KR20220113950A - 아밀로이드 침착물을 표적화하기 위한 변형된 면역글로불린 - Google Patents

아밀로이드 침착물을 표적화하기 위한 변형된 면역글로불린 Download PDF

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Abstract

항체에 결합된 아밀로이드 반응성 펩티드를 포함하는 변형된 면역글로불린뿐만 아니라 인간 아밀로이드 피브릴 및 항체-펩티드 융합 단백질에 결합하는 인간화 항체가 본원에 제공된다. 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 투여함으로써 아밀로이드계 질환을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다.

Description

아밀로이드 침착물을 표적화하기 위한 변형된 면역글로불린
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 11월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 62/936,002 및 2020년 9월 4일 출원된 미국 가출원 번호 63/074,912에 대하여 우선권을 주장하며, 그 내용은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일에 대한 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일에 대한 다음 제출 내용: 서열 목록의 컴퓨터로 읽을 수 있는 형태(CRF)(파일 이름: 165992000140SEQLIST.TXT, 기록된 날짜: 2020년 11월 12일, 크기: 52 KB)은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 아밀로이드 침착물(amyloid deposits)을 표적화하는 변형된 면역글로불린, 인간 아밀로이드 피브릴(fibril)에 결합하는 인간화 항체, 및 항체-펩티드 융합 단백질 그리고 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
배경
아밀로이드증은 중요한 기관 및 조직에서 단백질성 피브릴 및 헤파란 술페이트 프로테오글리칸의 응집 및 침착을 특징으로 하는 치명적인 단백질-폴딩 장애이다(Merlini, G. et al. (2003) N. Engl. J. Med. 349, 583-596; Merlini, G. et al. (2004) J. Intern. Med. 255, 159-178; De Lorenzi, E. et al. (2004) Curr. Med. Chem. 11, 1065-1084; Merlini, G. (2004) Neth. J. Med. 62, 104-105). 아밀로이드의 끊임없는 축적은 언제나 기관 기능장애 및 심한 이환이나 사망을 초래한다. 침착물은 알츠하이머병, 헌팅톤병 또는 프리온 질환 환자에서와 같이 중추성일 수 있거나, 경쇄(AL) 아밀로이드증 및 2형 당뇨병 환자에서 보이는 것과 같은 말초성일 수 있다. 국소적 또는 전신적으로의 추가 하위-그룹화는 전구체 단백질이 국소적으로(침착 부위에서) 생성되는지 또는 혈류에서 순환하고 원거리 해부학적 위치에서 침착되는지를 각각 나타낸다(Westermark, P. et al. (2007) Amyloid. 14, 179-183). 아밀로이드는 임의의 기관 또는 조직에 영향을 미칠 수 있지만, 신장, 췌장, 간, 비장, 신경 조직 및 심장은 가족성 또는 산발성 형태의 말초 아밀로이드 질환 환자에서 주요 침착 부위를 구성한다. 알츠하이머병은 현재 400만 명 이상의 미국인에게 발병하고 있으며 이 수치는 2050년까지 1,600만 명 초과로 증가할 것으로 추정된다. 이는 아밀로이드증의 가장 일반적인 형태이며 사회경제적으로 가장 큰 영향을 미친다. 대조적으로, 말초(또는 전신) 아밀로이드증은 고아 장애이지만 미국에서만 매년 5,000명 초과의 새로운 환자를 차지한다.
이들 중, 주요 말초 아밀로이드증은 면역글로불린 경쇄 단백질로 이루어진 피브릴의 침착을 초래하는 산발적인 모노클로날 형질 세포 이상인 경쇄-연관(AL) 아밀로이드증이다. AL은 모든 말초 아밀로이드 사례의 대략 2/3를 차지하고 미국에서 연간 100,000명당 약 1.4명의 계산된 발생률을 가지며, 이는 급성 림프구 및 만성 골수 백혈병의 발생률에 필적한다(Group, U. S. C. S. W. (2007) United States Cancer Statistics: 1999-2003 Incidence and Mortality Web-Based Report, U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease Control and Prevention National Cancer Institute, Atlanta). AL은 관련 형질 세포 이상 다발 골수종의 5분의 1만큼 일반적이지만, 부분적으로는 기관 파괴의 급속한 진행성 특성, 효과적인 항-아밀로이드 치료제의 부재 및 기관 부전이 발생하기 전에 질환을 효과적으로 진단할 수 없음으로 인해 13.2개월의 중앙값 생존만을 가지며 확실히 더 파괴적이다. 전체 AL 환자의 5% 미만이 진단 시점으로부터 10년 초과 생존한다(Comenzo, R. L. et al. (2002) Blood 99, 4276-4282). 더욱이, 심장 AL 아밀로이드증 환자에서 중앙값 생존은 5개월 미만이다.
ATTR은 전신 아밀로이드증의 한 형태이다. ATTR 아밀로이드증 환자의 25%가 진단 24개월 이내에 사망한다(Gertz and Dispenzieri JAMA 324(1)79-89 (2002)). 현재 치료법은 기관 손상을 예방하지 못한다. ATTR 아밀로이드증은 트랜스테리틴(TTR) 피브릴에 의해 유발된다. 트랜스티레틴은 간에서 만들어지는 단백질로 혈중 갑상샘 호르몬과 비타민 A를 운반하는 데 도움을 준다. 일반적으로 TTR은 4개의 단일쇄 단량체로 이루어진 사량체이다. 선천성 ATTR 아밀로이드증에서, TTR 유전자 돌연변이는 단백질을 불안정하게 하고 단량체로의 사량체 해리를 야기하고, 이는 아밀로이드 피브릴로 응집되는 것으로 생각된다. 야생형 ATTR 아밀로이드증에서, 정상 TTR 단백질은 불안정해지고, 미스폴딩되며, 아밀로이드 피브릴을 형성한다.
이러한 아밀로이드 피브릴은 이후 예를 들어, 손목 터널이라고 불리는 좁은 경로의 손목과 같은 신체 전체의 여러 기관에 축적된다. 이는 손과 팔이 저리고 얼얼해지는 손목 터널 증후군을 초래할 수 있다. 척추관 협소화(척추관 협착증)를 초래할 수 있는, 척추관. 심부전 및/또는 심방 세동이라고 불리는 불규칙한 심장 리듬을 초래할 수 있는, 심장.
미국에서 말초 아밀로이드증의 다른 우세한 형태는 염증 연관(AA) 아밀로이드증이며, 이는 관절염, 결핵 및 가족성 지중해열과 같은 만성 염증성 질환과 연관된다. AA의 발생률은 유럽의 특정 지역에서 가장 크며, 빈도는 인종 그룹마다 다르다(Buck, F. S. et al. (1989) Mod. Pathol. 2, 372-377). 가족성 지중해 열이 유행하고 치료받지 않는 지역에서는 AA 발생률이 100%일 수 있다. 덴마크에서 수행된 부검 연구에 기초하여, 유럽에서의 발생률은 0.86%로 추정되며(Lofberg, H. et al. (1987) Acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica 95, 297-302); 그러나 류마티스 관절염이나 건선 관절염 환자에서 AA의 발생률은 26%까지 높을 수 있다. 이러한 높은 유병률은 질환을 조기에 검출하기 위한 스크리닝 프로그램을 보장할 수 있다. 아밀로이드의 침착은 아밀로이드 피브릴의 전구체인 혈청 아밀로이드 단백질 A(sAA)의 혈장 농도의 지속적인 증가와 연관된다(Rocken, C. et al. (2002) Virchows Arch. 440, 111-122). AA는 침착되는 전구체 단백질의 유형에서 AL과 상이하지만 둘 다 피브릴 형성 및 침착과 연관된 공통적인 기계적 특징을 공유한다(Rocken, C. et al. (2006) J. Pathol. 210, 478-487; Rocken, C. et al. (2001) Am. J. Pathol. 158, 1029-1038).
아밀로이드의 병인이 잘 확립되어 있는 질환 외에, 아밀로이드의 구조적 및 고착적 특성을 갖는 피브릴 침착물은 질환 상태와의 관련성이 아직 확립되지 않았지만 다른 증후군에서 확인되었다. 예를 들어 2형 당뇨병에서, 섬 아밀로이드 전구체 단백질(IAPP)은 랑게르한스 섬(Islets of Langerhans)에서 아밀로이드로서 침착된다(Jaikaran, E. T. et al. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1537, 179-203). IAPP의 응집은 췌장 세포에 독성을 갖는 올리고머 구조를 초래한다(Lin, C. Y. et al. (2007) Diabetes 56, 1324-1332). 따라서, 1형 당뇨병 환자에서 IAPP 아밀로이드의 형성은 β 세포 파괴에 기여하고 인슐린 의존성으로의 전이를 촉진하는 것으로 제시된다(Jaikaran, E. T. et al. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1537, 179-203). 다른 예에서, 아포지단백질 A-I로 이루어진 아밀로이드 피브릴을 함유하는 플라크는 죽상경화 경동맥을 가진 환자의 절반 이상에서 확인되었다(Westermark, P. et al. (1995) Am. J. Pathol. 147, 1186-1192; Mucchiano, G. I. et al. (2001) J. Pathol. 193, 270-275). 이러한 피브릴의 침착은 더 나이 든 환자에서 더 흔했지만 apoA-I는 의심할 여지 없이 플라크 발달 초기에 존재한다(Vollmer, E. et al. (1991) Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol. 419, 79-88). 최종 예로서, Apo-A-I 아밀로이드는 또한 최근 무릎 대체 수술을 받은 환자로부터 얻은 무릎 관절 반월판에서 확인되었고, 관절의 물리적 악화에 기여할 수 있다(Solomon, A. et al. (2006) Arthritis Rheum. 54, 3545-3550).
총 29개 초과 단백질이 아밀로이드 침착물에서 피브릴의 구성성분으로서 화학적으로 또는 혈청학적으로 확인되었다. 질환을 구별하고, 치료를 결정하며, 예후를 확립하는 것은 이러한 단백질의 특성이다. 아밀로이드 피브릴이 임상적으로 이종인 질환 그룹과 연관되고 구조적으로 독특하고 기능적으로 다양한 전구체 단백질로부터 형성될 수 있지만, 침착물 자체는 피브릴 구조, 피브릴 에피토프 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)을 포함하는 유사한 액세서리 분자의 발생을 포함하는 많은 현저하게 유사한 특징을 공유한다. 아밀로이드는 피브릴 이외에, 글리코사미노글리칸(GAG) 및 특히 펄레칸 HSPG를 포함하는 이종 복합체이다(Ancsin, J. B. (2003) Amyloid 10, 67-79; Ailles, L. et al. (1993) Lab. Invest. 69, 443-448; Kisilevsky, R. (1994) Mol. Neurobiol. 9, 23-24; Kisilevsky, R. (1990) Lab. Invest. 63, 589-591; Snow, A. D. et al. (1987) Lab. Invest. 56, 120-123; Li, J. P. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6473-6477). 아밀로이드 및 아밀로이드 관련 장애의 부분 리스트가 도 1에 제공된다.
현재까지, 기관 기능의 회복을 촉진하고 개선된 예후를 초래할 수 있는 아밀로이드 침착물을 제거하기 위한 가장 효과적인 치료 개입에는 면역치료법의 수단으로서 아밀로이드 반응성 항체의 사용이 관여된다. AL 아밀로이드증의 치료를 위한 모노클로날 항체 11-1F4, AL 아밀로이드증 환자를 위한 NEOD001, 아밀로이드증을 위한 GSK2398852(항-SAP 모노클로날 항체), 알츠하이머병을 위한 솔라네주맙(Solanezumab), 알츠하이머병을 위한 정맥내 IgG(IVIG), 및 알츠하이머병을 위한 바피뉴주맙(Bapineuzumab)을 포함하는, 아밀로이드-관련 질환에 대한 몇몇 면역치료법(항체)이 개발되었다. 이들 접근 각각은 제한점이 있거나 후기 임상 시험(2/3상)에서 일차 결과를 충족하지 못했다.
인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 항체 또는 이의 작용부에 연결된 아밀로이드 반응성 펩티드를 포함하는 변형된 면역글로불린 및 항체-펩티드 융합 단백질이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 변형된 면역글로불린 및 항체-펩티드 융합 단백질은 예기치 않게 인간 아밀로이드 피브릴에 대한 항체 및 아밀로이드 반응성 펩티드의 결합에 의해 인간 아밀로이드 피브릴에 대해 더 높은 친화성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 아밀로이드 침착물을 제거하기 위한 항체의 증강된 활성을 제공한다. 특히, 항체 Fc는 예를 들어, 옵소닌화에 의해 식균작용을 하고 아밀로이드 피브릴 및 침착물을 제거할 수 있는 대식구를 모집하고, 아밀로이드 반응성 펩티드는 다양한 아밀로이드 피브릴 및 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸에 결합할 수 있다. 놀랍게도, N-말단 아밀로이드-반응성 펩티드에 접합된 인간화 항-아밀로이드 항체는 아밀로이드 섬유에 결합하는 키메라 항체보다 상당히 더 우수한 옵소닌화를 제공한다. 또한, VH9/VL4와 같은 특정 인간화 항체는 뮤린 또는 키메라 항체보다 더 높은 친화성으로 아밀로이드 피브릴에 결합한다.
아밀로이드증을 검출 및 치료하거나 본원에 제공된 변형된 면역글로불린을 사용하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
또한 변형된 면역글로불린을 인코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
한 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 반응성 펩티드; 및 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편으로서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 변형된 면역글로불린을 제공하며, 펩티드 및 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편은 Ig 경쇄의 N-말단 단부 및/또는 Ig 중쇄의 N- 및/또는 C-말단 단부에서 함께 결합된다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드는 서열 번호 1-14에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드-반응성 펩티드 및 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편은 Ig 경쇄의 N-말단 단부에서 함께 결합된다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 아밀로이드-반응성 펩티드와 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편 사이에 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 적어도 2개의 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함하고, 아밀로이드-반응성 펩티드는 동일한 펩티드 또는 상이한 펩티드이다.
일부 실시양태에서, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 CDRL1, 서열 번호 21에 제시된 CDRL2, 및 서열 번호 22에 제시된 CDRL3을 포함하며, VH는 서열 번호 17에 제시된 CDRH1, 서열 번호 18에 제시된 CDRH2, 서열 번호 19에 제시된 CDRH3을 포함한다.
일부 실시양태에서, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편은 키메라 항체 또는 이의 기능적 단편이다.
일부 실시양태에서, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편은 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, a) VL은 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; b) VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 실시양태에서, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Ig 항체는 인간 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 적어도 2개의 아밀로이드 반응성 펩티드를 포함하고, 펩티드는 동일한 펩티드 또는 상이한 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 rVλ6Wil, Aβ, Aβ(1-40), IAAP, ALκ4, Alλ1 또는 ATTR 피브릴에 결합한다.
다른 양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드에 융합된 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질이 본원에 제공되며, 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다.
일부 실시양태에서, a) VL은 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; b) VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; c) VL은 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 73에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하고, VH는 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 위치 36에 Tyr; 위치 37에 Leu; 위치 46에 Leu; 위치 85에 Leu; 및 위치 87에 Phe로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 위치 37에 Val; 위치 48에 Leu; 위치 67에 Leu; 위치 68에 Ser; 위치 71에 Lys; 위치 76에 Ser; 위치 78에 Val; 위치 79에 Leu; 위치 80에 Phe; 위치 89에 Thr; 위치 93에 Val; 및 위치 94에 Thr으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, VL은 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu, 및 위치 87에 Phe을 포함하고, VH는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하고, VH는 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 32-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함한다
일부 실시양태에서, VH는 서열 번호 43-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드-반응성 펩티드는 서열 번호 1-14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드는 VL 또는 VH의 N-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드는 스페이서에 의해 VL 또는 VH의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 펩티드 스페이서이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 아미노산 서열 GGGYS를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 rVλ6Wil, Aβ, Aβ(1-40), IAAP, ALκ4, Alλ1 또는 ATTR 피브릴에 결합한다.
다른 양태에서, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다.
다른 양태에서, 변형된 면역글로불린 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산(들)이 본원에 제공된다. 다른 양태에서, 핵산(들)을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 다른 양태에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 단락 [0045]의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체에 유효량의 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드 관련 장애는 아밀로이드증이다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드 관련 장애는 AL, AH, Aβ2M, ATTR, 트랜스티레틴, AA, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALEct2, AFib, ACys, ACal, AMed, AIAPP, APro, AIns, APrP 또는 Aβ 아밀로이드증으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
다른 양태에서, 본 발명은 아밀로이드 침착물을 본원에 제공된 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 제거를 위해 아밀로이드 침착물을 표적화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 제거된다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 옵소닌화된다.
다른 양태에서, 아밀로이드 침착물을 변형된 면역글로불린 항체-펩티드 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 제거를 위해 아밀로이드 침착물을 표적화하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 제거를 위해 아밀로이드 침착물을 표적화하는 단계는 아밀로이드 침착물의 제거를 초래한다.
일부 실시양태에서, 제거는 아밀로이드 침착물의 옵소닌화로부터 기인한다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질 내의 아밀로이드 반응성 펩티드의 반감기는 아밀로이드-반응성 펩티드 단독에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가된다.
다른 양태에서, 제1 발현 벡터 및 제2 발현 벡터를 제공하는 단계로서, 제1 발현 벡터는 Ig 항체 경쇄 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하며; 제2 발현 벡터는 Ig 항체 중쇄 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 제1 발현 벡터 및/또는 상기 제2 발현 벡터는 제1 펩티드를 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하고, 제3 핵산 서열은 상기 제1 핵산 서열 및/또는 상기 제2 핵산 서열에 인접하게 배치되는, 단계; 및 상기 제1 및 제2 발현 벡터를 세포에 삽입하는 단계를 포함하는, 변형된 면역글로불린을 생성하는 방법이 본원에 제공되며, 세포에서 제1 및 제2 발현 벡터의 발현은 제1 펩티드에 결합된 면역글로불린을 초래한다.
일부 실시양태에서, 제1 발현 벡터 및/또는 제2 발현 벡터는 제2 펩티드를 인코딩하는 제4 핵산 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열에 인접하게 배치된다.
일부 실시양태에서, 세포에서 제1 및 제2 발현 벡터의 발현은 제1 펩티드 및 제2 펩티드에 결합된 면역글로불린을 초래한다.
일부 실시양태에서, 스페이서 핵산 서열은 제3 핵산 서열과 제1 핵산 서열 및/또는 제2 제1 핵산 서열 사이에 배치된다.
다른 양태에서, 본 발명은 i) 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 대상체에 투여하는 단계로서, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합물은 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; ii) 검출 가능한 표지와 연관된 신호가 대상체로부터 검출될 수 있는지 여부를 결정하는 단계; 그리고 b) 신호가 검출되면, 대상에게 아밀로이드증 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드계 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 신호가 검출되지 않으면, 방법은 아밀로이드 침착물의 추후 발생에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 신호의 강도를 결정하는 단계 및 신호를 임계값과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 초과의 값에서 대상체가 아밀로이드 침착물을 갖는 것으로 결정된다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드증 치료는 대상체에서 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 투여는 대상체에서 아밀로이드 침착의 제거를 초래한다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 투여하는 단계로서, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합물은 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계, 및 변형된 면역글로불린 또는 항체 펩티드 융합 단백질로부터 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 침착물을 확인하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 아밀로이드가 없거나, 유의성이 알려지지 않은 모노클로날 감마병증(MGUS), 다발 골수종(MM), 또는 하나 이상의 관련된 형질 세포 질환을 앓고 있는 것으로 결정된다.
다른 양태에서, 본 발명은 단락 중 어느 하나의 변형 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합물을 검출 가능하게 표지하는 단계로서, 변형 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 펩티드가 리간드에 결합 친화성을 갖는, 단계; 리간드를 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질과 접촉시키는 단계; 및 검출 가능한 표지로부터 신호를 결정하여 리간드를 검출하는 단계를 포함하는, 리간드를 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린 또는 항체 펩티드 융합 단백질은 검출 가능한 표지에 접합된다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드 반응성 펩티드에 대해 N-말단인 스페이서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드는 항체의 VH의 N 말단에 결합된다.
하나의 양태에서, 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 인간화 항체가 본원에 제공되며, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고, VL은 위치 36에 Tyr; 위치 37에 Leu; 위치 46에 Leu; 위치 85에 Leu; 및 위치 87에 Phe로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고; VH는 위치 37에 Val; 위치 48에 Leu; 위치 67에 Leu; 위치 68에 Ser; 위치 71에 Lys; 위치 76에 Ser; 위치 78에 Val; 위치 79에 Leu; 위치 80에 Phe; 위치 89에 Thr; 위치 93에 Val; 및 위치 94에 Thr으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, VL은 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu, 및 위치 87에 Phe을 포함하고, VH는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하고, VH는 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VH는 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 인간화 항체가 본원에 제공되고, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, a) VL은 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; b) VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; c) VL은 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 실시양태에서, VL은 위치 36에 Tyr; 위치 37에 Leu; 위치 46에 Leu; 위치 85에 Leu; 및 위치 87에 Phe로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, VH는 위치 37에 Val; 위치 48에 Leu; 위치 67에 Leu; 위치 68에 Ser; 위치 71에 Lys; 위치 76에 Ser; 위치 78에 Val; 위치 79에 Leu; 위치 80에 Phe; 위치 89에 Thr; 위치 93에 Val; 및 위치 94에 Thr으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고; 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 항체는 전장 항체, Fab 단편, 또는 scFv이다.
일부 실시양태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형의 영역이다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 검출 가능한 표지에 접합된다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 rVλ6Wil 피브릴, Per125 wtATTR 추출물, KEN hATTR 추출물, SHI ALλ 간 추출물 및/또는 TAL ALκ 간 추출물에 결합한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 rVλ6Wil, Aβ, Aβ(1-40), IAAP, ALκ4, Alλ1 또는 ATTR 피브릴에 결합한다.
다른 양태에서, 인간화 항체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다. 다른 양태에서, 본 발명은 인간화 항체를 인코딩하는 핵산(들)을 제공한다]. 다른 양태에서, 핵산(들)을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 다른 양태에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간화 항체를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 단락 [0088]의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 인간화 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체에 유효량의 인간화 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 관련 장애는 아밀로이드증이다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 관련 장애는 AL, AH, Aβ2M, ATTR, 트랜스티레틴, AA, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALEct2, AFib, ACys, ACal, AMed, AIAPP, APro, AIns, APrP 또는 Aβ 아밀로이드증으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간화 항체를 검출 가능하게 표지하고, 인간화 항체를 대상체에 투여하고, 검출 가능한 표지와 연관된 신호가 대상체로부터 검출될 수 있는지 여부를 결정하여, 대상체가 아밀로이드 침착물을 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및 신호가 검출되면, 대상체에 아밀로이드증 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드계 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 신호가 검출되지 않으면, 방법은 아밀로이드 침착물의 추후 발생에 대해 대상체를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 신호의 강도를 결정하는 단계 및 신호를 임계값과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 초과의 값에서 대상체가 아밀로이드 침착물을 갖는 것으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드증 치료는 인간화 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간화 항체를 검출 가능하게 표지하는 단계, 인간화 항체를 대상체에 투여하는 단계, 및 인간화 항체로부터의 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 침착물을 확인하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 아밀로이드가 없거나, 유의성이 알려지지 않은 모노클로날 감마병증(MGUS), 다발 골수종(MM), 또는 하나 이상의 관련된 형질 세포 질환을 앓고 있는 것으로 결정된다.
도 1은 아밀로이드 및 아밀로이드 관련 장애의 부분 리스트를 나타낸다.
도 2는 Ig-펩티드 융합물의 개략도이다. 패널 A는 N-말단에서 Ig 경쇄에 융합된 펩티드 p5(서열 번호 1)의 개략도를 보여준다. 패널 B는 펩티드 p5(서열 번호 1)에 융합된 2개의 Ig 경쇄를 갖는 Ig 구조를 나타내는 Ig-펩티드 융합물을 도시한다.
도 3은 아밀로이드 침착물을 제거하기 위한 (스케일링하지 않는) Ig-펩티드 융합물에 대한 제안된 작용 모드의 개략도를 도시한다. Ig-펩티드는 아밀로이드 피브릴(또는 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸)과의 펩티드 상호작용을 통해 아밀로이드에 결합하며, 이는 파괴를 위해 아밀로이드를 포식하는(식균작용하는) 대식구를 모집한다.
도 4는 SDS-PAGE 겔 전기영동 후 125I-Igp5의 자가방사선사진을 나타낸다. 비-환원 조건 하에서, 단백질은 단일 Ig로서 실행되었고, 환원될 때, 온전한 Ig 분자와 일치하는 중쇄 및 경쇄-p5를 포함하는 것으로 나타났다.
도 5는 주사 20시간 후 AA 아밀로이드 마우스(AA) 및 건강한 아밀로이드-비함유 마우스(WT)에서 125I-Igp5의 생체분포를 나타낸다.
도 6은 Igp5의 주사 20시간 후, AA 마우스 및 건강한 야생형 대조군에서의 125I-Igp5의 SPECT/CT 이미지를 보여주며, AA 마우스의 아밀로이드-함유 간 및 비장에서의 흡수 및 WT 동물에서의 시약의 긴 혈액 풀 반감기를 보여준다. H, 심장; L, 간; S, 비장. 빨간색/노란색은 125I-Igp5의 존재를 나타낸다.
도 7은 인간 THP1 단핵구/대식구의 존재 하에서 pHrodo 적색-표지 rVλ6Wil 피브릴의 시험관내 식균작용을 나타낸다. 형광 강도의 증가는 대식구의 파고리소좀의 낮은 pH 환경에서 표지된 아밀로이드 기질의 존재를 나타낸다. MOPC 31c는 피브릴과 반응성이 없는 마우스 모노클로날 항체 대조군이다.
도 8은 SDS-PAGE 겔 전기영동 후 125I-Igp5의 자가방사선사진을 나타낸다. Igp5를 조직 배양 상청액으로부터 정제하고, 125I로 방사표지하고 생성물을 대조군으로서 뮤린 11-1F4(IgG1κ)를 사용하여 SDS-PAGE에 의해 특성분석했다. 환원 조건(Red.)과 비환원 조건(NR) 모두에서 단백질을 분석했다.
도 9는 다양한 아밀로이드-관련 기질에 대한 125I-Igp5의 결합을 도시한다. 패널 A는 125I-m11-1F4 및 125I-Igp5의 κ4-펩티드-코팅 비드 또는 rVλ6Wil 피브릴에 대한 결합을 보여준다. 125I-m11-1F4는 κ4-펩티드-코팅 비드에 결합하지만 rVλ6Wil 피브릴에는 결합하지 않는 반면, 125I-Igp5는 양쪽 기질에 모두 결합한다. 패널 B는 125I-Igp5 및 m11-1F4의 다양한 합성 아밀로이드 피브릴 및 아밀로이드 추출물에 대한 결합의 정량을 보여준다. 패널 C는 기질에 대한 125I-Igp5 및 125I-p5 결합 사이의 상관관계를 보여준다. 다양한 합성 아밀로이드 피브릴 및 아밀로이드 추출물에 대한 125I-Igp5의 결합은 m11-1F4에 비해 크게 증강되며, 반응성은 p5 펩티드 단독의 반응성과 상관관계가 있어서, 결합이 펩티드에 의해 유도됨을 나타낸다.
도 10은 다양한 조직의 마이크로자가방사선사진(ARG) 분석 및 콩고 레드 염색을 나타낸다. 패널 A는 마우스에서 간비장 AA 아밀로이드에서의 125I-Igp5의 보유뿐만 아니라 다른 조직에서의 아밀로이드 결합을 보여준다. ARG 및 콩고 레드 염색은 마우스에서 간비장 AA 아밀로이드에서의 125I-Igp5의 특이적 보유뿐만 아니라 다른 조직에서의 아밀로이드 결합을 입증한다. 패널 B는 아밀로이드 비함유 조직의 ARG 분석 결과를 나타낸다. 아밀로이드 비함유 조직과의 특이적 반응성은 건강한(WT) 마우스에서 관찰되지 않았고, 혈액 풀이 125I-Igp5의 유일하게 확인된 공급원이었다.
도 11a는 mIgG-p5의 개략도를 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로, mIgG-p5의 C-말단에서 N-말단으로, Ig 경쇄 서열("IgLC," 220개 아미노산), 스페이서 서열, 펩티드 p5(31개 아미노산), 스페이서 서열, 및 N-말단 분비 리더 서열을 포함하는 영역을 도식화한다. 도 11b는 왼쪽에서 오른쪽으로, Ig 경쇄의 N-말단(아미노산 잔기 DVVMTQTP(서열 번호 82)로 시작됨), p5 펩티드의 C-말단의 스페이서 서열(아미노산 잔기 VTPTV(서열 번호 24)), 펩티드 p5(아미노산 잔기 KAQKAQAKQAKQAQKAQKAQAKQAKQ(서열 번호 1)), 및 N-말단의 스페이서 서열(아미노산 잔기 AQAGQAGQAQGGGYS(서열 번호 23))을 포함하는 mIgG-p5 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 11b에서, 아미노산 서열은 C-말단에서 N-말단으로 도시된다. 도 11c는 Ig 경쇄의 N-말단에 융합된 펩티드 p5의 제안된 구조 모델을 나타낸다. 도 11d는 SDS-PAGE 겔 전기영동 후의 125I-표지 mIgG-p5, 125I-m11-1F4 및 125I-p5의 자가방사선사진이다. 각각의 단백질은 비-환원(NR) 또는 환원(R) 조건 하에서 나타내며, 전장 항체("Ig"), 중쇄("HC"), 경쇄("LC") 및 펩티드 p5의 상대 위치가 표시된다. 도 11e는 125I-mIgG-p5로의 주사 24, 48 또는 72시간 후 야생형, 아밀로이드-비함유 마우스에서 125I-표지 mIgG-p5의 생체분포를 나타낸다. 도 11f는 125I-mIgG-p5로의 주사 24, 48 또는 72시간 후 AA 아밀로이드증을 갖는(주로 간 및 비장에) 마우스에서 125I-표지 mIgG-p5의 생체분포를 나타낸다. 각각 도 11e 및 11f에서, y축은 생체 분포 수준을 조직의 그램 당 주입된 용량의 백분율로 나타내며, 조직 유형은 x축에 표시된다. 도 11g는 주사 24시간 후 AA 아밀로이드증을 갖는 마우스에서 125I-표지 mIg-p5를 나타내는 마이크로자가방사선사진 이미지를 나타낸다. 24시간는 검정색으로 나타낸다; 48시간은 진한 회색으로 나타내며, 72시간은 밝은 회색으로 나타낸다.
도 12는 모 뮤린 항체 m11-1F4의 주석이 달린 VH(상부, 서열 번호 15) 및 VL(하부, 서열 번호 16) 아미노산 서열을 제공한다. CDR은 박스로 나타내고, 정준 프레임워크 영역 잔기는 밑줄로 나타내고, VH-VL 인터페이스 잔기는 볼드체 및 이탤릭체로 나타낸다.
도 13a는 키메라(c) 11-1F4, 및 인간화 변이체, VH10/VL4, VH9/VL4, VH8/VL4, VH7/VL4, 또는 VH6/VL3의 합성 rVλ6Wil 경쇄 아밀로이드-유사 피브릴에 대한 결합을 측정하는 유리포이움-결합 면역흡착 검정(EuLISA)으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 13b는 70% 순수한 VH6/VL3-p5(6-3-p5), 65% 순수한 VH6/VL3-p5R(6-3-p5R), c11-1F4, 또는 VH6/VL3의 rVλ6Wil 피브릴에 대한 결합을 측정하는 EuLISA로부터의 데이터를 나타낸다. 도 13c는 VH9/VL/4-p5R의 rVλ6Wil 피브릴, Per125 wtATTR 추출물, Ken ATTR 추출물, SHI ALλ 간 추출물, 또는 TAL ALκ 간 추출물에 대한 결합을 측정하는 EuLISA로부터의 데이터를 나타낸다. 도 13d는 VH9/VL/4-p5의 rVλ6Wil 피브릴, Per125 wtATTR 추출물, Ken ATTR 추출물, SHI ALλ 간 추출물, 또는 TAL ALκ 간 추출물에 대한 결합을 측정하는 EuLISA로부터의 데이터를 나타낸다. 도 13e는 c11-1F4, m11-1F4, 또는 VH9/VL4의 rVλ6Wil 피브릴에 대한 결합을 측정하는 EuLISA로부터의 데이터를 나타낸다. 도 13f는 VH6/VL3-p5의 Sno ATTR 추출물(진한 회색 원) 또는 Ken ATTR 추출물(밝은 회색 원)에 대한 결합을 측정하고, c11-1F4의 Sno ATTR 추출물(검은색 사각형)에 대한 결합을 측정하는 EuLISA로부터 데이터를 나타낸다. 도 13g는 VH6/VL3-p5R의 Per125 wtATTR 결합(회색 원, 표지 참조), Sno ATTR 추출물(어두운 회색 원), 또는 Ken ATTR 추출물(밝은 회색 원)에 대한 결합, 및 c11-1F4의 Sno ATTR 추출물에 대한 결합(검은색 사각형)을 측정하는 EuLISA로부터의 데이터를 나타낸다. 모노클로날 항체(-로그(M))의 로그-변환 몰 농도를 x축에 나타내고, 결합 수준(유로퓸 펨토몰)을 y축에 나타낸다.
도 14는 풀다운 검정에서 조직으로부터 얻은 rVλ6Wil 아밀로이드-유사 피브릴 및 인간 아밀로이드 추출물에 대한 125I-mIgp5의 결합 결과를 나타낸다. y-축은 결합된 125I-mIgG-p5의 백분율을 나타내고, 각 샘플에 대한 결합 백분율은 히스토그램의 막대 위에 표시된다. x-축은 왼쪽에서 오른쪽으로, rVλ6Wil 피브릴(71% 결합), SNO 선천성(h) ATTR(12% 결합), KEN hATTR(15% 결합), Per 125 wtATTR(31% 결합), Per253 야생형(wt) ATTR(17% 결합), ALκ HIG 추출물(10% 결합), ALκ TAL 추출물(37% 결합), ALλ SHI 추출물(34% 결합), 및 ALλ TYL 추출물(21% 결합)을 포함하는 시험된 아밀로이드 추출물의 유형을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 15a는 x-축에서 왼쪽에서 오른쪽으로 나타낸 바와 같이, 인간 THP-1 대식구 단독, 또는 인간(h) IgG 대조군, ch11-1F4, muIgp5(expiHEK293 세포주에서 생산됨), VH6/VL3-p5, 또는 VH6/VL3-p5R의 존재 하에 pHrodo 적색-표지 rVλ6Wil 피브릴 흡수를 나타낸다. y축은 rVλ6Wil 피브릴 흡수 수준(형광 단위로 측정)을 보여주며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 15b는 x-축에서 왼쪽에서 오른쪽으로 나타낸 바와 같이, THP-1 단독의 존재 하에 또는 hIgG 대조군, c11-1F4, mIgp5, VH9/VL4-p5, 또는 VH9/VL4-p5R과 함께 대식구에 의한 pHrodo 적색-표지 rVλ6Wil 피브릴의 식균작용을 나타낸다. y축은 식균작용 수준(형광 단위)을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 15c는 x-축에서 왼쪽에서 오른쪽으로 나타낸 바와 같이, hIgG 대조군, 5 μg 리툭산(음성 대조군으로서의 키메라 mAb), 5 μg c11-1F4, 5 μg VH6/VL3, 5 μg VH9/VL4, VH6/VL3-p5R, 또는 VH6/VL3-p5의 존재 하에서 대식구에 의한 pHrodo 적색-표지 rVλ6Wil 피브릴의 식균작용을 나타낸다. y축은 식균작용 수준(pHrodo 형광)을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 16은 야생형(WT) 마우스에 정맥내 투여된 125I-표지 VH9/VL4 항체의 약동학(PK) 분석을 나타낸다. x축은 투여 후 시간(hours)을 나타내고, y축은 혈중 방사활성의 수준을 분당 계수("cpm")로 나타낸다. 곡선으로의 피팅은 이중 지수 감쇠 공식을 사용한다.
도 17a는 WT, 아밀로이드 비함유 마우스에서 125I-VH9/VL4-p5의 생체분포를 나타낸다. 도 17b는 WT, 아밀로이드 비함유 마우스에서 125I-VH9/VL4-p5R의 생체분포를 나타낸다. 도 17a 및 17b에서, x-축은 왼쪽에서 오른쪽으로, 근육, 간, 췌장, 비장, 왼쪽 신장, 오른쪽 신장, 위, 상장, 하장, 심장, 폐 및 혈액을 포함하는 샘플링된 기관을 나타내며; y축은 생체 분포 수준을 조직 그램당 주사된 용량의 백분율로서 나타낸다.
도 18은 마우스 혈장에서 VH6/VL3-p5의 안정성을 측정하는 펩티드 포획 ELISA로부터의 데이터를 나타낸다. 100 nM의 VH6/VL3-p5를 4℃의 PBS(가장 진한 회색), 37℃의 PBS(중간 진한 회색 원), 37℃의 EDTA 항응고화 혈장(중간 밝은 회색 원), 또는 37℃의 헤파린 항응고화 혈장(가장 밝은 회색 원)에 첨가했다. x축은 투여 후 시간(일)을 나타내고, y축은 리간드에 대한 항체 결합을 흡광도 단위("au")로 나타낸다.
아밀로이드와 결합하는 변형된 면역글로불린이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 펩티드-Ig 융합물이다.
I. 정의
달리 언급되지 않는 한, 통상적인 용법에 따라 기술 용어가 사용된다. 분자생물학에서 일반적인 용어의 정의는 문헌(Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710)) 및 기타 유사한 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 여기에서, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 맥락상 명확하게 달리 나타내지 않는 한, 단수뿐만 아니라 복수를 모두 나타낸다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 이그젬플리 그라티아(exampli gratia)로부터 유래되고, 본원에서 비-제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서 약어 "예를 들어(e.g.)"는 "예를 들어(for example)"라는 용어와 동의어이다. 본원에서 사용되는 용어 "포함한다(comprise)"는 "포함한다(include)"를 의미한다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 그러한 범위가 표현될 때, 다른 양태는 범위의 하나의 특정 값으로부터 및/또는 범위의 다른 특정 값까지를 포함한다. 범위 각각의 종결점은 다른 종결점과 관련하여 그리고 다른 종결점과 독립적으로 모두 유의하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 유사하게, 값이 근사치로 표현될 때, 선행어 "약"의 사용에 의해, 특정 값이 다른 양태를 형성함이 이해될 것이다. 특정한 예시적 실시양태에서, 용어 "약"은 당분야의 정상 공차의 범위 내에, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내에 있는 것으로 이해된다. 약은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 내인 것으로 이해될 수 있다. 맥락으로부터 달리 명확하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치 값은 용어 약에 의해 수식될 수 있다. 또한, "예", "예시적인" 또는 "예시된"과 같이 본원에서 사용되는 용어는 선호도를 나타내려는 것이 아니라, 이후 논의되는 양태가 제시된 양태의 단지 하나의 예일 뿐임을 설명하기 위한 것이다.
또한, 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 근사치인 것으로 이해되고, 설명을 위해 제공된다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 상충하는 경우에는 용어에 대한 설명을 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 게다가, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며 제한하려는 의도가 아니다.
본 개시의 다양한 실시양태의 검토를 용이하게 하기 위해, 특정 용어에 대한 다음의 설명이 제공된다.
투여: 선택한 경로에 의한 대상체 내로의 조성물의 도입. 예를 들어, 선택된 경로가 정맥내이면, 조성물을 대상체의 정맥내로 도입함으로써 조성물이 투여된다. 일부 예에서, 펩티드는 대상체에 투여된다.
용어 아밀로이드, 아밀로이드 침착물, 아밀로이드 피브릴, 및 아밀로이드 섬유는 특정 구조적 특성을 공유하는 불용성 섬유성 단백질 응집체를 의미한다. 단백질 응집체는 예를 들어, 임의의 여러 상이한 단백질의 응집에 의해 형성되고 섬유 축에 수직으로 적층된 β 시트의 순서화된 배열로 구성되는 3차 구조를 갖는다. 문헌(Sunde et al., J. Mol. Biol. (1997) 273:729-39)을 참고한다. 기관에서 아밀로이드의 비정상적 축적은 아밀로이드증을 야기할 수 있다. 비록 발생은 다양하지만, 모든 아밀로이드는 콩고 레드(Congo red)와 같은 특정 염료로 염색되고 염색 후 편광된 빛에 특징적인 적색-녹색 복굴절(birefringent) 외관을 갖는다는 점에서 공통적인 형태학적 특성을 갖는다. 아밀로이드는 또한 공통의 초미세구조 특징 및 공통의 x-선 회절 및 적외선 스펙트럼을 공유한다.
아밀로이드증은 아밀로이드 침착물의 존재와 같은 아밀로이드의 존재를 특징으로 하는 병리학적 상태 또는 질환을 지칭한다. "아밀로이드 질환" 또는 "아밀로이드증"은 아밀로이드 피브릴의 형성, 침착, 축적 또는 지속과 연관된 질환이다. 이러한 질환은 알츠하이머병, 다운증후군, 네덜란드형의 아밀로이드증을 동반한 선천성 뇌출혈, 및 뇌 베타-아밀로이드 혈관병증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전신 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, ATTR 아밀로이드증, ALect2 아밀로이드증 및 II형 당뇨병의 IAPP 아밀로이드증과 같은 다른 아밀로이드 질환도 아밀로이드 질환이다.
아밀로이드형성은 아밀로이드 침착물을 생산하거나 생산하는 경향을 지칭한다. 예를 들어, 특정 가용성 단량체 단백질은 잘 배열된, 분지되지 않은, 8-nm 내지 10-nm 폭의 피브릴로의 응집을 야기하는 광범위한 형태 변화를 겪을 수 있고, 이는 아밀로이드 응집체의 형성으로 끝난다. 예를 들어, 30개 이상의 단백질이 남성에서 아밀로이드 침착물(또는 아밀로이드)을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 다양한 단백질 부류 내의 모든 단백질, 예컨대 면역글로불린 경쇄가 아밀로이드를 형성할 수 있는 것은 아니며, 즉 일부 단백질은 비-아밀로이드형성이며, 이는 이들이 아밀로이드를 형성하는 경향이 없다는 것을 의미한다. 그러나, 다른 단백질 부류는 아밀로이드 침착물을 형성할 수 있고 따라서 아밀로이드형성이다. 또한, 경쇄 단백질의 부류 내에서, 일부는 아밀로이드 피브릴을 형성하는 용이성에 기초하여 다른 것들보다 더 "아밀로이드형성"이라고 여겨질 수 있다. 특정 경쇄 단백질은 환자 또는 시험관내에서 쉽게 아밀로이드 피브릴을 형성할 수 없기 때문에 비-아밀로이드형성이거나 아밀로이드형성이 덜 한 것으로 여겨진다.
동물: 살아있는 다세포 척추 생물, 예를 들어 포유류 및 조류를 포함하는 범주. 포유류라는 용어는 인간 및 비-인간 포유류를 모두 포함한다. 유사하게, 용어 "대상체"는 인간 및 수의학적 대상체를 모두 포함한다. 일부 예에서, 대상체는 대상체, 예컨대 아밀로이드 질환을 앓고 있는 대상체이다.
제거: "제거한다" 또는 "제거"는 측정 가능한 정도로 줄이거나 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에 제시된 바와 같은 아밀로이드 침착물의 제거는 침착물을 측정 가능하거나 식별 가능한 정도로 줄이거나 제거하는 것에 관련된다. 제거로 인해 100% 제거를 초래할 수 있지만 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 오히려, 제거는 100% 미만 제거, 예컨대 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 그 이상의 제거를 초래할 수 있다.
접합체: 본원에서 사용되는 용어 "접합체"는 2개 이상의 물질의 커플링 또는 결합의 생성물을 지칭하고, 생성된 생성물은 적어도 2개의 도메인과 같은 적어도 2개의 독특한 요소를 갖는다. 커플링된 물질은 동일할 수 있거나, 상이할 수 있다. 그러한 커플링은 하나 이상의 연결기를 거칠 수 있다. "단백질 접합체"는 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 서열의 커플링으로 초래된다. 예를 들어, 2개의 단백질의 접합체는 개별적으로 결합된 단백질 각각에 대응하는 도메인을 갖는 단일 단백질을 초래한다.
항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 헤테로 면역글로불린의 부류에 속하는 단쇄, 2쇄, 및 다쇄 단백질 및 당단백질을 지칭하고(모노클로날 항체가 바람직함); 그것은 또한 이러한 면역글로불린의 합성 및 유전적으로 조작된 변이체를 포함한다. "항체 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편 뿐만 아니라, 원하는 표적 에피토프 또는 에피토프들에 대한 특이성을 갖는 항체의 임의의 부분을 포함한다. "모노클로날 항체"는 B-림프구의 단일 클론에 의해 생산된 항체이다. 모노클로날 항체는 당업자에 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 골수종 세포와 면역 비장 세포의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 제조함으로써 생산된다.
에피토프는 항체 아미노산 서열의 특이성에 의해 결정된 바와 같이, 항체에 의해 인식되는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 항원 결정인자로도 불린다. 예를 들어, 에피토프는 특정 항체에 의해 인식되는 재조합 단백질의 일부일 수 있다. 또한, 에피토프는 입체형태적 에피토프 및 선형 에피토프일 수 있다.
키메라 항체는 전형적으로 상이한 종인 2개의 상이한 항체로부터 유래된 서열을 포함하는 항체를 지칭한다. 가장 전형적으로, 키메라 항체는 인간 및 뮤린 항체 단편, 일반적으로 인간 불변 및 뮤린 가변 영역을 포함한다.
인간화 항체는 모 항체의 항원-결합 특성을 유지하거나 실질적으로 유지하지만 인간에서 덜 면역원성인, 비-인간 항체, 전형적으로 뮤린 항체, 및 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.
상보성 결정 영역 또는 CDR은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 규정하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 각각 지정된 3개의 CDR을 갖는다. 정의상, 문헌(Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda (NIH Publication No. 91-3242))에 의해 기술된 넘버링 관례를 사용하여 경쇄의 CDR은 위치 24 및 34(L-CDR1), 50 및 56(L-CDR2), 89 및 97(L-CDR3)에서의 잔기에 의해 경계가 정해지고; 중쇄의 CDR은 위치 31 및 35b(H-CDR1), 50 및 65(H-CDR2), 95 및 102(H-CDR3)에서의 잔기에 의해 경계가 정해진다.
프레임워크 영역은 CDR 사이에 개재된 아미노산 서열을 지칭한다. 항체의 이들 부분은 CDR을 항원 결합을 위해 적절한 배향으로 유지시키는 역할을 한다.
특이성 결정 잔기 또는 SDR은 항원 접촉에 직접적으로 관여하는 면역글로불린의 아미노산 잔기를 의미한다.
불변 영역은 효과기 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 본 발명에 있어서, 변이체 항체는 인간 면역글로불린 유래의 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 다음 다섯 가지 이소형 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다: 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤. (중쇄의 IgG 서브클래스와 같은) 다양한 서브클래스의 중쇄는 상이한 효과기 기능을 담당한다. 따라서, 원하는 중쇄 불변 영역을 선택함으로써, 원하는 효과기 기능을 갖는 인간화 항체가 생산될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 유형, 바람직하게는 카파 유형일 수 있다.
유효량 또는 치료 유효량: 임의의 장애 또는 질환의 증상 및/또는 기저 원인을 방지, 치료(예방 포함), 감소 및/또는 완화하기에 충분한, 예를 들어 아밀로이드증을 방지, 억제 및/또는 완화하기 위한 제제의 양. 일부 실시양태에서, "유효량"은 질환의 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분하다. 유효량은 1회 이상 투여될 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 유효량은 아밀로이드를 결합시키기에 충분한 양이다. 펩티드는 예를 들어 체중의 kg 당 약 1 μg 초과 내지 약 30 mg/kg의 양으로 비경구 투여될 때 효과적일 수 있다.
발현 제어 서열: 이것이 작동 가능하게 연결되는 이종 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열. 발현 제어 서열은 발현 제어 서열이 핵산 서열의 전사, 적절한 경우 번역을 제어 및 조절하는 경우, 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 따라서, 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결인자, 단백질-인코딩 유전자 앞의 개시 코돈(ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위한 해당 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지, 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 용어 "제어 서열"은, 최소한, 그 존재가 발현에 영향을 미칠 수 있는 성분을 포함하는 것으로 의도되고, 또한 그 존재가 유리한 추가적인 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열이다. 또한, 프로모터-의존적 유전자 발현이 세포-유형 특이적, 조직-특이적으로 제어 가능하거나, 외부 신호 또는 제제에 의해 유도성이 되도록 하기에 충분한 프로모터 요소가 포함된다; 이러한 요소는 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다. 구성적 및 유도성 프로모터가 둘 모두 포함된다(예를 들어, Bitter et ah, Methods in Enzymology 153:516-544, 1987 참고). 예를 들어, 박테리아 시스템에서 클로닝할 때, 박테리오파지 람다의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등과 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 포유류 세포 시스템에서 클로닝할 때, 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 레트로바이러스 긴 말단 반복; 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 사용할 수 있다. 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 생성된 프로모터는 또한 핵산 서열의 전사를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 숙주의 삽입된 유전자 서열의 효율적인 전사를 용이하게 하는 프로모터 서열을 포함하는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 복제 기점, 프로모터, 및 형질전환된 세포의 표현형 선택을 허용하는 특이적 핵산 서열을 포함한다.
억제하다: 측정 가능한 정도만큼 감소시키는 것. 억제는, 예를 들면, 기능의 완전한 손실 또는 측정되는 양태의 완전한 중단을 요구하지 않는다. 예를 들어, 플라크 형성의 억제는 플라크의 추가 성장 중단, 플라크의 추가 성장 둔화, 또는 플라크의 크기 감소를 의미할 수 있다.
질환의 억제 또는 치료: 질환 또는 병태의 전체 발생 억제, 예를 들어 아밀로이드증 억제. "치료"란 질환의 징후나 증상 또는 병리학적 상태가 발병하기 시작한 후 이를 완화하는 치료적 개입을 지칭한다. 용어 "완화"는, 질환 또는 병리학적 상태를 참조하여, 치료의 임의의 관찰 가능한 유익한 효과를 지칭한다. 유익한 효과는, 예를 들어, 감수성 대상체에서 질환의 임상적 증상의 지연된 발병, 질환의 일부 또는 모든 임상적 증상의 중증도의 감소, 질환의 더 둔화된 진행, 대상체의 전체 건강 또는 웰빙의 개선, 또는 특정 질환에 특이적인 당분야에 잘 알려진 다른 파라미터에 의해 입증될 수 있다. "예방적" 치료는 병리 발생의 위험을 감소시키기 위한 목적으로 질환의 징후를 나타내지 않거나 조기 징후만을 나타내는 대상체에 투여되는 치료이다.
아밀로이드 침착 형성에 관하여, "억제"는 대조군과 비교했을 때와 같은 아밀로이드 침착 형성의 감소 방지를 지칭한다. 예를 들어, 억제는 대조군에 비해 아밀로이드 침착물의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 그 이상의 감소를 초래할 수 있다.
표지는 그 분자의 검출을 용이하게 하기 위해 다른 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 임의의 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지의 특정, 비제한적인 예는 형광 태그, 화학발광 태그, 합텐, 효소 결합 및 방사활성 동위원소를 포함한다. 예를 들어, "검출 가능하게 표지된" 단백질은 단백질의 존재가 단백질과 연관된 표지에 의해 결정될 수 있다는 것을 의미한다.
단리된: 펩티드(예를 들어, 본원에 개시된 펩티드 중 하나 이상), 세포, 핵산 또는 혈청 샘플과 같은 "단리된" 생물학적 성분은, 그 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분으로부터, 예를 들어 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 그리고 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 이와 떨어져 생산되거나 정제되었다. 따라서, "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질뿐만 아니라 화학적으로 합성된 펩티드 및 핵산을 포함한다. "단리된" 또는 "정제된"라는 용어는 절대 순도를 요구하지 않는다; 오히려 상대적인 용어로 의도된다. 따라서, 예를 들어, 단리된 펩티드 제조물은 펩티드 또는 단백질이 세포 내의 이의 자연 환경에 있는 펩티드 또는 단백질보다 더 풍부한 것이다. 바람직하게는, 단백질 또는 펩티드가 제조물의 전체 펩티드 또는 단백질 함량의 적어도 50%, 예컨대 펩티드 또는 단백질 농도의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 99%를 나타내도록 제조물이 정제된다.
결합하다: 본원에서 사용되는 용어 "결합하다", "결합된", "연결하다" 또는 "연결된"은 단백질 및/또는 단백질 도메인을 기능적으로 연결하기 위한 당분야에 알려진 임의의 방법을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 단백질 도메인은 개재된 서열 또는 도메인을 갖거나 갖지 않고, 재조합 융합 단백질에서와 같이 공유 결합을 통해 다른 단백질 도메인에 연결될 수 있다. 결합된이란 또한, 예를 들어, 2개의 핵산 서열을 동일한 핵산 가닥 내에 함께 배치하여 서열이 함께 발현되도록 하는 것과 같은, 2개의 서열을 함께 통합하는 것을 포함한다.
핵산: 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 뉴클레오티드 단위(리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 관련된 자연 발생 구조 변이체 및 이의 합성 비자연 발생 유사체)로 이루어진 중합체, 관련된 자연 발생 구조 변이체 및 이의 합성 비자연 발생 유사체. 따라서, 상기 용어는 뉴클레오티드 및 이들 사이의 결합이, 예를 들어 비제한적으로 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA) 등과 같은 비자연 발생 합성 유사체를 포함하는 뉴클레오티드 중합체를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 자동화된 DNA 합성장치를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 약 50개 이하의 짧은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)로 표현되는 경우, 이는 또한 "U"가 "T"를 대체하는 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
뉴클레오티드는 펩티드 핵산(PNA)에서와 같이 피리미딘, 퓨린 또는 이의 합성 유사체와 같은 당에 연결된 염기 또는 아미노산에 연결된 염기를 포함하는 단량체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 내의 하나의 단량체이다. 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 내의 염기 서열을 지칭한다.
뉴클레오티드 서열을 기술하기 위해 통상적인 표기법이 본원에 사용된다: 단일 가닥 뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5'-단부이며; 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향을 5'-방향으로 지칭한다. 신생 RNA 전사체에 뉴클레오티드를 5'에서 3'으로 첨가하는 방향을 전사 방향으로 지칭한다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥을 "코딩 가닥"으로 지칭하고; 그 DNA로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5' 단부에 대해 5'에 배치되는 DNA 가닥 상의 서열을 "업스트림 서열"로 지칭하고; RNA와 동일한 서열을 갖고 코딩 RNA 전사체의 3' 단부에 대해 3'인 DNA 가닥 상의 서열을 "다운스트림 서열"로 지칭한다.
cDNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 mRNA와 상보적이거나 동일한 DNA를 지칭한다.
인코딩은 규정된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 아미노산 서열을 갖고 생물학적 공정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유 특성 및 이로부터 생성된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는 유전자에 의해 생성된 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성한다면 단백질을 인코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다가 상기 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
재조합 핵산은 자연적으로 함께 결합되지 않는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 이는 적합한 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있는 증폭된 또는 조립된 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터와 같은 핵산 벡터를 포함한다. 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포를 "재조합 숙주 세포"로 지칭한다. 그 후, 유전자는 재조합 숙주 세포에서 발현되어, 예를 들어 "재조합 폴리펩티드"를 생성한다. 재조합 핵산은 또한 비-코딩 기능(예를 들어, 프로모터, 복제 기원, 리보솜-결합 부위 등)을 제공할 수 있다. 제1 서열은 제1 서열의 폴리뉴클레오티드가 제2 서열의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 경우, 제2 서열에 대하여 "안티센스"이다.
약학적으로 허용 가능한 담체: 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적인 것이다. 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995))은 본원에 개시된 융합 단백질의 약학 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술한다.
일반적으로, 담체의 성질은 이용되는 특정 투여 모드에 의존할 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 보통 비히클로서 물, 생리 식염수, 평형 염 용액(balanced salt solutions), 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약학적으로 및 생리적으로 허용 가능한 유체를 포함하는 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들어, 분말, 환제, 정제 또는 캡슐 형태)에 있어서, 종래의 비-독성 고체 담체는 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적 중성 담체 이외에, 투여될 약학 조성물은 소량의 비-독성 보조 물질, 예를 들어 수화제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충제 등, 예를 들어 아세트산 나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
폴리펩티드: 단량체가 아미드 결합을 통하여 함께 결합된 아미노산 잔기인 중합체. 아미노산이 알파-아미노산인 경우, L-광학 이성질체 또는 D-광학 이성질체가 사용될 수 있고, L-이성질체가 바람직하다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 아미노산 서열을 포괄하는 것으로 의도되고, 당단백질과 같은 변형된 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 구체적으로 자연 발생 단백질 뿐만 아니라 재조합적으로 또는 합성적으로 생산되는 것을 포함하도록 의도된다. 일부 예에서, 펩티드는 본원에 개시된 펩티드 중 하나 이상이다.
정제된: "정제"라는 용어는 절대 순도를 요구하지 않으며; 오히려 상대적인 용어로 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 단백질 제조물은 언급된 단백질이 세포 내 또는 생산 반응 챔버(적절한 경우) 내의 그 자연 환경에서의 단백질보다 더 순수한 것이다.
재조합체: 재조합 핵산은 자연 발생하지 않는 서열을 갖거나 달리 분리된 2개의 서열 절편의 인공 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이러한 인공 조합은 종종 화학적 합성에 의해, 또는 보다 일반적으로, 예를 들어 유전 공학 기술에 의해, 핵산의 단리된 절편의 인공 조작에 의해 달성된다.
서열 동일성: 2개의 핵산 서열, 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 유사성은 서열 사이의 유사성의 관점에서 표현되며, 달리 서열 동일성으로 지칭된다. 서열 동일성은 종종 동일성(또는 유사성 또는 상동성) 백분율의 관점에서 측정되고; 백분율이 높을수록 두 서열이 유사하다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은 문헌(Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson & Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp Gene 73: 237-244, 1988; Higgins & Sharp CABIOS 5: 151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res. 16, 10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. In the Biosciences 8, 155-65, 1992; 및 Pearson et al. Meth. Mol. Bio. 24, 307-31, 1994)에 기술된다. 문헌(Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990))은 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고찰을 제시한다.
NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)은 서열 분석 프로그램인 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련하여 사용하기 위해, 미국 국립 생명 공학 정보 센터(NCBI, Bethesda, MD)를 비롯한 여러 출처 및 인터넷 상에서 이용 가능하다.
작동 가능하게 연결된: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 필요한 경우 동일한 판독 프레임에서 2개의 단백질-코딩 영역을 결합시킨다.
약학 제제: 대상체 또는 세포에 적절히 투여되는 경우, 원하는 치료 또는 예방 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물.
벡터: 숙주 세포에 도입되어 형질전환된 숙주 세포를 생성하는 핵산 분자. 재조합 DNA 벡터는 재조합 DNA를 갖는 벡터이다. 벡터는 복제 기점과 같이 숙주 세포에서 복제를 가능하게 하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 당분야에 알려진 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 하나 이상의 바이러스로부터 유래된 적어도 일부 핵산 서열을 갖는 재조합 DNA 벡터이다. 용어 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자를 포함하며 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스에 걸쳐 기재된 바와 같다.
대상체는 척추동물을 지칭한다. 척추동물은 포유류, 예를 들어, 인간일 수 있다. 대상체는 인간 환자일 수 있다. 대상체는 질환 또는 병태를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 환자일 수 있으며, 치료 또는 진단이 필요하거나 질환 또는 병태의 진행에 대한 모니터링이 필요할 수 있다. 환자는 또한 유효성에 대해 모니터링될 필요가 있는 치료 요법에 있을 수 있다. 일부 예시적인 실시양태에서, 대상체는 알츠하이머병, 헌팅톤병 또는 프리온 질환과 같은 아밀로이드증, 또는 경쇄(AL) 아밀로이드증 및 2형 당뇨병 환자에서 보이는 것과 같은 말초 아밀로이드증을 앓고 있는 대상체를 포함한다.
치료하는 또는 치료라는 용어는 질환이나 병리학적 상태의 징후나 증상이 발병하기 시작한 후 이를 완화하는 치료적 개입을 지칭한다. 용어 "완화하는"은, 질환 또는 병리학적 상태를 참조하여, 치료의 임의의 관찰 가능한 유익한 효과를 지칭한다. 유익한 효과는, 예를 들어, 감수성 대상체에서 질환의 임상적 증상의 지연된 발병, 질환의 일부 또는 모든 임상적 증상의 중증도의 감소, 질환의 둔화된 진행, 대상체의 전체 건강 또는 웰빙의 개선, 또는 특정 질환에 특이적인 당분야에 잘 알려진 다른 파라미터에 의해 입증될 수 있다. "예방적" 치료는 병리 발생의 위험을 감소시키기 위한 목적으로 질환의 징후를 나타내지 않거나 조기 징후만을 나타내는 대상체에 투여되는 치료이다.
바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 용어 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 교환 가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 다음과 같다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌 발린, 글루탐산-아스파르트산 및 아스파라긴-글루타민.
본원에서 논의되는 바와 같이, 아미노산 서열에서 변이가 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 및 가장 바람직하게는 99%를 유지하는 경우, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에서의 작은 변이는 본 발명에 포괄되는 것으로 고려된다. 특히, 보존적 아미노산 대체가 고려된다. 보존적 대체는 측쇄가 관련된 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 인코딩된 아미노산은 일반적으로 다음 패밀리로 나뉜다: (1) 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트이고; (2) 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘이고; (3) 비-극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고, (4) 하전되지 않은 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 다른 아미노산 패밀리는 (i) 지방족-하이드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 그리고 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로, 또는 유사한 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로의 단리된 대체는, 특히 대체에 골격 부위 내의 아미노산이 관여되지 않는 경우, 생성된 분자의 결합 또는 특성에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 타당하다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 초래하는지 여부는 본원에 상세히 기술된 폴리펩티드 유도체 검정의 특이적 활성을 검정함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카복시-말단은 기능적 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공개 또는 독점 서열 데이터베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터화된 비교 방법이 알려진 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 형태 도메인을 확인하는 데 사용된다. 알려진 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법은 알려져 있다(Bowie et al. Science 253:164 (1991). 따라서, 상기 예는 당업자가 본 발명에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 규정하는 데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 형태를 인식할 수 있음을 입증한다.
바람직한 아미노산 치환은 다음과 같다: (1) 단백분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경하고, (4) 결합 친화성을 변경하고, (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형한다. 유사체는 자연-발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 자연-발생 서열(바람직하게는 분자간 접촉부를 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분)에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예를 들어, 대체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나, 모 서열을 특징짓는 다른 유형의 이차 구조를 파괴하는 경향이 없어야 한다). 당분야에 알려진 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 및 Thornton et al. Nature 354:105 (1991))에 기술되어 있다.
VH에서 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 축약-CDR, 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 포함된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 LI의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, HI의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102에서 발생한다(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008) 참고).
"프레임워크" 또는 "FR"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1 - H1(L1) - FR2 - H2(L2) - FR3 - H3(L3) - FR4; 또는 FR1 - CDR-H1(L1) - FR2 - CDR-H2(L2) - FR3 - CDR3-H3(L3) - FR4.
II. 변형된 면역글로불린 및 항체-펩티드 융합 단백질
A. 변형된 면역글로불린
특정한 예시적 실시양태에서, 아밀로이드를 표적화하는 변형된 면역글로불린이 제공된다. 이러한 변형된 면역글로불린은, 예를 들어, 단편, 항원 결합(Fab) 영역의 Ig 경쇄 단백질의 N-말단의 확장을 통해 또는 중쇄의 C-말단을 통해 면역글로불린(Ig)에 결합되어 펩티드-Ig 융합물을 형성하는 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함한다. 변형된 면역글로불린은 예를 들어, 변형된 면역글로불린을 대상체에 투여함으로써 아밀로이드증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 항체 11-1F4의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 11-1F4의 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 11-1F4의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
특정한 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 항체를 포함하고, 항체는 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
특정한 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 항체를 포함하고, 항체는 (a) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
한 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체를 포함하며, 항체는 펩티드에 결합된다.
다른 양태에서, 변형된 면역글로불린은 항체를 포함하고, 항체는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 표 1에 나타낸 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 변형된 면역글로불린은 항체를 포함하고, 항체는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3, 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL을 포함하고; 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 표 1에 나타낸 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 C-말단 라이신 잔기 없이 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
다른 양태에서, 변형된 면역글로불린은 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 표 1에 나타낸 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 항체 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 또한 펩티드와 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단 사이에 스페이서 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 경쇄의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 중쇄의 N-말단에 결합된다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에서 경쇄에 결합된다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에서 경쇄에 결합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 변형된 면역글로불린은 아밀로이드 침착물 또는 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 아밀로이드에서 하나 이상의 아밀로이드형성 펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린에 의해 결합된 아밀로이드는 아밀로이드형성 λ6 가변 도메인 단백질(Vλ6Wil) 또는 아밀로이드형성 면역글로불린 경쇄(AL), Aβ(1-40) 아밀로이드-유사 피브릴 또는 아밀로이드형성 Aβ 전구체 단백질, 또는 혈청 아밀로이드 단백질 A(AA)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 변형된 면역글로불린에 의해 결합된 아밀로이드는 면역글로불린 중쇄(AH), β2-마이크로글로불린(Aβ2M), 트랜스티레틴 변이체(ATTR), 아포지단백질 AI(AApoAI), 아포지단백질 AII(AApoAII), 겔솔린(AGel), 리소자임(ALys), 백혈구 화학주성 인자(ALect2), 피브리노겐 a 변이체(AFib), 시스타틴 변이체(ACys), 칼시토닌(ACal), 락트헤린(AMed), 섬 아밀로이드 폴리펩티드(AIAPP), 프로락틴(APro), 인슐린(AIns), 선행 단백질(APrP)의 아밀로이드생성 형태; α-시누클레인(AαSyn), 타우(ATau), 심방 나트륨이뇨 인자(AANF), 또는 IAAP, ALκ4, Alλ1 기타 아밀로이드형성 펩티드를 포함한다. 변형된 면역글로불린에 의해 결합되는 아밀로이드형성 펩티드는 단백질, 단백질 단편, 또는 단백질 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물 또는 아밀로이드 피브릴은 재조합 아밀로이드형성 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드는 질환 병리의 일부이다.
당업자라면 알 수 있듯이, 항원 결합 단편(또는 Fab 영역)은 표적 항원과 자연적으로 상호 작용하는 항체의 헤드이다. Fab 영역의 성분은, 예를 들어, 항체가 특이적 리간드에 결합하고, 그 상호작용을 통해, 면역계를 추가로 활성화할 수 있도록 한다. IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM 항체 이소형의 경우, Ig는 2개의 단백질, 즉 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 Ig를 형성하도록 쌍으로 상호작용하는 중쇄 및 경쇄로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두는 가변 도메인 및 불변 도메인으로 추가로 분할되며 - 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 Fab 기능적 영역을 포함하고, 중쇄는 세포 수용체 및 보체와 상호작용하는 단편 결정성(Fc) 도메인을 형성한다. Ig의 Fc 영역은 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 갖는다.
특정한 예시적 실시양태에서, 하기 표 1에 나타낸 펩티드 중 하나 이상은 경쇄 단백질의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단을 통해 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합되어, 변형된 면역글로불린을 형성할 수 있다. 즉, 표 1에서 하기에 확인된 임의의 서열은 펩티드-Ig 접합체를 형성하기 위해 독립적으로 또는 동시에 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편의 중쇄 또는 경쇄에 결합될 수 있다. 예를 들어, 아밀로이드 반응성 펩티드 중 2개는 Ig 경쇄 단백질의 N-말단에 아밀로이드 반응성 펩티드 아미노산 서열을 결합시킴으로써 단일 Ig 항체와 결합될 수 있다.
표 1.
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임의의 특정 이론에 얽매이고자 하지 않고, 펩티드-Ig 접합체의 펩티드 도메인은, 대상체에 투여될 때, 아밀로이드 침착물로 변형된 면역글로불린을 표적화하는 것으로 여겨진다. 그 후, Fc 도메인은 아밀로이드 부위에서 면역 반응을 촉발시키고, 이에 의해 예컨대 옵소닌화에 의한 아밀로이드의 제거를 초래한다. 또한, 변형된 면역글로불린은 아밀로이드 반응성 펩티드 단독보다 반감기가 긴 것으로 여겨진다. 예를 들어, 인간에서 IgG의 순환 반감기는 대략 21일인 반면, 인간에서 아밀로이드 반응성 펩티드 단독의 반감기는 대략 11시간이다. 따라서, Ig는 순환 중 변형된 면역글로불린의 반감기를 증강시킨다. 특정한 예시적 실시양태에서, 아밀로이드 침착물을 변형된 면역글로불린과 접촉시키면, 아밀로이드 침착물을 아밀로이드-반응성 펩티드 단독과 접촉시키는 것에 비해, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가된 반감기를 초래한다. 이와 같이, 변형된 면역글로불린은 대상체에 투여되면, 아밀로이드 침착물 부위에서 면역자극 효과를 더 길게 발휘할 수 있어, 아밀로이드 침착물 부위에서 면역반응을 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 변형된 면역글로불린 펩티드의 아밀로이드-반응성 펩티드는 서열 번호 1-14 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 예컨대, 서열 번호 1-14 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합된 아밀로이드-반응성 펩티드는 약 10 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본 발명의 아밀로이드-반응성 펩티드는 예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 펩티드는, 예를 들어 국제 특허 출원 WO2016032949에 기재되어 있으며, 이는 본원에 전체가 포함된다.
Ig 항체 또는 이의 단편에 결합된 아밀로이드-반응성 펩티드의 전부 또는 일부를 형성하는 아미노산은 자연 발생 아미노산, 비-자연 발생 아미노산, 번역 후 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도체화된 아미노산, 아미노산을 모방하도록 설계된 작제물 또는 구조 등의 변형물 및 입체이성질체일 수 있다. 본 발명의 펩티드를 형성하는 아미노산은 자연 발생 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산 중 하나 이상, 또는 변형되고 비일반적인 아미노산 중 하나 이상일 수 있다. 변형된 면역글로불린은 화학적 합성 또는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하는 재조합 수단을 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다.
특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 클로닝되고, Ig 경쇄에 융합되고, 발현 벡터로 융합되고, 적절한 숙주 세포로 형질전환되거나 형질감염되고, 발현에 적합한 조건 하에 배양되는 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다(실시예 참고). 이어서 펩티드-Ig 경쇄 융합물은 단리된다. 유리하게는, 그리고 당업자가 본 개시를 고려하여 이해할 바와 같이, 본원에 기술된 방법은 임의의 펩티드 서열을 Ig 항체에 결합시키는 데 사용될 수 있다. 즉, 아밀로이드-반응성 펩티드가 Ig 항체에 결합된 펩티드의 예로서 사용되지만, 펩티드를 Ig 항체에 - 예컨대 Ig 경쇄 단백질의 N-말단 단부 및/또는 Ig 중쇄 단백질의 N 및/또는 C-말단 단부에 - 결합시키는 방법은 펩티드를 Ig 항체에 결합시키기 위해 다양한 상이한 펩티드에 사용될 수 있다.
특정한 예시적 실시양태에서, 동일하거나 상이한 다수의 펩티드가 단일 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합될 수 있다. 예를 들어, 제1 발현 벡터는 펩티드 A를 인코딩하는 핵산 서열과 통합된 경쇄 핵산 서열을 포함할 수 있고, 펩티드 A에 대한 핵산 서열은 펩티드 A가 경쇄 단백질의 N-말단에 결합되어 발현되도록 벡터에 배치된다. 또한, 제2 발현 벡터는 펩티드 B를 인코딩하는 핵산 서열과 통합된 중쇄 핵산 서열을 포함할 수 있고, 펩티드 B에 대한 핵산 서열은 펩티드 B가 경쇄 단백질의 N-말단에 결합되어 발현되도록 벡터 내에 배치된다.
이러한 예시적인 실시양태에서, 발현 벡터 둘 모두가 동일한 세포 내에서 발현되는 경우, 생성된 Ig 단백질은 각각의 경쇄의(총 2개의 펩티드 A에 대해) N-말단 상에 하나씩의 펩티드 A 서열 및 중쇄의 N-말단 상에 펩티드 B를 가질 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 벡터는 C-말단 단부 상의 펩티드 C를 포함할 수 있고, 이로써, 2개의 펩티드 A 서열(각 경쇄 상의 하나), 중쇄의 N-말단 단부 상의 펩티드 B 서열, 및 중쇄의 C-말단 단부에 결합된 펩티드 C 서열을 갖는 항체를 생성한다. 이와 같이, 그리고 당업자가 본 개시에 기초하여 이해할 바와 같이, 발현 벡터는 단백질의 동일하거나 상이한 조합을 갖도록 면역글로불린을 변형시키도록 맞춤화될 수 있다. 아밀로이드 반응성 펩티드를 사용하는 구체적인 예로서, 변형된 면역글로불린은 2개의 p5 단백질 서열(서열 번호 1), 즉 각 경쇄 N-말단 단부 상에 하나씩을 포함할 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 면역글로불린에 결합된 펩티드는 리간드에 친화성을 가질 수 있고, 따라서 리간드를 검출하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시예에 있어서, 변형된 면역글로불린은 분리 또는 정제에 의해 얻을 수 있다. 단백질 정제 기술에는, 한 수준에서, 세포, 조직 또는 기관의 펩티드 및 비-펩티드 분획으로의 균질화 및 조정제 분획화가 관여된다. 다른 단백질 정제 기술은 예를 들어 황산암모늄, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 항체 등을 사용한 침전, 또는 열 변성에 의한 침전, 이어서 원심분리; 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 단계; 등전점 형성; 겔 전기영동, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 그리고 이러한 기술과 다른 기술의 조합을 포함한다.
다양한 크로마토그래피 기술은 이온-교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역-친화성 크로마토그래피, 및 역상 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 펩티드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 빠른 성능의 액체 크로마토그래피(FPLC) 또는 심지어 높은 성능의 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. 특정한 예시적 실시양태에서, Fc 도메인은 GGGYS 링커 서열(서열 번호 27)을 통해 아밀로이드-반응성 펩티드에 결합될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단과 아밀로이드 반응성 펩티드 사이에 아미노산 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 펩티드-Ig 접합체는 펩티드의 N-말단 및 시약을 발현하는 세포로부터의 Ig-펩티드의 분비에 필요한 리더 서열 사이에 아미노산 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 약 3 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본 발명의 스페이서 펩티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 핵산 서열 또는 아미노산 서열은, 그러한 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 서열에서 서로 가까운 경우, 다른 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 "인접"한다. 예를 들어, 2개의 핵산 서열은 본원에 기술된 바와 같이 서로 인접할 수 있지만 여전히 중간 스페이서 서열을 포함한다.
B. 항체-펩티드 융합 단백질
아밀로이드를 표적화하는 항체-펩티드 융합 단백질도 본원에 제공된다. 이러한 항체-펩티드 융합 단백질은 예를 들어, 단편, 항원 결합(Fab) 영역의 Ig 경쇄 단백질의 N-말단의 확장을 통해 또는 중쇄의 C-말단을 통해 면역글로불린(Ig)에 결합되어 펩티드-Ig 융합물을 형성하는 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함한다. 항체-펩티드 융합 단백질은 예를 들어 항체-펩티드 융합 단백질을 대상체에 투여함으로써 아밀로이드증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 3에 나타낸 바와 같은 항체의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR을 포함하는 항체를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
특정한 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 항체를 포함하고, 항체는 (a) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
한 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체를 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
다른 양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 항체를 포함하고, 항체는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 1에 나타낸 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 항체를 포함하고, 항체는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL을 포함하고; 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 1에 나타낸 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 C-말단 라이신 잔기 없이 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
다른 양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 1에 나타낸 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 항체 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 또한 펩티드와 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단 사이에 스페이서 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 경쇄의 N-말단에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 경쇄를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에서 경쇄에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에서 경쇄에 결합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드 침착물 또는 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드에서 하나 이상의 아밀로이드형성 펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 결합된 아밀로이드는 아밀로이드형성 λ6 가변 도메인 단백질(Vλ6Wil) 또는 아밀로이드형성 면역글로불린 경쇄(AL), Aβ(1-40) 아밀로이드-유사 피브릴 또는 아밀로이드형성 Aβ 전구체 단백질, 또는 혈청 아밀로이드 단백질 A(AA)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 결합된 아밀로이드는 면역글로불린 중쇄(AH), β2-마이크로글로불린(Aβ2M), 트랜스티레틴 변이체(ATTR), 아포지단백질 AI(AApoAI), 아포지단백질 AII(AApoAII), 겔솔린(AGel), 리소자임(ALys), 백혈구 화학주성 인자(ALect2), 피브리노겐 a 변이체(AFib), 시스틴 변이체(ACys), 칼시토닌(ACal), 락트헤린(AMed), 섬 아밀로이드 폴리펩티드(AIAPP), 프로락틴(APro), 인슐린(AIns), 선행 단백질(APrP)의 아밀로이드형성 형태; α-시누클레인(AαSyn), 타우(ATau), 심방 나트륨이뇨 인자(AANF), 또는 IAAP, ALκ4, Alλ1 기타 아밀로이드형성 펩티드를 포함한다. 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 결합되는 아밀로이드형성 펩티드는 단백질, 단백질 단편, 또는 단백질 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물 또는 아밀로이드 피브릴은 재조합 아밀로이드형성 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드는 질환 병리의 일부이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 아밀로이드 경쇄 피브릴에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드는 아밀로이드형성 λ6 가변 도메인 단백질(Vλ6Wil) 또는 아밀로이드형성 면역글로불린 경쇄(AL), Aβ(1-40) 아밀로이드-유사 피브릴 또는 아밀로이드형성 Aβ 전구체 단백질, 또는 혈청 아밀로이드 단백질 A(AA)와 같은 다양한 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 결합된 아밀로이드는 면역글로불린 중쇄(AH), β2-마이크로글로불린(Aβ2M), 트랜스티레틴 변이체(ATTR), 아포지단백질 AI(AApoAI), 아포지단백질 AII(AApoAII), 겔솔린(AGel), 리소자임(ALys), 백혈구 화학주성 인자(ALect2), 피브리노겐 a 변이체(AFib), 시스틴 변이체(ACys), 칼시토닌(ACal), 락트헤린(AMed), 섬 아밀로이드 폴리펩티드(AIAPP), 프로락틴(APro), 인슐린(AIns), 선행 단백질(APrP)의 아밀로이드형성 형태; α-시누클레인(AαSyn), 타우(ATau), 심방 나트륨이뇨 인자(AANF), 또는 IAAP, ALκ4, Alλ1 기타 아밀로이드형성 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드는 헤파란 설페이트 글리코사미노글리칸에 결합한다.
당업자라면 알 수 있듯이, 항원 결합 단편(또는 Fab 영역)은 표적 항원과 자연적으로 상호 작용하는 항체의 헤드이다. Fab 영역의 성분은, 예를 들어, 항체가 특이적 리간드에 결합하고, 그 상호작용을 통해, 면역계를 추가로 활성화할 수 있도록 한다. IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM 항체 이소형의 경우, Ig는 2개의 단백질, 즉 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한 Ig를 형성하도록 쌍으로 상호작용하는 중쇄 및 경쇄로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두는 가변 도메인 및 불변 도메인으로 추가로 분할된다 - 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 Fab 기능적 영역을 포함하고, 중쇄는 세포 수용체 및 보체와 상호작용하는 결정성 단편(Fc) 도메인을 형성한다. Ig의 Fc 영역은 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 갖는다.
특정한 예시적 실시양태에서, 하기 표 1에 나타낸 펩티드 중 하나 이상은 경쇄 단백질의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단을 통해 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합되어, 항체-펩티드 융합 단백질을 형성할 수 있다. 즉, 표 1에서 하기에 확인된 임의의 서열은 펩티드-Ig 접합체를 형성하기 위해 독립적으로 또는 동시에 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편의 중쇄 또는 경쇄에 결합될 수 있다. 예를 들어, 아밀로이드 반응성 펩티드 중 2개는 Ig 경쇄 단백질의 N-말단에 아밀로이드 반응성 펩티드 아미노산 서열을 결합시킴으로써 단일 Ig 항체와 결합될 수 있다.
임의의 특정 이론에 얽매이고자 하지 않고, 펩티드-Ig 접합체의 펩티드 도메인은, 대상체에 투여될 때, 항체-펩티드 융합 단백질을 아밀로이드 침착물로 표적화하는 것으로 여겨진다. 그 후, Fc 도메인은 아밀로이드 부위에서 면역 반응을 촉발시키고, 이에 의해, 예컨대 옵소닌화에 의한 아밀로이드의 제거를 초래한다. 또한, 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드 반응성 펩티드 단독에 비해 더 긴 반감기를 갖는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 인간에서 IgG의 순환 반감기는 대략 21일인 반면, 인간에서 아밀로이드 반응성 펩티드 단독의 반감기는 대략 11시간이다. 따라서, Ig는 항체-펩티드 융합 단백질의 순환 반감기를 증강시킨다. 특정한 예시적 실시양태에서, 아밀로이드 침착물을 항체-펩티드 융합 단백질과 접촉시키는 것은 아밀로이드 침착물을 아밀로이드 반응성 펩티드 단독과 접촉시키는 것에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가된 반감기를 초래한다. 이와 같이, 항체-펩티드 융합 단백질은, 대상체에 투여되는 경우, 아밀로이드 침착물 부위에서 면역자극 효과를 더 길게 발휘할 수 있어, 아밀로이드 침착물 부위의 면역반응을 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체-펩티드 융합 단백질의 아밀로이드-반응성 펩티드는 서열 번호 1-14 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다, 예를 들면, 서열 번호 1-14 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합된 아밀로이드-반응성 펩티드는 약 10 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본 발명의 아밀로이드-반응성 펩티드는 예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 펩티드는, 예를 들어 국제 특허 출원 WO2016032949에 기술되어 있으며, 이는 본원에 전체가 포함된다.
Ig 항체 또는 이의 단편에 결합된 아밀로이드-반응성 펩티드의 전부 또는 일부를 형성하는 아미노산은 자연 발생 아미노산, 비-자연 발생 아미노산, 번역 후 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도체화된 아미노산, 아미노산을 모방하도록 설계된 작제물 또는 구조 등의 변형물 및 입체이성질체일 수 있다. 본 발명의 펩티드를 형성하는 아미노산은 자연 발생 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산 중 하나 이상, 또는 변형되고 비일반적인 아미노산 중 하나 이상일 수 있다. 항체-펩티드 융합 단백질은 화학적 합성 또는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하는 재조합 수단을 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다.
특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 클로닝되고, Ig 경쇄에 융합되고, 발현 벡터로 융합되고, 적절한 숙주 세포로 형질전환되거나 형질감염되고, 발현에 적합한 조건 하에 배양되는 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다(실시예 참고). 이어서 펩티드-Ig 경쇄 융합물은 단리된다. 유리하게는, 그리고 당업자가 본 개시를 고려하여 이해할 바와 같이, 본원에 기술된 방법은 임의의 펩티드 서열을 Ig 항체에 결합시키는 데 사용될 수 있다. 즉, 아밀로이드-반응성 펩티드가 Ig 항체에 결합된 펩티드의 예로서 사용되지만, 펩티드를 Ig 항체에 - 예컨대 Ig 경쇄 단백질의 N-말단 단부 및/또는 Ig 중쇄 단백질의 N 및/또는 C-말단 단부에 - 결합시키는 방법은 펩티드를 Ig 항체에 결합시키기 위해 다양한 상이한 펩티드에 사용될 수 있다.
특정한 예시적 실시양태에서, 동일하거나 상이한 다수의 펩티드가 단일 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합될 수 있다. 예를 들어, 제1 발현 벡터는 펩티드 A를 인코딩하는 핵산 서열과 통합된 경쇄 핵산 서열을 포함할 수 있고, 펩티드 A에 대한 핵산 서열은 펩티드 A가 경쇄 단백질의 N-말단에 결합되어 발현되도록 벡터에 배치된다. 또한, 제2 발현 벡터는 펩티드 B를 인코딩하는 핵산 서열과 통합된 중쇄 핵산 서열을 포함할 수 있고, 펩티드 B에 대한 핵산 서열은 펩티드 B가 경쇄 단백질의 N-말단에 결합되어 발현되도록 벡터 내에 배치된다.
이러한 예시적인 실시양태에서, 발현 벡터 둘 모두가 동일한 세포 내에서 발현되는 경우, 생성된 Ig 단백질은 각각의 경쇄(총 2개의 펩티드 A에 대해)의 N-말단 상에 하나씩의 펩티드 A 서열 및 중쇄의 N-말단 상에 펩티드 B를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 벡터는 C-말단 단부 상의 펩티드 C를 포함할 수 있고, 이로써 2개의 펩티드 A 서열(각각의 경쇄 상에 하나씩)의 중쇄의 N-말단 단부 상에 펩티드 B 서열, 및 중쇄의 C-말단 단부에 결합된 펩티드 C 서열을 갖는 항체를 생성한다. 이와 같이, 그리고 당업자가 본 개시에 기초하여 이해할 바와 같이, 발현 벡터는 단백질의 동일하거나 상이한 조합을 갖게 면역글로불린을 변형시키도록 맞춤화될 수 있다. 아밀로이드 반응성 펩티드를 사용하는 구체적인 예로서, 항체-펩티드 융합 단백질은 2개의 p5 단백질 서열(서열 번호 1), 즉 각각의 경쇄 N-말단 단부 상에 하나씩을 포함할 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 면역글로불린에 결합된 펩티드는 리간드에 친화성을 가질 수 있고, 따라서 리간드를 검출하는 데 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 단리 또는 정제에 의해 얻을 수 있다. 단백질 정제 기술에는, 한 수준에서, 세포, 조직 또는 기관의 펩티드 및 비-펩티드 분획으로의 균질화 및 조정제 분획화가 관여된다. 다른 단백질 정제 기술은 예를 들어 황산암모늄, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 항체 등을 사용한 침전, 또는 열 변성에 의한 침전, 이어서 원심분리; 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 단계; 등전점 형성; 겔 전기영동, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 그리고 이러한 기술과 다른 기술의 조합을 포함한다.
다양한 크로마토그래피 기술은 이온-교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역-친화성 크로마토그래피, 및 역상 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 펩티드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 빠른 성능의 액체 크로마토그래피(FPLC) 또는 심지어 높은 성능의 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 GGGYS 링커 서열(서열 번호 27)을 통해 아밀로이드-반응성 펩티드에 결합될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 경쇄의 N-말단 또는 중질의 C-말단과 아밀로이드 반응성 펩티드 사이에 아미노산 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 펩티드-Ig 접합체는 펩티드의 N-말단 및 시약을 발현하는 세포로부터의 Ig-펩티드의 분비에 필요한 리더 서열 사이에 아미노산 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 약 3 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본 발명의 스페이서 펩티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열 또는 아미노산 서열은, 그러한 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 서열에서 서로 가까운 경우, 다른 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 "인접"한다. 예를 들어, 2개의 핵산 서열은 본원에 기술된 바와 같이 서로 인접할 수 있지만 여전히 개재 스페이서 서열을 포함한다.
III. 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 인간화 항체
인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 인간화 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 뮤린 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 및/또는 VL은 인간 VH 및/또는 VL 서열(예를 들어, "인간 수신체 서열")로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, VH 및/또는 VL은 예를 들어, VH 및/또는 VL의 프레임워크 영역 내에 아미노산 치환을 포함한다.
A. 인간화 항체
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 3에 나타낸 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는, 표 3에 나타낸 바와 같은 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 프레임워크 영역(FR)을 포함하고, VH는 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프레임워크 영역은 FR1, FR2, FR3 또는 FR4이다. 일부 실시양태에서, VL은 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 N-말단에서 C-말단으로 FR1, CDR-L1, FR2, CDR-L2, FR3, CDR-L3 및 FR4를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 FR1, FR2, FR3, 및 FR4를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 N-말단에서 C-말단으로 FR1, CDR-H1, FR2, CDR-H2, FR3, CDR-H3, 및 FR4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 그래프팅된 CDR을 갖는 인간 수신체 서열(예를 들어, 서열 번호 32 또는 서열 번호 43) 대비 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3, 또는 FR4)에서 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 VL 및/또는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 FR2에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, FR2에서의 아미노산 치환은 위치 36에서의 아미노산 치환, 위치 37에서의 아미노산 치환, 및 위치 46에서의 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, FR2에서의 아미노산 치환은 위치 36에서의 Tyr, 위치 37에서의 Leu, 및 위치 46에서의 Leu으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 FR3에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, FR3에서의 아미노산 치환은 위치 85에서의 아미노산 치환, 및 위치 87에서의 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, FR3에서의 아미노산 치환은 위치 85에 Leu 및 위치 87에 Phe로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 FR2에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, FR2에서의 아미노산 치환은 위치 37에서의 아미노산 치환 및 위치 48에서의 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, FR2에서의 아미노산 치환은 위치 37에 Val 및 위치 48에 Leu으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 FR3에서의 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, FR3에서의 아미노산 치환은 위치 67에서의 아미노산 치환, 위치 48에서의 아미노산 치환, 위치 71에서의 아미노산 치환, 위치 76에서의 아미노산 치환, 위치 78에서의 아미노산 치환, 위치 79에서의 아미노산 치환, 위치 80에서의 아미노산 치환, 위치 89에서의 아미노산 치환, 위치 93에서의 아미노산 치환, 및 위치 94에서의 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, FR3에서의 아미노산 치환은 위치 67에 Leu, 위치 48에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하며, 아미노산 위치는 서열 번호 32의 N-말단으로부터 순차적으로 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 33에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 34에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 41에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 42에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 51에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 90에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 92에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6A에 제시된 바와 같이 VL1에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하고, 아미노산 위치는 서열 32의 넘버링에 따라 VL의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 33에서 Ser, Gln, Glu, His 또는 Ala을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 34에 Ala 또는 Val을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 41에 Tyr을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 42에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 51에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 90에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 92에 Phe을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하며, 아미노산 위치는 VH의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 37에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 67에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 71에 Lys을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 76에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 78에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 79에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 80에 Phe을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 92에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 96에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 97에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 37에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 46에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 85에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr 및 위치 37에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 37에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 67에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 71에 Lys을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 76에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 78에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 79에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 80에 Phe을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 89에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 93에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 37에 Val 및 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu 및 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 71에 Lys, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu, 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 71에 Lys, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6A에 제시된 바와 같은 VL2, VL3, VL4, VL4-N33S, VL4-N33Q, VL4-N33E, VL4-N33A, VL4-N33H, VL4-G34A 또는 VL4-G34V로 구성되는 군으로부터 선택된 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6B에 제시된 바와 같은 VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH9-D54S, VH9-D54Q, VH9-D54E, VH9-D54A, VH9-D54H, VH9-G55A, VH9-G55V, VH9-M64V, VH9-M64I, VH9-M64L 또는 VH9-M64A로 구성되는 군으로부터 선택된 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH9의 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL3의 VL, 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH6의 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH10의 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 52에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH8의 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH7의 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 전장 항체, Fab 단편, 또는 scFv이다.
CDR 치환을 갖는 인간화 항체
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 하나 이상의 CDR 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR 치환은 CDR-L1에 있다. 일부 실시양태에서, CDR 치환은 CDR-H2에 있다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu 및 위치 87에 Phe로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하고; 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하고; 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하며, VL은 서열 번호 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하며, VL은 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 71에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 73에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고 VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 6C 및/또는 표 6D에 나타낸 바와 같은 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 각각 서열 번호 53-63에 제시된 서열을 갖는 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 36-42에 제시된 서열을 갖는 VL의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 CDR-L1에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR-L1에서의 아미노산 치환은 위치 28에 아미노산 치환 및 위치 29에 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-L1에서의 아미노산 치환은 위치 28에 Ser, Gln, Glu, His, 또는 Ala으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-L1에서의 아미노산 치환은 위치 29에 Ala 또는 Val으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 CDR-H2에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서의 아미노산 치환은 위치 54, 위치 55 또는 위치 64에 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서의 아미노산 치환은 위치 54에 Ser, Gln, Glu, Ala, 또는 His으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서의 아미노산 치환은 위치 55에 Ala 또는 Val으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서의 아미노산 치환은 위치 64에 Val, Ile, Leu 또는 Ala으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
B. 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질
또한, 아밀로이드-반응성 펩티드에 융합된 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 인간화 항체를 포함한다. 일부의 실시양태에서, 인간화 항체는 상기 기술된 인간화 항체 중 어느 하나이다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 인간화 항체를 포함하며, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 표 3에 나타낸 바와 같은 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는, 표 3에 나타낸 바와 같은 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 FR2에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, FR2에서의 아미노산 치환은 위치 36에 아미노산 치환, 위치 37에 아미노산 치환, 및 위치 46에 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, FR2에서의 아미노산 치환은 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 및 위치 46에 Leu으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 FR3에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, FR3에서의 아미노산 치환은 위치 85에 아미노산 치환, 및 위치 87에 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, FR3에서의 아미노산 치환은 위치 85에 Leu 및 위치 87에 Phe로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 FR2에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, FR2에서의 아미노산 치환은 위치 37에 아미노산 치환 및 위치 48에 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, FR2에서의 아미노산 치환은 위치 37에 Val 및 위치 48에 Leu으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 FR3에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, FR3에서의 아미노산 치환은 위치 67에 아미노산 치환, 위치 48에 아미노산 치환, 위치 71에 아미노산 치환, 위치 71에 아미노산 치환, 위치 76에 아미노산 치환, 위치 78에 아미노산 치환, 위치 79에 아미노산 치환, 위치 80에 아미노산 치환, 위치 89에 아미노산 치환, 위치 93에 아미노산 치환, 및 위치 94에 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, FR3에서의 아미노산 치환은 위치 67에 Leu, 위치 48에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하고, 아미노산 위치는 서열 번호 32의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 VL에 위치 33에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 34에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 41에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 42에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 51에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 90에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 92에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 표 6A에 나타낸 바와 같이 VL1에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하고, 아미노산 위치는 서열 번호 43의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 37에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 48에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 67에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 68에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 71에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 76에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 78에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 79에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 80에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 92에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 96에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 97에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 서열 번호 43에 제시된 아미노산 치환을 포함하는 VH에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH1에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하고, 아미노산 위치는 VL의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 33에 Ser, Gln, Glu, His 또는 Ala을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 34에 Ala 또는 Val을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 41에 Tyr을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 42에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 51에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 90에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 92에 Phe을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하고, 아미노산 위치는 VH의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 37에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 67에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 71에 Lys을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 76에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 78에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 79에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 80에 Phe을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 92에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 96에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 97에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 37에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 46에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 85에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr 및 위치 37에 Leu을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 37에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 67에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 71에 Lys을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 76에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 78에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 79에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합물은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 80에 Phe을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 89에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 93에 Val을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 37에 Val 및 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu 및 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하며, 인간화 항체는 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 71에 Lys, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu, 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 71에 Lys, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 6A에 나타낸 바와 같이 VL의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL2, VL3, VL4, VL4-N33S, VL4-N33Q, VL4-N33E, VL4-N33A, VL4-N33H, VL4-G34A 또는 VL4-G34V로 구성되는 군으로부터 선택된 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH9-D54S, VH9-D54Q, VH9-D54E, VH9-D54A, VH9-D54H, VH9-G55A, VH9-G55V, VH9-M64V, VH9-M64I, VH9-M64L 또는 VH9-M64A로 구성되는 군으로부터 선택된 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH9의 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL3의 VL 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH6의 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH10의 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 6A에 제시된 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 제시된 바와 같은 VH8의 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 표 6A에 제시된 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 제시된 바와 같은 VH7의 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드-반응성 펩티드는 표 1에 나타낸 펩티드 중 하나 이상을 포함한다. 특정한 일부 실시양태에서, 아밀로이드-반응성 펩티드는 서열 번호 1-14로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드-반응성 펩티드는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드-반응성 펩티드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드-반응성 펩티드는 양으로 하전된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드는 경쇄의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 인간화 항체를 포함하고, 인간화 항체는 경쇄를 포함하고, 아밀로이드 반응성 펩티드는 링커에 의해 경쇄의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGGYS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 하전되지 않는다.
일부 실시양태에서, 하기 표 1에 나타낸 펩티드 중 하나 이상은 경쇄 단백질의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단을 통해 인간화 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합되어, 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 형성할 수 있다. 즉, 표 1에서 하기 확인된 임의의 서열은 항체-펩티드 융합 단백질을 형성하기 위해 독립적으로 또는 동시에 인간화 항체 또는 이의 기능적 단편의 중쇄 또는 경쇄에 결합될 수 있다. 예를 들어, 아밀로이드 반응성 펩티드 중 2개는, 아밀로이드 반응성 펩티드 아미노산 서열을 인간화 항체 경쇄의 N-말단에 결합시킴으로써, 단일 Ig 항체와 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 아밀로이드 반응성 펩티드 및 경쇄를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로 VL 및 CL1을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 본원에 기술된 VL 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 본원에 기술된 VH 중 어느 하나이다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 아밀로이드 반응성 펩티드, 스페이서 펩티드, 및 경쇄를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VL 및 CL1을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 본원에 기술된 VL 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 분비 리더 펩티드, 제1 스페이서 펩티드, 아밀로이드 반응성 펩티드, 제2 스페이서 펩티드, 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 스페이서 펩티드는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 스페이서 펩티드는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 스페이서 펩티드는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로, VL 및 CL1을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 본원에 기술된 VL 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 본원에 기술된 VH 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, VH는 본원에 기술된 VH 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 도 11a 또는 도 11b에 도식화된 바와 같은 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 경쇄의 N-말단과 아밀로이드 반응성 펩티드 사이에 아미노산 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 펩티드의 N-말단 및 항체-펩티드 융합 단백질을 발현하는 세포로부터의 항체-펩티드 융합 단백질의 분비에 필요한 리더 서열 사이에 아미노산 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 가요성 스페이서 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 하전되지 않는다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 글리신 세린 링커이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 글리신 세린 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 약 3 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. 본 발명의 스페이서 펩티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 또는 155개 아미노산 길이이며, 이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 15개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 펩티드는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드 반응성 펩티드와 항체 사이에 스페이서를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 C-말단 라이신 잔기가 없는 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 C-말단 라이신 잔기가 없는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 C-말단 라이신 잔기가 없는, 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에서 경쇄에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에서 경쇄에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에서 경쇄에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체-펩티드 융합 단백질은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하고, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 N-말단에서 경쇄에 결합된다.
C. 인간화 항체 및 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 본 발명의 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형의 영역이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질은 Fc-매개 항체 효과기 기능을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질은 항체-의존적 세포 식균작용을 촉진한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 약 100, 10, 1, 0.1, 0.01 μM 미만의 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하며, 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75 또는 100 μM인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 500, 100, 10 또는 1 nM 미만인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000 또는 2200 nM 미만의 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하며, 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000 또는 2200 nM인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 약 40-50 nM인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 40-50 nM인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 50 nM 미만인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 c11-1F4의 Kd보다 작은 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 약 0.01, 0.1 또는 1 μM 미만인 항체의 농도에서(EC50) 절반-최대 결합을 가지며 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하여, 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 μM인 항체 농도에서(EC50) 절반-최대 결합을 가지며 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 약 1, 10, 100 또는 1000 nM 미만인 항체의 농도에서(EC50) 절반-최대 결합을 가지며 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 이들 값 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하여, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 100, 250, 500, 750 또는 1000 nM인 항체의 농도에서(EC50) 절반-최대 결합을 가지며 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 약 17 nM, 7 nM, 16 nM, 75 nM, 또는 95 nM인 항체의 농도에서(EC50) 절반-최대 결합을 가지며 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 약 10 nM, 20 nM, 80 nM, 또는 100 nM 미만인 항체의 농도에서(EC50) 절반-최대 결합을 가지며 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 c11-1F4의 EC50보다 작은 항체의 농도에서(EC50) 절반-최대 결합을 가지며 인간 아밀로이드 피브릴에 결합한다.
해리 상수 및 EC50을 계산하는 방법은 당분야에 알려져 있고, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 및 EuLISA를 포함한다(예를 들어, 실시예, 표 7 및 도 13a-13g 참고). 일부 실시양태에서, 해리 상수는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 Len(1-22) 단량체 펩티드에 대한 결합을 측정함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, EC50은 EuLISA를 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, EC50은 EuLISA를 사용하여 rVλ6Wil 피브릴, Per125 wtATTR 추출물, Ken ATTR 추출물, SHI ALλ 간 추출물 또는 TAL ALκ 간 추출물에 대한 결합 수준을 측정함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 검출 가능한 표지에 접합된다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 방사성핵종(예를 들어, I-125, I-123, I-131, Zr-89, Tc-99m, Cu-64, Br-76, F-18); 효소(홀스래디쉬 퍼옥시다제); 비오틴; 형광단 등으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 단백질을 검출 가능하게 표지하기 위한 당분야에 알려진 임의의 수단이 본원에 기술된 방법과 함께 사용되고/되거나 사용을 위해 적응될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 방사성동위원소로 방사성표지되거나, 형광 태그 또는 화학발광 태그로 표지될 수 있다. 예시적인 방사성동위원소는 예를 들어, 18F, 111In, 99mTc, 및 123I, 및 125I를 포함한다. 이들 및 다른 방사성동위원소는 예를 들어, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 경쇄 단백질에 공유적으로 연결된 DTPA 또는 DOTA와 같은 킬레이트제의 사용이 관여되거나 관여되지 않을 수 있는 잘 알려진 화학을 사용하여 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질에 부착될 수 있다. 예시적인 형광 또는 화학발광 태그는 라이신, 시스테인, 글루탐산, 및 아스파르트산 측쇄와의 반응에 의해 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질에 접합될 수 있는 플루오레세인, 텍사스 레드(Texas red), 로다민, 알렉사(Alexa) 염료, 및 루시퍼라제를 포함한다. 하나의 예시적인 실시양태에서, 표지는 사용되는 태그에 적절한 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 마이크로플레이트 판독기, 또는 형광계를 사용하여 검출된다. 방사활성 표지는, 예를 들어, 방사활성 방출의 유형에 따라 감마 또는 섬광 계수기(scintillation counter)를 사용하고, 특정 방사성핵종의 정확한 검출에 적합한 에너지 창(energy windows)을 사용함으로써 검출될 수 있다. 그러나, 방사성동위원소의 검출을 위한 임의의 다른 적합한 기술이 또한 표지를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 125I이다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 rVλ6Wil 피브릴, Per125 wtATTR 추출물, KEN hATTR 추출물, SHI ALλ 간 추출물, 및/또는 TAL ALκ 간 추출물에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드 침착물 또는 피브릴에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드에서 하나 이상의 아밀로이드형성 펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 결합된 아밀로이드는 아밀로이드형성 λ6 가변 도메인 단백질(Vλ6Wil) 또는 아밀로이드형성 면역글로불린 경쇄(AL), Aβ(1-40) 아밀로이드-유사 피브릴 또는 아밀로이드형성 Aβ 전구체 단백질, 또는 혈청 아밀로이드 단백질 A(AA)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 결합된 아밀로이드는 면역글로불린 중쇄(AH), β2-마이크로글로불린(Aβ2M), 트랜스티레틴 변이체(ATTR), 아포지단백질 AI(AApoAI), 아포지단백질 AII(AApoAII), 겔솔린(AGel), 리소자임(ALys), 백혈구 화학주성 인자(ALect2), 피브리노겐 a 변이체(AFib), 시스틴 변이체(ACys), 칼시토닌((ACal), 락트헤린(AMed), 섬 아밀로이드 폴리펩티드(AIAPP), 프로락틴(APro), 인슐린(AIns), 선행 단백질(APrP)의 아밀로이드형성 형태; α-시누클레인(AαSyn), 타우(ATau), 심방 나트륨이뇨 인자(AANF), 또는 IAAP, ALκ4, Alλ1 기타 아밀로이드형성 펩티드를 포함한다. 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 결합되는 아밀로이드형성 펩티드는 단백질, 단백질 단편, 또는 단백질 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물 또는 아밀로이드 피브릴은 재조합 아밀로이드형성 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드는 질환 병리의 일부이다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 인간 아밀로이드에 대한 결합은 인간 아밀로이드 피브릴의 식균작용을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 인간 아밀로이드 피브릴을 옵소닌화한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 rVλ6Wil 피브릴을 옵소닌화한다. 일부 실시양태에서, 대식구의 존재하에 본 개시의 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질과 인간 아밀로이드 피브릴을 접촉시키는 것은 대식구에 의한 인간 아밀로이드 피브릴의 흡수를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 대식구의 존재 하에 본 개시의 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질과 인간 아밀로이드 피브릴을 접촉시키는 것은 인간 아밀로이드 피브릴의 옵소닌화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 인간 아밀로이드에 대한 결합은 대조군 항체(예를 들어, mIgp5 및/또는 c11-1F4)와 동등하거나 더 큰 정도로 인간 아밀로이드 피브릴의 식균작용을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체를 포함하는 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 항체-의존적 세포 식균작용을 촉진한다.
또한 본원에 기술된 임의의 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
IV. 진단 및 검출 방법
특정한 예시적 실시양태에서, 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 및 항체-펩티드 융합 단백질은 다양한 제제로 표지되어, 융합 펩티드가 정제된 후와 같은 생체내 및 시험관내 검정에서 이의 검출을 가능하게 할 수 있다. 제한되고자 하지 않고, 이것은 방사성핵종(예를 들어, I-125, I-123, I-131, Zr-89, Tc-99m, Cu-64, Br-76, F-18); 효소(홀스래디쉬 퍼옥시다제); 비오틴; 형광 등을 포함할 수 있다. 단백질을 검출 가능하게 표지하기 위한 당분야에 알려진 임의의 수단이 본원에 기술된 방법과 함께 사용되고/되거나 사용을 위해 적응될 수 있다. 예를 들어, Ig 항체 또는 이의 단편, 및/또는 아밀로이드 반응성 펩티드는 방사성동위원소로 방사성표지되거나, 형광 태그 또는 화학발광 태그로 표지될 수 있다. 예시적인 방사성동위원소는 예를 들어, 18F, 111In, 99mTc, 및 123I, 및 125I를 포함한다. 이들 및 다른 방사성동위원소는 예를 들어 Ig 항체의 경쇄 단백질에 공유적으로 연결된 DTPA 또는 DOTA와 같은 킬레이트제의 사용을 수반이 관여되거나 관여되지 않을 수 있는 잘 알려진 화학을 사용하여 단리된 면역글로불린 경쇄에 부착될 수 있다. 예시적인 형광 또는 화학발광 태그는 라이신, 시스테인, 글루탐산, 및 아스파르트산 측쇄와의 반응에 의해 단백질에 접합될 수 있는 플루오레세인, 텍사스 레드(Texas red), 로다민, 알렉사(Alexa) 염료, 및 루시페라제를 포함한다. 하나의 예시적인 실시양태에서, 표지는 사용되는 태그에 적절한 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 마이크로플레이트 판독기, 또는 형광계를 사용하여 검출된다. 방사활성 표지는, 예를 들어, 방사활성 방출의 유형에 따라 감마 또는 섬광 계수기를 사용하고, 특정 방사성핵종의 정확한 검출에 적합한 에너지 창을 사용함으로써 검출될 수 있다. 그러나, 방사성동위원소의 검출을 위한 임의의 다른 적합한 기술이 또한 표지를 검출하는 데 사용될 수 있다.
아밀로이드증과 관련하여, 그러한 표지화는, 예를 들어, 아밀로이드의 존재를 진단하고, 아밀로이드 단백질 부하를 결정하고, 특정 대상체에서 아밀로이드에 결합하는 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 능력을 모니터링하고, 아밀로이드증의 진행을 모니터링하고, 및/또는 아밀로이드 치료(대상체로의 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 투여와 연관된 치료를 포함함)에 대한 대상체의 반응을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 아밀로이드 반응성 펩티드, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 포함하는 변형된 면역글로불린은 본원에 기술된 바와 같이 검출 가능한 표지로 표지화되고, 그 후 아밀로이드계 질환(예를 들어, 아밀로이드증, 유의성이 알려지지 않은 모노클로날 감마병증(MGUS), 다발 골수종(MM), 또는 관련된 형질 세포 질환)을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체에 투여된다. 그 후, 예를 들어, 검출 가능하게 표지된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 존재를 검출하도록 대상체가 이미지화될 수 있다.
특정한 예시적 실시양태에서, 검출 가능하게 표지된 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질로부터의 신호는 정량화되어, 대상체에서 아밀로이드 침착 수준의 표시를 제공할 수 있다. 예를 들어, 신호 강도는 그 위에서는 아밀로이드증이 존재하지만 그 아래에서는 아밀로이드증이 존재하지 않거나 낮은 수준인 표준 신호 임계값과 비교될 수 있다. 대상체는 아밀로이드를 갖는 것으로 진단될 수 있고, 이 경우 화학요법, 코르티코스테로이드 약물(레날리도마이드 또는 탈리도마이드) 및/또는 보르테조밉(Velcade)과 같은 치료가 투여될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본원에 기술된 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 대상체를 치료하기 위한 노력으로 대상체에 투여될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 대상체는 낮은 아밀로이드 부하, 중간 아밀로이드 부하, 또는 높은 아밀로이드 부하와 같은 하나 이상의 그룹으로 계층화된 후, 그에 따라 치료될 수 있다. 치료 진행을 모니터링하기 위해, 대상체는 검출 가능하게 표지된 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질이 재투여될 수 있고, 따라서 이의 아밀로이드 부하가 재평가될 수 있다.
V. 치료 방법
A. 변형된 면역글로불린을 사용하는 방법
특정한 예시적 실시양태에서, 아밀로이드증을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 면역글로불린의 유효량이 대상체에 투여되어, 대상체를 치료하거나 아밀로이드 침착물의 조영을 허용한다. 특정한 예시적 양태에서, 대상체에서 아밀로이드 침착물을 제거하는 방법이 제공된다. 방법은 예를 들어, 아밀로이드증을 갖는 대상체를 선택하는 단계 및 대상체에 본원에 기술된 바와 같은 변형된 면역글로불린의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 변형된 면역글로불린은 예를 들어, 경쇄 단백질의 N-말단 또는 Ig 항체 또는 이의 단편의 중쇄의 C-말단을 통해 Ig 항체 또는 이의 단편과 결합되는 아밀로이드 침착물에 결합하는 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함한다. 이에 의해 아밀로이드-반응성 Ig-융합 펩티드의 투여는 아밀로이드의 제거 및 이에 따른 대상체의 치료를 초래한다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 개체에서 아밀로이드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 질환의 병리에 기여할 수 있다. 다른 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 개체에서 아밀로이드증 또는 아밀로이드 관련 질환을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 아밀로이드증을 갖는 개체에서 아밀로이드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드증은 특정 조직 또는 기관 시스템, 예컨대 간, 심장 또는 중추신경계에 국소화된다. 다른 실시양태에서, 아밀로이드증은 전신 아밀로이드증이다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드증이다. 다른 실시양태에서, 아밀로이드증은 산발성 아밀로이드증이다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드증 또는 아밀로이드-관련 질환은 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, AH 아밀로이드증, Aβ 아밀로이드증, ATTR 아밀로이드증, ALect2 아밀로이드증, 및 II형 당뇨병의 IAPP 아밀로이드증, 알츠하이머병, 다운 증후군, 네덜란드 유형의 아밀로이드증을 갖는 선천성 뇌출혈, 뇌 베타-아밀로이드 혈관병증, 해면 뇌병증, 갑상샘 종양, 파킨슨병, 루이스체를 갖는 치매, 타우병증, 헌팅턴병, 노인성 전신 아밀로이드증, 가족성 혈액투석, 노인성 전신 노화, 노화 뇌하수체 장애, 의원성 증후군, 해면 뇌병증, 반응성 만성 염증, 갑상샘 종양, 골수종 또는 다른 형태의 암이다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 정상 노화와 연관된 아밀로이드에 결합한다. 다른 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 대상체에서 아밀로이드증 또는 아밀로이드-관련 질환의 진단, 치료 또는 예후에 사용된다.
특정한 예시적 실시양태에서, 아밀로이드증을 앓고 있는 대상체를 진단하고 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 대상체에 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함하는 검출 가능하게-표지된, 변형된 면역글로불린을 투여하는 단계 및 표지된, 변형된 면역글로불린의 투여에 기초하여, 대상체가 아밀로이드증을 앓고 있음을 결정하는 단계를 포함한다. 이어서, 유효량의 아밀로이드 치료가 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 아밀로이드 반응성 펩티드를 포함하는 하나 이상의 변형된 면역글로불린의 유효량이 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 영장류, 소, 설치류 또는 돼지와 같은 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
B. 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 사용하는 방법
또한, 본 개시의 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 아밀로이드-관련 장애는 AL, AH, Aβ2M, ATTR, 트랜스티레틴, AA, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALEct2, AFib, ACys, ACal, AMed, AIAPP, APro, AIns, APrP, 알파-시누클레인, 아우 또는 Aβ 아밀로이드증으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드증 또는 아밀로이드-관련 질환은 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, AH 아밀로이드증, Aβ 아밀로이드증, ATTR 아밀로이드증, ALect2 아밀로이드증, 및 II형 당뇨병의 IAPP 아밀로이드증, 알츠하이머병, 다운 증후군, 네덜란드 유형의 아밀로이드증을 갖는 선천성 뇌출혈, 뇌 베타-아밀로이드 혈관병증, 해면 뇌병증, 갑상샘 종양, 파킨슨병, 루이스체를 갖는 치매, 타우병증, 헌팅턴병, 노인성 전신 아밀로이드증, 가족성 혈액투석, 노인성 전신 노화, 노화 뇌하수체 장애, 의원성 증후군, 해면 뇌병증, 반응성 만성 염증, 갑상샘 종양, 골수종 또는 다른 형태의 암이다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드-관련 장애는 전신 아밀로이드증이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 정상 노화와 연관된 아밀로이드에 결합한다. 다른 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 대상체에서 아밀로이드증 또는 아밀로이드-관련 질환의 진단, 치료 또는 예후에 사용된다.
제거를 위해 아밀로이드 침착물을 표적화하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 아밀로이드 침착물을 본 개시의 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 제거된다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 제거된다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 옵소닌화된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 인간 아밀로이드 피브릴에 대한 결합은 인간 아밀로이드 피브릴의 식균작용 및 아밀로이드 침착물의 제거를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 인간 아밀로이드 피브릴을 옵소닌화하여, 아밀로이드 침착물을 제거한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 rVλ6Wil 피브릴을 옵소닌화한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 인간 아밀로이드 피브릴에 대한 결합은 인간 아밀로이드 피브릴의 식균작용 및/또는 옵소닌화를 대조군 항체(예를 들어, mIgp5 및/또는 c11-1F4)와 동등하거나 더 큰 정도로 촉진한다.
일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린 또는 검출 가능한 표지에 접합된 항체-펩티드 융합 단백질을 투여하는 단계, 표지를 검출하는 단계, 및 신호가 검출되는 경우 아밀로이드증 치료를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 아밀로이드-관련 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 방사성 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 I125, Tc99 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 효소 표지이다. 일부 실시양태에서, 표지는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제이다. 표지는 특정 인지체 검출 가능 부분, 예를 들어 표지된 아비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 대상체의 간, 비장 또는 혈액에서 확인된다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드증 치료는 본원에 제공된 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 포함한다.
또한 본원에는 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 침착물을 확인하는 방법이 본원에 제공되며, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 검출 가능한 표지에 접합된다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 방사성 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 I125, Tc99 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 효소 표지이다. 일부 실시양태에서, 표지는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제이다. 표지는 특정 인지체 검출 가능 부분, 예를 들어 표지된 아비딘과의 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 침착물은 대상체의 간, 비장 또는 혈액에서 확인된다.
일부 실시양태에서, 리간드를 검출 가능한 표지에 접합된 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합물과 접촉시키는 단계, 및 검출 가능한 표지로부터의 신호를 결정하는 단계를 포함하는, 리간드를 검출하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 방사성 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 I125, Tc99 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 효소 표지이다. 일부 실시양태에서, 표지는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제이다. 표지는 특정 인지체 검출 가능 부분, 예를 들어 표지된 아비딘과의 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출은 시험관내이다. 일부 실시양태에서, 검출은 생체내이다.
VI. 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 항체를 제조하는 방법
A. 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산
변형된 면역글로불린을 인코딩하는 핵산이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 기술된 임의의 변형된 면역글로불린을 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 항체 11-1F4의 VH 및/또는 VL을 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하며, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 항체 11-1F4의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체를 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
특정한 실시양태에서, 핵산은 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
특정한 실시양태에서, 핵산은 (a) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; (c) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
한 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 변형된 면역글로불린 항체를 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
다른 양태에서, 핵산은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 표 1에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 핵산은 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3; 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 표 1에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하고, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린은 C-말단 라이신 잔기 없이 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
다른 양태에서, 핵산은 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 1에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 경쇄를 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 항체 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 또한 펩티드와 항체 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단 사이에 스페이서 아미노산 서열을 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 항체 경쇄의 N-말단에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 변형된 면역글로불린을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산(들)이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 기술된 임의의 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다.
특정한 실시양태에서, 핵산은 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 항체는 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
특정한 실시양태에서, 핵산은 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 항체는 (a) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
한 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
다른 양태에서, 핵산은 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 항체는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL을 포함하고, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 1에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다.
다른 양태에서, 핵산은 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 항체는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL을 포함하고; 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 1에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 C-말단 라이신 잔기 없이 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
다른 양태에서, 핵산은 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 1에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 반응성 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 항체 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 또한 펩티드와 경쇄의 N-말단 또는 중쇄의 C-말단 사이에 스페이서 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
B. 인간화 항체 또는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산
본 개시의 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산(들)이 또한 본원에 제공된다. 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 본원에 기술된 임의의 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 3에 나타낸 바와 같은 항체의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 인간화 항체를 인코딩하며, 인간화 항체는 하나 이상의 CDR 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 인간화 항체를 인코딩하고, 인간화 항체는 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL, 및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, 아미노산 위치는 서열 번호 32의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 33에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 34에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 41에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 42에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 51에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 90에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 위치 92에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 6A에 제시된 바와 같이, VL1에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, 아미노산 위치는 서열 번호 43의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 37에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 48에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 67에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 68에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 71에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 76에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 78에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 79에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 80에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 92에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 96에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 위치 97에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH1에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 VL의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, 아미노산 위치는 VL의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 33에 Ser, Gln, Glu, His 또는 Ala을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 34에서 Ala 또는 Val을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 41에 Tyr을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 42에 Leu을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 51에 Leu을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 90에 Leu을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 92에 Phe을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, 아미노산 위치는 VH의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 37에 Val을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 67에 Leu을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 71에 Lys을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 76에 Ser을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 78에 Val을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 79에 Leu을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 80에 Phe을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 92에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 96에 Val을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 97에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 36에 Tyr을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서는 핵산은 위치 37에 Leu을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서 핵산은 위치 46에 Leu을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서는 위치 85에 Leu을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서 핵산은 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 VL에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 36에 Tyr 및 위치 37에 Leu을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu, 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 37에 Val을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 67에 Leu을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 71에 Lys을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서 핵산은 위치 76에 Ser을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 78에 Val을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 79에 Leu을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 80에 Phe을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 89에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 93에 Val을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 VH에서의 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩하며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 37에 Val 및 위치 48에 Leu을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 및 위치 68에 Ser을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 71에 Lys, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu, 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 71에 Lys, 위치 76에 Ser, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하는 VL, 및 위치 71에 Lys, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 93에 Val 및 위치 94에 Thr을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL2, VL3, VL4, VL4-N33S, VL4-N33Q, VL4-N33E, VL4-N33A, VL4-N33H, VL4-G34A 또는 VL4-G34V로 구성되는 군으로부터 선택되는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH9-D54S, VH9-D54Q, VH9-D54E, VH9-D54A, VH9-D54H, VH9-G55A, VH9-G55V, VH9-M64V, VH9-M64I, VH9-M64L 또는 VH9-M64A로 구성되는 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH9의 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL3의 VL 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH6의 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH10의 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH8의 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 표 6A에 나타낸 바와 같은 VL4의 VL, 및 표 6B에 나타낸 바와 같은 VH7의 VH를 포함하는 인간화 항체를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH는 서열 번호 69에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산(들)이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본 개시의 인간화 항체 중 어느 하나를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 C-말단 라이신 잔기가 없는 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 C-말단 라이신 잔기가 없는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 항체는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 C-말단 라이신 잔기가 없는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 항체는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며. 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 중쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 중쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 중쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하고, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 표 1의 임의의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간화 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하며, 경쇄는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합된다.
C. 벡터, 숙주 세포
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은 하나 이상의 벡터에 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 벡터가 본원에 제공되며, 경쇄는 펩티드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 펩티드에 결합된 중쇄 및 경쇄는 상이한 벡터에 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 본 개시의 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산(들)을 포함한다.
항체 생산을 위해, 펩티드 발현 벡터에 결합된 중쇄 및 경쇄는 당분야에 알려진 적절한 생산 세포주에 도입될 수 있다. 발현 벡터의 도입은 전기천공 또는 당분야에서 이용 가능한 임의의 다른 적합한 형질전환 기술을 통한 공동-형질감염에 의해 달성될 수 있다. 이어서 항체 생산 세포주가 선택되어 증식되고 항체가 정제될 수 있다. 정제된 항체는 이어서 SDS-PAGE와 같은 표준 기술에 의해 분석될 수 있다.
또한 본원에 기술된 임의의 변형된 면역글로불린을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 변형된 면역글로불린은 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우에 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참고한다(또한 대장균에서 항체 단편의 발현을 기술한, 문헌(Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254) 참고). 발현 후, 펩티드에 결합된 항체는 가용성 분획으로 박테리아 세포 페이스트로부터 단리되고, 추가로 정제될 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본 개시의 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산(들)을 포함하는 벡터를 포함한다.
글리코실화된 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양도 숙주로서 활용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429를 참고한다(트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하는 PLANTIBODIES™ 기술을 설명함).
척추동물 세포 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁 상태로 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVl 세포주; 인간 배아 신장 세포주(293 또는, 예를 들어 문헌(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977))에 기재된 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, 문헌(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))에 기술된, TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CVl); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌(Mather et al., Annals N Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 비롯한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌(Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003))을 참고한다.
D. 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 제조하는 방법
본 개시의 변형된 면역글로불린, 인간화 항체 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 제조하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 본 개시의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 변형된 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
VII. 마우스 항체를 인간화하는 방법
마우스 항체를 인간화하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 마우스 항체는 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, VL은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, VH는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, VH 및 VL은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 항체의 CDR-L1은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 마우스 항체의 CDR-L2는 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 마우스 항체의 CDR-L3은 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 마우스 항체의 CDR-H1은 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 마우스 항체의 CDR-H2는 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 마우스 항체의 CDR-H3은 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 항체는 표 3에 나타낸 바와 같이 항체 11-1F4의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마우스 항체는 서열 번호 15에 제시된 서열을 갖는 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 갖는 VL의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 마우스 항체를 인간화하는 방법은 i. 마우스 항체의 모델링된 구조를 얻기 위해 상동성 모델링을 수행하는 단계; ii. 마우스 항체의 모델링된 구조에서 프레임워크 잔기의 용매 접근 가능 표면적을 계산하는 단계; iii. 골격 잔기가 매몰 잔기인지 여부를 결정하는 단계로서, 매몰 잔기는 용매 접근 가능 표면적이 약 15% 미만인 잔기인, 단계; iv. 인간 VH 및 VL을 제공하는 단계; v. 마우스 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3을 각각 인간 VH 및 VL에 도입함으로써, 그래프팅된 항체를 생성하는 단계; 및 vi. 그래프팅된 항체에서 위치에 역돌연변이를 도입하는 단계로서, 역돌연변이를 위한 위치는 매몰 잔기인, 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 vi는 반복된다. 일부 실시양태에서, 단계 vi는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 수행된다.
일부 실시양태에서, 역-돌연변이를 위한 위치는 CDR에 매우 근접한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이를 위한 위치는 CDR로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 아미노산 잔기만큼 분리된다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이에 대한 위치는 CDR로부터 그 사이의 임의의 범위 또는 값을 포함하여, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10옹스트롬(Angstroms) 이하만큼 분리된다.
일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VL에 도입되고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VL에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 36에 Tyr을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VL에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 37에 Leu을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VL에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 46에 Leu을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VL에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 85에 Leu을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VL에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 87에 Phe을 포함한다.
일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 37에 Val을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 48에 Leu을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 67에 Leu을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 68에 Ser을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 71에 Lys을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역-돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역-돌연변이는 위치 76에 Ser을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역 돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역 돌연변이는 위치 78에 Val을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역 돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역 돌연변이는 위치 79에 Leu을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역 돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역 돌연변이는 위치 80에 Phe을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역 돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역 돌연변이는 위치 89에 Thr을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역 돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역 돌연변이는 위치 93에 Val을 포함한다. 일부 실시양태에서, 역 돌연변이는 인간 VH에 도입되고, 역 돌연변이는 위치 94에 Thr을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 그래프팅된 항체의 CDR에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 그래프팅된 항체의 VL에 비해 CDR-L1에 아미노산 치환을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR-L1에서의 아미노산 치환은 위치 28에 아미노산 치환 및 위치 29에 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-L1에서의 아미노산 치환은 위치 28에서 Ser, Gln, Glu, His, 또는 Ala으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-L1에서의 아미노산 치환은 위치 29에서 Ala 또는 Val으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 그래프팅된 항체의 VH에 비해 CDR-H2에 아미노산 치환을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서의 아미노산 치환은 위치 54, 위치 55, 또는 위치 64에 아미노산 치환으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서의 아미노산 치환은 위치 54에서 Ser, Gln, Glu, Ala, 또는 His으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서의 아미노산 치환은 위치 55에서 Ala 또는 Val으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서의 아미노산 치환은 위치 64에서 Val, Ile, Leu 또는 Ala으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
실시양태
실시양태 1. 다음을 포함하는 변형된 면역글로불린:
아밀로이드-반응성 펩티드로서, 서열 번호 1-14로 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 아밀로이드-반응성 펩티드; 및
Ig 항체 또는 이의 기능적 단편.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 아밀로이드-반응성 펩티드 및 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편이 Ig 경쇄 단백질의 N-말단 또는 Ig 중쇄 단백질의 C-말단에서 함께 결합되는, 변형된 면역글로불린.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 변형된 면역글로불린이 아밀로이드-반응성 펩티드와 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편 사이에 스페이서 서열을 포함하는 변형된 면역글로불린.
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 변형된 면역글로불린이 적어도 2개의 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함하고, 아밀로이드-반응성 펩티드가 동일한 펩티드 또는 상이한 펩티드인, 변형된 면역글로불린.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 제시된 변형된 면역글로불린의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.
실시양태 6. 아밀로이드 침착물을 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 제시된 변형된 면역글로불린과 접촉시키는 단계를 포함하는, 제거를 위해 아밀로이드 침착물을 표적화하는 방법.
실시양태 7. 실시양태 6에 있어서, 제거를 위한 아밀로이드 침착물의 표적화가 아밀로이드 침착물의 제거를 초래하는, 방법.
실시양태 8. 실시양태 6 또는 7에 있어서, 제거가 아밀로이드 침착물의 옵소닌화로부터 초래되는, 방법.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합된 아밀로이드 반응성 펩티드가 AA, AL, AH, ATTR, Aß2M, ALect2, 야생형, TTR, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALect2, Afib, ACys, ACal, AMedin, AIAPP, APro, AIns, APrP, 또는 Aβ를 포함하는 하나 이상의 아밀로이드 침착 유형에 결합하는, 방법.
실시양태 10. 실시양태 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 아밀로이드 침착물과 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편에 결합된 아밀로이드-반응성 펩티드의 접촉이 아밀로이드-반응성 펩티드 단독에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 만큼 아밀로이드-반응성 Igp5 접합체의 반감기를 증가시키는, 방법.
실시양태 11. 다음을 포함하는 변형된 면역글로불린:
펩티드; 및
펩티드 및 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편이 Ig 경쇄 단백질의 N-말단 단부 및/또는 Ig 중쇄 단백질의 N- 및/또는 C-말단 단부에서 함께 결합되는, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 변형된 면역글로불린이 펩티드와 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편 사이에 스페이서 서열을 포함하는 변형된 면역글로불린.
실시양태 13. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 변형된 면역글로불린이 적어도 2개의 펩티드를 포함하고, 펩티드가 동일한 펩티드 또는 상이한 펩티드인, 변형된 면역글로불린.
실시양태 14. 다음을 포함하는, 변형된 면역글로불린을 생성하는 방법:
제1 발현 벡터와 제2 발현 벡터를 제공하는 단계로서,
상기 제1 발현 벡터는 Ig 항체 경쇄 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하고;
상기 제2 발현 벡터는 Ig 항체 중쇄 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고;
제1 발현 벡터 및/또는 상기 제2 발현 벡터는 제1 펩티드를 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하고, 제3 핵산 서열은 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열에 인접하게 배치되는, 단계; 및
제1 및 제2 발현 벡터를 세포에 삽입하는 단계로서, 세포에서의 제1 및 제2 발현 벡터의 발현은 제1 펩티드에 결합된 면역글로불린을 생성하는, 단계.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 제1 발현 벡터 및/또는 제2 발현 벡터가 제2 펩티드를 인코딩하는 제4 핵산 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열에 인접하여 배치되는, 방법.
실시양태 16. 실시양태 15에 있어서, 제1 및 제2 발현 벡터의 발현이 제1 펩티드 및 제2 펩티드에 결합된 면역글로불린을 생성하는, 방법.
실시양태 17. 실시양태 14에 있어서, 스페이서 핵산 서열이 제3 핵산 서열과 제1 핵산 서열 및/또는 제2 제1 핵산 서열 사이에 배치되는, 방법.
실시양태 18. 실시양태 14에 있어서, 제1 펩티드가 서열 번호 1-14에 제시된 아미노산 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
실시양태 19. 실시양태 14 내지 19 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 변형된 면역글로불린.
실시양태 20. 다음을 포함하는, 아밀로이드계 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법:
대상체가 아밀로이드 침착물을 갖는지 여부를 다음에 의해 결정하는 단계로서:
실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 변형된 면역글로불린을 검출 가능하게 표지하고,
변형된 면역글로불린을 환자에 투여하고,
검출 가능한 표지와 연관된 신호가 대상체로부터 검출될 수 있는지 여부를 결정하는, 단계; 및
신호가 검출되면, 대상체에 아밀로이드증 치료를 투여하는 단계.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, 신호가 검출되지 않는 경우, 아밀로이드 침착물의 추후 발생에 대해 대상체를 모니터링하는, 방법.
실시양태 22. 실시양태 21에 있어서, 신호의 강도를 결정하는 단계 및 신호를, 그 위의 대상체는 아밀로이드 침착물을 보유하는 것으로 결정되는 임계값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시양태 23. 실시양태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 아밀로이드증 치료가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 24. 실시양태 23에 있어서, 변형된 면역글로불린의 투여가 대상체에서 아밀로이드 침착물의 제거를 초래하는, 방법.
실시양태 25. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 변형된 면역글로불린을 검출 가능하게 표지하는 단계, 변형된 면역글로불린을 대상체에 투여하는 단계, 및 변형된 면역글로불린으로부터의 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에서 아밀로이드 침착물을 확인하는 방법.
실시양태 26. 실시양태 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 아밀로이드가 없거나, 유의성이 알려지지 않은 모노클로날 감마병증(MGUS), 다발 골수종(MM), 또는 하나 이상의 관련된 형질 세포 질환을 앓고 있는 것으로 결정되는, 방법.
실시양태 27. 다음을 포함하는, 리간드를 검출하는 방법:
실시양태 11 내지 13 중 어느 하나의 변형된 면역글로불린을 검출 가능하게 표지하는 단계로서, 변형된 면역글로불린의 펩티드는 리간드에 결합 친화성을 갖는, 단계;
리간드를 변형된 면역글로불린과 접촉시키는 단계; 및
검출 가능한 표지로부터의 신호를 결정함으로써, 리간드를 검출하는 단계.
실시양태 28. 다음을 포함하는 변형된 면역글로불린:
아밀로이드-반응성 펩티드로서, 서열 번호 1-14에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, 아밀로이드-반응성-펩티드; 및
항체 또는 이의 면역학적 활성 단편으로서, 항체는 서열 번호 17에 제시된 CDRH1, 서열 번호 18에 제시된 CDRH2, 서열 번호 19에 제시된 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
및 서열 번호 20에 제시된 CDRL1, 서열 번호 21에 제시된 CDRL2 및 서열 번호 22에 제시된 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편.
실시양태 29. 제28항에 있어서, 아밀로이드 반응성 펩티드가 서열 번호 1 또는 서열 번호 2를 포함하는, 변형된 면역글로불린.
실시양태 30. 실시양태 28 또는 29에 있어서, 아밀로이드 반응성 펩티드가 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 경쇄의 N 말단에 결합되는, 변형된 면역글로불린.
실시양태 31. 실시양태 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 아밀로이드 반응성 펩티드가 링커에 의해 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 경쇄의 N-말단에 결합되는, 변형된 면역글로불린.
실시양태 32. 실시양태 28 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편이 Fc 영역을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
실시양태 33. 실시양태 28 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 항체가 키메라 또는 인간화 항체인, 변형된 면역글로불린.
실시양태 34. 실시양태 28 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 프레임워크 서열을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
실시양태 35. 실시양태 28 내지 34 중 어느 하나의 변형된 면역글로불린을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 아밀로이드증을 치료하는 방법.
실시양태 36. 실시양태 28 내지 34 중 어느 하나의 변형된 면역글로불린을 제조하는 방법으로서, 숙주 세포를 변형된 면역글로불린을 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로 형질전환하는 단계, 및 변형된 면역글로불린을 생산하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 37. 실시양태 1 내지 4, 11 내지 13, 또는 28 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 변형된 면역글로불린이 rVλ6Wil, Aβ, Aβ(1-40), IAAP, ALκ4, Alλ1 또는 ATTR 피브릴에 결합하는, 변형된 면역글로불린.
실시양태 38. 실시양태 1 내지 4, 11 내지 13, 또는 28 내지 34 중 어느 하나의 변형된 면역글로불린을 인코딩하는 핵산.
실시양태 39. 실시양태 38의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
실시양태 40. 제39항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 숙주 세포.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 이의 범위를 제한하는 임의의 방식으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시 및 당업자에게 일반적인 수준의 기술에 비추어, 하기 실시예는 단지 예시적인 것으로 의도되고, 다수의 변화, 변형 및 변경이 현재 개시된 주제의 범위를 벗어나지 않고 이용될 수 있음을 당업자는 인식할 것이다. 첨부된 도면은 본 개시의 명세서 및 기재의 통합 부분으로 고려됨이 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다음의 약어가 적용된다: eq(당량); M(몰 농도); μM(마이크로몰 농도); N(노르말 농도); mol(몰); mmol(밀리몰); μmol(마이크로몰); nmol(나노몰); g(그램); mg(밀리그램); kg(킬로그램); μg(마이크로그램); L(리터); mL(밀리리터); μl(마이크로리터); cm(센티미터); mm(밀리미터); μm(마이크로미터); nm(나노미터); ℃(섭씨 도); h(시간); min(분); sec(초); msec(밀리초).
실시예 1. 아밀로이드 침착물의 표적화 및 제거를 위한 친아밀로이드성 펩티드에 융합된 면역글로불린의 생성 및 사용
소개: 면역글로불린-펩티드 융합 작제물은 다른 단백질 또는 펩티드를 포함하는 Ig로 이루어진 합성 생체분자이다. Ig는 관심 펩티드에 두 가지 주요 이점; 주로, Ig와 신생아 Fc-수용체의 상호작용으로 인한 아밀로이드-반응성 펩티드의 혈장 반감기의 증강, 및 두 번째로, 막-결합 Fc-수용체를 통한 상호작용 및 보체의 결합을 통해 효과기 면역 세포와 결합하고 활성화하는 능력을 부여한다. 아밀로이드 침착물의 표적화 및 제거(예를 들어, 제거)를 위한 융합 펩티드 항체를 생성하기 위해, 본 발명자들은 펩티드 아미노산 서열 및 스페이서 요소를 Ig 경쇄 단백질의 N-말단에 결합시킴으로써 합성 친아밀로이드성 펩티드 p5(서열 번호 1)를 뮤린 IgG2a에 포함하는 뮤린 Ig-펩티드 융합 작제물을 합성했다(도 2).
당업자가 본 개시에 기초하여 이해할 수 있는 바와 같이, 상기 작제물은 본 발명자들이 개발하거나 제안한 임의의 수의 아밀로이드-반응성 펩티드 및 본원에 기술된 바와 같은 임의의 수의 스페이서 서열을 포함할 수 있다(표 1의 것들을 포함함; 또한 WO2016032949 참고). 뮤린 Igp5 융합물을 HEK293T/17 세포에서 생성하고, 시험관내 결합 패널 및 식균작용 검정을 사용하여 이론 증명 데이터를 생성하는 데 사용하고, 아밀로이드증의 마우스 모델을 사용하여, 전신 아밀로이드 침착물과 함께 국소화됨이 나타났다. 종합하면, 이들 데이터는 Ig-펩티드 융합물이 (1) 다수의 형태의 아밀로이드 침착물에 결합하고, (2) 생체내 아밀로이드에 특이적으로 결합하고, (3) 배양된 대식구 검정 시스템을 사용하여, 시험관내에서 아밀로이드 추출물 및 합성 피브릴을 옵소닌화할 수 있음을 입증한다. 본 발명자들은 Ig-펩티드 융합물이 모든 아밀로이드 침착물 및/또는 과황산화된 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에서 발견되는 단백질 피브릴에 아밀로이드-반응성 펩티드를 통해 결합하는 작용 모드를 기대한다. 그 후, Fc 영역은 보체를 고정하고, 대식구 및 그 후 아밀로이드를 제거할 수 있는 Fc 수용체를 발현하는 다른 세포를 연루시킬 수 있다. 도 3은 이러한 공정의 개략도를 도시한다.
물질 및 방법: Igp5 중쇄 작제물의 경우, 뮤린 IgG2a 중쇄의 CH2(불변 중쇄 도메인 2) 및 CH3(불변 중쇄 도메인 3) 도메인을 코딩하는 pFUSE-mIgG2A-Fc 벡터를 InvivoGen(San Diego, CA)으로부터 구입했다. 뮤린 11-1F4 Ig의 서열로부터 유래된 뮤린 중쇄 VH(가변 중쇄) 및 CH1(불변 중쇄 도메인 1) 도메인에 대한 cDNA를 합성하고(Genscript, Piscataway, NJ), 5' 분비 리더 및 Fc 영역의 CH2/CH3 도메인과 같은 프레임으로 벡터에 클로닝했다. Igp5 경쇄 작제물의 경우, 펩티드 p5에 대한 cDNA(서열 번호 1)를 5' 분비 리더, 15개 아미노산 5' 스페이서(서열 번호 23) 및 5개 아미노산 3' 스페이서(서열 번호 24)에 이어서 뮤린 11-1F4 VL(가변 경쇄) 및 CL(불변 경쇄) 영역을 인코딩하는 서열과 함께 합성하고(Genscript) pcDNA3.1-Hygro(+) 벡터에 클로닝했다. Igp5 경쇄 작제물의 아미노산 서열은 서열 번호 25에 제공되어 있다. 벡터는 Ig-결핍 혈청을 갖는 배지에서 배양된 HEK293T/17 세포주에 일시적으로 형질감염시켰다. 분비된 Igp5를 단백질 A-접합 매트릭스를 사용하여 배지로부터 정제했다. 정제된 Igp5와 합성 아밀로이드 피브릴의 결합은 풀다운 검정을 사용하여 입증되었다. 생체내 뮤린 AA 아밀로이드와의 반응성을 요오드-125(125I)-표지 Igp5를 사용하여 마이크로자가방사선사진, 조직 생물분포 측정 및 소동물 SPECT/CT 조영에 의해 평가했다. 합성 피브릴의 Igp5-매개된 식균작용은 정량적 pHrodo-적색 형광 검정에서 THP-1 인간 대식구 세포를 사용하여 시험관내에서 측정했다.
결과: Fcp5 융합물은 약 1-4 μg/배양 배지 ㎖로 HEK 세포주 둘 다에서 발현되었다. 풀다운 검정을 위해, Igp5를 125I로 표지했다. 환원 및 비-환원 조건을 사용하는 겔 전기영동을 사용하여 Igp5 작제물에서 중쇄 및 경쇄 모두의 존재를 나타내었다(도 4).
풀다운 검정을 사용하여 125I-Igp5는 재조합 아밀로이드형성 λ6 가변 도메인 단백질(rVλ6Wil; 표 2)로 이루어진 합성 피브릴에 결합하는 것으로 나타났다. 반응성은 피브릴 펠렛 내 방사성표지된 물질의 존재에 의해 입증된 바와 같이 70% 초과였다.
표 2.
Figure pct00002
AA 아밀로이드를 갖는 마우스에서, 125I-Igp5는 조직 생물분포 측정에 의해 입증된 바와 같이 간 및 비장 내의 아밀로이드 침착물(이들 마우스에서 가장 큰 아밀로이드 침착물 부위)에 특이적으로 결합했다(도 5). 특히, 건강한 아밀로이드-비함유 마우스에서는 이들 기관에서 125Igp5의 보유가 없었다(도 5). 마이크로자가방사선사진에서 모든 기관 및 조직(도시되지 않음)에서 더 적은 아밀로이드 침착물에서의 흡수가 관찰되었다. IV 주사 20시간 후, AA 마우스 및 건강한 아밀로이드-비함유 대조군의 SPECT/CT 조영은, 125I-Igp5가 AA 마우스의 간 및 비장에서 흡수됨을 확인했고; 그러나, WT 마우스에서는 입증된 바와 같이 혈액 풀에서만 흡수되었다(도 6).
마지막으로, Igp5는 시험관내에서 pHrodo 녹색-표지 합성 경쇄 아밀로이드 피브릴의 식균작용을 효과적으로 매개했다(도 7).
논의: 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 Ig 경쇄의 N-말단에 기능적 펩티드를 융합시킴으로써 증강된 리간드 결합 특성을 갖는 기능적 Ig 분자를 생성할 수 있음을 입증했다. 또한, 본 발명의 데이터는 아밀로이드 반응성 펩티드를 Ig 경쇄에 융합시킴으로써, 시험관내 및 생체내 아밀로이드에 특이적으로 결합하고, 옵소닌화 시약으로서 작용할 수 있고 대식구에 의한 아밀로이드 흡수를 증강시킬 수 있는 Ig-펩티드 융합물을 생성할 수 있음을 나타낸다. Igp5 융합물, 또는 다른 친아밀로이드성 펩티드를 이용하는 유사한 작제물은 아밀로이드 침착물로 면역학적 활성 생체분자(Ig)를 표적화하고 그에 의해 면역계의 세포(대식구 및 호중구)에 의한 환자에서의 아밀로이드의 제거를 촉진하기 위한 신규한 시약을 제공할 수 있다. 이들 시약은 전부는 아니더라도 많은 형태의 아밀로이드 질환을 가진 환자에게 범-아밀로이드 반응성과 이점을 제공할 수 있다. 또한, 적절한 방사성핵종으로 표지된 경우, 이들 시약은 또한 SPECT 내지 PET 조영에 의해 환자에서 아밀로이드 침착물을 검출하는 데 사용될 수 있고, 비표지된 Ig-펩티드 융합 시약을 사용한 요법 전에 요법에 대한 반응의 모니터링, 또는 환자의 계층화를 위해 사용될 수 있다.
실시예 2. 아밀로이드 피브릴에 대한 Ig-펩티드 융합물의 결합.
본 실시예는 다양한 아밀로이드-관련 기질에 대한 Igp5의 결합을 보여준다. 본 실시예는 또한 마우스 조직에서의 펩티드-Ig 융합물을 보여준다.
물질 및 방법
펩티드 p5에 융합된 Igκ LC 서열을 포함하는 펩티드-Ig 융합물을 벡터에서 발현시켰다. IgG1 가변, IgG1 CH1, 및 IgG2a CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgHC 서열을 제2 벡터 시스템에서 발현시켰다. 벡터는 HEK 293T/17 세포 내로 공동-형질감염시켰고, Ig 생성물은 단백질 A-접합 비드를 사용하여 단리했다. Igp5 및 Ig 대조군을 125I로 방사성표지하고 겔 전기영동에 의해 분석했다. 125I-Igp5 및 Ig 대조군과 합성 아밀로이드 피브릴 및 아밀로이드 추출물의 결합은 풀다운 검정을 사용하여 평가했다. 조직 보유를 평가하기 위해, 125I-Igp5를 건강한(WT) 마우스 및 중증 전신 혈청 알부민 단백질 A(AA) 아밀로이드증을 가진 마우스(H2/IL-6 트랜스제닉) 내로 정맥내 주사했다. 이어서 125I-Igp5의 조직 국소화를 마이크로자가방사선사진(ARG)에 의해 평가했다.
결과
Igp5를 HEK 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 비드를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 예비 분석을 위해 125I로 방사성표지했다. 125I-표지 Igp5를 환원 및 비-환원 조건 모두에서 SDS-PAGE에 의해 분석했다. 뮤린 11-1F4(IgG1κ)를 Ig 대조군으로 사용했다. p5 펩티드 단독도 비교로 분석했다. 도 8은 정제된 125I-Igp5의 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 정제된 Igp5는 겔 전기영동 후 중쇄 및 경쇄 모두를 갖는 온전한 Ig로서 나타났다.
125I-Igp5 및 Ig 대조군의 합성 아밀로이드 피브릴 및 아밀로이드 추출물에 대한 결합을 풀다운 검정을 사용하여 평가했다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 125I-Igp5는 다양한 아밀로이드 관련 기질에 결합한다. 125I-m11-1F4는 κ4-펩티드-코팅 비드에 결합했지만 rVλ6Wil 피브릴에는 결합하지 않은 반면, 125I-Igp5는 양쪽 기질에 모두 결합했다. 125I-Igp5는 rVλ6Wil 및 Aβ(1-40) 아밀로이드-유사 피브릴에 약 64%(대조군 Ig인 뮤린 11-1F4보다 21배 더 높음)로 결합했다. 아밀로이드 추출물에 대한 결합 역시 10-30배 더 높았고 125I-p5와 양의 상관관계가 있었다(r = 0.9, p = 0.01). 다양한 합성 아밀로이드 피브릴 및 아밀로이드 추출물에 대한 125I-Igp5의 결합은 m11-1F4에 비해 크게 증강되고, 반응성은 p5 펩티드 단독의 반응성과 상관관계가 있어서, 결합이 펩티드에 의해 유도됨을 나타낸다.
생체 내에서 IgP5의 보유에 대해 평가하기 위해, 건강한(WT) 마우스 및 중증 전신 혈청 알부민 단백질 A(AA) 아밀로이드증을 갖는 마우스(H2/IL-6 트랜스제닉) 내로 125I-Igp5를 정맥내 주사했다. 다양한 조직에 걸친 125I-Igp5의 국소화는 마이크로자가방사선사진(ARG)에 의해 평가했다. 콩고 레드 염색을 사용하여 아밀로이드 침착물을 염색했다. 도 10의 패널 A에 나타낸 바와 같이, ARG 및 콩고 레드 염색은 마우스에서의 간비장 AA 아밀로이드에서 125I-Igp5의 특이적 보유뿐만 아니라 다른 조직에서의 아밀로이드 결합을 입증한다. 도 10의 패널 B에 나타낸 바와 같이, 혈액 풀이 125I-Igp5의 유일하게 확인된 공급원이었던 WT 마우스에서는 아밀로이드-비함유 조직과 특이적 반응성이 관찰되지 않았다.
이러한 결과는 Igp5가 많은 형태의 아밀로이드에 결합하고, 생체내 아밀로이드를 특이적으로 표적화한다는 것을 보여준다.
실시예 3. 항-아밀로이드 항체의 인간화
하기 실시예는 인간화 항-아밀로이드 항체의 생성을 설명한다.
물질 및 방법
모 항체 및 펩티드 아미노산 서열
뮤린 항체 m11-1F4를 모 항체로 사용하여 인간화 항체를 생성했다. 경쇄의 N-말단에 융합된 펩티드 p5를 갖는 모 뮤린 항체를 "mIgG-p5"로 명명했다. N-말단에서 C-말단으로, mIgG-p5 경쇄는 항체 경쇄에 융합된 아미노산 스페이서 서열, p5 펩티드 서열, 다른 아미노산 스페이서 서열, 및 분비 리더 서열을 포함했다(도 11a 및 도 11b 참고).
p5의 아미노산 서열은 서열 번호 1(표 1 참고)에 제시된다.
항체 인간화
인간화 항체는 다음과 같이 생성하였다. 먼저, m11-1F4의 가변 도메인 서열을 분석했다. 상보성 결정 영역(CDR), 초가변 루프 및 프레임워크 영역(FR)을 확인했다. m11-1F4의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열은 하기 표 3에 제시된다. CDR, FR, 및 VH-VL 계면에서의 잔기의 아미노산 서열을 또한 도 12에 나타낸다.
표 3.
Figure pct00003
다음으로, 상동성 모델링을 수행하여 마우스 항체의 모델링된 구조를 얻었다. 상동성 모델은 맞춤형 빌드 상동성 모델(Build Homology Models) 프로토콜을 사용하여 구축했다. 디설피드 가교를 특정하고 연결하였다. 루프는 2산 최적화 단백질 에너지(DOPE) 방법을 사용하여 최적화했다.
프레임워크 잔기의 용매 접근 가능 표면적을 계산했다. 이 결과에 기초하여, 매몰 프레임워크 잔기를 확인했다. 용매 접근 가능 표면적이 15% 미만인 잔기를 매몰 잔기로 간주했다.
다음으로, 마우스 대응부와 가장 높은 서열 동일성을 공유하는 VH 및 VL 서열 각각에 대한 하나의 인간 수신체를 선택했다(표 4A-4B 참고). 마우스 항체의 CDR을 인간 수용체 프레임워크에 직접 그래프팅하여, 어떠한 역돌연변이 없이 그래프팅된 항체의 서열을 얻었다. 이들 서열을 "VH1" 및 "VL1"로 명명한다(하기 표 6A-6B 참고).
표 4A.
Figure pct00004
표 4B.
Figure pct00005
다음으로, 단계 5에서 확인된 중요 잔기를 그래프팅된 VH1 및 VL1 및 마우스 VH 및 VL의 서열에서 비교했다. 그래프팅된 및 마우스 항체 프레임워크 서열에서 상이한 모든 중요 잔기(즉, 추정 역-돌연변이 부위)를 확인했다.
다음으로, 하나 이상의 역돌연변이를 하기 지침에 따라 단계적 방식으로 그래프팅된 항체 서열에 포함시켰다: (1) 면역 반응을 유도할 가능성이 낮은 매몰 잔기를 역돌연변이를 위해 선택하였다; (2) 또한 CDR의 근처에 있는 매몰 잔기를 더 높은 우선순위로 역돌연변이를 위해 선택하였다; 그리고 (3) 다른 매몰 FR 잔기를 낮은 우선순위로 역돌연변이를 위해 선택하였다.
마지막으로, VH 또는 VL의 N-말단으로부터 계수된 바와 같이, 잔기 D54, G55 또는 M64에서 인간화 중쇄 가변 영역 VH9의 CDR에, 그리고 잔기 N33 또는 G34에서 인간화 경쇄 가변 영역 VL4의 CDR에 추가 돌연변이를 도입했다. 이들 돌연변이는 번역 후 변형 부위를 제거하도록 설계되었고, 하기 표 6A-6B에 기재된다.
표면 플라즈몬 공명(SPR)
m11-1F4 항체에 대한 천연 리간드인 Vκ4Len(1-22)("Len(1-22) 단량체") 단량체 펩티드에 결합하는 인간화 항-아밀로이드 항체의 친화성을 Biacore 8K 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템을 사용하여 측정했다. 모 항체 m11-1F4는 변성된 카파 4 경쇄 단백질의 N-말단에 존재하는 에피토프에 결합한다. Len(1-22) 단량체는 국제 출원 번호 PCT/US2017/015905에 기재된 바와 같이, 이 에피토프를 포함하는 펩티드이다. 추가 돌연변이를 갖는 VH9 및 VL4 버전을 포함하여, 인간화 중쇄 영역 VH9 및 인간화 경쇄 VL4를 포함하는 항-아밀로이드 항체의 결합 친화성을 시험했다(표 5).
모든 SPR 데이터는 Biacore 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 처리했다. 플로우 셀 1 및 각 사이클에서 완충액의 블랭크 주입을 반응 단위 감산에 대한 이중 참조로 사용하였다. SPR 실험을 위한 추가 실험 조건은 하기의 표 3에 제공된다.
표 5.
Figure pct00006
결과
인간화 VH 및 VL 서열을 갖는 항체는 m11-1F4로부터 유래되었다. 인간화 VL 서열을 VL1-VL4로 지정하고, 인간화 VH 서열을 VH1-VH10으로 지정했다. 인간화 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 하기 표 6A-6B에 제공된다. 표 6A-6B에서, CDR 서열은 밑줄치고, VL4 및 VH9에 도입된 추가 돌연변이 및 역돌연변이된 잔기는 볼드화되고, 이탤릭화된다. VL4 및 VH9에 도입된 추가 돌연변이는 표 6A 및 6B의 IgG 컬럼에 기재된다; 이들 돌연변이는 VL 또는 VH의 N-말단에 대해 넘버링된다. VL4 및 VH9의 변이체는 변형된 CDR로 생성하였고, 이들 CDR 서열은 VL4 및 VH9에 비해 표 6C 및 6D에 제시된다.
표 6A.
Figure pct00007
표 6B.
Figure pct00008
Figure pct00009
표 6C.
Figure pct00010
표 6D.
Figure pct00011
인간화 및 모 VL 서열의 아미노산 서열 동일성을 서열 정렬에 의해 비교했다. 112 잔기 VL 서열 중, VL4는 m11-1F4에 대해 91.1% 동일성을 가졌고, VL3은 m11-1F4에 대해 93.8% 동일성을 가졌고, VL3은 VL4에 대해 98.1% 동일성을 가졌다.
인간화 항-아밀로이드 항체의 결합 친화성
표 7은 Len(1-22) 단량체 펩티드에 대한 인간화 항-아밀로이드 항체의 결합을 측정하는 SPR 검정의 결과를 제공한다. 구체적으로, 표 7의 "리간드" 열에 표시된 바와 같이, 추가 아미노산 치환이 있거나 없는 인간화 VH9 및 VL4 서열을 시험했다.
표 7.
Figure pct00012
실시예 4. 펩티드 p5에 융합된 항-아밀로이드 항체의 아밀로이드 피브릴 및 세포 추출물에 대한 결합
하기 실시예는 인간화 항-아밀로이드 항체의 아밀로이드 피브릴 및 인간 AL 및 ATTR 아밀로이드 추출물에 결합하는 능력을 시험하는 효소-결합 면역흡착 검정 및 풀다운 실험을 기술한다.
물질 및 방법
시험된 항아밀로이드 항체
실시예 3에 기재된 바와 같이 인간화 항-아밀로이드 항체를 사용했다. 또한 라이신("p5") 또는 아르기닌("p5R") 잔기를 갖는 펩티드 p5의 변이체를 경쇄의 N-말단에 융합시키고, VH6/VL3-p5, VH6/VL3-p5R, VH9/VL4-p5, 및 VH9/VL4-p5R을 생성했다. p5R의 아미노산 서열은 서열 번호 2(표 1 참고)에 제시된다.
유로퓸-결합 면역흡착 검정(EuLISA)
유로퓸-결합 면역흡착 검정(EuLISA)을 수행하기 위해, rVλ6Wil 피브릴(초음파분쇄됨)의 현탁액을 인산염 완충 식염수(PBS)에서 0.83 μM로 제조했다. 피브릴을 각 웰에 50 μL를 첨가하여 96-웰 마이크로플레이트의 웰 상에 코팅했다. 플레이트를 하룻밤 37℃에서 건조했다. 마이크로플레이트의 웰을 200 μL/웰을 사용하여 슈퍼블록(Superblock)(Thermofisher)(SB)을 첨가하여 차단하고 37℃에서 1시간 동안 방치했다. 일차(시험) 항체(즉, 인간화 항체)를 첨가하고, 100 μL/웰을 사용하여 1 μM로 시작하는 1:2 희석 시리즈에서 SB + 0.05% tween 20(SBT) 중에 제조했다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세척 단계(플레이트를 PBS + 0.05% tween 20을 사용하여 3회 세척함) 후, 2차 항체를 100 μL/웰로 SBT 중 비오틴화된 염소 항-인간 IgG(Sigma)의 1:3000 희석액으로 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 다른 세척 단계 후에, SBT 중 유로퓸/스트렙타비딘(Perkin Elmer)의 1:1000 희석액 100 μL/웰을 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 최종 세척 단계 후, 100 μL/웰의 유로퓸 증강 용액(Perkin Elmer)을 첨가했다. 시간 분해 형광 방출을 마이크로플레이트 판독기(Wallac)를 사용하여 검출하였다.
풀다운 결합 검정
rVλ6Wil로부터 합성 아밀로이드 피브릴을 제조하기 위해, 인산염-완충 식염수(PBS) 중 1 mg/mL의 단량체, 0.01% w/v NaN3, pH7.5를 함유하는 1 mL-부피를 0.2 mm 기공-크기 필터를 통해 여과하고, 15 mL 원뿔형 폴리프로필렌 튜브(BD BioSciences, Bedford, MA)에 첨가하고, 반응 혼합물이 불투명해질 때까지 225 rpm에서 3 내지 5일 동안 37℃에서 45°각도로 진탕했다.
정제된 인간 아밀로이드 조직 추출물은 변형 없이 Pras 등(Pras, M. et al. J Clin Invest. 1968 Apr; 47(4): 924-933)에 기재된 바와 같이 물 부유법을 사용하여 경쇄-(AL) 또는 트랜스티레틴-연관(ATTR) 아밀로이드증 환자로부터의 부검-유래 조직을 사용하여 제조했다. 물 세척에서 단리된 정제된 아밀로이드 물질 및 아밀로이드 풍부 펠렛을 수집하여 사용할 때까지 RT에서 동결건조 보관하였다.
풀다운 검정을 위해 25 마이크로리터의 1 mg/mL AL 추출물, 또는 합성 rVλ6Wil 가변 도메인 피브릴(Wall, J. et al. Biochemistry 38 (1999) 14101-14108)을 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 21,000 x g로 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 버리고 펠릿을 0.05% tween-20(PBST)으로 200 μL의 PBS에 재현탁했다. 125I-p5+14의 1:100 희석액 10마이크로리터(분당 약 100,000 카운트(CPM); 약 5 ng 펩티드) 스톡을 현탁액에 첨가했다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 회전시켰다. 이어서, 샘플을 15,000 x g에서 10분 동안 2회 원심분리했다. 상청액 및 펠릿을 각 단계 후에 분리하고, 각각의 방사활성을 1분 획득으로 Cobra II 감마 카운터(Perkin Elmer)를 사용하여 측정했다. 펠렛에 결합된 125I-p5+14의 백분율을 다음과 같이 결정했다:
펠렛 CPM / (펠렛 CPM + 상청액 CPM) x 100
결과
EuLISA
rVλ6Wil 피브릴에 결합하는 인간화 항-아밀로이드 항체의 능력을 EuLISA에 의해 시험했다(도 13a). 도 13a에 제시된 데이터에 기초하여, c11-1F4는 약 72 nM의 EC50 값으로 결합했고, VH10/VL4는 17 nM의 EC50 값으로 결합했으며, VH9/VL4는 7 nM의 EC50 값으로 결합했고, VH8/VL4는 16 nM의 EC50 값으로 결합했고, VH7/VL4는 75 nM의 EC50 값으로 결합했고, VH6/VL3은 95 nM의 EC50 값으로 결합했다. VH9/VL4는 c11-1F4에 비해 증가된 결합을 나타냈다(도 13a). VH9/VL4 항체는 VH6/VL3보다 더 큰 정도로 아밀로이드 피브릴에 결합했다(도 13a). 추가 개발을 위해 VH9/VL4 및 VH6/VL3을 선택했다.
도 13B에 제시된 바와 같이, VH6/VL3의 경쇄의 N-말단으로의 펩티드 p5 및 p5R의 첨가는 rVλ6Wil 피브릴에 대한 결합을 약 30배(EC50에 기초하여) 증강시켰다. 도 13b에 제시된 데이터에 기초하여, VH6/VL3-p5는 3 nM의 EC50 값으로 결합했고, VH6/VL3-p5R은 3 nM의 EC50 값으로 결합했고, c11-1F4는 약 100 nM의 EC50 값으로 결합했고, VH6/VL3은 95 nM의 EC50 값으로 결합했다.
일반적으로, p5의 아르기닌 변이체(p5R)를 갖는 변이체는 p5 변이체보다 우수했다(도 13c 및 도 13d). 이 결과는 펩티드 단독의 이전 연구와 일치했다(Wall, J.S. et al. PLoS One. 2013 Jun 4;8(6):e66181).
도 13e에 나타낸 바와 같이, VH9/VL4는 뮤린 모체와 동일한 rVλ6Wil 피브릴에 대한 반응성을 가졌다.
도 13e 및 도 13f에 나타낸 바와 같이, VH6/VL3-p5 및 VH6/VL3-p5R 둘 모두는 hATTR 아밀로이드 추출물에 대한 결합을 나타냈다. 도 13e 및 도 13f의 데이터에 기초하여, VH6/VL3-p5는 Sno hATTR 추출물에 50 nM의 EC50 값으로, 및 Ken ATTR 추출물에 90 nM의 EC50 값으로 결합했고, VH6/VL3-p5R은 Sno ATTR 추출물에 47 nM의 EC50 값으로, Ken ATTR 추출물에 70 nM의 EC50 값으로, 및 125 wtATTR에 85 nM의 EC50 값으로 결합했다.
하기 표 8은 mIgp5, hIgG1, c11-1F4, m11-1F4, VH6/VL3-p5, VH9/VL4-p5, 및 VH9/VL4-p5R이 rVλ6Wil 피브릴, Per125 wtATTR 추출물, KEN hATTR 추출물, SHI ALλ 간 추출물 및 TAL ALκ 간 추출물에 결합하는 능력을 측정하는 ELISA의 결과를 제공한다. 항체 및 기질의 각각의 조합에 대해, 로그-변환 EC50, EC50, 및 검정에서의 최대 결합 수준을 나타낸다. "na"라고 표시된 조건은 시험되지 않았다.
표 8에 나타낸 바와 같이, p5 또는 p5R에 융합된 인간화 항-아밀로이드 항체는 다양한 아밀로이드 피브릴 및 아밀로이드 추출물에 결합할 수 있었다. VH6/VL3-p5, VH9/VL4-p5 및 VH9/VL4-p5R은 m11-1F4 및 모든 다른 대조군 항체보다 더 높은 친화성(EC50 측정 기준)으로 시험된 모든 피브릴 및 추출물에 결합했다. VH9/VL4-p5R은 일반적으로 VH9/VL4-p5보다 낮은 EC50을 나타내었고, VH9/VL4-p5는 일반적으로 VH6/VL3-p5보다 낮은 EC50을 나타내었다.
표 8.
Figure pct00013
Figure pct00014
풀다운 실험
기질을 면역침전시키는 항-아밀로이드 항체의 능력을 조사했다. mIgG-p5는 풀다운 검정에서 Wil 피브릴 및 아밀로이드 추출물에 대한 우수한 결합을 산출했다(도 14).
VH9/VL4 모체 및 변이체 능력은 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 mIgp5에 비해 상당히 감소했다. 표 9에서, 나타낸 값은 결합%이고, 데이터가 없는 세포는 시험되지 않은 항체/기질 조합을 나타낸다.
표 9.
Figure pct00015
실시예 5. 펩티드 p5에 융합된 항-아밀로이드 항체 및 생체외 식균작용
하기 실시예는 옵소닌으로서 작용하는 인간화 항-아밀로이드 항체의 능력을 시험하는 실험을 기재한다. 구체적으로, 항-아밀로이드 항체의 존재 하에 아밀로이드 피브릴의 생체외 식균작용 수준을 측정했다.
물질 및 방법
생체외 식균작용
고상 Wil 피브릴 흡수의 검정을 위해, 24웰 조직 배양 플레이트를 I형 래트 콜라겐(20 mM 아세트산 중 75 μg/ml, 0.4 ml)으로 실온에서 2시간 동안 코팅하고, 0.5 ml PBS로 세척하고, 20 μg/웰의 pHrodo 적색-표지 rVλ6 피브릴(30% 표지된 분획)로 4℃에서 0.5 ml PBS 중에서 하룻밤 코팅했다. 웰을 0.5 ml PBS로 세척하고, 0.5 ml 무혈청 페놀 레드-비함유 RPMI 1640을 첨가했다. 항체 옵소닌을 5 μg/웰로 첨가한 후, 혈청-비함유, 페놀-레드 비함유 RPMI 1640 중 RAW 264.7 또는 비유도 THP-1 세포(0.5 ml 중 1.2 X 106)를 즉시 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 흡수 측정을 위해, 각각의 웰로부터의 세포를 웰-스캐닝 모드에서 530/25 nm 여기 및 645/40 nm 방출로 BioTek SynergyHT-1 마이크로플레이트 판독기에서의 형광 측정을 위해 검은색 플라스틱/투명 바닥 96 웰 마이크로플레이트(Corning)의 웰로 3개씩 옮긴다. 1 ml의 배지 단독에서 인큐베이션된 웰로부터의 배경 판독치를 감산하여 상대 형광 단위를 수득했다.
결과
인간화 항-아밀로이드 항체가 아밀로이드 피브릴에 대한 옵소닌으로서 작용하는(즉, 아밀로이드 피브릴의 식균작용을 촉진하는) 능력을 시험했다.
VH9/VL4-p5 및 VH9/VL4-p5R은 VH6/VL3-p5 및 VH6/VL3-p5R보다 더 rVλ6Wil 피브릴 흡수를 촉진하였고, 이는 상기 기재된 ELISA 결합 데이터의 차이와 일치했다(도 15a 및 도 15b 참고). 펩티드가 없는 VH9/VL4는 도 15c에 나타낸 바와 같이, p5 또는 p5R이 부착된 VH6/VL3과 대략 동일하게 우수했고, 펩티드가 없는 VH6/Vl3보다 여러 배 더 우수했다.
VH9/VL4 단독은 c11-1F4보다 더 우수한 옵소닌이었다(도 15b).
VH6/VL3-p5 및 VH6/VL3-p5R은 mIgp5와 동등한 수준의 피브릴 흡수를 촉진했고, c11-1F4보다 더 우수했다(도 15a). VH9/VL4-p5 및 VH9/VL4-p5R은 또한 mIgp5와 동등한 수준의 피브릴 흡수를 촉진했고, c11-1F4보다 더 우수했다(도 15b).
놀랍게도, p5 또는 p5R 펩티드에 접합된 인간화 항-아밀로이드 항체는 c11-1F4보다 유의하게 더 우수한 옵소닌화를 제공했다.
실시예 6. 야생형 마우스에서 VH9/VL4의 약동학 측정
하기 실시예는 야생형 마우스에 투여된 VH9/VL4의 약동학 평가를 기재한다.
물질 및 방법
VH9/VL4 투여
VH9/VL4를 125I로 표지하고 야생형 마우스에 투여했다.
결과
125I-표지 VH9/VL4를 야생형 마우스에 투여하고, 경시적으로 존재하는 125I-표지 VH9/VL4의 수준을 측정했다(도 16).
선형 제거 성분(도 16에서 더 큰 점)을 곡선에 피팅함으로써, 반감기는 (-0.693/-기울기): t1/2 = 173.5시간(7일)으로 계산되었다.
전체 곡선(도 16에서의 점선으로 더 작은 점)을 이중 지수 감쇠에 피팅함으로써, 반감기는 (-0.693/-k2): t1/2 = 86.6시간(3.6일)으로 계산되었다.
실시예 7. 야생형 마우스에서의 VH9/VL4 생체분포
하기 실시예는 야생형 마우스에 투여된 p5 또는 p5R에 접합된 VH9/VL4의 생체분포 평가를 기재한다.
물질 및 방법
VH9/VL4-p5 또는 VH9/VL4-p5R을 야생형 마우스에 투여하고, 주사 48시간 후 근육, 간, 췌장, 비장, 좌우 신장, 위, 상장, 하장, 심장, 폐 및 혈액에 존재하는 항체의 수준을 측정했다(도 17a 및 도 17b).
결과
야생형 마우스에서 VH9/VL4-p5(도 17a) 또는 VH9/VL4-p5R(도 17b)의 특이적 축적의 증거는 없었다. 48시간에서의 높은 혈구 풀은 모 IgG에 대한 약동학 추정치와 일치했다. 높은 폐 활성 수준은 안락사 시 혈액 침윤 때문이다.
실시예 8. 펩티드 온전성 및 혈장 안정성의 검증
다음 실시예는 p5 및 p5R에 접합된 인간화 항-아밀로이드 항체의 온전성 및 혈장 안정성을 평가하기 위한 SDS-PAGE 및 펩티드 포획 ELISA 실험을 기재한다.
물질 및 방법
펩티드 포획 ELISA
마우스 혈장에서 VH6/VL3-p5의 안정성을 측정하기 위해 펩티드 포획 ELISA를 수행했다. 100 nm의 VH6/VL3-p5를 4℃ PBS, 37℃ PBS, 37℃ EDTA 혈장 또는 37℃ 헤파린 혈장 중 하나에 첨가하고(도 18), 72시간의 경과에 걸쳐 존재하는 온전한 VH6/VL3-p5의 양을 측정했다. VH6/VL3-p5를 항-인간 Fc-반응성 항체를 사용하여 포획하고 비오틴화된 항-펩티드 p5 mAb를 사용하여 검출했다. 신호를 스트렙타비딘-접합 HRPO를 사용하여 검출하고 플레이트 판독기를 사용하여 정량하였다.
결과
또한, 항-펩티드 p5 모노클로날 항체의 결합 및 헤파린-결합 연구는 펩티드가 IgG 상에 존재한다는 것을 나타냈다(데이터는 나타내지 않음).
마우스 혈장 안정성 검정에서, VH6/VL3-p5의 수준은 신선한 마우스 혈장에서 72시간에 걸쳐 변화하지 않았다(도 18).
서열
모든 폴리뉴클레오티드 서열은 5'→3 방향으로 표시된다. 모든 폴리펩티드 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 도시된다.
11-1F4 VH 서열(서열 번호 15)
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHPNLMSRLSISKDISKSQVLFKLNSLQTDDTATYYCVTLDYWGQGTSVTVSS
11-1F4 VL 서열(서열 번호 16)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
11-1F4 CDR-H1 서열(서열 번호 17)
GFSLSSYGVS
11-1F4 CDR-H2 서열(서열 번호 18)
VIWGDGSTNYHPNLMS
11-1F4 CDR-H3 서열(서열 번호 19)
LDY
11-1F4 CDR-L1 서열(서열 번호 20)
RSSQSLVHRNGNTYLH
11-1F4 CDR-L2 서열(서열 번호 21)
KVSNRFS
11-1F4 CDR-L3 서열(서열 번호 22)
FQTTYVPNT
5' 스페이서 서열(서열 번호 23)
AQAGQAGQAQGGGYS
3' 스페이서 서열(서열 번호 24)
VTPTV
Igp5 경쇄 작제물(서열 번호 25)
AQAGQAGQAQGGGYSKAQKAQAKQAKQAQKAQKAQAKQAKQVTPTVDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
p5-3' 스페이서-11-1F4 VL 서열(서열 번호 26)
KAQKAQAKQAKQAQKAQKAQAKQAKQVTPTVDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
링커 서열(서열 번호 27)
GGGYS
IGKV2-30*02-인간 생식계열 서열(서열 번호 28)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPP
인간 VL 수용체 서열(서열 번호 29)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
IGHV4-4*08- 인간 생식계열 서열(서열 번호 30)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
인간 VL 수신체 서열(서열 번호 31)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDYWGQGTSVTVSS
VL1(서열 번호 32)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL2(서열 번호 33)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL3(서열 번호 34)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL4(서열 번호 35)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL4-N33S(서열 번호 36)
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VL4-N33Q(서열 번호 37)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRQGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL4-N33E(서열 번호 38)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHREGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL4-N33A(서열 번호 39)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRAGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL4-N33H(서열 번호 40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRHGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL4-G34A(서열 번호 41)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRAGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VL4-G34V(서열 번호 42)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHRVGNTYLHWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQTTYVPNTFGGGTKLEIK
VH1(서열 번호 43)
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VH2(서열 번호 44)
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Ig 경쇄의 N-말단(서열 번호 82)
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Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Ala Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Leu Phe 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 59 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Val Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Leu Phe 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 60 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Val 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Leu Phe 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 61 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr 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Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Ala 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Leu Phe 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 64 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 64 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 65 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Gln Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 66 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Glu Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 67 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Ala Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 68 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg His Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 69 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Ala Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Val Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 71 Val Ile Trp Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 Val Ile Trp Gly Gln Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 Val Ile Trp Gly Glu Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 Val Ile Trp Gly Ala Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 75 Val Ile Trp Gly His Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 76 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 76 Val Ile Trp Gly Asp Ala Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 77 Val Ile Trp Gly Asp Val Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Val Ser 1 5 10 15 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 79 Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Ile Ser 1 5 10 15 <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Leu Ser 1 5 10 15 <210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Ala Ser 1 5 10 15 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 82 Pro Thr Gln Thr Met Val Val Asp 1 5

Claims (100)

  1. 변형된 면역글로불린으로서,
    아밀로이드 반응성 펩티드; 및
    인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편으로서, 상기 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 펩티드 및 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편은 Ig 경쇄의 N-말단 단부 및/또는 Ig 중쇄의 N- 및/또는 C-말단 단부에서 함께 결합되는, Ig 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아밀로이드 반응성 펩티드가 서열 번호 1-14에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아밀로이드-반응성 펩티드 및 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편이 Ig 경쇄의 N-말단 단부 또는 Ig 중쇄의 N-말단 단부에서 함께 결합되는, 변형된 면역글로불린.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드-반응성 펩티드와 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편 사이에 스페이서 서열을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함하되, 상기 아밀로이드-반응성 펩티드가 동일한 펩티드 또는 상이한 펩티드인, 변형된 면역글로불린.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편이 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고,
    상기 VL이 서열 번호 20에 제시된 CDRL1, 서열 번호 21에 제시된 CDRL2 및 서열 번호 22에 제시된 CDRL3을 포함하고; 그리고
    상기 VH가 서열 번호 17에 제시된 CDRH1, 서열 번호 18에 제시된 CDRH2, 서열 번호 19에 제시된 CDRH3을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편이 키메라 항체 또는 이의 기능적 단편인, 변형된 면역글로불린.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편이 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 여기서
    a) 상기 VL은 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; 또는
    b) 상기 VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고;
    c) 상기 VL은 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  9. 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 항체 또는 이의 기능적 단편이 인간 프레임워크 서열을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ig 항체가 인간 Fc 영역을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  11. 제1항 내지 제6항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역글로불린은 인간화된 것인, 변형된 면역글로불린.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, rVλ6Wil, Aβ, Aβ(1-40), IAAP, ALκ4, Alλ1 또는 ATTR 피브릴에 결합하는 것인, 변형된 면역글로불린.
  13. 아밀로이드 반응성 펩티드에 융합된 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 항체를 포함하는 항체-펩티드 융합 단백질로서, 상기 항체가 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 VL이 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 항체-펩티드 융합 단백질.
  16. 제13항에 있어서,
    a) 상기 VL이 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; 또는
    b) 상기 VL이 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고;
    c) 상기 VL이 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  17. 제14항 또는 제16항에 있어서,
    상기 VL은
    a. 위치 36에 Tyr;
    b. 위치 37에 Leu;
    c. 위치 46에 Leu;
    d. 위치 85에 Leu; 및
    e. 위치 87에 Phe
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고,
    상기 VH는
    a. 위치 37에 Val;
    b. 위치 48에 Leu;
    c. 위치 67에 Leu;
    d. 위치 68에 Ser;
    e. 위치 71에 Lys;
    f. 위치 76에 Ser;
    g. 위치 78에 Val;
    h. 위치 79에 Leu;
    i. 위치 80에 Phe;
    j. 위치 89에 Thr;
    k. 위치 93에 Val; 및
    l. 위치 94에 Thr
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고,
    상기 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 VL이 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu, 및 위치 87에 Phe을 포함하고, 상기 VH가 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  19. 제17항에 있어서, 상기 VL이 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하고, 상기 VH가 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  20. 제17항에 있어서, 상기 VL이 서열 번호 32-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  21. 제17항 또는 제20항에 있어서, 상기 VH가 서열 번호 43-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  22. 제17항에 있어서, 상기 VL이 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  23. 제17항에 있어서, VL이 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VH가 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드 반응성 펩티드가 서열 번호 1-14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드 반응성 펩티드가 VL의 N-말단 또는 VH의 N-말단에 융합된, 항체-펩티드 융합 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 아밀로이드 반응성 펩티드가 스페이서에 의해 VL의 N-말단에, 또는 VH의 N-말단에 융합된, 항체-펩티드 융합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 스페이서가 펩티드 스페이서인, 항체-펩티드 융합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 스페이서가 아미노산 서열 GGGYS를 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  29. 제13항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, rVλ6Wil, Aβ, Aβ(1-40), IAAP, ALκ4, Alλ1 또는 ATTR 피브릴에 결합하는, 항체-펩티드 융합물.
  30. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물.
  31. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 핵산(들).
  32. 제31항의 핵산(들)을 포함하는 벡터.
  33. 제32항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  34. 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 제33항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질을 제조하는 방법.
  35. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 아밀로이드 관련 장애가 아밀로이드증인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 아밀로이드 관련 장애가 AL, AH, Aβ2M, ATTR, 트랜스티레틴, AA, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALEct2, AFib, ACys, ACal, AMed, AIAPP, APro, AIns, APrP, 또는 Aβ 아밀로이드증으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  39. 아밀로이드 침착물을 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 제거를 위해 아밀로이드 침착물을 표적화하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 아밀로이드 침착물이 제거되는, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 아밀로이드 침착물이 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질에 의해 옵소닌화되는, 방법.
  42. 아밀로이드 침착물을 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 제거를 위해 아밀로이드 침착물을 표적화하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 제거를 위한 아밀로이드 침착물의 표적화가 아밀로이드 침착물의 제거를 초래하는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 제거가 아밀로이드 침착물의 옵소닌화로부터 초래되는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질에서의 아밀로이드 반응성 펩티드의 반감기가 아밀로이드-반응성 펩티드 단독에 비해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상 증가되는, 방법.
  46. 변형된 면역글로불린을 생성하는 방법으로서,
    제1 발현 벡터와 제2 발현 벡터를 제공하는 단계로서,
    상기 제1 발현 벡터는 Ig 항체 경쇄 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하고;
    상기 제2 발현 벡터는 Ig 항체 중쇄 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고;
    상기 제1 발현 벡터 및/또는 상기 제2 발현 벡터는 제1 펩티드를 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하고, 상기 제3 핵산 서열은 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열에 인접하게 배치되는 단계; 및
    상기 제1 및 제2 발현 벡터를 세포에 삽입하는 단계로서, 상기 세포에서 제1 및 제2 발현 벡터의 발현은 제1에 결합된 면역글로불린을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제1 발현 벡터 및/또는 상기 제2 발현 벡터가 제2 펩티드를 인코딩하는 제4 핵산 서열을 포함하고, 상기 제4 핵산 서열은 제1 핵산 서열 및/또는 상기 제2 핵산 서열에 인접하게 배치되는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 세포에서 제1 및 제2 발현 벡터의 발현이 제1 펩티드 및 제2 펩티드에 결합된 면역글로불린을 생성하는, 방법.
  49. 제46항에 있어서, 스페이서 핵산 서열이 제3 핵산 서열과 제1 핵산 서열 및/또는 제2 제1 핵산 서열 사이에 배치되는, 방법.
  50. 아밀로이드계 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    a) 다음에 의해 대상체가 아밀로이드 침착물을 갖는지 여부를 결정하는 단계로서:
    i) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질을 대상체에 투여하고, 변형된 면역글로불린 또는 항체 펩티드 융합 단백질은 검출 가능한 표지를 포함하며, 그리고
    ii) 상기 검출 가능한 표지와 연관된 신호가 대상체로부터 검출될 수 있는지 여부를 결정하는, 단계; 및
    b) 신호가 검출되면, 상기 대상체에게 아밀로이드증 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 신호가 검출되지 않는 경우, 아밀로이드 침착물의 추후 발생에 대해 대상체를 모니터링하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 신호의 강도를 결정하는 단계 및 신호를 임계 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 초과의 값에서 대상체가 아밀로이드 침착물을 갖는 것으로 결정되는, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드증 치료가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 투여가 대상체에서 아밀로이드 침착의 제거를 초래하는, 방법.
  55. 대상체에서 아밀로이드 침착물을 확인하는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 검출 가능한 표지 및 변형된 면역글로불린 또는 항체 펩티드 융합 단백질로부터 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 아밀로이드가 없거나 유의성이 알려지지 않은 모노클로날 감마병증(MGUS), 다발 골수종(MM), 또는 하나 이상의 관련된 형질 세포 질환을 앓고 있는 것으로 결정되는, 방법.
  57. 리간드를 검출하는 방법으로서,
    상기 리간드를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 변형된 면역글로불린 또는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질과 접촉시키는 단계로서, 상기 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 검출 가능한 표지를 포함하고, 상기 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질의 펩티드는 리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 단계, 및
    검출 가능한 표지로부터 신호를 결정함으로써, 리간드를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 인간화 항체로서, 상기 인간화 항체가 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 여기서
    상기 VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 그리고
    상기 VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고,
    상기 VL은
    a. 위치 36에 Tyr;
    b. 위치 37에 Leu;
    c. 위치 46에 Leu;
    d. 위치 85에 Leu; 및
    e. 위치 87에 Phe
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고,
    상기 VH는
    a. 위치 37에 Val;
    b. 위치 48에 Leu;
    c. 위치 67에 Leu;
    d. 위치 68에 Ser;
    e. 위치 71에 Lys;
    f. 위치 76에 Ser;
    g. 위치 78에 Val;
    h. 위치 79에 Leu
    i. 위치 80에 Phe;
    j. 위치 89에 Thr;
    k. 위치 93에 Val; 및
    l. 위치 94에 Thr
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고;
    상기 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 인간화 항체.
  59. 제58항에 있어서, 상기 VL이 위치 36에 Tyr, 위치 37에 Leu, 위치 46에 Leu, 위치 85에 Leu, 및 위치 87에 Phe을 포함하고, 상기 VH가 위치 37에 Val, 위치 48에 Leu, 위치 67에 Leu, 위치 68에 Ser, 위치 71에 Lys, 위치 89에 Thr, 위치 93에 Val, 및 위치 94에 Thr을 포함하는, 인간화 항체.
  60. 제58항에 있어서, 상기 VL이 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하고, 상기 VH가 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함하는, 인간화 항체.
  61. 제58항에 있어서, 상기 VL이 서열 번호 33-42로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항체.
  62. 제58항 또는 제61항에 있어서, 상기 VH가 서열 번호 44-63으로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항체.
  63. 제58항에 있어서, 상기 VL이 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항체.
  64. 제58항에 있어서, 상기 VL이 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항체.
  65. 인간 아밀로이드 피브릴에 결합하는 인간화 항체로서, 상기 인간화 항체가 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 여기서
    a) 상기 VL은 서열 번호 64-70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하거나; 또는
    b) 상기 VL은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, 상기 VH는 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 및 서열 번호 71-81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 인간화 항체.
  66. 제65항에 있어서, VL이
    a. 위치 36에 Tyr;
    b. 위치 37에 Leu;
    c. 위치 46에 Leu;
    d. 위치 85에 Leu; 및
    e. 위치 87에 Phe
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하며,
    상기 VH가
    a. 위치 37에 Val;
    b. 위치 48에 Leu;
    c. 위치 67에 Leu;
    d. 위치 68에 Ser;
    e. 위치 71에 Lys;
    f. 위치 76에 Ser;
    g. 위치 78에 Val;
    h. 위치 79에 Leu;
    i. 위치 80에 Phe;
    j. 위치 89에 Thr;
    k. 위치 93에 Val; 및
    l. 위치 94에 Thr
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고;
    상기 아미노산 위치는 Kabat의 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 인간화 항체.
  67. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 전장 항체, Fab 단편, 또는 scFv인, 인간화 항체.
  68. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 Fc 영역을 포함하는, 인간화 항체.
  69. 제68항에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형의 영역인, 인간화 항체.
  70. 제58항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지에 접합되는, 인간화 항체.
  71. 제58항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, rVλ6Wil 피브릴, Per125 wtATTR 추출물, KEN hATTR 추출물, SHI ALλ 간 추출물, 및/또는 TAL ALκ 간 추출물에 결합하는, 인간화 항체.
  72. 제58항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, rVλ6Wil, Aβ, Aβ(1-40), IAAP, ALκ4, Alλ1 또는 ATTR 피브릴에 결합하는, 인간화 항체.
  73. 제58항 내지 제72항 중 어느 한 항의 인간화 항체를 포함하는 약학 조성물.
  74. 제58항 내지 제73항 중 어느 한 항의 인간화 항체를 인코딩하는 핵산(들).
  75. 제74항의 핵산(들)을 포함하는 벡터.
  76. 제75항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  77. 인간화 항체를 인코딩하는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 제76항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 인간화 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 인간화 항체를 제조하는 방법.
  78. 제58항 내지 제73항 중 어느 한 항의 인간화 항체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 아밀로이드 관련 장애가 아밀로이드증인, 방법.
  80. 제78항에 있어서, 상기 아밀로이드 관련 장애가 AL, AH, Aβ2M, ATTR, 트랜스티레틴, AA, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALEct2, AFib, ACys, ACal, AMed, AIAPP, APro, AIns, APrP, 또는 Aβ 아밀로이드증으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  82. 아밀로이드계 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    제58항 내지 제73항 중 어느 한 항의 인간화 항체를 검출 가능하게 표지하고,
    상기 인간화 항체를 환자에 투여하고,
    검출 가능한 표지와 연관된 신호가 대상체로부터 검출될 수 있는지 여부를 결정하고; 그리고
    상기 신호가 검출되면, 상기 대상체에게 아밀로이드증 치료를 투여하는 것에 의해
    대상체가 아밀로이드 침착물을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 신호가 검출되지 않는 경우, 아밀로이드 침착물의 추후 발생에 대해 대상체를 모니터링하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 신호의 강도를 결정하는 단계 및 신호를 임계 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 초과의 값에서 대상체가 아밀로이드 침착물을 갖는 것으로 결정되는, 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드증 치료가 제58항 내지 제73항 중 어느 한 항의 인간화 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  86. 대상체에서 아밀로이드 침착물을 확인하는 방법으로서, 제58항 내지 제73항 중 어느 한 항의 인간화 항체를 검출 가능하게 표지하는 단계, 인간화 항체를 대상체에 투여하는 단계, 및 인간화 항체로부터의 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 아밀로이드가 없거나 유의성이 알려지지 않은 모노클로날 감마병증(MGUS), 다발 골수종(MM), 또는 하나 이상의 관련된 형질 세포 질환을 앓고 있는 것으로 결정되는, 방법.
  88. 제1항 내지 제12항 중 어느 한항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질에 있어서, 상기 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 검출 가능한 표지에 접합되는, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질.
  89. 제1항 내지 제12항 중 어느 한항의 변형된 면역글로불린 또는 제13항 내지 제29항 중 어느 한 항의 항체-펩티드 융합 단백질에 있어서, 상기 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질은 아밀로이드 반응성 펩티드에 N-말단인 스페이서를 포함하는, 변형된 면역글로불린 또는 항체-펩티드 융합 단백질.
  90. 제16항에 있어서,
    a) VL이 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH가 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 73에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  91. 제90항에 있어서, 상기 VL이 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하고, 상기 VH가 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  92. 제90항에 있어서, 상기 VL이 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드 반응성 펩티드가 서열 번호 1-14로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  94. 제65항에 있어서,
    a) VL이 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH가 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 73에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항체-펩티드 융합 단백질.
  95. 제94항에 있어서, 상기 VL이 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하고, 상기 VH가 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함하는, 인간화 항체.
  96. 제94항에 있어서, 상기 VL이 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 인간화 항체.
  97. 제8항에 있어서,
    a) VL이 서열 번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH가 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 73에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  98. 제97항에 있어서, 상기 VL이 위치 46에 Leu 및 위치 87에 Phe을 포함하고, 상기 VH가 위치 48에 Leu, 위치 96에 Ser, 위치 78에 Val, 위치 79에 Leu, 위치 80에 Phe 및 위치 94에 Thr을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  99. 제97항에 있어서, 상기 VL이 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH가 서열 번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드 반응성 펩티드가 서열 번호 1-14로 구성되는 군에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 면역글로불린.
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