KR101306162B1

KR101306162B1 - 치주질환 진단용 키트

Info

Publication number: KR101306162B1
Application number: KR1020110022139A
Authority: KR
Inventors: 문해란
Original assignee: (주)에스엘에스
Priority date: 2011-03-12
Filing date: 2011-03-12
Publication date: 2013-09-09
Also published as: KR20120104055A

Abstract

본 발명은 치주질환의 원인이 되는 원인균의 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍을 포함하는 치주질환 진단용 키트 및 상기 키트를 이용하여 치주질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머쌍 또는 치주질환 진단용 키트를 사용하면, 단 한번의 검사만으로도 구강 내에 존재하는 치주질환 원인균의 존재 여부를 탐지, 검출함으로써 구강세포가 치주질환 원인균에 감염되었는지를 신속하고 경제적으로 진단할 수 있으므로, 치주질환의 조기진단 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

치주질환 진단용 키트{A Kit for Diagnosing Periodontal Disease}

본 발명은 치주질환 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 치주질환의 원인이 되는 원인균의 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머쌍, 상기 프라이머쌍을 포함하는 치주질환 진단용 키트 및 상기 키트를 이용하여 치주질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

인간의 구강 내에는 수십억에 달하는 세균이 덩어리를 이룬 채로 서식하여 프라그(plaque, 치태)를 이루고 있는데, 프라그 내의 세균은 음식물로 섭취된 당분을 이용하여 살아간다. 프라그는 치아 표면에 주로 생성되어 칫솔질에 의하여 일부 제거되기도 하지만, 치아와 치아 사이나, 치아와 잇몸 사이에 생긴 프라그는 칫솔질에 의해서도 제거되지 않고 잔류하며, 이러한 부위에 남아있는 프라그는 석회화 물질인 치석으로 변화되면서 구강내 세균을 증식시킨다. 아울러, 이처럼 증식된 세균으로부터 방출된 독성물질은 잇몸같은 치주조직을 손상시켜 염증을 일으키게 되고, 상기 염증이 치조골로 전이되면, 급성 또는 만성적 치주질환(periodontal disease)을 유발시키게 된다.

상기 치주질환은 크게 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 분류되는데, 치은염은 치조골의 파괴 없이 치은 출혈과 같이 치은 부위에만 염증이 존재하는 가벼운 치주질환으로서 염증 처치에 의해 잇몸 조직이 정상적인 상태로 환원될 수 있는 치주질환을, 치주염은 치조골 내부로 염증이 파급되어 치아 지지조직이 파괴되는 공격적인 치주질환을 각각 의미한다. 대체로 치주질환의 초기단계인 치은염은 연한 잇몸조직에만 침범한 것으로 이 단계에서는 회복이 가능하지만, 치료받지 않은 채로 있으면 치은염은 치주염을 유발시킬 수 있고, 치주염은 치주질환의 후기단계로서 치아를 지지하는 잇몸, 뼈들이 심하게 손상되는 것으로, 이 단계에서는 특별한 치료가 필요하며, 그렇지 않으면 치아를 손실시키게 된다. 특히, 치주질환이 진행됨에 따라 잇몸과 치조골을 침범하여 충치가 없는 치아라도 치아가 상실될 수 있는데, 18세 이상의 성인 가운데 적어도 절반 이상이 치주질환의 초기상태에 있으며, 경우에 따라서는 5~6세의 어린이에서도 증상이 발견되기도 하므로, 전체적인 치주질환의 원인을 규명하거나 또는 치은염으로부터 치주염으로의 진행을 완화시켜서 치아의 손실을 방지하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재까지의 연구에 따르면, 환경 요인, 진행 중인 여타 질환 및 유전적 요인에 의하여 치주질환이 발병하기도 하지만, 이것보다는 세균에 의한 치주조직의 감염에 의하여 치주질환이 발병되는 경우가 압도적으로 우위를 차지하는 것으로 알려져 있다. 특히, 치은염으로부터 치주염으로의 진행은 특이적인 그람-음성 세균 집합체(프라그)에 의한 것으로 알려져 있다. 상기 프라그는 구강 내 세균으로부터 분비된 분비물에 의하여 형성되고, 구강 내 세균이 그의 내부에 존재하게 되는데, 평균적으로 1㎎의 프라그내에는 약 10⁸개의 세균이 포함되어 있고, 그 중에서 25% 이상이 정상적으로 생존하는 것으로 알려져 있다.

상기 프라그가 형성되는 과정을 구체적으로 살펴보면, 구강 내 세균에서 분비되는 점착성 물질이 치아의 표면에 얇은 막을 형성하고, 상기 막에 상기 세균이 부착된 다음, 시간 경과에 따라 세균의 양이 증가하여 상기 세균과 분비물로 구성된 집락(프라그)이 형성된다. 특히, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 음식물로 섭취한 탄수화물 성분인 자당에서 덱스트란과 레반 등의 점착성 물질을 생산하는데, 이에 균이 부착하여 8 내지 24시간 후에 프라그가 형성된다. 이러한 초기단계를 지나게 되면 프라그를 구성하는 세균의 종류에도 변화가 생기는데, 초기에는 연쇄구균과 나이세리아(Neisseria sp.), 카디아(Cardia sp.) 등의 호기성 세균이 우세하지만, 점차 혐기성 세균인 엑티노마이세스(Actinomyces sp.), 베일로넬라(Veillonella sp.), 푸조박테리움(Fusobacterim sp.) 등이 증가하며, 이들 세균은 치은염을 유발하는 주요한 원인균으로 알려져 있다.

아울러, 이들 세균에 의한 치은염이 적절히 치료되지 않을 경우, 치아 및 치주의 표면이 손상되어 손상부위를 통해 세균이 치은내로 직접 침투하거나 또는 상기 세균으로부터 분비되는 효소(collagenase 등), 내독소, 면역반응 유발물질 등의 물질이 치은의 상피세포 결합을 이완시키고 상피를 통과해서 치주 결합조직에 도달하여 염증을 일으킴으로써 이들 조직을 약화시킨다.

상술한 치주질환은 치은염으로부터 치주염으로 진행하기 전에 조기에 진단하여 치료할 경우, 가벼운 치료만으로도 구강건강을 회복할 수 있기 때문에, 이를 조기에 진단할 수 있는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 특허공개 제2007-0001984호에는 박테리아로부터 유래된 arg-진지페인(arg-gingipain)과 같은 박테리아 병독성 생성물의 검출을 위한 제1 검출 검정기 및 환자의 면역계 또는 염증계로부터 유래된 호중구 엘라스타아제의 검출을 위한 제2 검출 검정기를 포함하는 치주질환을 검출하기 위한 시험키트가 개시되어 있고, 특허공개 제2010-0061438호에는 세균의 ITS를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드, 치주질환 원인 세균 특이적 올리고뉴클레오티드 및 세균 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 치주질환 진단용 키트 및 상기 키트를 이용하여 치주질환을 진단하는 방법이 개시되어 있으며, 특허등록 제843443호에는 동물에서 치주질환을 일으키는 신규 박테리아, 상기 박테리아 특이적인 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 백신이 개시되어 있고, 특허등록 제1019131호에는 치주질환에 대한 감수성을 나타내는 인터루킨-1 베타(IL-B) 유전자의 상류영역(IL-1B(-3737))과 관련된 다형성을 검출하기 위한 방법 및 제제가 개시되어 있다.

그러나, 상기 진단키트 및 방법을 사용할 경우에는, 치주질환을 유발시키는 다양한 원인균의 감염여부를 각 원인균별로 개별적으로 확인할 수 있을 뿐이므로, 치주질환의 진단을 효과적으로 진행할 수 없고 이에 소요되는 경제적 부담도 매우 높다는 단점이 있었다.

이에, 보다 효과적이고 경제적으로 치주질환의 원인균의 감염여부를 확인하여 치주질환을 조기에 진단할 수 있는 키트를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 보다 효과적이고 경제적으로 치주질환의 원인균의 감염여부를 확인하여 치주질환을 조기에 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 지금까지 치주질환을 유발시키는 주요 원인균으로 알려진 9종의 세균의 유전자와 상보적으로 결합하여, 치주질환 원인균의 감염여부를 확인할 수 있는 각 프라이머쌍을 포함하는 키트를 이용할 경우, 단 한번의 검사에 의하여 치주질환 원인균의 감염에 의한 치주질환의 발병여부를 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 치주질환을 유발시키는 주요 원인균으로 알려진 9종의 세균의 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머쌍을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머쌍을 포함하는 치주질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 치주질환 진단용 키트를 이용하여 치주질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머쌍 또는 치주질환 진단용 키트를 사용하면, 단 한번의 검사만으로도 구강 내에 존재하는 치주질환 원인균의 존재 여부를 탐지, 검출함으로써 구강 세포가 치주질환 원인균에 감염되었는지를 신속하고 경제적으로 진단할 수 있으므로, 치주질환의 조기진단 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 치주질환 진단용 키트에 9종의 치주질환 원인균의 DNA를 적용하여 진단한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 2는 치주질환 환자의 시료를 대상으로 수행한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

본 발명자들은 다양한 치주질환의 원인균의 감염여부를 확인하여 치주질환을 조기에 진단할 수 있는 키트를 개발하고자, 한번의 PCR 반응을 통해 다수의 유전자를 증폭시킬 수 있는 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR) 방법에 주목하게 되었다. 이에, 치주질환을 유발시키는 주요 원인균으로 알려진 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros) 및 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens)의 게놈유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 하기의 염기서열을 가지는 각각의 프라이머 염기쌍을 설계하였다.

(1) 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스 검출용 프라이머

Aafor: 5'-CTTACCTACTCTTGACATCCGAA-3'(서열번호 1)

Aarev: 5'-ATGCAGCACCTGTCTCAAAGC-3'(서열번호 2)

(2) 포르피로모나스 긴기발리스 검출용 프라이머

Pgfor: 5'-CTTGACTTCAGTGGCGGCAG-3'(서열번호 3)

Pgrev: 5'-AGGGAAGACGGTTTTCACCA-3'(서열번호 4)

(3) 타네렐라 포시티아 검출용 프라이머

Tffor: 5'-AGCGATGGTAGCAATACCTGTC-3'(서열번호 5)

Tfrev: 5'-TTCGCCGGGTTATCCCTC-3'(서열번호 6)

(4) 트레포네마 덴티콜라 검출용 프라이머

Tdfor: 5'-CCGAATGTGCTCATTTACATAAAGGT-3'(서열번호 7)

Tdrev: 5'-GATACCCATCGTTGCCTTGGT-3'(서열번호 8)

(5) 푸조박테리움 뉴클레아툼 검출용 프라이머

Fnfor: 5'-CGCAGAAGGTGAAAGTCCTGTAT-3'(서열번호 9)

Fnrev: 5'-TGGTCCTCACTGATTCACACAGA-3'(서열번호 10)

(6) 프레보텔라 인터미디아 검출용 프라이머

Pifor: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3'(서열번호 11)

Pirev: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3'(서열번호 12)

(7) 캄필로박터 렉터스 검출용 프라이머

Crfor: 5'-TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC-3'(서열번호 13)

Crrev: 5'-TTTCTGCAAGCAGACACTCTT-3'(서열번호 14)

(8) 펩토스트렙토코커스 마이크로스 검출용 프라이머

Pmfor: 5'-GCCGTAAACGATGAGTGCTAGG-3'(서열번호 15)

Pmrev: 5'-CCAGGCGGAATGCTTAGTGT-3'(서열번호 16)

(9) 에이케넬라 코로덴스 검출용 프라이머

Ecfor: 5'-GGGAAGAAAAGGGAAGTGCT-3'(서열번호 17)

Ecrev: 5'-TCTTCAGGTACCGTCAGCAAAA-3'(서열번호 18)

그런 다음, 상기 각 세균이 포함된 시료를 대상으로 하여, 상기 설계된 각 프라이머 염기쌍을 이용한 PCR을 수행함으로써, 상기 각 프라이머 쌍이 시료에 포함된 각 세균을 검출할 수 있는지의 여부를 확인하였다. 그 결과, 80 내지 90%의 성공율로 상기 각 프라이머가 각 세균을 검출할 수 있는지를 확인할 수 있었다.

다음으로, 상기 각 세균을 모두 포함하는 시료를 대상으로 하여, 상기 사용된 각 프라이머 염기쌍을 모두 포함한 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR을 수행한 결과, 놀랍게도 90 내지 100%의 성공율로 시료에 포함된 세균을 검출할 수 있었다. 이에, 상기 9쌍의 프라이머 염기쌍을 다양한 조합으로 포함하는 멀티플렉스 PCR을 수행하여, 각 조합에 따른 검출 성공율을 비교한 결과, 82.5 내지 97.5%의 넓은 범위의 성공율로서 상기 9종의 세균을 검출할 수 있었고, 96% 이상의 검출 성공율을 나타내는 조합은 9쌍의 프라이머 염기쌍을 모두 포함하는 조합임을 확인할 수 있었다.

상술한 결과로부터, 본 발명의 9종의 세균을 검출할 수 있는 9쌍의 프라이머 염기쌍은 각각 개별적으로 사용하여 PCR을 수행할 경우보다는, 멀티플렉스 PCR을 수행할 경우에, 더욱 효과적으로 시료에 포함된 세균을 검출할 수 있는 효과를 나타냄을 확인하였다.

결국, 본 발명의 치주질환 진단용 키트는 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros) 및 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens)의 게놈유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 가지는 각각의 프라이머 염기쌍을 포함한다. 이때, 상기 프라이머 염기쌍은 특별히 이에 제한되지 않으나, 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스를 검출할 수 있는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍, 포르피로모나스 긴기발리스를 검출할 수 있는 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍, 타네렐라 포시티아를 검출할 수 있는 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍, 트레포네마 덴티콜라를 검출할 수 있는 서열번호 7 및 8의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍, 푸조박테리움 뉴클레아툼을 검출할 수 있는 서열번호 9 및 10의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍, 프레보텔라 인터미디아를 검출할 수 있는 서열번호 11 및 12의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍, 캄필로박터 렉터스를 검출할 수 있는 서열번호 13 및 14의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍, 펩토스트렙토코커스 마이크로스를 검출할 수 있는 서열번호 15 및 16의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍 및 에이케넬라 코로덴스를 검출할 수 있는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍을 사용함이 바람직하다.

한편, 본 발명의 상기 치주질환 진단용 키트를 이용하여 치주질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 (ⅰ) 구강세포의 DNA를 제2항 또는 제3항의 치주질환 진단용 키트에 적용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 PCR 절편을 수득하는 단계; 및, (ⅱ) 상기 수득한 PCR 절편을 전기영동하여 상기 치주질환 진단용 키트에 포함된 프라이머에 의해 증폭된 PCR 절편이 확인될 경우 치주질환이 발병한 것으로 판정하고, 상기 프라이머에 의해 증폭된 PCR 절편이 확인되지 않을 경우 치주질환이 발병하지 않은 것으로 판정하는 단계를 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 치주질환 원인균의 게놈 유전자에 특이적인 프라이머의 설계

미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스로부터 9종의 치주질환 원인균(아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aa), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis, Pg), 타네렐라 포시티아(Tannerella forsythia, Tf), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola, Td), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum, Fn), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia, Pi), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus, Cr), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros, Pm), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens, Ec))에 대한 전체 게놈 염기서열을 확보하였다. 확보한 각 염기서열을 컴퓨터 프로그램(DNASTAR, MegAlign™ 5, DNASTAR Inc.)에 적용하여 상기 염기서열에 특이적인 프라이머를 설계하고, 양성 대조군(PC)으로서 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)를 코딩하는 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 설계하였다:

아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aa) 검출용 프라이머

Aafor: 5'-CTTACCTACTCTTGACATCCGAA-3'(서열번호 1)

Aarev: 5'-ATGCAGCACCTGTCTCAAAGC-3'(서열번호 2)

포르피로모나스 긴기발리스(Pg) 검출용 프라이머

Pgfor: 5'-CTTGACTTCAGTGGCGGCAG-3'(서열번호 3)

Pgrev: 5'-AGGGAAGACGGTTTTCACCA-3'(서열번호 4)

타네렐라 포시티아(Tf) 검출용 프라이머

Tffor: 5'-AGCGATGGTAGCAATACCTGTC-3'(서열번호 5)

Tfrev: 5'-TTCGCCGGGTTATCCCTC-3'(서열번호 6)

트레포네마 덴티콜라(Td) 검출용 프라이머

Tdfor: 5'-CCGAATGTGCTCATTTACATAAAGGT-3'(서열번호 7)

Tdrev: 5'-GATACCCATCGTTGCCTTGGT-3'(서열번호 8)

푸조박테리움 뉴클레아툼(Fn) 검출용 프라이머

Fnfor: 5'-CGCAGAAGGTGAAAGTCCTGTAT-3'(서열번호 9)

Fnrev: 5'-TGGTCCTCACTGATTCACACAGA-3'(서열번호 10)

프레보텔라 인터미디아(Pi) 검출용 프라이머

Pifor: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3'(서열번호 11)

Pirev: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3'(서열번호 12)

캄필로박터 렉터스(Cr) 검출용 프라이머

Crfor: 5'-TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC-3'(서열번호 13)

Crrev: 5'-TTTCTGCAAGCAGACACTCTT-3'(서열번호 14)

펩토스트렙토코커스 마이크로스(Pm) 검출용 프라이머

Pmfor: 5'-GCCGTAAACGATGAGTGCTAGG-3'(서열번호 15)

Pmrev: 5'-CCAGGCGGAATGCTTAGTGT-3'(서열번호 16)

에이케넬라 코로덴스(Ec) 검출용 프라이머

Ecfor: 5'-GGGAAGAAAAGGGAAGTGCT-3'(서열번호 17)

Ecrev: 5'-TCTTCAGGTACCGTCAGCAAAA-3'(서열번호 18)

양성 대조군 검출용 프라이머

PCfor: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(서열번호 19)

PCrev: 5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 20)

상기 서열번호 1 및 2의 프라이머에 의하여 검출되는 Aa의 단편은 77bp의 길이를 나타내고, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머에 의하여 검출되는 Pg의 단편은 378bp의 길이를 나타내며, 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머에 의하여 검출되는 Tf의 단편은 88bp의 길이를 나타내고, 상기 서열번호 7 및 8의 프라이머에 의하여 검출되는 Td의 단편은 122bp의 길이를 나타내며, 상기 서열번호 9 및 10의 프라이머에 의하여 검출되는 Fn의 단편은 101bp의 길이를 나타내고, 상기 서열번호 11 및 12의 프라이머에 의하여 검출되는 Pi의 단편은 339bp의 길이를 나타내며, 상기 서열번호 13 및 14의 프라이머에 의하여 검출되는 Cr의 단편은 598bp의 길이를 나타내고, 상기 서열번호 15 및 16의 프라이머에 의하여 검출되는 Pm의 단편은 237bp의 길이를 나타내며, 상기 서열번호 17 및 18의 프라이머에 의하여 검출되는 Ec의 단편은 50bp의 길이를 나타낼 것으로 예상되었고, 양성 대조군의 프라이머(서열번호 19 및 20)에 의하여 검출되는 단편은 3,480bp의 길이를 나타낼 것으로 예상되었다.

실시예 2: PCR 및 멀티플렉스 PCR의 수행

상기 실시예 1에서 설계한 20종의 프라이머를 이용하여 각각의 원인균을 포함하는 시료로부터 원인균을 개별적으로 검출하였을 뿐만 아니라, 모든 원인균을 포함하는 시료를 대상으로 하여 상기 20종의 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR를 수행하고, 이들 검출 성공율을 상호 비교하였다.

실시예 2-1: 개별 PCR

주형으로서 각 원인균(Aa, Pg, Tf, Td, Fn, Pi, Cr, Pm 또는 Ec)으로부터 수득한 게놈 DNA 5㎕에, 각 원인균에 해당하는 프라이머 염기쌍(정방향 0.4㎕(10μM), 역방향 0.4㎕(10μM)), 중합효소(HOT Taq. Polymerase mix) 10㎕ 및 멸균 증류수 4.2㎕를 가하여 PCR 반응물을 각각 수득하고, 각 PCR 반응물을 가열(94℃, 12분)한 다음, 35회의 중합효소반응(denaturation: 95℃, 30초; annealing: 65℃, 60초; extension: 72℃, 90초)을 수행하였다. 끝으로, 72℃에서 7분간 반응시켜 PCR을 수행한 다음, 전기영동하여 각 밴드의 크기를 확인함으로써, PCR이 성공적으로 수행되었는지를 확인하였다. 이때, 각 원인균별로 10세트의 실험을 반복수행하여, 각 세균에 대한 검출 성공율을 산출하였다(참조: 표 1).

PCR을 통한 치주질환 원인균 검출 성공율(단위: %)

원인균	검출 성공율
Aa	80
Pg	80
Tf	90
Td	90
Fn	90
Pi	80
Cr	90
Pm	80
Ec	80

상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 프라이머를 이용한 PCR 방법에 의해 각 원인균을 검출한 결과, 전체적으로 80 내지 90%의 검출 성공율을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 2-2: 멀티플렉스 PCR

주형으로서 각 원인균(Aa, Pg, Tf, Td, Fn, Pi, Cr, Pm 및 Ec)으로부터 수득한 각각의 게놈 DNA 5㎕, 각 원인균에 해당하는 각각의 프라이머 염기쌍(정방향 0.4㎕(10μM), 역방향 0.4㎕(10μM)), 중합효소(HOT Taq. Polymerase mix) 100㎕ 및 멸균 증류수 42㎕를 가하여 혼합하고, 상기 혼합물을 20㎕씩 분주하여 10세트의 PCR 반응물을 각각 수득하였으며, 각 PCR 반응물을 가열(94℃, 12분)한 다음, 35회의 중합효소반응(denaturation: 95℃, 30초; annealing: 65℃, 60초; extension: 72℃, 90초)을 수행하였다. 끝으로, 72℃에서 7분간 반응시켜 PCR을 수행한 다음, 전기영동하여 각 밴드의 크기를 확인함으로써 PCR이 성공적으로 수행되었는지를 확인하였다(참조: 표 2).

멀티플렉스 PCR을 통한 치주질환 원인균 검출 성공율(단위: %)

실험군	검출 성공율
1	100
2	90
3	90
4	90
5	90
6	100
7	90
8	100
9	90

상기 표 2에서 보듯이, 본 발명의 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 각 원인균을 검출한 결과, 전체적으로 90 내지 100%의 검출 성공율을 나타냄을 알 수 있었다.

상기 실시예 2-1 및 2-2의 결과에서 보듯이, 각각의 프라이머를 이용한 개별적인 PCR을 수행하여 얻어진 80 내지 90%의 성공율 보다도 멀티플렉스 PCR을 수행하여 얻어진 성공율이 높다는 것은, 사용된 각 프라이머가 멀티플렉스 PCR의 성공율을 향상시키는 역할을 수행하기 때문이라고 예측되었다.

실시예 3: 멀티플렉스 PCR에 영향을 미치는 프라이머 조합의 최적화

멀티플렉스 PCR에 사용된 각 프라이머가 멀티플렉스 PCR의 성공율을 향상시키는 역할을 수행할 것으로 예측되었는 바, 멀티플렉스 PCR의 성공율을 향상시키기 위한 최적화된 프라이머 조합을 검색하고자 하였다.

구체적으로, 각 원인균의 게놈 DNA 및 이에 해당하는 각 프라이머 염기쌍 세트를 다양한 조합으로 포함하는 PCR 반응물을 각각 작제하고, 상기 실시예 2의 조건으로 PCR을 수행한 다음, 이의 검출 성공율을 산출하였다(참조: 표 3 내지 10). 이때, 각 PCR 반응물은 동일 반응물에 대하여 20세트씩 PCR을 수행하여 평균 성공율을 산출하였다.

프라이머 2세트의 조합에 따른 검출 성공율(단위: %)

원인균	검출 성공율
Aa+Pg	83.0
Tf+Td	86.5
Fn+Pi	85.5
Cr+Pm	84.0
Pm+Ec	85.0
Aa+Ec	83.5
Pg+Pm	82.5
Tf+Cr	86.0
Td+Fn	84.5

상기 표 3에서 보듯이, 프라이머 2세트를 조합할 경우, 82.5 내지 86.5%의 검출 성공율을 나타내었다.

프라이머 3세트의 조합에 따른 검출 성공율(단위: %)

원인균	검출 성공율
Aa+Pg+Tf	86.5
Td+Fn+Pi	84.0
Cr+Pm+Ec	86.0
Aa+Tf+Fn	87.0
Aa+Td+Cr	84.5
Pg+Fn+Pm	87.5
Tf+Pi+Ec	85.5
Aa+Td+Ec	88.0
Fn+Cr+Ec	85.0

상기 표 4에서 보듯이, 프라이머 3세트를 조합할 경우, 84.0 내지 88.0%의 검출 성공율을 나타내었다.

프라이머 4세트의 조합에 따른 검출 성공율(단위: %)

원인균	검출 성공율
Aa+Pg+Tf+Td	88.5
Pg+Tf+Td+Fn	89.5
Tf+Td+Fn+Pi	86.5
Td+Fn+Pi+Cr	88.0
Fn+Pi+Cr+Pm	89.0
Pi+Cr+Pm+Ec	85.5
Aa+Pg+Pm+Ec	87.0
Aa+Pg+Fn+Pi	86.0
Aa+Td+Cr+Ec	87.5

상기 표 5에서 보듯이, 프라이머 4세트를 조합할 경우, 85.5 내지 89.5%의 검출 성공율을 나타내었다.

프라이머 5세트의 조합에 따른 검출 성공율(단위: %)

원인균	검출 성공율
Aa+Pg+Tf+Td+Fn	87.5
Aa+Pg+Tf+Pm+Ec	90.5
Aa+Pi+Cr+Pm+Ec	89.0
Fn+Pi+Cr+Pm+Ec	90.0
Tf+Td+Cr+Pm+Ec	87.0
Aa+Td+Fn+Pm+Ec	88.0
Tf+Td+Fn+Pi+Cr	89.5
Aa+Td+Fn+Pi+Ec	88.5
Aa+Pg+Td+Pm+Ec	91.0

상기 표 6에서 보듯이, 프라이머 5세트를 조합할 경우, 87.0 내지 91.0%의 검출 성공율을 나타내었다.

프라이머 6세트의 조합에 따른 검출 성공율(단위: %)

원인균	검출 성공율
Aa+Pg+Tf+Td+Fn+Pi	90.0
Aa+Pg+Tf+Cr+Pm+Ec	90.5
Td+Fn+Pi+Cr+Pm+Ec	92.5
Aa+Pg+Tf+Td+Pi+Cr	89.5
Aa+Pg+Td+Fn+Pm+Ec	91.0
Aa+Tf+Pi+Cr+Pm+Ec	92.0
Tf+Td+Fn+Pi+Cr+Ec	91.5
Aa+Td+Fn+Cr+Pm+Ec	88.5
Aa+Pg+Fn+Pi+Cr+Pm	89.0

상기 표 7에서 보듯이, 프라이머 6세트를 조합할 경우, 88.5 내지 92.5%의 검출 성공율을 나타내었다.

프라이머 7세트의 조합에 따른 검출 성공율(단위: %)

원인균	검출 성공율
Aa+Pg+Tf+Td+Fn+Pi+Cr	91.0
Aa+Pg+Tf+Td+Fn+Pm+Ec	93.0
Aa+Pg+Tf+Pi+Cr+Pm+Ec	92.5
Tf+Td+Fn+Pi+Cr+Pm+Ec	90.0
Aa+Tf+Td+Fn+Cr+Pm+Ec	91.5
Aa+Pg+Td+Fn+Pi+Cr+Pm	90.5
Aa+Pg+Tf+Fn+Pi+Pm+Ec	93.5
Pg+Tf+Td+Pi+Cr+Pm+Ec	94.0
Pg+Tf+Td+Fn+Cr+Pm+Ec	92.0

상기 표 8에서 보듯이, 프라이머 7세트를 조합할 경우, 90.0 내지 94.0%의 검출 성공율을 나타내었다.

프라이머 8세트의 조합에 따른 검출 성공율(단위: %)

원인균	검출 성공율
Pg+Tf+Td+Fn+Pi+Cr+Pm+Ec	93.0
Aa+Tf+Td+Fn+Pi+Cr+Pm+Ec	92.0
Aa+Pg+Td+Fn+Pi+Cr+Pm+Ec	93.5
Aa+Pg+Tf+Fn+Pi+Cr+Pm+Ec	94.5
Aa+Pg+Tf+Td+Pi+Cr+Pm+Ec	95.5
Aa+Pg+Tf+Td+Fn+Cr+Pm+Ec	92.5
Aa+Pg+Tf+Td+Fn+Pi+Pm+Ec	95.0
Aa+Pg+Tf+Td+Fn+Pi+Cr+Ec	94.0
Aa+Pg+Tf+Td+Fn+Pi+Cr+Pm	91.5

상기 표 9에서 보듯이, 프라이머 8세트를 조합할 경우, 91.5 내지 95.5%의 검출 성공율을 나타내었다.

프라이머 9세트의 조합에 따른 검출 성공율(단위: %)

실험군	검출 성공율	실험군	검출 성공율
1	93.0	11	95.5
2	97.0	12	96.0
3	95.0	13	95.5
4	93.5	14	96.5
5	94.0	15	97.5
6	96.5	16	94.5
7	92.5	17	92.0
8	97.0	18	96.0
9	95.0	19	93.5
10	94.5	20	94.0

상기 표 10에서 보듯이, 프라이머 9세트를 조합할 경우, 92.0 내지 97.5%의 검출 성공율을 나타내었다.

상기 표 3 내지 표 10의 결과를 종합하면, 프라이머 세트의 조합수가 증가할 수록 검출 성공율이 향상되는 경향을 나타내었으며, 특히 96% 이상의 검출 성공율은 9세트의 프라이머를 모두 포함하는 조함의 경우에만 나타남을 확인하였다.

따라서, 치주질환 진단용 키트의 제조시에는, 본 발명에서 제공하는 9세트의 프라이머 세트를 모두 포함함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 4: 임상시료를 대상으로 한 멀티플렉스 PCR 분석

상기 실시예 3의 결과에서 보듯이, 치주질환 진단용 키트의 제조시에는 본 발명에서 제공하는 9세트의 프라이머 세트를 모두 포함함이 바람직함을 확인하였으므로, 상기 9세트의 프라이머 세트를 모두 포함하는 키트를 제조하고, 그의 성능을 분석하였다.

먼저, 상기 서열번호 1 내지 20의 염기서열을 가지는 각 프라이머 세트, 중합효소(HOT Taq. Polymerase mix) 및 멸균 증류수를 포함하는 치주질환 진단용 키트를 제조하였다.

이어, 각 원인균(Aa, Pg, Tf, Td, Fn, Pi, Cr, Pm 또는 Ec)으로부터 수득한 각각의 게놈 DNA를 각각 개별적으로 또는 혼합한 다음, 상기 제조된 치주질환 진단용 키트에 적용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하고, 그 결과를 전기영동으로 확인하였다(참조: 도 1).

도 1은 본 발명의 치주질환 진단용 키트에 9종의 치주질환 원인균의 DNA를 적용하여 진단한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, M은 마커(1Kb plus ladder)로서 각 밴드는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1100, 1200 및 1300bp를 나타내고, 1번 레인은 Cr의 DNA를 나타내며, 2번 레인은 Pg의 DNA를 나타내고, 3번 레인은 Pi의 DNA를 나타내며, 4번 레인은 Td의 DNA를 나타내고, 5번 레인은 Fn의 DNA를 나타내며, 6번 레인은 Tf의 DNA를 나타내고, 7번 레인은 Aa의 DNA를 나타내며, 8번 레인은 Pm의 DNA를 나타내고, 9번 레인은 Ec의 DNA를 나타내며, S는 상기 9종의 원인균 DNA를 혼합한 DNA를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, Cr은 598bp의 밴드로 표시되고, Pg는 378bp의 밴드로 표시되며, Pi는 339bp의 밴드로 표시되고, Td는 122bp의 밴드로 표시되며, Fn은 101bp의 밴드로 표시되고, Tf는 88bp의 밴드로 표시되며, Aa는 77bp의 밴드로 표시되고, Pm은 237bp의 밴드로 표시되며, Ec는 50bp의 밴드로 표시되고, 이들을 혼합하여 멀티플렉스 PCR을 수행한 경우에는 상기 9가지의 밴드가 모두 표시됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 치주질환 진단용 키트를 사용할 경우, 9종의 치주질환 원인균을 용이하게 검출할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 임상시료를 대상으로 한 멀티플렉스 PCR 분석

상기 실시예 3에서 보듯이, 치주질환 진단용 키트의 제조시에는 본 발명에서 제공하는 9세트의 프라이머 세트를 모두 포함함이 바람직함을 확인하였으므로, 상기 9세트의 프라이머 세트를 모두 포함하는 키트를 이용하여 임상시료를 분석하였다.

구체적으로, 종래의 검사방법에 따라 치주염이 발병된 것으로 확인된 환자 8명의 구강세포를 생리식염수로 1회 세척한 후, 세포를 게놈 DNA 분리키트(Genomic DNA isolation Kit, Cat. No. K-3032, Bioneer 사)를 이용하여 분리 정제하고, 최종적으로 50㎕의 증류수에 용해시켜 각각의 주형 DNA로 활용하였다. 다음으로, 상기 주형을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-2와 동일한 조건으로 멀티플렉스 PCR을 수행하고, 각 PCR 단편을 전기영동하여 분석하였다(참조: 도 2). 도 2는 치주질환 환자의 시료를 대상으로 수행한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진으로서, M은 마커(1Kb plus ladder)로서, 각 밴드는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1100, 1200 및 1300bp를 나타내고, 1번 내지 8번 레인은 서로 다른 치주질환 환자(피검자 1 내지 8)의 시료를 나타내며, N은 음성 대조군을 나타낸다.

도 2에서 보듯이, 피검자 1의 시료에서는 598bp 및 378bp의 밴드가 검출되어 캄필로박터 렉터스(Cr)와 포르피로모나스 긴기발리스(Pg)에 감염된 것으로 확인되었고, 피검자 2의 시료에서는 598bp의 밴드가 검출되어 캄필로박터 렉터스(Cr)에 감염된 것으로 확인되었으며, 피검자 3의 시료에서는 598bp 및 339bp의 밴드가 검출되어 캄필로박터 렉터스(Cr)와 프레보텔라 인터미디아(Pi)에 감염된 것으로 확인되었고, 피검자 4의 시료에서는 598bp의 밴드가 검출되어 캄필로박터 렉터스(Cr)에 감염된 것으로 확인되었으며, 피검자 5의 시료에서는 598bp, 122bp 및 77bp의 밴드가 검출되어 캄필로박터 렉터스(Cr), 트레포네마 덴티콜라(Td) 및 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aa)에 감염된 것으로 확인되었고, 피검자 6의 시료에서는 598bp의 밴드가 검출되어 캄필로박터 렉터스(Cr)에 감염된 것으로 확인되었으며, 피검자 7 및 8의 시료에서는 아무런 밴드가 검출되지 않아 감염된 균주가 없는 것으로 확인되었고, 음성 대조군에서는 그 어떠한 원인균도 감염되어 있지 않은 것으로 판명되었다.

따라서, 본 발명의 치주질환 진단용 키트를 사용할 경우, 환자로부터 치주질환 원인균의 감염여부를 간편하고 신속하게 진단할 수 있음을 확인하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros) 또는 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens)의 게놈유전자와 상보적으로 결합할 수 있는, 서열번호 1 내지 18의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍.
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 타네렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus), 펩토스트렙토코커스 마이크로스(Peptostreptococcus micros) 또는 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens)의 게놈유전자와 상보적으로 결합할 수 있는, 서열번호 1 내지 18의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍을 포함하는 치주질환 진단용 키트.
제2항에 있어서,
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되고, 포르피로모나스 긴기발리스는 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되며, 타네렐라 포시티아는 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되고, 트레포네마 덴티콜라는 서열번호 7 및 8의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되며, 푸조박테리움 뉴클레아툼는 서열번호 9 및 10의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되고, 프레보텔라 인터미디아는 서열번호 11 및 12의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되며, 캄필로박터 렉터스는 서열번호 13 및 14의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되고, 펩토스트렙토코커스 마이크로스는 서열번호 15 및 16의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되며, 에이케넬라 코로덴스는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 프라이머 염기쌍에 의하여 검출되는 것을 특징으로 하는
치주질환 진단용 키트.
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