KR20220090296A

KR20220090296A - 가분해성 프로브 및 이를 이용한 미생물을 검출 또는 동정하는 방법

Info

Publication number: KR20220090296A
Application number: KR1020200181346A
Authority: KR
Inventors: 김성호; 김하진; 권태준; 강주헌
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-06-29
Also published as: KR102533260B1

Abstract

본 출원은 가분해성 프로브 및 이를 이용한 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 가분해성 프로브를 기반으로 하는 다중 분석법을 이용하여 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 방법은 매우 신속하고 정확하게 다종의 미생물이 혼합된 시료로부터 1 종 이상의 미생물을 검출 또는 동정할 수 있다.

Description

가분해성 프로브 및 이를 이용한 미생물을 검출 또는 동정하는 방법{Hydrolyzable probe and method for detecting or identifying microorganisms using the same}

가분해성 프로브를 이용하여 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에 관한 것이다.

FISH (Fluorescent in situ Hybridization) 이미징 기반의 미생물 동정은 균종들 간 리보솜 RNA 시퀀스의 차이에 민감한 FISH 프로브를 제작하여 배양을 거치지 않고 형광 이미징으로 각 균종의 존재를 확인하는 방법이다. 그러나, 미생물 종들 간의 시퀀스가 동일하지 않더라도 매우 유사하다면 한 종의 프로브를 사용한 한 번의 FISH 분석만으로는 단일 종의 미생물만을 정확히 검출하는 것이 어려울 수 있다. 또한, FISH 이미징 기반의 미생물 동정은 배경 신호와 잡음, 비표적 미생물 등을 표적 미생물로 잘못 인식할 수 있다는 문제점이 존재한다.

따라서, 다중 FISH 분석법이 활용되고 있으나, 형광 이미징으로 구별 가능한 형광신호 색상의 수는 제한적이므로, 1 종 이상의 미생물 종을 다중 FISH 분석을 통해 검출하기 위해서는, 사용된 형광신호를 제거하고, 동일 색상의 형광신호를 재사용할 필요가 있다. 이 경우, 검출이 끝난 형광신호를 빠르게 제거하는 것이 매우 중요한데, 기존의 프로브 혼성화 과정 기반 FISH 분석법의 경우, 한 사이클의 FISH 분석 당 프로브의 혼성화 및 비혼성화 과정에 약 1 시간이 소요된다. 따라서, 분석 시간을 단축하기 위해서는 각 종에 대한 슬라이드 채널을 별도로 마련해야 하거나, 강한 빛으로 형광신호를 감쇄시킨 후 FISH 과정을 반복할 수 밖에 없다. 다만, 이 경우, 타겟으로 하는 종의 다양성만큼 검출 효율이 감소할 수 밖에 없고, 시료의 손상을 초래하는 등의 문제점이 존재한다. 따라서, 다중 FISH 분석의 분석 효율을 높이기 위해서는, 시료의 손상 없이, 간단한 조작만으로도 짧은 시간 내에 검출 완료된 형광신호를 제거할 수 있는 방법이 요구된다.

또한 다중 FISH 분석을 다양한 종류의 미생물 검출에 사용하기 위해서는 미생물의 종류에 상관없이 프로브가 효율적으로 전달되고, 일관되게 좋은 성능을 갖는 것이 필요하다. PNA 프로브는 널리 사용되는 DNA 프로브에 비해서 강한 결합력, 높은 안정성, 및 변형 용이성 등을 나타내는 것으로 알려져 있어 이러한 목적에 부합된다. 국내 등록특허 제 10-1810786 호는 쿠도아충 (Kudoa septempunctata)을 검출할 수 있는 PNA 프로브에 대하여 개시하고 있다. 이러한 장점에도 불구하고, PNA 프로브의 높은 제조 비용으로 인해, 길이가 짧은 PNA 프로브를 제조하여 사용할 수 밖에 없는데, 이 경우, 프로브의 특이적 결합성 (specificity)이 감소하여 하나의 프로브를 가지고 하나의 종을 검출하기 어려운 문제가 생길 수 있다.

이런 배경 하에서, 본 발명자들은 다중 FISH 분석을 위하여 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 개발하였고, 상기 가분해성 프로브를 이용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 미생물을 검출하는 경우, 상술한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해소할 수 있음을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.

일 양상은 (a) 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 시료 내 미생물에 접촉시켜 미생물과 혼성화하는 단계; (b) 상기 미생물과 혼성화된 프로브로부터 방출되는 신호를 검출하는 단계; (c) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지를 상기 프로브로부터 분리하여 제거하는 단계; 및 (d) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지가 제거된 미생물에 대하여 상기 (a) 내지 (c) 단계를 적어도 1 회 이상 반복하여 실시하는 단계를 포함하는, 미생물을 검출 또는 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 방법을 포함하는 감염성 질환의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 포함하는 미생물 검출 또는 동정용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

일 양상은 (a) 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 시료 내 미생물에 접촉시켜 미생물과 혼성화하는 단계; (b) 상기 미생물과 혼성화된 프로브로부터 방출되는 신호를 검출하는 단계; (c) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지를 상기 프로브로부터 분리하여 제거하는 단계; 및 (d) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지가 제거된 미생물에 대하여 상기 (a) 내지 (c) 단계를 적어도 1 회 이상 반복하여 실시하는 단계를 포함하는, 미생물을 검출 또는 동정하는 방법을 제공한다.

상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법은 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 시료 내 미생물에 접촉시켜 미생물과 혼성화하는 단계 (상기 (a) 단계)를 포함한다.

상기 프로브는 항체, 앱타머, DNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic Acid), 올리고사카라이드, 펩티드, 또는 단백질인 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 프로브는 미생물의 일부, 예를 들어, 미생물의 표면에 발현된 다당체, 미생물 내 유전물질 (DNA, RNA 등), 미생물의 단백질에 결합할 수 있는 것이면 제한없이 허용될 수 있다. 상세하게는, 상기 프로브 (예컨대, 프로브의 구조 또는 서열 등)는 특정 미생물 또는 미생물 종에 특이적으로 결합할 수 있도록 디자인될 수 있다. 가장 바람직하게 상기 프로브는 PNA일 수 있다.

본 명세서의 용어, "PNA (Peptide Nucleic Acid)"는 DNA 또는 RNA와 유사한 인공적으로 합성된 중합체를 의미한다. 구체적으로, PNA는 DNA의 당-인산 뼈대를 펩티드 결합체로 치환한 것을 의미한다. 상기 PNA는 DNA 뼈대 구조가 가지는 음전하의 성격을 띠지 않는 중성적인 구조를 가지는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 프로브로서 PNA 프로브를 사용하는 경우, 기존의 DNA 프로브를 사용하는 경우에 비하여 특정 미생물 종을 검출 또는 동정하는 시간을 현저히 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 기존의 DNA 프로브를 사용한 경우, 약 12 시간 동안 혼성화를 수행하였음에도 여전히 낮은 검출 효율을 나타낸 반면, PNA 프로브를 사용한 경우, 약 1 내지 10 분 동안 혼성화를 수행한 것만으로도 현저히 증가된 검출 효율을 나타낼 수 있다.

이는, PNA 프로브가 기존의 DNA 프로브에 비하여 더욱 우수한 종 특이성 (species specificity) 및 막 투과성을 가지는 것에 의한 것일 수 있다. 구체적으로, PNA 프로브는 기존의 DNA 프로브에 비하여 더욱 빠르게 미생물에 침투하여 리보좀 RNA 시퀀스를 인식할 수 있기 때문에, 특정 미생물 종을 검출 또는 동정하는 시간을 현저히 단축시킬 수 있다.

그 외에도 PNA 프로브는 기존의 DNA 프로브에 비하여 다양한 장점을 나타내는데, 구체적으로는 다음과 같다. 첫째, PNA 프로브는 전하를 띠지 않아 강한 결합력을 가진다. DNA 프로브는 전기적으로 음전하를 띠기 때문에 이중 나선구조를 이루기 위해서 DNA끼리 결합할 때, 같은 극끼리 밀어내는 힘이 존재하지만 PNA 프로브는 전하를 띠지 않는 중성의 뼈대를 가지므로 DNA나 RNA와 결합하는 과정에서 전기적 반발이 일어나지 않는다. 따라서, PNA 프로브는 DNA 프로브에 비하여 타겟 유전자와 더욱 강하게 결합할 수 있다. 두번째로, PNA 프로브는 높은 안정성을 가진다. 펩티드 결합물로 뼈대를 치환한 PNA는 화학적으로 핵산이기 보다는 단백질 (펩티드)에 가깝기 때문에 핵산분해효소 등에 강한 저항성을 가지고 성능을 유지할 수 있다. 세번째로, 인위적 합성으로 만들어진 PNA 프로브는 검출 표지나 유용한 분자들을 손쉽게 활용할 수 있도록 2 차 변형이 편리하다는 장점을 가진다. PNA의 화학구조에 특정 분자 또는 작용기를 연결해 물리화학적 성질을 용도에 맞게 변형하는 것이 가능하다.

일 구체예에 따르면, 상기 프로브는 서열번호 1의 서열을 포함하고, Escherichia coli, Escherichia dysenteriae, Escherichia flexneri, 또는 Escherichia marmotae를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 서열을 포함하고, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 5 또는 서열번호 6의 서열을 포함하고, Cronobacter sakazakii, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 7의 서열을 포함하고, Cronobacter sakazakii, Edwardsiella piscicida, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 8의 서열을 포함하고, Staphylococcus argenteus 또는 Staphylococcus aureus를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 9의 서열을 포함하고, Staphylococcus argenteus를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 포함하고, Pseudomonas aeruginosa를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 12, 서열번호 13, 또는 서열번호 14의 서열을 포함하고, Enterococcus faecalis를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 15의 서열을 포함하고, Proteus mirabilis를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 16 또는 서열번호 17의 서열을 포함하고, Streptococcus pneumoniae를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 18의 서열을 포함하고, Enterococcus faecium을 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 19 또는 서열번호 20의 서열을 포함하고, Streptococcus pyogenes를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 21 또는 서열번호 22의 서열을 포함하고, Streptococcus thermophilus를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 23 또는 서열번호 24의 서열을 포함하고, Streptococcus mutans를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브;

서열번호 25의 서열을 포함하고, Salmonella enterica를 검출 또는 동정하기 위한 PNA 프로브; 또는 이의 조합일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 프로브는 검출 표지와 연결된 것일 수 있다.

상기 검출 표지는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자, 및 방사성 동위원소로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 검출 표지로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물질로는 플루오레세인, Eu3⁺, Eu3⁺ 킬레이트, 크립테이트, FITC, RITC, FAM, VIC, HEX, Cy5, Cy3, SYBR Green, DAPI, TAMRA, 로다민, 프루오르다이트 (Fluoredite), 프루오르프라임 (FluorePrime), 및 ROX 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I, 및 ¹²⁵I-볼톤 (Bonton) 헌터 (Hunter) 시약 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 프로브가 상기 검출 표지와 연결됨으로써 미생물을 시각화 (또는 이미징)하고, 미생물을 검출 또는 동정할 수 있다. 상기 검출 표지와 연결된 프로브를 사용하면, 각각의 검출 표지의 시그널의 변동에 의해, 단순 이미징만으로 프로브와 미생물의 혼성화 및 미생물과 혼성화된 프로브와 검출 표지의 해리를 용이하게 확인할 수 있다.

상기 프로브는 가분해성 프로브일 수 있다. 상기 "가분해성 프로브"는 프로브에 연결된 검출 표지가 필요에 따라 프로브로부터 용이하게 분리 또는 해리될 수 있도록, 검출 표지와 프로브가 분해성 결합에 의하여 연결된 프로브-검출 표지의 복합체를 의미할 수 있다. 따라서, 상기 가분해성 프로브는 필요에 따라 용이하게 프로브-검출 표지의 복합체에서 프로브 및 검출 표지로 분해될 수 있다.

구체적으로, 상기 프로브는 상기 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 분해성 공유결합은 화학적 작용에 의하여 분해 또는 절단되는 것일 수 있다. 즉, 상기 분해성 공유결합을 화학적 작용에 의해 분해 또는 절단시킴으로써, 상기 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 프로브로부터 상기 검출 표지를 필요에 따라 용이하게 분리 또는 해리시킬 수 있다. 이로 인해, 상기 프로브는 가분해성의 특성을 가지는 것일 수 있다.

상기 분해성 공유결합은 이황화 결합, 산 분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합, 및 효소 분해성 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 분해성 공유결합은 가수분해성, 산화성, 또는 환원성 분해가 일어나기 쉬운 결합일 수 있다.

상기 화학적 작용은 상기 분해성 공유결합을 분해 또는 절단시킬 수 있는 화학적 반응을 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학적 작용은 가수분해, 효소분해, 산화, 및 환원 반응 등을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 분해성 공유결합은 이황화 결합일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로브는 상기 검출 표지와 이황화 결합으로 연결된 것일 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 이황화 결합은 화학적 작용에 의하여 필요에 따라 용이하게 분해 또는 절단될 수 있고, 이로 인해, 상기 검출 표지가 연결된 프로브로부터 상기 검출 표지가 필요에 따라 용이하게 분리 또는 해리될 수 있다. 상기 "이황화 결합 (disulfide bond)" 은 디설피드 결합이라고도 지칭되며, 두 개의 SH기가 산화 (oxidation)되어 생성하는 -S-S- 형태의 황 원소 사이의 공유결합을 의미한다.

일 구체예에서, 상기 이황화 결합을 분해 또는 절단시킬 수 있는 화학적 작용은 환원반응을 포함할 수 있다. 즉, 상기 이황화 결합은 환원제에 의하여 -S-S-가 두 개의 SH기로 치환되는 환원반응에 의하여 분해 또는 절단될 수 있다. 상기 환원제로는, 메르캅토에탄올 (mercaptoethanol), 글루타티온 (glutathione: GSH), 다이싸이오쓰레이톨 (dithiothreitol: DTT), TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine), 시스테인 (cysteine), THPP (Tris(3-hydroxypropyl)phosphine), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 사용될 수 있다.

상기 방법은 2 종 이상의 프로브를 사용할 수 있다. 상기 2 종 이상의 프로브는 각각 결합하는 타겟 서열이 상이한 것일 수 있다. 일반적으로 미생물의 종을 결정하는 유전자 변이는 염색체의 특정 영역에 몰려있지 않고, 흩어져 있기 때문에, 한 개의 긴 프로브보다 여러 개의 짧은 프로브가 종 간 변이를 검출하는데 더욱 효과적일 수 있다. 또한, 길이가 긴 프로브를 사용하는 경우, 프로브를 제조하는데 큰 비용이 발생할 수 있고, 막 투과성이 감소할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 상대적으로 길이가 짧으면서 (예컨대, 약 10 내지 30 nt), 타겟 영역이 상이한 2 종 이상의 프로브를 사용하여, 미생물 검출 효율을 극대화할 수 있다.

상기 2 종 이상의 프로브는 각각 다른 종의 미생물과 특이적으로 혼성화하거나, 각각 동일한 종의 미생물과 특이적으로 혼성화하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 2 종 이상의 프로브는, 시료 내 서로 상이한 2 종 이상의 미생물에 각각 특이적으로 혼성화할 수 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 2 종 이상의 프로브는, 시료 내 동일한 종류의 미생물 내의 상이한 영역에 각각 특이적으로 혼성화할 수 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 2 종 이상의 프로브는 시료 내 동일한 한 종류의 미생물과 반복하여 혼성화할 수 있는 동일한 프로브이거나, 시료 내 서로 상이한 2 종 이상의 미생물 내의 동일한 영역에 혼성화할 수 있는 동일한 프로브일 수 있다.

상기 2 종 이상의 프로브는 각각 동일하거나 상이한 표지물질로 표지된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 2 종 이상의 프로브는 각각 다른 색상의 신호를 방출하는 검출 표지와 연결된 것일 수 있다.

상기 방법은 상기 2 종 이상의 프로브를 동시에 사용하거나 순차적으로 사용하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 한 사이클 (cycle)의 분석에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 2 종 이상의 프로브가 동시에 투여되어 시료 내 미생물과 혼성화될 수 있다. 또한, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 사이클이 반복되는 다중 분석에 있어서, 각 사이클의 (a) 단계마다 특정 종류의 프로브가 투여되어, 매 사이클마다 상이한 종류의 프로브가 시료 내 미생물과 순차적으로 혼성화될 수 있다.

따라서, 상기 방법에 있어서, 상기 2 종 이상의 프로브가 각각 상이한 종류의 미생물 종과 특이적으로 혼성화하는 경우, 상기 시료 내 미생물 중 2 종 이상의 미생물을 구별할 수 있다. 또한, 상기 방법에 있어서, 상기 2 종 이상의 프로브가 동일한 종류의 미생물 내의 상이한 영역에 각각 특이적으로 혼성화하는 경우, 상기 시료 내 미생물 중 1 종의 미생물을 더욱 정확하게 구별할 수 있다.

따라서, 상기 방법은 상기 시료 내 미생물 중 1 종 이상의 미생물을 구별하기 위한 것일 수 있다.

상기 방법의 상기 (a) 단계에서는, 상기 프로브를 시료 내 미생물과 접촉시켜 미생물과 혼성화시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 시료는 생체 시료, 환경 시료, 또는 식품 시료를 포함할 수 있다. 상기 생체 시료는 생체내 또는 시험관내로부터 수득한 생물학적 조직 또는 체액 기원의 시료를 포함하는 생물학적 대상체로부터 수득한 시료를 지칭할 수 있다. 구체적으로, 상기 생체 시료는 사람을 포함하는 포유동물로부터 단리된 체액 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 또는 소변), 기관, 조직, 분획, 및 세포일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 생체 시료로부터의 추출물, 예를 들어, 생물학적 유체 (예를 들어, 혈액 또는 소변)로부터의 항체, 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 환경 시료는 수질 시료 또는 토양 시료를 포함할 수 있다. 상기 시료는 미생물이 포함된 것일 수 있다.

상기 미생물은 박테리아, 바이러스, 곰팡이균, 진균, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 "혼성화 (Hybridization)"는 상기 프로브가 미생물의 일부, 예를 들어, 미생물의 표면에 발현된 다당체, 미생물 내 유전물질 (DNA, RNA 등), 미생물의 단백질 등에 결합하는 것을 의미할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 미생물 내 유전물질 (DNA, RNA 등)의 특정 염기 서열과 상보적으로 결합함으로써, 미생물과 혼성화될 수 있다. 상기 혼성화를 위한 구체적인 방법, 조건, 및 시약 등은 특별히 제한되지 않고, 당업계에 알려진 사실을 바탕으로 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법에 있어서, 상기 PNA 프로브를 사용하는 경우, 상기 혼성화는 약 1 내지 10 분, 약 1 내지 9 분, 약 1 내지 8 분, 약 1 내지 7 분, 약 1 내지 6 분, 약 1 내지 5 분, 약 1 내지 4 분, 약 1 내지 3 분, 또는 약 1 내지 2 분 동안 수행되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 혼성화는 약 5 분 이내의 시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 상술한 바와 같이, 상기 방법에 있어서, 상기 PNA 프로브를 사용하는 경우, 상기 혼성화 시간이 현저히 단축될 수 있기 때문에, 상기 혼성화는 약 5 분 이내의 시간 동안 수행되는 것만으로도 충분할 수 있다.

상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법은 상기 미생물과 혼성화된 프로브로부터 방출되는 신호를 검출하는 단계 (상기 (b) 단계)를 포함한다.

상기 검출하는 단계는 당업계에 알려진 방법, 예를 들어 조직화학, 면역조직화학, 면역형광, 발색 계내 혼성화, 형광 계내 혼성화 (FISH) 등에 의해서 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 검출하는 단계에서는 미생물과 혼성화된 프로브로부터 방출되는 신호가 존재하는 부분의 신호와 그 이외의 부분의 신호를 비교함으로써 미생물의 존재 유무나 미생물의 종류를 결정할 수 있다. 또한, 미리 알고 있는 농도의 미생물을 포함하는 표준 시료를 이용해 비교함으로써 시료 내 포함된 미생물의 농도를 구할 수 있다.

상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법은 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지를 상기 프로브로부터 분리하여 제거하는 단계 (상기 (c) 단계)를 포함한다.

상기 제거하는 단계에서는, 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 대하여 미생물로부터 프로브를 분리시키는 비혼성화 단계를 거칠 필요 없이, 상기 미생물과 혼성화된 프로브로부터 프로브와 연결된 검출 표지만을 신속하게 분리하여 제거할 수 있다. 구체적으로 상술한 바와 같이, 상기 미생물과 혼성화된 프로브는 검출 표지와 분해성 공유결합에 의해 연결된 가분해성 프로브이기 때문에, 상기 분해성 공유결합을 상기 화학적 작용에 의해 분해 또는 절단하는 것만으로, 상기 프로브로부터 검출 표지를 매우 신속하고 간단하게 분리시키고, 제거할 수 있다. 이로 인해, 신호 검출이 완료된 시료로부터 이미 검출된 신호를 매우 신속하고 간단하게 제거할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법에 있어서, 시료 내 미생물을 상기 검출 표지 (예컨대, 형광물질)와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브로 혼성화하는 경우, 신호 검출이 완료된 시료로부터 타겟 종과 혼성화를 이룬 프로브를 분리 및 제거하는 과정 (예컨대, 유기 용매를 이용한 세척)을 거칠 필요 없이, 약 1 분 이내에 미생물과 혼성화한 프로브로부터 검출 표지를 분리하여 이미 검출된 신호를 매우 신속하게 제거할 수 있다. 이러한 검출 표지의 분리 및 제거 과정은 상기 신호 검출이 완료된 시료에 대하여, 타겟 종과 혼성화한 프로브와 검출 표지를 연결하는 분해성 공유결합을 분해 또는 절단시킬 수 있는 상기 화학적 반응을 유도 (예컨대, 환원제의 처리)하는 것에 의하여 매우 간단하고 신속하게 수행될 수 있다. 또한, 일 구체예에 따르면, 형광신호를 제거하기 위하여 강한 레이저를 조사하여 광표백 (photobleaching)을 수행하는 기존 FISH 분석법과 비교하여, 상기 가분해성 프로브를 사용하는 경우, 현저히 증가된 속도로 검출 완료된 신호를 제거할 수 있다. 더하여, 상기 가분해성 프로브를 사용하는 경우, 검출 완료된 신호를 제거하기 위한 강한 레이저 조사를 수행할 필요가 없으므로, 시료가 손상되는 것도 원천적으로 방지할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법에 있어서, 상기 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 사용하는 경우, 상기 (c) 단계의, 미생물과 혼성화된 프로브로부터 검출 표지를 분리하여 제거하는 단계는 약 5 내지 60 초, 약 5 내지 50 초, 약 5 내지 40 초, 약 5 내지 30 초, 약 5 내지 20 초, 또는 약 5 내지 10 초 동안 수행되는 것일 수 있다. 상술한 바와 같이, 상기 방법에 있어서, 상기 검출 표지와 분해성 공유결합에 의해 연결된 가분해성 프로브를 사용하는 경우, 상기 (c) 단계에서 매우 용이하고 신속하게 검출 표지를 분리 및 제거할 수 있기 때문에, 상기 검출 표지를 분리하여 제거하는 단계는 약 1 분 이내의 시간 동안 수행되는 것만으로도 충분할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 (a) 내지 (c) 단계가 반복되는 다중 분석을 수행하기 위해서는, 신호 검출이 완료된 시료로부터 이미 검출된 신호를 빠르게 제거하는 것이 매우 중요하다. 그로 인해, 신호 검출이 완료된 시료에 새로운 검출 표지와 연결된 프로브를 다시 투여하여 미생물과 혼성화하고, 새로운 검출 표지의 신호를 검출하는 과정을 신속하게 반복할 수 있어, 상기 다중 분석의 분석 효율을 현저히 증가시킬 수 있기 때문이다.

따라서, 상기 가분해성 프로브를 사용하는 상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법은 기존의 FISH 분석법과 비교하여, 이미 검출된 신호를 더욱 빠르게 제거하여 분석 시간을 현저히 단축시킬 수 있기 때문에, 이로 인해 다중 분석의 분석 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 다시 말해, 상기 방법은, 기존의 FISH 분석법과 비교하여, 다중 분석의 분석 시간을 현저히 단축시킬 수 있기 때문에, 다종의 미생물이 혼합된 시료로부터 1 종 이상의 미생물을 더욱 빠르고 정확하게 검출 또는 동정할 수 있다.

상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법은 상기 (c) 단계에서 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지가 제거된 미생물에 대하여 상기 (a) 내지 (c) 단계를 적어도 1 회 이상 반복하여 실시하는 단계 (상기 (d) 단계)를 포함한다.

즉, 상기 방법은 상기 (a) 내지 (c) 단계가 반복되는 다중 분석을 이용하여 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은, 가분해성 프로브를 기반으로 하는 다중 FISH (Fluorescent in situ Hybridization) 분석법을 이용하여 미생물을 검출 또는 동정하는 방법일 수 있다.

본 명세서의 용어, "FISH (Fluorescent in situ Hybridization) 분석법"은 형광분자가 부착된 프로브를 이용하여 염색체에서 특정 DNA 서열을 탐지하는 분석법을 의미한다.

상기 "다중 FISH 분석법"은 다수의 FISH 분석이 복합적으로 진행되는 것을 의미할 수 있다. 구체적으로 한 사이클의 FISH 분석 후 다음 사이클의 FISH 분석이 순차적으로 진행됨으로써, FISH 분석이 반복되는 것을 의미하는 것일 수 있다. 또한, 상기 다중 FISH 분석법은 다수의 프로브를 이용하거나, 다수의 타겟을 검출 또는 탐지하는 FISH 분석법을 의미하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, FISH 분석은 상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에서 상기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 사이클이 1 회 수행되는 것을 의미할 수 있다. 또한, 다중 FISH 분석은 상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에서 상기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 수행되는 것을 의미할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법은, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 사이클마다 동일한 종류의 프로브를 사용하거나, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 사이클마다 상이한 종류의 프로브를 사용할 수 있다.

미생물 종들 간의 시퀀스가 동일하지 않더라도 매우 유사하다면 한 종의 프로브로 단일 종의 미생물만을 정확히 검출 또는 동정하는 것이 어려울 수 있다. 예컨대, 특정 프로브가 타겟하는 서열과 동일하거나 약 1 bp 이상의 차이를 가지는 매우 유사한 서열을 E. coli와 S. enterica가 모두 포함하고 있는 경우, 상기 특정 프로브를 사용한 한 번의 FISH 분석만으로는 상기 두 종을 명확히 구별하지 못할 가능성이 있다. 또한, 이미징 기반으로 단일 종의 미생물을 검출 또는 동정하는 FISH 분석법의 문제점 중 하나는 배경 신호와 잡음, 비표적 미생물 등을 표적 미생물로 잘못 인식할 수 있다는 것이다.

따라서, 일 구체예에 따르면, 상기 방법에 있어서, 단일 종의 미생물이 포함하는 2 이상의 특정 영역 각각을 특이적으로 타겟하는 2 종 이상의 프로브를 순차적으로 사용하여, 상기 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 상기 다중 FISH 분석의 각 사이클마다 검출된 미생물 종의 일치 여부를 재확인할 수 있다. 이를 통해, 여러 종의 미생물이 혼합된 시료 내에서 단일 종의 미생물만을 정확히 검출 또는 동정할 수 있고, 검출 오류 확률을 현저히 감소시킬 수 있다. 또한, 일 구체예에 따르면, 상기 방법에 있어서, 상기 가분해성 PNA 프로브를 사용하여, 상기 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 미생물과 프로브의 혼성화 시간을 현저히 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 혼성화된 프로브와 연결된 검출 표지를 빠르게 제거하여, 새로운 프로브의 신호를 검출하는 과정을 반복하는데 소요되는 시간을 현저히 단축시킬 수 있다.

따라서, 상기 방법에 있어서, 단일 종의 미생물을 검출하기 위해, 2 종 이상의 상기 가분해성 프로브를 순차적으로 사용하여 상기 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 기존의 FISH 분석법에 비하여 분석 시간을 현저히 단축시키면서 현저히 우수한 분석 정확도를 나타낼 수 있어, 분석 효율을 현저히 증가시킬 수 있다.

형광 이미징으로 구별 가능한 형광신호 색상의 수는 제한적이므로, 2 종 이상의 복수의 미생물 종을 다중 FISH 분석을 통해 검출 또는 동정하기 위해서는, 특정 미생물 종을 검출하기 위해 사용된 형광신호를 제거하고, 다른 미생물 종을 검출하기 위해 동일 색상의 형광신호를 재사용할 필요가 있다. 이 경우, 검출이 끝난 형광신호를 빠르게 제거하는 것이 매우 중요하다. 기존의 FISH 기반 미생물 동정 기술의 경우, 한 시료 내에서 2 종 이상의 복수의 미생물 종을 순차적으로 검출 또는 동정하기 위하여, 검출이 끝난 후, 미생물과 혼성화된 프로브-형광물질 복합체를 제거하는 비혼성화 과정을 거친 후, 새로운 프로브-형광물질 복합체를 투여하여 다시 미생물과 혼성화하는 과정에 많은 시간이 소요된다. 예컨대, 기존의 DNA 프로브 기반 FISH 분석법의 경우, 한 사이클 당 프로브의 혼성화 및 비혼성화 과정에 약 1 시간이 소요된다. 또한, 기존의 FISH 기반 미생물 동정 기술에서는, 2 종 이상의 복수의 미생물 종을 검출 또는 동정하는 경우, 분석 시간을 단축하기 위해서는 각 종에 대한 슬라이드 채널을 별도로 마련해야 하고, 이 경우, 타겟으로 하는 종의 다양성만큼 검출 효율도 감소할 수 밖에 없는 문제점이 있었다.

반면, 일 구체예에 따르면, 2 종 이상의 복수의 미생물 종을 검출하기 위하여, 상기 방법에 있어서, 상기 2 종 이상의 가분해성 프로브를 순차적으로 사용하여 상기 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 1 차 사이클에 의하여 특정 미생물 종에 대한 검출이 끝난 후, 미생물과 혼성화된 프로브-검출 표지 복합체를 제거하는 비혼성화 과정을 거칠 필요없이, 미생물과 혼성화된 프로브에서 검출 표지만을 빠르게 제거할 수 있다. 이로 인해, 상기 1 차 사이클에서 검출한 미생물 종과는 상이한 미생물 종을 타겟하는 새로운 프로브의 신호를 검출하는 2 차 사이클 과정을 빠르게 반복할 수 있다. 또한, 일 구체예에 따르면, 상기 방법에 있어서, 상기 2 종 이상의 가분해성 프로브를 순차적으로 사용하여 상기 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 상술한 바와 같이 타겟하는 종이 상이한 각 사이클의 FISH 분석을 매우 신속하게 반복할 수 있기 때문에, 한 개의 슬라이드 시료 내에서 2 종 이상의 복수의 미생물 종 각각을 순차적으로 빠르게 검출할 수 있다. 이를 통해, 기존 FISH 분석법의 문제점을 해소하고, 시료 내의 타겟 미생물에 대한 검출 효율을 극대화할 수 있다.

따라서, 2 종 이상의 복수의 미생물 종을 검출하기 위해, 상기 방법에 있어서, 상기 2 종 이상의 가분해성 프로브를 순차적으로 사용하여 상기 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 기존의 FISH 분석법에 비하여, 분석 시간을 현저히 단축시키면서 현저히 우수한 분석 정확도를 나타낼 수 있어, 분석 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 이를 통해, 한 시료 내에 존재하는 2 종 이상의 복수의 미생물 종을 더욱 신속하고, 더욱 정확하게 검출 또는 동정할 수 있다.

상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법은 상기 (a) 단계 이전에 수행되는 미생물을 농축 및 고정하는 단계; 및 미생물을 투과화 (permeabilization)하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 "미생물의 고정 (fixation)"은 미생물에 프로브를 결합시키기 위하여 미생물의 내부 및 외부 구조를 고정하거나, 미생물과 결합되지 않은 프로브 및 프로브로부터 분리된 검출 표지 등을 제거하는 것을 용이하게 하도록 미생물을 특정 위치에 부착 또는 고정하는 것을 지칭할 수 있다. 상기 "미생물의 투과화 (permeabilization)"는 미생물에 프로브가 유입되도록 미생물을 투과 가능한 상태로 만드는 것을 지칭할 수 있다.

상기 미생물을 농축 및 고정하는 단계에서 사용되는 구체적인 방법, 조건, 및 시약 등은 특별히 제한되지 않고, 당업계에 알려진 사실을 바탕으로 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 상기 단계에서 미생물을 농축하고 고정함으로써, 상기 방법에 있어서, 미생물과 결합되지 않은 프로브 및 프로브로부터 분리된 검출 표지 등을 제거하고 새로운 프로브를 투여하여 미생물과 다시 접촉시킬 수 있다. 따라서, 상기 단계에서 미생물을 농축하고 고정함으로써, 순차적으로 프로브를 미생물과 혼성화시킬 수 있고, 이로 인해, 미생물을 다중 검출할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 미생물을 농축 및 고정하는 단계에서 자성 입자를 이용할 수 있다. 구체적으로, 시료와 자성 입자를 접촉시켜 시료 내 포함된 미생물이 자성 입자와 결합할 수 있다. 상기 자성 입자와 결합된 미생물을 포함하는 시료에 자기장을 인가하여 상기 자성 입자와 결합된 미생물만을 농축하고 특정 영역에 고정할 수 있다. 상기 자기장은 통상적인 모든 방법으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 전자기 유도에 의한 전자석, 영구 자석 등의 자석 등을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 "자성 입자"는 상자성을 띠는 입자를 지칭할 수 있다. 상자성이란 자기장이 존재할 때 자기장의 방향으로 약하게 자화되는 성질을 의미한다. 상기 자성 입자들은 공지된 방법을 통해서 제조한 것이거나, 또는 상업적으로 판매되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 자성 입자는 표면에 미생물 부착 인자가 코팅된 것일 수 있다. 상기 "미생물 부착 인자"는 바이러스, 박테리아, 원생동물 등의 다양한 미생물의 표면에 있는 당단백질이나 탄수화물에 결합 (부착)할 수 있는 인자로서, 예를 들어, 임의의 다양한 종류의 미생물에 결합할 수 있는 항체, 항체의 단편, 앱타머, 핵산, 펩티드, 단백질, 또는 임의의 화합물일 수 있다. 상기 미생물 부착 인자는, 예를 들어, 만노스 결합 렉틴 (mannose binding lectin: MBL), C 반응성 단백질 (C-reactive protein: CRP), 옵소닌, CD14, 톨 유사 수용체 4 (Toll like receptor 4: TLR4), NET (Neutrophil extracellular trap), 및 사이토카인 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한, 일 구체예에서, 상기 미생물을 농축 및 고정하는 단계는 원심분리 방식을 이용할 수 있다. 또한, 일 구체예에서, 상기 미생물을 농축 및 고정하는 단계는 슬라이드 표면을, 미생물을 부착시킬 수 있는 물질 (예컨대, 양이온성 물질)로 코팅하고 상기 슬라이드 표면에 시료 내 미생물을 부착시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 미생물을 부착시킬 수 있는 물질은 poly-l-lysine일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 일 구체예에서, 상기 미생물을 농축 및 고정하는 단계는 고정액을 처리하여 상기 슬라이드 표면에 부착된 미생물을 고정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 고정액은 약 2 내지 5% 포름알데히드 (formaldehyde) 용액, 약 20 내지 60% 에탄올 용액, 약 90% 이상의 메탄올 용액, 또는 이들의 조합일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 미생물을 투과화하는 단계에서 사용되는 구체적인 방법, 조건, 및 시약 등은 특별히 제한되지 않고, 당업계에 알려진 사실을 바탕으로 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 미생물을 투과화하는 단계에서는, 세포 투과성 시약으로 약 10 내지 40 분 동안 상기 고정된 미생물에 대하여 투과화 처리를 수행할 수 있다. 또한, FISH 분석에 필요한 시약들인 FISH 버퍼, DAPI, 2X SSC 버퍼 등을 추가로 처리할 수 있다. 상기 세포 투과성 시약은 약 1 내지 10 mg/mL lysozyme 용액, 약 20 내지 80% 에탄올 용액, 약 90 내지 100% 메탄올 용액, 또는 이들의 조합일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법은 미세유체소자를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 (i) 미세유체소자 내로 시료 및 자성 입자를 주입하여 미세유체소자 내에서 시료 내의 미생물 및 자성 입자가 결합하거나, 시료 내의 미생물 및 자성 입자가 결합한 것을 미세유체소자 내로 주입하는 단계; (ii) 상기 미세유체소자 내의 특정 부위에 자기장을 인가하여, 상기 자성 입자와 결합한 미생물만을 농축하고, 상기 농축된 미생물을 미세유체소자 내의 특정 부위에 고정하는 단계; (iii) 상기 미세유체소자 내로 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 주입하여 상기 가분해성 프로브를 상기 고정된 미생물에 접촉시켜 미생물과 혼성화하는 단계; (iv) 상기 미세유체소자와 연결된 장치를 통해, 상기 미생물과 혼성화된 프로브로부터 방출되는 신호를 검출하는 단계; (v) 상기 미세유체소자 내로 상기 분해성 공유결합을 분해 또는 절단시킬 수 있는 물질을 주입하여, 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지를 상기 프로브로부터 분리하여 제거하는 단계; 및 (vi) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지가 제거된, 상기 미세유체소자 내의 특정 영역에 고정된 미생물에 대하여 상기 (iii) 내지 (v) 단계를 적어도 1 회 이상 반복하여 실시하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법에서, 미생물을 배양하는 단계 또는 미생물의 유전물질을 증폭하는 단계를 포함하지 않을 수 있다. 일반적으로, 생체 시료, 환경 시료, 또는 식품 시료 내 포함된 미생물은 미량인 경우가 많기 때문에, 종래 표지된 프로브를 미생물과 결합시켜 표지된 프로브로부터 방출되는 신호를 측정하는 방법은 효율성이 떨어지는 문제점이 있다. 측정 효율을 증가시키기 위해서 시료 내 미생물을 정제하거나, 미생물의 유전물질을 PCR 등의 방법으로 증폭시키거나 미생물을 배양하는 기술이 사용되고 있으나, 미생물을 정제하는 과정에서 변형이 일어날 수 있고, 유전물질을 증폭시키는 과정은 시간이 오래 걸리고 유전정보를 모르는 경우 사용할 수 없으며, 미지의 미생물이 포함된 경우나 다수의 미생물이 포함된 경우 배양 조건을 설정하기가 어렵다. 그러나, 상기 방법의 일 구체예에 따르면, 미생물을 자성 입자에 부착시키고 자성 입자를 자기장에 의해 분리해냄으로써 미생물을 농축하거나 고정시킬 수 있으므로 미생물을 배양하는 단계 또는 미생물의 유전물질을 증폭하는 단계를 포함하지 않고도 미생물을 효율적으로 검출할 수 있다.

상기 방법은 신호가 방출된 프로브의 정보를 이용하여 미생물의 존재 여부 또는 미생물의 종류를 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 (a) 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 시료 내 미생물에 접촉시켜 미생물과 혼성화하는 단계; (b) 상기 미생물과 혼성화된 프로브로부터 방출되는 신호를 검출하는 단계; (c) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지를 상기 프로브로부터 분리하여 제거하는 단계; 및 (d) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지가 제거된 미생물에 대하여 상기 (a) 내지 (c) 단계를 적어도 1 회 이상 반복하여 실시하는 단계를 포함하는, 감염성 질환의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 정보를 제공하는 방법은 신호가 방출된 프로브의 정보를 이용하여 미생물의 존재 여부 또는 미생물의 종류를 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, E. coli에 특이적인 프로브를 사용한 경우, 이러한 프로브에서 신호가 방출된다면 시료 내 포함된 미생물의 종류로 E. coli를 판정할 수 있다. 시료 내 포함된 미생물의 종류를 판정함으로써 감염성 질환의 발병 가능성, 발병 여부, 또는 감염성 질환의 종류의 진단에 관한 정보를 제공할 수 있다.

상기 정보제공방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 포함하는 미생물 검출 또는 동정용 조성물을 제공한다.

상기 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 정보제공방법 또는 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 정보제공방법 또는 미생물을 검출 또는 동정하는 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

일 양상에 따른 방법 또는 조성물에 의하면, 시료 내 미생물과 혼성화할 수 있는 프로브가 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결되기 때문에, 미생물과 혼성화한 프로브로부터 방출된 신호의 검출이 완료된 경우, 상기 프로브로부터 상기 검출 표지를 매우 용이하고 신속하게 분리 및 제거할 수 있다. 그로 인해, 상기 시료 내로 새로운 검출 표지와 연결된 프로브를 다시 투여하여 미생물과 혼성화하고, 새로운 검출 표지의 신호를 검출하는 과정을 신속하게 반복할 수 있다. 이를 통해, 다종의 미생물을 순차적으로 검출하거나, 단일 종의 미생물에 대한 검출 결과를 재확인하기 위한 다중 분석의 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 방법 또는 조성물에 의하면, 기존의 FISH 분석법의 긴 분석 시간, 분석 정확도의 감소, 및 분석 효율의 감소 등의 문제를 해소하고, 매우 신속하고 정확하게 다종의 미생물이 혼합된 시료로부터 1 종 이상의 미생물을 검출 또는 동정할 수 있다.

도 1은 S. aureus 종에 대하여 PNA 프로브 또는 DNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 단일 종의 미생물을 검출하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 4는 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 단일 종의 미생물을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 복수의 미생물 종을 검출하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 6은 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 복수의 미생물 종을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 명세서에서 특별한 정의가 없으면, 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다.

실시예 1. PNA (peptide nucleic acid) 프로브 기반의 FISH 분석

프로브 투과성이 낮은 S. aureus 종을 검출 또는 동정하기 위하여 PNA (peptide nucleic acid) 프로브 및 기존의 DNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 수행하였고, 양자의 검출 효율을 비교하였다.

먼저, 시료 내의 S. aureus 종을 검출 또는 동정하기 위하여, 시료의 미생물을 농축, 고정, 및 투과화 처리하였다. 구체적으로, 시료를 원심분리하여 시료 내 미생물을 농축하였다. 또한, 슬라이드 표면을 poly-l-lysine으로 코팅하고, 상기 농축된 미생물을 상기 슬라이드 표면에 붙인 후, 약 3.7% 포름알데히드 (formaldehyde) 용액으로 약 30 분 동안 처리하여 미생물을 슬라이드 표면에 고정하였다. 그 후, 세포 투과성 시약 약 5 mg/mL lysozyme 용액으로 약 30 분 동안 상기 고정된 미생물에 대하여 투과화 처리를 수행하였다.

그 후, 상기 고정 및 투과화 처리된 미생물을 PNA 프로브 또는 DNA 프로브로 혼성화 (hybridization)하였다. 구체적으로, 형광물질이 표지된 PNA 프로브 또는 DNA 프로브를 10% (wt/vol) Dextran sulfate, 10 mM NaCl, 30% (vol/vol) formamide, 0.1% (vol/vol) Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2% (wt/vol) polyvinylpyrrolidone, 0.2 % (wt/vol) Ficoll, 0.1% (wt/vol) sodium pyrophosphate, 및 5 mM disodium EDTA와 혼합한 후, 상기 혼합용액 100 μL를 상기 고정된 미생물에 약 55°C에서 약 30 분 동안 처리하였다. 그 후, 미생물을 세척하여 타겟과 혼성화되지 않은 프로브를 제거하고, 공초점 현미경 (confocal microscope)으로 지정된 영역을 이미징하였다.

도 1은 S. aureus 종에 대하여 PNA 프로브 또는 DNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 기존의 DNA 프로브를 사용한 경우, 약 12 시간 동안 혼성화를 수행하였음에도 여전히 낮은 검출 효율을 나타낸 반면, PNA 프로브를 사용한 경우, 약 5 분 동안 혼성화를 수행한 것만으로도 현저히 증가된 검출 효율을 나타냄을 확인하였다.

본 실시예를 통해, 상기 PNA 프로브 기반의 FISH 분석법은 기존의 DNA 프로브 기반의 FISH 분석법에 비하여 특정 미생물 종을 검출 또는 동정하는 시간을 현저히 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 이는, 기존의 DNA 프로브에 비하여 PNA 프로브가 더욱 우수한 종특이성 (species specificity)을 나타냄을 의미한다. 또한, 기존의 DNA 프로브에 비하여 PNA 프로브가 더욱 빠르게 미생물에 침투하고 리보좀 RNA 시퀀스를 인식하여, 균종을 판별하는 시간을 현저히 감소시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 2. 가분해성 PNA 프로브의 제조

상기 FISH 분석의 효율을 높이기 위하여 기존의 DNA 프로브에 비하여 현저히 우수한 검출 효율을 나타내는 PNA 프로브에 형광물질을 표지하여 가분해성 PNA 프로브를 제조하였다.

먼저, 다양한 미생물 종을 특이적으로 검출할 수 있는 다수의 PNA 프로브를 제조하였고, 표 1에 나타내었다.

PNA 프로브	염기 서열 (5' -> 3')	타겟 균종
1	AGGAAGGGAGTAAAG (서열번호 1)	Escherichia coli, Escherichia dysenteriae, Escherichia flexneri, 또는 Escherichia marmotae
2	GCGGTAGCACAGAGA (서열번호 2)	Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola
3	AGCGGTAGCACAGAG (서열번호 3)	Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola
4	GAGCGGTAGCACAGA (서열번호 4)	Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola
5	ATGCCATCAGATGTG (서열번호 5)	Cronobacter sakazakii, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola
6	CATGCCATCAGATGT (서열번호 6)	Cronobacter sakazakii, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola
7	GGCCTCATGCCATCA (서열번호 7)	Cronobacter sakazakii, Edwardsiella piscicida, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Klebsiella variicola, Raoultella ornithinolytica, 또는 Raoultella planticola
8	AACGGACGAGAAGCT (서열번호 8)	Staphylococcus argenteus 또는 Staphylococcus aureus
9	AAGTGAAAGACGGTC (서열번호 9)	Staphylococcus argenteus
10	CCTGAGGGAGAAAGT (서열번호 10)	Pseudomonas aeruginosa
11	CTACTGAGCTAGAGT (서열번호 11)	Pseudomonas aeruginosa
12	AACGCTTCTTTCCTC (서열번호 12)	Enterococcus faecalis
13	TCTTTCCTCCCGAGT (서열번호 13)	Enterococcus faecalis
14	AGAAGAACAAGGACG (서열번호 14)	Enterococcus faecalis
15	GCACTATCGGATGAA (서열번호 15)	Proteus mirabilis
16	AAAAGGTGCACTTGC (서열번호 16)	Streptococcus pneumoniae
17	CTTGCATCACTACCA (서열번호 17)	Streptococcus pneumoniae
18	CCGCATGGTTTTGAT (서열번호 18)	Enterococcus faecium
19	ACCGCATAAGAGAGA (서열번호 19)	Streptococcus pyogenes
20	CGCATAAGAGAGACT (서열번호 20)	Streptococcus pyogenes
21	CCGCATAACAATGGA (서열번호 21)	Streptococcus thermophilus
22	CGCATAACAATGGAT (서열번호 22)	Streptococcus thermophilus
23	TGAAAGATGCAAGCG (서열번호 23)	Streptococcus mutans
24	CAAGAACGTGTGTGA (서열번호 24)	Streptococcus mutans
25	TGAGTCTTGTAGAGG (서열번호 25)	Salmonella enterica

다음으로, 제조된 PNA 프로브와 형광물질을 화학적으로 쉽게 분리 가능한 가분해성 결합방식, 즉, 이황화 결합 (disulfide bond)으로 연결하여, 가분해성 PNA 프로브를 수득하였다.

상기 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 수행하는 경우, 혼성화 후 타겟 RNA로부터 PNA 프로브를 분리시키는 과정 없이 빠르게 형광신호를 제거할 수 있다. 이로 인해, 순차적으로 반복하여 수행되는 다중 FISH 분석의 시간을 현저히 단축시켜 분석 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 이와 관련하여 하기의 실시예 3 및 4에서 더욱 상세하게 기재하였다.

실시예 3. 가분해성 PNA 프로브 기반의 FISH 분석

상기 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 시료의 미생물을 농축, 고정, 및 투과화 처리한 후, E. coli 16s rRNA 특이적 가분해성 PNA 프로브로 약 5 분 동안 혼성화하였다. 그 후, 미생물을 세척하여 타겟 종과 혼성화되지 않은 프로브를 제거하고, 공초점 현미경으로 촬영하여 지정된 영역을 이미징하였다. 그 후, 약 100 mM TCEP 용액으로 약 1 분 동안 처리하여 타겟 종과 혼성화된 프로브로부터 형광물질을 분리시켰고, 같은 영역을 이미징하여 형광신호가 사라진 것을 확인하였다.

도 2는 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 미생물을 상기 가분해성 PNA 프로브로 혼성화하는 경우, 형광 이미지 분석 이후, 미생물의 타겟 RNA와 혼성화를 이룬 PNA 프로브를 분리시키는 과정 (예컨대, 유기 용매를 이용한 세척)없이, TCEP 용액을 처리하는 것만으로, 약 1 분 이내에 미생물과 혼성화를 이룬 PNA 프로브로부터 형광신호를 빠르게 제거할 수 있음을 확인하였다. 또한, 형광신호를 제거하기 위하여 강한 레이저를 조사하는 광표백 (photobleaching)을 수행하는 FISH 분석법과 비교하여, 상기 가분해성 PNA 프로브 기반 FISH 분석법의 경우 더욱 빠른 속도로 형광신호를 제거할 수 있음을 확인하였다.

본 실시예의 결과는, 상기 가분해성 PNA 프로브 기반 FISH 분석법은 기존의 FISH 분석법과 비교하여, 더욱 짧은 시간 내에 다종의 미생물이 혼합된 시료로부터 1 종 이상의 미생물을 검출 또는 동정할 수 있음을 시사한다. 또한, 분석 시간이 현저히 단축됨으로써, 다중 FISH 분석 효율을 현저히 증가시켜 분석 정확도를 높일 수 있음을 시사한다. 더하여, 상기 가분해성 PNA 프로브 기반 FISH 분석을 수행하는 경우, 형광신호를 제거하기 위한 강한 레이저 조사를 수행할 필요가 없으므로, 시료가 손상되는 것도 원천적으로 방지할 수 있음을 시사한다.

실시예 4. 가분해성 PNA 프로브 기반의 다중 FISH 분석

4-1. 단일 미생물 종의 검출 또는 동정을 위한 다중 FISH 분석

따라서, 본 실시예에서는, 시료 내에서 단일 종의 미생물을 검출 또는 동정하기 위하여, 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하는 다중 FISH 분석을 수행하였다.

도 3는 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 단일 종의 미생물을 검출하는 과정을 나타내는 모식도이다.

구체적으로, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 시료의 미생물을 농축, 고정, 및 투과화 처리한 후, 제 1 프로브로 약 5 분 동안 1차 혼성화를 수행하였다. 그 후, 미생물을 세척하여 타겟 종과 혼성화되지 않은 프로브를 제거하고, 공초점 현미경으로 촬영하여 지정된 영역을 이미징하였다. 그 후, 약 100 mM TCEP 용액으로 약 1 분 동안 처리하여 타겟 종과 혼성화된 프로브로부터 형광물질을 분리시켰고, 같은 영역을 이미징하여 형광신호가 사라진 것을 확인한 후, 제 2 프로브로 2차 혼성화를 수행하여 상기 과정을 반복하였다. 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브는 모두 E. coli 16s rRNA 특이적 가분해성 PNA 프로브이다. 다만, 상기 2 종의 프로브는 각각 E. coli 16s rRNA 내에서 타겟하는 서열이 상이하다.

도 4은 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 단일 종의 미생물을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 1차 FISH 분석에서 Cy3로 표지된 제 1 프로브는 E. coli뿐만 아니라 K. pneumonia 및 P. mirabilis와도 혼성화하여 형광신호를 방출함으로써, 상기 미생물 종들을 정확히 구별하지 못함을 확인하였다. 반면, 2차 FISH 분석에서, 상기 1차 FISH 분석에 사용된 동일한 시료에 Cy5로 표지된 제 2 프로브를 사용한 경우, E. coli와 특이적으로 혼성화하여 방출하는 형광신호를 확인할 수 있었고, 이로 인해, 상기 미생물 종들을 정확히 구별할 수 있음을 확인하였다.

본 실시예를 통해, 단일 종의 미생물이 포함하는 2 이상의 특정 영역 각각을 특이적으로 타겟하는 2 종 이상의 프로브를 순차적으로 사용하는 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 상기 다중 FISH 분석의 각 사이클마다 검출된 미생물 종의 일치 여부를 재확인할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 다중 FISH 분석을 통해, 여러 종의 미생물이 혼합된 시료 내에서 단일 종의 미생물만을 정확히 검출 또는 동정할 수 있고, 검출 오류 확률을 현저히 감소시킬 수 있음을 의미한다.

또한, 본 실시예를 통해, 상기 다중 FISH 분석에서 가분해성 PNA 프로브를 사용함으로써, 미생물과 프로브의 혼성화 시간을 현저히 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 혼성화된 프로브의 형광신호를 빠르게 제거하여, 새로운 프로브의 형광신호를 검출하는 과정을 반복하는데 소요되는 시간을 현저히 단축시킬 수 있음을 확인하였다.

결과적으로, 본 실시예의 결과는, 단일 종의 미생물을 검출하기 위해, 2 종 이상의 가분해성 PNA 프로브를 순차적으로 사용하는 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 기존의 FISH 분석법에 비하여 분석 시간을 현저히 단축시키면서 현저히 우수한 분석 정확도를 나타낼 수 있어, 분석 효율을 현저히 증가시킬 수 있음을 시사한다.

4-2. 복수 미생물 종의 검출 또는 동정을 위한 다중 FISH 분석

시료 내에서 2 종 이상의 복수의 미생물 종을 검출 또는 동정하기 위하여, 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하는 다중 FISH 분석을 수행하였다.

도 5은 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 복수의 미생물 종을 검출하는 과정을 나타내는 모식도이다.

구체적으로, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 시료의 미생물을 농축, 고정, 및 투과화 처리한 후, S. aureus 16s rRNA 특이적 가분해성 PNA 프로브로 약 5 분 동안 1차 혼성화를 수행하였다. 그 후, 미생물을 세척하여 타겟 종과 혼성화되지 않은 프로브를 제거하고, 공초점 현미경으로 촬영하여 지정된 영역을 이미징하였다. 그 후, 약 100 mM TCEP 용액으로 약 1 분 동안 처리하여 타겟 종과 혼성화된 프로브로부터 형광물질을 분리시켰고, 같은 영역을 이미징하여 형광신호가 사라진 것을 확인한 후, E. coli 16s rRNA 특이적 가분해성 PNA 프로브로 2차 혼성화를 수행하여 상기 과정을 반복하였다.

도 6은 여러 종의 가분해성 PNA 프로브를 사용하여 FISH 분석을 순차적으로 반복하는 다중 FISH 분석을 통해 복수의 미생물 종을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 여러 종의 가분해성 PNA 프로브 기반의 다중 FISH 분석을 수행하는 경우, 검출이 끝난 후, 약 1 분이 안되는 짧은 시간 동안 미생물과 혼성화된 프로브의 형광신호를 빠르게 제거할 수 있음을 확인하였다. 이로 인해, 다른 미생물 종을 타겟하는 프로브의 형광신호를 검출하는 과정을 신속하게 반복할 수 있어 2 종 이상의 복수의 미생물 종을 매우 신속하게 검출 또는 동정할 수 있음을 확인하였다.

본 실시예의 결과는 상기 가분해성 PNA 프로브 기반의 다중 FISH 분석에 의할 경우, 상술한 바와 같이 타겟하는 종이 상이한 각 사이클의 FISH 분석을 매우 신속하게 반복할 수 있기 때문에, 한 개의 슬라이드 시료 내에서 2 종 이상의 복수의 미생물 종 각각을 순차적으로 빠르게 검출할 수 있음을 의미한다. 이를 통해, 기존 FISH 분석법의 문제점을 해소하고, 시료 내의 타겟 미생물에 대한 검출 효율을 극대화할 수 있음을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> UNIST(ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) <120> Hydrolyzable probe and method for detecting or identifying microorganisms using the same <130> PN136046KR <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 1 <400> 1 aggaagggag taaag 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 2 <400> 2 gcggtagcac agaga 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 3 <400> 3 agcggtagca cagag 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 4 <400> 4 gagcggtagc acaga 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 5 <400> 5 atgccatcag atgtg 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 6 <400> 6 catgccatca gatgt 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 7 <400> 7 ggcctcatgc catca 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 8 <400> 8 aacggacgag aagct 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 9 <400> 9 aagtgaaaga cggtc 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 10 <400> 10 cctgagggag aaagt 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 11 <400> 11 ctactgagct agagt 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 12 <400> 12 aacgcttctt tcctc 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 13 <400> 13 tctttcctcc cgagt 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 14 <400> 14 agaagaacaa ggacg 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 15 <400> 15 gcactatcgg atgaa 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 16 <400> 16 aaaaggtgca cttgc 15 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 17 <400> 17 cttgcatcac tacca 15 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 18 <400> 18 ccgcatggtt ttgat 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 19 <400> 19 accgcataag agaga 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 20 <400> 20 cgcataagag agact 15 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 21 <400> 21 ccgcataaca atgga 15 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 22 <400> 22 cgcataacaa tggat 15 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 23 <400> 23 tgaaagatgc aagcg 15 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 24 <400> 24 caagaacgtg tgtga 15 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe 25 <400> 25 tgagtcttgt agagg 15

Claims

(a) 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 시료 내 미생물에 접촉시켜 미생물과 혼성화하는 단계;
(b) 상기 미생물과 혼성화된 프로브로부터 방출되는 신호를 검출하는 단계;
(c) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지를 상기 프로브로부터 분리하여 제거하는 단계; 및
(d) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지가 제거된 미생물에 대하여 상기 (a) 내지 (c) 단계를 적어도 1 회 이상 반복하여 실시하는 단계를 포함하는 미생물을 검출 또는 동정하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 분해성 공유결합은 이황화 결합, 산 분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합, 및 효소 분해성 결합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 분해성 공유결합은 화학적 작용에 의하여 분해 또는 절단되는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 프로브는 항체, 앱타머, DNA, RNA, PNA (Peptide Nucleic Acid), 올리고사카라이드, 펩티드, 또는 단백질인 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은 2 종 이상의 프로브를 동시에 사용하거나 순차적으로 사용하는 것인, 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 2 종 이상의 프로브는 각각 결합하는 타겟 서열이 상이한 것인, 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 2 종 이상의 프로브는 각각 다른 색상의 신호를 방출하는 검출 표지와 연결된 것인, 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 2 종 이상의 프로브는 각각 다른 종의 미생물과 특이적으로 혼성화하거나, 상기 2 종 이상의 프로브는 각각 동일한 종의 미생물과 특이적으로 혼성화하는 것인, 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 방법은 상기 시료 내 미생물 중 1 종 이상의 미생물을 구별하기 위한 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은 미세유체소자를 이용하여 수행되는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은 신호가 방출된 프로브의 정보를 이용하여 미생물의 존재 여부 또는 미생물의 종을 판정하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
(a) 검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 시료 내 미생물에 접촉시켜 미생물과 혼성화하는 단계;
(b) 상기 미생물과 혼성화된 프로브로부터 방출되는 신호를 검출하는 단계;
(c) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지를 상기 프로브로부터 분리하여 제거하는 단계; 및
(d) 상기 미생물과 혼성화된 프로브에 연결된 검출 표지가 제거된 미생물에 대하여 상기 (a) 내지 (c) 단계를 적어도 1 회 이상 반복하여 실시하는 단계를 포함하는 감염성 질환의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
검출 표지와 분해성 공유결합으로 연결된 가분해성 프로브를 포함하는 미생물 검출 또는 동정용 조성물.