KR20220087184A - 감귤류 품종 아수미 선별용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감귤 품종 선별용 조성물; 이를 포함하는 키트; 이를 이용한 감귤 품종 선별 방법; 및 감귤 품종 선별을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

Description

감귤류 품종 아수미 선별용 마커 및 이의 용도{Novel marker for selecting a citrus variety 'Asumi'and the use thereof}

본 발명은 감귤 품종 선별용 조성물; 이를 포함하는 키트; 이를 이용한 감귤 품종 선별 방법; 및 감귤 품종 선별을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

아수미(Asumi) 품종은 일본에서 육성된 감귤 품종 중 하나로, 국내에 약 30ha 이상이 재배되고 있다. 도입 당시, 아수미와 매우 유사한 품종이 혼입되어 농가에 큰 피해를 끼침에 따라, 아수미를 다른 품종과 구분하는 방법을 요구하는 민원이 급증해왔다.

뿐만 아니라, 무병묘 등 신품종이 공급되고 있으므로, 품종 별로 명확한 구분을 실시하여 보급 시에 묘목의 유통질서를 확립하고, 타 품종 혼입을 사전에 방지하기 위하여, 조기에 신속하고 정확하게 아수미를 구분할 필요성이 증가하고 있다.

일반적인 생물의 종 또는 특성 식별에 있어서, 종래에 형태적, 이화학적 방법도 사용되었으나, 최근 분자생물학이 발달하면서 특정 유전자 또는 SNP를 탐색하고 이를 마커로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성 등 다양한 분야에 활용되고 있다.

아수미와 같은 감귤류의 경우에도, RAPD(Random amplified polymorphic DNA) 또는 SCAR(sequence-characterized amplified region) 마커와 같이 분자 마커들을 이용하여 유전자 분석을 수행한 것이 보고되었으나(Turk J Agric For 33 (2009) 375-384), 현재까지 아수미 품종을 구분하기 위한 분자 마커는 보고된 바 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 타 품종으로부터 아수미 품종을 조기 구분하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아수미 판별용 SCAR 마커를 새로이 발굴하고, 이 마커가 아수미를 구분할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 감귤 품종 선별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 감귤 품종 선별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 감귤 품종 선별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 감귤 품종 선별을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다,

이하, 본 발명 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 감귤 품종 선별용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "감귤 품종 선별용 조성물"은 여러 감귤류 품종 중에서 특정한 감귤의 품종을 구별, 선별, 판별 또는 식별할 수 있는 조성물을 의미한다. 감귤류(citrus) 품종으로는 청견, 황금향, 흥진, 하례, 궁천, 오렌지, 및 아수미 등이 있다. 본 발명의 목적상, 상기 조성물은 감귤 품종 중 아수미를 선별할 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "아수미(asumi)"는 일본에서 '흥진 46호'와 '하루미'를 교배하여 육성된 감귤류 품종을 의미한다. 상기 아수미는 아스미 또는 asumi와 혼용될 수 있다.

상기 아수미는 매우 유사한 품종이 혼입되는 문제점이 있으며, 무병묘 등 신품종 보급 시 유통질서 확립을 위해 신속하고 정확하게 구분할 필요성이 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드가 감귤 품종을 선별할 수 있는 마커가 될 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 상기 마커는 감귤 품종을 신속하고 정확하게 선별할 수 있으며, 특히 아수미를 선별하는 마커가 될 수 있음을 확인하였다.

상기 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 이용하여 감귤 품종을 선별할 수 있다면 그 종류에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 마커는 RAPD(Random amplified polymorphic DNA) 마커, SCAR(sequence-characterized amplified region) 마커, PCR을 위한 마커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제를 포함하여 감귤 품종이 아수미 또는 이외의 품종으로 선별되는지 여부를 확인할 수 있다(실시예 1, 도 1, 및 도 2).

상기 "서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드"는 다른 감귤류 품종과 대비하여 아수미가 특이적으로 갖는 서열을 폴리뉴클레오티드 중 하나일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 서열이 대상 시료에 존재하는지 여부에 따라 대상 품종이 아수미 인지 여부를 확인할 수 있다. 구체적으로, 대상 시료로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드가 검출 또는 증폭될 경우 상기 대상 품종은 아수미로 결정될 수 으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 유전자 또는 단백질이 특정 서열번호의 염기서열 또는 아미노산 서열을 갖는 것으로 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 염기서열 또는 아미노산 서열로 이루어진 유전자 또는 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 목적하는 Ganoderma 속 미생물에 특이적으로 존재하는 것인 한, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 서열을 갖는 유전자 또는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다.

또한, 특정 서열번호로 표현되는 염기서열 또는 아미노산 서열의 유전자 또는 단백질과 동일 또는 상응하는 활성을 갖는 이상, 특정 서열번호로 표현되는 염기서열 또는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 서열도 본 발명의 범주에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 특정 서열번호의 염기서열 또는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있으며, 상응하는 효능 또는 활성을 나타내는 것으로, 목적하는 Ganoderma 속 미생물에 특이적으로 존재하는 것인한, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

구체적으로, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 아수미가 특이적으로 갖는 폴리뉴클레오티드이고, 서열번호 1의 염기서열을 모두 포함하므로, 상기 "서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드"는 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드도 포함함은 자명하다(실시예 1).

본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

본 발명에서 "검출할 수 있는 제제"는 당업계에서 일반적으로 유전자를 검출하는데 이용하는 임의의 제제를 모두 포함하며, 상기 마커의 서열 전체 또는 일부를 검출하여 마커의 존재를 확인할 수 있는 제제를 의미한다. 본 발명에서 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있다면, 종류, 서열, 제조방법 등에 제한되지 않는다,

구체적으로, 상기 제제는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브, 프라이머, 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 제제는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, "프라이머"는 검출하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 본 발명에서 프라이머는 PCR 반응을 통한 마커의 검출에 이용되기 위해 제작될 수 있으며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 따라 당업계에 알려진 방법으로 합성될 수 있다.

상기 프라이머는 RAPD 분석용 universal UBC 프라이머, SCAR 마커에 사용된 프라이머일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 10 내지 30, 28 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있으나, 이는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있다면 그 길이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 상보적이면 사용 가능하다.

구체적으로, 상기 프라이머는 서열번호 2의 프라미어, 서열번호 3의 프라이머, 또는, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성되는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 관련하여, 본 발명의 일 실시에에서는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 증폭 또는 검출함으로써 감귤 품종을 선별할 수 있음을 확인하였으며, 특히, 대상 감귤이 아수미인지 여부를 선별하였다(실시예 1, 실시예 2, 도 1, 및 도 2).

본 발명에서 "프로브"는 공지의 방법으로 특정 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화 될 수 있는 것이라면 본 발명의 범주에 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃ 1 × SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃ 0.1 × SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃ 0.1 × SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 30℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 60℃, 38℃ 내지 60℃, 38℃ 내지 58℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 감귤 품종 선별용 조성물을 포함하는 감귤 품종 선별용 키트를 제공한다,

상기 "감귤 품종 선별용 조성물"은 전술한 바와 같다.

상기 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것 일수 있으며, 본 발명의 목적상 상기 키트는 감귤 품종 중 아수미를 선별할 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 키트는 PCR　키트, RT-PCR　키트(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 감귤의 품종을 선별할 수 있다면 그 작동 원리나 형태에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 키트는 감귤 품종 선별을 위해 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분　조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 다른 구성 성분의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 키트는 마커의 검출을 위한 프라이머 쌍, 및 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 키트는 마커 검출을 위해 수행되는 증폭 반응에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있고, 또한, RT-PCR을 수행하기 위한 역전사 효소 등 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 실시간 PCR 반응 수행 및 분석을 위해 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "DNA 칩"은 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한 번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는 일반적으로 편평한 고체 지지판, 일반적으로 현미경용 슬라이드 보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산 및 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간의 다중 혼성화 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 감귤 품종 선별 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) 대상 시료로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 감귤 품종 선별용 조성물을 이용하여 핵산을 증폭 또는 검출하는 단계; 및 (b) 얻어진 증폭 산물로부터 감귤의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 감귤 품종 선별 방법을 제공한다.

상기 "감귤 품종 선별용 조성물"은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 "감귤 품종 선별 방법"은 여러 감귤류 품종 중에서 특정한 감귤의 품종을 구별, 선별, 판별 또는 식별하는 방법을 의미한다. 상기 감귤 품종 선별 방법은 특정한 감귤의 품종을 구별, 선별, 판별 또는 식별할 수 있다면 구체적인 방법에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 감귤 품종 선별 방법은 아수미를 선별하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 대상 시료는 감귤류 유래인 것일 수 있으며, 상기 게놈 DNA는 감귤의 종자, 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것일 수 있으나, 대상 작물의 게놈 DNA를 분리할 수 있다면 그 종류에 제한되지 않는다.

상기 검출은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 구체적으로, 형광물질이 결합된 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드 특이적 프로브 또는 항체 등일 수 있으며, PCR을 위한 프라이머 또는 프로브에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 증폭은 당업자에게 알려진 어떠한 방법으로도 수행될 수 있으며, 구체적인 예로 PCR, 리가제 연쇄반응(LCR), 전사증폭, 자가유지 서열 복제 또는 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 방법 등이 사용될 수 있다.

하나의 구체예로, 상기 단계(b)는 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 방법은 (c) 증폭 산물이 검출되는 경우에 상기 감귤 품종을 아수미로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아수미 품종 구분용 마커를 이용할 경우 품종 구분에 소요되는 시간 및 비용절감이 가능하다. 이에, 타 품종 혼입을 사전에 방지하여 농가의 피해 및 분쟁을 차단하며, 신품종 유통질서를 확립함으로써, 농업, 종자 및 식품 등 다양한 산업에서의 활용을 기대할 수 있다.

도 1은 아수미에서 대조군과 샘플 선발 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 마커로 청견 및 황금향과 비교하여 아수미를 판별한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 마커로 흥진, 하례, 궁천, 및 오렌지와 비교하여 아수미를 판별한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: RAPD를 이용한 아수미 판별용 마커 확인 및 프라이머 제작

1-1: 대조군과 아수미의 염기서열 비교

감귤 화분 특이적 RAPD(Random amplification of polymorphic DNA) 분석에 적합한 프라이머를 선발하기 위하여, 10개의 염기로 구성된 700종의 University of British Columbia(UBC, BC, Canada) 프라이머를 이용하여 PCR을 진행함으로써, 대조군과 비교하여 아수미에서 다른 PCR 산물을 갖는 아수미 샘플을 선발하였다(도 1). 전술한 PCR은 94℃ 5분, 94℃ 1분; 38℃ 2분; 72℃ 1분(45 회 반복); 72℃ 5분, 4℃의 순서로 이를 반복하여 수행하였다.

1-2: 아수미 특이적 SCAR 마커 확인 및 아수미 판별용 프라이머 제작

아수미 유래 PCR 산물을 대조군과 비교하였을 때, 대조군과 다른 PCR 산물은 T-벡터에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열에 대해 NCBI를 이용하여 DNA의 상동성을 분석하였으나, 유의하게 높은 상동성을 보이는 염기서열을 확인할 수 없었다.

이에 따라, 분리한 PCR 산물은 현재까지 알려지지 않은 염기서열로 예상하였으며, 확인한 아수미 특이적 서열을 as-218-1-M13F_D03으로 명명하였고, 이의 서열은 다음과 같다.

- as-218-1-M13F_D03 (서열번호 4)

CTCAGCCCAGAACCCGAACCAATGGCTCAAAATAACAACCAAACACTTAAAGAGTTGGCAACTCCTAACTTGGACCAGCAACCCTTATGCATTGAGAATCCAAACCCTCAGGTAAACTTTGAACTCAAATCTGGGATGATTCATCTTCTTCATATCTGCAATGCTTTGCAATCCATTGACGTTTCTTTTTGTAAAAGGGTAATGGAGCTGGTGGAGGGGGAGGATCTTGCGGTGGTTTGGGGTCACAATGGTGACATAAGATTGGAGATTTTTTCTTTTTGTTTTTCTTTTTCCTTGTGGTGGCATAATCATTATCCTCTTCCTAATCATCCCAGCAGGGACAATTAGGGTCACACATGCCAGAGCCAGGGGCATCCCATAGGAAATGGCCAATTTACTTGGCTGGATAAACTGGGTAACCTTCAGAGTTGAACCCTGTAATGGGTAGATCTTCCTGGGCTGAG

전술한 as-218-1-M13F_D03 서열 중에서, 마지막 뉴클레오티드 7개 서열을 제외한 폴리뉴클레오티드의 경우에도 본 발명의 마커가 될 수 있음을 확인하였는 바, 이를 서열번호 1에 나타내었다.

- 서열번호 1

CTCAGCCCAGAACCCGAACCAATGGCTCAAAATAACAACCAAACACTTAAAGAGTTGGCAACTCCTAACTTGGACCAGCAACCCTTATGCATTGAGAATCCAAACCCTCAGGTAAACTTTGAACTCAAATCTGGGATGATTCATCTTCTTCATATCTGCAATGCTTTGCAATCCATTGACGTTTCTTTTTGTAAAAGGGTAATGGAGCTGGTGGAGGGGGAGGATCTTGCGGTGGTTTGGGGTCACAATGGTGACATAAGATTGGAGATTTTTTCTTTTTGTTTTTCTTTTTCCTTGTGGTGGCATAATCATTATCCTCTTCCTAATCATCCCAGCAGGGACAATTAGGGTCACACATGCCAGAGCCAGGGGCATCCCATAGGAAATGGCCAATTTACTTGGCTGGATAAACTGGGTAACCTTCAGAGTTGAACCCTGTAATGGGTAGATCTTCCTG

이러한 결과를 바탕으로, 아수미 판별을 위하여 as-218-1-M13F_D03F 및 as-218-1-M13F_D03R 프라이머를 제작하였다. 상기 두 프라이머는 상기 서열번호 1에 표시한 CTCAGCCCAGAACCCGAACCAATGGCTC 서열 및 GTTGAACCCTGTAATGGGTAGATCTTCCTG 서열을 타겟으로 하는 프라이머로 제작하였으며, 이의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	명칭	서열
2	as-218-1-M13F_D03F	CTCAGCCCAGAACCCGAACCAATGGCTC
3	as-218-1-M13F_D03R	CAGGAAGATCTACCCATTACAGGGTTCAAC

실시예 2: 아수미 판별용 SCAR 마커 및 프라이머를 이용한 아수미 판별

실시예 1에서 확인한 아수미 판별용 마커 및 제작한 프라이머가 실제로 아수미를 판별할 수 있는지 여부를 확인하는 작업을 수행하였다.

이를 위하여, 아수미, 청견, 황금향, 흥진, 하례, 궁천, 및 오렌지를 대상으로, 실시예 1의 as-218-1-M13F_D03F 및 as-218-1-M13F_D03R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 전술한 PCR은 95℃ 5분, 95℃ 30초; 58℃ 30초; 72℃ 1분(35 회 반복); 72℃ 5분, 4℃ 의 순서로 이를 반복하여 수행하였다.

그 결과, 상기 프라이머가 타겟으로 하는 마커인 457bp 사이즈의 PCR 산물은 아수미 시료에서만 확인할 수 있었다(도 2 및 도 3).

따라서, 본 발명에서 확인한 아수미 특이적 SCAR 마커 및 이의 프라이머는 아수미를 판별할 수 있음을 확인하였다.

상술한 실시예로부터, 본 발명자들은 본 발명에서 새롭게 개발한 폴리뉴클레오티드 마커 및 이를 확인하기 위한 프라이머가 다른 작물에 대비하여 아수미를 판별할 수 있음을 확인하였다. 이에, 아수미를 분자 마커를 이용하여 대량으로 신속하게 조기 판별할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel marker for selecting a citrus variety 'Asumi'and the use thereof <130> KPA201376-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 457 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Asumi <400> 1 ctcagcccag aacccgaacc aatggctcaa aataacaacc aaacacttaa agagttggca 60 actcctaact tggaccagca acccttatgc attgagaatc caaaccctca ggtaaacttt 120 gaactcaaat ctgggatgat tcatcttctt catatctgca atgctttgca atccattgac 180 gtttcttttt gtaaaagggt aatggagctg gtggaggggg aggatcttgc ggtggtttgg 240 ggtcacaatg gtgacataag attggagatt ttttcttttt gtttttcttt ttccttgtgg 300 tggcataatc attatcctct tcctaatcat cccagcaggg acaattaggg tcacacatgc 360 cagagccagg ggcatcccat aggaaatggc caatttactt ggctggataa actgggtaac 420 cttcagagtt gaaccctgta atgggtagat cttcctg 457 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctcagcccag aacccgaacc aatggctc 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 caggaagatc tacccattac agggttcaac 30 <210> 4 <211> 464 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Asumi <400> 4 ctcagcccag aacccgaacc aatggctcaa aataacaacc aaacacttaa agagttggca 60 actcctaact tggaccagca acccttatgc attgagaatc caaaccctca ggtaaacttt 120 gaactcaaat ctgggatgat tcatcttctt catatctgca atgctttgca atccattgac 180 gtttcttttt gtaaaagggt aatggagctg gtggaggggg aggatcttgc ggtggtttgg 240 ggtcacaatg gtgacataag attggagatt ttttcttttt gtttttcttt ttccttgtgg 300 tggcataatc attatcctct tcctaatcat cccagcaggg acaattaggg tcacacatgc 360 cagagccagg ggcatcccat aggaaatggc caatttactt ggctggataa actgggtaac 420 cttcagagtt gaaccctgta atgggtagat cttcctgggc tgag 464

Claims (11)

1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 감귤 품종 선별용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 감귤 품종 중 아수미를 선별할 수 있는 것인, 감귤 품종 선별용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브, 프라이머, 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것인, 감귤 품종 선별용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 것인, 감귤 품종 선별용 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 감귤 품종 선별용 키트.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 감귤 품종 중 아수미를 선별할 수 있는 것인, 감귤 품종 선별용 키트.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 키트는 PCR　키트, RT-PCR(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 감귤 품종 선별용 키트.
   
8. (a) 대상 시료로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제4항 중 어느 하나의 조성물을 이용하여 핵산을 증폭 또는 검출하는 단계; 및
   (b) 얻어진 증폭 산물로부터 감귤의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 감귤 품종 선별 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 감귤의 종자, 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것인, 감귤 품종 선별 방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 단계(b)는 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것인, 감귤 품종 선별 방법.
    
11. 제8항에 있어서, 상기 방법은 (c) 증폭 산물이 검출되는 경우에 상기 감귤 품종을 아수미로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 감귤 품종 선별 방법.

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