KR20220075628A - 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법 및 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 치아 우식의 원인이 되는 유해균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae), 락토바실러스 속(Lactobacillus) 및 액티노티그넘 속(Actinotignum), 및 구강 내에서 정상적으로 존재하는 상재균인 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 및 액티노마이세스 속(Actinomyces)의 일곱 가지 미생물에 대한 프라이머 세트(또는 프라이머 및 프로브 세트)를 사용하는 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법 및 상기 프라이머 세트(또는 프라이머 및 프로브 세트)를 포함하는 치아 우식증 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 PCR, 특히 실시간-PCR을 이용하여 한국인의 유아기 또는 아동기의 치아 우식증과 밀접하게 관련된 미생물을 매우 정확하게 그리고 정량적으로도 검출할 수 있어 치아 우식증의 신속 정확한 진단 또는 이를 위한 정보제공이 가능하다. 특히 본 발명은 멀티플렉스 PCR을 적용할 수 있어, 적은 수의 반응액 내에서 치아 우식증과 관련된 여러 표적 미생물을 동시에 정확하게 검출하는 것이 가능하므로 보다 신속하고 용이한 진단 또는 정보제공을 가능하게 한다는 장점이 있다. 또한 본 발명은 한국인 유아 또는 아동에 적합하도록 발명된 것으로, 그동안 효과적인 방법이 없어 정확한 진단이 어려웠던 한국인 유아 또는 아동의 치아 우식증 진단에 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
본 발명에 따르면 PCR, 특히 실시간-PCR을 이용하여 한국인의 유아기 또는 아동기의 치아 우식증과 밀접하게 관련된 미생물을 매우 정확하게 그리고 정량적으로도 검출할 수 있어 치아 우식증의 신속 정확한 진단 또는 이를 위한 정보제공이 가능하다. 특히 본 발명은 멀티플렉스 PCR을 적용할 수 있어, 적은 수의 반응액 내에서 치아 우식증과 관련된 여러 표적 미생물을 동시에 정확하게 검출하는 것이 가능하므로 보다 신속하고 용이한 진단 또는 정보제공을 가능하게 한다는 장점이 있다. 또한 본 발명은 한국인 유아 또는 아동에 적합하도록 발명된 것으로, 그동안 효과적인 방법이 없어 정확한 진단이 어려웠던 한국인 유아 또는 아동의 치아 우식증 진단에 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법 및 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 치아 우식의 원인이 되는 유해균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae), 락토바실러스 속(Lactobacillus) 및 액티노티그넘 속(Actinotignum), 및 구강 내에서 정상적으로 존재하는 상재균인 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 및 액티노마이세스 속(Actinomyces)의 일곱 가지 미생물에 대한 프라이머 세트(또는 프라이머 및 프로브 세트)를 사용하는 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법 및 상기 프라이머 세트(또는 프라이머 및 프로브 세트)를 포함하는 치아 우식증 진단용 키트에 관한 것이다.
치아 우식은 치아의 에나멜질이나 상아질이 침범된 불가역적 질환으로, 미취학 아동기와 초등학교 학령기 및 청소년기에 집중적으로 발생하는 특징을 가지는 현대병 중의 하나이며 원인균에 의한 다인성 감염병으로 정의되기도 한다. 치아 우식은 입안에 서식하는 박테리아에 의해 설탕, 전분 등이 분해되면서 생성된 산(acid)에 의해 치아 표면의 무기질이 빠져나가고 그 속의 유기질이 용해되면서 치아의 법랑질이 손상되어 치아가 파괴되는 현상을 말한다. 치아 우식의 발생에는 유전, 질병, 치아의 위치 및 형태와 같은 환자 요인, 구강 위생 상태, 식생활 습관과 같은 환경 요인, 구강 내 세균의 종류, 양, 활동성과 같은 세균 요인 등이 원인이 된다. 인간의 구강에는 약 700종 이상의 세균이 상재하고 있는데, 치아 우식의 대표적인 원인균으로 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 알려져 있고, 락토바실러스 속(Lactobacillus) 등이 치아 우식의 활성과 관련되어 있다고 보고되고 있다.
2018년의 아동구강건강실태조사에 따르면 우리나라의 12세 아동이 경험한 평균 충치 개수는 1.9개로 경제협력개발기구(OECD, Organization for Economic Cooperation and Development) 가입국 평균인 1.2개보다 많은 수준이며, OECD 가입국 중 하위권에 해당한다. 뿐만 아니라 영구치 우식의 경험률은 만 6세부터 증가하여 만 20세 무렵에 이르면 90%를 상회하는 등 대다수의 국민들이 경험한 수준에 이른다.
치아 우식은 발생 후 완전한 치료가 어려워 반드시 후유증이 남게 되며, 소아기 때의 치아 상실의 가장 큰 원인이 된다. 또한 생활수준이 높아지면서 국민의 평균수명이 늘어나고, 이에 따라 노인 인구도 증가하는 추세이기 때문에 조기 치아 관리의 필요성이 대두되고 있으며, 이에 따라 치아 우식의 조기진단 및 예방적 개입이 매우 중요하다.
차세대 염기서열분석법(Next Generation Sequencing, NGS)은 세포로부터 추출한 유전체 DNA(genomic DNA)를 많은 조각으로 단편화하여 단편화된 DNA 조각의 염기서열을 해독해 유전자 정보 전체를 빠르고 정확하게 분석할 수 있는 기술이다. 차세대 염기서열분석(NGS)의 플랫폼을 통하여 16S rRNA 염기서열 기반의 유전체 DNA를 구성하고 있는 세균의 염기서열 분석이 가능해졌을 뿐만 아니라 유전체 분석에 필요한 비용이 급격히 낮아져 다양하고 많은 연구 분야에서 활용되고 있다.
현재까지 치아 우식의 원인인 구강 세균 검출을 위해 국내에 상용화 되어있는 대부분의 qPCR(quantitative Polymerase Chain Reaction) 키트는 스트렙토코커스 뮤탄스균을 검출하는 것을 목적으로 하는 실정이다. 그러나 현재 보고되는 문헌들에 의하면 치아 우식의 원인균은 인종별로 다를 뿐만 아니라, 같은 인종 내에서도 연령과 시기별로 다르다는 점들이 부각된다. 그러므로 우리나라 국민에 적합한, 특히 우리나라 국민의 유아기 또는 아동기에 적합한 치아 우식증의 진단 관련 기술의 개발이 필요하다.
또한, 치아 우식 유발 구강 미생물의 검출을 위해서 균을 배양기에서 배양하는 방법, 미생물의 항체를 이용하여 미생물을 검출하는 방법 등 외에도 기술의 개발이 이루어졌으나, 낮은 민감도, 검출균 종류의 제한 등의 원인으로 치아 우식을 유발하는 다종의 미생물을 동시에 정확하게 검출하기 위한 기술이 부족한 실정이다. 그러므로 이러한 문제를 개선할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 차세대염기서열분석(NGS)의 마이크로바이옴을 바탕으로, 우리나라 국민의 유아기 또는 아동기의 정상적인 상재균과 치아 우식 관련 유해균을 분석하고, 이들을 정확하고 용이하게, 특히 다종의 미생물을 동시에 검출할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다.
Corby P, et al, 2005, Journal of clinical microbiology, 43(11):5753-9.
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따라서 본 발명의 주된 목적은 한국인의 유아기 또는 아동기에 적합한 치아 우식증의 진단 관련 기술, 보다 구체적으로는 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법 및 치아 우식증 진단용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제1세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제2세트; 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제3세트; 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제4세트; 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제5세트; 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제6세트; 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제7세트;를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 제1세트는 서열번호 17의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제2세트는 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제3세트는 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제4세트는 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제5세트는 서열번호 21의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제6세트는 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제7세트는 서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 제1세트 및 제2세트를 하나의 반응액 내에 포함시키고, 상기 제3세트 및 제4세트를 하나의 반응액 내에 포함시키고, 상기 제5세트, 제6세트 및 제7세트를 하나의 반응액 내에 포함시켜 중합효소연쇄반응을 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 서열번호 15의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제8세트;를 더 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 제8세트는 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는 프로브 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제1세트; 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제2세트; 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제3세트; 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제4세트; 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제5세트; 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제6세트; 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제7세트;를 포함하는 치아 우식증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 제1세트는 서열번호 17의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제2세트는 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제3세트는 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제4세트는 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제5세트는 서열번호 21의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제6세트는 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는 프로브를, 상기 제7세트는 서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 제1세트 및 제2세트가 하나의 조성물로 포함되고, 상기 제3세트 및 제4세트가 하나의 조성물로 포함되고, 상기 제5세트, 제6세트 및 제7세트가 하나의 조성물로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서, 서열번호 15의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제8세트;를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 제8세트는 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는 프로브 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면 PCR, 특히 실시간-PCR을 이용하여 한국인의 유아기 또는 아동기의 치아 우식증과 밀접하게 관련된 미생물을 매우 정확하게 그리고 정량적으로도 검출할 수 있어 치아 우식증의 신속 정확한 진단 또는 이를 위한 정보제공이 가능하다. 특히 본 발명은 멀티플렉스 PCR을 적용할 수 있어, 적은 수의 반응액 내에서 치아 우식증과 관련된 여러 표적 미생물을 동시에 정확하게 검출하는 것이 가능하므로 보다 신속하고 용이한 진단 또는 정보제공을 가능하게 한다는 장점이 있다. 또한 본 발명은 한국인 유아 또는 아동에 적합하도록 발명된 것으로, 그동안 효과적인 방법이 없어 정확한 진단이 어려웠던 한국인 유아 또는 아동의 치아 우식증 진단에 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선(amplification plot)의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선(standard curve)을 나타낸 것이다.
도 2는 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 액티노티그넘 속(Actinotignum)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 액티노마이세스 속(Actinomyces)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 락토바실러스 속(Lactobacillus)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 7은 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 8은 총 박테리아의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 8가지의 균주 중 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae)의 프라이머 및 프로브(제1세트 및 제2세트)를 혼합한 후, 멀티플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에서 8가지의 균주 중 액티노티그넘 속(Actinotignum)과 액티노마이세스 속(Actinomyces)의 프라이머 및 프로브(제3세트 및 제4세트)를 혼합한 후, 멀티플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 8가지의 균주 중 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva), 락토바실러스 속(Lactobacillus), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 및 총 박테리아의 프라이머 및 프로브(제5세트, 제6세트, 제7세트 및 제8세트)를 혼합한 후, 멀티플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 액티노티그넘 속(Actinotignum)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 액티노마이세스 속(Actinomyces)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 락토바실러스 속(Lactobacillus)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 7은 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis)의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 8은 총 박테리아의 플라스미드 DNA를 다양한 농도의 배율로 희석한 후 싱글플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과로, 최소검출한도와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 8가지의 균주 중 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae)의 프라이머 및 프로브(제1세트 및 제2세트)를 혼합한 후, 멀티플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에서 8가지의 균주 중 액티노티그넘 속(Actinotignum)과 액티노마이세스 속(Actinomyces)의 프라이머 및 프로브(제3세트 및 제4세트)를 혼합한 후, 멀티플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 8가지의 균주 중 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva), 락토바실러스 속(Lactobacillus), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 및 총 박테리아의 프라이머 및 프로브(제5세트, 제6세트, 제7세트 및 제8세트)를 혼합한 후, 멀티플렉스 실시간-PCR 실험조건에서 나타난 형광 증폭 곡선의 결과와 표준 곡선을 나타낸 것이다.
본 발명의 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법은 치아 우식의 원인이 되는 유해균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae), 락토바실러스 속(Lactobacillus) 및 액티노티그넘 속(Actinotignum), 및 구강 내에서 정상적으로 존재하는 상재균인 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 및 액티노마이세스 속(Actinomyces)의 일곱 가지 미생물에 대한 프라이머 세트를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 분야에서 '프라이머'는 일반적으로 DNA 합성 시 주형에 상보적인 또 하나의 중합체 가닥이 만들어지는 개시점이 되는 짧은 유전자 서열의 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 본 발명에서 사용되는 용어 '프라이머' 또한 상기와 같은 의미로 이해할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 각 프라이머 세트는 각각의 표적 미생물의 유전체 DNA에 특이적으로 존재하는 부위를 증폭할 수 있도록 설계된 것으로, 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하며, 시료 내에 표적 미생물 또는 표적 미생물의 유전체 DNA가 존재할 경우 이 시료 또는 시료로부터 추출된 DNA를 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)을 수행하면 예상되는 크기의 증폭산물을 생성할 수 있다.
본 발명에서 상기 제1세트가 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 프라이머 세트, 제2세트가 스카도비아 위그시에에 대한 프라이머 세트, 제3세트가 액티노티그넘 속에 대한 프라이머 세트, 제4세트가 액티노마이세스 속에 대한 프라이머 세트, 제5세트가 아비오트로피아 디펙티바에 대한 프라이머 세트, 제6세트가 락토바실러스 속에 대한 프라이머 세트, 제7세트가 라우트로피아 미라빌리스에 대한 프라이머 세트로 제공된다.
보다 구체적으로 상기 제1세트는 스트렙토코커스 뮤탄스의 gtfB를 증폭하기 위한 프라이머 세트로 예상되는 증폭 DNA의 크기는 124bp이고, 상기 제2세트 내지 제7세트는 각 표적 미생물의 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트로 예상되는 증폭 DNA의 크기는 각각 순서대로 111bp, 163bp, 240bp, 281bp, 78bp, 230bp이다.
따라서 본 발명의 프라이머 세트를 사용하고 시료 또는 시료로부터 추출된 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였을 때, 상기와 같은 예상되는 크기의 증폭산물이 생성되면, 시료 내에 해당 미생물이 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 예를 들어, 제1세트를 사용하여 124bp 크기의 증폭산물이 생성되면 시료 내에 스트렙토코커스 뮤탄스가 존재한다고 판단할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 시료 내에 존재하는 미생물이 결정되면, 다음과 같은 치아 우식증 진단에 관한 정보를 얻을 수 있다.
시료 내에 스트렙토코커스 뮤탄스, 스카도비아 위그시에이, 액티노티그넘 속 미생물, 락토바실러스 속 미생물 중 세 가지 이상의 미생물이 존재하는 것으로 결정되거나 아비오트로피아 디펙티바, 라우트로피아 미라빌리스, 액티노마이세스 속 미생물 중 한 가지 이하의 미생물이 존재하는 것 또는 두 가지 경우를 모두 만족하는 경우에는, 즉 제1세트에 의한 증폭산물, 제2세트에 의한 증폭산물, 제3세트에 의한 증폭산물, 제6세트에 의한 증폭산물 중 세 가지 이상이 검출되거나 제4세트에 의한 증폭산물, 제5세트에 의한 증폭산물, 제7세트에 의한 증폭산물 중 한 가지 이하로 검출되는 경우 또는 두 가지 경우를 모두 만족하는 경우 상기 대상은 치아 우식증 고위험군으로 분류할 수 있다.
시료 내에 스트렙토코커스 뮤탄스, 스카도비아 위그시에이, 액티노티그넘 속 미생물, 락토바실러스 속 미생물 중 두 가지 이하의 미생물이 존재하는 것으로 결정되거나 아비오트로피아 디펙티바, 라우트로피아 미라빌리스, 액티노마이세스 속 미생물 중 두 가지 이상의 미생물이 존재하는 것 또는 두 가지 경우를 모두 만족하는 경우에는, 즉 제1세트에 의한 증폭산물, 제2세트에 의한 증폭산물, 제3세트에 의한 증폭산물, 제6세트에 의한 증폭산물 중 두 가지 이하로 검출되거나 제4세트에 의한 증폭산물, 제5세트에 의한 증폭산물, 제7세트에 의한 증폭산물 중 두 가지 이상으로 검출되는 경우 또는 두 가지 경우를 모두 만족하는 경우 상기 대상은 치아 우식증 저위험군으로 분류할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트가 표적으로 하는 각 미생물들은 한국인 유아 또는 아동 중 치아 우식이 없는 정상군과 치아 우식이 있는 실험군의 구강 미생물을 차세대 염기서열분석(NGS)을 통한 마이크로바이옴 분석으로 확인하고, 이 결과를 기존의 연구결과들과 대조하여 선정한 것으로, 한국인 유아 또는 아동의 치아 우식증과 밀접한 관련이 있는 미생물들이라고 할 수 있다. 따라서 본 발명은 한국인 유아 또는 아동을 대상으로 하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 정보제공방법은 한국인 유아 또는 아동의 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법인 것이 바람직하며, 본 발명의 키트는 한국인 유아 또는 아동의 치아 우식증 진단용 키트인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 본 발명은 만 12세 미만이며 유치열이 완성된 한국인 유아 또는 아동을 대상으로 한다.
본 발명에서 사용되는 시료, 즉 PCR에 주형으로 사용되는 시료로는 구강에서 유래된 생물학적 시료를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 타액(침) 또는 가글액을 사용한다. 또한, 상기와 같은 시료를 그대로 PCR을 위한 주형으로 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 시료로부터 DNA 추출한 다음 생성된 추출 DNA를 주형으로 사용한다.
본 발명에서 PCR로는 변성(denaturation) - 결합(annealing) - 신장(extension)의 3단계를 반복하는 3단계 PCR(3-step PCR) 또는 결합과 신장을 동시에 수행하는 2단계 PCR(2-step PCR)을 사용할 수 있다. 바람직하게는 반응시간을 줄일 수 있는 2단계 PCR을 사용한다.
PCR 조건은 95℃로 15초 동안의 변성 단계와 60℃로 30초 동안의 결합 및 신장 단계를 40회 반복(사이클)하는 조건이다.
바람직하게는 상기와 같은 조건으로 PCR을 수행하기 전 UDG(Uracil-DNA Glycosylase) 반응 단계를 추가하여 오염으로 인한 결과오류를 방지한다.
본 발명에서 바람직하게는 실시간-PCR(real-time PCR)(또는 정량적 PCR(quantitative PCR))을 수행한다. 본 발명에서 제공하는 프로브는 이러한 실시간-PCR을 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시간-PCR을 수행하면, 시료 내 표적 미생물의 농도 또는 수를 측정할 수 있어 보다 정확한 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 따라서 바람직하게는 본 발명의 프라이머 세트는 상기 프로브를 더 포함한다.
본 발명의 프라이머 세트는 멀티플렉스 PCR을 적용할 수 있다. 본 발명에서 실험을 통해 확인된 바에 따르면, 본 발명의 제1세트 및 제2세트는 서로의 반응에 간섭하지 않으며, 제3세트 및 제4세트; 제5세트, 제6세트, 제7세트 및 제8세트; 또한 서로의 반응에 간섭하지 않는다. 따라서 이들 서로 간섭하지 않는 프라이머 세트의 PCR을 하나의 반응액 내에서 수행할 수 있다. 예를 들어 제1세트 및 제2세트를 하나의 반응액에 첨가하여 PCR을 수행할 수 있다. 이렇게 멀티플레스 PCR이 가능하다는 점은 반응액의 수를 줄여 반응에 필요한 재료, 인력, 시간 등의 소모를 줄일 수 있어, 결과적으로 실시 용이성을 높이는 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 제8세트는 일반적인 그람 양성 및 그람 음성 미생물에 대한 프라이머 세트로 PCR 반응 대조군의 역할을 할 수 있다. 이 세트를 함께 사용하면 제1세트 내지 제7세트의 표적 미생물 이외에 시료 내에 존재하는 다른 그람 양성 및 그람 음성 미생물을 모두 검출할 수 있으므로, 시료 내 총 미생물의 양을 파악할 수 있다. 따라서 바람직하게는 본 발명의 정보제공방법은 상기 제8세트를 더 사용하며, 본 발명의 키트는 상기 제8세트를 더 포함한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브는 검출 용이성 등을 위한 표지물질이 표지된 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 표지물질은 예를 들어 그 자체가 검출가능한 신호를 방출하는 직접적인 표지물질일 수 있으며, 다른 물질과의 반응 혹은 다른 물리적인 자극에 의해 검출가능한 상태로 전환되는 간접적인 표지물질일 수 있다.
본 발명의 키트는 상기와 같은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하여 중합효소연쇄반응을 통한 치아 우식증 진단을 용이하게 할 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 제1세트 및 제2세트; 제3세트 및 제4세트; 제5세트, 제6세트, 제7세트 및 제8세트; 사이에 간섭이 없는 것으로 확인되었으므로, 본 발명의 키트는 바람직하게는 서로 간섭이 없는 세트들의 PCR 반응이 하나의 반응액 내에서 이루어질 수 있도록 구성된다. 예를 들어, 제1세트 및 제2세트; 제3세트 및 제4세트; 제5세트, 제6세트 및 제7세트(또는 제8세트 포함);가 각각 하나의 조성물로 포함되도록 구성된다. 예를 들어, 하나의 튜브에 상기 간섭이 없는 프라이머 세트끼리 포함된 형태일 수 있다.
본 발명의 키트는 상기와 같은 프라이머 세트 이외에도 PCR을 용이하게 수행하는데 필요한 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있다. 예를 들어, PCR에 필요한 중합효소(polymerase), dNTP, 완충액 등이 포함될 수 있으며, 시료로부터 DNA를 추출하는데 필요한 시약, 기구 등이 더 포함될 수도 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 치아 우식 관련 구강 세균 선정
1-1. 분석 시료
치아 우식을 일으키는 원인 유해균 및 상재균을 선별하기 위한 분석은 부산대학교 치과병원 소아치과에 검진 및 치료를 위해 내원한 120명의 아동을 대상으로 하였으며(표 1 참조), 만 6세 미만(그룹1), 만 6세 이상 ~ 만 12세 미만(그룹2)으로 분류하였다. 연령별 군 분류는 세계보건기구(World Health Organization; WHO)에서 제시하는 구강 건강 조사의 기준을 따랐으나, 만 6세 미만 아동의 경우 유치열이 완성된(상, 하 유치 20개 맹출 상태) 아동을 대상으로 하였다. 또한 일반적으로 유치열이 완성되는 시기는 만 3세이므로, 유치열이 완성되고 타액을 모을 수 있는 협조가 가능한 만 3세 ~ 6세 아동을 주 대상으로 하였다. 구강위생 관리 능력에 지장을 줄 정도의 심한 전신질환이 있거나, 타액선 기능 이상이 있는 아동은 제외하였으며, 대상자 본인과 법정대리인으로부터 동의서를 받았다. 피검자에 가글액을 제공하여 30초간 가글하도록 한 후 가글액과 타액을 함께 지정된 용기에 수집하고 분석 전까지 냉장 보관하였다.
1-2. 미생물로부터 DNA의 추출
ExgeneTM Clinic SV DNA 추출 키트(진올바이오테크놀러지, 한국)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 시료의 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 추출한 유전체 DNA는 Microplate reader Epoch 2(BioTek, 미국)로 농도 및 품질(260/280 비율, 260/230 비율)을 확인한 후 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용한 마이크로바이옴 분석에 주형 DNA로 사용하였다.
| 군 | 구분 | 연령대 | 시료유형 | 인원수(명) |
| 대조군(정상군) | 그룹1 | 만6세 미만 | 타액(saliva) | 30 |
| 그룹2 | 만6~12세 미만 | 타액(saliva) | 30 | |
| 실험군(치아 우식군) | 그룹1 | 만6세 미만 | 타액(saliva) | 30 |
| 그룹2 | 만6~12세 미만 | 타액(saliva) | 30 | |
| 합계 | 120 | |||
1-3. 차세대 염기서열분석을 통한 마이크로바이옴 분석
상기 1-2에서 추출한 DNA 시료로 구강미생물의 종류를 확인하기 위해서 차세대 염기서열분석을 수행하였다. 만 6세 미만인 그룹1과 만 6세 이상 ~ 만 12세 미만인 그룹2의 그룹 간 마이크로바이옴 데이터로 군집의 다양성을 분석하였고, 그 결과 각 그룹별로 치아 우식이 없는 대조군(비우식군, 정상군)과 비교하여 치아 우식이 있는 실험군에서 통계적으로 유의하게 증가하거나 감소하는 구강 세균을 후보군으로 선정하였다.
만 6세 미만인 그룹1의 타액 시료를 분석 결과, 치아 우식이 없는 대조군에서 갓샬키아 퓨리닐리티카(Gottschalkia purinilytica), 나이세리아 오랄리스(Neisseria oralis) 외 5종의 균주, 치아 우식이 있는 실험군에서는 액티노티그넘(Actinotignum) 속, 코리네박테리움 마트루초티(Corynebacterium matruchotii), 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae) 외 8종류의 균주가 우세하게 많이 발견되었다.
만 6세 이상 ~ 만 12세 미만인 그룹2의 타액 시료 분석 결과, 대조군에서 액티노마이세스(Actinomyces) 속, 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva), 클로아시박테리움(Cloacibacterium) 속, 코리네박테리움 듀럼(Corynebacterium durum), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabillis) 외 38종의 균주가, 실험군에서는 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 프리보텔라 덴티콜라(Prevotella denticola), 프리보텔라 팔렌스(Prevotella pallens), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 외 34종의 균주가 우세하게 발견되었다(표 2 및 표 3 참조).
| 군 | 분류 수준 | 균주명 |
| 대조군 | 종(Species) | Gottschalkia purinilytica |
| 종(Species) | Neisseria oralis | |
| ... | ... | |
| 실험군 | ... | ... |
| 속(Genus) | Actinotignum | |
| 종(Species) | Corynebacterium matruchotii | |
| 종(Species) | Scardovia wiggsiae |
| 군 | 분류 수준 | 균주명 |
| 대조군 | 속(Genus) | Actinomyces |
| 종(Species) | Abiotrophia defectiva | |
| 종(Species) | Cloacibacterium | |
| 종(Species) | Corynebacterium durum | |
| 종(Species) | Lautropia mirabilis | |
| ... | ... | |
| 실험군 | ... | ... |
| 속(Genus) | Lactobacillus | |
| 종(Species) | Prevotella denticola | |
| 종(Species) | Prevotella pallens | |
| 종(Species) | Streptococcus mutans |
1-4. 치아 우식 관련 구강 세균 선정
상기 1-3의 방법으로 분석한 연령대별 마이크로바이옴 데이터로 치아 우식과 관련된 구강 세균의 후보군을 선별하였다.
최종적으로 선정된 균주의 선행논문에 의하면 치아 우식 원인 유해 세균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 치아 우식의 주된 원인균으로 알려져 있고(Journal of clinical microbiology, 43(11):5753-9; Journal of dental research, 90(11):1298-305), 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae)는 초기 치아 우식 유발과 관련되어 있으며 치아 우식군의 구강 내에서 높은 농도로 발견된다고 알려진바 있다(Journal of dental research, 90(11):1298-305; Infection and immunity, 85(8)). 락토바실러스 속(Lactobacillus)은 치아 우식의 활성과 관련되어 있으며, 치아 우식이 진행된 환자의 구강에서 다수 발견되고(Journal of clinical microbiology, 43(11):5753-9; Infection and immunity, 85(8); Microbial ecology, 67(4):962-9), 액티노티그넘 속(Actinotignum)은 3세 이상 치아 우식을 앓는 유아의 구강에서 발견된다고 알려져 있다(PLoS One, 10(5):e0128534).
반면에 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva)는 치아 우식이 없는 건강한 어린이의 구강에서 발견된다고 알려져 있으며(Journal of clinical microbiology, 43(11):5753-9; PLoS One, 10(5):e0128534; PLoS One, 8(3):e58487), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis)는 치아 우식 치료 후 충치가 재발하지 않은 비우식 군의 구강에서 증가하여 발견된다고 알려진다(Journal of dental research, 90(11):1298-305; Infection and immunity, 85(8); Journal of Periodontology, 83(10):1279-87). 또한, 액티노마이세스 속(Actinomyces)은 만 4세의 치아 우식이 없는 어린이의 타액과 플라크에서 발견되었다고 알려진 바 있다(Infection and immunity, 85(8); PLoS One, 10(5):e0128534; Journal of Oral Microbiology, 11(1):1653124).
그러므로, 기존의 연구논문과 상기 1-3의 임상 시료 분석 결과가 일치하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae), 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis), 락토바실러스 속(Lactobacillus), 액티노티그넘 속(Actinotignum), 액티노마이세스 속(Actinomyces)의 균주들을 최종적으로 선정하였다(표 4 참조).
| 선별 균주 | 선행문헌 |
| Streptococcus mutans | Journal of clinical microbiology, 43(11):5753-9 Journal of dental research, 90(11):1298-305 |
| Scardovia wiggsiae | Journal of dental research, 90(11):1298-305 Infection and immunity, 85(8) |
| Actinotignum | Microbial ecology, 67(4):962-9 |
| Actinomyces | Infection and immunity, 85(8) PLoS One, 10(5):e0128534 Journal of Oral Microbiology, 11(1):1653124 |
| Abiotrophia defectiva | Journal of clinical microbiology, 43(11):5753-9 PLoS One, 10(5):e0128534 PLoS One, 8(3):e58487 |
| Lactobacillus | Journal of clinical microbiology, 43(11):5753-9 Infection and immunity, 85(8) Microbial ecology, 67(4):962-9 |
| Lautropia mirabilis | Journal of dental research, 90(11):1298-305 Infection and immunity, 85(8) Journal of Periodontology, 83(10):1279-87 |
2. 프라이머 및 프로브의 제작 및 합성
상기 1의 선정을 통해 선별된 각 치아 우식 관련 유해균 및 상재균의 gtfB 및 16S rRNA 유전자를 분석하여 상호 저해하지 않으며 민감도와 특이성을 확보할 수 있도록 프라이머(표 5 참조) 및 프로브(표 6 참조)를 디자인하였다.
또한 추가로 그람 양성 및 그람 음성(총 박테리아)에 대한 프라이머 및 프로브를 각각 디자인하여 모든 박테리아를 검출할 수 있도록 하였다.
선정한 7종류의 후보군과 총 박테리아에 대한 특이적 염기서열을 타겟으로 프라이머 디자인 시 Tm(melting temperature), 헤어핀, 자가-이합체화, 헤테로-이합체화를 고려하고, 타겟만을 특이적으로 검출할 수 있도록 하였다.
프로브들은 Taq man probe형으로 디자인하였으며, 마이크로바이옴 데이터의 서열 개수(reads)를 참고하고 형광 간의 서로 간섭을 고려하여 4종의 프로브 표지물질(dye)을 선정하였다.
| 세트 | 균주 | 프라이머 명칭 | 서열번호 | 서열(5'→3') | 유전자 | 증폭크기(bp) |
| A | Streptococcus mutans | 정방향 | 1 | ACAGCTCAGAGATGCTATTCTTAA | gtfB | 124 |
| 역방향 | 2 | ATTATTGAAGTGACGCCATACAC | ||||
| Scardovia wiggsiae | 정방향 | 3 | GGAGCATGCGGATTAATTCGAT | 16S rRNA | 111 | |
| 역방향 | 4 | TGCACCACCTGTAACCCA | ||||
| B | Actinotignum | 정방향 | 5 | TAACTCGGAGGAAGGTGGG | 16S rRNA | 163 |
| 역방향 | 6 | ACGAGGTCGAGTTGCAGA | ||||
| Actinomyces | 정방향 | 7 | TGTTTTTGGTGGGGGATGGG | 16S rRNA | 240 | |
| 역방향 | 8 | TGCTTCACTGGCGAAAGAGGTTT | ||||
| C | Abiotrophia defectiva | 정방향 | 9 | TTCAGTGAGGAAAGGTGGC | 16S rRNA | 281 |
| 역방향 | 10 | GCAGTTACTCTATGCGCTGT | ||||
| Lactobacillus | 정방향 | 11 | AAGTCACGGCTAACTACGTG | 16S rRNA | 78 | |
| 역방향 | 12 | CTTTACGCCCAATAAATCCGG | ||||
| Lautropia mirabilis | 정방향 | 13 | CTTATGTGTAGGGCTTCAC | 16S rRNA | 230 | |
| 역방향 | 14 | CCTACTTCTGGTAAAACCCACT | ||||
| 총 박테리아 | 정방향 | 15 | TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAG | 16S rRNA | 159, 161 | |
| 역방향 | 16 | TGCGGGACTTAACCCAACAT |
| 세트 | 균주 | 서열번호 | 서열(5'→3') | 5'표지 | 3'표지 |
| A | Streptococcus mutans | 17 | AATGACGGTCGCCGTTATGAAAATGG | VIC | QSY |
| Scardovia wiggsiae | 18 | GACATAACCTGGATGATGCCAGAGATGG | FAM | QSY | |
| B | Actinotignum | 19 | CATGCTACAATGGCCGGTACAG | ABY | QSY |
| Actinomyces | 20 | TGGACGGTCACACTGGGACTGAGACA | JUN | QSY | |
| C | Abiotrophia defectiva | 21 | CGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAA | ABY | QSY |
| Lactobacillus | 22 | CGCGGTAATACGTAGGTGGCAA | FAM | QSY | |
| Lautropia mirabilis | 23 | ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGC | VIC | QSY | |
| Total bacteria | 24 | CAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG | JUN | QSY | |
| 25 | ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGT | JUN | QSY |
3. 프라이머 및 프로브 검증
3-1. 균주 플라스미드 제작
상기 프라이머 및 프로브의 유효성을 평가하기 위해서 차세대 염기서열분석을 통해 선별된 다양한 균주의 플라스미드를 분석 시료로 사용하였다.
분석 대상 균주는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스카도비아 위그시에이(Scardovia wiggsiae), 락토바실러스 속(Lactobacillus), 액티노티그넘 속(Actinotignum), 아비오트로피아 디펙티바(Abiotrophia defectiva), 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis), 액티노마이세스 속(Actinomyces) 및 총 박테리아이다. 상기 균주들의 타겟 서열을 플라스미드에 클로닝하여 실험에 사용하였다.
3-2. 싱글플렉스 실시간-PCR
각 대상 균주에 대한 상기 2의 프라이머 및 프로브(표 5 및 6 참조)의 작동 여부 확인을 위해서 실시간-PCR을 실시하였다.
싱글플렉스 실시간-PCR 반응을 위한 조성물은 프라이머 및 프로브 혼합물 2㎕, 균주 플라스미드 DNA 2㎕, 2X Taqman multiplex mastermix(Thermofisher, 미국) 10㎕, 3차 멸균수 6㎕를 포함하여, 최종 용량이 20㎕가 되게 하였다. 그 다음 96-웰 플레이트에 분주하고, 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. PCR 반응을 수행하기 위한 PCR 기기는 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System(Thermofisher, 미국)을 사용하였고, 오염 방지 단계의 UDG 반응을 위해 50℃에서 2분간 반응시켰으며, 이후 UDG의 불활성화를 위해 95℃에서 10분간 유지하였다. PCR 증폭의 단계는 95℃에서 15초, 60℃에서 30초로 40회 반복하여 수행하였다(표 7 내지 9 참조).
| 프라이머 (정방향 및 역방향 각각) |
프로브 | |
| Streptococcus mutans | 4 μM | 2 μM |
| Scardovia wiggsiae | 4 μM | 2 μM |
| Actinotignum | 4 μM | 2 μM |
| Actinomyces | 4 μM | 2 μM |
| Abiotrophia defectiva | 9 μM | 2 μM |
| Lactobacillus | 4 μM | 2 μM |
| Lautropia mirabilis | 4 μM | 2 μM |
| Total bacteria | 2 μM | 1 μM |
| 구분 | 부피 |
| 2X Taqman multiplex mastermix | 10 ㎕ |
| 10X 프라이머/프로브 혼합물 | 2 ㎕ |
| 플라스미드 DNA | 2 ㎕ |
| 증류수 | 6 ㎕ |
| 전체 부피 | 20 ㎕ |
| 목적 | 단계별 온도 | 시간 | 사이클 |
| UDG반응 | 50℃ | 2분 | 1 |
| UDG불활성화 | 95℃ | 10분 | 1 |
| 증폭 | 95℃ | 15초 | 40 |
| 60℃ | 30초 |
3-3. 싱글플렉스 실시간-PCR 민감도 시험
제작된 프라이머 및 프로브를 기반으로 하여 최적화된 PCR 조건으로 치아 우식 관련 유해균, 상재균, 총 박테리아에 대한 8종의 싱글플렉스 실시간-PCR 실험을 통해 각 균주에 대한 민감도(sensitivity) 시험을 수행하였다.
프라이머의 민감도 확인을 위해 균주별 109 카피수로 들어 있는 초기 표준 플라스미드 DNA를 1/10배씩 순차적으로 희석을 수행하여 형광 증폭 곡선(amplification plot)으로 최소 검출 한도를 확인하고, 형광 증폭 곡선의 결과에 나타난 시료의 Ct(cycle threshold) 값을 바탕으로 표준 곡선(standard curve)을 구축하고 각 시료의 정량에 적용하였다(표 10 내지 17 참조).
| Streptococcus mutans | ||||||||
| 플라스미드 DNA양 | 316 pg | 31.6 pg | 3.16 pg | 316 fg | 31.6 fg | 3.16 fg | 316 ag | 31.6 ag |
| Ct값 | 14.91 | 18.19 | 21.46 | 24.69 | 27.87 | 31.15 | 34.80 | 38.11 |
| Log값 | 7.97 | 6.98 | 5.99 | 5.02 | 4.05 | 3.06 | 1.96 | 0.96 |
| DNA 카피값 | 1.0x108 | 1.0x107 | 1.0x106 | 1.0x105 | 1.0x104 | 1.0x103 | 1.0x102 | 1.0x101 |
| Scardovia wiggsiae | ||||||||
| 플라스미드 DNA양 | 312 pg | 31.2 pg | 3.12 pg | 312 fg | 31.2 fg | 3.12 fg | 312 ag | 31.2 ag |
| Ct값 | 14.73 | 18.08 | 21.39 | 24.62 | 27.81 | 30.93 | 33.93 | 38.05 |
| Log값 | 8.01 | 6.98 | 5.97 | 4.98 | 4.01 | 3.05 | 2.13 | 0.87 |
| DNA 카피값 | 1.0x108 | 1.0x107 | 1.0x106 | 1.0x105 | 1.0x104 | 1.0x103 | 1.0x102 | 1.0x101 |
| Actinotignum | ||||||||
| 플라스미드 DNA양 | 322 pg | 32.2 pg | 3.22 pg | 322 fg | 32.2 fg | 3.22 fg | 322 ag | 32.2 ag |
| Ct값 | 16.27 | 20.06 | 23.63 | 26.98 | 30.53 | 34.31 | 37.72 | 39.46 |
| Log값 | 8.12 | 7.01 | 5.96 | 4.98 | 3.94 | 2.83 | 1.83 | 1.32 |
| DNA 카피값 | 1.0x108 | 1.0x107 | 1.0x106 | 1.0x105 | 1.0x104 | 1.0x103 | 1.0x102 | 1.0x101 |
| Actinomyces | ||||||||
| 플라스미드 DNA양 | 331 pg | 33.1 pg | 3.31 pg | 331 fg | 33.1 fg | 3.31 fg | 331 ag | 33.1 ag |
| Ct값 | 16.12 | 19.69 | 23.09 | 26.53 | 29.59 | 33.69 | 37.16 | 39.04 |
| Log값 | 8.06 | 7.00 | 5.99 | 4.97 | 4.06 | 2.84 | 1.81 | 1.25 |
| DNA 카피값 | 1.0x108 | 1.0x107 | 1.0x106 | 1.0x105 | 1.0x104 | 1.0x103 | 1.0x102 | 1.0x101 |
| Abiotrophia defectiva | ||||||||
| 플라스미드 DNA양 | 335 pg | 33.5 pg | 3.35 pg | 335 fg | 33.5 fg | 3.35 fg | 335 ag | 33.5 ag |
| Ct값 | 16.34 | 18.69 | 22.08 | 26.01 | 29.15 | 32.58 | 36.09 | 38.46 |
| Log값 | 7.87 | 7.15 | 6.12 | 4.93 | 3.98 | 2.93 | 1.87 | 1.15 |
| DNA 카피값 | 1.0x108 | 1.0x107 | 1.0x106 | 1.0x105 | 1.0x104 | 1.0x103 | 1.0x102 | 1.0x101 |
| Lactobacillus | ||||||||
| 플라스미드 DNA양 | 314 pg | 31.4 pg | 3.14 pg | 314 fg | 31.4 fg | 3.14 fg | 314 ag | 31.4 ag |
| Ct값 | 16.47 | 20.16 | 24.29 | 27.94 | 31.49 | 34.88 | 38.48 | 39.69 |
| Log값 | 8.19 | 7.12 | 5.92 | 4.86 | 3.83 | 2.84 | 1.80 | 1.45 |
| DNA 카피값 | 1.0x108 | 1.0x107 | 1.0x106 | 1.0x105 | 1.0x104 | 1.0x103 | 1.0x102 | 1.0x101 |
| Lautropia mirabilis | ||||||||
| 플라스미드 DNA양 | 329 pg | 32.9 pg | 3.29 pg | 329 fg | 32.9 fg | 3.29 fg | 329 ag | 32.9 ag |
| Ct값 | 14.65 | 18.21 | 21.80 | 25.11 | 28.72 | 32.37 | 35.43 | 39.92 |
| Log값 | 7.98 | 6.98 | 5.97 | 5.04 | 4.02 | 2.99 | 2.13 | 0.87 |
| DNA 카피값 | 1.0x108 | 1.0x107 | 1.0x106 | 1.0x105 | 1.0x104 | 1.0x103 | 1.0x102 | 1.0x101 |
| 총 박테리아 | ||||||||
| 플라스미드 DNA양 | 635 pg | 63.5 pg | 6.35 pg | 635 fg | 63.5 fg | 6.35 fg | 635 ag | 63.5 ag |
| Ct값 | 13.94 | 16.98 | 20.34 | 23.37 | 26.74 | 29.87 | 32.60 | 33.62 |
| Log값 | 8.14 | 7.11 | 5.97 | 4.95 | 3.80 | 2.74 | 1.82 | 1.47 |
| DNA 카피값 | 1.0x108 | 1.0x107 | 1.0x106 | 1.0x105 | 1.0x104 | 1.0x103 | 1.0x102 | 1.0x101 |
실험 결과, 총 박테리아를 포함한 총 8개의 균주에 대하여 실시간-PCR을 수행하였을 때, 각 프라이머 및 프로브가 제대로 작동함을 확인하였고 이상적인 qPCR 효능 범위(90 ~ 120%)에 속했으며, 8종의 각 균에 대한 표준 곡선의 R2값은 약 0.99 정도로, 1에 매우 근접한 값으로 신뢰도가 매우 높음을 확인하였다(도 1 내지 8 참조). 또한 10배씩 순차적으로 희석한 시료를 대상으로 실험한 결과 모든 균주가 101 카피수에서도 검출됨을 확인하였다(표 18참조).
| 균주 | Ct값(플라스미드 DNA양) | DNA 카피값 |
| Streptococcus mutans | 38.11 (31.6 ag) | 1.0 x 101 |
| Scardovia wiggsiae | 38.05 (31.2 ag) | 1.0 x 101 |
| Actinotignum | 39.46 (32.2 ag) | 1.0 x 101 |
| Actinomyces | 39.04 (33.1 ag) | 1.0 x 101 |
| Abiotrophia defectiva | 38.46 (33.5 ag) | 1.0 x 101 |
| Lactobacillus | 39.69 (31.4 ag) | 1.0 x 101 |
| Lautropia mirabilis | 39.92 (32.9 ag) | 1.0 x 101 |
| 총 박테리아 | 33.62 (63.5 ag) | 1.0 x 101 |
3-4. 멀티플렉스 실시간-PCR
총 박테리아를 포함한 총 8개의 균주에 대한 프라이머 및 프로브를 총 3세트로 혼합하여 단 한 번의 반응으로 여러 개의 균이 동시에 검출 가능한지 확인하기 위해 멀티플렉스 실시간-PCR 실험을 수행하였다. 멀티플렉스 실시간-PCR의 조성물의 구성은 각 세트에 해당하는 균주(A 세트 2종, B 세트 2종, C 세트 4종)의 정방향 프라이머, 역방향 프라이머와 프로브 혼합물 2㎕, 각 세트에 해당하는 균주 플라스미드의 DNA(A 세트 4㎕, B 세트 4㎕, C 세트 8㎕ )와 2X Taqman multiplex mastermix(Thermofisher, 미국) 10㎕, 마지막으로 동일한 용량으로 맞추기 위한 3차 멸균수(A 세트 4㎕, B 세트 4㎕)를 포함하여 총 20㎕가 되게 하였다(표 19 및 20 참조).
| 구분 | 부피 |
| 2X Taqman multiplex mastermix | 10 ㎕ |
| 10X 프라이머/프로브 혼합물 (2종) | 2 ㎕ |
| 플라스미드DNA(각 세트별 2종 혼합물) | 4 ㎕ |
| 증류수 | 4 ㎕ |
| 전체 부피 | 20 ㎕ |
| 구분 | 부피 |
| 2X Taqman multiplex mastermix | 10 ㎕ |
| 10X 프라이머/프로브 혼합물 (4종) | 2 ㎕ |
| 플라스미드DNA(각 세트별 4종 혼합물) | 8 ㎕ |
| 증류수 | - |
| 전체 부피 | 20 ㎕ |
그 다음 96 웰 플레이트에 분주하고, 실시간 중합 효소 연쇄반응을 실시하였다. 멀티플렉스 실시간-PCR의 조건은 싱글플렉스 실시간-PCR과 동일하게 오염 방지 단계의 UDG 반응을 위해 50℃에서 2분간 반응시켰으며, 이후 UDG의 불활성화를 위해 95℃에서 10분간 유지하였다. PCR 증폭의 단계는 95℃에서 15초, 60℃에서 30초로 40회 반복하여 수행하였다(표 21 참조).
| 목적 | 단계별 온도 | 시간 | 사이클 |
| UDG반응 | 50℃ | 2분 | 1 |
| UDG불활성화 | 95℃ | 10분 | 1 |
| 증폭 | 95℃ | 15초 | 40 |
| 60℃ | 30초 |
3-5. 멀티플렉스 실시간-PCR 민감도 시험
본 발명자들이 제작한 프라이머 및 프로브를 기반으로 총 3개의 프라이머 및 프로브의 세트를 구성하였다. 총 8종의 균주 DNA 및 균주별 프라이머와 프로브를 세트별로 혼합한 후 멀티플렉스 실시간-PCR 실험을 수행하였고, 각 프라이머 세트 혼합물이 정상적으로 작동하는지 확인하였다.
각 세트로 구성된 균주별 플라스미드 DNA 혼합물에 대하여 프라이머 세트 혼합물이 정상적으로 작동함을 확인하였다(도 9 내지 11 참조). 또한 각 세트의 균주별 플라스미드 DNA에 대해 순차적으로 희석을 수행하였고, 형광 증폭 곡선의 결과에 나타난 시료의 Ct 값을 바탕으로 표준 곡선을 구축하였으며, 최소검출 한도를 확인하였다. 표준 곡선의 R2값은 약 0.99 정도로, 1에 매우 근접한 값으로 신뢰도가 매우 높았고(도 9 내지 11 참조), 총 박테리아를 포함한 총 8종의 균주에 대하여 실시간-PCR을 수행하였을 때, 모든 프라이머 및 프로브 혼합물에서 각 균이 101 카피수에서도 검출됨을 확인할 수 있었다(표 22 참조).
| 균주 | Ct값(플라스미드 DNA양) | DNA 카피값 |
| Streptococcus mutans | 37.71 (31.6 ag) | 1.0 x 101 |
| Scardovia wiggsiae | 39.35 (31.2 ag) | 1.0 x 101 |
| Actinotignum | 38.92 (32.2 ag) | 1.0 x 101 |
| Actinomyces | 38.65 (33.1 ag) | 1.0 x 101 |
| Abiotrophia defectiva | 36.7 (33.5 ag) | 1.0 x 101 |
| Lactobacillus | 38.81 (31.4 ag) | 1.0 x 101 |
| Lautropia mirabilis | 38.05 (32.9 ag) | 1.0 x 101 |
| Total bacteria | 32.94 (63.5 ag) | 1.0 x 101 |
결론적으로 임상 연구 샘플을 기반으로 차세대 염기서열분석(NGS)으로 치아 우식증 관련 구강 마이크로바이옴 데이터를 생산하였고, 선정된 유해균 및 상재균에 대한 프라이머 및 프로브를 제작하였다. 이를 통해 TaqMan 멀티플렉스 실시간-PCR 기법을 이용하여서 한 반응(single reaction)에서 최대 4개의 타겟 균주를 증폭하여 검출할 수 있는 종-특이적 PCR 프라이머 및 프로브를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
<110> Helixco inc.
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and kit
<130> 20201127
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<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Streptococcus mutans
<400> 1
acagctcaga gatgctattc ttaa 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Streptococcus mutans
<400> 2
attattgaag tgacgccata cac 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Scardovia wiggsiae
<400> 3
ggagcatgcg gattaattcg at 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Scardovia wiggsiae
<400> 4
tgcaccacct gtaaccca 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Actinotignum
<400> 5
taactcggag gaaggtggg 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Actinotignum
<400> 6
acgaggtcga gttgcaga 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Actinomyces
<400> 7
tgtttttggt gggggatggg 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Actinomyces
<400> 8
tgcttcactg gcgaaagagg ttt 23
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Abiotrophia defectiva
<400> 9
ttcagtgagg aaaggtggc 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Abiotrophia defectiva
<400> 10
gcagttactc tatgcgctgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Lactobacillus
<400> 11
aagtcacggc taactacgtg 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Lactobacillus
<400> 12
ctttacgccc aataaatccg g 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Lautropia mirabilis
<400> 13
cttatgtgta gggcttcac 19
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Lautropia mirabilis
<400> 14
cctacttctg gtaaaaccca ct 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Total bacteria
<400> 15
tggagcatgt ggtttaattc gaag 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Total bacteria
<400> 16
tgcgggactt aacccaacat 20
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Streptococcus mutans
<400> 17
aatgacggtc gccgttatga aaatgg 26
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Scardovia wiggsiae
<400> 18
gacataacct ggatgatgcc agagatgg 28
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Actinotignum
<400> 19
catgctacaa tggccggtac ag 22
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Actinomyces
<400> 20
tggacggtca cactgggact gagaca 26
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Abiotrophia defectiva
<400> 21
cggtgcatta gctagttggt agggtaa 27
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Lactobacillus
<400> 22
cgcggtaata cgtaggtggc aa 22
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Lautropia mirabilis
<400> 23
atcgctagta atcgcggatc agcatgc 27
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Total bacteria
<400> 24
caggtggtgc atggttgtcg tcag 24
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for Total bacteria
<400> 25
acaggtgctg catggctgtc gt 22
Claims (10)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제1세트;
서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제2세트;
서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제3세트;
서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제4세트;
서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제5세트;
서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제6세트; 및
서열번호 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제7세트;를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 치아 우식증의 진단을 위한 정보제공방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1세트는 서열번호 17의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제2세트는 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제3세트는 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제4세트는 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제5세트는 서열번호 21의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제6세트는 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제7세트는 서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1세트 및 제2세트를 하나의 반응액 내에 포함시키고,
상기 제3세트 및 제4세트를 하나의 반응액 내에 포함시키고,
상기 제5세트, 제6세트 및 제7세트를 하나의 반응액 내에 포함시켜 중합효소연쇄반응을 수행하는, 방법. - 제1항에 있어서,
서열번호 15의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제8세트;를 더 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는, 방법. - 제4항에 있어서,
상기 제8세트는 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는 프로브 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는, 방법. - 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제1세트;
서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제2세트;
서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제3세트;
서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제4세트;
서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제5세트;
서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제6세트; 및
서열번호 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제7세트;를 포함하는 치아 우식증 진단용 키트. - 제6항에 있어서,
상기 제1세트는 서열번호 17의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제2세트는 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제3세트는 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제4세트는 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제5세트는 서열번호 21의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제6세트는 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는 프로브를,
상기 제7세트는 서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는, 키트. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 제1세트 및 제2세트가 하나의 조성물로 포함되고,
상기 제3세트 및 제4세트가 하나의 조성물로 포함되고,
상기 제5세트, 제6세트 및 제7세트가 하나의 조성물로 포함되는, 키트. - 제6항에 있어서,
서열번호 15의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 제8세트;를 더 포함하는, 키트. - 제9항에 있어서,
상기 제8세트는 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는 프로브 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는, 키트.
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|---|---|---|---|
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