)의 표면에 결합될 수 있다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 트랜스포좀 복합체(24)가 또한 고체 지지체(16)에 결합될 수 있다. 트랜스포좀 복합체(24)를 고체 지지체(16) 상에 로딩하기 전에, L-어댑터(21)가 트랜스포사제 효소(32)(예를 들어, 2개의 Tn5 분자를 포함함)와 혼합되어 트랜스포좀 복합체(24)의 일례를 형성할 수 있다. L-어댑터(21)는 서로 하이브리드화되는 2개의 모자이크 단부 서열인 M1, M2를 포함할 수 있다. 모자이크 단부 서열들 중 하나인 M1 은 태그멘테이션 공정 후에 수행되는 라이게이션 공정 동안 각각의 단편(14, 14')의 한쪽 말단에 첨가되는 전이 가닥(26)이다. 모자이크 말단 서열들 중 다른 하나인 M2는 라이게이션 및 태그멘테이션 공정 후에 제거되는 비-전이 가닥(28)의 일부이다. 이러한 모자이크 단부 서열 M2 는 고체 지지체(16)에 부착된 어댑터 서열(18')의 하이브리드화 가능 서열 H에 상보적인 상보적 하이브리드화 가능 서열 HC에 부착된다. 상보적 하이브리드화 가능 서열 HC는 L-어댑터(21)가 어댑터 서열(18')에 하이브리드화될 수 있게 한다. 따라서, 상보적 하이브리드화 가능 서열 HC는 트랜스포좀 복합체(24)가 고체 지지체 상으로 로딩될 수 있게 한다.
트랜스포좀 복합체(24)를 고체 지지체(16) 상에 로딩하는 것은 트랜스포좀 복합체(24)를 고체 지지체(16)와 혼합하는 단계, 및 어댑터 서열(18')의 하이브리드화 가능 서열 H로의 L-어댑터(21)의 상보적 하이브리드화 가능 서열 HC의 하이브리드화에 적합한 조건에 혼합물을 노출시키는 단계를 수반할 수 있다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 개별 트랜스포좀 복합체(24)는 고체 지지체(16) 상의 어댑터 서열(18')들 각각에 부착될 수 있다.
복합체(10')를 형성하는 이러한 예시적인 방법에서, 태그멘테이션 공정이 이어서 수행된다. 더 긴 핵산 샘플(예를 들어, DNA)(30)을 포함하는 유체(예를 들어, 태그멘테이션 완충액)가 트랜스포좀 복합체(24)가 로딩되어 있는 고체 지지체(16)에 첨가될 수 있다. 샘플(30)이 고체 지지체-결합 트랜스포좀 복합체(24)와 접촉함에 따라, 더 긴 핵산 샘플(30)이 태그멘테이션된다. 태그멘테이션의 이러한 예 동안, 샘플(30)은 단편들(14, 14')로 단편화되고, 단편들(14, 14') 각각은 그의 5'-말단에서 L-어댑터(21)의 모자이크 단부 서열 M1로 태그된다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 더 긴 핵산 샘플(30)의 태그멘테이션은 인접한 트랜스포좀 복합체(24)들 사이, 및 그에 따라 인접한 어댑터 서열(18')들 사이에 복수의 가교된 분자를 생성한다. 가교된 분자들은 고체 지지체(16) 주위를 둘러싼다. 트랜스포좀 복합체(24)들 및 어댑터 서열(18')들은 가교된 분자들로서 핵산 샘플(30)의 인접성을 유지하며, 그에 따라 가교된 분자들은 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')이다.
이어서, 트랜스포사제 효소(32)는 도데실황산나트륨(SDS) 처리 또는 가열 또는 프로테이나아제 K 분해를 통해 제거될 수 있다.
이어서, 유리 모자이크 단부 서열 M1을 각각의 어댑터 서열(18')에 결합시키기 위해 라이게이션이 수행될 수 있다. 도 2a에서, 별 모양은 라이게이션이 수행되는 곳을 나타낸다. 일례에서, 라이게이션은 적합한 리가제를 함유하는 완충액을 도입하고, 효소 활성을 개시하기에 적합한 시간 동안 대략 적합한 온도까지 가열함으로써 개시될 수 있다. 적합한 리가제 효소의 예에는 이. 콜라이(E.Coli) DNA 리가제, T7 리가제 등이 포함된다. 일례에서, 이. 콜라이 DNA 리가제를 함유하는 완충액은 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+)를 또한 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 약 15 분 동안 약 16℃까지 가열하면 효소 활성이 개시된다. 생성된 구조는 도 2b에 도시되어 있다.
이어서, L-어댑터(21)의 비-전이 가닥(28)이 제거될 수 있다. 이러한 예에서, 비-전이 가닥(28)들 각각은 T7 엑소뉴클레아제와 같은 임의의 적절한 5'-3' 엑소뉴클레아제 효소(23)를 사용하여 제거된다. 일례에서, 비-전이 가닥 제거는 5'-3' 엑소뉴클레아제 효소(23)를 함유하는 완충액을 도입하고, 미리 결정된 시간 동안 대기함으로써 개시될 수 있다. 5'-3' 엑소뉴클레아제 효소(23)는 실온(예를 들어, 약 22℃ 내지 약 25℃)에서 비-전이 가닥(28)을 분해할 수 있으며, 그에 따라 추가의 가열이 사용되지 않는다. 이어서, 분해된 비-전이 가닥(28)은 세척될 수 있다.
엑소뉴클레아제 효소를 사용하여 비-전이 가닥(28)을 제거하는 것이 열 변성을 사용하는 것보다 더 바람직할 수 있다. 5'-3' 엑소뉴클레아제 효소(23)는 비-전이 가닥(28)을 효율적으로 분해하여, 후속하여 부착되는 어댑터 서열의 하이브리드화를 위해 (열 변성이 사용되는 경우보다) 더 매끈한 주형을 생성한다(도 2c의 참조 부호 22 참조). 이는 라이브러리 수율을 개선할 수 있다. 또한, 5'-3' 엑소뉴클레아제 효소(23)를 통해 비-전이 가닥(28)을 제거하면, 비-전이 가닥(28)의 열 변성 후에 손실이 관찰된 아데닌(A) 및 티민(T) 풍부 영역에 걸쳐 라이브러리 커버리지가 개선될 수 있다(도 11 참조). 또한 추가로, 엑소뉴클레아제 효소를 통한 분해는 전체 라이브러리 제조 공정의 시간을 증가시키지 않는다.
이제 도 2c를 참조하면, 복합체(10')를 형성하는 방법의 이러한 예는 부분 Y-어댑터(25)를 도입하는 단계를 수반한다. 부분 Y-어댑터(25)는 모자이크 단부 서열 M1에 상보적인 모자이크 단부 서열 M3 및 어댑터 서열(22)을 포함한다. 어댑터 서열(22)은 제2 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 2 시퀀싱 프라이머 서열), 및 플로우 셀 상의 증폭 프라이머들 중 다른 하나(P7)에 상보적인 제2 서열(P7')을 포함할 수 있다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 부분 Y-어댑터(25)의 모자이크 단부 서열 M3는 전이 가닥(26)의 모자이크 단부 서열 M1(이제 어댑터 서열(18')에 라이게이션됨)에 하이브리드화되며, 그에 따라 부분 Y-어댑터(25)를 고체 지지체(16)에 부착시킨다.
본 명세서에 개시된 예들에서, 어댑터 서열들(18, 18'및/또는 22)은 또한 시퀀싱 샘플 인덱스 또는 바코드 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 본 명세서에 개시된 구획화 방법에 대한 백업(backup) 또는 대안으로서 사용될 수 있다.
시퀀싱 레디 단편들을 생성하기 위하여, 단편들(14, 14')이 모자이크 단부 서열 M3, 및 그에 따라 서열(22)들에 부착되는 것을 보장하기 위해 추가의 신장 및 라이게이션이 수행된다.
생성된 복합체(10')는 도 2c에 도시되어 있다.
(도 2c에 도시된) 복합체(10')를 형성하는 또 다른 예시적인 방법이 도 3에 부분적으로 도시되어 있다. 이러한 예시적인 방법에서, 전이 가닥(26)의 라이게이션 및 비-전이 가닥(28)의 분해는 단일 원-포트 프로토콜의 일부로서 수행된다.
이러한 예시적인 방법에서, 어댑터 서열(18')이 결합쌍의 하나의 구성원(20)을 통해 고체 지지체(16)에 결합된다. 도 2a를 참조하여 기술된 바와 같은 어댑터 서열(18')이 사용될 수 있으며, 이는 하이브리드화 가능 서열 H, 제1 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 1 시퀀싱 프라이머 서열), 및 플로우 셀 상의 증폭 프라이머들 중 하나(예를 들어, P5)의 적어도 일부와 동일하여 카피가 증폭 프라이머(P5)에 상보적(예를 들어, P5')이 되는 제1 서열(P5)을 포함한다. 또한, 이러한 예시적인 방법에서, 트랜스포좀 복합체(24)는 도 2a를 참조하여 기술된 바와 같이 고체 지지체(16) 상에 로딩된다. 간략하게 말하면, 트랜스포좀 복합체(24)의 L-어댑터(21)의 상보적 하이브리드화 가능 서열 HC가 어댑터 서열(18')의 하이브리드화 가능 서열 H에 하이브리드화된다.
복합체(10')(도 2c)를 형성하는 이러한 예시적인 방법에서, 도 2a를 참조하여 기술된 바와 같이 태그멘테이션이 수행된다.
이어서, 전이 가닥(26)의 라이게이션 및 비-전이 가닥(28)의 분해가 함께 수행될 수 있다. 이는 도 3에 개략적으로 도시되어 있다. 리가제 및 엑소뉴클레아제 효소가 상승적으로 작용하게 하기 위하여, 태그멘테이션된 고체 지지체로 도입되는 시약 포뮬레이션(formulation)은 완충액, 리가제 효소, 5'-3' 엑소뉴클레아제 효소(23)(예를 들어, T7 엑소뉴클레아제), 및 각각의 효소가 필요로 하는 임의의 다른 성분(예를 들어, 보조 인자, 예컨대 NAD+)을 포함한다. 일례에서, 라이게이션 및 분해는, 시약 포뮬레이션을 도입하고, 약 15 분 동안 약 25℃까지 가열하여 효소 활성을 개시함으로써 개시될 수 있다.
리가제 및 엑소뉴클레아제 효소를 동일한 시약 포뮬레이션으로 통합시키면, 프로토콜 시간이 (예를 들어, 도 2a 내지 도 2c에 도시된 예시적인 방법과 비교하여 약 10 분) 감소되고, 또한 세척 단계의 수가 감소될 수 있다.
이어서, 방법의 이러한 예는 도 2c를 참조하여 기술된 바와 같이 부분 Y-어댑터(25)를 도입하는 단계가 이어진다. 시퀀싱 레디 단편들 및 최종 복합체(10')를 생성하기 위하여, 단편들(14, 14')이 모자이크 단부 서열 M3, 및 그에 따라 서열(22)들에 부착되는 것을 보장하기 위해 추가의 신장 및 라이게이션이 수행된다.
도 1, 도 2a 내지 도 2c, 및 도 3을 참조하여 기술되는 복합체들(10, 10')을 제조하는 방법은 몇 가지 예를 제공하지만, 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')이 고체 지지체(16)에 부착되는 한 다른 방법들이 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
본 명세서에 개시된 다른 예들에서, 플로우 셀과 떨어져서 라이브러리 제조의 일부를 수행하고, 플로우 셀 상에서 라이브러리 제조의 일부를 수행함으로써 인접성 정보가 보존될 수 있다.
이러한 예에서, 라이브러리 제조는, 도 4에 개략적으로 도시된 바와 같이, 태그멘테이션을 사용하여 플로우 셀의 외부에서 개시될 수 있다.
도시된 예에서, 더 긴 핵산 샘플(30)(예를 들어, 이중 가닥 DNA)을 포함하는 유체(예를 들어, 태그멘테이션 완충액)가 트랜스포좀 복합체(24')와 혼합될 수 있다. 도 4에 도시된 예에서, 각각의 트랜스포좀 복합체(24')는 2개의 트랜스포사제 효소(도 4에 "32"로 총괄적으로 도시됨), 전이 가닥(26'), 및 비-전이 가닥(28')을 포함하는 이량체이다. 다른 예들에서, 다양한 트랜스포좀 복합체가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 이들 중 하나는 트랜스포사제 효소(32) 및 전이 가닥(26')을 포함하고, 다른 것은 트랜스포사제 효소(32) 및 비-전이 가닥(28')을 포함한다.
이러한 예에서, 전이 가닥(26')은 태그멘테이션 공정 동안 각각의 단편(14, 14')의 한쪽 말단에 부가되는 어댑터이다. 일례에서, 각각의 전이 가닥(26)은, 제1 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 1 시퀀싱 프라이머 서열) 및 플로우 셀 상의 증폭 프라이머들 중 하나(예를 들어, P5)의 적어도 일부에 상보적인 제1 서열(P5')을 포함하는 어댑터이다.
이러한 예에서, 비-전이 가닥(28')은 태그멘테이션 동안 단편(14, 14') 내로 통합되지 않는 어댑터이지만, 오히려 후속하여 각각의 단편(14, 14')의 다른쪽 말단에 라이게이션될 수 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 비-전이 가닥(28')은 태그멘테이션 동안 적어도 부분적인 염기쌍 형성을 통해 전이 가닥(26')에 부착될 수 있다. 이러한 예에서, 비-전이 가닥(28')은 제2 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 2 시퀀싱 프라이머 서열) 및 플로우 셀 상의 증폭 프라이머들 중 하나(예를 들어, P7)의 적어도 일부와 동일하여 카피가 증폭 프라이머(P7)에 상보적(예를 들어, P7')이 되는 제2 서열(P7)을 포함하는 어댑터이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 유체 내에서, 트랜스포좀(24')은 더 긴 핵산 샘플(30)을 단편들(14, 14')로 단편화하고, 전이 가닥(26')을 각각의 단편(14, 14')의 5' 말단에 라이게이션시킨다. 일례에서, 전이 가닥(26')은 편측성 전위(one-sided transposition)에 의해 더 긴 핵산 샘플(30)의 각각의 단편(14, 14')의 5'-말단에 통합된다. 비-전이 가닥(28')은 염기쌍 형성을 통해 전이 가닥(26')에 부착될 수 있다.
이러한 예시적인 태그멘테이션 공정은 더 긴 핵산 샘플(30)의 인접성을 유지시키는데, 그 이유는 생성된 단편들(14, 14')(및 그에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 임의의 전이 가닥(26') 및 비-전이 가닥(28'))이 트랜스포사제(32)를 통해 서로 부착된 상태로 존재하기 때문이다. 부착된 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')은 본 명세서에서 부착된 단편(34)들로 지칭된다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 부착된 단편(34)들은 플로우 셀로 도입될 수 있으며, 여기서 라이브러리 제조를 완료하기 위해 추가적인 처리가 수행될 수 있다. 이는 본 명세서에 개시된 방법을 참조하여 추가로 기술되는 도 8에 개략적으로 도시되어 있다.
플로우 셀
본 명세서에 개시된 방법은 플로우 셀(36)을 이용할 수 있으며, 그 예가 도 5a에 도시되어 있다. 플로우 셀(36)은 레인 또는 플로우 채널(40)을 적어도 부분적으로 한정하는 기판(38)을 포함한다.
기판(38)은 단일 층/재료일 수 있다. 적합한 단일 층 기판의 예에는 에폭시 실록산, 유리, 개질된 유리 또는 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 기타 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌(예컨대, Chemours의 TEFLON®), 사이클릭 올레핀/사이클로-올레핀 중합체(예컨대, Zeon의 ZEONOR®), 폴리이미드 등을 포함함), 나일론(폴리아미드), 세라믹/세라믹 산화물, 실리카, 용융 실리카, 또는 실리카-기반 재료, 알루미늄 실리케이트, 규소 및 개질된 규소(예를 들어, 붕소 도핑된 p+ 규소), 규소 질화물(Si3N4), 규소 산화물(SiO2), 탄탈륨 오산화물(Ta2O5) 또는 기타 탄탈륨 산화물(들)(TaOx), 하프늄 산화물(HaO2), 탄소, 금속, 무기 유리 등이 포함될 수 있다. 기판(38)은 또한 다층 구조물일 수 있다. 다층 구조물의 몇몇 예에는 유리 또는 규소가 포함되며, 탄탈륨 산화물 또는 다른 세라믹 산화물의 코팅층이 표면에 존재한다. 다층 구조물의 다른 예에는 패턴화된 수지를 상부에 갖는 기본 지지체(예를 들어, 유리 또는 규소)가 포함된다. 다층 기판의 또 다른 예에는 SOI(silicon-on-insulator) 기판이 포함될 수 있다.
일례에서, 기판(38)은 직경이 약 2 mm 내지 약 300 mm 범위이거나, 최대 치수가 약 10 피트(약 3 미터) 이하인 직사각형 시트 또는 패널을 가질 수 있다. 일례에서, 기판(38)은 직경이 약 200 mm 내지 약 300 mm 범위인 웨이퍼이다. 다른 예에서, 기판(38)은 폭이 약 0.1 mm 내지 약 10 mm 범위인 다이이다. 예시적인 치수가 제공되었지만, 임의의 적절한 치수를 갖는 기판(38)이 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 다른 예의 경우, 300 mm 둥근 웨이퍼보다 표면적인 더 큰 직사각형 지지체인 패널이 사용될 수 있다.
도 5a에 도시된 예에서, 플로우 셀(36)은 플로우 채널(40)을 포함한다. 몇몇 플로우 채널(40)이 도시되어 있지만, 임의의 개수의 채널(40)이 플로우 셀(36)에 포함될 수 있다는 것(예를 들어, 단일 채널(40), 4개의 채널(40) 등)을 이해하여야 한다. 각각의 플로우 채널(40)은 2개의 접합된 구성요소(예를 들어, 기판(36) 및 덮개 또는 2개의 기판(36)) 사이에 규정된 영역이며, 이는 그로 도입되어 그로부터 제거되는 유체들(예를 들어, 본 명세서에 기술된 것들)을 가질 수 있다. 각각의 플로우 채널(40)은, 임의의 특정 플로우 채널(40) 내로 도입된 유체가 임의의 인접한 플로우 채널(40) 내로 유동하지 않도록, 각각의 다른 플로우 채널(40)로부터 격리될 수 있다. 플로우 채널(40) 내로 도입되는 유체들의 몇몇 예는 반응 성분들(예를 들어, 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')(예를 들어, 고체 지지체(16) 상에 있거나 서로 부착되어 있음), 폴리머라제들, 시퀀싱 프라이머들, 뉴클레오타이드들 등), 세척 용액들, 탈차단제(deblocking agent)들 등을 도입시킬 수 있다.
플로우 채널(40)은 부분적으로 기판(38)의 재료(들)에 의존하는 임의의 적절한 기법을 이용하여 기판(38)에 형성될 수 있다. 일례에서, 플로우 채널(40)은 유리 기판(38)에 에칭된다. 다른 예에서, 플로우 채널(40)은 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피 등을 이용하여 다층 기판(38)의 수지에 패턴화될 수 있다. 또 다른 예에서, 별도의 재료(도시되지 않음)가 기판(38)에 적용되어, 별도의 재료가 플로우 채널(40)의 벽을 형성하고 기판(38)이 플로우 채널(40)의 바닥을 형성하게 할 수 있다.
일례에서, 플로우 채널(40)은 직선형 구성을 갖는다. 플로우 채널(40)의 길이 및 폭이 각각 기판(38)의 길이 및 폭보다 작아서, 플로우 채널(40)을 둘러싸는 기판 표면의 일부가 덮개(도시되지 않음) 또는 다른 기판(38)으로의 부착에 이용 가능하게 할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 플로우 채널(40)의 폭은 적어도 약 1 mm, 적어도 약 2.5 mm, 적어도 약 5 mm, 적어도 약 7 mm, 적어도 약 10 mm, 또는 그 초과일 수 있다. 일부 경우에, 각각의 레인/플로우 채널(40)의 길이는 적어도 약 10 mm, 적어도 약 25 mm, 적어도 약 50 mm, 적어도 약 100 mm, 또는 그 초과일 수 있다. 각각의 플로우 채널(40)의 폭 및/또는 길이는 상기 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다. 다른 예에서, 플로우 채널(40)은 정사각형(예컨대, 10 mm x 10 mm)이다.
각각의 플로우 채널(40)의 깊이는, 미세접촉, 에어로졸 또는 잉크젯 인쇄가 플로우 채널 벽을 형성하는 별도의 재료를 증착시키는 데 사용될 때 단층 두께만큼 얕을 수 있다. 깊이는 별도의 재료(도시되지 않음)가 덮개를 기판(38)에 접합하거나 2개의 기판(38)을 함께 접합하는 데 사용될 때 더 깊을 수 있다. 다른 예들의 경우, 각각의 플로우 채널(40)의 깊이는 약 1 μm, 약 10 μm, 약 50 μm, 약 100 μm, 또는 그 초과일 수 있다. 일례에서, 깊이는 약 10 μm 내지 약 100 μm의 범위일 수 있다. 다른 예에서, 깊이는 약 10 μm 내지 약 30 μm의 범위일 수 있다. 또 다른 예에서, 깊이는 약 5 μm 이하이다. 각각의 플로우 채널(40)의 깊이는 상기 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있음을 이해하여야 한다.
플로우 셀(36)의 플로우 채널(40) 내의 아키텍처(architecture)의 다양한 예가 도 5b 및 도 5c에 도시되어 있다.
도 5b에 도시된 예에서, 플로우 셀(36)은 단일 층 기판(38A) 및 단일 층 기판(38A)에 적어도 부분적으로 형성된 플로우 채널(40)을 포함한다.
고분자 하이드로겔(42)이 플로우 채널(40)에 존재한다. 고분자 하이드로겔(42)의 예에는 아크릴아미드 공중합체, 예컨대 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드(PAZAM)가 포함된다. PAZAM 및 일부의 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 하기 구조식 (I)로 표현된다:
Figure pct00001
상기 식에서,
RA는 아지도, 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알킨, 할로겐, 선택적으로 치환된 하이드라존, 선택적으로 치환된 하이드라진, 카르복실, 하이드록시, 선택적으로 치환된 테트라졸, 선택적으로 치환된 테트라진, 니트릴 산화물, 니트론, 설페이트, 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되고;
RB는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
RC, RD, 및 RE는 각각 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의-(CH2)p-는 선택적으로 치환될 수 있고;
p는 1 내지 50의 범위의 정수이고;
n은 1 내지 50,000의 범위의 정수이고;
m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
당업자는 구조식 (I)에서 반복되는 "n" 및 "m" 특징부들의 배열이 대표적인 것이며, 모노머 서브유닛들이 중합체 구조에서 임의의 순서로 존재할 수 있음(예를 들어, 랜덤, 블록, 패턴화, 또는 이들의 조합)을 인식할 것이다.
PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1500 kDa 또는 약 10 kDa 내지 약 1000 kDa 범위일 수 있거나, 특정 예에서는 약 312 kDa일 수 있다.
일부 예에서, PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 선형 중합체이다. 일부 다른 예에서, PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 약하게 가교결합된 중합체이다.
다른 예들에서, 고분자 하이드로겔(42)은 구조식 (I)의 변형체일 수 있다. 하나의 예에서, 아크릴아미드 단위는 N,N-다이메틸아크릴아미드(
Figure pct00002
)로 대체될 수 있다. 이러한 예에서, 구조식 (I)의 아크릴아미드 단위는
Figure pct00003
로 대체될 수 있으며, 여기서 RD, RE, 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 (아크릴아미드의 경우에서의 H 대신에) C1-C6 알킬이다. 이러한 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다. 다른 예에서, 아크릴아미드 단위에 더하여 N,N-다이메틸아크릴아미드가 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 구조식 (I)은 반복되는 "n" 및 "m" 특징부들에 더하여
Figure pct00004
을 포함할 수 있으며, 여기서 RD, RE, 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 C1-C6 알킬이다. 이러한 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다.
초기 고분자 하이드로겔의 다른 예로서, 구조식 (I)의 반복되는 "n" 특징부는 하기 구조식 (II)를 갖는 헤테로사이클릭 아지도 기를 포함하는 단량체로 대체될 수 있다:
Figure pct00005
상기 식에서, R1은 H 또는 C1-C6 알킬이고; R2는 H 또는 C1-C6 알킬이고; L은 탄소, 산소, 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 내지 20개의 원자를 갖는 선형 사슬을 포함하는 링커로서, 사슬의 탄소 및 임의의 질소 원자 상에 10개의 선택적 치환기가 존재하고; E는 탄소, 산소, 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 원자를 포함하는 선형 사슬로서, 사슬의 탄소 및 임의의 질소 원자들 상에 선택적 치환기가 존재하고; A는 N 치환된 아미드로서, H 또는 C1-C4 알킬이 N에 부착되어 있고; Z는 질소 함유 헤테로사이클이다. Z의 예에는 단일 환형 구조 또는 융합 구조로서 존재하는 5 내지 10개의 고리 구성원이 포함된다.
또 다른 예로서, 고분자 하이드로겔(42)은 하기 구조식 (III) 및 (IV) 각각의 반복 단위를 포함할 수 있다:
Figure pct00006
및
Figure pct00007
상기 식에서, R1a, R2a, R1b 및 R2b 각각은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐로부터 선택되고; R3a 및 R3b 각각은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 페닐, 또는 선택적으로 치환된 C7-C14 아르알킬로부터 선택되고; 각각의 L1 및 L2는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬렌 링커 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌 링커로부터 선택된다.
다른 분자가 올리고뉴클레오타이드 프라이머들(44, 46)을 그에 그래프팅하도록 기능화되는 한 그러한 분자가 고분자 하이드로겔(42)을 형성하기 위해 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 적합한 중합체 층의 다른 예에는 아가로스와 같은 콜로이드 구조; 또는 젤라틴과 같은 중합체 메시 구조; 또는 폴리아크릴아미드 중합체 및 공중합체, 실란 비함유 아크릴아미드(SFA), 또는 아지드분해 버전(azidolyzed version)의 SFA와 같은 가교결합된 중합체 구조를 갖는 것들이 포함된다. 적합한 폴리아크릴아미드 중합체의 예들은 아크릴아미드 및 아크릴산 또는 비닐 기를 함유하는 아크릴산으로부터 합성되거나, [2+2] 광고리화 반응을 형성하는 단량체들로부터 합성될 수 있다. 적합한 고분자 하이드로겔(42)의 또 다른 예에는 아크릴아미드와 아크릴레이트의 혼합 공중합체가 포함된다. 아크릴 단량체(예를 들어, 아크릴아미드, 아크릴레이트 등)를 함유하는 다양한 중합체 아키텍처, 예컨대 별(star) 중합체, 별형상(star-shaped) 또는 별-블록(star-block) 중합체, 덴드리머(dendrimer) 등을 포함하는 분지형 중합체가 본 명세서에 개시된 예들에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 단량체들(예를 들어, 아크릴아미드, 촉매를 함유하는 아크릴아미드 등)이 무작위로 또는 블록으로 별형상 중합체의 분지(아암)에 통합될 수 있다.
고분자 하이드로겔(42)을 플로우 채널(40) 내로 도입하기 위해, 고분자 하이드로겔(42)의 혼합물이 생성되고, 이어서 기판(38A)(적어도 부분적으로 내부에 형성된 플로우 채널(40)을 가짐)에 적용될 수 있다. 하나의 예에서, 고분자 하이드로겔(42)은 (예를 들어, 물, 또는 에탄올 및 물과의) 혼합물로 존재할 수 있다. 이어서, 혼합물은 스핀 코팅, 또는 침지 또는 딥 코팅, 분무 코팅, 또는 정압 또는 부압 하에서의 재료의 유동, 또는 다른 적절한 기법을 이용하여 기판 표면들(플로우 채널(들)(40) 내의 표면을 포함함)에 적용될 수 있다. 이러한 유형의 기법들은 고분자 하이드로겔(42)을 기판(38A) 상에(예를 들어, 플로우 채널(40) 내에 및 플로우 채널(40)을 둘러싸는 간극 영역(48) 상에) 전면적으로 증착시킨다. 간극 영역(48) 상이 아닌 플로우 채널(40) 내에 고분자 하이드로겔(42)을 특이적으로 증착시키기 위해 다른 선택적 증착 기법들(예를 들어, 마스크, 제어 인쇄 기법 등을 포함함)이 이용될 수 있다.
일부 예에서, 기판 표면(플로우 채널(40) 내에서 노출되는 부분을 포함함)이 활성화될 수 있고, 이어서 혼합물(고분자 하이드로겔(42)을 포함함)이 그에 적용될 수 있다. 하나의 예에서, 실란 또는 실란 유도체(예를 들어, 노르보르넨 실란)가 증착, 스핀 코팅 또는 다른 증착법을 이용하여 기판 표면 상에 증착될 수 있다. 다른 예에서, 기판 표면은 플라즈마 애싱(plasma ashing)에 노출되어, 고분자 하이드로겔(42)에 부착될 수 있는 표면 활성화제(들)(예를 들어, -OH 기)를 생성할 수 있다.
고분자 하이드로겔(42)에 따라, 적용된 혼합물은 경화 공정에 노출될 수 있다. 일례에서, 경화는 실온(예를 들어, 약 25℃) 내지 약 95℃ 범위의 온도에서 약 1 밀리초 내지 약 수일 범위의 시간 동안 수행될 수 있다.
이어서, 일부 예에서는, 고분자 하이드로겔(42)을 플로우 채널(들)(40) 내의 표면 상에 적어도 실질적으로 무손상 상태로 남겨두면서 플로우 채널(들)(40)의 주연부에 있는 간극 영역(48)으로부터 고분자 하이드로겔(42)을 제거하기 위해 연마(polishing)가 수행될 수 있다.
플로우 셀(36)은 또한 증폭 프라이머들(44, 46)을 포함한다.
그래프팅 공정은 플로우 채널(40) 내의 고분자 하이드로겔(42)에 증폭 프라이머들(44, 46)을 그래프팅하기 위해 수행될 수 있다. 일례에서, 증폭 프라이머들(44, 46)은 프라이머들(44, 46)의 5' 말단 또는 그 근처에서의 단일점 공유 결합에 의해 고분자 하이드로겔(42)에 고정될 수 있다. 이러한 결합은 i) 프라이머(44, 46)의 어댑터 특이적 부분이 그의 동족 핵산 단편(예를 들어, 단편들(14, 14')에 부착된 P5' 부분)에 어닐링되도록 자유롭게 남겨두고, ii) 프라이머 신장을 위해 3' 하이드록실기를 자유롭게 남겨둔다. 임의의 적절한 공유 결합이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 종결(terminated) 프라이머의 예에는 고분자 하이드로겔(42)의 아지드 모이어티에 부착될 수 있는 알킨 종결 프라이머가 포함된다. 적합한 프라이머(44, 46)의 구체적인 예에는 HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, GENOME ANALYZER™, ISEQ™, 및 다른 기기 플랫폼에서의 시퀀싱을 위해 Illumina Inc.에서 판매하는 상업용 플로우 셀의 표면 상에서 사용되는 P5 및 P7 프라이머가 포함된다.
일례에서, 그래프팅은 (예를 들어, 일시적으로 접합되거나 영구적으로 접합된 덮개를 사용하는) 증착, 덩크(dunk) 코팅, 분무 코팅, 퍼들 분배(puddle dispensing)를 통한 유동, 또는 프라이머(들)(44, 46)를 플로우 채널(42) 내의 고분자 하이드로겔(42)에 부착시키는 다른 적절한 방법에 의한 유동을 수반할 수 있다. 이러한 예시적인 기법들 각각은 프라이머(들)(44, 46), 물, 완충액, 및 촉매를 포함할 수 있는 프라이머 용액 또는 혼합물을 이용할 수 있다. 그래프팅 방법들 중 어떠한 것을 이용하여도, 프라이머들(44, 46)은 플로우 채널(40) 내의 고분자 하이드로겔(42)의 반응성 기와 반응하고, 주위 기판(38A)에 대해서는 친화성을 갖지 않는다. 이와 같이, 프라이머들(44, 46)은 플로우 채널(40) 내의 고분자 하이드로겔(42)에 선택적으로 그래프팅된다.
도 5c에 도시된 예에서, 플로우 셀(38)은 지지체(52) 및 지지체(52) 상에 위치한 패턴화된 재료(50)를 포함하는 다층 기판(38B)을 포함한다. 패턴화된 재료(50)는 간극 영역(48)들에 의해 분리된 함몰부(54)들을 형성한다. 함몰부(54)는 플로우 채널(들)(40) 각각 내에 위치한다.
도 5c에 도시된 예에서, 패턴화된 재료(50)는 지지체(52) 상에 위치한다. 함몰부(54)를 형성하도록 선택적으로 증착되거나 증착되고 패턴화될 수 있는 임의의 재료 및 간극 영역(48)이 패턴화된 재료(50)에 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
하나의 예로서, 무기 산화물이 증착, 에어로졸 인쇄, 또는 잉크젯 인쇄를 통해 지지체(52)에 선택적으로 적용될 수 있다. 적합한 무기 산화물의 예에는 탄탈륨 산화물(예를 들어, Ta2O5), 알루미늄 산화물(예를 들어, Al2O3), 규소 산화물(예를 들어, SiO2), 하프늄 산화물(예를 들어, HfO2) 등이 포함된다.
다른 예로서, 수지가 지지체(52)에 적용되고 이어서 패턴화될 수 있다. 적합한 증착 기법에는 화학 기상 증착, 딥 코팅, 덩크 코팅, 스핀 코팅, 분무 코팅, 퍼들 분배, 초음파 분무 코팅, 닥터 블레이드(doctor blade) 코팅, 에어로졸 인쇄, 스크린 인쇄, 미세접촉 인쇄 등이 포함된다. 적합한 패터닝 기법에는 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피(NIL), 스탬핑 기법, 엠보싱 기법, 성형 기법, 미세에칭 기법, 인쇄 기법 등이 포함된다. 적합한 수지의 일부 예에는 다면체 올리고머 실세스퀴옥산 수지(POSS)-기반 수지, 비-POSS 에폭시 수지, 폴리(에틸렌 글리콜) 수지, 폴리에테르 수지(예를 들어, 개환된 에폭시), 아크릴 수지, 아크릴레이트 수지, 메타크릴레이트 수지, 무정형 플루오로중합체 수지(예를 들어, Bellex의 CYTOP®), 및 이들의 조합이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다면체 올리고머 실세스퀴옥산"(POSS)은 실리카(SiO2)와 실리콘(R2SiO) 사이의 하이브리드 중간체(예를 들어, RSiO1.5)인 화학 조성을 지칭한다. POSS의 예는 전체적으로 참고로 포함된 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있다. 일례에서, 조성은 화학식 [RSiO3/2]n을 갖는 유기규소 화합물이며, 여기서 R 기들은 동일하거나 상이할 수 있다. POSS에 대한 예시적인 R 기에는 에폭시, 아지드/아지도, 티올, 폴리(에틸렌 글리콜), 노르보르넨, 테트라진, 아크릴레이트, 및/또는 메타크릴레이트, 또는 추가로, 예를 들어, 알킬, 아릴, 알콕시, 및/또는 할로알킬 기가 포함된다. 본 명세서에 개시된 수지 조성은 단량체 단위로서 하나 이상의 상이한 케이지(cage) 또는 코어(core) 구조를 포함할 수 있다. 다면체 구조는
Figure pct00008
와 같은 T8 구조일 수 있으며,
Figure pct00009
로 표현될 수 있다. 이러한 단량체 단위는 전형적으로 작용기 R1 내지 R8의 8개 아암을 갖는다.
단량체 단위는
Figure pct00010
와 같은 T10 으로 지칭되는 10개의 규소 원자 및 10개의 R 기를 갖는 케이지 구조를 가질 수 있거나,
Figure pct00011
와 같은 T12로 지칭되는 12개의 규소 원자 및 12개의 R 기를 갖는 케이지 구조를 가질 수 있다. POSS-기반 재료는 대안적으로 T6, T14, 또는 T16 케이지 구조를 포함할 수 있다. 평균 케이지 함량은 합성 동안 조정될 수 있고/조정될 수 있거나, 정제 방법에 의해 제어될 수 있고, 단량체 유닛(들)의 케이지 크기의 분포가 본 명세서에 개시된 예들에서 사용될 수 있다.
도 5c에 도시된 바와 같이, 패턴화된 재료(50)는 내부에 형성된 함몰부(54), 및 인접한 함몰부(54)들을 분리하는 간극 영역(48)들을 포함한다. 규칙적인 패턴, 반복 패턴 및 비규칙적인 패턴을 비롯한 함몰부(54)의 다수의 다양한 레이아웃(layout)이 예상될 수 있다. 일례에서, 함몰부(54)들은 조밀 충전(close packing) 및 밀도 개선을 위해 육각 격자에 배치된다. 다른 레이아웃에는, 예를 들어, 직선(직사각형) 레이아웃, 삼각형 레이아웃 등이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 행과 열에 존재하는 함몰부(54)들의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(54)들 및/또는 간극 영역(48)들의 반복 배열일 수 있다. 또 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(54)들 및/또는 간극 영역(48)들의 무작위 배열일 수 있다. 패턴에는 반점, 패드, 줄무늬, 소용돌이, 선, 삼각형, 직사각형, 원, 원호, 체크, 격자무늬(plaid), 대각선, 화살표, 정사각형, 및/또는 크로스-해치(cross-hatch)가 포함될 수 있다.
함몰부(54)의 레이아웃 또는 패턴은 한정된 영역 내의 함몰부(54)의 밀도(함몰부(54)의 개수)와 관련하여 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 함몰부(54)는 ㎟당 대략 2백만개의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는, 예를 들어, ㎟당 약 100개, ㎟당 약 1,000개, ㎟당 약 10만개, ㎟당 약 1백만개, ㎟당 약 2백만개, ㎟당 약 5백만개, ㎟당 약 1천만개, ㎟당 약 5천만개, 또는 그 초과 또는 미만의 밀도를 포함하는 다양한 밀도로 조정될 수 있다. 패턴화된 재료(50) 내의 함몰부(54)의 밀도는 상기 범위로부터 선택되는 하한 값들 중 하나와 상한 값들 중 하나 사이에 있을 수 있음을 추가로 이해하여야 한다. 예로서, 고밀도 어레이는 약 100 nm 미만만큼 떨어져 있는 함몰부(54)들을 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 중간 밀도 어레이는 약 400 nm 내지 약 1 μm만큼 떨어져 있는 함몰부(54)들을 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 저밀도 어레이는 약 1 μm 초과만큼 떨어져 있는 함몰부(54)들을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예시적인 밀도가 제공되었지만, 임의의 적절한 밀도가 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 함몰부(54)의 밀도는 부분적으로 함몰부(54)의 깊이에 좌우될 수 있다. 일부 경우에, 함몰부(54)들 사이의 간격이 본 명세서에 열거된 예보다 훨씬 더 큰 것이 바람직할 수 있다.
함몰부(54)들의 레이아웃 또는 패턴은 또한 또는 대안적으로 평균 피치, 또는 함몰부(54)의 중심에서 인접 함몰부(54)의 중심까지의 간격(중심간 간격) 또는 하나의 함몰부(54)의 가장자리에서 인접 함몰부(54)의 가장자리까지의 간격(가장자리간 간격) 측면에서 특징지어질 수 있다. 패턴은 규칙적일 수 있어서 평균 피치를 중심으로 한 변동 계수가 작거나, 패턴은 비규칙적일 수 있으며 이 경우 변동 계수는 상대적으로 클 수 있다. 어느 경우든, 평균 피치는, 예를 들어, 약 50 nm, 약 0.1 μm, 약 0.5 μm, 약 1 μm, 약 5 μm, 약 10 μm, 약 100 μm, 또는 그 초과 또는 미만일 수 있다. 특정 패턴의 함몰부(54)에 대한 평균 피치는 상기 범위로부터 선택되는 하한 값들 중 하나와 상한 값들 중 하나 사이에 있을 수 있다. 일례에서, 함몰부(54)는 약 1.5 μm의 피치(중심간 간격)를 갖는다. 예시적인 평균 피치 값이 제공되었지만, 다른 평균 피치 값이 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
각각의 함몰부(54)의 크기는 그의 체적, 개구 면적, 깊이, 및/또는 직경에 의해 특징지어질 수 있다.
각각의 함몰부(54)는 유체를 가둘 수 있는 임의의 체적을 가질 수 있다. 최소 또는 최대 체적은, 예를 들어, 플로우 셀(38)의 하류측 사용을 위해 예상되는 처리량(예를 들어, 다중성(multiplexity)), 해상도(resolution), 뉴클레오타이드, 또는 분석물 반응성을 수용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 체적은 적어도 약 1×10-3 μ㎥, 적어도 약 1×10-2 μ㎥, 적어도 약 0.1 μ㎥, 적어도 약 1 μ㎥, 적어도 약 10 μ㎥, 적어도 약 100 μ㎥, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 체적은 최대 약 1×104 μ㎥, 최대 약 1×103 μ㎥, 최대 약 100 μ㎥, 최대 약 10 μ㎥, 최대 약 1 μ㎥, 최대 약 0.1 μ㎥, 또는 그 미만일 수 있다.
각각의 함몰부 개구가 차지하는 면적은 체적에 대해 전술된 것과 유사한 기준에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각각의 함몰부 개구의 면적은 적어도 약 1×10-3 μm2, 적어도 약 1×10-2 μm2, 적어도 약 0.1 μm2, 적어도 약 1 μm2, 적어도 약 10 μm2, 적어도 약 100 μm2, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 면적은 최대 약 1×103 μm2, 최대 약 100 μm2, 최대 약 10 μm2, 최대 약 1 μm2, 최대 약 0.1 μm2, 최대 약 1×10-2 μm2, 또는 그 미만일 수 있다. 각각의 함몰부 개구가 차지하는 면적은 상기 명시된 값들보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다.
각각의 함몰부(54)의 깊이는 고분자 하이드로겔(42)의 일부를 수용하기에 충분히 클 수 있다. 일례에서, 깊이는 적어도 약 0.1 μm, 적어도 약 0.5 μm, 적어도 약 1 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 100 μm, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 깊이는 최대 약 1 × 103 μm, 최대 약 100 μm, 최대 약 10 μm, 또는 그 미만일 수 있다. 일부 예에서, 깊이는 약 0.4 μm이다. 각각의 함몰부(54)의 깊이는 상기 명시된 값들보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있을 수 있다.
일부 경우에, 각각의 함몰부(54)의 직경 또는 길이 및 폭은 적어도 약 50 μm, 적어도 약 0.1 μm, 적어도 약 0.5 μm, 적어도 약 1 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 100 μm, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 직경 또는 길이 및 폭은 최대 약 1 × 103 μm, 최대 약 100 μm, 최대 약 10 μm, 최대 약 1 μm, 최대 약 0.5 μm, 최대 약 0.1 μm, 또는 그 미만(예를 들어, 약 50 nm)일 수 있다. 일부 예에서, 직경 또는 길이 및 폭은 약 0.4 μm 이다. 각각의 함몰부(54)의 직경 또는 길이 및 폭은 상기 명시된 값들보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다.
도 5c에 도시된 예에서, 고분자 하이드로겔(42)은 각각의 함몰부(54) 내에 위치한다. 고분자 하이드로겔(42)은, 고분자 하이드로겔(42)이 함몰부(54) 내에 존재하고 주위 간극 영역(48) 상에는 존재하지 않도록, 도 5b를 참조하여 기술된 바와 같이 적용될 수 있다.
도 5a, 도 5b, 또는 도 5c에 도시되어 있지는 않지만, 플로우 셀(36)이 또한 기판(38)에 부착된 덮개를 포함할 수 있음을 이해하여야 한다. 일례에서, 덮개는, 예를 들어, 간극 영역(48)들 중 일부에서, 기판(38)의 적어도 일부에 접합될 수 있다. 덮개와 기판(38) 사이에 형성되는 접합부는 화학적 결합, 또는 (예를 들어, 체결구 등을 사용한) 기계적 결합일 수 있다.
덮개는 기판(38)을 향해 지향되는 여기광에 대해 투과성인 임의의 재료일 수 있다. 예로서, 덮개는 유리(예를 들어, 보로실리케이트, 용융 실리카 등), 플라스틱 등일 수 있다. 적절한 시판용 보로실리케이트 유리의 예는 Schott North America, Inc.로부터 입수 가능한 D 263®이다. 적절한 시판용 플라스틱 재료, 즉, 사이클로올레핀 중합체의 예는 Zeon Chemicals L.P.로부터 입수 가능한 ZEONOR® 제품이다.
덮개는 레이저 접합, 확산 접합, 양극 접합, 유테틱(eutectic) 접합, 플라즈마 활성화 접합, 유리 프릿 접합 또는 당업계에 공지된 다른 방법과 같은 임의의 적절한 기법을 이용하여 기판(38)에 접합될 수 있다. 일례에서, 덮개를 기판(38)에 접합시키기 위해 스페이서 층이 사용될 수 있다. 스페이서 층은 기판(38)의 적어도 일부와 덮개를 함께 밀봉하는 임의의 재료일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서 층은 기판(38)과 덮개의 접합을 돕는 방사선-흡수 재료일 수 있다.
다른 예들에서, 플로우 셀(36)은 또한 기판(38)에 부착된 추가의 패턴화되거나 패턴화되지 않은 기판(38)을 포함할 수 있다. 기판(38)들은 본 명세서에 기술된 바와 같이 접합될 수 있다.
방법
방법은 대체로 게놈 샘플로부터 복수의 인접성 보존 라이브러리 단편(14, 14')에 대한 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성하는 단계를 포함한다. 일련의 이미지들 중 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지는 다음과 같은 단계들에 의해 순차적으로 생성된다: 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14') 중 일부를 포함하는 각각의 샘플을 플로우 셀(36)로 도입하는 단계로서, 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14') 중 일부는 고체 지지체(16)에 부착되거나(도 1) 서로 부착되는(예를 들어, 도 3에 도시된 부착된 단편(34)들), 단계; 고체 지지체(16)로부터 또는 서로(34)로부터 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')의 방출을 개시하는 단계; 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')을 증폭시켜 복수의 각각의 주형 가닥을 생성하는 단계; 각각의 주형 가닥을 염색하는 단계; 및 각각의 주형 가닥을 이미징하는 단계.
본 명세서에 개시된 방법(들)과 관련하여, 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성하기 위해 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')이 순차적 증폭 및 이미징과 조합하여 사용된다. 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지는 특정 샘플을 사용하여 생성된 주형 가닥의 공간적 위치 및 배향을 기록한다. 이와 같이, 이들 이미지는 클러스터(주형 가닥) 위치를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 클러스터는 특정 시간에 플로우 셀로 도입된 특정 샘플로부터 유래된다.
방법은 복합체(10)가 플로우 셀(36) 내로 도입되는지 또는 부착된 단편(34)이 플로우 셀 내로 도입되는지에 따라 약간 달라질 수 있다. 다양한 예가 이제 기술될 것이다.
복합체(10 또는 10')를 사용하는 방법
이러한 예에서, 게놈 샘플(예를 들어, 샘플(30))이 단편화되어 복수의 인접성 보존 단편들(14, 14')을 형성하며, 이들 단편 각각은 고체 지지체(16)에 부착된다. 게놈 샘플(30)로부터의 모든 인접성 보존 단편들(14, 14')이 동일한 고체 지지체(16)에 부착되지 않을 수 있고; 오히려, 게놈 샘플(30)의 특정 부분과 관련된 인접성 보존 단편들(14, 14')이 각각의 고체 지지체(16)에 부착될 수 있음을 이해하여야 한다. 이와 같이, 게놈 샘플(30)이 단편화되어 복수의 복합체(10 또는 10')를 형성한다. 이는 도 1, 도 2a 내지 도 2c, 도 3을 참조하여 기술된 바와 같이 달성되거나, 어댑터들(18, 22 또는 18', 22)을 단편들(14, 14') 각각에 통합시켜 이들이 시퀀싱 레디 단편들(12, 12')이 되도록 하는 임의의 다른 인접성 보존 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
게놈 샘플(30)을 사용하여 형성된 복합체(10 또는 10')는 혼합물로 통합될 수 있다. 이와 같이, 복수의 인접성 보존 단편들(14, 14') 각각이 또한 혼합물로 통합된다. 혼합물의 액체 캐리어는 완충액, 예를 들어 Tris-HCl 완충액 또는 0.5x 소듐 시트레이트 식염수(SSC) 완충액일 수 있다.
액체 캐리어를 (예를 들어, 복합체(10 또는 10')에 존재하는) 복수의 인접성 보존 단편들(14, 14')에 첨가하여 초기에 혼합물을 형성할 수 있고, 이어서 혼합물을 추가의 액체 캐리어로 희석시켜, 플로우 셀(36)(또는 그의 개별 레인(40))에 개별적으로 도입하려는 미리 결정된 수의 희석 샘플을 생성할 수 있다.
생성되는 혼합물의 최종 부피, 및 그에 따른 혼합물의 희석률은 임의의 바람직한 방식으로 제어될 수 있다. 일부 경우에, 희석률은 플로우 셀(36)의 체적(또는, 예를 들어, 다중 채널 플로우 셀의 각각의 채널(40)) 및 플로우 셀(36)로 도입하려는 원하는 샘플 개수에 좌우될 수 있다. 하나의 예에서, 플로우 셀(36)(또는 그의 채널(40))의 체적은 제한 희석 인자로서 사용될 수 있다. 이와 같이, 일부 예에서, 캐리어 액체를 첨가하여 혼합물을 미리 결정된 부피로 희석시킬 수 있으며, 이때 미리 결정된 부피는 i) 제한 희석으로서의 플로우 셀(36)의 체적 및 ii) 플로우 셀(36)로 도입하려는 미리 결정된 수의 희석 샘플에 기초한다. 일례로서, 플로우 셀(36) 또는 플로우 셀(36)의 하나의 레인(40)은 약 50 μL의 체적을 가질 수 있고, 원하는 샘플 개수는 200개일 수 있다. 이러한 예에서, 혼합물은 약 10,000 μL로 희석될 수 있다. 다른 예로서, 플로우 셀(36) 또는 플로우 셀(36)의 하나의 레인(40)은 약 100 μL의 체적을 가질 수 있고, 원하는 샘플 개수는 384개일 수 있다. 이러한 예에서, 혼합물은 약 38,400 μL로 희석될 수 있다.
원하는 희색 샘플 개수는, 예를 들어, 플로우 셀(36)의 체적 및 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지에서의 개별 주형 가닥의 원하는 해상도에 좌우될 수 있다. 플로우 셀(38) 체적이 작을수록, 플로우 셀(36)로 도입하려는 각각의 개별 희석 샘플이 (덜 희석된 혼합물이 사용된 경우보다) 더 적은 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')을 함유하도록 더 희석된 혼합물을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 유형의 플로우 셀(36)에서, 더 적은 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')은 더 적은 주형 가닥을 생성할 것이며, 이는 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지에서 주형 가닥의 해상도를 개선할 수 있다. 일례에서, 원하는 샘플 개수는 약 100개 샘플 내지 약 1000개 샘플의 범위일 수 있다. 다른 예들에서, 혼합물로부터 제조하려는 원하는 희석 샘플 개수는 1000개 초과일 수 있다. 희석 샘플 개수의 상한은, 부분적으로, 전체 방법이 수행되는 원하는 시간 프레임에 따라 좌우될 수 있다.
이어서, 혼합물은 미리 결정된 수의 희석 샘플로 분할될 수 있다. 하나의 예에서, 희석된 혼합물은 모든 희석 샘플이 동시에 생성되도록 분할될 수 있다. 다른 예에서, 임의의 하나의 희석 샘플의 미리 결정된 부피는, 그 샘플이 플로우 셀(36)로 도입될 시간일 때 벌크 혼합물로부터 분리될 수 있다.
도 6a 내지 도 6d는 시간-기반 클러스터링 이미지들의 생성의 다양한 단계 동안 위에서 본 (예를 들어, 도 5b에 도시된 바와 같은) 패턴화되지 않은 플로우 셀(36)의 예를 도시한다.
도 6a 내지 도 6d에 개략적으로 도시된 바와 같이, 플로우 셀(36)은, 플로우 셀 리셉터클(35); 플로우 셀 리셉터클(35) 내에 위치한 플로우 셀(36)로 희석 샘플(56A) 및 염료(도시되지 않음)를 각각 전달하기 위한 전달 플루이딕스(39)를 포함하는 플루이딕 제어 시스템(37); 플로우 셀 리셉터클(35) 내에 위치한 플로우 셀(36)을 조명하도록 위치한 조명 시스템(62); 플로우 셀 리셉터클(35) 내에 위치한 플로우 셀(36)의 이미지를 캡처하도록 위치한 검출 시스템(64); 및 플루이딕 제어 시스템(37), 조명 시스템(62), 및 검출 시스템(64)과 작동적으로 소통하는 컨트롤러(41)를 포함하는 시스템 내로 도입될 수 있으며, 컨트롤러(41)는 전달 플루이딕스(39)가 희석 샘플(56A)을 플로우 셀 리셉터클(35) 내에 위치한 플로우 셀(36)로 도입하게 하고; 희석 샘플(56A)에 존재하는 인접성 보존 라이브러리 단편들로부터 플로우 셀 리셉터클(35) 내에 위치한 플로우 셀(36) 내에 주형 가닥(58A)이 생성된 후에, 전달 플루이딕스(39)가 염료를 플로우 셀 리셉터클(35) 내에 위치한 플로우 셀(36)로 도입하게 하고; 조명 시스템(62)이 플로우 셀 리셉터클(35) 내에 위치한 플로우 셀(36) 내의 염색된 주형 가닥을 조명하게 하고; 검출 시스템(64)이 플로우 셀 리셉터클(35) 내에 위치한 플로우 셀(36) 내의 조명되고 염색된 주형 가닥을 이미징하게 한다.
위치에 있을 때, 플로우 셀(36)은 플루이딕 제어 시스템(39)(예컨대, 펌프, 밸브 등)과 유체 소통하고, 조명 시스템(62) 및 검출 시스템(64)과 광학 소통한다.
도 6a에서, (도 6a에 10A로 도시된 복합체(10 또는 10') 중 일부를 포함하는) 희석 샘플(56A)들 중 첫 번째 샘플이 플로우 셀(36) 내로 도입된다. 각각의 희석 샘플(56A)들 중 임의의 샘플(또는 예를 들어, 도 6c의 56B)의 도입은 희석 샘플들(56A, 56B) 중 하나를 플로우 셀(36)로 유체적으로 지향시키는 것을 수반한다. 희석 샘플(56A)은, 예를 들어, 카트리지(45)로 도입될 수 있고, 플루이딕 제어 시스템(37)은 희석 샘플(56A)을 카트리지(45)로부터 전달 플루이딕스(39)(예컨대, 펌프, 밸브 등)를 사용하여 플로우 셀(36)의 플로우 채널(40)로 유체 수송할 수 있다.
희석 샘플(56A) 내에 복합체(10A)가 농축되면, 복합체(10A)의 전부는 아니더라도 대부분이 고분자 하이드로겔(42) 및 그 위의 임의의 프라이머(44, 46)(이는 도 6a 내지 도 6d에 도시되어 있지 않음) 상으로 침강될 것이다. 일부 예에서, 복합체(10A)는 플로우 채널(40)의 깊이 또는 함몰부(54)로 인해 플로우 채널(40) 또는 함몰부(54) 내에 침강되어 유지될 수 있다. 다른 예들에서, 플로우 채널(40) 또는 함몰부(54)는 복합체(10A)가 부착되는 포획 부위를 포함할 수 있다.
일부 복합체(10A)는 침강되지 않을 수 있고, 이러한 복합체(10A)는 추가 공정 전에 플로우 셀(36)로부터 제거될 것임을 이해하여야 한다. 이와 같이, 방법의 일부 예는 이어서 플로우 셀(36)로부터 포획되지 않은 복합체(10A)를 세척하는 단계를 포함한다. 세척 단계는 유체를 플로우 셀(36) 내로 도입하는 것을 수반할 수 있다. 유동은 플로우 셀(36)의 출구 포트를 통해 침강되지 않고/침강되지 않거나 부착되지 않은 임의의 복합체(10A)를 밀어낼 수 있다.
방법의 이러한 예는 이어서 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')이 부착된 각각의 고체 지지체(16)로부터 그러한 단편들의 방출을 개시하는 단계를 포함한다. 이러한 예에서, 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')(인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14') 및 그에 부착된 어댑터들(18, 22 또는 18', 22))이 각각의 고체 지지체(16)로부터 방출된다. 도 6a에서, 고체 지지체(16)로부터의 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')의 방출은 각각의 고체 지지체(16)로부터 바깥쪽으로 향하는 화살표로 표시된다.
시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')의 방출은 몇몇 상이한 방식으로 개시될 수 있다. 하나의 예에서, 방출을 개시하는 단계는 플로우 셀(36)을 가열하는 것을 포함한다. 이러한 예에서, 시스템은 히터(43)를 포함할 수 있다. 컨트롤러(41)는 히터(43)가 고체 지지체(16)로부터 또는 서로로부터 인접성 보존 라이브러리 단편들(12, 12') 중 일부의 방출을 개시하게 할 수 있다. 예로서, 70℃ 초과의 온도를 사용하여 결합을 적어도 부분적으로 파괴하고, 그에 따라 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')의 방출을 개시할 수 있다. 다른 예에서, 방출을 개시하는 단계는 플로우셀(36)에 절단 작용제(cleaving agent)를 도입하는 것을 수반한다. 플루이딕 제어 시스템(37)이 절단 작용제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 절단 작용제는 고체 지지체(16)로부터의 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')의 화학적, 효소적 또는 광화학적 방출을 개시할 수 있다. 이들 예에서, 열 또는 광과 같은 다른 자극이 절단 작용제를 촉발시켜 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')을 고체 지지체(16)로부터 방출시킬 수 있다. 하나의 예로서, 유리 바이오틴이 절단 작용제로서 도입될 수 있고, 약 92℃로의 가열이 고체 지지체(16)로부터 바이오틴-올리고 방출을 유도하는 데 사용될 수 있다.
방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')은 고체 지지체(16)로부터 수송되어 고분자 하이드로겔(42) 상으로 시딩(seeding)된다. 더욱 구체적으로, 증폭 프라이머들(46, 48)은 상대적으로 제한된 방식으로 방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')을 시딩한다. 일례에서, 시딩은 플로우 셀(36) 내에서 단편(12, 12') 중 제1 또는 제2 서열과 고분자 하이드로겔(42) 상의 프라이머들(46, 48) 중 상보적인 하나의 프라이머 사이의 하이브리드화를 통해 달성된다. 시딩은 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12') 및 프라이머(들)(46, 48)에 적합한 하이브리드화 온도에서 수행될 수 있다. 히터(43)는 플로우 셀(36)이 시딩 온도에 이르도록 제어될 수 있다.
비드를 제거하기 위해 세척 공정이 수행될 수 있다.
이어서, 시딩된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')은 클러스터 생성과 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여 증폭될 수 있다. 클러스터 생성의 하나의 예에서, 방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')은 고충실도(high-fidelity) DNA 폴리머라제를 사용하여 3' 신장에 의해 하이브리드화된 프라이머들(46, 48)로부터 카피(copy)된다. 원래의 시퀀싱-레디 핵산 단편(12, 12')은 변성되어, 플로우 채널(40) 또는 함몰부(54)의 일부 내에 고정된 상태로 카피를 남겨둔다. 임의의 클론 증폭 공정이 이용될 수 있다. 하나의 예에서, 고정된 카피를 증폭시키기 위해 등온 브리지 증폭이 사용될 수 있다. 예를 들어, 카피된 주형은 루프 오버(loop over)하여 인접한 상보적 프라이머들(46, 48)에 하이브리드화되고, 폴리머라제는 카피된 주형을 카피하여 이중 가닥 브리지를 형성하며, 이는 변성되어 2개의 단일 가닥으로 된 가닥을 형성한다. 이러한 2개의 가닥은 루프 오버하여 인접한 상보적 프라이머들(46, 48)에 하이브리드화되고, 다시 신장되어 2개의 새로운 이중 가닥 루프를 형성한다. 공정은 조밀한 클론성 클러스터를 생성하기 위해 등온 변성 및 증폭의 사이클에 의해 각각의 주형 카피에 대해 반복된다. 이중 가닥 브리지의 각각의 클러스터는 변성된다. 일례에서, 역방향 가닥은 특정 염기 절단에 의해 제거되어, 정방향 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 남긴다. 클러스터링이 플로우 채널(40) 내의 몇몇 주형 가닥(58A) 또는 함몰부(54)들의 일부의 형성을 가져옴을 이해하여야 한다. 일부 예에서, 컨트롤러(41)는 히터(43)가 열 사이클을 실행하게 하여 시딩된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')을 증폭시킨다.
도 6b는 제1 희석 샘플(56A)(구획)의 복합체(10A)로부터 생성된 주형 가닥(58A)의 클러스터(60A)들을 도시한다. 도 6b에서 클러스터(60A)는 명료함을 위해 그 윤곽이 표시되어 있다. 도 6b는 4개의 클러스터(60A)를 도시하지만, 클러스터(60A)의 개수는 샘플(56A)로 도입된 복합체(10A)의 개수뿐만 아니라 각각의 고체 지지체(16)로부터 방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')의 개수에 좌우될 것임을 이해하여야 한다. 클러스터(60A)는 방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12') 각각으로부터 생성된다. 더욱이, 방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')은 플로우 셀 표면을 가로질러 확산될 수 있으며, 그에 따라 클러스터(60A)들은 플로우 셀 표면을 가로질러 생성될 수 있다.
제1 희석 샘플(56A)에 대한 클러스터(60A)들을 생성한 후에, 염료가 플로우 셀(36) 내로 도입된다. 주형 가닥(58A)을 염색할 수 있는 임의의 형광 염료가 사용될 수 있다. 적합한 형광 염료의 예에는 Molecular Probes, Inc.의 SYBR® 계열 염료(예를 들어, SYBR® Green, SYBR® Gold, SYBR® Safe 등), 에티듐 브로마이드, 프로피듐 요오다이드, 크리스탈 바이올렛, EVAGREEN® 염료(Biotium의 제품), DAPI(4',6-다이아미디노-2-페닐인돌) 등이 포함된다. 염료는, 예를 들어, 제2 카트리지(도시되지 않음)로부터 플로우 셀(36) 내로 도입되고, 주형 가닥(58A)을 염색하기에 적절한 시간 동안 인큐베이션되고, 이어서 플로우 셀(36) 밖으로 플러싱된다.
이어서, 플로우 셀(36) 내의 염색된 주형 가닥(58A)을 조명하기 위해 조명 시스템(62)이 사용될 수 있다. 조명 시스템은 광원 및 복수의 광학 구성요소를 포함할 수 있다. 광원의 예에는 레이저, 아크 램프, LED, 또는 레이저 다이오드가 포함될 수 있다. 광학 구성요소는, 예를 들어, 반사기, 다이크로익(dichroic), 빔 스플리터, 시준기, 렌즈, 필터, 웨지, 프리즘, 거울, 검출기 등일 수 있다. 조명 시스템은 사용되는 염료에 대응하는 플로우 셀 표면으로 여기 광을 지향시키도록 작동적으로 위치할 수 있다.
검출 시스템(64)은 형광 주형 가닥(58A)의 이미지(I1)를 캡처하는 데 사용될 수 있다. 이러한 이미지(I1)는 희석 샘플(56A)에 대한 시간-기반 클러스터링 이미지인데, 그 이유는 그것이 희석 샘플(56A)과 관련된 주형 가닥(58A)의 공간적 위치 및 배향을 묘사하기 때문이다. 임의의 적합한 카메라가 플로우 셀(36) 상의 클러스터(60A)의 이미지(I1)를 캡처하는 데 사용될 수 있다.
이미지(I1)는 후속 검색 및 사용을 위해 전자적으로 저장될 수 있다. 이와 같이, 시스템의 일부 예는 이미지(I1)를 저장하기 위한 전자 저장 구성요소(47)를 포함한다. 전자 기록에서, 이미지(I1)는 희석 샘플(56A)에 연결될 수 있다. 이미지(I1)에는 또한 시간 기록(temporal record)이 할당될 수 있다. 이와 같이, 방법의 일부 예는, 일련의 이미지들 내의 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지(I1)에, 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 포함하는 각각의 샘플의 도입에 관한 시간 기록을 할당하는 단계를 포함한다. 시간 기록은 희석 샘플(56A)이 도입되고/도입되거나 이미징되었을 때를 나타내는 타임 스탬프(time stamp), 도입 및/또는 이미징 순서에서의 단계 번호(예를 들어, 200개 중 샘플 1, 200개 중 샘플 2, ... 200개 중 샘플 X), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
플로우 셀(36) 상의 클러스터(60A)가 이미징된 후에 세척이 수행될 수 있다. 물, 완충액, 또는 다른 순한 세척 용액이 사용될 수 있다.
이어서, 도 6a 및 도 6b를 참조하여 도시되고 기술된 공정들이 제2 희석 샘플(56B)(도 6c에 도시됨)에 대해 반복된다.
도 6c에서, 제2 희석 샘플(56B)이 플로우 셀(36) 내로 도입된다. 복합체(10B)(복합체(10 또는 10')일 수 있음)는 플로우 셀 표면에 침강되고/침강되거나 부착된다.
도 6c에 도시된 바와 같이, 방법은 이어서 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')이 부착된 각각의 고체 지지체(16)로부터 이들 단편의 방출을 개시하는 단계를 포함한다. 이러한 예에서, 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')(인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14') 및 그에 부착된 어댑터들(18, 22 또는 18', 22))이 각각의 고체 지지체(16)로부터 방출된다.
방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')은 고체 지지체(16)로부터 수송되어 고분자 하이드로겔(42) 상으로 시딩된다. 이어서, 시딩된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')은 클러스터 생성과 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여 증폭될 수 있다. 이러한 클러스터링 라운드(round)는 플로우 채널(40) 또는 함몰부(54) 중 일부 내에서의 몇개 더 많은 주형 가닥(58B)의 형성을 가져옴을 이해하여야 한다.
도 6d는 제2 희석 샘플(56B)(구획)의 각각의 복합체(10B)로부터 생성된 주형 가닥(58B)의 클러스터(60B)를 도시한다. 도 6d에서 클러스터(60A, 60B)는 명료함을 위해 그 윤곽이 표시되어 있다. 도 6d는 3개의 클러스터(60B)를 도시하지만, 클러스터(60B)의 개수는 샘플(56B)로 도입된 복합체(10B)의 개수뿐만 아니라 각각의 고체 지지체(16)로부터 방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')의 개수에 좌우될 것임을 이해하여야 한다.
제2 희석 샘플(56B)에 대한 클러스터(60B)들을 생성한 후에, 염료가 다시 플로우 셀(36) 내로 도입된다. 주형 가닥(58A)을 염색하는 데 사용된 동일한 염료가 주형 가닥(58B) 및 임의의 후속 생성된 주형 가닥을 염색하는 데 사용될 수 있다.
이어서, 플로우 셀(36) 내의 염색된 주형 가닥들(58A, 58B)을 조명하기 위해 조명 시스템(62)이 사용될 수 있다. 각각의 클러스터(60A, 60B) 내의 형광 주형 가닥들(58A, 58B)의 이미지(I2)를 캡처하기 위해 검출 시스템(64)이 사용될 수 있다.
이미지(I2)는 또한 후속 검색 및 사용을 위해 전자적으로 저장될 수 있다. 전자 기록에서, 이미지(I2)는 희석 샘플(56B)에 연결될 수 있다. 이미지(I2)에는 또한 시간 기록이 할당될 수 있다. 시간 기록은 희석 샘플(56B)이 이미징되었을 때를 나타내는 타임 스탬프, 순서에서의 단계 번호(예를 들어, 200개 중 샘플 2), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
플로우 셀(36) 상의 클러스터들(60A, 60B)이 이미징된 후에 세척이 수행될 수 있다. 물, 완충액, 또는 다른 순한 세척 용액이 사용될 수 있다.
이어서, 도 6a 및 도 6b를 참조하여 도시되고 기술된 공정들은 원래의 혼합물로부터 유래된 희석 샘플 개수에 대해, 예를 들어, 기술된 시스템을 사용하여 반복될 수 있다. 각각의 추가 이미지(I3, I4, ... IX)는 각각의 희석 샘플(56C, 56D, ... 56X)의 도입으로 생성된 주형 가닥들(58C, 58D, ... 58X)의 새로운 클러스터들(60C, 60D, ... 60X)을 묘사할 것이다. 각각의 희석 샘플(56A, 56B, ... 56X)에 대해 얻은 모든 이미지(I1, I2, … Ix)는 특정 혼합물, 및 그에 따른 특정한 더 긴 핵산 분자(30)와 관련된다.
각각의 순차적 이미지(I2, I3, I4, ... IxI)는 직전 이미지(I1, I2, I3, … Ix)와 관련하여 새로 형성된 클러스터(60B, 60C, 60D, ... 60X)를 묘사하기 때문에, 제1 샘플(56A)에 후속하여 도입되는 각각의 샘플에 대한 분해된 클러스터 이미지를 생성하기 위해 이미지 차감(subtraction)이 이용될 수 있다. 몇몇 예시적인 분해된 클러스터 이미지(RIx)가 도 6에 도시되어 있다.
도 7은 도 6a 및 도 6b를 참조하여 기술된 바와 같이 순차적으로 도입되고, 증폭되고, 염색되고, 이미징되는 6개의 상이한 희석 샘플(56A, 56B, 56C, 56D, 56E, 56F)에 대해 취해진 이미지들(I1, I2, I3, I4, I5, I6)을 도시한다. 도시된 바와 같이, 새로 도입되고 처리된 희석 샘플들(56A, 56B, 56C, 56D, 56E, 56F) 각각에 대해 새로운 클러스터들(60A, 60B, 60C, 60D, 60E, 60F)이 각각 생성된다.
제1 샘플(56A)에 대한 이미지(I1)가 하나의 샘플로부터의 클러스터(60A)를 포함하기 때문에, 원래의 이미지(I1)가 클러스터(60A)의 공간적 확인을 위해 사용될 수 있음에 따라, 분해된 클러스터 이미지가 생성될 필요가 없다. 제1 샘플(56A)에 후속하여 도입된 각각의 샘플의 경우, 분해된 클러스터 이미지(RI2, RI3, RI4, RI5, RI6)가 다른 이미지들(I2, I3, I4, I5, I6) 각각에 대해 생성된다. 하나의 예로서, 이미지(I1)(클러스터(60A) 내의 주형 가닥(58A)을 묘사함)가 이미지(I2)(클러스터(60A) 내의 주형 가닥(58A) 및 클러스터(60B) 내의 주형 가닥(58B)을 묘사함)로부터 차감되어 제2 샘플(56B)에 대한 분해된 클러스터 이미지(RI2)를 생성할 수 있다. 이러한 분해된 클러스터 이미지(RI2)는 제2 샘플(56B)과 관련된 클러스터(60B)들 내의 주형 가닥(58B)들의 공간적 위치 및 배향을 묘사한다. 다른 예의 경우, 이미지(I1)(클러스터(60A) 내의 주형 가닥(58A)을 묘사함) 및 이미지(I2)(클러스터(60A) 내의 주형 가닥(58A) 및 클러스터(60B) 내의 주형 가닥(58B)을 묘사함)가 이미지(I3)(클러스터(60A) 내의 주형 가닥(58A), 클러스터(60B) 내의 주형 가닥(58B), 및 클러스터(60C) 내의 주형 가닥(58C)을 묘사함)로부터 차감되어 제3 샘플, 예를 들어, 56C에 대한 분해된 클러스터 이미지(RI3)를 생성한다. 이러한 분해된 클러스터 이미지(RI3)는 제3 샘플(56C)과 관련된 클러스터(60C)들 내의 주형 가닥(58C)들의 공간적 위치 및 배향을 묘사한다. 분해된 클러스터 이미지(RI4, RI5, 및 RI6)는 전술한 이미지들 중 임의의 것을 차감함으로써 유사한 방식으로 생성될 수 있다.
이미지 차감은 일련의 I1, I2, I3, ... Ix 중 임의의 것에 대해 수행될 수 있음을 이해하여야 한다. 임의의 주어진 희석 샘플(56X)에 대한 생성된 분해된 클러스터 이미지(RIx)는 희석 샘플(56X)과 관련된 주형 가닥(58X)들의 공간적 위치 및 배향을 묘사한다.
분해된 클러스터 이미지는 후속 분석을 위해 저장될 수 있다.
부착된 단편(34)들을 사용하는 방법
이러한 예에서, 게놈 샘플이 단편화되어, 예를 들어 부착된 단편(34)들로서 서로 부착되는 복수의 인접성 보존 단편들(14, 14')을 형성한다. 게놈 샘플로부터의 모든 인접성 보존 단편들(14, 14')이 서로 부착되지 않을 수 있고; 오히려, 도 4에 도시된 공정은 몇몇 부착된 단편(34)들의 형성을 가져올 수 있음을 이해하여야 한다.
게놈 샘플을 사용하여 형성된 부착된 단편(34)들은 혼합물로 통합될 수 있다. 이와 같이, 복수의 인접성 보존 단편들(14, 14') 각각이 또한 혼합물로 통합된다. 혼합물의 액체 캐리어는 완충액, 예를 들어 Tris-HCl 완충액 또는 0.5x 소듐 시트레이트 식염수(SSC) 완충액일 수 있다.
액체 캐리어를 복수의 부착된 단편(34)들에 첨가하여 초기에 혼합물을 형성할 수 있고, 이어서 혼합물을 추가의 액체 캐리어로 희석시켜, 플로우 셀(36)(또는 그의 개별 레인(40))에 개별적으로 도입하려는 미리 결정된 수의 희석 샘플을 생성할 수 있다.
생성되는 혼합물의 최종 부피, 및 그에 따른 혼합물의 희석률은 임의의 바람직한 방식으로 그리고 본 명세서에 기술된 바와 같이 제어될 수 있다.
이어서, 혼합물은 미리 결정된 수의 희석 샘플로 분할될 수 있다. 하나의 예에서, 희석된 혼합물은 모든 희석 샘플이 동시에 생성되도록 분할될 수 있다. 다른 예에서, 임의의 하나의 희석 샘플의 미리 결정된 부피는, 그 샘플이 플로우 셀(36)로 도입될 시간일 때 벌크 혼합물로부터 분리될 수 있다.
이러한 예시적인 방법에서, 도 4에 도시된 부착된 단편(34)들은 희석 샘플들 중 하나의 일부로서 플로우 채널로 도입된다. 이러한 희석 샘플(66A)의 일례가 도 8에 도시되어 있다.
도 8에 도시된 바와 같이, 플로우 셀(36) 내에서, 트랜스포사제(32)가 부착된 단편(34)들로부터 제거된다. 이는, 예를 들어, SDS 또는 프로테이나아제를 사용하여 달성될 수 있다. 트랜스포사제(32)의 제거는 각각의 인접성 보존 단편(14, 14')(및 그에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 임의의 가닥(26', 28'))을 인접한 인접성 보존 단편들(14, 14')로부터 유리시킨다. 다시 말하면, 부착된 단편(34)의 하위-단편(72)이 방출되고, 전이 가닥(26')을 통해 고분자 하이드로겔(42) 상으로 시딩될 수 있다. 도 8에 개략적으로 도시된 바와 같이, 전이 가닥(26')은 플로우 셀(36)의 표면 상의 각각의 상보적 프라이머(46)에 하이브리드화된다. 일부 경우에, 하이브리드화 동안 열이 가해질 수 있다. 열을 가하는 것은 전이 가닥(26')의 용융 온도에 좌우될 수 있다. 하나의 예로서, 전이 가닥(26')의 P5' 부분은 고분자 하이드로겔(42)에 부착된 상보적 P5 증폭 프라이머(46)에 하이브리드화된다.
플로우 셀(36)로부터 트랜스포사제(32)를 제거하기 위해 플로우 셀(36)의 플로우 채널을 통해 세척 용액이 유동될 수 있다. 적합한 세척 용액의 예에는 트랜스포사제를 제거할 수 있는 SDS가 포함된다. 플로우 셀(36)을 세정하기 위해 TRIS 또는 하이브리드화 세척 완충액과 같은 제2 세척 용액이 사용될 수 있다.
증폭 전에, 방법의 이러한 예는 제2 서열 부분(예를 들어, 비-전이 가닥(28'))을 하이브리드화된 단부에 대향하는 단부에 있는 하이브리드화된 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14') 각각으로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 이와 같이, 방법의 일부 예에서, 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14') 각각은 플로우 셀(26)의 표면 상의 제1 프라이머 서열(46)에 하이브리드화되는 제1 단부에 있는 제1 서열 부분을 포함하고; 그리고 증폭 전에, 방법은 제1 단부에 대향하는 제2 단부에 있는 하이브리드화된 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14') 각각에 제2 서열 부분을 부착시키는 단계를 추가로 포함하며, 제2 서열 부분은 플로우 셀(36)의 표면 상의 제2 프라이머 서열(48)과 동일하여 제2 서열 부분의 카피가 제2 프라이머 서열(48)에 하이브리드화될 수 있다.
제2 서열 부분의 도입은 신장 라이게이션을 사용하여 수행될 수 있다. 일례에서, 비-전이 가닥(28')들을 상응하는 단편들(14, 14')에 결합시키기 위해 (도 8에 화살표(74)로 표시된 바와 같이) 신장 라이게이션이 개시될 수 있다. 일례에서, 신장 라이게이션은, 신장 라이게이션 믹스(mix)를 플로우 셀(36)로 도입하고, 효소 활성에 적합한 온도(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 50℃ 범위의 온도)까지 가열함으로써 개시될 수 있다.
신장 라이게이션 믹스는 비-전이 가닥(28')과 그의 상응하는 단편(14 또는 14') 사이의 결합의 형성을 촉매하는 라이게이션 효소(예를 들어, DNA 리가제)를 포함할 수 있다. 도 4를 참조하여 기술된 바와 같이, 비-전이 가닥(28')은 제2 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 2 시퀀싱 프라이머 서열) 및 플로우 셀 표면 상의 증폭 프라이머(48)(P7)들 중 다른 프라이머의 적어도 일부와 동일한 제2 서열(P7)을 포함한다. 이러한 제2 서열은 클러스터링 동안 플로우 셀 표면 상의 증폭 프라이머(48)(P7)에 하이브리드화될 수 있는 상보적 카피, 예를 들어 P7'이 증폭 동안 생성될 수 있게 한다. 이와 같이, 라이게이션은 플로우 셀 표면에 부착된 시퀀싱 레디 라이브러리 단편들(12, 12')의 형성을 가져온다.
신장 라이게이션 믹스는 프라이머(46)들의 노출된 말단에 부착되어 이러한 프라이머(46)들에서 원치 않는 신장을 방지하는 차단 기(blocking group)를 또한 포함할 수 있다. 대안적으로, 프라이머(46)는 차단 기(예를 들어, 3'포스페이트)가 부착된 표면에 그래프팅될 수 있다. 또 다른 예에서, 차단 기가 사용되지 않을 수 있다.
생성된 단편들(12, 12')이 서로 부착됨에 따라, 단편(12)으로부터 단편(12')을 해리시키기 위해 가열이 사용될 수 있다. 프라이머(46)에 하이브리드화되지 않은 단편(12')은 세척을 이용하여 플로우 셀(36)로부터 제거될 수 있다.
사용되는 경우, 임의의 차단된 프라이머(46)가 이어서 증폭이 수행될 수 있도록 (예를 들어, 키나제 또는 다른 적절한 탈차단제를 사용하여) 차단 해제될 수 있다. 이러한 예에서, 증폭은 클러스터 생성과 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 클러스터 생성은 도 6a를 참조하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 도 6a를 참조하여 기술된 시스템이 사용될 수 있다.
도 9a는 희석 샘플(66A)(도 8에 도시됨)의 부착된 단편(34)으로부터 생성된 주형 가닥(68A)의 클러스터(70A)들을 예시한다. 도 9a에서 클러스터(70A)는 명료함을 위해 그 윤곽이 표시되어 있다. 도 9a는 4개의 클러스터(70A)를 도시하지만, 클러스터(70A)의 개수는 샘플(66A)로 도입된 부착된 단편(34)의 개수뿐만 아니라 부착된 단편(34)으로부터 방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')의 개수에 좌우될 것임을 이해하여야 한다.
제1 희석 샘플(66A)에 대한 클러스터(70A)들을 생성한 후에, 도 6b를 참조하여 기술된 바와 같이 염료가 플로우 셀(36) 내로 도입된다. 염료는 플로우 셀(36) 내로 도입되고, 주형 가닥(68A)을 염색하기에 적절한 시간 동안 인큐베이션되고, 이어서 플로우 셀(36) 밖으로 플러싱된다.
이어서, 플로우 셀(36) 내의 염색된 주형 가닥(68A)을 조명하기 위해 조명 시스템(62)이 사용될 수 있고, 형광 주형 가닥(68A)의 이미지(I1)를 캡쳐하기 위해 검출 시스템(64)이 사용될 수 있다. 이러한 이미지(I1)는 희석 샘플(66A)에 대한 시간-기반 클러스터링 이미지인데, 그 이유는 그것이 희석 샘플(66A)과 관련된 주형 가닥(68A)의 공간적 위치 및 배향을 묘사하기 때문이다.
이미지(I1)는 후속 검색 및 사용을 위해 전자적으로 저장될 수 있다. 전자 기록에서, 이미지(I1)는 희석 샘플(66A)에 연결될 수 있다. 이미지(I1)에는 또한 시간 기록이 할당될 수 있다. 시간 기록은 희석 샘플(66A)이 도입되고/도입되거나 이미징되었을 때를 나타내는 타임 스탬프, 도입 및/또는 이미징 순서에서의 단계 번호(예를 들어, 200개 중 샘플 1, 200개 중 샘플 2, ... 200개 중 샘플 X), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
플로우 셀(36) 상의 클러스터(70A)가 이미징된 후에 세척이 수행될 수 있다. 물, 완충액, 또는 다른 순한 세척 용액이 사용될 수 있다.
이어서, 도 8 및 도 9a를 참조하여 도시되고 기술된 공정들이 제2 희석 샘플(66B)(도 9b에 도시됨)에 대해 반복된다.
도 9b에서, 제2 희석 샘플(66B)이 플로우 셀(36) 내로 도입된다. 도 8을 참조하여 기술된 바와 같이 부착된 단편(34)은 하위-단편(72)으로 분해될 수 있다. 하위-단편(72)들 중 적어도 일부의 하나의 전이 가닥(26)이 플로우 셀(36) 상의 상보적 증폭 프라이머(46)에 하이브리드화될 것이다. 이어서, 도 8을 참조하여 기술된 신장 라이게이션 및 다른 공정들이 수행될 수 있으며, 이는 플로우 셀 표면에 부착된 시퀀싱-레디 핵산 단편(12)을 생성한다.
클러스터 생성은 도 6a를 참조하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
도 9c는 제2 희석 샘플(66B)의 부착된 단편(34)으로부터 생성된 주형 가닥(68B)의 클러스터(70B)들을 도시한다. 도 9c에서 클러스터(70A, 70B)는 명료함을 위해 그 윤곽이 표시되어 있다. 도 9c는 2개의 클러스터(70B)를 도시하지만, 클러스터(70B)의 개수는 샘플(66B)로 도입된 부착된 단편(34)의 개수뿐만 아니라 부착된 단편(34)으로부터 방출된 시퀀싱-레디 핵산 단편들(12, 12')의 개수에 좌우될 것임을 이해하여야 한다.
제2 희석 샘플(66B)에 대한 클러스터(70B)들을 생성한 후에, 염료가 다시 플로우 셀(36) 내로 도입된다. 주형 가닥(68A)을 염색하는 데 사용된 동일한 염료가 주형 가닥(68B) 및 임의의 후속 생성된 주형 가닥을 염색하는 데 사용될 수 있다.
이어서, 플로우 셀(36) 내의 염색된 주형 가닥들(68A, 68B)을 조명하기 위해 조명 시스템(62)이 사용될 수 있다. 각각의 클러스터(70A, 70B) 내의 형광 주형 가닥들(68A, 68B)의 이미지(I2)를 캡처하기 위해 검출 시스템(64)이 사용될 수 있다.
이미지(I2)는 또한 후속 검색 및 사용을 위해 전자적으로 저장될 수 있다. 전자 기록에서, 이미지(I2)는 희석 샘플(66B)에 연결될 수 있다. 이미지(I2)에는 또한 시간 기록이 할당될 수 있다. 시간 기록은 희석 샘플(56B)이 이미징되고/이미징되거나 도입되었을 때를 나타내는 타임 스탬프, 순서에서의 단계 번호(예를 들어, 1000개 중 샘플 2), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
플로우 셀(36) 상의 클러스터들(70A, 70B)이 이미징된 후에 세척이 수행될 수 있다. 물, 완충액, 또는 다른 순한 세척 용액이 사용될 수 있다.
이어서, 도 9b 및 도 9c를 참조하여 도시되고 기술된 공정들은 원래의 혼합물로부터 유래된 희석 샘플 개수에 대해 반복될 수 있다. 각각의 추가 이미지(I3, I4, ... IX)는 각각의 희석 샘플(66C, 66D, ... 66X)의 도입으로 생성된 주형 가닥들(68C, 68D, ... 68X)의 새로운 클러스터들(70C, 70D, ... 70X)을 묘사할 것이다. 각각의 희석 샘플(66A, 66B, ... 66X)에 대해 얻은 모든 이미지(I1, I2, … Ix)는 특정 혼합물, 및 그에 따른 특정한 더 긴 핵산 분자(30)와 관련된다.
각각의 순차적 이미지(I2, I3, I4, ... Ix)는 직전 이미지(I1, I2, I3, … Ix)와 관련하여 새로 형성된 클러스터(70B, 70C, 70D, ... 70X)를 묘사하기 때문에, 제1 샘플(66A)에 후속하여 도입되는 각각의 샘플에 대한 분해된 클러스터 이미지를 생성하기 위해 이미지 차감이 이용될 수 있다. 분해된 클러스터 이미지(RIx)는 도 7을 참조하여 기술된 바와 같이 생성될 수 있다.
이미지 차감은 일련의 I1, I2, I3, ... Ix 중 임의의 것에 대해 수행될 수 있음을 이해하여야 한다. 임의의 주어진 희석 샘플(66X)에 대한 생성된 분해된 클러스터 이미지(RIx)는 희석 샘플(66X)과 관련된 주형 가닥(68X)들의 공간적 위치 및 배향을 묘사한다.
분해된 클러스터 이미지는 후속 분석을 위해 저장될 수 있다.
다른 방법들
개별 희석 샘플(56A, 66A)을 도입하기보다는, 희석된 혼합물이 미리 결정된 부피로 플로우 셀 내로 확산될 수 있고, 생성된 주형 가닥들(58X, 68X)의 이미지를 증폭하고, 염색하고, 기록하기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같이 플로우 셀(38) 상에서의 처리가 수행될 수 있다. 확산은 한 번에 하나의 미리 결정된 부피가 도입되도록 제어될 수 있다.
이와 같이, 방법의 일부 예는 하기 단계들에 의해 플로우 셀(36)로 도입되는 제한 희석 샘플 각각에 대한 시간-기반 클러스터링 이미지를 생성하는 단계를 포함한다: 플로우 셀 내로의 혼합물의 확산을 제어함으로써 한 번에 제한 희석 샘플들 중 하나가 플로우 셀(36)로 도입되게 하는 단계; 플로우 셀(36) 내의 제한 희석 샘플들 중 하나에서 고체 지지체(16)로부터 또는 서로로부터(예를 들어, 부착된 단편(34)으로부터) 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')의 방출을 개시하는 단계; 인접성 보존 라이브러리 단편들(14, 14')을 증폭시켜 복수의 각각의 주형 가닥(58A, 68A)을 생성하는 단계; 각각의 주형 가닥(58A, 68A)을 염색하는 단계; 및 각각의 주형 가닥(58A, 68A)을 이미징하는 단계.
시퀀싱 및 분석
혼합물로부터의 모든 희석 샘플이 본 명세서에 기술된 바와 같이 증폭되고 이미징된 경우, 플로우 셀(36)이 시퀀싱 작업을 위해 준비된 것이다. 합성에 의한 시퀀싱(SBS), 사이클릭-어레이 시퀀싱(cyclic-array sequencing), 라이게이션에 의한 시퀀싱(sequencing-by-ligation), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 등으로 종종 지칭되는 기법을 포함하는 다양한 시퀀싱 접근법 또는 기술이 사용될 수 있다.
하나의 예로서, 합성에 의한 시퀀싱(SBS) 반응은 HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NOVASEQ™, NEXTSEQDX™, ISEQ™, NEXTSEQ™, 또는 Illumina(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)의 다른 시퀀서 시스템과 같은 시스템 상에서 실행될 수 있다. SBS의 경우, 주형 내의 뉴클레오타이드들의 서열을 결정하기 위해 주형 가닥들(58A, 58B, ... 58X)을 따른 시퀀싱 프라이머들의 신장이 모니터링된다. 시퀀싱 반응과의 간섭을 방지하기 위해, 특히 바람직하지 않은 프라이밍을 방지하기 위해 주형 가닥들(58A, 58B, ... 58X)의 3'-말단 및 임의의 플로우 셀-결합 프라이머들(46, 48)(주형 가닥들(58A, 58B, ... 58X)에 부착되어 있지 않음)이 차단될 수 있다.
주형 가닥들(58A, 58B, ... 58X) 상의 상보적 서열에 하이브리드화되는 시퀀싱 프라이머가 도입될 수 있다. 이러한 시퀀싱 프라이머는 주형 가닥들(58A, 58B, ... 58X)이 시퀀싱을 위해 준비되게 한다.
기본 화학 공정은 중합(예를 들어, 폴리머라제 효소에 의해 촉매됨) 또는 라이게이션(예를 들어, 리가제 효소에 의해 촉매됨)일 수 있다. 특정 폴리머라제-기반 SBS 공정의 경우, 형광 표지된 뉴클레오타이드가 주형 의존적 방식으로 시퀀싱 프라이머에 부가되어, 주형의 서열을 결정하기 위해 시퀀싱 프라이머에 부가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출이 사용될 수 있게 한다. 예를 들어, 제1 SBS 사이클을 개시하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 폴리머라제 등이 플로우 셀(36) 등 내로/이를 통해 전달될 수 있으며, 여기서 시퀀싱 프라이머 신장은 표지된 뉴클레오타이드가 통합되게 한다. 이러한 통합은 이미징 이벤트를 통해 검출될 수 있다. 이미징 이벤트 동안, 조명 시스템(62)은 플로우 셀(36)에 여기 광을 제공할 수 있다.
일부 예에서, 형광 표지된 뉴클레오타이드는, 일단 뉴클레오타이드가 주형에 부가되면 추가의 프라이머 신장을 종결시키는 가역적 종결 속성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결인자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체가 주형에 부가될 수 있어서, 모이어티를 제거하기 위해 탈차단제가 전달될 때까지 후속 신장이 일어날 수 없게 한다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 예의 경우, 탈차단 시약은 (검출이 수행된 후에) 플로우 셀(36) 등에 전달될 수 있다.
세척(들)은 다양한 유체 전달 단계 사이에서 수행될 수 있다. 이어서, n개의 뉴클레오타이드만큼 주형을 신장시키도록 SBS 사이클이 n회 반복됨으로써, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다.
SBS가 상세히 설명되었지만, 본 명세서에 기술된 플로우 셀(36)이 유전자형 결정을 위해 다른 시퀀싱 프로토콜과 함께 이용되거나, 다른 화학적 및/또는 생물학적 응용에서 이용될 수 있음을 이해하여야 한다.
시퀀싱 작업 동안 얻어진 시퀀싱 리드들은 분해된 클러스터 이미지들(RI2, RI3, ... RIX)에 기초하여 함께 그룹화될 수 있다. 이어서, 그룹화된 시퀀싱 리드들은 분해된 클러스터 이미지들(RI2, RI3, ... RIX)에 기초하여 희석 샘플들 각각에 연결될 수 있다. 그룹화되고 연결된 시퀀싱 리드들이 동일한 더 긴 핵산 샘플(30)로부터 유래된 것이라는 추론이 이루어질 수 있다. 이와 같이, 방법의 일부 예는 복수의 라이브러리 단편들 각각에 대한 각각의 주형 가닥을 포함하는 플로우 셀(26) 상에서 시퀀싱 작업을 수행하는 단계; 및 분해된 클러스터링 이미지들(RI, RI2, RI3, ... RIx)에 기초하여 시퀀싱 리드들을 다양한 그룹으로 함께 그룹화하는 단계를 포함한다.
본 발명을 추가로 예시하기 위해, 본 명세서에 실시예가 제공된다. 이러한 실시예는 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니됨을 이해하여야 한다.
실시예
실시예 1
바코드 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 어댑터(18))를 바이오틴 링커를 통해 M280 스트렙타비딘 비드(Thermofisher)에 부착시켜, 비드풀(beadpool)을 형성하였다. 유니버셜 트랜스포좀을 올리고의 말단에 있는 상보적 서열에 하이브리드화시켜 비드-연결 트랜스포좀(BLT)을 형성하였다. 이어서, BLT를 세척 완충액 중에서 세척하고, 작업 완충액 중에 재현탁시키고, 액세서리 단백질(단일 가닥 결합 단백질(Thermofisher) 및 이중 가닥 결합 단백질(Illumina)을 첨가하였다.
고분자량 NA12878 DNA(Qiagen MAGATTRACT® HMW DNA 추출 프로토콜을 사용하여 배양된 세포로부터 추출됨)를 BLT 믹스에 첨가하고, 튜브를 부드럽게 뒤집어서 혼합하였다. 이어서, 튜브를 약 15 분 동안 실온에서 인큐베이션하여 DNA가 비드 주위를 감싸게 하였다. 이어서, 태그멘테이션 완충액(염화마그네슘 및 트리스 아세테이트를 함유함)을 각각의 튜브에 첨가하고, 샘플을 약 55℃에서 약 10 분 동안 인큐베이션하였다. 이 단계 동안, 트랜스포좀은 DNA를 태그멘테이션하였고, 태그된 DNA는 BLT에 부착되었다. 태그멘테이션 반응 후에, 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 첨가하고, 샘플을 실온에서 약 5 분 동안 인큐베이션하여 트랜스포사제를 변성시켰다. 이어서, 튜브를 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하였다. 비드를 세척 완충액으로 세척하였다. 최종 세척 후에, 비드를 리가제 믹스(T7 리가제 및 그의 관련 완충액인 NEB의 T7 리가제 완충액을 함유함)에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 혼합하고, 실온에서 약 45 분 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 동안, 전이 가닥(트랜스포좀이 초기에 하이브리드화됨) 내의 갭을 라이게이션하여, 태그된 DNA를 비드에 물리적으로 부착시켰다. 이어서, 샘플을 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하고, 비드를 다시 세척 완충액 중에서 세척하였다.
이어서, 태그된 비드를 비-전이 가닥의 제거 및 샘플 인덱스(예를 들어, 어댑터(22))의 도입을 위해 2개의 그룹으로 나누었다. 하나의 그룹(comp. 그룹)을 비교용 워크플로우에 노출시켰고, 여기서 비-전이 가닥을 제거하기 위해 비-전이 가닥을 제거하기 위해 열이 사용되었다. 다른 그룹(ex. 그룹)을 예시용 워크플로우에 노출시켰고, 여기서 비-전이 가닥을 제거하기 위해 엑소뉴클레아제가 사용되었다.
comp. 그룹을 세척 완충액 중에 재현탁시키고, 약 5 분 동안 약 80℃까지 가열하여 비-전이 가닥을 변성시켰다. 이어서, comp. 그룹을 함유하는 튜브를 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하고, 비드를 세척하였다. 이어서, 세척 완충액 중에 희석된 샘플 인덱스를 comp. 그룹의 비드에 첨가하고, 이러한 혼합물을 약 80℃에서 약 1 분 동안 인큐베이션한 후에, 서서히 온도를 하강시켰다.
ex. 그룹을 T7 엑소뉴클레아제 믹스(T7 엑소뉴클레아제 및 NEB Buffer 4를 함유함) 중에 현탁시키고, 실온에서 약 10 분 동안 인큐베이션하였다. T7 엑소뉴클레아제의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성은 비-전이 가닥을 분해하였다. 이어서, ex. 그룹을 함유하는 튜브를 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하고, 비드를 세척하였다. 이어서, 세척 완충액 중에 희석된 샘플 인덱스를 ex. 그룹의 비드에 첨가하고, 이러한 혼합물을 약 55℃에서 약 5 분 동안 인큐베이션하여 샘플 인덱스가 어닐링되게 하였다.
comp. 그룹 및 ex. 그룹을 각각 함유하는 튜브를 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하였다. 신장 라이게이션 믹스를 첨가하고, 샘플을 약 37℃에서 약 5 분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 다시 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하고, comp. 그룹 및 ex. 그룹의 비드를 세척 완충액 중에서 세척하였다. 최종 세척 후에, 비드를 세척 완충액 중에 재현탁시켰다.
comp. 그룹의 일부 비드 및 ex. 그룹의 일부 비드를 하위 샘플링하여 PCR 반응에 사용하였다. 각각의 PCR 믹스는, 각각의 비드에 더하여, Illumina PCR 믹스 EPM, 및 P5 및 P7 올리고로 이루어졌다. 각각의 샘플을 PCR을 이용하여 증폭시켰다.
PCR 후에, comp. 그룹 및 ex. 그룹 각각의 PCR 상청액의 하위 샘플을 새로운 튜브로 옮기고, 샘플 정제 비드를 사용하여 0.50x 내지 0.62x 크기 선택(고체상 가역 고정화(solid phase reversible immobilization, SPRI))을 수행하였다. 생성된 라이브러리를 재현탁 완충액 중에서 용리시켰다. 이러한 라이브러리를 개별 HISEQ™ 2500 Rapid 플로우 셀(표준 2x101 사이클 리드 길이를 사용함) 상에서 시퀀싱하였다. Fastq 생성 후에, 샘플을 인간 게놈(hg38)에 정렬시키고, 데이터를 IGV 내로 불러왔다.
도 10은, 라이브러리 제조 프로토콜에서 고온 단계에 의해 부정적으로 영향을 받는 것으로 알려진 인간 게놈의 AT 풍부 영역에 대해, comp. 그룹(열 변성으로 표지됨) 및 ex. 그룹(T7 엑소뉴클레아제로 표지됨) 각각으로부터의 라이브러리를 사용하여 얻어진 커버리지를 도시한다. 비-전이 가닥이 열 변성을 통해 제거된 comp. 그룹 라이브러리 단편들에 대한 결과가 도 10의 상단에 도시되어 있고, 엑소뉴클레아제 분해를 통해 비-전이 가닥이 제거된 ex. 그룹 라이브러리 단편들에 대한 결과가 도 10의 하단에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, ex. 그룹 라이브러리 단편들에 대한 AT 풍부 영역에 완전한 커버리지가 존재하는 한편, comp. 그룹 라이브러리 단편들에 대한 동일한 영역에는 단지 부분적 커버리지가 존재하였다. 이러한 결과는 본 명세서에 개시된 효소 분해 방법의 사용이 라이브러리 커버리지를 증가시키고, 열 변성과 비교할 때 게놈의 AT 풍부 영역에 걸친 시퀀싱을 개선시킴을 나타낸다.
실시예 2
도 2a 내지 도 2c의 방법(다단계 라이게이션 및 분해) 및 도 3의 방법(원 포트 라이게이션 및 분해)에서 기술한 바와 같이 복합체를 제조하였다.
BLT 생성, DNA 결합, 태그멘테이션, 및 SDS로의 노출을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 트랜스포사제의 제거 및 그와 관련된 세척 후에, 태그된 비드들을 이어서 다단계 라이게이션 및 분해를 통한(ex. 그룹 2로 지칭됨) 또는 원 포트 라이게이션 및 분해를 통한(ex. 그룹 3으로 지칭됨) 비-전이 가닥의 제거를 위해 2개의 그룹으로 나누었다.
ex. 그룹 2를 E. Coli DNA 리가제 및 그의 관련 완충액(둘 모두 NEB의 제품임)을 포함하는 E. Coli DNA 리가제 믹스 중에 재현탁시켰다. 이어서, ex. 그룹 2 샘플들을 혼합하고, 약 16℃에서 약 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, ex. 그룹 2 샘플을 함유하는 튜브를 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하고, ex. 그룹 2 비드를 세척 완충액 중에서 세척하였다. 세척 후에, ex. 그룹 2 비드를 T7 엑소뉴클레아제 및 NEB Buffer 4를 함유하는 믹스 중에 재현탁시키고, 약 25℃에서 약 10 분 동안 인큐베이션하였다.
ex. 그룹 3을 E. Coli DNA 리가제, T7 엑소뉴클레아제, NAD+, 및 CUTSMART™ 완충액(NEB의 제품)을 포함하는 조합된 리가제 및 엑소뉴클레아제 믹스 중에 약 25℃에서 약 15 분 동안 재현탁시켰다.
이어서, ex. 그룹 2 및 ex. 그룹 3을 함유하는 튜브를 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하고, 각각의 비드를 세척하였다. 이어서, 세척 완충액 중에 희석된 샘플 인덱스를 각각의 ex. 그룹의 비드에 첨가하고, 이러한 혼합물을 약 55℃에서 약 5 분 동안 인큐베이션하여 샘플 인덱스가 어닐링되게 하였다.
ex. 그룹 2 및 ex. 그룹 3을 각각 함유하는 튜브를 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하였다. 신장 라이게이션 믹스를 첨가하고, 샘플을 약 37℃에서 약 5 분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 다시 자석 위에 놓고, 상청액을 제거하고, comp. 그룹 및 ex. 그룹의 비드를 세척 완충액 중에서 세척하였다. 최종 세척 후에, 비드를 세척 완충액 중에 재현탁시켰다.
ex. 그룹 2의 일부 비드 및 ex. 그룹 3의 일부 비드를 하위 샘플링하여 PCR 반응에 사용하였다. 각각의 PCR 믹스는, 각각의 비드에 더하여, Illumina PCR 믹스 EPM, 및 P5 및 P7 올리고로 이루어졌다. 각각의 샘플을 PCR을 이용하여 증폭시켰다.
PCR 후에, ex. 그룹 2 및 ex. 그룹 3 각각의 PCR 상청액의 하위 샘플을 새로운 튜브로 옮겼다. 샘플 정제 비드를 첨가하고, 2.5x SPRI를 수행하였으며, 생성된 라이브러리를 재현탁화 완충액 중에서 용리시켰다. 이어서, 정화된(cleaned-up) 라이브러리를 Bioanalyzer 2100 High Sensitivity 칩 상에서 동작(running)시켜, 도 11의 트레이스(trace)를 얻었다. 결과는, 라이브러리의 크기 프로파일 및 수율이 다단계 라이게이션 및 분해 그리고 원 포트 라이게이션 및 분해에 필적하였음을 보여준다. 이러한 결과는 조합된 시약 포뮬레이션이 라이게이션에 악영향을 주지 않았고 단편 또는 전이 가닥의 분해를 야기하지 않았음을 나타낸다.
실시예 1 및 실시예 2에 기재된 라이브러리 제조 방법을 이용하여 얻은 예시적인 비드 결합된 라이브러리 단편들(복합체들)을 하위 샘플들로 나누고 희석시켜 본 명세서에 기재된 바와 같은 복수의 희석 샘플을 형성할 수 있다. 이어서, (클러스터링, 염색, 및 이미징을 포함하는) 도 6a 내지 도 6d를 참조하여 기술된 방법을 희석 샘플들 각각에 대해 수행하여 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성할 수 있다. 모든 희석 샘플이 증폭되고 이미징된 경우, 플로우 셀이 시퀀싱 작업을 위해 준비된 것이다. 본 명세서에 개시된 라이브러리 제조 기법 및 시간-기반 이미징 기법은 긴 DNA 단편을 효율적으로 및 신뢰성 있게 재구성하기 위해 함께 사용될 수 있다.
추가의 유의 사항
또한, 본 명세서에 제공된 범위는 언급된 범위 및 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위(마치 명시적으로 언급되어 있기라도 한 것과 같음)를 포함함을 이해하여야 한다. 예를 들어, 약 2 mm 내지 약 300 mm로 표시된 범위는 약 2 mm 내지 약 300 mm의 명시적으로 언급된 한계뿐만 아니라, 약 15 mm, 22.5 mm, 245 mm 등과 같은 개별 값, 및 약 20 mm 내지 약 225 mm 등과 같은 하위 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
이하 더 상세히 논의되는 전술한 개념들 및 추가의 개념들의 모든 조합이 (그러한 개념들이 상호 불일치하지 않는다면) 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려됨을 이해하여야 한다. 특히, 본 명세서의 말미에 보이는 청구된 발명 요지의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려된다. 참고로 포함된 임의의 개시 내용에서 또한 볼 수 있는 본 명세서에서 명시적으로 사용된 용어는 본 명세서에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미가 부여될 수 있음을 또한 이해하여야 한다.
몇몇 실시예가 상세히 설명되었지만, 개시된 실시예는 변경될 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 전술한 설명은 비제한적인 것으로 간주되어야 한다.

Claims (27)

  1. 게놈 샘플로부터 복수의 인접성 보존(contiguity preserved) 라이브러리 단편에 대한 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 일련의 이미지들 중 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지는 하기 단계들에 의해 순차적으로 생성되는, 방법:
    상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 포함하는 각각의 샘플을 플로우 셀(flow cell)로 도입하는 단계로서, 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부가 고체 지지체에 부착되거나 서로 부착되는, 단계;
    상기 고체 지지체로부터 또는 서로로부터 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부의 방출을 개시하는 단계;
    복수의 각각의 주형 가닥을 생성하기 위해 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 증폭시키는 단계;
    상기 각각의 주형 가닥을 염색하는 단계; 및
    상기 각각의 주형 가닥을 이미징하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 일련의 이미지들 중 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지에, 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 포함하는 상기 각각의 샘플의 도입에 관한 시간 기록(temporal record)을 할당하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 시간 기록은 타임 스탬프(time stamp) 또는 순서에서의 단계 번호인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이미지 차감(subtraction)을 이용하여 상기 각각의 샘플들 각각에 대한 분해된 클러스터링 이미지를 생성하는 단계로서, 각각의 분해된 클러스터링 이미지는 상기 샘플들 중 상이한 하나의 샘플과 관련된 상기 각각의 주형 가닥의 공간적 위치 및 배향을 기록하는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분해된 클러스터링 이미지를 저장하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 복수의 라이브러리 단편들 각각에 대한 상기 각각의 주형 가닥을 포함하는 상기 플로우 셀 상에서 시퀀싱 작업을 수행하는 단계; 및
    상기 분해된 클러스터링 이미지들에 기초하여 시퀀싱 리드(read)들을 함께 다양한 그룹으로 그룹화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법
  7. 제6항에 있어서, 상기 분해된 클러스터링 이미지들에 기초하여 상기 다양한 그룹을 상기 샘플들 중 상이한 하나의 샘플 각각에 연결하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들을 생성하기 전에, 상기 방법은,
    액체 캐리어(carrier)를 상기 복수의 인접성 보존 라이브러리 단편에 첨가하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
    상기 혼합물을 상기 액체 캐리어로 희석하여 상기 플로우 셀로 도입하려는 미리 결정된 수의 희석 샘플을 생성하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 각각의 샘플의 도입은 상기 희석 샘플들 중 하나를 상기 플로우 셀로 유체적으로 지향시키는 것을 수반하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 복수의 인접성 보존 라이브러리 단편을 포함하는 혼합물은 i) 제한 희석으로서의 상기 플로우 셀의 체적 및 ii) 상기 미리 결정된 수의 희석 샘플에 기초하여 미리 결정된 부피로 희석되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 인접성 보존 라이브러리 단편은 상기 고체 지지체에 부착되고;
    상기 방출은 가열을 수반하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 각각은 상기 플로우 셀의 표면 상의 제1 프라이머 서열에 하이브리드화되는 제1 단부에 있는 제1 서열 부분을 포함하고;
    증폭 전에, 상기 방법은 상기 제1 단부에 대향하는 제2 단부에 있는 상기 하이브리드화된 인접성 보존 라이브러리 단편들 각각에 제2 서열 부분을 부착시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제2 서열 부분은 상기 플로우 셀의 표면 상의 제2 프라이머 서열과 동일한, 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 인접성 보존 라이브러리 단편은 상기 고체 지지체에 부착되고;
    상기 고체 지지체는 그에 부착된 복수의 어댑터를 갖고;
    상기 방법은 하기 단계들에 의해 상기 고체 지지체에 부착된 상기 인접성 보존 라이브러리 단편을 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    상기 고체 지지체 및 복수의 L-어댑터의 존재 하에 상기 게놈 샘플을 태그멘테이션(tagmentation)하는 단계로서, 각각의 L-어댑터는 전이(transferred) 가닥 및 비-전이(non-transferred) 가닥을 포함함으로써 복수의 샘플 단편을 생성하며, 그에 따라 각각의 전이 가닥은 각각의 샘플 단편의 5'-말단에 통합되고, 각각의 비-전이 가닥은 각각의 어댑터의 일부에 하이브리드화되는, 단계;
    상기 각각의 전이 가닥을 상기 복수의 어댑터들 중 각각의 어댑터에 라이게이션하는 단계;
    5'-3' 엑소뉴클레아제를 사용하여 상기 비-전이 가닥을 분해하는 단계; 및
    부분 Y-어댑터를 상기 전이 가닥들 각각에 부착시키는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 라이게이션 및 분해가 단일 원 포트(one pot) 프로토콜로 수행되는, 방법.
  14. 게놈 샘플의 복수의 인접성 보존 라이브러리 단편을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계로서, 상기 복수의 인접성 보존 라이브러리 단편은 고체 지지체에 부착되거나 서로 부착되어 있는, 단계;
    상기 혼합물을 희석하여 플로우 셀로 도입하려는 미리 결정된 수의 희석 샘플을 생성하는 단계; 및
    하기 단계들에 의해 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 적어도 하나에 대한 시간-기반 클러스터링 이미지를 생성하는 단계를 포함하는, 방법:
    상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 포함하는 상기 희석 샘플들 중 제1 희석 샘플을 상기 플로우 셀로 도입하는 단계;
    상기 고체 지지체로부터 또는 서로로부터 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부의 방출을 개시하는 단계;
    복수의 주형 가닥을 생성하기 위해 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 증폭시키는 단계;
    상기 복수의 주형 가닥을 염색하는 단계; 및
    상기 복수의 주형 가닥을 이미징하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 혼합물은, i) 제한 희석으로서의 상기 플로우 셀의 체적 및 ii) 상기 플로우 셀로 도입될 상기 미리 결정된 수의 희석 샘플에 기초하여 미리 결정된 부피로 희석되는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    하기 단계들에 의해 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부 다른 단편에 대한 제2의 시간-기반 클러스터링 이미지를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부 다른 단편을 포함하는 상기 희석 샘플들 중 제2 희석 샘플을 상기 플로우 셀로 도입하는 단계;
    상기 고체 지지체로부터 또는 서로로부터 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부 다른 단편의 방출을 개시하는 단계;
    제2의 복수의 주형 가닥을 생성하기 위해 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부 다른 단편을 증폭시키는 단계;
    상기 제2 복수의 주형 가닥을 염색하는 단계; 및
    상기 제2 복수의 주형 가닥을 이미징하는 단계.
  17. 제16항에 있어서, 상기 미리 결정된 수의 희석 샘플들 서로에 대해 상기 도입하는 단계, 상기 방출을 개시하는 단계, 상기 증폭시키는 단계, 상기 염색하는 단계, 및 상기 이미징하는 단계를 반복함으로써 미리 결정된 수의 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들에 대한 미리 결정된 수의 시간-기반 클러스터링 이미지를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 미리 결정된 수의 시간-기반 클러스터링 이미지들 각각에, 상기 각각의 희석 샘플의 도입에 관한 시간 기록을 할당하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 시간 기록은 타임 스탬프 또는 순서에서의 단계 번호인, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 이미지 차감을 이용하여 상기 플로우 셀로 도입되는 상기 희석 샘플들 각각에 대한 분해된 클러스터 이미지를 생성하는 단계로서, 각각의 분해된 클러스터 이미지는 상기 희석 샘플들 중 상이한 하나의 희석 샘플과 관련된 상기 복수의 주형 가닥의 공간적 위치 및 배향을 기록하는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 인접성 보존 라이브러리 단편은 상기 고체 지지체에 부착되고;
    상기 고체 지지체는 그에 부착된 복수의 어댑터를 갖고;
    상기 방법은 하기 단계들에 의해 상기 고체 지지체에 부착된 상기 인접성 보존 라이브러리 단편을 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    상기 고체 지지체 및 복수의 L-어댑터의 존재 하에 상기 게놈 샘플을 태그멘테이션하는 단계로서, 각각의 L-어댑터는 전이 가닥 및 비-전이 가닥을 포함함으로써 복수의 샘플 단편을 생성하며, 그에 따라 각각의 전이 가닥은 각각의 샘플 단편의 5'-말단에 통합되고, 각각의 비-전이 가닥은 각각의 어댑터의 일부에 하이브리드화되는, 단계;
    상기 각각의 전이 가닥을 상기 복수의 어댑터들 중 각각의 어댑터에 라이게이션하는 단계;
    5'-3' 엑소뉴클레아제를 사용하여 상기 비-전이 가닥을 분해하는 단계; 및
    부분 Y-어댑터를 상기 전이 가닥들 각각에 부착시키는 단계.
  22. 제21항에 있어서, 라이게이션 및 분해가 단일 원 포트 프로토콜로 수행되는, 방법.
  23. 플로우 셀 리셉터클;
    상기 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 플로우 셀로 희석 샘플 및 염료를 각각 전달하기 위한 전달 플루이딕스(fluidics)를 포함하는 플루이딕 제어 시스템;
    상기 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 상기 플로우 셀을 조명하도록 위치한 조명 시스템;
    상기 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 상기 플로우 셀의 이미지를 캡처하도록 위치한 검출 시스템; 및
    상기 플루이딕 제어 시스템, 상기 조명 시스템, 및 상기 검출 시스템과 작동적으로 소통하는 컨트롤러를 포함하는, 시스템으로서, 상기 컨트롤러는,
    상기 전달 플루이딕스가 상기 희석 샘플을 상기 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 상기 플로우 셀로 도입하게 하고;
    상기 희석 샘플에 존재하는 인접성 보존 라이브러리 단편들로부터 상기 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 상기 플로우 셀 내에 주형 가닥이 생성된 후에, 상기 전달 플루이딕스가 상기 염료를 상기 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 상기 플로우 셀로 도입하게 하고;
    상기 조명 시스템이 상기 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 상기 플로우 셀 내의 상기 염색된 주형 가닥을 조명하게 하고;
    상기 검출 시스템이 상기 플로우 셀 리셉터클 내에 위치한 상기 플로우 셀 내의 상기 조명되고 염색된 주형 가닥을 이미징하게 하는, 시스템.
  24. 제23항에 있어서, 상기 플로우 셀 리셉터클은 히터를 포함하는 시퀀서의 일부이며, 상기 컨트롤러는,
    상기 히터가 고체 지지체로부터 또는 서로로부터 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부의 방출을 개시하게 하고;
    상기 히터가 열 사이클을 실행하게 함으로써 상기 인접성 보존 라이브러리 단편들 중 일부를 증폭시켜 상기 주형 가닥을 생성하는, 시스템.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 희석 샘플을 포함하는 제1 카트리지; 및
    상기 염료를 포함하는 제2 카트리지를 추가로 포함하는, 시스템.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이미지를 저장하기 위한 전자 저장 구성요소를 추가로 포함하는, 시스템.
  27. 제23항에 있어서, 상기 이미지는 게놈 샘플로부터의 복수의 인접성 보존 라이브러리 단편에 대한 일련의 시간-기반 클러스터링 이미지들 중 시간-기반 클러스터링 이미지이고, 상기 일련의 이미지들 중 각각의 시간-기반 클러스터링 이미지는 순차적으로 생성되는, 시스템.
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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4105644A3 (en) 2006-03-31 2022-12-28 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
US9670530B2 (en) * 2014-01-30 2017-06-06 Illumina, Inc. Haplotype resolved genome sequencing
SG10201903408VA (en) * 2014-10-17 2019-05-30 Illumina Cambridge Ltd Contiguity preserving transposition
PT3207134T (pt) * 2014-10-17 2019-09-17 Illumina Cambridge Ltd Transposição que preserva a contiguidade
WO2016183478A1 (en) * 2015-05-14 2016-11-17 Life Technologies Corporation Barcode sequences, and related systems and methods
GB201704754D0 (en) * 2017-01-05 2017-05-10 Illumina Inc Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
US11378544B2 (en) * 2018-01-08 2022-07-05 Illumina, Inc. High-throughput sequencing with semiconductor-based detection

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US11714848B2 (en) 2023-08-01
CA3131580A1 (en) 2021-06-10
AU2020398353A1 (en) 2021-10-14
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