CN104968327A - 口腔用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有耐药菌出现危险比已有的抗菌剂等低等优点的新着眼点的牙周病预防剂。包含日本芜菁冷水提取物的具有生物膜形成抑制作用的口腔用组合物。

Description

口腔用组合物

技术领域

本发明涉及对于引发口腔疾病的口腔生物膜的牙周病改善效果良好的口腔用组合物。

背景技术

牙周病是出现在牙周组织的疾病的总称，狭义上指牙龈炎、牙周炎和咬合性外伤之类的疾病。牙周病是主要由牙菌斑引起的口腔内感染症。人的口腔内存在700种以上的细菌，在健康的口腔内，牙齿表面附着有链球菌(Streptococcus)属和放线菌(Actinomyces)属等初期附着菌。其中的内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)被认为是出血性牙龈炎致病菌，初期附着的内氏放线菌形成生物膜而生成牙菌斑，从而使牙龈发生炎症。有报道称，放线菌导致的牙龈的炎症是通过菌体膜上的核蛋白介以牙龈上皮细胞和巨噬细胞的TLR2产生IL-8和TNF-α而导致的。如果牙龈发生炎症，则形成牙周袋，并伴随出血和龈沟渗出液的渗出，形成作为牙周病病原性细菌已知的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)等在牙周袋生存的环境。此外，内氏放线菌不仅附着于牙齿表面，而且与大量的口腔内细菌共凝集，从而成为牙周病病原性细菌向牙菌斑附着的基础。由于这些原因，内氏放线菌使初期牙菌斑转变为后期牙菌斑(牙周病生物膜)，因此近年来作为与牙周病发生相关的重要的细菌引发关注。

以往的牙周病预防中，杀灭牙龈卟啉单胞菌等牙周病病原性细菌来抑制牙周病是主流的想法，但牙周病病原性细菌与生物膜一起存在于牙周袋的深处，因此抗菌物质不易渗透，大多无法获得预期的效果。

为了改善这一点，专利文献1中揭示了通过将(A)N-酰基肌氨酸或其盐和(B)异硫氰酸苄酯混合且使(A)/(B)的质量比为0.5～20，显示口腔生物膜抗菌效果和牙龈炎改善效果。然而，专利文献1中，耐药菌出现的危险性依然很高。

牙周病因发生牙龈炎而加重，因此可通过预防牙龈炎而更有效地预防牙周病。因此，抑制内氏放线菌的生物膜形成的原材料可期待有效的牙周病预防效果。

本发明人等确认了内氏放线菌的生物膜形成因酸压力而被促进，日本芜菁和小松菜等5种十字花科植物和冰叶日中花的提取物具有使内氏放线菌的酸诱导性生物膜形成量下降50～90％的活性(专利文献2)。

本申请中，将确认了生物膜形成抑制活性的植物提取物中活性最高且容易获得的日本芜菁(日本芜菁，Brassica rapa var.nipposinica)作为候选原材料，进行了详细的活性评价并对其活性成分的性状确定进行了详细研究。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本专利特开2008-174542号公报

专利文献2:日本专利特开2013-056855号公报

发明的概要

发明所要解决的技术问题

牙周病病原性细菌与生物膜一起存在于牙周袋的深处，一直以来使用以某种牙周病病原性细菌为靶细菌的抗菌剂的牙周病抑制法中，口腔生物膜阻碍抗菌剂的渗透，难以发挥所设想的牙周病抑制效果。此外，出现抗药菌的危险性高，抗菌剂的使用不理想。因此，与采用抗菌剂的牙周病病原性细菌的控制相比，进行初期牙周病病原性细菌的生物膜形成的控制被认为是更安全且有效的牙周病预防法。

解决技术问题所采用的技术方案

本发明人等进行了认真研究，发现日本芜菁的提取物对由酸诱导的内氏放线菌的生物膜形成具有抑制效果。提取温度越低，该抑制效果越高。对日本芜菁的活性成分进行了分离，推测活性成分为分子量10kDa以上的成分，发现活性部分中所含的成分的80％以上为蛋白质，从而完成了本发明。日本芜菁提取物对内氏放线菌的增殖不产生影响，因此被认为作用机理与抗菌作用不同。

内氏放线菌是从牙龈炎和根面龋部位被发现的革兰氏阳性杆菌，被认为是初期的牙周病病原性细菌。由于与链球菌和牙周病病原性细菌共凝集，因此是向牙周病菌斑的菌群迁移的关键细菌，认为内氏放线菌的控制可用于牙周病预防。本发明人等的研究中，确认生物膜形成因牙周病病原性细菌产生的丁酸等酸而增加。

发明的效果

本发明的包含日本芜菁提取物的口腔用组合物显著地抑制初期牙周病病原性细菌的生物膜形成，所以可用作比抗菌剂更安全且有效的牙周病预防法。

附图的简单说明

图1为基于提取温度的不同的生物膜形成抑制活性的比较。

图2为基于提取温度的不同的生物膜形成抑制活性的比较。

图3为日本芜菁冷水提取物的在羟磷灰石上的生物膜形成抑制活性。

图4A为口腔内临床分离株的系统分析。

图4B为口腔内临床分离株的系统分析。

图5为日本芜菁冷水提取物对临床分离株的生物膜形成抑制活性。

图6为流动池中的日本芜菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性。

图7为采用共聚焦激光显微镜的生物膜观察图。

图8为日本芜菁冷水提取物、日本芜菁冷水提取物的采用透析处理的透析内液、透析外液的生物膜形成抑制活性的比较。

图9为日本芜菁冷水提取物透析内液的阴离子交换层析的结果。

图10为日本芜菁冷水提取物透析内液的硫酸铵分离部分的生物膜形成抑制活性。

图11为日本芜菁冷水提取物透析内液的硫酸铵分离物的阴离子交换层析的结果。

图12为掺入日本芜菁冷水提取物的口香糖的生物膜形成抑制活性。

实施发明的方式

本申请的发明涉及包含日本芜菁提取物的口腔用组合物。

另外，本申请的发明涉及所述日本芜菁提取物为冷水提取物的口腔用组合物。

此外，本申请的发明涉及包含日本芜菁提取物的牙周病生物膜形成抑制剂。

另外，本申请的发明涉及所述日本芜菁提取物为冷水提取物的酸诱导生物膜形成抑制剂。

此外，本申请的发明涉及由上述口腔用组合物形成的漱口剂、牙膏剂、吸入剂、含片剂和食品。

以下，通过实施例对本发明进行具体说明。本申请的发明并不局限于这些实施例。

实施例

(实施例1)

日本芜菁提取物的制备方法：

购入市售的日本芜菁(茨城县产)，冷冻干燥，从而制备日本芜菁干燥叶。将日本芜菁干燥叶细碎粉碎，以1g该粉碎的日本芜菁干燥叶对应50ml去离子蒸馏水的比例在70℃、室温和4℃下进行2小时的提取。抽滤所得的提取液，以13000×g·10分钟离心，将其上清冷冻干燥后的产物作为日本芜菁提取物供于试验。

(实施例2)

生物膜形成试验

(实施例2-1)

使用96孔微量滴定板的生物膜形成

将内氏放线菌ATCC19039或放线菌临床分离株用5ml的脑心浸液(BHI)液体培养基在37℃的厌氧条件下培养一晚至稳定期，以1100×g·10分钟离心而集菌。以同样的条件用PBS离心清洗3次，将用PBS调至O.D._660nm＝0.3的产物作为供试菌悬浮液供于试验体系。

生物膜形成用96孔微量滴定板进行。向各孔中添加100μl的0.5％蔗糖添加2×胰酪胨大豆肉汤(TSB)培养基、50μl试验样品、20μl的125mM丁酸、20μl供试菌悬浮液、10μl的PBS，以37℃、5％CO₂的条件下进行16～20小时的培养。

(实施例2-2)

96孔微量滴定板上的生物膜形成量的定量

将按照实施例2-1培养而得的培养上清倾析，用200μl的PBS清洗各孔后添加100μl的0.25％番红溶液(日水制药株式会社)，静置15分钟而对生物膜染色。将番红溶液倾析后用去离子蒸馏水清洗2次，干燥后添加100μl的70％乙醇，振荡30分钟而溶出番红，用酶标仪测定492nm的吸光度，对生物膜量进行定量。

通过上述的实施例，对从日本芜菁以70℃、室温、4℃的各条件下提取而得的各日本芜菁提取物的单位重量的比活性进行了评价，结果在4℃的条件下提取而得的冷水提取物的比活性最高(图1和图2)。此外，日本芜菁冷水提取物对内氏放线菌的增殖未显示影响。

因此，以日本芜菁冷水提取物作为放线菌生物膜抑制原材料的候选材料，对在人口腔内是否有显示活性的可能性进行进一步的研究。

(实施例2-3)

在羟磷灰石(HA)上的生物膜形成

HA盘使用将牛的牙齿以表面被牙釉质被覆的方式成形为7mm×7mm×1.5mm的形状而得的产物。将HA盘用高压釜灭菌后，用PBS在室温下平衡1小时，将400μl无菌采集的人唾液在室温下静置1小时而形成菌膜，用PBS清洗后用5mg/ml的BSA溶液在室温下封闭30分钟而得的产物用于试验。

生物膜形成用24孔微量滴定板进行。向各孔中添加400μl的0.5％蔗糖添加2×TSB培养基、200μl试验样品、80μl的125mM丁酸、80μl供试菌悬浮液、40μl的PBS，将HA盘置于各孔，按照实施例2-1进行了培养。

(实施例2-4)

HA上的生物膜形成量的定量

按照实施例2-3进行了培养后，将HA盘用镊子取出，用PBS浸渍一次后清洗。清洗后的HA盘放入新的孔中，添加600μl番红溶液，静置15分钟而对生物膜染色。将HA用镊子取出，用去离子蒸馏水清洗后置于新的孔中添加600μl的70％乙醇，振荡30分钟而溶出番红，将300μl该溶出液移至96孔微量滴定板并按照实施例2-2对生物膜量进行了定量。

在通过上述实施例形成了菌膜的羟磷灰石上，对日本芜菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性进行评价而得的结果示于图3。日本芜菁冷水提取物在羟磷灰石上也与96孔上同样显示内氏放线菌生物膜形成抑制活性。

(实施例3)

放线菌临床分离株的分离

(实施例3-1)

PCR/多重PCR

PCR通过向PCR管中添加10×Ex Taq缓冲液2.5μl、DNA模板1μl、dNTP2μl、引物各0.025μl、Ex taq 0.125μl、MgCl₂ 2μl、H₂O 16.88μl而进行。多重PCR通过将上述的组成改为50μM正向引物3个、反向引物3个各0.1μl、H₂O 16.75μl而进行。反应条件为在95℃热处理10分钟后进行30个循环的95℃·30秒、50℃·30秒、72℃·30秒，最后在72℃用7分钟完成延伸反应。多重PCR以53℃的退火温度进行。

(实施例3-2)

临床分离株的分离

从任意选择的健康男女7人(男:3人，女:4人)采集牙菌斑，用放线菌选择培养基(CFAT琼脂培养基)培养，对形成的菌落革兰氏染色后，通过显微镜观察筛选革兰氏阳性杆菌。

从各革兰氏阳性杆菌用基因组提取试剂盒(西格玛)提取基因组，按照实施例3-1进行PCR，扩增16SrRNA基因的上游的约500bp。用于PCR的引物序列示于表1。

PCR产物用PCR Clean-Up试剂盒(普洛麦格)纯化，碱基序列分析对外委托微基因日本株式会社((株)マクロジェンジャパン社)进行。对获得的16SrRNA基因的碱基序列进行与GenBank上的数据库的同源性检索而鉴定菌。对于上述中鉴定为放线菌属的菌，将atpA按照实施例3-1用多重PCR扩增，碱基序列分析同样对外委托微基因日本株式会社进行。使用的引物序列示于表1。将获得的碱基序列与数据库上的atpA的碱基序列一起进行系统分析，从而进行种的鉴定，将获得的内氏放线菌、口腔放线菌作为放线菌临床分离株。

[表1]

表1引物序列

通过上述实施例，从人口腔内进行临床分离株的分离，结果从7人成功分离共计9株放线菌临床分离株(内氏放线菌:4株，口腔放线菌:5株)。进一步对分离得到的放线菌临床分离株中的7株评价了日本芜菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性，结果生物膜形成量根据菌株而不同，但是日本芜菁冷水提取物对全部的临床分离株显示生物膜抑制活性(图5)。结合图3的结果，提示日本芜菁冷水提取物在人口腔内也显示生物膜形成抑制活性的可能性高。

(实施例4)

使用流动池的日本芜菁冷水提取物的生物膜抑制评价

上述的实施例中，使用96孔板的采用静止体系的评价中，显示日本芜菁冷水提取物具有内氏放线菌生物膜抑制活性。然而，若考虑实际的口腔内，唾液不断分泌，口腔内存在唾液的流动。于是，为了对日本芜菁冷水提取物在口腔内是否也显示内氏放线菌的生物膜抑制活性进行评价，使用模拟口腔环境的流动池系统，对日本芜菁冷水提取物的内氏放线菌生物膜抑制活性进行了评价。

评价方法

(实施例4-1)评价菌株

使用内氏放线菌ATCC19039株。

(实施例4-2)日本芜菁提取物的制备

购入市售的日本芜菁，通过冷冻干燥制备日本芜菁的干燥叶。相对于1_g细碎粉碎的日本芜菁干燥叶用50ml去离子蒸馏水在4℃条件下进行2小时的提取。将通过抽滤和离心除去日本芜菁残渣而得的上清冷冻干燥，回收日本芜菁冷水提取物。

(实施例4-3)使用流动池的生物膜形成试验

将内氏放线菌用5ml的BHI培养基培养一晚，离心集菌后，用PBS进行离心清洗，用BHI培养基调至O.D._660nm＝0.4，将其作为供试菌液。将400μl供试菌液接种于流动池室(ACCFL0001:斯托瓦尔生命科学公司(STOVALL LIFESCIENCE社))，室的朝向设定为生物膜形成面位于下侧后，在37℃的条件下静置3小时，使菌附着于生物膜形成面。静置后，室的朝向设定为生物膜形成面位于上侧，通过蠕动泵使添加了0.25％蔗糖、60mM丁酸的TSB培养基以3ml/小时的流速流动的同时进行48小时的培养，形成生物膜。日本芜菁冷水提取物的生物膜抑制活性通过将最终浓度1mg/ml的日本芜菁冷水提取物添加于上述培养基同样地进行培养来评价。

(实施例4-4)生物膜的观察

将所形成的生物膜用去离子蒸馏水进行清洗，用LIVE/DEAE生物膜生活力试剂盒(英杰公司)进行Live/Dead染色后，通过共聚焦激光显微镜观察生物膜。

通过上述的实施例在使用流动池的流动体系的条件下对日本芜菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性进行了评价，结果日本芜菁冷水提取物抑制了内氏放线菌的生物膜形成(图6、7)。此外，根据采用共聚焦激光显微镜的观察，在添加日本芜菁冷水提取物的条件下形成的生物膜中，死菌所占的比例减少(图7)。

更具体来说，使用流动池的评价中，添加丁酸后，内氏放线菌的生物膜形成也增加，该生物膜中活菌和死菌以同等程度存在。构成生物膜的死菌的比例比未添加丁酸的情况高。在1mg/ml的日本芜菁冷水提取物的存在下，内氏放线菌的生物膜形成量被抑制，特别是死菌的附着量减少。因此，确认日本芜菁冷水提取物抑制依存于丁酸的内氏放线菌的生物膜形成。

(实施例5)

日本芜菁冷水提取物的分离

(实施例5-1)

透析

将日本芜菁冷水提取物溶解于去离子蒸馏水，以13000×g、10分钟离心而回收上清，加入分离分子量10kDa的透析用纤维素管(亚速旺株式会社(アズワン))中，对于去离子蒸馏水在低温室内进行2天的透析。将透析内液和透析外液的一部分冷冻干燥并回收。

为了如上所述对日本芜菁冷水提取物的分子量进行推定，通过分离分子量10kDa的透析用纤维素管透析日本芜菁冷水提取物，对透析内液和外液的生物膜形成抑制活性进行了评价，结果透析内液的活性更高。提示活性成分的分子量在10kDa以上(图8)。

(实施例5-2)

日本芜菁冷水提取物的透析内液的阴离子交换层析

将样品溶解于10mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，将离心分离后的上清上样至DEAE-TOYOPEARL 650M(ψ1.6×70cm)。用同一缓冲液清洗后，通过0～0.5M的NaCl线性梯度洗脱，各部分分别分取5ml。全部的操作以1ml/分钟的流速进行。

将日本芜菁冷水提取物的透析内液通过阴离子交换层析分离，对依存于哪个成分的洗脱而显示活性进行了评价(图9)。其结果是，在蛋白质的第1峰至第2峰的范围内，依存于蛋白质的洗脱图案而显示了活性。由此提示活性成分可能是蛋白质。

(实施例5-3)

硫酸铵分离

将按照实施例5-1制备的日本芜菁冷水提取物的透析内液样品溶解于PBS，将硫酸铵的浓度按30％、45％、60％、75％逐级提高，将各浓度下的沉淀物以13000×g、15分钟离心而回收。将回收的沉淀分离部分溶解于去离子蒸馏水，透析后冷冻干燥而回收。此外，75％未沉淀分离部分也在透析后冷冻干燥而回收。

如上所述，如果生物膜形成抑制活性成分为蛋白质，则认为硫酸铵分离有效，将日本芜菁冷水提取物的透析内液通过硫酸铵分离，对各浓度下的沉淀分离部分的生物膜形成抑制活性进行了评价(图10)。硫酸铵浓度45～60％下的沉淀分离部分可见最高的生物膜形成抑制活性。

(实施例5-4)

日本芜菁冷水提取物的硫酸铵分离物的离子交换层析

将按照实施例5-3制备的硫酸铵浓度45～60％下的沉淀分离部分按照实施例5-2通过阴离子交换层析进行了分离，结果可见2个生物膜形成抑制活性峰(图11)。

(实施例6)

含有成分定量

(实施例6-1)

蛋白质定量

蛋白质的定量使用BCA法进行。

(实施例6-2)

糖定量

糖的定量使用苯酚硫酸法进行。

(实施例6-3)

多酚定量

多酚的定量使用福林酚法进行。

关于上述纯化，将日本芜菁冷水提取物通过透析、硫酸铵分离和阴离子交换层析进行分离的结果的汇总示于表2。随着纯化阶段的推进，单位重量的比活性升高，活性成分的纯化越来越到位。此外，离子交换层析的活性分离部分的含有成分的80％以上为蛋白质，提示了活性成分为蛋白质的可能性。

[表2]

表2.日本芜菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性成分的纯化阶段汇总

(实施例7)

掺入日本芜菁提取物的口香糖的生物膜形成抑制活性评价

(实施例7-1)

掺入日本芜菁的口香糖的制备

以表3的组成制成掺入日本芜菁提取物的口香糖。

[表3]

表3口香糖组成

BFI-01:投入日本芜菁冷水提取物，混合12分钟。

BFI-02:混合12分钟后投入日本芜菁冷水提取物，再混合3分钟左右。

(实施例7-2)

口香糖提取液的制备

向5g的口香糖中加入25ml加温至37℃的PBS，在研钵内推挤5分钟而进行提取，以1100×g、15分钟离心，回收其上清，将通过灭菌滤器(0.2μm)进行了灭菌处理的产物作为口香糖提取液。

(实施例7-3)

口香糖提取液的生物膜抑制活性评价

用96孔微量滴定板进行。向各孔中添加50μl的1％蔗糖添加4×TSB培养基、100μl口香糖提取液、20μl的125mM丁酸、20μl供试菌悬浮液、10μl的PBS，以37℃、5％CO₂的条件下进行16～20小时的培养。生物膜形成量的定量按照实施例2-2进行。

(实施例7-4)

日本芜菁提取物自口香糖的溶出率评价

进行280nm的波长的吸光度(Abs280nm)测定，通过以下的计算式评价日本芜菁提取物的溶出率。

(A1)使日本芜菁提取物以2000ppm的浓度溶解于对照口香糖提取液而得的样品的Abs280nm

(A2)掺入日本芜菁冷水提取物的口香糖的提取液的Abs280nm

(A3)对照口香糖的Abs280nm

溶出率(％)＝((A2－A3)/(A1－A3))×100

通过上述的实施例对掺入日本芜菁冷水提取物的口香糖的提取液的生物膜形成抑制活性进行了研究，结果掺入日本芜菁冷水提取物的口香糖的提取液抑制了内氏放线菌的生物膜形成(图12)。此外，未见将日本芜菁冷水提取物掺入口香糖而导致的活性下降。BFI-01的日本芜菁冷水提取物的溶出率为83.0％，BFI-02为85.7％。

日本芜菁冷水提取物对于放线菌临床株也显示生物膜形成抑制活性，且在羟磷灰石上和使用流动池的评价中抑制了生物膜形成，所以提示了日本芜菁冷水提取物在人口腔内也显示生物膜形成抑制活性的可能性。

根据日本芜菁冷水提取物的活性成分的分离，提示了蛋白质为活性成分的可能性。另一方面，虽然数据上未示出，但BSA和乳蛋白制剂未见生物膜抑制活性，因此认为并非蛋白质全部可见活性，日本芜菁提取物中所含的蛋白质可见特异性的放线菌生物膜形成抑制活性。

日本芜菁冷水提取物可见放线菌生物膜形成抑制活性，对放线菌临床分离株也可见效果。日本芜菁冷水提取物在羟磷灰石上和使用流动池的评价中也显示生物膜形成抑制活性，提示了在人口腔中显示活性的可能性。此外，掺入日本芜菁冷水提取物的口香糖显示了内氏放线菌生物膜形成抑制活性。

将日本芜菁冷水提取物通过透析、硫酸铵分离、阴离子交换层析进行了分离，结果提示活性成分为分子量10kDa以上的蛋白质。

接着，通过常规方法制造了作为上述的口香糖以外的制品的包含本发明的含有日本芜菁冷水提取物的生物膜形成抑制剂的漱口剂、牙膏、口臭用喷雾、含片、糖果、压片糖、软糖、饮料。以下示出它们的配方。这些例子并不限定本发明产品的范围。

(实施例8)

按照下述配方制造了漱口剂。

(实施例9)

按照下述配方制造了牙膏。

(实施例10)

按照下述配方制造了口臭用喷雾。

(实施例11)

按照下述配方制造了含片。

(实施例12)

按照下述配方制造了糖果。

(实施例13)

按照下述配方制造了压片糖。

(实施例14)

按照下述配方制造了软糖。

(实施例15)

按照下述配方制造了饮料。

工业上利用的可能性

本发明的包含日本芜菁冷水提取物的口腔用组合物具有显示作为与以往的牙周病病原性细菌的抗菌剂不同的作用的生物膜形成抑制作用的牙周病预防作用，所以是基于新的着眼点的牙周病预防剂。因此，与已有的抗菌剂等相比，可以有耐药菌出现危险低等优点，能够应用于各种产品。

本申请要求基于2013年2月1日提出申请的日本专利申请号2013-018728的优先权，引用其内容作为本申请的一部分。

Claims (11)

1.口腔用组合物，其特征在于，包含十字花科植物的冷水提取物。

2.如权利要求1的口腔用组合物，其特征在于，所述十字花科植物的冷水提取物为日本芜菁冷水提取物。

3.生物膜形成抑制剂，其特征在于，包含十字花科植物的冷水提取物。

4.如权利要求3所述的生物膜形成抑制剂，其特征在于，所述十字花科植物的提取物为日本芜菁冷水提取物。

5.如权利要求3所述的生物膜形成抑制剂，其特征在于，为牙周病生物膜抑制剂。

6.如权利要求3所述的生物膜形成抑制剂，其特征在于，为酸诱导生物膜抑制剂。

7.漱口剂，其特征在于，由权利要求1或2所述的口腔用组合物形成。

8.牙膏剂，其特征在于，由权利要求1或2所述的口腔用组合物形成。

9.吸入剂，其特征在于，由权利要求1或2所述的口腔用组合物形成。

10.含片剂，其特征在于，由权利要求1或2所述的口腔用组合物形成。

11.食品，其特征在于，包含权利要求1或2所述的口腔用组合物。