KR20220070232A - 망막의 변성을 치료하기 위한 약물가능성 표적 - Google Patents

망막의 변성을 치료하기 위한 약물가능성 표적 Download PDF

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KR20220070232A
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rpe
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카필 바티
사바네로 칼라 야디라 바르보사
저스틴 런 위엔 창
발렌두 쉐하르 자
루치 샤마
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더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
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Abstract

본 발명은 Nox4, 라디칼 산소 종의 형성, 세린 단백질 분해 효소, 도파민 수용기, NF-κB, mTOR, AMPK, RPE 상피 간엽 이행, RPE 역분화, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는 하나 이상의 화합물을 투여함을 포함하는, 망막의 질환 또는 장애 또는 망막의 변성을 피험체에서 치료하거나 개선시키는 신규 방법 및 망막의 색소 상피 세포를 복원시키는 신규 방법; 및 이러한 방법의 시행을 위한 키트에 관한 것이다.

Description

망막의 변성을 치료하기 위한 약물가능성 표적
본 출원은 2019년 9월 13일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/899,899호의 특권을 청구한다. 본 특허 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 그의 전체가 혼입된다.
연방 정부가 후원하는 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원 국립 안 연구소(National Institutes of Health, National Eye Institute)에 의해 프로젝트 번호 Z01#: EY000532하에 정부의 지원으로 이루어 졌다. 정부는 발명의 특정 권리를 갖는다.
망막은 척추동물의 눈의 내부 표면에 위치한 빛에 민감하게 반응하는 신경 조직으로 이루어진 하나의 층이다. 각막, 수정체 및 유리체액을 통과한 후 망막에 도달하는 빛은 신경 자극을 촉발시키는 화학적 및 전기적 사건으로 바뀐다. 빛을 이러한 생물학적 과정으로 전환시키기 위한 과정인 변환에 책임을 지는 세포는 광수용기 세포로 지칭되는 특수화된 뉴런이다.
망막의 색소 상피(RPE: retinal pigment epithelium)는 신경계 망막을 맥락막으로부터 분리시키는 포유동물 눈에 있는 빽빽이 채워진 육각형 세포의 분극화된 단일층이다. RPE중의 세포는 색소 과립을 함유하고, 혈액-망막 장벽을 형성하고 광수용기와 밀접하게 상호작용하여 망막상의 수정체에 의해 집중되는 광 에너지의 흡수에 의해 시각적 기능을 유지함으로써 망막의 생리기능에 있어서 중대한 역할을 수행한다. 이들 세포는 또한 이온, 물 및 대사 최종 산물을 망막아래의 공간으로부터 혈액으로 수송하고, 글루코스, 레티놀 및 지방산과 같은 영양분을 혈액으로부터 취하며, 이들 영양분을 광수용기에 전달한다.
RPE 세포는 또한 망막의 시각 회로의 일부이다: 광수용기는 전-트랜스-레티날(all-trans-retinal)(이는 광자 흡수 후 11-시스-레티날로 다시 형성됨)을 재이성화시킬 수 없으므로, 레니탈은 RPE로 수송되고, 여기서 이는 11-시스-레티날로 재이성화되고 광수용기로 다시 수송된다.
RPE는 광수용기 유지, 및 혈관신생의 조절에 있어서 중요한 역할을 담당하고, 생체내에서 다양한 RPE 기능장애는 시각-변경 질환, 예컨대 망막 색소변성, RPE 박리, 이형성증, 위축증, 망막증, 황반 이영양증 또는 변성(노인성 황반 변성 포함)과 연관되고, 이는 광수용기 손상 및 실명을 초래할 수 있다.
두번째로 황반에 영향을 줄 수 있는 일반적인 망막의 질환으로는 망막의 박리, 병적 근시, 망막 색소변성, 당뇨병성 망막증, CMV 망막염, 폐색성 망막 혈관 질환, 미숙아 망막증(ROP: retinopathy of prematurity), 맥락막 파열, 눈 히스토플라스마 증후군(POHS: ocular histoplasmosis syndrome), 톡소플라스마증(toxoplasmosis), 및 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis)가 포함된다. 상기 목록은 완전한 것은 아니다.
많은 안과 질환, 예컨대 (노인성) 황반 변성, 황반 이영양증, 예컨대 스타르가르트병(Stargardt's disease) 및 스타르가르트-유사 질환, 베스트병(Best disease)(난황형 황반 이영양증), 및 성인 난황형 이영양증 또는 망막 색소변성의 하위유형은 망막 그 자체 또는 RPE의 변성 또는 악화와 연관된다. 광수용기 구제 및 시각 기능의 보존이 RPE 세포의 망막하 이식에 의해 달성될 수 있는 것으로 입증되었다[코페이(Coffey) 등의 문헌 "Nat. Neurosci. 2002:5, 53-56"; 린(Lin) 등의 문헌 "Curr. Eye Res. 1996:15, 1069-1077"; 리틀(Little) 등의 문헌 "Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996:37, 204-211"; 소베(Sauve) 등의 문헌 "Neuroscience 2002:114, 389-401"]. 망막의 퇴행성 질환 및 손상을 치료하기 위해 사용될 수 있는, 예컨대 인간 줄기 세포로부터 RPE 세포를 생산하는 방법을 찾아낼 필요가 있다.
노인성 황반 변성(AMD)은 노년 인구에서 실명의 가장 흔한 원인이다. AMD의 두가지 유형, 즉 RPE 위축증을 일으키는 건조 형태 및 RPE를 침투하는 맥락막 맥관구조의 비정상적인 성장을 일으키는 습윤 형태가 존재한다. 기능부전의 RPE는, 광수용기를 지원할 수 없게 되어 신경계 망막 층의 변성 및 이에 따른 시력 손실을 일으키므로, 질환 병리 및 진행과 연관되어 왔다. 현재, AMD의 습윤 형태를 위해 이용가능한 치료만이 존재하고, 이는 레이저 응고 요법 및 항-VEGF 주사를 포함한다. 유사하게, 결국 실명을 유도하는 RPE EMT 세포에서의 상피의 표현형의 손실을 특징으로 하는 증식성 유리체망막증(PVR: proliferative viteroretinopathy) 및 노인성 및 유전성 망막의 변성과 같은 망막의 퇴행성 질환을 위한 효과적인 치료는 아직까지 존재하지 않는다.
망막의 변성의 치료에 유용한 화합물 및 방법에 대한 요구가 지속되고 있다. 이러한 치료는 다수의 병인으로부터 일어나는 망막의 변성을 예방하거나 이의 발생율을 감소시킬 것이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 Nox4 또는 활성 산소 종 형성을 저해하거나, 또는 세린 단백질 분해 효소, 도파민 수용기, NF-κB, mTOR, AMPK, RPE 상피 간엽 이행, RPE 역분화, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는 약학적 효과량의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 망막의 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 망막의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 특정 실시태양에서, 망막의 질환은 황반 또는 망막 주변의 변성, 망막의 색소 상피 위축증, 황반 이영양증, 지도모양 위축증, 맥락막 신생혈관 증식, 스타르가르트 질환, 스타르가르트-유사 질환, 베스트병, 난황형 황반 이영양증, 성인 난황형 이영양증, 망막 색소변성, 증식성 유리체망막증, 망막의 박리, 병적 근시, 당뇨병성 망막증, CMV 망막염, 폐색성 망막 혈관 질환, 미숙아 망막증(ROP), 맥락막 파열, 눈 히스토플라스마 증후군(POHS), 톡소플라스마증, 또는 레버 선천성 흑암시이다.
본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 다른 실시태양에서, 화합물은 Nox4 저해제(또는 활성 산소 종 저해제)이다. 본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 또 다른 실시태양에서, 화합물은 NF-κB, mTOR, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절한다. 구체적인 실시태양에서, 화합물은 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하고, Rho GTP 가수분해 효소는 CDC42 및/또는 RAC1이다. 다른 실시태양에서, 화합물은 AMPK를 조절한다. 또 다른 실시태양에서, 화합물은 RPE 상피 간엽 이행 또는 RPE 역분화를 조절한다.
본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 특정 실시태양에서, 화합물은 아미노카프로산(Aminocapropic acid), L-701,324, Vas2870, L-745,870 염산염, Me-3,4-데포스타틴(dephostatin), N-메틸-1-데옥시노지리마이신(deoxynojirimycin), L-750,667 트리하이드로클로라이드, (+)-MK-801 말레산 수소, 펨피딘(Pempidine) 타르타르산염, (-)-나프록센(Naproxen) 나트륨, 랄록시펜(Raloxifene) 염산염, SKF 83959 브롬화수소산염, L-687,384 염산염, 7,7-디메틸-(5Z,8Z)-에이코사디에노산, SP-600125, Ro41-0960, 안시타빈(Ancitabine) 염산염, 리스페리돈(Risperidone), 텔렌제핀(Telenzepine) 중염산염, NO-711 염산염, U-99194A 말레산염, S(+)-라클로프라이드(Raclopride) L-타르타르산염, 피렌제핀(Pirenzepine) 중염산염, 캅토프릴(Captopril), 티오페라미드(Thioperamide) 말레산염, 알프레놀올(Alprenolol) 염산염, 리토드린(Ritodrine) 염산염, 푸트레신(Putrescine) 중염산염, 1-(2-메톡시페닐)피페라진 염산염, PAPP, U-69593, AG-1478, 리루졸(riluzole), 펜톨아민(Phentolamine) 메실산염, DBO-83, 포르메스탄(Formestane), 카르바마제핀(Carbamazepine), 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오르화물 염산염, 터부탈린(Terbutaline) 헤미황산염, UK 14304, GR 113808, 레플루노미드(Leflunomide), 아세틸티오콜린(Acetylthiocholine) 염화물, 스페르미딘(spermidine), 5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드(amiloride), ATPO, 아카데니신(Acadenisine) 또는 메트포르민(Metformin), 또는 이의 조합물이다. 본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 특별한 실시태양에서, 화합물은 아미노카프로산; L-745,870; 리루졸; 아카데니신; 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 몇몇 실시태양에서, 화합물은 약학 조성물의 형태로 투여되고, 여기서 약학 조성물은 화합물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Nox4를 저해하거나, 또는 NF-κB, mTOR, AMPK, RPE 상피 간엽 이행, 또는 RPE 역분화, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는 약학적 효과량의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 망막의 변성의 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 망막의 변성을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 망막의 변성을 치료하는 방법의 특정 실시태양에서, 화합물은 Nox4 저해제(또는 활성 산소 종 저해제)이다. 본 발명의 망막의 변성을 치료하는 방법의 또 다른 실시태양에서, 화합물은 NF-κB, mTOR, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절한다. 구체적인 실시태양에서, 화합물은 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하고, Rho GTP 가수분해 효소는 CDC42 및/또는 RAC1이다. 다른 실시태양에서, 화합물은 AMPK를 조절한다. 또 다른 실시태양에서, 화합물은 RPE 상피 간엽 이행 또는 RPE 역분화를 조절한다.
본 발명의 망막의 변성을 치료하는 방법의 특정 실시태양에서, 화합물은 아미노카프로산, L-701,324, Vas2870, L-745,870 염산염, Me-3,4-데포스타틴, N-메틸-1-데옥시노지리마이신, L-750,667 트리하이드로클로라이드, (+)-MK-801 말레산 수소, 펨피딘 타르타르산염, (-)-나프록센 나트륨, 랄록시펜 염산염, SKF 83959 브롬화수소산염, L-687,384 염산염, 7,7-디메틸-(5Z,8Z)-에이코사디에노산, SP-600125, Ro41-0960, 안시타빈 염산염, 리스페리돈[확인바람], 텔렌제핀 중염산염, NO-711 염산염, U-99194A 말레산염, S(+)-라클로프라이드 L-타르타르산염, 피렌제핀 중염산염, 캅토프릴, 티오페라미드 말레산염, 알프레놀올 염산염, 리토드린 염산염, 푸트레신 중염산염, 1-(2-메톡시페닐)피페라진 염산염, PAPP, U-69593, AG-1478, 리루졸, 펜톨아민 메실산염, DBO-83, 포르메스탄, 카르바마제핀, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오르화물 염산염, 터부탈린 헤미황산염, UK 14304, GR 113808, 레플루노미드, 아세틸티오콜린 염화물, 스페르미딘, 5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드, ATPO, 아카데니신 또는 메트포르민, 또는 이의 조합물이다. 본 발명의 망막의 변성을 치료하는 방법의 특별한 실시태양에서, 화합물은 아미노카프로산; L-745,870; 리루졸; 아카데니신; 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
본 발명의 망막의 변성을 치료하는 방법의 몇몇 실시태양에서, 화합물은 약학 조성물의 형태로 투여되고, 여기서 약학 조성물은 화합물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또한 다른 양태에서, 본 발명은 Nox4, 또는 활성 산소 종 형성을 저해하거나, 또는 세린 단백질 분해 효소, 도파민 수용기, NF-κB, mTOR, AMPK, RPE 상피 간엽 이행, 또는 RPE 역분화, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는 약학적 효과량의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 망막의 색소 상피 세포의 복원이 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 망막의 색소 상피 세포를 복원시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 망막의 색소 상피 세포를 복원시키는 방법의 특정 실시태양에서, 망막의 질환은 황반 변성, 망막의 색소 상피 위축증, 황반 이영양증, 스타르가르트 질환, 스타르가르트-유사 질환, 베스트병, 난황형 황반 이영양증, 성인 난황형 이영양증, 망막 색소변성, 증식성 유리체망막증, 망막의 박리, 병적 근시, 당뇨병성 망막증, CMV 망막염, 폐색성 망막 혈관 질환, 미숙아 망막증(ROP), 맥락막 파열, 눈 히스토플라스마 증후군(POHS), 톡소플라스마증, 또는 레버 선천성 흑암시이다.
본 발명의 망막의 색소 상피 세포를 복원시키는 방법의 다른 실시태양에서, 화합물은 Nox4 저해제이다. 본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 또 다른 실시태양에서, 화합물은 NF-κB, mTOR, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절한다. 구체적인 실시태양에서, 화합물은 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하고 Rho GTP 가수분해 효소는 CDC42 및/또는 RAC1이다. 다른 실시태양에서, 화합물은 AMPK를 조절한다. 또 다른 실시태양에서, 화합물은 RPE 상피 간엽 이행 또는 RPE 역분화를 조절한다.
본 발명의 망막의 색소 상피 세포를 복원시키는 방법의 특정 실시태양에서, 화합물은 아미노카프로산, L-701,324, Vas2870, L-745,870 염산염, Me-3,4-데포스타틴, N-메틸-1-데옥시노지리마이신, L-750,667 트리하이드로클로라이드, (+)-MK-801 말레산 수소, 펨피딘 타르타르산염, (-)-나프록센 나트륨, 랄록시펜 염산염, SKF 83959 브롬화수소산염, L-687,384 염산염, 7,7-디메틸-(5Z,8Z)-에이코사디에노산, SP-600125, Ro41-0960, 안시타빈 염산염, 리스페리돈[확인바람], 텔렌제핀 중염산염, NO-711 염산염, U-99194A 말레산염, S(+)-라클로프라이드 L-타르타르산염, 피렌제핀 중염산염, 캅토프릴, 티오페라미드 말레산염, 알프레놀올 염산염, 리토드린 염산염, 푸트레신 중염산염, 1-(2-메톡시페닐)피페라진 염산염, PAPP, U-69593, AG-1478, 리루졸, 펜톨아민 메실산염, DBO-83, 포르메스탄, 카르바마제핀, 아미노에틸)벤젠설포닐 플루오르화물 염산염, 터부탈린 헤미황산염, UK 14304, GR 113808, 레플루노미드, 아세틸티오콜린 염화물, 스페르미딘, 5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드, ATPO, 아카데니신 또는 메트포르민, 또는 이의 조합물이다. 본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 특별한 실시태양에서, 화합물은 아미노카프로산; L-745,870; 리루졸; 아카데니신; 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
망막의 색소 상피 세포를 복원시키는 몇몇 실시태양에서, 화합물은 약학 조성물의 형태로 투여되고, 여기서 약학 조성물은 화합물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적 효과량의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료할 필요가 있는 환자에게 투여함을 포함하고, 여기서 화합물이 아미노카프로산, Vas2870, L-745,870, 리루졸, 아카데니신, 또는 메트포르민인, 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법의 몇몇 실시태양에서, 화합물은 약학 조성물의 형태로 투여되고, 여기서 약학 조성물은 화합물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법의 특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 피험체의 눈에 국부적으로 투여되거나, 유리체내 주사, 테논낭하(sub-tenon) 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여된다.
본 발명의 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법의 특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 피험체의 눈에 국부적으로 투여되거나, 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여된다.
본 발명의 망막의 질환을 치료하는 방법의 특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 피험체의 눈에 국부적으로 투여되거나, 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여된다.
본 발명의 망막의 변성을 치료하는 방법의 특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 피험체의 눈에 국부적으로 투여되거나, 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여된다.
본 발명의 망막의 색소 상피 세포를 복원시키는 방법의 특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 피험체의 눈에 국부적으로 투여되거나, 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여된다.
도 1a 내지 1s는 보체 자격의 인간 혈청(CC-HS: complement competent human serum)이 AMD-유사 세포의 내적표현형을 성숙한 iRPE에서 유도함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) F-액틴(ACTIN)(녹색) 및 β-카테닌(CATENIN)(적색)이 세포 경계에서 공-편재화된 성숙하고 분극화된 iRPE 세포를 연구 전체를 통해 사용하였다(n=3). (b-d) 48시간 동안 CC-HS에 의해 처리된 iRPE는, 보체 비자격 인간 혈청(CI-HS: complement incompetent human serum)과 비교하여, APOE 양성 RPE-아래 침적물에서 유의적인 10-배 증가를 보여주었고; n=10의 상이한 iRPE 세포주는 각각의 세포주에 대해 3회의 기술적 반복을 갖는다. (e, f) CC-HS는, 나일 레드(Nile red)에 의해 염색함으로써 관찰되는 바와 같이, 또한 CI-HS 처리와 비교하여 중성 지질 소적을 상향조절하였다(n=3). (g, h) 투과 전자 현미경법(TEM: transmission electron microscopy)은 RPE-아래 박층 및 지질 침적물이 단지 CC-HS 처리된 iRPE에서만 존재함을 확인하였다(h에서 화살표)(n= 10). (i,j) CC-HS 처리는, F-액틴 염색(황색)(J에서 화살표), 및 RPE 육각형성(hexagonality)의 손실에 의해 볼 수 있듯이, iRPE에서 스트레스 섬유를 유도하였다(n=3). (k-o) CC-HS 처리된 iRPE 세포에서의 연접 보전성(junctional integrity)의 손실. (k,l) 또 다른 연접 표지자, Na+/K+ ATP아제(ATPase)(녹색)와 공-염색된 세포질에서의 밀착 연접 표지자, CLDN16(적색)의 잘못-편재화된 발현(K와 비교되는 L에서의 화살표)(n=3). (m,n) CC-HS 처리된 iRPE의 TEM은 인접한 RPE 세포 사이에서의 밀착 연접의 소실을 확인하였다(m에서의 화살표와 비교되는 n에서의 화살표)(n=3). (o) 상자-도표는 CC-HS 처리된 iRPE 단일층에 대한 TER 측정에서 CI-HS 처리된 세포에 대하여 유의적인 3-배 증가를 보여준다. (p)는, 식세포의 능력에 관하여 평가된, CC-HS 처리된 세포에서의 iRPE 기능성의 손실을 나타낸다. CC-HS 처리는 광수용기 외절의 섭취에 있어서 유의적인 6-배 저하를 초래하였다. (q-s) CC-HS 처리는 CI-HS 샘플과 비교할 경우 생리학적 자극, 예컨대 ATP 및 1 mM K+에 대한 iRPE 반응의 손실을 유도하였다. 건강한 세포에 대하여 스트레스받은 iRPE 세포에서의 변경된 반응의 대표적인 흔적은 (q 및 r)에 제시된다.
도 2a 내지 2g는 CC-HS 유도된 AMD 유사 세포의 내적표현형이 아마도 C5a 및 C3a 신호생성을 통해 작용함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) 웨스턴 블롯(Western blot)은 보체 수용기 3a(C3aR) 및 보체 수용기 5a(C5aR)가 iRPE 세포 용해물의 막 분별물에만 존재함을 확인하였고, 양성 대조군으로서 작용하는 세포질 분별물, 간 및 A549 세포주 용해물은 발현하지 않았다. 공지된 막 단백질 표지자인 Na+/K+ ATP아제는 적재 대조군(loading control)로서 작용한다. (b,c) 콜라겐 V(녹색, 하단 표지자, 하부 패널)가 아닌 에즈린(ezrin)(녹색, 상단 과정 표지자, 상부 패널)과 C5aR1, C3aR1(적색)의 공-편재화는 iRPE 세포의 상단측 상의 수용기의 존재를 확증한다. (d-g) iRPE 세포 용해물중 전체 ERK1/2, AKT, 및 인산화된 p-ERK1/2, p-AKT 단백질 수준을 CI-HS, 또는 CC-HS에서 처리된 3가지 상이한 iRPE 세포주에 대하여 WB에 의해 검토하였고, 정량화는 막대 그래프로 제시된다.
도 3a 내지 3k는 NF-κB 경로의 활성화가 AMD-유사 세포의 내적표현형을 유도함으로써 C5aR1 및 C3aR1의 다운스트림에서 작동함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a-b) CI-HS와 비교하여, CC-HS에 의한 iRPE 처리는 세포기질로부터 핵으로의 p65 소단위(적색으로 염색됨, b)의 전좌를 유도하였고, 이는 NF-κB 경로의 활성화를 지시한다. (c) qRT-PCR은 추가로 CC-HS 처리된 iRPE에서 NF-κB 경로의 표적 및 경로 유전자의 증가된 발현을 확인하였다. (d, e)는 CC-HS 처리된 세포에서 IL-8 및 IL-18의 증가된 상단 및 하단 분비를 확인하였고, 이는 경로의 활성화를 시사한다. (f-h) p65(적색)의 핵 전좌는 C3, C5 또는 CFD 고갈된 인간 혈청으로 처리된 iRPE에서 보여지지 않고, 이는 보체 단백질 C3 및 C5가 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 NF-κB의 활성화에 필수적 역할을 가짐을 시사한다. (i-k) NF-κB 경로의 음성 조절자 NEMO에서 돌연변이를 갖는 환자로부터의 iRPE를 검사하여 NF-κB 경로의 역할을 확인하였다. (i)는 핵에서 p65의 증가된 하단 수준을 보여준다. (j-k) 환자 세포주는 더 많은 APOE 양성의 iRPE-아래 침적물을 보여주었고, 데이터의 정량화는 도 k에 제시된다.
도 4a 내지 4j는 아나필라톡신 보체가 iRPE 세포에서 자가포식을 하향조절함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a-f) 자가포식 단백질, LC3(적색, a,b) 및 ATG5(적색, d,e)는, CI-HS 처리된 iRPE과 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서 하향조절된다. (c,f) 웨스턴 블롯의 정량화는, CI-HS 처리된 샘플과 비교하여, CC-HS 처리된 샘플에서 LC3-II(i) 및 ATG5(l)에 대해 2배 감소된 발현을 확인한다. (g) qRT-PCR은, CI-HS 처리된 세포와 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서 다수의 자가포식 경로 유전자의 3 내지 6배 감소된 발현을 보여준다. (h,i) 자가포식 용해소체의 축적은 iRPE 상에서 CC-HS 처리에 의해서 유도되고 CI-HS 처리에 의해서는 유도되지 않는다. (j) 웨스턴 블롯은 CC-HS 처리에 의해 유도된 LC3-II 발현 감소가 C5 및 C3 고갈된 인간 혈청에 의해 처리되거나, 또는 CC-HS에 의해 처리된 C5aR+C3aR 차단된 세포에 의해 처리된 iRPE에서 존재하지 않음을 확인한다.
도 5a 내지 5f는 단백질독성 고 처리량 선별이 iRPE 건강을 구제하는 약물을 식별함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) CI-HS 및 (b) CC-HS 처리된 iRPE 세포에서의 칼슘 반응 곡선. (c) A23187은 48시간의 기간에 걸쳐 iRPE를 사멸시키는 단백질독성 약물이다. 10 μM A23187 농도는 대략 40%의 세포를 48시간내에 사멸시킨다. 점 도표는 384-웰 플레이트의 2가지 상이한 세트로부터의 결과를 보여준다. 플레이트 3-6 iRPE를 10 um A23187 및 46 uM의 1280종의 약학적 활성 약물의 라이브러리(LOPAC: Library of Pharmaceutically Active Drugs) 약물로 치료하는 한편, 플레이트 7-10에서는, iRPE를 10 uM A23187 및 9.2 uM의 LOPAC에 의해 치료하였다. 세포 생존율에 대하여 셀티트글로우(CellTitrGlow)(ATP 방출) 검정을 사용하여 점수를 기록하고 Y-축 상에 표시하였다. 46 um의 농도에서, 대부분의 약물이 세포독성인 반면, 9.2 uM 농도 범위에서, 대략 20종의 약물이 iRPE 세포 생존을 다양한 정도로 향상시켰음을 주지한다. (d-f) 4종의 약물(L745,870 - d; 리루졸 - e; 아미노카프로산 - f)의 7-점 용량 곡선은 3개의 상이한 A23187 농도(2.5 uM, 적색; 5 uM, 청색; 및 10 uM, 녹색)에 대하여, 2가지의 iRPE 샘플 사이에서 재현가능한 세포 생존을 보여준다.
도 6a 내지 6k는 항-단백질독성 약물이 iRPE에 대한 CC-HS의 효과를 개선시키고 RPE 세포 건강 및 기능을 구제함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a-e) 약물(리루졸, L745,470, 및 아미노카프로산) 및 CC-HS에 의한 iRPE의 병용-처리는 NF-κB(적색)의 p65 소단위의 핵 전좌(a-e), 또는 자가포식 단백질, ATG5(적색)의 감소된 발현(f-j)을 유도하지 않는다.
도 7a 내지 7h는 항-단백질독성 약물이 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 NF-κB 활성화를 억제하고 자가포식을 상향조절함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a, b) L-745,870(L-745) 또는 아미노카프로산(ACA)에 의한 CC-HS 처리된 iRPE 세포의 병용-처리는, CC-HS 및 비히클 처리된 세포와 비교하여, 나일 레드 양성 지질 소적의 양(a) 및 피불린(Fibulin)3의 발현(b)을 감소시켰다. (c-f) 래트 눈에서 레이저 병변의 경계에서 CC-HS 처리된 iRPE 세포의 L-745 및 ACA에 의한 병용-처리는 CC-HS 처리된 iRPE 세포(c, d) 및 RPE 세포(e, f)의 면적을 감소시키고(c, e) 육각형성을 향상시켰다(d, f). (g, h) L-745 및 ACA에 의한 CC-HS 처리된 iRPE 세포의 병용-처리는 단일층 TER(g) 및 식세포 능력(h)을 증가시켰다.
도 8a 내지 8b는 CI-HS 또는 CC-HS 처리 이후의 iRPE 표현형에서의 변화를 도식적으로 나타낸다.
도 9a 내지 9m은 보체 자격 인간 혈청(CC-HS) 처리가 하단 RPE 침적물을 유도함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) 경상피 저항(TER: Transepithelial resistance)의 점진적인 증가는 iRPE 단일층의 성숙을 지시한다. (b) APOE(적색) 및 C5ab(녹색)에 대해 공-염색된, CC-HS 처리된 트랜스웰(transwell) 막. (c, d) 면역염색은 CI-HS 처리된 iRPE와 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서 증가된 피불린3(녹색) 발현을 보여준다. (e, f) 오일 레드(Oil red) O 염색(적색)은 CI-HS 처리된 iRPE와 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서 더 많은 수의 세포내 지질 소적을 보여준다. (g, h) iRPE의 하단 표면에 대한 주사 전자 현미경사진(SEM: Scanning electron micrographs)은 CC-HS 처리 이후 증가된 박층형 침적물을 보여준다(적색 화살표). (i-l) 면역염색은 변경된 비멘틴(Vimentin)(적색) 발현을 보여주고, CC-HS 처리된 iRPE(j) 및 AMD 눈에서의 GA 병변의 경계(l)에서 세포골격 구조는 없다. CI-HS 처리된 세포(i) 및 비-병변 RPE(k) 영역은 비멘틴의 세포골격 발현에 의해 조직화된 정상적인 막질 및 세포질을 보여준다. F-액틴(녹색) 표지자는 액틴 세포골격을 표지한다. (m) 전기생리학 데이터의 정량화는 CC-HS 처리가 휴지 상태하에 TER을 2.5배 더 낮추고 1 mM K 및 ATP 자극하에 TER 변화를 약화시킴을 보여준다.
도 1Oa 내지 1Om은 아나필라톡신 보체 단백질이 AMD-유사 세포의 내적표현형을 iRPE에서 중재함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) 1차 및 iRPE 세포에서의 C3aR1 및 C5aR1에 대한 mRNA 발현 수준. iRPE 세포에서 C5aR1의 ∼30배 더 높은 발현을 주지한다. 양쪽 수용기의 발현은 CC-HS 처리에 의해 증가한다. (b) 에즈린(녹색, 상단 표지자)과의 공-편재화, 및 콜라겐 IV(녹색, 하단 표지자)와의 최소한의 공-편재화에 의해 확인되는 바와 같은, iRPE 세포에서 C3aR1(좌측 패널, 적색) 및 C5aR1(우측 패널, 적색)의 iRPE 세포 우세 상단 발현의 면역염색. (c-f) 인간 해부용 시체의 눈에서, 에즈린(녹색, 상단 표지자) 및 콜라겐 IV(녹색, 하단 표지자)와의 공-편재화에 의해 확인되는 바와 같이, C3aR1 및 C5aR1은 RPE 세포의 상단 및 하단측에서 유사하게 발현된다. RPE 세포에서 이들 수용기의 현저한 세포내 발현이 또한 존재한다. (g-k) 단백질 CFD(C3 및 C5의 업스트림), C3, C5가 고갈된 인간 혈청, 및 병용-처리된 CC-HS + C3aR1 및 C5aR1에 대한 수용기 차단제에 의해 처리된 iRPE 막의 APOE 염색은 CC-HS 처리와 비교하여, 모든 조건하에 감소된 APOE 발현을 보여준다. (l, m) C5 및 C3 단백질이 고갈된 인간 혈청에 의해 처리된 iRPE의 전기생리학적 반응은 RPE 세포의 정상적 전기 특성을 나타낸다.
도 11a 내지 11e는 RNAseq가 CI-HS 처리된 세포와 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서 NF-κB 표적 유전자의 상향조절 및 자가포식 유전자의 하향조절을 식별함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) 3명의 상이한 공여자 유래된 iRPE 샘플로부터의 RNAseq 데이터의 히트맵(heatmap)은 CI-HS 및 CC-HS 처리에 의한 샘플의 군집화를 보여준다. (b) CI-HS 대 CC-HS 처리된 iRPE에서의 통계적으로 상이한 유전자 발현 패턴의 상위 10개 경로. (c) RNAseq 데이터의 히트맵은 CI-HS 처리된 iRPE와 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서 NF-κB 표적 유전자의 상향조절을 식별한다. (d) 면역염색은 CI-HS 처리된 세포와 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서 NF-κB 표적 유전자 RELB(적색) 및 TRAF3(적색)의 증가된 발현을 보여준다. (e) CC-HS 처리된 iRPE에서 NF-κB 다운스트림 사이토킨, IL-18의 상단 및 하단 분비에서의 2-배의 상향조절.
도 12a 내지 12f는 아나필라톡신 보체가 iRPE에서 자가포식을 하향조절함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a, b) 웨스턴 블롯은 3명의 상이한 공여자 유래된 CC-HS 처리된 iRPE 샘플에 대하여 자가포식 단백질, ATG5(a), ATG7(a), 및 LC3-II(b)의 감소된 수준을 보여준다. 정규화를 위해 β-액틴을 사용하였다. (c) CI-HS 처리된 iRPE와 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서의 자가포식 경로 유전자의 3 내지 6-배 감소된 발현. (d) TEM은 iRPE 상의 CC-HS 처리에서 자가포식 용해소체의 축적(적색 화살표)을 보여준다. (e) 웨스턴 블롯은 LC3-II 발현 수준이 상단측, 또는 양쪽측 상에서 CC-HS에 의해 처리된 iRPE 샘플에서만 감소되었고 하단측 상에서만 처리된 경우는 감소되지 않았음을 보여준다. 정규화를 위해 β-액틴을 사용하였다. (f) 웨스턴 블롯은 CI-HS 처리된 iRPE, C5 또는 C3 고갈된 인간 혈청에 의해 처리된 iRPE, 및 CC-HS 및 C5aR1+C3aR1 수용기 차단제에 의해 병용-처리된 iRPE에 대하여 유사한 LC3-II 발현 수준을 보여주었다. 정규화를 위해 β-액틴을 사용하였다. (g-u) CC-HS 처리된 iPSC-RPE 세포에서의 NF-κB 경로의 시간 의존적 활성화(g-k), 자가포식의 하향조절(l-q), 및 APOE 침적물 형성(r-u).
도 13a 내지 13g는 iRPE 세포에 의한 단백질독성 고 처리량 선별을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) 96시간째, A23187의 모든 3개의 농도(2.5 μM, 10 μM, 25 μM)는 iRPE 세포에 대해 세포독성이다. (b) 모든 10개의 플레이트에 대한 평균 상대 광 강도는 A23187에 의해 처리된 모든 플레이트에 대하여 유사한 결과를 보여주었고, 이는 상이한 플레이트에 있어서 선별 재현성을 시사한다. (c) A23187에 의한 세포 사멸율은 9.2 μM 약물에 의해 치료된 플레이트에서 약간 감소하면서 모든 플레이트에 대해 유사하고, 이는 이들 플레이트에서의 세포 생존을 시사한다. (d-f) 3개의 상이한 A23187 농도(2.5 μM - e, 10 μM - f, 25 μM - g) 및 7개의 상이한 약물 농도(10 pM 내지 10 μM 범위)를 사용하는 2차 선별의 히트맵. 4종의 선택 약물의 반응이 강조된다. (g) 후속 선별에서의 적중 검증(hit-validation)을 위해 45종의 약물을 1차 선별로부터 선택하였다. 7-점 용량 곡선의 선형 반응 및 2개의 상이한 iRPE 샘플 사이의 재현성에 기초하여 4종의 약물(L745,870, AG-1478, 리루졸, 및 아미노카프로산)을 후속 선별에서 선택하였다. (h) PCA 도표는 약물 및 CC-HS에 의해, 단지 CC-HS에 의해, 및 단지 CI-HS에 의해 처리된 iRPE에 대한 별도의 군집 형성을 보여준다. (i, j) 3명의 공여자 및 3개의 처리 그룹(CI-HS 대 CC-HS, CC-HS+비히클 대 CC-HS+L, 745,870 또는 ACA)으로부터 유래된 iRPE에 대한 RNAseq 데이터의 히트맵은 CC-HS에 의해 처리된 샘플과 비교하여 약물 및 CC-HS에 의해 병용-처리된 샘플에서 NF-κB 경로 유전자의 상향조절의 역전 및 자가포식 유전자의 하향조절의 역전을 보여준다.
도 14a 내지 14i는 환자-특이적 iPSC-RPE가 질환-유발 돌연변이를 보유하였음을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) 생어(Sanger) 서열 분석은 L-ORD를 앓는 환자로부터 유래된 iPSC에서 S163R 돌연변이의 존재를 확인한다. 서열은 상부에 제시되고 돌연변이에 의해 영향받는 염기는 흑색 화살표에 의해 서열 크로마토그램(chromatogram) 상에서 지시된다. 이형접합 점 돌연변이(AGC -> AGC, AG G )는 피이크내의 피이크로서 나타난다. DNA 생어 서열분석을 위한 프라이머는 "방법"에 기재되어 있다. (b) 지시된 RPE 시그니처(signature) 유전자의 델타Ct 값에 대한 상자 도표 다이어그램. 각각의 상자는 적어도 2명의 상이한 영향받지 않는 형제자매 또는 L-ORD 환자 공여자로부터의 n=3의 iPSC-RPE로부터 측정된 델타Ct의 분포를 나타낸다. 상자의 하부 및 상부는 10 백분위 및 90 백분위를 정의한다. 상자 내부의 밴드는 중간값을 정의한다. (c) 연속적으로 7일 동안 광수용기 외절이 공급된 iPSC-RPE 단일층에 대한 투과 전자 현미경법 영상. 정상적 RPE 형태, 및 풍부한 상단 과정(황색 화살표), 멜라닌소체(자홍색 화살표), 및 하단에 위치된 핵(백색 화살표)을 포함하는 고도로 분극화된 구조를 보여주는 영향받지 않는 형제자매(위) 및 환자(아래)로부터 유래된 iPSC-RPE의 TEM. 스케일 바(Scale bar): 2 μm. (d) 보존된 육각형 형태 및 풍부한 상단 과정을 보여주는 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터 유래된 iPSC-RPE의 SEM 영상. (e) 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터 유래된 iPSC-RPE의 세포 면적에 대한 상자 도표. iPSC-RPE 단일층을 막 표지자(ADIPOR1)로 면역염색하여 세포 형태의 다중파라미터 분석을 위해 이들의 육각형 형태의 윤곽을 형성하였다. L-ORD 환자 iPSC-RPE는 영향받지 않는 형제자매(79.8+/-57.5 ㎛2)와 비교하여 평균적으로 더 큰 크기를 갖고(107.7 +/- 68.5 ㎛2) 더욱 변동성이 큰 경향이 있었다(p=0.000026). 유사한 공간적 불규칙성이 인간 AMD 공여자의 눈에서 보고되고 있다. (f) iPSC-RPE 세포 사이에서의 기능적 밀착 연접의 확립을 경상피 저항 측정에 의해 EVOM 상피 볼트옴미터(voltohmmeter)[월드 프리시즌스 인스트루먼츠(World Precisions Instruments)]를 사용하여 측정하였다. 질환 연관된 미스센스 돌연변이는 RPE 단일층의 경상피 저항을 변경시키지 않는다. (g) 역분화(상피의 간엽 이행)를 겪는 RPE 세포에서 강화된 유전자의 산포도는 정상적 조건하에 L-ORD 환자 세포가 질병에 걸리거나 또는 스트레스를 받는 RPE를 지시하는 비정상적인 표현형을 나타내지 않음을 보여준다. 공급받지 않은(회색으로 제시됨) 환자 iPSC-RPE에서의 역분화(EMT)-관련된 유전자의 발현은 공급받지 않은 영향받지 않는 형제자매의 발현 패턴과 닮았다. (h) 정상적인 배양 조건을 거친, 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터 유래된 iPSC-RPE는 APOE 하단 침적물의 유사한 수준을 보여준다. 스케일 바: 50 ㎛. (i) 정상 산소 조건하에서의 iPSC-RPE에 의한 VEGF의 상청액으로의 방출을 ELISA에 의해 측정하였다. RPE의 고도로 분극화된 구조는 VEGF를 비롯한 단백질의 벡터 수송 및 분비에 책임이 있다. 천연적으로, 영향받지 않는 형제자매로부터 유래된 iPSC-RPE(회색으로 제시됨)는 VEGF를 분극화된 방식으로, 우세적으로 하단에 분비하였다. L-ORD 환자 유래된 iPSC-RPE는 하단 VEGF 분비에서 대략 ∼53.3% 감소로 극성 손실을 나타낸다(P=0.046).
도 15a 내지 15h는 L-ORD 환자-유래된 RPE에서 CTRP5의 발현 및 편재화를 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) L-ORD에서, S163R 돌연변이는 CTRP5(분비 단백질) 및 구불구불한 막 관련된 단백질(MFRP: membrane frizzled related protein)을 코딩하는 비시스트론성(bicistronic) 전사물에서 발생된다. 돌연변이는 전사물의 mRNA 발현을 바꾸지 않는다. (b) 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자의 iPSC-RPE로부터의 세포 용해물에 대한 대표적인 웨스턴 블롯. CTRP5는 분비된 단백질이므로, 영향받지 않는 형제자매에서 강한 25 kDa 밴드(CTRP5)는 CTRP5가 전체 세포 추출물에서 더 큰 정도로 보유됨을 지시할 수 있다. (c) β-액틴으로 정규화된 웨스턴 블롯(세포 용해물)의 정량화(p<0.05). (d) 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터의 iPSC-RPE에서, CTRP5는 48시간 후 ELISA에 의해 측정될 경우 상단측에 선택적으로 분비되었다. 영향받지 않는 형제자매 및 환자에 의해 분비된 양 사이에 측정가능한 차이는 관찰되지 않았다. 무시가능한 양의 CTRP5가 하단 배지에서 검출되었다(데이터는 제시되지 않음). (e) 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터의 iPSC-RPE의 면역형광 염색의 에어리스칸(Airyscan) 공초점 현미경 영상. 막 수용기 ADIPOR1(녹색으로 제시됨)은 CTRP5(적색으로 제시됨), HOESCHT(청색으로 제시된 핵 염색)와 공-편재화된다. (f) 고유의 면역표지화된 ADIPOR1(6 nm 면역금) 및 CTRP5(12 nm 면역금)의 TEM 영상은 수용기-리간드 상호작용의 증거를 제공한다(흑색 화살표에 의해 지시됨). (g) 공개된 결정학상 구조를 사용하는 ADIPOR1(청색으로 제시됨) 및 CTRP5(녹색으로 제시됨) 사이의 단백질-단백질 상호작용에 대한 3-D 모델. h) 세린(극성)에서 아르기닌(+)으로의 돌연변이는 잔기의 전하를 양성이 되도록 변경시킨다. 이러한 양성 전하는 인접한 아르기닌 잔기가 접근하지 못하게 하고 돌연변이체 CTRP5의 ADIPOR1로의 결합 친화도를 감소시키는 입체배좌적 변화를 일으킬 것으로 예상된다.
도 16a 내지 16f는 ADIPOR1 상에서의 CTRP5의 감소된 길항작용이 L-ORD에서 변경된 AMPK 신호생성을 초래함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) ELISA에 의해 결정된 포스포-AMPK 수준은 영향받지 않는 형제자매(N=21; 100% ± 0.04)와 비교하여 5% 혈청 함유 배지에서 배양되는 L-ORD 환자 iPSC-RPE(N=15; 120.6% ± 0.075)에서 기선 활성에 있어서 대략 20.6% 증가를 지시한다. (b) 아디포넥틴 함유 혈청의 존재 및 부재하의 포스포-AMPK 수준에 미치는 재조합 구형 CTRP5의 영향. 데이터는 처리되지 않은 조건으로 정규화된다(0 ug/mL gCTRP5). 영향받지 않는 형제자매에서, 천연 리간드, 아디포넥틴의 부재하에서의(0% 혈청 조건하) 0.2 ㎍/mL의 재조합 구형 CTRP5의 첨가는 pAMPK 수준에서 20% 감소를 나타낸다(N=9; 0.81 ± 0.04). 이러한 유의적인 감소는 기선 조건하에 5% 혈청의 존재에 의해 사라진다(N=6; 0.99 ± 0.01). L-ORD 환자 iPSC-RPE에서, 0.2 ㎍/mL의 재조합 구형 CTRP5의 첨가는 p-AMPK 수준에 대하여 측정가능한 영향을 주지 않고(N=6; 1.12 ± 0.09), 심지어 혈청의 부재하에서도 그러하다(N=6; 0.98 ± 01). (c) 유래된 iPSC-RPE의 p-AMPK 수준에 미치는 재조합 전장 CTRP5의 용량-반응 효과. 영향받지 않는 형제자매(5시간 0% 혈청)에서, AMPK의 인산화 수준은 재조합 전장 CTRP5의 농도 증가에 따라 처리 후(30분) 감소된다. 25 ug/mL의 CTRP5는 p-AMPK 수준에 있어서 ∼50% 감소를 초래한다(N=6, 47.89% ± 0.13). 전장 CTRP5의 유사한 농도가 가해진 환자 RPE는 p-AMPK 수준에 있어서 측정가능한 변화를 이끌어내지 않았다. (d) 혈청의 부재하에 AMP:ATP 비를 상승시키는 조건은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 환자 유래된 iPSC-RPE에서 p-AMPK 수준을 변경시킨다. 모든 데이터는 0% 혈청 함유 조건으로 정규화된다. 2 mM AICAR(AMP 유사체), 또는 500 nM BAM15[ATP 생산을 감소시키는 미토콘드리아 짝풀림제(uncoupler)]에 의한 30분간의 처리는 영향받지 않는 형제자매에서 AMPK 수준을 추가로 상승시킨다. 대조적으로 환자 RPE의 p-AMPK 수준은 AMP 또는 ATP 수준의 변화에 비감수성이다. 그러나, 3 mM 메트포르민에 의한 2-주간의 치료는 AMP:ATP 비의 변화에 대한 L-ORD 환자의 감수성을 회복시킨다. (e) L-ORD 환자 유래된 iPSC-RPE에서의 상승된 AMPK는 PEDF-R의 mRNA 발현을 유의적으로 상향조절한다(∼8-배). (f) 면역조직화학 분석은 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서 상단 막으로 편재화된 상승된 PEDF-R 단백질 발현을 확인하였다.
도 17a 내지 17f는 L-ORD 환자에서 변경된 지질 대사가 감소된 신경보호 신호생성에 기여함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) 지질-풍부한 외절의 식세포작용에 의한 섭취 및 포스포리파아제에 의한 이들의 자유 지방산(RPE는 케톤생성 및 신경보호 지질 중재자, 예컨대 NPD1의 합성을 위해 이를 이용함)으로의 소화를 도시하는 추정상의 모델. 인간 암 세포주에서, 상승된 p-AMPK 수준은 포스포리파아제 D 활성을 억제하는 것으로 제시되어 왔고, 이러한 제안된 기작을 통해 L-ORD 환자에서의 증가된 지질 섭취는 DHA-유래된 뉴로프로텍틴(Neuroprotectin) D1의 이용 및 합성을 감소시키고 소화되지 않은 지질은 축적된다. (b) ph-Rhodo 표지화된 외절의 섭취를 FACS에 의해 정량화하여 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터 유래된 iPSC-RPE의 식세포작용 속도를 비교하였다. L-ORD 환자 iPSC-RPE(N=14; 11.81 ± 3.55)의 식세포작용 섭취는 영향받지 않는 형제자매(N=15; 7.86 ± 3.94)에 비해 33% 더 높았다. 이러한 증가된 지질 섭취 현상은 산화적 스트레스에 대한 보호 반응으로서 RPE에 대해 보고되었다. (c, d) 전체적인 PEDF-R 발현에서의 유의적인 증가에도 불구하고, L-ORD 환자 포스포리파아제 A2 활성은 ELISA에 의해 영향받지 않는 형제자매에 비해 40% 더 낮은 것으로 측정되었다. (e) 포스포리파아제 A2 활성은 상승된 수준의 pAMPK가 가해진 정상적 iPSC-RPE(n=6)에서 유의적으로 감소(∼26%)된 것으로 제시된다(n=6, 혈청 기아에 의해 유도됨)(p<0.05). (f) PEDF의 분극화된 분비를 ELISA에 의해 결정하였다. L-ORD 환자(N=12)는 PEDF의 감소된 상단 분비(환자: 939.6 ng/mL / 형제자매: 1277.22 ng/mL) 및 증가된 하단 분비(환자: 92.16 ng/mL / 형제자매: 75.96 ng/mL)를 나타내었고, 그 결과 영향받지 않는 형제자매(N=12, 19.82 ± 3.67)와 비교하여 유의적으로 감소된 PEDF 비(Ap/Ba)(10.13 ± 1.63)를 나타내었다(p=0.0014). 데이터는 평균 ± SE이고, 3회의 독립적 실험의 평균을 나타낸다. *는 p<0.05를 지시한다. f) 상단 분비된 DHA-유래된 뉴로프로텍틴 D1을 탠덤 질량 분석 지질체학 분석(tandem mass spectrometry lipidomic analysis)에 의해 측정하였다. 6일에 걸쳐 수집해서 모은 영향받지 않는 형제자매(Z8: n=12, 9i: n=12)는 L-ORD 환자(K8: n=12, E1: n=12)에 비해 대략 ∼10배 더 많은 NPD1을 분비하였다(p=0.0089).
도 18a 내지 18h는 L-ORD 환자 RPE가 상피의 간엽 이행에 대하여 증가된 감수성을 가짐을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a, b) 모든 영상은 63x 대물렌즈를 사용하여 수득하였다. 스케일 바=20 ㎛. b) 기재된 조건하에 수득된 영상을 형태측량(shapemetric) 분석하여 세포 면적 분포에 대한 상자 도표를 작성하였다(아래쪽 세선: 데이터의 5%, 아래쪽 힌지: 데이터의 25%, 중심선: 중간값, 위쪽 힌지: 데이터의 75%, 위쪽 세선: 데이터의 95%). L-ORD 환자 iPSC-RPE(N=6 영상, 135.37 ± 1.76 μm)는 영향받지 않는 형제자매(N=5, 95.77 ± 1.68 μm)와 비교하여 증가된 세포 크기 및 변동성을 갖는다(p<2E-16). 영향받지 않는 형제자매에서, 광수용기가 공급되는 동안 개시되는 메트포르민 치료는 치료되지 않은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 세포 면적에 최소한의 효과를 가졌다(N=7, 93.14 ± 1.56 μm)(p=0.52). 그러나, 3 mM 메트포르민 치료는 치료되지 않은 환자와 비교하여 환자 세포 면적(N=7, 117.92 ± 0.96 μm)의 유의적인 감소를 초래하였다(p<2E-16). 던넷(Dunnett)의 다중 비교 시험을 수행하여 치료되지 않은 영향받지 않는 형제자매 또는 L-ORD 환자를 비교하였다. (c) 7-일 POS 공급 후 iPSC-RPE 단일층의 APOE 염색된 크라이오섹션(cryosection)에 대한 면역형광 현미경 영상. L-ORD 환자 iPSC-RPE는 상단 및 하단 APOE 침적(백색 화살표)의 변경된 상대적 비율을 나타내었다. POS 공급 동안 메트포르민으로 치료된 L-ORD 환자는 영향받지 않는 형제자매와 유사한 상단 및 하단 APOE 침적(황색 화살표)의 상대적 비율의 재분포를 생성하였다. (d) c)에 제시된 바와 유사한 영상의 APOE 신호의 적분된 밀도에 대한 영상 정량화. APOE 신호의 적분된 밀도는 치료되지 않은 L-ORD 환자(N=5; 상단: 185.69 ± 5.42; 하단: 46.38 ± 2.51)에서 영향받지 않는 형제자매(N=4; 상단 30.89 ± 12.05; 하단: 8.45 ± 3.09)와 비교하여 유의적으로 더 높다(상단: p=7.76E-6; 하단: p=2.71E-5). 메트포르민 치료된 영향받지 않는 형제자매(N=8; 상단 119.98 ± 20.36; 하단: 23.55 ± 6.17)와 비교하여 메트포르민 치료된 L-ORD 환자(N=4; 상단 79.30 ± 37.51; 하단: 13.58 ± 4.58) 사이에 유의적인 차이는 없다(상단: p=0.32; 하단: p=0.32). 모든 영상은 20x로 촬영되었다. 스케일 바=50 μm. (f) 감소된 맥락막 혈류를 모방하는 혈중산소감소 조건(6시간)하의 VEGF 분비의 ELISA 측정은 노인성 황반 변성의 병리생리학에 관여되어 왔고, 물질대사 스트레스인자로서 작용하여 저산소증-구동된 EMT에 대한 L-ORD iPSC-RPE의 감수성을 결정한다. 도 1i)에 제시된 정상산소 조건과 유사하게, L-ORD 환자 iPSC-RPE(N=10; Ap: 1.89 ± 0.30; Ba: 1.8 ± 0.24)는 영향받지 않는 형제자매(N=9; Ap: 0.78 ± 0.16; Ba: 1.59 ± 0.36)와 비교하여 비-분극화된 방식으로 VEGF를 분비한다(Ap: p=0.005; Ba: p=0.63). 메트포르민에 의한 치료 이전(2주)에 L-ORD 환자 RPE(N=6; Ap: 0.59 ± 0.09; Ba: 1.8 ± 0.24)를 저산소증-구동된 EMT에 대해 보호하고 치료되지 않은 또는 메트포르민 치료된 영향받지 않는 형제자매(N=9; Ap: 0.98 ± 0.16; Ba: 1.64 ± 0.33)와 유사하도록 상단/하단 VEGF 극성을 회복시킨다(Ap: p=0.09; Ba: p=0.64). (g) 영향받지 않는 형제자매와 비교되는 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서의 역분화(EMT)-관련된 유전자의 발현에 미치는 POS 공급 효과. 7-일간의 POS 공급(백색으로 제시됨)은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 L-ORD 환자에서 EMT-관련된 유전자의 발현을 증가시킨다. 7-일의 POS 공급 동안의 메트포르민 치료(적색으로 제시됨)는 EMT 관련된 유전자의 발현을 억제한다. 파선은 4-배 차이를 지시한다. 항존 유전자: ACTB 및 GAPDH. (h) 후향성 임상 연구로부터의 결과 표는 비삼출성 노인성 황반 변성의 개시 연령을 지연시킴을 보여준다(362.51/H35.31). 50 내지 59세의 환자 연령에서, 메트포르민은 56세의 연령(n=157, 메트포르민 부재)으로부터 58.5세의 연령(n=16, 메트포르민 존재)으로 개시 연령을 지연시킨다(p=0.001).
도 19는 L-ORD 환자의 유전자 발현 프로파일이 pAMPK의 활성화를 기선에서 제한하는 보상성 시도를 제안함을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 20은 메트포르민이 정상산소 상태에서 L-ORD 환자 RPE에서 VEGF의 잘못분극화된 분비를 구제함을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 21은 메트포르민 치료가 RPE에 의한 베타-하이드록시부티레이트 상단 분비를 증가시킴을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 22a 내지 22b는 RPE-EMT 및 RPE-역분화의 특징을 생체내에서 모방하는 기계적 망막 손상의 모델을 도시한다.
도 23a 내지 23b는 Nox4가 온전한 RPE에 존재하고, 손상된 RPE에서 고도로 발현됨을 보여주는 데이터를 도시한다.
도 24는 Nox4가 EMT 표지자로서 공지된 세포골격 단백질과 공-편재화됨을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 25는 VAS2870을 사용하는 NOX4의 약리학적 저해가 EMT 표지자인 SMA를 하향조절함을 입증하는 데이터를 도시한다.
도 26A 내지 26C는 shRNA를 사용하는 NOX4의 넉다운(knockdown)을 보여주는 데이터를 도시한다.
도 27은 shRNA를 사용하는 NOX4의 하향-조절이 손상된 RPE에서 세포 이동을 감소시켰음을 보여주는 데이터를 도시한다.
도 28A 내지 28C는 shRNA를 사용하는 NOX4의 하향-조절이 EMT 표지자인 ZEB1을 하향-조절함을 보여주는 데이터를 도시한다.
도 29A 내지 29C는 NOX4 shRNA 렌티바이러스 입자가 긁힌 RPE에서 네스틴(Nestin)을 성공적으로 하향조절함을 보여주는 데이터를 도시한다.
도 30A 내지 30B는 NOX4가 EMT 표지자의 발현을 효과적으로 하향조절함을 보여주는 데이터를 도시한다.
도 31A 내지 31C는 RPE 세포에서의 ABCA4 편재화를 입증하는 데이터를 도시한다. A: ABCA4의 웨스턴 블롯 분석은 그의 막 편재화를 확인한다. 인간 1차(hp) RPE, 대조 iPSC-RPE 및 섬유아세포(음성 대조군)로부터의 막(M) 및 세포질 분별물(C). Na/K ATP아제는 RPE 세포에서의 상단 막 단백질이다. B: RPE 막 상에서의 ABCA4 및 Na/K ATP아제 공-편재화. C: RPE 세포의 정사영은 ABCA4 및 Na/K ATP아제의 상단 공-편재화를 확인한다.
도 32A 내지 320는 스타르가르트 iRPE의 특징을 입증하는 데이터를 도시한다. A-B: qRT-PCR(A) 및 웨스턴 블롯(B)에 의해 제시되는 iRPE(ABCA4-/-, C1 및 C2로부터 유래됨)에서의 ABCA4 발현의 부재. iPSC - 음성 대조군(A, B); 원숭이 망막 - 양성 대조군(B), 대조군 1 - ABCA4-/- iRPE에 대한 동종계 대조군. C: 생어 서열은 환자 iRPE에서 돌연변이의 존재를 확인한다(6088bp 위치에서 엑손 44에서 C>T). D-E: dd-PCR(D) 및 웨스턴 블롯 분석(E)에 의한 환자 iRPE에서의 ABCA4의 발현. F-I: 대조군 및 스타르가르트 iRPE 단일층의 TEM 영상은 상단 과정, 상단에 위치된 멜라닌소체, 밀착 연접, 및 하단에 위치된 핵을 갖는 분극화된 RPE를 보여준다. 건강한 RPE는 ABCA4-/- 클론에 대한 동종계 대조군 1 및 환자 iRPE에 대한 대조군 2(영향받지 않는 형제자매)를 포함한다. O: 성숙한 RPE 표지자의 면역염색은 -/- iRPE 및 대조군 세포의 유사한 발현을 보여준다. **p<0.01; ***p<0.001.
도 33A 내지 33N은 스타르가르트 iRPE에서 반복된 스타르가르트 병리생리학을 입증하는 데이터를 도시한다. A-G: 야생형 POS 공급된 스타르가르트 iRPE는 증가된(2 내지 3배) 지질 침적물을 나타낸다. 비공급(A-C) 및 POS-공급(D-F)시 RPE-내부/아래 보디피(bodipy)-양성 침적물의 비교 분석. 스타르가르트 iRPE는 POS에 노출되는 동안 증가된(2 내지 3배) 세라미드 축적을 나타내었다(J-L). G: 대조 iRPE와 비교되는 스타르가르트-iRPE에서의 지질 침적물의 정량적 분석(M) 및 세라미드 축적(N). 본원에 제공된 대조 데이터 포인트는 ABCA4-/- 클론에 대한 동종계 대조군 1 및 환자에 대한 대조군 2로부터의 iRPE의 평균이다(p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001).
도 34A 내지 34N은 보체 스트레스 하에서 ABCA4 지질 취급에 있어서의 ABCA1 KO의 효과; ABCA1KD 스타르가르트 iRPE에서의 세포-내부/하부의 지질 축적; 및 ABCA1 활성화가 스타르가르트 RPE에서 지질 축적 결함을 구제함을 보여주는 데이터를 도시한다. CI-HS(A-C) 및 CC-HS(D-F) 처리된 iRPE 세포에서의 보디피 지질-양성 침적물의 영상. G: RPE-내부/아래 지질-양성 침적물의 정량적 분석. 건강한 iRPE와 비교할 경우, 스타르가르트 iRPE는 보디피 염색에서 2배 증가를 보여준다(p.ns). CC-HS(H-J) 및 CC-HS+ GW 3965(K-M) 처리된 iRPE 세포의 RPE-내부/아래 보디피-양성 침적물 영상. 10 μM GW 3965(ABCA1 활성화제)에 의해 처리될 경우 패널 K-L에서의 감소된 지질 침적물을 주지한다. N: RPE-내부/아래 보디피-양성 침적물의 정량적 분석은 스타르가르트 iRPE에서의 유의적인 감소를 확인한다. 본원에 제공된 대조 데이터 포인트는 ABCA4-/- 클론에 대한 동종계 대조군 1 및 환자에 대한 대조군 2(영향받지 않는 형제자매)로부터의 iRPE의 평균이다(p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001).
도 35A 내지 35B는 스타르가르트 iRPE 세포에서의 POS 소화 결함을 입증하는 데이터를 도시한다. A: 스타르가르트-iRPE에서의 리포푸신(lipofuscin)-유사 축적 및 POS의 소거에서의 결함. 유세포분석 기반의 식세포작용 검정은 4시간째 건강한-iRPE과 비교하여 스타르가르트-iRPE에서 유사한 POS 섭취를 보여준다. B: 스타르가르트-iRPE에서의 감소된 소화율. 세포에게 pHrdho-표지화된 POS를 4시간 동안 공급하고, POS 처리 4시간 후 배지를 세척하고, 4시간 및 24시간째 유세포분석을 위해 수집하였다. 건강한 RPE는 ABCA4-/- 클론에 대한 동종계 대조군 1 및 환자에 대한 대조군 2를 포함한다(***p<0.001).
도 36A 내지 36C는 메트포르민 치료가 질환 표현형을 개선시킴을 입증하는 데이터를 도시한다. A: 스타르가르트 iRPE 세포에서의 세라미드 발현에 대한 정량적 분석은 메트포르민에 의해 치료된 POS-공급된 스타르가르트 iRPE에서 그의 축적의 극적인 감소를 보여주었다. 본원에 제공된 대조 데이터 포인트는 ABCA4-/- 클론에 대한 동종계 대조군 1 및 환자에 대한 대조군 2로부터의 iRPE의 평균이다. B: 메트포르민에 의해 치료된 Abca4-/- 마우스에 대한 보디피에 의해 염색된 RPE/맥락막의 플랫-마운트(flat-mount) 영상에서의 지질 분포. C: 지질 염색의 정량화는 치료된 ABCA4 KO 마우스에서 감소된 침적물을 확인한다(***p<0.001, ****p<0.0001).
다음은 본 개시내용을 실행하는데 있어서 숙련가에게 도움을 주기 위해 제공되는 상세한 설명이다. 당분야의 숙련가라면 본 개시내용의 취지 또는 범주를 벗어나지 않고 본원에 기재된 실시태양을 변형 및 변경시킬 수 있다. 본원에 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 도면 및 기타 참고문헌은 명백히 참고로 그의 전체가 혼입된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야에서 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 설명에 사용된 용어는 단지 특별한 실시태양을 설명하기 위한 것이고 개시내용을 제한하려는 것은 아니다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한 사이에서 각각의 사이에 있는 값(내용상 달리 명확히 지시되지 않는 한, 하한의 단위의 10분의 1까지, 예컨대 범위내에 속하는 각각의 탄소 원자 수가 제공되는, 탄소 원자 수를 함유한 기의 경우), 및 임의의 다른 언급되거나 언급된 범위내의 사이에 있는 값은 본 개시내용에 포괄되는 것으로 이해한다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위내에 포함될 수 있고 또한 본원에 포괄되고, 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한을 받는다. 언급된 범위가 상한 또는 하한중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 양쪽 제한을 배제하는 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다.
본원의 상세한 설명 및 청구범위내의 모든 수치값은 지시된 값의 "약" 또는 "대략적" 값으로 변형되고, 당분야의 숙련가에 의해 예상될 수 있는 실험적 오차 및 편차를 고려한다.
하기 용어는 본 개시내용을 설명하기 위해 사용된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상세한 설명에 사용된 용어는 단지 특별한 실시태양을 설명하기 위한 것이고 개시내용을 제한하려는 것이 아니다.
본원 및 청구범위에 사용되는 경우 관사 "하나"는, 내용상 달리 명확히 지시되지 않는 한, 하나 또는 하나 보다 많은(즉 적어도 하나)의 관사의 문법적 대상을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "하나의 구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나 보다 많은 구성 요소를 의미한다.
명세서 및 청구범위에 사용되는 경우 "및/또는"이라는 어구는, 등위접속된 구성요소들중 "하나 또는 둘 다", 즉 몇몇 경우 공동으로 존재하고 다른 경우 분리적으로 존재하는 구성요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"에 의해 열거된 다수의 구성요소는 동일한 양식으로 해석되어야 하고, 즉 "하나 이상의" 구성요소들이 그와 같이 등위접속된다. 다른 구성요소들은, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 구성요소와 관련되든 관련되지 않든, 이러한 구체적으로 식별된 구성요소 이외의 다른 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다. 이와 같이, 비-제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은, 제약이 없는 표현, 예컨대 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 하나의 양태에서, 단지 A만을 지칭할 수 있고(B 이외의 구성요소를 선택적으로 포함함); 또 다른 실시태양에서, 단지 B만을 지칭할 수 있으며(A 이외의 구성요소를 선택적으로 포함함); 또한 다른 실시태양에서, A 및 B 둘 다를 지칭할 수 있는 등이다(다른 구성요소를 선택적으로 포함함).
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 경우, "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 목록중에 별도의 항목이 존재하는 경우, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 다수의 또는 목록중의 구성요소들중 적어도 하나 뿐만 아니라 하나 보다 많은 구성요소, 및 선택적으로 추가적인 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 명확히 대조적으로 지시되는 유일한 용어, 예컨대 "∼중 단지 하나" 또는 "∼중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용될 경우, "∼로 구성된"은 다수의 또는 열거된 구성요소중 정확히 하나의 구성요소를 포함함을 지칭한다. 일반적으로 용어 "또는"은 본원에서 사용될 경우, 배제적 용어, 예컨대 "둘중 하나", "∼중 하나", "∼중 단지 하나" 또는 "∼중 정확히 하나"가 선행된다면, 유일한 선택사항(즉, "하나 또는 나머지, 그러나 둘 다는 아님)을 지시하는 것으로만 해석될 것이다.
청구범위에서, 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 변천성 구절, 예컨대 "포함하는", "포함되는, "전달하는", "갖는", "함유하는", "연루되는", "보유하는", "∼로 이루어진" 등은 제약이 없는 것으로, 즉, 제한되지 않고 포함함을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 단지 변천성 구절 "∼로 구성되는" 및 "∼로 본질적으로 구성되는"은, 각각 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures), 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이, 폐쇄적이거나 반-폐쇄적인 변천성 구절일 것이다. 특히 "∼로 본질적으로 구성되는"과 관련하여, "∼로 본질적으로 구성되는"은 본 발명의 화합물 또는 치료에 해로운 영향을 주지 않는 추가적인 성분들에 대해 제약이 없을 것이고, 본 발명의 화합물의 질을 떨어뜨리거나 이를 조작불가능하게 만들어서 본원에 기재된 치료에서 본 발명의 화합물의 효능을 감소시키거나 본원에 기재된 치료의 목표에 반하는 해로운 부작용을 유도할 수 있는 임의의 추가적인 성분들은 배제할 것이다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 경우, 하나 이상의 구성요소의 목록에 있어서 "적어도 하나"는 이라는 구절은 구성요소의 목록중 임의의 하나 또는 그 이상의 구성요소로부터 선택되지만, 구성요소의 목록내에 구체적으로 열거된 각각 및 개개의 구성요소중 적어도 하나를 반드시 포함할 필요는 없고 구성요소의 목록내의 구성요소의 임의의 조합을 배제하지 않는, 적어도 하나의 구성요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한 "적어도 하나"라는 구절이 지칭하는 구성요소의 목록내에 구체적으로 식별된 구성요소 이외의 구성요소가, 구체적으로 식별된 구성요소와 관련되든 관련되지 않든, 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 이와 같이, 비-제한적 예로서, "A 및 B중 적어도 하나"(또는, 동등하게는, "A 또는 B중 적어도 하나," 또는, 동등하게는 "A 및/또는 B중 적어도 하나")는 B가 존재하지 않으면서(선택적으로 B 이외의 구성성분을 포함함) 적어도 하나의, 선택적으로 하나 보다 많은 A를 지칭하고; 또 다른 실시태양에서, A가 존재하지 않으면서(선택적으로 A 이외의 구성성분을 포함함) 적어도 하나의, 선택적으로 하나 보다 많은 B를 지칭할 수 있으며; 또한 다른 실시태양에서, 적어도 하나, 선택적으로 하나 보다 많은 A, 및 적어도 하나, 선택적으로 하나 보다 많은 B(선택적으로 다른 구성요소를 포함함)를 지칭할 수 있는 등이다.
하나 보다 많은 단계 또는 작용을 포함하는 본원에 기재된 특정 방법에서, 내용상 다르게 지시되지 않는 한, 방법의 단계 또는 작용의 순서는 방법의 단계 또는 작용이 언급된 순서에 반드시 제한되는 것은 아님을 또한 이해해야 한다.
용어 "병용-투여" 및 "병용-투여하는" 또는 "병용 치료법"은, 치료제가 어느 정도로, 바람직하게는 효과적인 양으로 동시에 존재하는 한, 동시발생 투여(2종 이상의 치료제를 동시에 투여함) 및 시간차 투여(1종 이상의 치료제를 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여와 상이한 시간에 투여함) 둘 다를 지칭한다. 바람직한 특정 양태에서, 본원에 기재된 1종 이상의 본 발명의 화합물은 적어도 1종의 추가적인 생물활성제, 예를 들면 특별히 항암제, 예컨대 표피 성장 인자 수용기를 표적화하는 화학요법제 또는 생물요법제[예를 들어, 표피 성장 인자 수용기 저해제, 예컨대 게피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 네라티닙(neratinib), 라파티닙(lapatinib), 세툭시맵(cetuximab), 반데타닙(vandetanib), 네시투마맵(necitumamab), 오시메르티닙(osimertinib), 또는 이의 조합물중 적어도 1종]와 함께 병용-투여된다. 특별히 바람직한 양태에서, 화합물의 병용-투여는 항암 활성을 비롯하여 상승적인 활성 및/또는 치료를 초래한다 .
용어 "화합물"은, 본원에 사용될 경우, 달리 지시되지 않는 한, 본원에 개시된 임의의 특정 화학적 화합물을 지칭하고, 이의 호변이성질체, 위치이성질체(regioisomers), 기하 이성질체, 및 적용가능한 경우, 광학 이성질체(거울상이성질체) 및 다른 입체이성질체(부분입체이성질체)를 비롯한 입체이성질체, 뿐만 아니라, 상황상 적용가능한 경우, 이의 전구약물 및/또는 중수소화된 형태를 비롯하여 약학적으로 허용가능한 염 및 유도체를 포함하다. 고려되는 중수소화된 소분자는 약물 분자에 함유된 1개 이상의 수소 원자가 중수소에 의해 치환된 분자이다.
상황상 그의 사용에서, 용어 "화합물"은 일반적으로 단일 화합물을 지칭하지만, 또한 다른 화합물, 예컨대 입체이성질체, 위치이성질체 및/또는 광학 이성질체(라세미체 혼합물 포함) 뿐만 아니라 특정 거울상이성질체 또는 개시된 화합물의 거울상이성질체적으로 강화된 혼합물을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 상황상 활성 자리로의 화합물의 투여 및 전달을 용이하게 하도록 변형된 화합물의 전구약물 형태를 지칭할 수 있다. 본 화합물을 설명함에 있어서, 서로 동일하게 연관된 다수의 대체물 및 변형체가 기재됨을 주지한다. 숙련가라면 본원에 기재된 분자는 아래에 일반적으로 기재된 바와 같이 안정한 화합물임을 이해한다. 결합이 제시되는 경우, 이중 결합 및 단일 결합 모두는 제시된 화합물의 상황 및 원자가 상호작용에 대한 공지된 법칙내에서 표시되거나 이해된다.
용어 "환자" 또는 "피험체"는, 본 개시내용에 따른 조성물에 의한 치료(예방학적 치료 포함)가 제공되는 동물, 바람직하게는 인간 또는 가축을 설명하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 사용된다. 이들 특정 동물, 예컨대 인간 환자에게 특이적인 감염, 증상 또는 질환의 치료에 있어서, 용어 "환자"는 가축, 예컨대 개 또는 고양이 또는 농장 동물, 예컨대 말, 소, 양 등을 비롯한 특정 동물을 지칭한다. 일반적으로, 본 개시내용에서, 용어 "환자"는 용어의 사용의 상황으로부터 달리 언급되거나 암시되지 않는 한 인간 환자를 지칭한다.
용어 "효과적"은, 화합물, 조성물 또는 성분의 의도된 용도와 관련하여 사용될 경우 의도된 결과에 영향을 미치는 화합물, 조성물 또는 성분의 양을 설명하기 위해 사용된다. 용어 "효과적"은, 본 출원에서 다르게 설명되거나 사용되는 모든 다른 효과적인 양 또는 효과적인 농도를 포괄한다.
치료학적 화합물
본 발명은 망막의 색소 상피의 형태, 및 증상, 생존력, 기능성을 향상시키는, 유전자, 또는 단백질 또는 조직 miRNA 또는 mRNA 또는 긴-비코딩 RNA의 발현을 조절할 수 있는 화합물을 제공한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 NADPH-산화효소 4(Nox4) 기능 및/또는 발현을 저해하거나, 또는 라디칼 산소 종의 형성을 저해하는 화합물이다. Nox 계열의 NADPH 산화효소는 유일하게 알려진 그의 기능이 NADPH로부터 02 분자로 전자 전달을 촉매화함으로써 ROS를 생산하는 것인 효소의 그룹이다. 촉매적 소단위 Nox의 4종의 설치류 유전자(Nox 1-4)는 식별되었고, 각각 세포내 신호생성에 있어서 상이한 기능 및 조직-특이적 발현을 갖는다[람베쓰(Lambeth)의 2004년 문헌; 브라운(Brown) 및 그리엔들링(Griendling)의 2009년 문헌; 장(Zhang) 등의 2010년 문헌].
특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 세린 단백질 분해 효소, 도파민 수용기, NF-κB, mTOR, Rho GTP 가수분해 효소, CDC42, 및/또는 RAC1, 또는 이의 조합물의 발현을 조절하는 화합물이다.
다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 AMPK를 조절하는 화합물이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 RPE 상피 간엽 이행 또는 RPE 역분화를 조절한다.
NF-κB(활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인헨서: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell)는 DNA의 전사, 사이토킨 생산 및 세포 생존을 제어하는 단백질 복합체이다. NF-κB는 거의 모든 동물 세포 유형에서 발견되고, 스트레스, 사이토킨, 자유 라디칼, 중금속, 자외선 조사, 산화된 LDL, 및 박테리아 또는 바이러스 항원과 같은 자극에 대한 세포의 반응에 관여한다. NF-κB는 감염에 대한 면역 반응을 조절하는데 있어서 핵심적인 역할을 담당한다. NF-κB의 부정확한 조절은 암, 염증 및 자가면역 질환, 패혈증, 바이러스 감염, 및 부적절한 면역 발달과 연관되었다. NF-κB는 또한 시냅스 가소성 및 기억의 과정에 관여한다.
mTOR은 단백질 키나아제의 포스파티딜이노시톨 3-키나아제-관련된 키나아제 계열의 일원이다. mTOR는 다른 단백질과 결합하고, 2개의 별개의 단백질 복합체, mTOR 복합체 1 및 mTOR 복합체 2(이들은 상이한 세포 과정을 조절함)의 핵심 성분으로서 작용한다.
Rho GTP 가수분해 효소는 모든 진핵 세포에서 매우 다양한 신호 전달 경로를 제어하는 분자 스위치이다. Rho GTP 가수분해 효소는, 세포-세포 접착 및 이동의 기본인 동적 액틴 세포골격 조립 및 재배열에 중심이다. 인간 Cdc42는 Rho 계열의 작은 GTP 가수분해 효소가고, 이는 세포 형태, 세포 이동, 엔도시토시스(endocytosis) 및 세포 주기 진행을 비롯한 세포의 다양한 기능을 제어하는 신호생성 경로를 조절한다. 활성화된 Cdc42는 p21-활성화된 키나아제 PAK1 및 PAK2를 입체배좌 변화에 의해 활성화시키고, 이는 다시 액틴 재조직화를 개시하고 세포 접착, 이동, 및 침투를 조절한다. Ras-관련된 C3 보툴리눔 독소 기질 1로서도 공지된 Rac1은 작은(∼21 kDa) 신호생성 G 단백질이고, GTP 가수분해 효소의 Rho 계열의 Rac 하위계열의 일원이다. Rac1은, 예컨대 세포 주기, 세포-세포 접착, 운동성(액틴 망조직을 통한), 및 상피 분화(표피 줄기 세포를 유지하기 위해 필수적인 것으로 제안됨)를 비롯한 많은 세포 과정에 대한 다면발현성 조절자이다.
세린 단백질 분해 효소는 엘라스타아제, 프로테이나아제 3, 키모트립신(chymotrypsin), 카텝신(cathepsin) G, 트립신, 트롬빈, 프롤릴 올리고펩티다아제 및 기타 효소를 포함하는 효소의 부류이다. 단백질 분해 효소/항-단백질 분해 효소 활성의 균형의 붕괴는 다수의 질환 상태의 발병에 연루되어 왔다. 세린 단백질 분해 효소 저해제는 세린 단백질 분해 효소를 조절, 특별히 하향조절하거나 저해할 수 있는 화합물의 큰 계열을 포괄한다.
도파민 수용기는 척추동물 중추신경계(CNS)에서 중요한 G 단백질-커플링된 수용기의 부류이다. 도파민 수용기는 G-단백질 커플링, 뿐만 아니라 상이한 단백질(도파민 수용기-상호작용 단백질) 상호작용을 통한 신호생성을 통해서 상이한 효과자를 활성화시킨다. 도파민 수용기의 적어도 5개의 하위유형인 D1, D2, D3, D4, 및 D5가 존재한다. 도파민 수용기 길항물질은 도파민 수용기의 발현을 조절할 수 있는, 특별히 하향조절할 수 있는 화합물의 큰 계열을 포괄한다.
5' AMP-활성화된 단백질 키나아제 또는 AMPK 또는 5' 아데노신 일인산염-활성화된 단백질 키나아제는, 주로 세포의 에너지가 낮을 경우 글루코스 및 지방산 섭취 및 산화를 활성화시키기 위해, 세포의 에너지 항상성에 있어서 일정 역할을 담당하는 효소(EC 2.7.11.31)이다. 이는 매우 보존적인 진핵 단백질 계열에 속하고, 그의 상동유전자(orthologue)는 효모 및 식물에서 각각 SNF1 및 SnRK1이다. 이는 기능적 효소가 효모로부터 인간까지 보존되도록 함께 만드는 3종의 단백질(소단위)로 구성된다. 그의 성분의 이소형(isoform)이 존재하므로, 포유동물에 12가지 형태의 AMPK가 존재하고, 이들 각각은 상이한 조건하에 상이한 조직 편재화, 및 상이한 기능을 가질 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 라디칼 산소 종의 형성을 저해하는 NOX4 저해제 화합물이다. 다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 NF-κB를 저해하거나 하향조절한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 세린 단백질 분해 효소를 저해하거나 하향조절한다. 다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 도파민 수용기의 발현을 조절한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 mTOR 또는 Rho GTP 가수분해 효소의 발현을 조절한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 보체 수용기(C3aR 및 C5aR)의 발현을 조절한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 자가포식을 상향조절한다. 이러한 실시태양에서, 자가포식의 상향조절은 RPE 건강을 향상시키고 APOE 침적물을 감소시킨다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 AMPK를 조절한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 RPE 상피 간엽 이행 또는 RPE 역분화를 조절한다.
특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 아미노카프로산, L-701,324, Vas2870, L-745,870 염산염, Me-3,4-데포스타틴, N-메틸-1-데옥시노지리마이신, L-750,667 트리하이드로클로라이드, (+)-MK-801 말레산 수소, 펨피딘 타르타르산염, (-)-나프록센 나트륨, 랄록시펜 염산염, SKF 83959 브롬화수소산염, L-687,384 염산염, 7,7-디메틸-(5Z,8Z)-에이코사디에노산, SP-600125, Ro41-0960, 안시타빈 염산염, 리스페리돈, 텔렌제핀 중염산염, NO-711 염산염, U-99194A 말레산염, S(+)-라클로프라이드 L-타르타르산염, 피렌제핀 중염산염, 캅토프릴, 티오페라미드 말레산염, 알프레놀올 염산염, 리토드린 염산염, 푸트레신 중염산염, 1-(2-메톡시페닐)피페라진 염산염, PAPP, U-69593, AG-1478, 리루졸, 펜톨아민 메실산염, DBO-83, 포르메스탄, 카르바마제핀, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오르화물 염산염, 터부탈린 헤미황산염, UK 14304, GR 113808, 레플루노미드, 아세틸티오콜린 염화물, 스페르미딘, 5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드, ATPO, 아카데니신 또는 메트포르민, 또는 이의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 L-745,870; 리루졸, 아미노카프로산; Vas2870; 아카데니신; 메트포르민, 또는 이의 조합물이다. 또한 다른 특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 메트포르민이다.
추가적인 실시태양에서 NOX4 저해가 요망될 경우, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 하나 이상의 siRNA 분자 또는 NOX4를 저해하는 하나 이상의 항체를 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 조성물의 화합물은 NOX4를 저해하는 항체의 생산을 일으키는 1종 이상의 생물활성제를 포함한다.
추가적인 실시태양에서, 상세한 설명은 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 용매화물 및 다형체, 예컨대 이의 약학적으로 허용가능한 염 형태, 예를 들어, 산 및 염기 염 형태를 비롯하여 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 제공한다.
치료학적 조성물
효과량의 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 화합물, 및 본원에 기재된 이외의 하나 이상의 화합물의 조합물을 모두 효과량으로 약학적으로 허용가능한 양의 담체, 첨가제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 약학 조성물은 본 개시내용의 추가의 양태를 나타낸다.
본 개시내용은, 적용가능한 경우, 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 특별히 산 또는 염기 부가 염을 포함하는 조성물을 포함한다. 이러한 양태에 따라서 유용한 전술된 염기 화합물의 약학적으로 허용가능한 산 부가 염을 제조하기 위해 사용되는 산은 무독성 산 부가염, 즉, 약리학적으로 허용가능한 음이온을 함유하는 염, 예컨대 무엇 보다도, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 질산염, 황산염, 중황산염, 인산염, 산 인산염, 아세트산염, 락트산염, 시트르산염, 산 시트르산염, 타르타르산염, 중주석산염, 석신산염, 말레산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 당산염, 벤조산염, 메탄설폰산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염 및 파모산염[즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3 나프토에이트)]염을 형성하는 산이다.
약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 또한 본 개시내용에 따른 화합물 또는 유도체의 약학적으로 허용가능한 염 형태를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 천연에서 산성인 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염기 염을 제조하기 위한 시약으로서 사용될 수 있는 화학적 염기는 이러한 화합물과 무독성 염기 염을 형성하는 염기이다. 이러한 무독성 염기 염으로는 무엇보다도 이러한 약리학적으로 허용가능한 양이온, 예컨대 알칼리 금속 양이온(예를 들어, 칼륨 및 나트륨) 및 알칼리 토 금속 양이온(예를 들어, 칼슘, 아연 및 마그네슘), 암모늄 또는 수용성 아민 부가염, 예컨대 N-메틸글루카민-(메글루민: meglumine), 및 저급 알카놀암모늄으로부터 유래된 염, 및 약학적으로 허용가능한 유기 아민의 다른 염기 염이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 화합물은, 본 개시내용에 따라서, 경구, 비경구 또는 국부 경로에 의해 단일 용량으로 또는 분할된 용량으로 투여될 수 있다. 국소 안구 투여에서 본 개시내용에 따른 화합물의 투여가 또한 사용될 수 있다. 활성 화합물의 투여는 연속 투여(정맥내 점적 주입) 내지 하루에 수회의 경구 투여(예를 들면, Q.I.D.)의 범위일 수 있고, 다른 투여 경로중에서도 경구, 국부, 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 경피(이는 침투 증진제를 포함할 수 있음), 볼점막, 설하 및 좌약 투여를 포함할 수 있다. 장용 제피의 경구 정제는 투여의 경구 경로로부터 화합물의 생물이용성을 증진시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 가장 효과적인 투여형은 선택된 특정 제제의 약물동태학 뿐만 아니라 환자에서 질환의 위중성에 좌우될 것이다. 비내(intra-nasal), 기관내(intra-tracheal) 또는 폐 투여를 위한 스프레이, 미스트 또는 에어로졸로서의 본 개시내용에 따른 화합물의 투여가 또한 사용될 수 있다. 점안약, 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 및 망막하 주사로서의 본 개시내용에 따른 화합물의 투여가 또한 사용될 수 있다. 따라서 본 개시내용은 또한 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물을, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 첨가제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용에 따른 화합물은 즉시 방출, 중간 방출 또는 지연되거나 제어된 방출 형태로 투여될 수 있다. 지연되거나 제어된 방출 형태는 바람직하게는 경구적으로, 뿐만 아니라 좌약 및 경피 또는 국부 형태로 투여된다. 리포솜 형태의 근육내 주사는 주사 부위에서 화합물의 방출을 제어하거나 지연시키기 위해 또한 사용될 수 있다.
특별한 실시태양에서, 본원에 기재된 화합물은 국소 안구 투여 경로에 의해 투여된다. 이러한 실시태양에서, 본 개시내용에 따른 화합물은 안과용 약학 조성물로서 투여된다. 이러한 안과용 약학 조성물은 눈에 직접 적용하기 위해 점안약, 미스트, 프로스트(frost), 포움(foam), 크림, 연고 또는 에멀젼(emulsion)의 형태로 제조된다. 특별한 실시태양에서, 조성물은 수성 점안약으로서 제조된다. 이러한 실시태양에서, 점안약은 단상성(monophasic)이다. 수성 점안약에 함유된 본 발명의 화합물의 농도는 일반적으로, 그러나 제한없이, 0.01 W/V% 이상, 바람직하게는 0.1 W/V% 이상, 더욱 바람직하게는 0.5 W/V% 이상, 및 일반적으로 20 W/V% 이하, 바람직하게는 10 W/V% 이하, 및 더욱 바람직하게는 5 W/V% 이하이다. 실제로 투여되는 본 발명의 화합물의 양은 치료되는 개별체에 좌우되고, 바람직하게는 현저한 부작용을 동반하지 않으면서 원하는 치료를 달성하기 위해 최적화된 양이다. 효과적인 용량은 당분야의 숙련가에 의해 충분히 결정될 수 있다.
본 발명의 점안약은, 필요할 경우, 본 발명의 특징 및 점안약의 안정성이 손상되지 않는 한, 일반적으로 점안약에 첨가되는 첨가제를 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 예로는 등장성 제제, 예컨대 염화 나트륨, 염화 칼륨, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 붕산, 글루코스, 프로필렌 글리콜 등; 완충 제제, 예컨대 인산염 완충제, 아세트산염 완충제, 붕산염 완충제, 탄산염 완충제, 시트르산염 완충제, 트리스(tris) 완충제, 글루탐산, ε-아미노카프로산 등; 보존제, 예컨대 염화 벤즈알코늄, 염화 벤제토늄, 클로르헥시딘 글루콘산염, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 탈수소아세트산 나트륨, 파라옥시벤조에이트 에스테르, 에데트산 나트륨, 붕산 등; 안정화제, 예컨대 아황산수소 나트륨, 티오황산 나트륨, 에데트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔 등; 수용성 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 등; 증점제, 예컨대 콘드로이틴 황산 나트륨, 히알루론산 나트륨, 카복시비닐 중합체, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 마크로골(macrogol) 등; pH 조정제, 예컨대 염산, 수산화 나트륨, 인산, 아세트산 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특별한 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 점안약은 인공 눈물에 함유될 수 있는 하나 이상의 다른 구성성분, 즉, 아미노에틸설폰산, 콘드로이틴 황산 나트륨, L-아스파르트산 칼륨, L-아스파르트산 마그네슘, L-아스파르트산 칼륨 마그네슘(동몰 혼합물), 탄산수소 나트륨, 탄산 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 염화 나트륨, 인산수소 나트륨, 인산 이수소 나트륨, 인산 이수소 칼륨, 건조된 탄산 나트륨, 황산 마그네슘, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 글루코스, 및 메틸셀룰로스를 추가로 함유할 수 있다. 첨가되는 이들 첨가제의 양이 첨가되는 첨가제의 종류, 용도 등에 의존하여 다양하지만, 이들은 단지 첨가제의 목적을 달성할 수 있는 농도로 첨가될 필요가 있다.
본원에 기재된 바와 같은 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하는 종래의 방식으로 제형화될 수 있고, 또한 제어된-방출 제형으로 투여될 수 있다. 이들 약학 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체로는 이온 교환체, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 황산 프롤라민(prolamine), 인산수소 이나트륨, 인산수소 칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기제 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지(wool fat)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 국부적으로, 안구내로, 안구 표면으로, 직장으로, 비강으로, 볼점막으로, 질로, 또는 이식된 저장기를 경유하여 투여될 수 있다. 용어 "비경구적"은 본원에서 사용될 경우 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 유리체내, 망막하, 망막으로, 테논낭하, 흉골내, 경막내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 국소 안구 투여에 의해, 경구적으로, 복강내로 또는 정맥내로 투여된다.
본원에 기재된 바와 같은 조성물의 주사가능한 멸균 형태는 수성 또는 또는 유성의 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당분야에 공지된 기법에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 멸균 제제는 또한 무독성의 비경구적으로-허용가능한 희석제 또는 용매중의 주사가능한 멸균 용액 또는 현탁액일 수 있고, 예를 들면 1,3-부탄디올중의 용액으로서이다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매는 물, 링거(Ringer)의 용액 및 등장성 염화 나트륨 용액이다. 또한, 멸균 고정유는 용매 또는 현탁 매질로서 관례적으로 이용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 비롯한 임의의 완하성(bland) 고정유가 이용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 그의 글리세라이드 유도체는 주사가능 의약품의 제조에 있어서 천연의 약학적으로-허용가능한 오일, 예컨대 올리브유 또는 피마자유로서, 특별히 이들의 폴리옥시에틸화 형태로 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 예컨대 Ph. Helv 또는 유사 알코올을 또한 함유할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물은, 제한되지 않지만 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 비롯한 임의의 경구적으로 허용가능한 투여형으로 경구적으로 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우, 통상적으로 사용되는 담체는 락토즈 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예컨대 스테아르산 마그네슘이 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토즈 및 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액이 경구 사용을 위해 요구되는 경우, 활성 구성성분은 유화제 및 현탁제와 조합된다. 원한다면, 특정한 감미제, 착향료 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다. 특정 실시태양에서, 경구 투여를 위한 약학 조성물은 혈액-망막 장벽을 가로질러 화합물을 전달하는 것을 돕는 제형을 포함한다.
다르게는, 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물은 직장 투여를 위한 좌약의 형태로 투여될 수 있다. 이들은 제제를 적합한 비자극성 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있고, 이러한 부형제는 실온에서 고체이지만 직장 온도에서 액체이므로 직장에서는 약물을 방출하기 위해 용해될 것이다. 이러한 물질로는 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물은 또한 국부적으로 투여될 수 있다. 적합한 국부 제형은 이들 영역 또는 기관 각각을 위해 쉽게 제조된다. 하부 장관에 대한 국부적 적용은 직장 좌약 제형으로(상기 참조) 또는 적합한 관장 제형으로 달성될 수 있다. 국부적으로-허용가능한 경피 패치가 또한 사용될 수 있다.
국부 적용을 위해, 약학 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 연고로 제형화될 수 있다. 본 개시내용의 화합물의 국부 투여를 위한 담체로는 미네랄 오일, 유동 파라핀, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 특정한 바람직한 양태에서, 화합물은 환자의 스텐트에서 발생되는 폐색의 경향을 저해하거나 감소시키기 위해 환자내로 수술적으로 이식되는 스텐트 상으로 코팅될 수 있다.
다르게는, 약학 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 적합한 담체로는 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
안과적 사용을 위해, 약학 조성물은 보존제, 예컨대 벤질알코늄 염화물의 존재 또는 부재하에, 등장성의 pH 조정된 멸균 염수중의 미크론화된 현탁액으로서, 또는, 바람직하게는, 등장성의 pH 조정된 멸균 염수중의 용액으로서 제형화될 수 있다. 다르게는, 안과적 사용을 위해, 약학 조성물은 연고, 예컨대 바셀린으로 제형화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 안과적 사용 또는 국소 안구 사용을 위한 약학 조성물은 친유성적으로 변형된 조성물 및 이식가능한 담체를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약학 제형에 대해 당분야에 잘 공지된 기법에 따라 제조되고, 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생물이용성을 증진시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오르화 탄소, 및/또는 다른 종래의 용해화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조될 수 있다.
단일 투여형을 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물중 화합물의 양은 치료되는 주체 및 질환, 특별한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 조성물은 약 0.05 밀리그램 내지 약 750 밀리그램, 또는 더 더욱 바람직하게는 약 1 밀리그램 내지 약 600 밀리그램, 및 보다 더욱 바람직하게는 약 10 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성성분을 단독으로,또는 적어도 하나의 본 개시내용에 따른 화합물 이외의 물질과 조합하여 함유하도록 제형화되어야 한다.
또한 임의의 특별한 환자를 위한 특정 투여량 및 치료 섭생이 이용되는 특정 화합물의 합성, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 배출 속도, 약물 조합, 및 치료 담당의사의 판단 및 치료되는 특별한 질환 또는 증상의 위중성을 비롯한 다양한 인자에 좌우될 것임을 이해해야 한다.
본원에 기재된 방법에 따른 화합물을 사용하는 치료법이 필요한 환자 또는 피험체는, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에서 효과량의 본 개시내용에 따른 화합물(이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체 포함)을 단독으로 또는 본원에서 식별되지 않은 다른 공지된 치료제와 조합하여 환자(피험체)에게 투여함으로써 치료될 수 있다.
이들 화합물은 임의의 적절한 경로, 예를 들면, 경구적으로, 비경구적으로, 정맥내로, 피내로, 피하로, 또는 국부적으로, 예컨대 경피로, 액체, 크림, 겔 또는 고체 형태, 또는 에어로졸 형태로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 치료되는 환자에서 심각한 독성 영향을 일으키지 않으면서 환자에게 원하는 증후를 위해 치료학적으로 효과적인 양을 전달하기에 충분한 양으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에 포함된다. 본원에 언급된 모든 조건을 위한 활성 화합물의 바람직한 용량은 1일당 약 10 ng/kg 내지 300 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg, 더욱 일반적으로 1일당 수여자/환자의 체중 1 킬로그램당 0.5 내지 약 25 mg의 범위이다. 전형적인 국부 투여량은 적합한 담체에서 0.01 내지 5%(중량/중량)의 범위일 것이다.
화합물은 편리하게는 단위 투여형당 1 mg 미만, 1 mg 내지 3000 mg, 바람직하게는 5 내지 500 mg의 활성 구성성분을 함유하는 투여형을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 단위 투여형으로 투여된다. 25 내지 250 mg의 경구 투여량이 종종 편리하다.
활성 구성성분은 바람직하게는 약 0.00001 내지 30 mM, 바람직하게는 약 0.1 내지 30 μM의 활성 화합물의 피이크 혈장 농도를 달성하도록 투여된다. 이는, 예를 들면, 선택적으로 염수, 또는 수성 매질중 활성 구성성분의 용액 또는 제형의 정맥내 주사에 의해 달성되거나, 또는 활성 구성성분의 거환으로서 투여된다. 활성 제제의 효과적인 혈장 농도를 생성하기 위해 경구 투여가 또한 적절하다.
약물 조성물중 활성 화합물의 농도는 약물의 흡수, 분포, 비활성화, 및 배출 속도 뿐만 아니라 당분야의 숙련가에게 공지된 기타 인자에 좌우될 것이다. 투여량 값은 또한 개선되어야 하는 증상의 위중성에 따라 달라짐을 주지해야 한다. 임의의 특별한 피험체의 경우, 특정 투여량 섭생은 개별적 요구 및 조성물을 투여하거나 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정되어야 하고, 본원에 제시된 농도 범위는 단지 예시적이며 청구된 조성물의 범주 및 실행을 제한하려는 것이 아님을 추가로 이해해야 한다. 활성 구성성분은 한번 투여될 수 있거나, 다양한 시간 간격으로 다수의 더 작은 용량으로 분할되어 투여될 수 있다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용의 담체를 포함할 것이다. 이들은 젤라틴 캡슐에 둘러싸이거나 정제로 압착될 수 있다. 치료학적 경구 투여를 목적으로, 활성 화합물 또는 그의 전구약물 유도체는 부형제와 함께 혼입되고 정제, 트로키제(troche) 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 상용성인 결합제, 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다.
정제, 환제, 캡슐, 트로키제 등은 임의의 하기 구성성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 트라가칸트 고무 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 분산제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산 마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화 규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 착향료, 예컨대 박하, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료. 단위 투여형이 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질에 더하여 액체 담체, 예컨대 지방 오일을 포함할 수 있다. 또한, 단위 투여형은 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 기타 물질, 예를 들면, 당 코팅제, 쉘락(shellac), 또는 장용제를 함유할 수 있다.
활성 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 엘릭시르(elixir), 현탁제, 시럽, 웨이퍼(wafer), 츄잉검 등의 성분으로서 투여될 수 있다. 시럽은 활성 화합물에 더하여 감미제로서의 수크로스 및 특정 보존제, 염료 및 착색제 및 향료를 함유할 수 있다.
활성 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 또한 원하는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질, 또는 원하는 작용을 보강하는 물질, 예컨대 무엇보다도 표피 성장 인자 수용기 저해제, EPO 및 다바포이에틴 알파(darbapoietin alfa)를 비롯한 항암제와 혼합될 수 있다. 본 개시내용의 바람직한 특정 양태에서, 하나 이상의 본 개시내용에 따른 화합물은 본원에 기재되지 않은 또 다른 생물활성제, 또는 상처 치유제, 예컨대 항생제와 함께 병용-투여될 수 있다.
비경구, 피내, 피하, 또는 국부 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소 나트륨; 킬레이트 시약, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염 및 긴장성을 조정하기 위한 제제, 예컨대 염화 나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 담길 수 있다.
정맥내로 투여된다면, 바람직한 담체는 생리식염수 또는 인산염 완충된 염수(PBS: phosphate buffered saline)이다.
하나의 양태에서, 활성 화합물은 신체로부터 신속히 제거되는 것으로부터 화합물을 보호하는 담체, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 방출 제어된 제형과 함께 제조된다. 생분해성, 생물화합성 중합체가 사용될 수 있고, 예컨대 에틸렌 비닐 아세트산염, 폴리산무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이다. 이러한 제형을 제조하기 위한 방법은 당분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
리포솜 현탁액이 또한 약학적으로 허용가능한 담체이다. 이들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,522,811호(이는 본원에 참고로 그의 전체가 혼입됨)에 기재된 바와 같은 당분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 리포솜 제형은 적절한 지질(들)(예컨대 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤)을 나중에 증발되는 무기 용매에 용해시키고, 용기의 표면 상에서 건조된 지질의 얇은 막을 남김으로써 제조될 수 있다. 이어서 활성 화합물의 수성 용액을 용기내로 도입한다. 이어서 용기를 손으로 저어 지질 물질을 용기의 측부로부터 떨어뜨리고, 지질 응집물을 분산시키고, 이로써 리포솜 현탁액을 형성한다.
치료학적 방법
추가적인 양태에서, 상세한 설명은 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 염 형태, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다. 치료학적 조성물은 환자 또는 피험체, 예를 들면, 동물, 예컨대 인간에서 안과 질환 상태 또는 증상을 치료하거나 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 치료학적 조성물은 환자 또는 피험체, 예를 들면, 동물, 예컨대 인간에서 망막의 장애 또는 증상을 치료하거나 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료" 등은, 본원에 사용될 경우, 안과 질환 상태 또는 증상의 치료를 포함하여, 본 화합물이 투여되는 환자에게 이점을 제공하는 임의의 작용을 지칭한다. 상세한 설명은 안과 질환, 예컨대 (노인성) 황반 변성, 황반 이영양증, 예컨대 스타르가르트 및 스타르가르트-유사 질환, 베스트병(난황형 황반 이영양증), 및 성인 난황형 이영양증 또는 망막 색소변성의 아형을 치료하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 조성물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 방법은, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 보조제, 또 다른 생물활성제 또는 이의 조합물을 선택적으로 포함하는, 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 투여함을 포함한다.
추가적인 실시태양에서, 상세한 설명은 효과량, 예를 들어, 치료학적 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 염 형태, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 보조제, 또 다른 생물활성제 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물을 안과 질환, 장애 또는 이의 증후를 치료하거나 개선시킬 필요가 있는 피험체에게 투여함을 포함하고, 여기서 조성물이 피험체에서 이러한 질환 또는 장애 또는 이의 증후를 치료하거나 개선시키는데 효과적인, 피험체 또는 환자, 예를 들어, 동물, 예컨대 인간에서 안과 질환, 장애 또는 이의 증후를 치료하거나 개선시키기 위한 방법을 제공한다.
추가적인 실시태양에서, 상세한 설명은 효과량, 예를 들어, 치료학적 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 염 형태, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 보조제, 또 다른 생물활성제 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물을 망막의 변성을 치료할 필요가 있는 피험체에게 투여함을 포함하고, 여기서 조성물이 피험체에서 이러한 망막의 변성의 증후를 치료하거나 개선시키는데 효과적인, 피험체 또는 환자, 예를 들어, 동물, 예컨대 인간에서 망막의 변성을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
추가적인 실시태양에서, 상세한 설명은 효과량, 예를 들어, 치료학적 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 염 형태, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 보조제, 또 다른 생물활성제 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물을 망막의 색소 상피 세포를 복원시킬 필요가 있는 피험체에게 투여함을 포함하고, 여기서 조성물이 피험체에서 망막의 색소 상피 세포를 복원시키는데 효과적인, 피험체 또는 환자, 예를 들어, 동물, 예컨대 인간에서 망막의 색소 상피 세포를 복원시키기 위한 방법을 제공한다.
추가적인 실시태양에서, 상세한 설명은 효과량, 예를 들어, 치료학적 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 염 형태, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 보조제, 또 다른 생물활성제 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물을 황반 변성을 치료할 필요가 있는 피험체에게 투여함을 포함하고, 여기서 조성물이 피험체에서 황반 변성의 증후를 치료하거나 개선시키는데 효과적인, 피험체 또는 환자, 예를 들어, 동물, 예컨대 인간에서 황반 변성을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 구체적인 실시태양에서, 황반 변성은 노인성 황반 변성이다. 다른 실시태양에서, 황반 변성은 위축성, 신생 혈관 또는 삼출성 황반 변성이다. 다른 실시태양에서, 황반 변성은 초기 단계 황반 변성, 중간 단계 황반 변성, 또는 진행 단계 황반 변성이다. 하나의 특별한 실시태양에서, 상세한 설명은 효과량, 예를 들어, 치료학적 효과량의 메트포르민 또는 이의 염 형태, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 보조제, 또 다른 생물활성제 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물을 초기 단계 황반 변성을 치료할 필요가 있는 피험체에게 투여함을 포함하고, 여기서 조성물이 피험체에서 초기 단계 황반 변성의 증후를 치료하거나 개선시키는데 효과적인, 피험체 또는 환자, 예를 들어, 동물, 예컨대 인간에서 초기 단계 황반 변성을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 본 개시내용은 효과량의 본 개시내용에 따른 화합물을, 선택적으로 또 다른 생물활성제와 병용하여 안과 질환을 치료하거나 개선시킬 필요가 있는 환자에게 투여함을 포함하는, 상기와 같은 인간 환자에서 안과 질환을 치료하거나 개선시키는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시태양에서, 상세한 설명은 효과량, 예를 들어, 치료학적 효과량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 염 형태, 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 보조제, 또 다른 생물활성제 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물을 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료할 필요가 있는 피험체에게 투여함을 포함하고, 여기서 조성물이 피험체에서 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하거나 개선시키는데 효과적인, 피험체 또는 환자, 예를 들어, 동물, 예컨대 인간에서 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 특별한 실시태양에서, 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하기 위한 방법은 효과량의 메트포르민 또는 이의 염을 투여함을 포함한다.
용어 "생물활성제"는 본 발명의 화합물이 사용되도록 의도된 치료, 저해 및/또는 방지/예방에 영향을 주는데 도움을 주는 생물학적 활성을 갖는 제제로서 본 발명의 화합물과 병용하여 사용되는, 본 개시내용에 따른 화합물 이외의 제제를 설명하기 위해 사용된다. 본원에 사용하기 위한 바람직한 생물활성제는 본 발명의 화합물이 사용되거나 투여되는 경우와 유사한 약리학적 활성을 갖는 제제를 포함한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은, 적용가능한 경우, 화합물의 용해 및 생물이용성을 촉진시키기 위하여 환자의 위장관의 위액에서 화합물의 용해도를 증가시키기 위해 제공되는 본원에 기재된 하나 이상의 화합물의 염 형태를 설명하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 사용된다. 약학적으로 허용가능한 염은, 적용가능한 경우, 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 염기 및 산으로부터 유래된 염을 포함한다. 적합한 염은 약학 분야에 잘 공지된 다수의 산 및 염기중에서도 알칼리 금속, 예컨대 칼륨 및 나트륨, 알칼리 토금속, 예컨대 칼슘, 마그네슘 및 암모늄 염으로부터 유래된 염을 포함한다. 나트륨 및 칼륨 염은 본 개시내용에 따른 인산염의 중화 염으로서 특별히 바람직하다.
용어 "약학적으로 허용가능한 유도체"는 환자에게 투여될 경우 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물의 활성 대사산물을 직접적으로 또는 간접적으로 제공하는, 임의의 약학적으로 허용가능한 전구약물 형태(예컨대 에스테르, 아미드, 기타 전구약물 그룹)를 설명하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 사용된다.
키트
추가적인 양태에서, 상세한 설명은 의료 전문인에 의해 사용될 경우 적절한 양의 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 환자 또는 세포에 투여함을 단순화할 수 있는 키트를 제공한다.
본 발명의 전형적인 키트는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물의 하나 이상의 단위 투여형, 및 피험체 또는 세포로의 투여를 위한 지시서를 포함한다. 본 발명의 전형적인 키트는 또한, 또는 다르게는, 대량의 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 함유할 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 투여하기 위해 사용되는 장치, 및 피험체 또는 세포로의 투여를 위한 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 장치의 예로는 정맥내 캐뉼라삽입 장치, 주사기, 드립백(drip bag), 패치, 국부 겔, 펌프, 광분해로부터 보호를 제공하는 용기, 자가주사기, 점안기, 및 흡입기를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
하나의 특별한 실시태양에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 포함하는 용액, 점안기 및 피험체의 눈에 직접적으로 용액을 투여하는데 대한 지시서를 포함한다. 이러한 특정 실시태양에서, 용액은 추가적인 점안기 없이 직접적으로 소적을 분배할 수 있는 점적기 팁을 포함하는 용기내에 제공된다.
본 발명의 키트는 하나 이상의 본 발명의 화합물을 활성 구성성분으로서 투여하기 위해 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 활성 구성성분이 비경구 투여를 위해 재구성되어야 하는 고체 형태로 제공된다면, 키트는 활성 구성성분이 비경구 투여에 적합한 미립자-부재 멸균 용액을 형성하도록 용해될 수 있는 적합한 비히클의 밀봉된 용기를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 비히클의 예로는: 주사용수 USP; 수성 비히클, 예컨대, 제한되지 않지만, 염화 나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화 나트륨 주사, 및 락트산화된 링거 주사; 수혼화성 비히클, 예컨대, 제한되지 않지만, 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜; 및 비-수성 비히클, 예컨대, 제한되지 않지만, 옥수수유, 목화씨유, 땅콩유, 참깨유, 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조산염이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1 - 보체 자격의 인간 혈청(CC-HS)은 AMD-유사 세포의 내적표현형을 성숙한 iPSC-RPE에서 유도한다
5명의 상이한 건강한 개별체로부터 유래된 iPSC를 본 분석에 사용하였다. 이전에 공개된 프로토콜을 사용하여 iPSC를 성숙한 RPE 세포로 분화시켰다[메이-시메라(May-Simera) 등의 2018년 문헌, 샤르마(Sharma) 등의 2019년 문헌]. iRPE 세포의 성숙도를 세포막 상의 β-카테닌(catenin)의 존재[메이-시메라(May-Simera) 등의 2018년 문헌, 도 1A] 및 배양 3주 후에 시작된 단일층의 경상피 저항(TER)의 점진적 증가에 의해 확인하였다(p<2x10-16, 3주에서 4 내지 6주; 도 9A). 1차 RPE 세포에 대한 공개된 기록과 일치하게[존슨(Johnson) 등의 2011년 문헌; 필그림(Pilgrim) 등의 2017년 문헌], CI-HS 처리된 세포와 비교하여 CC-HS 처리된 iRPE에서 APOE 양성 iRPE-아래 침적물의 5-배 증가가 관찰되었다(p<0.0001; 도 1B-D). AMD 눈에서 보여진 드루젠(drusen) 침적물과 유사하게[물린스(Mullins) 등의 문헌 "2000 FASEB J"], APOE 양성 침적물은 항-막 공격 복합체(MAC: membrane attack complex) 항체와 함께 공-염색되었다(도 9B). CC-HS 처리된 iRPE는 또한 더 높은 수준의 드루젠 표지자 피불린3을 나타내었고[마르모스타인((Marmostein) 등의 2002년 문헌; 도 9C, D], 중성 지질 침적물에 대한 RPE-아래 염색이 증가하였고(나일 레드), 트리글리세라이드 및 에스테르화된 콜레스테롤 침적물에 대한 세포내 염색이 증가하였다(오일 레드 O)[필그림(Pilgrim) 등의 2017년 문헌; 도 1E, F 및 9E, F). 세포내 지질 침적물의 존재를 CC-HS 처리된 iRPE 세포의 투과 전자 현미경법(TEM)에 의해 추가로 확인하였다(도 1H에서의 황색 화살표). TEM 및 주사 전자 현미경법(SEM: scanning electron microscopy)은 또한 CC-HS 처리된 샘플에서 전형적인 돔-형상의 외관을 갖는 하단-박층형 침적물의 존재를 입증하였다(적색 화살표: 도 1G, H 및 9G, H). 이들 발견은, CC-HS 처리가 iRPE 세포에서 AMD의 몇몇 특징적 질환 표현형을 유도한다는 청구내용을 함께 지지한다. 이와 같이, AMD 발병에 연루된 RPE 세포-자율적 경로를 연구하고 초기 질환 단계에서 개입할 수 있는 약물을 발견하기 위한 시험관내 모델을 제공한다.
CC-HS 처리된 세포의 TEM은 또한 인접한 RPE 세포 사이의 붕괴된 연접 복합체를 보여주었다(도 1I, J에서의 화살표). CC-HS 처리된 샘플에서 인접한 RPE 세포 사이의 밀착 연접의 보전성을 연구하기 위해, 샘플을 밀착 연접 및 액틴 세포골격 표지자에 대해 염색하였다. 중요한 RPE 밀착 연접 단백질인 CLDN16[왕(Wang) 등의 2010년 문헌]은 CC-HS 처리된 샘플에서 종종 세포 경계로부터 사라졌고 세포내로 편재화되었다(도 1K, L에서 화살표). F-액틴 염색은 이들의 특징적인 육각형 형태를 보유하는데 실패한 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 세포내 스트레스 섬유를 나타내었다(도 1M, N에서의 화살표). 비멘틴 면역염색은, 비멘틴이 세포막으로부터 소실되고 확대되고 신장된 세포의 세포질에서 어떠한 구조물도 없이 나타남으로써 CC-HS 처리된 iRPE 세포의 역분화를 추가로 확인하였다[타미야(Tamiya) 등의 2010년 문헌; 도 9I, J). 상피의 표현형의 손실은 광 간섭 단층촬영을 사용하여 환자의 눈에서 보고되었다[쿠르시오(Curcio) 등의 2017년 문헌]. 이러한 이전에 보고된 RPE 상피 표현형의 손실이 CC-HS iRPE 모델에서 보여지는 역분화 표현형과 일치하는지를 검토하기 위해, 해부용 시체 AMD 눈으로부터의 RPE-플랫마운트를 비멘틴 및 F-액틴에 대해 면역염색하였다(도 9K, L). 전형적인 육각형 형태의 손실을 보여주는 F-액틴 염색 및 적절한 구조를 갖지 않으면서 세포질에 존재하는 증가된 비멘틴 면역염색에 의해, GA 병변의 경계에서의 RPE 세포의 역분화를 확인하였고(도 9K, L), 시험관내 관찰을 확인한다. CC-HS 처리된 iRPE 세포의 역분화는 CI-HS 처리된 iRPE와 비교하여 TER에서 3-배 감소(p<10-5)를 일으켰다(도 1O). 이는 또한 광수용기 외절(POS: photoreceptor outer segment)에 대한 식세포작용 능력이 6-배 감소(p<10-5)하는 것으로 확인되는 바와 같이, CC-HS 처리된 세포의 기능적 성숙도의 손실을 일으켰다(도 1P). 추가적으로, CC-HS 처리된 세포는, 감소된 정상-상태 경상피 전위(TEP: Trans epithelial potential)(4 mV v/s 0.25 mV, p<10-4), 5 mM에서 1 mM로 상단 K+ 농도를 감소시키는 생리학적 자극에 대한 더 낮은 과분극 반응(2 mV v/s 0.5 mV, p<0.0001), 및 상단 ATP 자극에 대한 무시할만한 탈분극 반응(p<0.03; 도 1Q, R; 9M)에 의해 입증되는 바와 같이, CI-HS 처리된 세포와 비교하여 그들의 분극화된 상태를 손실하였다. 전체적인 결과는 CC-HS 처리가 AMD RPE에서 보여지는 몇몇 전형적인 특징; 가장 주목할만하게는, APOE의 형성 및 지질을 함유한 세포 아래 침적물을 유도함을 보여주었다. 이러한 작업은, CC-HS 처리 및 RPE-아래 침적물이 기능적 성숙 및 상단-하단 극성의 손실에 의한 상피의 표현형의 변성과 연관되어, 진행된 질환 단계를 유도하는 것으로 생각되는 표현형인 세포의 역분화를 유도한다는 이전의 지식을 확장시킨다.
실시예 2 - CC-HS 촉발된 AMD 질환 표현형은 C3aR1 및 C5aR1 신호생성을 통해 유도된다.
iRPE 세포에서 CC-HS 촉발된 AMD 세포의 표현형은 C3a-C3aR1 및 C5a-C5aR1 신호생성 유도된 세포내 염증을 통해 보체 경로의 아나필라톡신 아암(arm)에 의해 생성된다는 가설이 세워졌다[페르난데즈-고디노(Femandez-Godino) 및 피어스(Pierce)의 2018년 문헌]. RNAseq는 C3aR1과 비교하여 C5aR1에서 ∼30배 더 높은 발현을 나타내는 iRPE 세포에서의 양쪽 수용기의 발현을 확인하였다(도 10A). 더욱이, 양쪽 수용기의 발현은 CC-HS 처리에 의해 증가한다. 웨스턴 블롯에 의해 iRPE 세포의 막 분별물에서 C3aR1 및 C5aR1 수용기 편재화를 확인하였다(도 2A). 하단 막 표지자 콜라겐 IV가 아닌 상단 막 표지자 에즈린과의 이들의 공-편재화는 2개의 보체 단백질에 대한 수용기, C3a 및 C5a가 주로 상단에 위치됨을 시사한다(도 2B, C, 10B). CC-HS가 iRPE 세포에서 C3aR 및 C5aR 신호생성을 활성화시킴을 증명하기 위해, 샘플을 C3aR1 및 C5aR1 수용기의 다운스트림에 있는 2개의 핵심 키나아제, AKT 및 ERK1/2의 인산화에 대해 검토하였다[하지쉔갈리스(Hajishengallis) 및 람브리스(Lambris)의 2010의 문헌; 주(Zhu) 등의 문헌 "2015 Mol Vis"; 부쉬(Busch) 등의 문헌 "2017 Front. In Immu."]. 3가지 공여자 iRPE 샘플에 대한 CC-HS 처리된 샘플의 웨스턴 블롯은 CI-HS 처리된 세포와 비교하여 CC-HS 처리된 세포에서 2 내지 4배 증가된 수준의 pAKT(p<0.01) 및 pERK1/2(p<0.01)를 보여주었다(도 2D-G). 더욱이, C3aR1 및 C5aR1의 우세적인 상단 편재화와 일치하게, CC-HS의 상단만의 처리는 CC-HS의 조합된 상단/하단 처리와 유사하게 4.5 내지 5배 TER 감소(p<10-16)를 초래하였다. 대조적으로, CC-HS의 하단만의 처리는 단지 2배 TER 감소(p<10-16)를 초래하였다(도 2H). iRPE 세포에서 AMD 세포의 표현형을 유도함에 있어서 C5aR1 및 C3aR1 신호생성의 역할을 추가로 분석하기 위해, 고갈된 혈청 및 수용기 차단제 전략을 이용하였다. C3(p<0.01) 또는 C5(p<0.01) 단백질에서 혈청이 고갈된 iRPE 세포의 처리, 또는 CC-HS 혈청에서의 C3aR1[콤프스타틴(compstatin), 10 μM] 및 C5aR1(PMX053, 10 μM)의 차단제의 동시적인 사용(p<0.01)은 CC-HS + 비히클 처리와 비교하여 2배 더 낮은 RPE-아래 APOE 침적물을 생성하였다(도 21, 10C-G). C3a 및 C5a 형성의 업스트림 조절자인 보체 인자 D의 고갈은 또한 CC-HS 완전 배지와 비교하여 RPE-아래 APOE 침적물을 저하시켰다[샤르마(Sharma) 및 와드(Ward)의 2011년 문헌; 도 S2C, D]. 유사하게, CC-HS 처리된 샘플과 비교하여, 5배 더 높은 iRPE 단일층 TER은 C3(p<10-16) 또는 C5(p<10-16)에서 고갈된 혈청에 의해 또는 C3aR1 및 C5aR1 수용기에 대한 차단제의 사용에 의해(콤프스타틴, 10 mM 및 PMX053, 각각 10 μM; p<10-16) 처리된 샘플에서 발견되었다(도 2J). 더욱이, C3 및 C5 단백질에서 고갈된 혈청으로 처리된 샘플에서 iRPE 단일층의 전기생리학적 특성의 변화는 관찰되지 않았다(도 1Q, R을 도 10H, I와 비교함). 요약하면, 데이터로부터 RPE 세포의 상단 표면을 통해 우세하게 발생하는 C3aR1 또는 C5aR1 보체 수용기의 자극이 iRPE 세포에서 AMD 질환 표현형을 촉발시키기 위해 필요함을 알 수 있다.
실시예 3 - C3aR1 및 C5aR1 유도된 RPE-아래 침적물은 NF-κB의 과활성화 및 자가포식 경로의 하향조절에 의해 중재된다.
CI-HS 및 CC-HS 처리된 iRPE 세포에 대한 RNAseq 분석은 CC-HS 처리에 의해 유도된 극적으로 상이한 전반적 유전자 발현 패턴을 나타내었다(도 11A). 면역 세포에서의 아나필라톡신 보체(C3a, C5a)의 영향과 일치하게, 자가포식(p<10-6) 및 TNF/NF-κB(p<10-5) 경로는 iRPE 세포의 CC-HS 처리에 의해 가장 변화되었다[프릴레이(Freeley) 등의 2016년 문헌; 쿠마(Kumar)의 문헌 "2019 Int Rev of Immu"; 응우옌(Nguyen) 등의 2018년 문헌; 도 11B, C, D]. 이로부터 iRPE 세포에서의 C3aR1 및 C5aR1 신호생성이 이들 두 경로를 통해 작동한다는 가설이 세워졌다. CC-HS 처리는 실제로 NF-κB의 p65(RELA) 소단위가 핵으로 전좌되도록 하고, 이는 그의 활성화를 시사한다[레이엣(Rayet) 및 겔리나스(Gelinas)의 문헌 "1999, Oncogene"; 도 3A, B]. p65의 핵 전좌는, RNAseq(도 11B, p<10-5), 선택된 표적 유전자의 qRT-PCR-기반 타당성 확인(예를 들어 IL-6, IL-8, GADD45B, EGR2, NFκB1A, REL1, NFκB1, SNAP25; 도 3C, p<10-1 내지 p<10-6), 및 두가지 NF-κB 표적 유전자 RELB 및 TRAF3에 대한 면역염색에 의해 확인되는 바와 같이(도 11B-D), NF-κB 표적 유전자의 발현을 4 내지 6배 증가시켰다[틸보그스(Tilborghs) 등의 2017년 문헌]. 더욱이, CC-HS 처리는 Nκ-KB 경로의 염증성 사이토킨, IL-8(도 3D, 상단 p<0.01, 하단 p<10-5) 및 IL-18(도 11E, 상단 p<0.005, 하단 p<0.005)의 분비를 두배로 만들었다. C3 또는 C5 단백질이 고갈된 혈청으로 처리된 iRPE 세포에서 p65의 핵 전좌의 결핍은 iRPE 세포에서 NF-κB 경로의 직접적인 활성화에서의 아나필라톡신 보체의 역할을 추가로 확인하였다(도 3E-G). NF-κB 활성화가 RPE-아래 APOE 침적물의 형성을 직접 유도하는지의 여부를 결정하기 위해, 유전자 NEMO에서 E391X 돌연변이를 갖는 환자로부터 유래된 iRPE 세포를 NF-κB 신호생성의 음성 조절자로서 사용하였다[질버만-루덴코(Zilberman-Rudenko) 등의 2016년 문헌]. 문헌과 일치하게, p65의 핵 전좌는 돌연변이체 iRPE 세포에서 CI-HS 처리 조건하에서 조차도 발견되었다(도 3H). 더욱이, 5 내지 6배 더 높은(p<0.001) RPE-아래 APOE 침적물은 돌연변이체 iRPE 세포에서 CI-HS 처리 조건하에 발견되었다(도 3I, J). 전체적으로, 이들 결과는 iRPE 세포에서 아나필라톡신 보체 촉발된 AMD 질환 표현형이 NF-κB 경로의 활성화를 통해 쉽게 중재됨을 입증한다.
RNAseq 분석은 또한 CC-HS 처리된 세포에서 자가포식 경로에서의 통계적으로 유의적인 결함을 나타내었고(p<10-6)(도 11C), 이는 RPE에서 AMD 및 자가포식 조절장애 사이의 문헌에 나타난 관련성에 의해 지지된다[신하(Sinha) 등의 2016년 문헌; 골레스타네(Golestaneh) 등의 2017년 문헌]. 이는 iRPE 세포에서 CC-HS 유도된 AMD 세포의 내적표현형에서의 자가포식 역할을 연구하도록 촉구한다. 면역염색 및 웨스턴 블롯 분석 결과, 자가포식 조절에 필수적인 유전자, ATG5, ATG7, 및 LC3-II가 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 CI-HS 처리된 iRPE 세포와 비교하여 3 내지 4배 하향조절되었음을 알 수 있었다(도 4A-I; 12A, B). 이들 결과는 qRT-PCR에 의해 추가로 확증되었는데, 이는 중요한 자가포식 경로 유전자(예를 들어 ATG3, ATG12, ATG4B, ATG4D, BCL2, LAMP1, SQSTM1, MAP1LC3A, MAP1LC3B)의 발현이 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 CI-HS iRPE 세포와 비교하여 4 내지 16배 하향조절됨을 보여주었다(p<0.01-10-3)(도 12F). CC-HS 처리된 세포에서의 핵심 자가포식 유전자의 감소된 발현은 감소된 자가포식 변화를 시사하고, 이는 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 자가소화포(autophagosome)의 증가된 축적에 의해 확인되었다(화살표, 도 12E).
C3aR1 및 C5aR1의 우세한 상단 편재화와 일치하게, iRPE의 상단측 상에서의 CC-HS의 처리가 세포에서 자가포식을 위한 주요 표지자인 LC3-II의 하향조절을 촉발시키기에 충분함을 입증하였다(도 4J, 12C; 양쪽 측 CC-HS 및 상단만의 CC-HS 처리 사이에서 p=ns). 더욱이, CC-HS 처리된 세포와 달리, C3 또는 C5 단백질이 고갈된 CC-HS 혈청에 의해 처리된 iRPE 세포는 자가포식 하향조절을 유도할 수 있었고 CI-HS 혈청과 유사하게 행동하였다(도 4K, 12D, p<0.05 CI-HS 대 CC-HS; p=ns CI-HS 대 C5 고갈 또는 C3 고갈 CC-HS). 유사하게, C3aR1 및 C5aR1 차단제와 커플링된 CC-HS에 의해 처리된 iRPE 세포는 CI-HS 처리된 샘플과 유사하게 행동하였고, LC3 수준에서 통계적으로 유의적인 감소를 나타내지 않았다(p=ns CI-HS 대 C3aR + C5aR 차단제 + CC-HS; 도 4K, 12D). 전체적으로, 이들 결과로부터 아나필라톡신 보체 신호생성 C3aR1 및 C5aR1이 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 자가포식을 저해함을 확인한다.
RPE-아래 드루젠 침적물의 형성을 유도하는 사건의 순서를 추가로 이해하기 위해, iRPE 세포 상으로의 CC-HS의 첨가 이후 NF-κB 활성화 및 자가포식 하향조절에 대한 시간 경과에 따른 분석을 수행하였다. CC-HS를 첨가한지 6시간 이내에, p65의 핵 전좌는 24시간에 걸쳐 단지 몇몇 세포에서 입증되었고, 이러한 전좌는 대부분의 세포에서 관찰되었다(도 12g-k). 유사하게, LC3-II 하향조절은 CC-HS로 처리한지 6시간 이내에 즉시 관찰될 수 있었고 24시간까지 최대 수준에 도달하였다(도 12l-q). 대조적으로, APOE 침적물에서의 소거 증가는 48시간의 시점에서만 관찰되었고(도 12r-u), 이는 NF-κB 상향조절 및 자가포식 하향조절이 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서의 APOE 침적물의 형성에 선행하였음을 시사한다.
이전에, NF-κB 신호생성 및 자가포식은 STAT3 활성과 관련되어왔다[존체어(Jonchere) 등의 2015년 문헌]. 감소된 STAT3 전사 활성은 자가포식 하향조절을 초래하는 것으로 생각된다[존체어(Jonchere) 등의 2015년 문헌]. STAT3 활성이 CC-HS 처리된 샘플에서 변경되었는지의 여부를 검토하기 위해, CC-HS 및 CI-HS 처리된 샘플에서의 STAT3 인산화를 비교하였다. 티로신 잔기 705에서의 STAT3의 인산화는 5 내지 6배 하향조절되었고(p<0.001), 이는 STAT3의 감소된 전사 활성을 시사한다. iRPE 세포에서의 감소된 STAT3 활성이 RPE-아래 APOE 침적물 형성을 직접적으로 유도하는지의 여부를 확인하기 위해, 죠브 증후군(Job's syndrome)을 갖는 환자로부터의 RPE 세포를 생성하였다. DNA 결합 돌연변이로 인하여, STAT3은 이들 세포에서 전사적으로 불활성이다. 이전의 데이터와 일치하게, 대조 세포와 비교하여 10 내지 12배 더 높은 APOE 양성 RPE-아래 침적물이 STAT3 돌연변이체 세포에서 CI-HS 처리 조건하에서 조차도 관찰된다. 이는 NF-κB 과활성화의 STAT3 하향조절 다운스트림이 또한 APOE 침적물 형성에 기여함을 시사한다.
실시예 4 - iRPE 세포보호 약물을 발견하기 위한 고 처리량 선별
RNAseq는, 세포에서 작용하는 TNF/NF-κB, 자가포식, 탄수화물 대사작용, 단백질 분해, 이온 항상성 및 상피의 표현형을 비롯하여 다수의 경로에 의해 iRPE의 CC-HS 처리에서 촉발된 고도의 복합 반응을 보여주었다(도 11B). 상피의 표현형의 손실/RPE 역분화가 핵심 AMD 세포의 표현형이고, 고 처리량 선별을 위한 설정에 더욱 용이하다는 가설이 세워졌다. 세포에서 RPE 역분화를 저해하고 상피의 표현형을 회복하는 약물은 추가적인 AMD 세포의 내적표현형을 구제하는 작용을 할 수 있을 것이다. 약물 선별을 다음과 같은 세가지 이유로 CC-HS 혈청 대신에 칼슘-이온운반체 A23187을 사용하여 고안하였다: 1) 아마도 활성 보체 단백질이 액체 취급관의 벽 상에 흡착되므로, CC-HS는 배지 교환을 위해 사용되는 액체 취급관에서 활성을 손실하였다; 2) A23187과 유사하게, iRPE의 CC-HS 처리는 또한 세포내 칼슘 항상성에서 결함을 유발하였다. 비록 CI-HS 및 CC-HS 처리된 세포에서의 기선 칼슘 수준이 유사할지라도(100 내지 120 nM; 도 5A-C), 세포내 칼슘 저장의 활성화를 유도하여 세포내 칼슘을 증가시키는 ATP 자극은 200 nM의 증가를 보여주는 CI-HS 처리된 세포와 비교하여 CC-HS 처리된 세포에서 유의적으로 약화되었다(80 nM 증가)(도 5A-C, p<0.05); CC-HS 처리와 유사하게, A23187 처리는 iRPE 세포 사멸을 초래한다(도 5D, 13A).
96시간째, A23187의 모든 3개의 농도(2.5, 10, 25 μM)는 세포에 완전히 독성이지만, 48시간째 2.5 μM은 50%의 세포 사멸을 일으켰고, 10 μM은 70%의 세포사멸을 일으켰다(도 5D, S6A). A23187의 10 μM 농도를 약물 선별을 위해 선택하였는데, 이는 세포 사멸을 구제하기 위해 더 큰 여유를 제공하기 때문이다. 1280종의 약물을 갖는 상업적으로 입수가능한 약학적 활성 화합물의 라이브러리(LOPAC)를 2개의 상이한 농도, 9.2 μM 및 46 μM에서 선별을 위해 사용하였다. 스트레스 인자, 10 μM A23187와 함께 약물 치료를 384-웰 플레이트에서 성숙한 iRPE 세포에 가하였고, 셀티트글로(CellTitrGlo) 검정을 사용하여 ATP 방출에 의해 48시간 후 세포 사멸을 점수로 기록하였다. A23187가 함유된 모든 검정 플레이트에 대한 신호의 비교가능한 상대 평균 강도는 선별의 일관성 및 재현성을 확인하였다(도 13B). 정규화된 세포 사멸 신호는, 더 낮은 약물 농도(9.2 μM)를 갖는 플레이트 7 내지 10이 더 높은 약물 농도(46 μM)를 갖는 플레이트와 비교하여 세포 사멸이 감소되었음을 보여주었다(도 13C). 사실, 46 μM에서 대부분의 약물은 세포독성인 반면, 9.2 μM에서 45종의 약물은 A23187 처리된 세포에서 향상된(40% 이상) 세포 생존을 나타내었다(도 13G).
약물 데이터에 대한 더욱 면밀한 분석은 384-웰 래인(lane)의 일부에서 가능한 인공산물이 거짓 양성 신호에 기여할 수 있음을 보여주었다(도 13G에서 원으로 표시됨). 실제 신호로부터 거짓 양성 신호를 구별하기 위해, 2개의 상이한 iPSC 세포주로부터 유래된 iRPE를 사용하여 45종의 모든 약물에 대하여 후속 선별을 수행하였다. 후속 선별을 3개의 상이한 A23187 농도(2.5, 5, 10 μM)에서 및 10 nM 내지 1 mM 범위내의 7개의 상이한 농도의 약물로 수행하였다(도 13D-F). 단지 2가지 약물(L,745,870 및 아미노카프로산(ACA); 도 5E, F)이 2가지 iRPE 샘플에 대하여 재현가능한 세포보호 활성을 나타내었고, 이는 수개의 384-웰 래인에 대하여 거짓-양성 효과의 초기 관찰을 확인하였다(도 13G). 전체적으로, HTS 선별은 시험관내 AMD 모델에서 시험하기 위한 2가지 약물을 제공하였다.
실시예 5 - L456,780 및 아미노카프로산은 iRPE 세포에서 CC-HS 유도된 NF-κB 활성화 및 자가포식 저해를 역전시켰다.
7-점 용량 반응 곡선(도 5D-F)에 기초하여, 약물 둘 다에 대한 IC50 용량을 선택하여(L456,780의 경우 6 μM 및 아미노카프로산(ACA)의 경우 30 μM) iRPE 세포를 CC-HS와 함께 병용-처리하였다. p65에 대한 면역염색은, CC-HS 및 비히클(DMSO) 병용-처리된 샘플과 비교하여 CC-HS 및 L745,870 또는 CC-HS 및 아미노카프로산에 의해 병용-처리된 iRPE에서 감소된 핵 편재화를 보여주었다(도 6A-E). RNAseq는 CC-HS 및 L,745,870 또는 아미노카프로산에 의한 iRPE의 병용-처리가 CC-HS 처리에 의해 유도되는 유전자 발현 변화를 역전시켰고(도 13H, I) CC-HS 및 DMSO 병용-처리된 샘플과 비교하여 NF-κB 경로 유전자의 발현을 감소시켰음(16-배까지)(도 13I)을 확인해 주었다. 일관되게, CC-HS 처리된 iRPE에서 하향조절된 자가포식 유전자는, ATG5에 대한 면역염색에 의해 확인되는 바와 같이(도 6F-J), CC-HS 및 2가지 약물중 하나(도 6F-J; 13J)에 의해 병용-처리된 iRPE에서 상향조절되었다. 전체적으로, 이들 결과는 HTS에서 발견된 세포보호 약물 둘다가 NF-κB 경로를 억제하고 자가포식을 상향조절함으로써 iRPE 세포에 대한 CC-HS 처리의 영향을 역전시킬 수 있음을 입증하였다. 이는 RPE-상피의 표현형, 기능, 및 AMD 세포의 내적표현형에 대한 이들 약물의 효과를 추가로 시험하도록 촉구하였다.
실시예 6 - 시험관내 CC-HS 처리된 세포에서 및 생체내 래트 모델에서 iRPE 상피의 표현형의 복원
해부용 시체 눈에서 보여지고 시험관내 모델에서 관찰되는 AMD 세포의 표현형의 핵심적인 전형적 특징은 RPE-아래의 지질 및 단백질이 풍부한 침적물, 드루젠 표지자의 증가된 발현, 및 상피의 표현형 및 RPE 기능성의 손실이다. CC-HS 처리된 샘플과 비교할 경우, CC-HS 및 L745,870 또는 ACA에 의해 병용-처리된 iRPE는 나일 레드 염색에 의해 측정할 경우 RPE 지질 침적물의 40 내지 60% 더 낮은 수준(도 7A; CC-HS + 비히클 대 CC-HS + L,745,870, p<0.01; CC-HS + 비히클 대 CC-HS + ACA, p<0.01) 및 피불린 3의 4-배 더 낮은 발현(도 7B; CC-HS + 비히클 대 CC-HS + ACA, p<0.01)을 갖는다. 3000-13,000 RPE 세포의 정량화는, CC-HS + 비히클 처리와 비교하여 CC-HS 및 L745,870에 의해 병용-처리된 세포가 162.24 um2의 평균 면적(p<0.01) 및 8.25의 육각형성 스코어(여기서 10은 완전한 육각형을 나타냄, p<10-15)를 갖고, CC-HS 및 ACA에 의해 처리된 세포가 106.72 um2의 평균 면적(p<10-15) 및 8.52의 육각형성 스코어(p<10-15)를 가짐을 보여주었다(도 7C, D). 유사한 결과는 단지 CC-HS + 비히클에 의해 처리되거나 CC-HS 및 2가지 약물에 의해 병용-처리된 iRPE에 대한 RNAseq에 의해 수득되었다. 두 약물 모두 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 역분화 표지자의 발현을 억제(4 내지 10 배)할 수 있었다(도 13H).
이들 약물의 생체내 활성을 시험하기 위해, RPE 역분화의 래트 모델을 개발하였다. 마이크로펄스(micropulse) 레이저를 사용하여 래트 RPE의 0.5 mm 면적을 손상시켰다. 레이저조사된 영역중의 RPE 세포는 제거되어, 세포-세포 접촉의 손실에 기인하여 레이저 병변 주변의 세포가 역분화를 겪도록 한다. 이들 세포는, CC-HS 처리된 인간 세포와 유사하게, 비멘틴의 조직화되지 않은 더 높은 세포질 발현에 의해 확대되고 신장되었다. 레이저 손상 시점에 2가지 약물을 래트의 망막하 공간에 주입함으로써 래트 RPE 역분화에 대한 약물의 효과를 시험하였다. 레이저 병변 주변의 400-4000 RPE 세포의 정량화는, 레이저조사된 RPE와 비교하여, L745,870(p<10-15) 및 ACA(p<10-15) 주사된 세포에서 1 내지 1.3배 더 작은 영역을 보여주었다(ACA=397.53 um2, L745,870=439.55 um2, 레이저=537.43 um2)(도 7E). 약물 치료는 또한 육각형성 스코어를 레이저 병변 치료 주변 세포에서의 6.91에서 CC-HS + L745,870 치료에서의 7.42로 향상시켰다(p<10 -14)(도 7F). 이들 생체내 실험은 역분화 RPE 세포의 상피 표현형을 복원시키는 이들 2가지 약물의 능력을 확인하였다.
마지막으로, 약물이 성숙한 RPE 표현형 및 RPE 기능성을 구제할 수 있는지의 여부를 검토하였다. 약물 및 CC-HS에 의해 병용-처리된 샘플의 TER은 비히클 + CC-HS에 의해 처리된 샘플과 비교하여 2 내지 3배 더 높았고(p<10-15), CI-HS 처리된 세포의 TER 값과 유사하였다(도 7G). 유사하게, 약물 둘 다의 첨가는 CC-HS 및 비히클에 의해 처리된 세포와 비교하여 광수용기 외절에 대해 식세포작용을 하는 RPE 세포의 능력을 부분적으로 구제하였다(2배까지; p<10-15)(도 7H). 결론적으로, 이들 결과로부터 약물, L,745,870 및 아미노카프로산이 CC-HS 처리된 iRPE 세포에서 보여지는 AMD 세포의 내적표현형을 역전시키고 RPE 기능성 및 상피의 표현형을 복원하였음이 확인되었다(도 8). 시험관내 및 생체내 데이터는 AMD 질환 개시를 지연시키고 그의 진행을 둔화시키는 이들 약물의 잠재적인 용도를 지지하는 충분한 증거를 제공한다.
실시예 7 - L-ORD 및 AMD의 기작 및 효과적인 치료법으로서의 메트포르민의 용도
본 실험에서, 환자-특이적인 유도된 다분화능 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)를 후발성 망막의 변성에 걸린 가계의 구성원 및 이들의 영향받지 않는 형제자매로부터 생산하고, 이들을 RPE로 분화시켜 근본적인 질환 기작을 연구하였다. 기본 조건하에, 환자 및 대조 피험체는 유사한 자갈 모양 형태를 나타내고, RPE-특이적 시그니처 유전자의 유사한 발현 패턴을 공유하며, 또한 성숙한 RPE 표지자인 RPE-65에 대해 양성으로 염색되었다. 모델은, 환자-RPE가 질환의 다음의 2가지 핵심적 특징을 중재하는 변경된 세포 기능을 가짐을 보여줌으로써, 시험관내에서 인간 질환 표현형을 정확히 반복하는 것으로 입증되었다: 1) 드루젠의 입증된 성분인 APOE의 상승된 하단 침적 및 2) CNV의 형성의 원인이 되는 인자인 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)의 과도한 상단 분비. CTRP5에서의 돌연변이간의 관련성을 연구하고, 질환-원인 표현형을 관찰하였다. 문헌에 보고된 바와 대조적으로, CTRP5는 환자 및 영향받지 않는 형제자매 사이에서 필적할만한 수준으로 발현되고 분비된다. RPE 상에서의 그의 수용기는 아디포넥틴 수용기 1(AdipoR1)인 것으로 식별되었고, MFRP 또는 아디포넥틴 수용기 2가 아니었다. AMPK는 ADP:ATP 비를 모니터링하는 세포의 에너지 상태에 대한 센서이고, 인산화시 활성화된다. 환자 RPE는 혈청 기아하에 놓일 경우 에너지 상태의 변화에 비감수성인 것으로 나타났다. 추가적으로, AMPK 활성에서의 이러한 감소는 오메가-3 지질(DHA)에 풍부한 광수용기 외절(POS)의 이용을 감소시킨다. 이는 DHA-유래된 신경영양 인자, 예컨대 뉴로프로텍틴 D1(NPD1)의 감소된 분비에 의해 분명하다. 이러한 연구에서, 항-당뇨병 약물인 메트포르민은 세포의 스트레스에 대하여 AMPK를 재감작화시키고(에너지 항상성을 복원하고), POS 사용 효율을 복원하며, APOE 및 VEGF 둘 다의 분비를 재분극화함으로써 환자 RPE 세포를 구제하는 것으로 나타난다. 메트포르민이 효과적인 임상 치료법일 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 당뇨병을 위한 메트포르민에 의해 동시적으로 치료된 AMD 환자에 대해 후향성 코호트 연구를 수행하였고, 메트포르민이 임상적 결과를 통계적으로 향상시켰고 발병 연령을 2년 지연시켰음을 발견하였다. 합쳐서 고려해 보면, 이들 결과는 L-ORD 및 AMD의 기초가 되는 질환 기작을 밝혀내고 메트포르민의 안구 전달이 현재 치료 선택지가 없는 "건조한 AMD"를 갖는 환자를 위해 효과적인 치료법임을 입증한다.
L-ORD는 전형적으로 50 내지 60년간 제시된 희귀 유전성의 실명 질환이고, 안저에서의 황색 반점의 침적물 및 지연된 암순응(야맹증)을 특징으로 한다. 노인성 황반 변성(AMD)과는 다르게, 광수용기 변성은 말초(간상체)로부터 진행되고, 이후 중심 원추 시력이 손실되어 점진적으로 전체적 시력 손실을 초래한다. OCT는 망막하 침적물의 존재 뿐만 아니라 RPE 아래 침적을 지시하는 RPE 및 부르크막(Bruch's membrane) 사이의 분리 영역을 보여주었고, 이는 간상체 기능에서 관찰된 손실이 아래에 놓인 RPE의 기능부전 또는 사멸에 비해 부차적일 수 있음을 시사한다. AMD와 유사하게, 질환의 후반의 진전된 단계는 종종 맥락막 신생혈관 증식(CNV)으로의 진행을 특징으로 한다[아예(Aye) 등의 2010년 문헌; 보루아(Borooah) 등의 2009년 문헌; 쿠크라스(Cukras) 등의 2016년 문헌; 자콥슨(Jacobson) 등의 2014년 문헌; 쿤츠(Kuntz) 등의 1996년 문헌; 밀암(Milam) 등의 2000년 문헌].
후발성 망막의 변성(L-ORD)을 앓는 2명의 환자 및 2명의 영향받지 않는 형제자매로부터 취해진 피부 섬유아세포로부터 iPSC를 얻었다. 공여자당 2개의 클론을 생성하는 사이토튠(Cytotune) iPS 2.0 센다이(sendai) 재프로그램화 키트를 사용하여 섬유아세포 배양을 재프로그래밍하였다. 모든 iPSC 세포주는 전형적인 iPSC 형태를 공유하고, 다분화능 표지자: OCT4, NANOG, SOX2, 및 SSEA4를 발현하고, 핵형적으로(karyotypically) 정상이었다. 시험관내 배아유사세포 덩어리(EB: embryoid body) 검정은 모든 3가지 발육 배양 층(외배엽, 내배엽, 중배엽)으로부터 세포 유형으로 분화하는 능력을 입증하였다.
8개의 iPSC-RPE 세포주는 2개의 그룹으로서 고려되었다: 4개의 건강한 영향받지 않는 형제자매 iPSC-RPE, 및 4개의 L-ORD 환자 iPSC-RPE. 이러한 분류는 공여자(유전적) 및 클론 변동성 뿐만 아니라 분화 및 세포 배양 조건이 내재된 기술적 변동성을 설명한다. iPSC에 의한 후발성 신경퇴행성 질환의 모델링은 생물 시계를 재설정하는 재프로그래밍 과정에 기인하여 종종 어려운 것으로 입증되었으므로[베라(Vera) 및 스투더(Studer), 2015], 데이터를 분류하고 분석하기 위해 이러한 접근법을 사용하는 것은 다수의 환자 및 대조군 사이를 비교하여 질환 표현형에 직접적으로 기인할 수 있는 유일하게 연관된 통계적으로 유의적인 차이를 식별하는 체계를 제공하였다[슈스터(Schuster) 등의 2015년 문헌; 비테일(Vitale) 등의 2012년 문헌].
시험관내 모델은 임상적 질환 표현형을 복제한다.
iPSC를 서열분석하여 환자 세포주가 S163R 점 돌연변이를 보유함을 증명하였다(도 14a). 이전에 공개된 프로토콜을 사용하여 iPSC를 RPE 세포로 분화시키고[샤르마(Sharma) 등의 2019a 문헌] 트랜스웰 상으로 접종하였고, 여기서 이들은 성숙한 분극화된 RPE의 표지자(TYR, PAX6, MITF, RLBP1, DCT, CLDN19, GPNMB, ALDH1A3, BEST1, TYRP1, 및 RPE65)를 안정하게 발현하였다(도 14b). 투과 전자 현미경에 의해 풍부한 상단 과정(황색 화살표), 상단에 편재화된 멜라닌소체(자홍색 화살표), 및 하단에 편재화된 핵(백색 화살표)을 갖는 RPE 세포의 단일층이 제시되었다(도 14c). L-ORD 환자 및 영향받지 않는 형제자매를 비교하는 주사 전자 영상은 트랜스웰 상에서 성장하는 iPSC-RPE가 전형적인 육각형 또는 자갈 모양의 외관을 나타냄을 보여줄 뿐만 아니라, RPE 세포 크기 및 형상에서 위상학적 차이를 보여주었고, 이는 이러한 이질성이 L-ORD 환자 RPE의 특징임을 시사한다(도 14d). 세포 크기 분포에서의 차이가 존재하는지의 여부를 결정하기 위해, 세포 경계의 윤곽을 나타내도록 말초 막 단백질(ZO-1 또는 ADIPOR1)에 의해 염색된 iPSC-RPE 상에서 정량적 영상 분석을 수행하였다. 세포 영역은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 L-ORD 환자 RPE에서 유의적으로 더 크고 더욱 변동성인 것으로 밝혀졌다(도 14e). TER 측정은 정상적 RPE 밀착 연접의 형성을 확인하였고(도 14f) L-ORD 환자 특이적 iPSC-RPE 및 영향받지 않는 건강한 형제자매 사이에 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 형태학적 및 표현형적 변화는 종종 상피의 세포가 이들 세포의 극성 및 세포 접착을 손실하게 되는 과정인 RPE 역분화와 연관된다. 그러나, 정상적 배양(비-스트레스) 조건하에, L-ORD 환자 RPE에서 역분화와 관련된 유전자의 발현 패턴은 영향받지 않는 형제자매에서 관찰되는 패턴과 유사하다(도 14g). 동일한 조건하에, 세포를 용해시키고, 아래에 놓인 하단 아포지단백질 E(APOE) 침적물[이는 고밀도 지단백질 (HDL)과 연관된 것으로 제시되었고 지질 트래픽킹(trafficking)과 관련됨][이쉬다(Ishida) 등의 2004년 문헌]을 염색하고 분석한 결과, 영향받지 않는 형제자매에 대하여 L-ORD 환자에서 전체 양 및 분포에서 약간의 차이를 나타내었다(도 14h). 마지막으로, L-ORD 환자 RPE는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 분극화된 분비의 손실을 나타내었다(도 14i). 특별히, 하단 VEGF 분비는 영향받지 않는 형제자매(n=3)와 비교하여 L-ORD 환자 RPE(n=7)에서 대략 50%(p=0.046) 감소하였다. 합쳐서 고려해 보면, 이들 결과는 iPSC-RPE 모델이 CTRP5에서 질환-유발 돌연변이와 연관된 표현형적 변화를 보존하였음을 시사한다.
CTRP5는 RPE 대사작용의 자가분비 조절자이다.
L-ORD에서 S163R 점 돌연변이를 갖는 것으로 공지된 CTRP5 단백질은, 또한 구불구불한 막 관련된 단백질(MFRP)을 인코딩하는 비시스트론성 유전자에 의해 생산된다. 점 돌연변이가 L-ORD 환자에서 CTRP5 또는 MFRP의 mRNA 발현을 변경하였는지의 여부를 결정하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다. CTRP5 및 MFRP를 비교하는 델타 Ct 값은 상이한 공여자 및 클론에 대하여 유사하였고, 이는 발현시 환자-특이적 차이가 없음을 지시한다(도 15a). 흥미롭게도, CTRP5의 웨스턴 블롯은 L-ORD 환자 RPE의 세포 용해물에서 감소된 단백질 발현을 지시하였다(도 15b). 도 15c: L-ORD 환자 iPSC-RPE에서의 CTRP5 단백질 수준을 밀도계측에 의해 정량화하고 β-액틴으로 정규화하였고, 발현의 7-배 감소를 지시하였다. CTRP5 엘리사(Elisa) 및 WB는 CTRP5가 상단으로 분비됨을 지시한다(도 15d). 하단 챔버로부터의 측정된 CTRP5는 검출 한계 미만이었다(데이터는 제시되지 않음). CTRP5에서의 돌연변이가 L-ORD에서 질환 표현형을 야기하는 기작을 결정하기 위해, 초-해상 현미경을 사용함으로써 특정 리간드-수용기 상호작용을 식별하여 아디포넥틴에 대한 CTRP5의 상동성[야마우치(Yamauchi) 등의 2014년 문헌; 야마우치(Yamauchi) 및 가도와키(Kadowaki)의 2013년 문헌] 및 구불구불한 막 관련된 단백질(MFRP)과의 그의 보고된 상호작용[만달(Mandal) 등의 2006년 문헌; 수(Shu) 등의 2006년 문헌]에 기초하여 추정적인 후보 수용기를 선별하였다. 면역형광 공초점 현미경은 아디포넥틴 수용기 1(ADIPOR1, 녹색-수용기)와 CTRP5(적색-리간드)의 공동-표지화를 보여주었다(도 15e). 배양된 인간 iPSC-RPE의 고유의 면역금 표지화는 CTRP5(12 nm) 및 ADIPOR1(6 nm) 상호작용을 확인하였다(도 15f). 도 15g는 개연론적 상호작용을 결정하기 위해 3D-구조적 구속을 고려하여, 내재성 막 단백질, ADIPOR1(청색), 및 CTRP5와 그의 상호작용(청록색)의 모델을 나타낸다. 도 15g에 도시된 바와 같이, 아디포넥틴과 유사하게, CTRP5는 그의 기초적 구조 단위로서 삼량체를 형성할 뿐만 아니라, 부케(bouquet)-유사 배열을 닮은 보다 고차원의 구조물을 형성하는 경향이 있다[투(Tu) 및 팔크제위스키(Palczewski) 2012]. 이러한 모델을 사용하여 L-ORD에서 S163R 돌연변이를 자극하였다. 양성으로 하전된 아르기닌의 획득은, 유사하게 하전된 아르기닌을 ADIPOR1의 표면 상에서 쫓아냄으로써 - 수용기에 대한 그의 결합 친화도를 약화시킴으로써 - CTRP5의 ADIPOR1과의 정전기적 상호작용을 변경시킨다(도 15h).
CTRP5는 세포 에너지 상태에 대한 AMPK 감수성을 미세 조정한다.
아디포넥틴 및 그의 수용기는 AMP-활성화된 단백질 키나아제(AMPK) 의존성 기작에서 지질 대사작용을 조절하는 것으로 공지되어 있다. 이와 같이, CTRP5에서의 돌연변이가 AMPK 활성화 및 신호생성 경로를 변경하여 에너지 항상성을 조절하는지의 여부를 결정하기 위해 다음의 실험을 고안하였다.
혈청 함유 배지중의 기선에서, AMPK 활성의 척도인 포스포-AMPK(p-AMPK)의 수준은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서 20% 더 높았다(p<0.05)(도 16a).
이와 같이, 도 16b에서, iPSC-RPE를 재조합 CTRP5 구형 형태(0.2 ㎍/mL gCTRP5)와 함께 30분 동안 혈청의 존재(+) 및 혈청의 부재(-)하에 항온처리하여 AMPK 신호생성에서의 그의 역할을 평가하였다. 혈청 함유 배지에서 형제자매 및 환자로부터의 iPSC-RPE로의 gCTRP5의 첨가는 AMPK 활성을 변경시키지 않았다. 그러나, 혈청 결핍 배지에서 gCTRP5의 첨가는 영향받지 않는 형제자매 뿐만 아니라 L-ORD 환자에서 p-AMPK 수준을 20% 감소시켰다(p<0.05). 이들 데이터는 CTRP5가 AMPK 수준을 미세 조정하기 위한 대사작용의 스위치로서 작용하여 세포의 에너지 요구사항을 충족시킴을 입증한다.
ADIPOR1-CTRP5(수용기-리간드) 상호작용을 보다 잘 설명하기 위해, 재조합 전장 CTRP5의 농도를 증가시키면서 외생적으로 첨가함으로써 리간드 용량 반응 곡선을 작성하였다(혈청 부재 배지에서)(도 16c). 영향받지 않는 형제자매에서, CTRP5에서의 용량-의존성 증가는 p-AMPK 수준에서의 유의적인 감소를 초래한 반면(25 ㎍/mL에서 ∼50% 감소, p<0.05), L-ORD 환자에서, CTRP5의 첨가는 AMPK 활성에 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는 돌연변이체 CTRP5가 고유의 CTRP5와 연관되고 그의 정상적 생물 활성을 교란시키는 복합체(더욱 고차원의 구조)를 형성함을 시사한다.
AMPK는 세포 에너지 상태에 대한 민감한 지시자이고 AMP 또는 ATP의 수준에 의해 표준적으로 활성화된다[하디(Hardie) 및 린(Lin)의 2017년 문헌]. 따라서, AMPK 인산화를 자극하는 것으로 공지된 조건(증가된 AMP:ATP 비)하에서의 형제자매 및 환자 iPSC-RPE의 AMPK 활성(혈청 부재 배지에서)을 특징지웠다(도 16d). iPSC-RPE를 혈청 결핍 배지에서 5시간 동안 항온처리하고[박(Park) 등의 2009년 문헌], 이후 30분 동안 AICAR(AMP 유사체) 또는 BAM15(ATP 생산을 감소시키기 위한 미토콘드리아 짝풀림제)에 노출시켰다. 예상되는 바와 같이, 영향받지 않는 형제자매로부터 유래된 iPSC-RPE에서, AMP:ATP 비의 증가는 AMPK를 활성화시켰다. 흥미롭게도, 동일한 실험 조건하에서, L-ORD 환자 iPSC-RPE는 AMP 또는 ATP 수준에서의 변화를 감지하지 못했다. 이들 결과는 AMP 또는 ATP를 감지하지 못한 것이 L-ORD 환자에서 부조화한 AMPK 활성화에 기반한 핵심 기작이고 치료학적 개입을 위한 신규 표적일 수 있음을 시사한다.
아디포넥틴은 세라미다아제(ceramidase) 활성을 자극하여 세포 생존을 촉진시키는 것으로 공지되어 있다[카도와키(Kadowaki) 및 야마우치(Yamauchi)의 2011년 문헌]. 라카라주(Lakkaraju) 박사의 실험실에 의해 보고된 바와 같이, RPE의 상단 표면에서의 과량의 세라미드는 세포내 보체(C3a) 생성 및 RPE 대사작용의 mTOR 재프로그래밍화를 유도하는 병리학적 특징일 수 있다[카우어(Kaur) 등의 2018년 문헌]. 환자 세포에서의 증가된 AMPK 활성화와 일치하게, L-ORD 환자 iPSC-RPE에서의 세라미드에 대한 면역염색(정면 영상)은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 과도한 세라미드를 나타내지 않았고, 이는 상기 기재된 AMPK 결함이 L-ORD에서 질환 발병의 1차적 중재자일 수 있음을 암시한다.
AMPK는 L-ORD에서 관찰되는 질환 표현형에 기여할 수 있는 다수의 대사 경로의 중심 조절자이다. AMPK 관련된 유전자의 유전자 발현 프로파일은 PNPLA2(PEDF-R)가 L-ORD 환자의 iPSC-RPE에서 고도로 발현되었음을 보여주었다. 흥미롭게도, 상승된 수준의 p-AMPK는 골격근 세포에서 PEDF-R 상에 대한 발현을 증가시키는 것으로 보고되어 있다[우(Wu) 등의 2017년 문헌]. 면역조직화학 분석은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서 PEDF-R(적색)의 증가된 단백질 발현을 확인하였다(도 16f). 총괄적으로, 이들 결과는 PEDF-R의 AMPK-교란된 수준이 L-ORD 환자(인간) RPE에서의 노인성 병리학적 변화에 기여할 수 있음(촉발시킬 수 있음)을 시사한다.
L-ORD에서의 상승된 AMPK는 PEDF-R 중재된 망막의 신경보호를 파괴한다.
RPE가 어떻게 발병되는지를 연구하기 위해, L-ORD 환자 및 영향받지 않는 형제자매에 대한 비교 연구를 PEDF-R 중재된 신경영양적 신호생성 및 혈관신생 저해제로서의 그의 역할에 관하여 수행하였다. 도 17a는 CTRP5에서의 돌연변이가 노인성 RPE에서 정상적 항상성을 파괴하여 지질 섭취 및 활용에 불균형을 초래하게 하는 모델을 제시한다. L-ORD 환자 iPSC-RPE는 산화적-스트레스 유도된 아폽토시스(apoptosis)를 보상하기 위해 RPE 세포에 보고되는 현상인 상승된 식세포작용 능력을 나타낸다[무커르지(Mukherjee) 등의 2007년 문헌]. 증가된 지질 섭취는 증가된 포스포리파아제 A2 활성을 필요하게 만들어서 인지질을 분할시키고, 생물학적 활성 화합물을 위한 전구체 분자로서 작용하는 유리 지방산, 예컨대 DHA, 에이코사노이드, 및 뉴로프로텍틴 D1(NPD1)을 생산한다. 그러나, L-ORD 환자 iPSC-RPE에서, 기선에서 상승된 수준의 AMPK는 포스포리파아제-A2 효소 활성을 저해하여 이들 신경보호 인자의 생산을 방해한다. 도 17b에서, iPSC-RPE 공급된 phRodo 표지화된 외절에 대한 FACS 분석 결과, L-ORD 환자 iPSC-RPE는 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 1.5배 더 많은 POS에 대해 식세포작용을 하였다. 지질 섭취가 증가될지라도, L-ORD 환자 iPSC-RPE에서 기선에서의 포스포리파아제 a2 활성은 아마도 증가된 AMPK 활성에 기인하여 ∼40% 감소된다(p<0.05, 도 17c). iPSC-RPE에서, 포스포리파아제 A2의 효소 활성은 pAMPK 수준에 의존한다(도 17d). WT iPSC-RPE에서 혈청 기아에 의해 야기된 상승된 pAMPK 수준은 포스포리파아제 A2 활성을 ∼30% 감소시켜(p<0.05) L-ORD 환자에서 관찰되는 조건을 모방한다. RPE에서, PEDF는 우세적으로 상단에 분극화된 양상으로 분비된다[마미니쉬키스(Maminishkis) 등의 2006년 문헌; 소노다(Sonoda) 등의 2009년 문헌]. 그러나, PEDF 분비의 PEDF 비(Ap/Ba)는 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서 유의적으로 더 낮다(도 17e). 감소된 양의 상단 PEDF와 결부된 더 낮은 PEDF-R 효소 활성은 함께 유의적으로 더 낮은 미토콘드리아 기능(하단 호흡, 양자 누출, ATP 생산) 및 감소된 뉴로프로텍틴 D1(NPD1) 상단 분비를 초래한다(p<0.05). 총괄적으로 이들 결과는 L-ORD 환자에서 변경된 지질 대사작용이 광수용기의 감소된 PEDF-중재된 신경보호에 어떻게 기여하는 지를 입증한다.
메트포르민은 AMPK 및 병리학적 표현형을 재감작화한다.
축적된 증거는 AMD를 비롯한 질환의 주체에서 통상적인 발병 기작으로서 파괴된 지질 대사작용이 연루되었음을 보여준다[반(Ban) 등의 2018년 문헌; 수(Xu) 등의 2018년 문헌]. 이들 대사 결함은 RPE 세포의 장기간의 건강과 결부된다. RPE 세포에서 PEDF-R 결핍의 결과를 결정하기 위해, L-ORD iPSC-RPE 및 영향받지 않는 형제자매에게 7-일간 광수용기 외절(POS)을 공급하여 높은 지방-유도된 상피의 손상을 악화시킨다. 부수적으로, 항-당뇨병성 약물인 메트포르민의 지질-저하 효과[슈나이더(Schneider) 등의 1990년 문헌]가 RPE 역분화 및 극성의 손실을 역전시킬 수 있는지의 여부를 연구하였다. RPE 극성의 핵심적인 형태학적 지시자인 세포 크기를 ZO-1에 대한 염색(녹색)에 의해 평가하여 세포 경계를 식별하고(도 18a) REShAPE(클라우드-컴퓨팅 기반의 세포 계량형태 분석기)에서 자동화된 영상 분석 알고리즘을 이용하여 RPE 세포의 계량형태적 분석을 수행하였다.
환자 iPSC-RPE를 POS 공급 첫째날에 시작하여 매일 3 mM 메트포르민으로 치료하였다[팬(Fan) 등의 2015년 문헌; 김(Kim) 등의 2011년 문헌]. 환자 iPSC-RPE 공급된 POS는 공급되지 않는 세포와 비교할 경우에도 증가된 세포 크기 및 변동성을 나타내었다. 유사한 계량형태는 또한 강한 공간 불규칙성을 나타내는 인간 AMD 눈에서 보고되었다[라쉬드(Rashid) 등의 2016년 문헌]. 주목할만하게, 메트포르민 치료는 환자 iPSC-RPE의 POS 스트레스-유도된 확대를 크게 예방하였다(p<2e-6)(도 18b). 도 18c는 유사하게 POS-공급된 iPSC-RPE에서 극저밀도 지단백질(VLDL) 및 고밀도 지단백질(HDL)의 주요 구성원인 아포지단백질 E(APOE)의 분포가 영향받음을 보여준다.
영향받지 않는 형제자매에서, APOE는 RPE의 상단 및 하단 표면으로부터 분비되지만, 주로 상단에 존재하는 것으로 밝혀졌고(도 18c, 상부), 여기서 이는 지질 트래피킹에서 역할을 수행할 수 있고[이쉬다(Ishida) 등의 2004년 문헌], 대조적으로, L-ORD 환자 iPSC-RPE는 APOE의 증가된 수준을 나타내었다. 백색 화살표는 AMD에서 APOE-풍부한 드루젠 침적물을 연상시키는 APOE 침적물의 하단 증가를 지시한다[존슨(Johnson) 등의 2011년 문헌]. 메트포르민으로 치료된 환자 RPE는 APOE-함유 하단 침적물의 축적을 개선시킨다(황색 화살표). 영상 J를 사용하여 상단 및 하단 APOE-양성 염색 주변에 관심있는 직사각형 영역을 그려서 편재화된 평균 적분 강도를 정량화하였고, 데이터는 도 18d에 요약되어 있다.
도 18e에서, 메트포르민으로 예비치료된(1½ 주) L-ORD 환자 iPSC-RPE는 AICAR(AMP 유사체)에 대한 감수성을 복원시켰다. 이러한 결과는 메트포르민이 정상적 에너지 항상성을 복원시키고 임상적인 가치를 가질 수 있음을 시사한다.
7일 동안의 POS 공급은 또한 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서 85종의 EMT-관련된 유전자의 발현 프로파일을 변경시켰다(도 18g). 영향받지 않는 형제자매와 비교하여, L-ORD 환자 iPSC-RPE는 상피의-간엽 이행과 연관된 54종의 유전자를 >4-배(백색) 상향조절하였다(예를 들어 ESR1, WNT5a, PDGFRB, GNG11, TMEFF1, BMP7, 및 RAC1). 대조적으로, 메트포르민(자홍색)으로 치료된 L-ORD 환자 iPSC-RPE는 42종의 EMT 유전자를 <4-배 하향조절하였다(예를 들어 SPF, DSC2, COL3A1, VSP13A, CAMK2N, TGFB1, BMP1). 합쳐서 고려해 보면, 이들 데이터는 L-ORD 환자 iPSC-RPE가 1) 지질-스트레스 유도된 상피의 간엽 이행에 감수성이고, 2) 메트포르민이 AMPK를 재감작화하여 세포 크기, APOE 침적, VEGF 분비, 및 유전자 발현에서의 병리학적 변화를 개선시킬 수 있음을 지시한다.
추가적으로 노화를 동반하는 혈중산소감소 미세환경은 지질 대사작용을 유사하게 변경시키는 것으로 제시되었다[쿠리하라(Kurihara) 등의 2016년 문헌]. 혈중산소감소 스트레스(3% O2, 6시간)를 이용하여 이러한 교란이 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서 VEGF 분비를 어떻게 조절하는지를 결정하였다. 정상산소 조건과 유사하게, L-ORD 환자는 역분화(EMT)의 지시자인 상승된 수준의 상단 분비를 갖는 잘못분극화된 VEGF 분비를 나타내었다. 메트포르민에 의한 24시간 동안의 치료는 이러한 표현형을 구제하기에 불충분하였고(데이터는 제시되지 않음), 이는 메트포르민이 주로 유전자 발현을 변경시킴으로써 그의 영향을 행사함을 시사한다(도 18e). 이러한 가설을 뒷받침하여, 메트포르민에 의한 1½주 치료는 저산소증-유도된 상단 VEGF 분비(p=0.005)를 개선시키고 VEGF 극성을 복원하였다(도 18f).
메트포르민이 AMD의 치료에 유리할 수 있다는 임상적 증거가 있는지의 여부를 결정하기 위해, 카이저 퍼머넌트 메디칼(Kaiser Permanante Medical)에 소개된 AMD 환자에 대한 후향성 코호트 연구를 수행하여 개별체에 의한 메트포르민의 동시적인 사용이 진단에 영향을 주는지의 여부를 시험하였다. 일반적으로 조기 발병으로 고려되는 50 내지 59세 연령의 그룹에 속하는 개별체의 경우[쉬크(Schick) 등의 2015년 문헌], 이러한 연구에 따르면 메트포르민은 발병 연령을 만 2년 지연시켰다(p=0.001).
총괄적으로 이들 결과는 메트포르민 또는 AMPK가 감작화하는 약물이 RPE 표현형을 복원시킬 수 있고 건조 AMD에 대한 잠재적인 치료임을 시사한다.
실시예 8 - 후발성 망막의 변성을 갖는 환자로부터의 iPSC-RPE에 대한 분석은 건강한 RPE 표현형의 조절에서의 AMPK의 역할을 식별하고, AMD 및 다른 망막의 퇴행성 질환의 잠재적인 치료를 위한, 공지된 타입 2 당뇨병 약물인 메트포르민의 용도 변경을 유도한다.
후발성 망막의 변성(L-ORD)은 더욱 흔한 망막의 변성, 예컨대 노인성 황반 변성(AMD)과 동일한 임상적 표현형(드루젠-유사 침적물, 질환의 후기에 진행될 수 있는 맥락막 신생혈관 증식)의 대부분을 공유하는 희귀 유전성 단성(monogenic) 망막 이영양증이다.
근본적인 L-ORD는 CTRP5에서의 돌연변이이고, 이는 글루코스 및 지질 대사작용(변경된 대사작용은 많은 형태의 망막의 변성과 연관됨)의 중요한 조절자인 공지된 아디포카인(adipokine)인 아디포넥틴과 구조적으로 유사하다.
후발성 망막의 변성, 또는 L-ORD는 대체적으로 40세 이후에 AMD와 유사한 병리를 나타낸다. L-ORD 환자는 광수용기 및 시각 회로에서 문제를 나타내는 지연된 암순응을 갖는다. 더욱이, 이들은 드루젠 유사 침적물을 갖고, 이는 FAF 상에서 과형광 침적물로서 나타났다. 최종적으로, 이들은 OCT에서 보여지는 내부 및 외부 광수용기 분절을 파열시켰다.
L-ORD는 RPE에서 고도로 발현되는 아디포넥틴 동종 상동유전자인 CTRP5에서의 단일 미스센스 돌연변이에 의해 야기된다. CTRP5의 구형 도메인은 아디포넥틴에 40% 상동성이고, 이는 세포 대사작용에서의 가능한 역할을 지시한다.
세포의 대사작용에 대한 중요한 판독은 ATP/AMP의 비를 모니터링하는 중요한 에너지 센서인 AMPK이고, 영양 결핍 동안에 인산화된다(활성화된다). 본 발명자들은 환자가 과활성 pAMPK 수준(데이터는 제시되지 않음)을 갖기 때문에 세포가 ATP 및 AMP에서의 변화에 비감수성일 것이라는 가설을 세웠다. 혈청 기아의 조건하에(3시간), pAMPK 수준은 L-ORD 환자 및 영향받지 않는 형제자매 둘 다에서 기선과 비교하여 상승된다.
AMP 유사체인 AICAR의 첨가(30분)는 L-ORD 환자에서가 아닌 영향받지 않는 형제자매에서 AMPK의 인산화를 추가로 자극한다. ATP 생산을 저해하는 미토콘드리아 짝풀림제인 BAM15의 첨가(30분)는 또한 추가로 L-ORD 환자에서가 아닌 영향받지 않는 형제자매에서 AMPK의 인산화를 자극한다. 사실상, L-ORD 환자는 ATP 또는 AMP의 변화에 대해 혈청 기아 조건하에 비감수성이다. 3 mM 메트포르민으로 구성된 메트포르민 치료를 상단 및 하단 배지에 1½ 내지 2주 동안 가하였다. 메트포르민으로 치료된 L-ORD 환자는 혈청 기아 이후 AICAR에 대한 감수성을 다시 수득하였다.
L-ORD 환자에서 AMPK 신호생성 경로의 변화를 유전자 발현을 통해 추가로 평가하여, 연관된 많은 유전자에서의 보상적 하향조절을 밝혀내었다. 메트포르민(3 mM)에 의한 1½ 내지 2주 동안의 치료는 몇몇 유전자에서 추가의 감소를 초래하지만, 다른 유전자에서는 상향조절을 초래한다. 특별히, PNPLA2(PEDF-R)에서 유의적인 증가가 존재한다. RPE에서, PEDF-R은 지방산 대사작용에서 중요한 역할을 수행한다.
도 19에서, L-ORD 환자의 유전자 발현 프로파일은 기선에서 pAMPK의 활성화를 제한하는 보상적 시도를 시사하는 것으로 보여진다.
영향받지 않는 형제자매(N=8), N=2 공여자로부터
(24G로부터 2명, Z8로부터 2명, Y9로부터 2명, 9i로부터 2명)
LORD-환자(N=7), N=2 공여자로부터
(공여자 E1로부터 3명, 공여자 K8로부터 4명)
메트포르민 환자(N=4), N=2 공여자로부터
RPE에 의한 사이토킨의 분극화된 분비는 이들의 성숙하고 분화된 상태의 전형적인 특징이다. 상피 간엽 이행(EMT)을 촉진시키는 조건하에, RPE는 이들의 형태를 손실하고, 이들의 분비는 잘못분극화된다. RPE의 역분화는 망막의 변성, 예컨대 AMD에서 종종 제안되는 기작이다. 전형적으로 VEGF는 RPE에 의해 주로 하단으로 분비된다. L-ORD 환자에서, VEGF 분비의 극성은 ELISA에 의해 평가되는 바와 같이 손실된다. 대조적으로, 메트포르민(3 mM)에 의한 1½ 내지 2주 동안의 치료는 분극화된 VEGF 분비를 구제하고, 이는 메트포르민이 EMT 저해를 중재할 수 있음을 시사한다. 이는 도 19에 제시된다.
치료되지 않음:
영향받지 않는 형제자매
상단 N=7
하단 N=3
L-ORD 환자
상단 N=7
하단 N=3
도 20은 B-hB가 식세포작용에 의해 포섭된 광수용기 외절로부터 유래된 지방산(이의 팔미트산염은 주요 성분임)을 이용하는 RPE에 의해 생성되고, 지방산 산화로 지칭되는 과정을 통해 자가 지지되는 대사산물을 생성하여 망막을 위해 글루코스를 소비함을 입증한다. 본 발명자들은 증가하는 지방산 산화 및 케톤체 형성(B-hB)이 망막하 공간에서 지질 축적을 감소시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 메트포르민 치료는 L-ORD 환자 RPE에 의한 상단 B-hB 분비에서 유의적인 25% 증가를 초래하였다.
3 mM 메트포르민으로 구성된 메트포르민 치료는 1½ 내지 2주 동안 상단 및 하단 배지에 가해졌다.
각각의 막대 도표는 두 부류의 상이한 공여자(영향받지 않는 형제자매 또는 환자)로부터 수집된 N=12의 생물학적 반복을 나타낸다. *는 p 값<0.05을 지시한다.
실시예 9 - 메트포르민은 망막의 퇴행성 질환에 대한 발병 연령의 중간값을 지연시킨다.
약물 메트포르민[상표명: 포르타메트(Fortamet), 글루오파게(Gluophage), 글루메트자(Glumetza), 리오메트(Riomet)]은 타입 2 당뇨병(T2D)을 치료하기 위해 널리 사용된다. 메트포르민의 안전성 프로파일은 US 및 유럽 시장 둘다에서 사용된 수년간의 기간에 기반하여 널리 확립되었다. 메트포르민은 영국에서 1958년에 최초로 아론 래보레이토리즈(Aron laboratories)의 자회사 로나(Rona)에 의해 당뇨병 환자에서 혈중 글루코스를 저하시키는 그의 강력한 효과로 인해 시판되었고, AMP-활성화된 단백질 키나아제 AMPK 효소를 활성화시켜서 세포의 대사작용 및 혈중 글루코스 수준을 정상화시키는 것으로 이후 밝혀졌다.
메트포르민이 AMD의 치료에 유리할 수 있다는 임상적 증거가 존재하는지의 여부를 결정하기 위해, 카이저 퍼머넌트 메디칼에 소개된 AMD 환자에 대한 후향성 코호트 연구를 수행하여 개별체에 의한 메트포르민의 동시적인 사용이 진단에 영향을 주는지의 여부를 시험하였다. 일반적으로 조기 발병으로 고려되는 50 내지 59세 연령의 그룹에 속하는 개별체의 경우[쉬크(Schick) 등의 2015년 문헌], 이러한 연구에 따르면 메트포르민은 발병 연령을 만 2년 지연시켰다(p=0.001). 이러한 연구의 결과는 도 14 내지 18에 제시된다.
도 14a-14i는 환자-특이적 iPSC-RPE가 질환-유발 돌연변이를 보유함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. a) 생어 서열 분석은 L-ORD를 갖는 환자로부터 유래된 iPSC에서 S163R 돌연변이의 존재를 확인한다. 서열은 상부에 제시되고 돌연변이에 의해 영향받은 염기는 서열 크로마토그램 상에서 흑색 화살표에 의해 지시된다. 이형접합 점 돌연변이(AGC -> AGC, AGG)는 피이크내의 피이크로서 나타난다. DNA 생어 서열분석을 위한 프라이머는 "방법"에 기재된다. b) 지시된 RPE 시그니처 유전자의 델타Ct 값에 대한 상자 도표 다이어그램. 각각의 상자는 적어도 2부류의 상이한 영향받지 않는 형제자매 또는 L-ORD 환자 공여자로부터의 n=3의 iPSC-RPE로부터 측정된 델타Ct의 분포를 나타낸다. 상자의 하부 및 상부는 10 백분위 및 90 백분위를 정의한다. 상자 내부의 밴드는 중간값을 정의한다. (c) 연속적으로 7일 동안 광수용기 외절이 공급된 iPSC-RPE 단일층에 대한 투과 전자 현미경법 영상. 정상적 RPE 형태, 및 풍부한 상단 과정(황색 화살표), 멜라닌소체(자홍색 화살표), 및 하단에 위치된 핵(백색 화살표)을 포함하는 고도로 분극화된 구조를 보여주는 영향받지 않는 형제자매(위) 및 환자(아래)로부터 유래된 iPSC-RPE의 TEM. 스케일 바: 2 μm. (d) 보존된 육각형 형태 및 풍부한 상단 과정을 보여주는 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터 유래된 iPSC-RPE의 SEM 영상. (e) 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터 유래된 iPSC-RPE의 세포 면적에 대한 상자 도표. iPSC-RPE 단일층을 막 표지자(ADIPOR1)로 면역염색하여 세포 형태의 다중파라미터 분석을 위해 이들의 육각형 형태의 윤곽을 형성하였다. L-ORD 환자 iPSC-RPE는 영향받지 않는 형제자매(79.8+/-57.5 ㎛2)와 비교하여 평균적으로 더 큰 크기를 갖고(107.7 +/- 68.5 ㎛2) 더욱 변동성이 큰 경향이 있었다(p=0.000026). 유사한 공간적 불규칙성이 인간 AMD 공여자의 눈에서 보고되고 있다[래쉬드(Rashid, A.) 등의 문헌 "정상적 눈 및 질환을 앓는 눈에서의 RPE 세포 및 시이트 특성(RPE Cell and Sheet Properties in Normal and Diseased Eyes). Adv Exp MEd Biol 854, 757-763 (2016)]. (f) iPSC-RPE 세포 사이에서의 기능적 밀착 연접의 확립을 경상피 저항 측정에 의해 EVOM 상피 볼트옴미터(월드 프리시즌스 인스트루먼츠)를 사용하여 측정하였다. 질환 연관된 미스센스 돌연변이는 RPE 단일층의 경상피 저항을 변경시키지 않는다. (g) 역분화(상피의 간엽 이행)를 겪는 RPE 세포에서 강화된 유전자의 산포도는 정상적 조건하에 L-ORD 환자 세포가 질병에 걸리거나 또는 스트레스를 받는 RPE를 지시하는 비정상적인 표현형을 나타내지 않음을 보여준다. 공급받지 않은(회색으로 제시됨) 환자 iPSC-RPE에서의 역분화(EMT)-관련된 유전자의 발현은 공급받지 않은 영향받지 않는 형제자매의 발현 패턴과 닮았다. (h) 정상적인 배양 조건을 거친, 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터 유래된 iPSC-RPE는 APOE 하단 침적물의 유사한 수준을 보여준다. 스케일 바: 50 ㎛. (i) 정상 산소 조건하에서의 iPSC-RPE에 의한 VEGF의 상청액으로의 방출을 ELISA에 의해 측정하였다. RPE의 고도로 분극화된 구조는 VEGF를 비롯한 단백질의 벡터 수송 및 분비에 책임이 있다. 천연적으로, 영향받지 않는 형제자매로부터 유래된 iPSC-RPE(회색으로 제시됨)는 VEGF를 분극화된 방식으로, 우세적으로 하단에 분비하였다. L-ORD 환자 유래된 iPSC-RPE는 하단 VEGF 분비에서 대략 ∼53.3% 감소하여 극성 손실을 나타낸다(P=0.046).
도 15a 내지 15h는 L-ORD 환자-유래된 RPE에서 CTRP5의 발현 및 편재화를 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) L-ORD에서, S163R 돌연변이는 CTRP5(분비 단백질) 및 구불구불한 막 관련된 단백질(MFRP)을 코딩하는 비시스트론성(bicistronic) 전사물에서 발생된다. 돌연변이는 전사물의 mRNA 발현을 바꾸지 않는다. (b) 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자의 iPSC-RPE로부터의 세포 용해물에 대한 대표적인 웨스턴 블롯. CTRP5는 분비된 단백질이므로, 영향받지 않는 형제자매에서 강한 25 kDa 밴드(CTRP5)는 CTRP5가 전체 세포 추출물에서 더 큰 정도로 보유됨을 지시할 수 있다. (c) β-액틴으로 정규화된 웨스턴 블롯(세포 용해물)의 정량화(p<0.05). (d) 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터의 iPSC-RPE에서, CTRP5는 48시간 후 ELISA에 의해 측정될 경우 상단측에 선택적으로 분비되었다. 영향받지 않는 형제자매 및 환자에 의해 분비된 양 사이에 측정가능한 차이는 관찰되지 않았다. 무시가능한 양의 CTRP5가 하단 배지에서 검출되었다(데이터는 제시되지 않음). (e) 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터의 iPSC-RPE의 면역형광 염색의 에어리스칸(Airyscan) 공초점 현미경 영상. 막 수용기 ADIPOR1(녹색으로 제시됨)은 CTRP5(적색으로 제시됨), HOESCHT(청색으로 제시된 핵 염색)와 공-편재화된다. (f) 고유의 면역표지화된 ADIPOR1(6 nm 면역금) 및 CTRP5(12 nm 면역금)의 TEM 영상은 수용기-리간드 상호작용의 증거를 제공한다(흑색 화살표에 의해 지시됨). (g) 공개된 결정학상 구조를 사용하는 ADIPOR1(청색으로 제시됨) 및 CTRP5(녹색으로 제시됨) 사이의 단백질-단백질 상호작용에 대한 3-D 모델. h) 세린(극성)에서 아르기닌(+)으로의 돌연변이는 잔기의 전하를 양성이 되도록 변경시킨다. 이러한 양성 전하는 인접한 아르기닌 잔기가 접근하지 못하게 하고 돌연변이체 CTRP5의 ADIPOR1로의 결합 친화도를 감소시키는 입체배좌적 변화를 일으킬 것으로 예상된다.
도 16a 내지 16f는 ADIPOR1 상에서의 CTRP5의 감소된 길항작용이 L-ORD에서 변경된 AMPK 신호생성을 초래함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) ELISA에 의해 결정된 포스포-AMPK 수준은 영향받지 않는 형제자매(N=21; 100% ± 0.04)와 비교하여 5% 혈청 함유 배지에서 배양되는 L-ORD 환자 iPSC-RPE(N=15; 120.6% ± 0.075)에서 기선 활성에 있어서 대략 20.6% 증가를 지시한다. (b) 아디포넥틴 함유 혈청의 존재 및 부재하의 포스포-AMPK 수준에 미치는 재조합 구형 CTRP5의 영향. 데이터는 치료되지 않은 조건으로 정규화된다(0 ug/mL gCTRP5). 영향받지 않는 형제자매에서, 천연 리간드, 아디포넥틴의 부재하에서의(0% 혈청 조건하) 0.2 ㎍/mL의 재조합 구형 CTRP5의 첨가는 pAMPK 수준에서 20% 감소를 나타낸다(N=9; 0.81 ± 0.04). 이러한 유의적인 감소는 기선 조건하에 5% 혈청의 존재에 의해 사라진다(N=6; 0.99 ± 0.01). L-ORD 환자 iPSC-RPE에서, 0.2 ㎍/mL의 재조합 구형 CTRP5의 첨가는 p-AMPK 수준에 대하여 측정가능한 영향을 주지 않고(N=6; 1.12 ± 0.09), 심지어 혈청의 부재하에서도 그러하다(N=6; 0.98 ± 01). (c) 유래된 iPSC-RPE의 p-AMPK 수준에 미치는 재조합 전장 CTRP5의 용량-반응 효과. 영향받지 않는 형제자매(5시간 0% 혈청)에서, AMPK의 인산화 수준은 재조합 전장 CTRP5의 농도 증가에 따라 처리 후(30분) 감소된다. 25 ug/mL의 CTRP5는 p-AMPK 수준에 있어서 ∼50% 감소를 초래한다(N=6, 47.89% ± 0.13). 전장 CTRP5의 유사한 농도가 가해진 환자 RPE는 p-AMPK 수준에 있어서 측정가능한 변화를 이끌어내지 않았다. (d) 혈청의 부재하에 AMP:ATP 비를 상승시키는 조건은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 환자 유래된 iPSC-RPE에서 p-AMPK 수준을 변경시킨다. 모든 데이터는 0% 혈청 함유 조건으로 정규화된다. 2 mM AICAR(AMP 유사체), 또는 500 nM BAM15(ATP 생산을 감소시키는 미토콘드리아 짝풀림제)에 의한 30분간의 처리는 영향받지 않는 형제자매에서 AMPK 수준을 추가로 상승시킨다. 대조적으로 환자 RPE의 p-AMPK 수준은 AMP 또는 ATP 수준의 변화에 비감수성이다. 그러나, 3 mM 메트포르민에 의한 2-주간의 치료는 AMP:ATP 비의 변화에 대한 L-ORD 환자의 감수성을 회복시킨다. (e) L-ORD 환자 유래된 iPSC-RPE에서의 상승된 AMPK는 PEDF-R의 mRNA 발현을 유의적으로 상향조절한다(∼8-배). (f) 면역조직화학 분석은 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서 상단 막으로 편재화된 상승된 PEDF-R 단백질 발현을 확인하였다.
도 17a 내지 17f는 L-ORD 환자에서 변경된 지질 대사가 감소된 신경보호 신호생성에 기여함을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. (a) 지질-풍부한 외절의 식세포작용에 의한 섭취 및 포스포리파아제에 의한 이들의 자유 지방산(RPE는 케톤생성 및 신경보호 지질 중재자, 예컨대 NPD1의 합성을 위해 이를 이용함)으로의 소화를 도시하는 추정상의 모델. 인간 암 세포주에서, 상승된 p-AMPK 수준은 포스포리파아제 D 활성을 억제하는 것으로 제시되어 왔고[무크호파드야이(Mukhopadhyay, S.) 등의 문헌 "AMP-활성화된 단백질 키나아제 및 포스포리파아제의 상호간의 조절(Reciprocal regulation of AMP-activated protein kinase and phospholipase); D. J Biol Chem 290, 6986-6993, doi: 10.1074/jbc.M114.622571(2015)], 이러한 제안된 기작을 통해 L-ORD 환자에서의 증가된 지질 섭취는 DHA-유래된 뉴로프로텍틴 D1의 이용 및 합성을 감소시키고 소화되지 않은 지질은 축적된다. (b) ph-Rhodo 표지화된 외절의 섭취를 FACS에 의해 정량화하여, 영향받지 않는 형제자매 및 L-ORD 환자로부터 유래된 iPSC-RPE의 식세포작용 속도를 비교하였다. L-ORD 환자 iPSC-RPE(N=14; 11.81 ± 3.55)의 식세포작용에 의한 섭취는 영향받지 않는 형제자매(N=15; 7.86 ± 3.94)에 비해 33% 더 높았다. 이러한 증가된 지질 섭취 현상은 산화적 스트레스에 대한 보호 반응으로서 RPE에 대해 보고되었다[무크헤르지(Mukherjee, P. K.) 등의 문헌 "광수용기 외절 식세포작용은 산화 스트레스-유도된 아폽토시스를 수반되는 뉴로프로텍틴 D1 합성에 의해 약화시킨다(Photoreceptor outer segment phagocytosis attenuates oxidative stress-induced apoptosis with concomitant neuroprotectin D1 synthesis); Proc Natl Acad Sci USA 104, 13158-13163, (2007)]. d) 전체적인 PEDF-R 발현에서의 유의적인 증가에도 불구하고, L-ORD 환자 포스포리파아제 A2 활성은 ELISA에 의해 영향받지 않는 형제자매에 비해 40% 더 낮은 것으로 측정되었다. (e) 포스포리파아제 A2 활성은 상승된 수준의 pAMPK가 가해진 정상적 iPSC-RPE(n=6)에서 유의적으로 감소(∼26%)된 것으로 제시된다(n=6, 혈청 기아에 의해 유도됨)(p<0.05). (f) PEDF의 분극화된 분비를 ELISA에 의해 결정하였다. L-ORD 환자(N=12)는 PEDF의 감소된 상단 분비(환자: 939.6 ng/mL / 형제자매: 1277.22 ng/mL) 및 증가된 하단 분비(환자: 92.16 ng/mL / 형제자매: 75.96 ng/mL)를 나타내었고, 그 결과 영향받지 않는 형제자매(N=12, 19.82 ± 3.67)와 비교하여 유의적으로 감소된 PEDF 비(Ap/Ba)(10.13 ± 1.63)를 나타내었다(p=0.0014). 데이터는 평균 ± SE이고, 3회의 독립적 실험의 평균을 나타낸다. *는 p<0.05를 지시한다. f) 상단 분비된 DHA-유래된 뉴로프로텍틴 D1을 탠덤 질량 분석 지질체학 분석에 의해 측정하였다. 영향받지 않는 형제자매(Z8, 9i)는 L-ORD 환자(K8, E1)에 비해 대략 ∼10 배 더 많은 NPD1을 분비하였다(p=0.0089).
도 18a 내지 18h는 L-ORD 환자 RPE가 상피의 간엽 이행에 대하여 증가된 감수성을 가짐을 입증하는 다양한 시험 데이터를 도시한다. 대표적인 영상은 광수용기 외절의 7일 동안의 연속적 공급을 수반하는 iPSC-RPE의 막 표지자 ZO-1의 면역형광 염색(녹색으로 제시됨)을 보여준다. 모든 영상은 63x 대물렌즈를 사용하여 수득하였다. 스케일 바=20 ㎛. b) (a)에 기재된 조건하에 수득된 영상을 형태측량 분석하여 세포 면적 분포에 대한 상자 도표를 작성하였다(아래쪽 세선: 데이터의 5%, 아래쪽 힌지: 데이터의 25%, 중심선: 중간값, 위쪽 힌지: 데이터의 75%, 위쪽 세선: 데이터의 95%). L-ORD 환자 iPSC-RPE(N=6 영상, 135.37 ± 1.76 μm)는 영향받지 않는 형제자매(N=5, 95.77 ± 1.68 μm)와 비교하여 증가된 세포 크기 및 변동성을 갖는다(p<2E-16). 영향받지 않는 형제자매에서, 광수용기가 공급되는 동안 개시되는 메트포르민 치료는 치료되지 않은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 세포 면적에 최소한의 효과를 가졌다(N=7, 93.14 ± 1.56 μm)(p=0.52). 그러나, 3 mM 메트포르민 치료는 치료되지 않은 환자와 비교하여 환자 세포 면적(N=7, 117.92 ± 0.96 μm)의 유의적인 감소를 초래하였다(p<2E-16). 던넷의 다중 비교 시험을 수행하여 치료되지 않은 영향받지 않는 형제자매 또는 L-ORD 환자를 비교하였다. (c) 7-일 POS 공급 후 iPSC-RPE 단일층의 APOE 염색된 크라이오섹션에 대한 면역형광 현미경 영상. L-ORD 환자 iPSC-RPE는 상단 및 하단 APOE 침적(백색 화살표)의 변경된 상대적 비율을 나타내었다. POS 공급 동안 메트포르민으로 치료된 L-ORD 환자는 영향받지 않는 형제자매와 유사한 상단 및 하단 APOE 침적(황색 화살표)의 상대적 비율의 재분포를 생성하였다. (d) c)에 제시된 바와 유사한 영상의 APOE 신호의 적분된 밀도에 대한 영상 정량화. APOE 신호의 적분된 밀도는 치료되지 않은 L-ORD 환자(N=5; 상단: 185.69 ± 5.42; 하단: 46.38 ± 2.51)에서 영향받지 않는 형제자매(N=4; 상단 30.89 ± 12.05; 하단: 8.45 ± 3.09)와 비교하여 유의적으로 더 높다(상단: p=7.76E-6; 하단: p=2.71E-5). 메트포르민 치료된 영향받지 않는 형제자매(N=8; 상단 119.98 ± 20.36; 하단: 23.55 ± 6.17)와 비교하여 메트포르민 치료된 L-ORD 환자(N=4; 상단 79.30 ± 37.51; 하단: 13.58 ± 4.58) 사이에 유의적인 차이는 없다(상단: p=0.32; 하단: p=0.32). 모든 영상은 20x로 촬영되었다. 스케일 바=50 μm. (f) 감소된 맥락막 혈류를 모방하는 혈중산소감소 조건(6시간)하의 VEGF 분비의 ELISA 측정은 노인성 황반 변성의 병리생리학에 관여되어 왔고[무크헤르지(Mukherjee, P. K.) 등의 문헌 "광수용기 외절 식세포작용은 산화 스트레스-유도된 아폽토시스를 수반되는 뉴로프로텍틴 D1 합성에 의해 약화시킨다(Photoreceptor outer segment phagocytosis attenuates oxidative stress-induced apoptosis with concomitant neuroprotectin D1 synthesis); Proc Natl Acad Sci USA 104, 13158-13163, (2007)], 물질대사 스트레스인자로서 작용하여 저산소증-구동된 EMT에 대한 L-ORD iPSC-RPE의 감수성을 결정한다. 도 1i)에 제시된 정상산소 조건과 유사하게, L-ORD 환자 iPSC-RPE(N=10; Ap: 1.89 ± 0.30; Ba: 1.8 ± 0.24)는 영향받지 않는 형제자매(N=9; Ap: 0.78 ± 0.16; Ba: 1.59 ± 0.36)와 비교하여 비-분극화된 방식으로 VEGF를 분비한다(Ap: p=0.005; Ba: p=0.63). 메트포르민에 의한 치료 이전(2주)에 L-ORD 환자 RPE(N=6; Ap: 0.59 ± 0.09; Ba: 1.8 ± 0.24)를 저산소증-구동된 EMT에 대해 보호하고 치료되지 않은 또는 메트포르민 치료된 영향받지 않는 형제자매(N=9; Ap: 0.98 ± 0.16; Ba: 1.64 ± 0.33)와 유사하도록 상단/하단 VEGF 극성을 회복시킨다(Ap: p=0.09; Ba: p=0.64). (g) 영향받지 않는 형제자매와 비교되는 L-ORD 환자 iPSC-RPE에서의 역분화(EMT)-관련된 유전자의 발현에 미치는 POS 공급 효과. 7-일간의 POS 공급(백색으로 제시됨)은 영향받지 않는 형제자매와 비교하여 L-ORD 환자에서 EMT-관련된 유전자의 발현을 증가시킨다. 7-일간의 POS 공급 동안의 메트포르민 치료(적색으로 제시됨)는 EMT 관련된 유전자의 발현을 억제한다. (h) 후향성 임상 연구로부터의 결과 표는 비삼출성 노인성 황반 변성의 개시 연령을 지연시킴을 보여준다(362.51/H35.31). 50 내지 59세의 환자 연령에서, 메트포르민은 56세의 연령(n=157, 메트포르민 부재)으로부터 58.5세의 연령(n=16, 메트포르민 존재)으로 개시 연령을 지연시킨다(p=0.001).
실시예 10 - 망막의 색소 상피(RPE) 질환에서 RPE의 건강한 표현형을 향상시키고 유지시키는 신규 치료법
siRNA 선별을 수행하여 iPSC-RPE의 상피 표현형을 유지시키는데 필요한 후보 유전자 및 경로를 식별하였다; RPE로 분화될 경우 GFP를 발현하는 리포터(reporter) 유도된 다분화능 줄기(iPS) 세포주를 사용한다. 이러한 시도에 의해, NOX4를 식별하였다. NOX4는 저해될 경우 손상된 RPE 세포에서 상피의 표현형을 강하게 촉진시키는 NADPH 산화효소이다.
망막의 손상은 RPE의 역분화, 증식, 및 이동을 특징으로 하는 RPE-EMT를 유도한다. 도 22A 및 22B는 모델에서의 기계적 손상이 RPE-EMT의 특징을 생체내에서 모방할 수 있음을 보여주고; 기계적 손상 이후 RPE 세포는 EMT를 겪게 되어 EMT의 특징적인 형태 및 표지자를 나타낸다.
NOX4는 NADPH 효소이고 그의 주요 역할은 활성 산소 종(ROS)을 생산하는 것이다. NOX4는 손상된 RPE에서 고도로 발현된다. 도 23A는 NOX4가 온전한 RPE에 존재하고 손상된 RPE에서 고도로 발현됨을 보여준다. 또한, 도 23B에서, 손상된 RPE는 산화될 경우 형광으로 되는 핵 염기를 사용함으로써 온전한 RPE와 비교하여 ROS의 수준을 증가시키는 것으로 제시된다.
도 24는 NOX4가 EMT 표지자, 비멘틴 및 평활근 액틴(SMA: Smooth Muscle Actin)으로서 공지된 세포골격 단백질과 공-편재화되고, NOX4와 EMT 표지자의 결합이 EMT에서 NOX4의 역할에 대한 표시임을 보여준다.
도 25는 VAS2870을 사용하는 NOX4의 약리학적 저해가 EMT 표지자 SMA를 하향조절함을 보여준다.
도 26A 내지 26C는 shRNA의 사용에 의한 NOX4의 넉다운(knockdown)을 보여주고, NOX4의 성공적인 하향조절을 확인한다.
도 27은 손상된 RPE에서 shRNA 감소된 세포 이동을 사용하는 NOX4의 하향-조절을 보여준다. NOX4의 하향조절은 도 28A-28C에 제시된 바와 같이 ZEB1(EMT 표지자)을 하향조절한다.
도 29A 및 29B는 NOX4 shRNA 렌티바이러스 입자가 긁힌 RPE에서 네스틴을 성공적으로 하향조절함을 보여준다.
NOX4의 약리학적 저해를 수행함으로써, 도 30A 및 30B에 제시된 바와 같이, NOX4의 저해가 EMT 표지자의 발현을 효과적으로 하향조절함을 확인하였다.
이러한 실험의 결과로서, NOX4는 발현시 인간 망막의 색소 상피(RPE)의 상피 표현형을 조절하는 신규한 표적 유전자인 것으로 제시되었다. NOX4의 활성을 조절하는 약리학적 저해제는 증식성 유리체망막증(PVR), 노인성 및 유전성 망막의 변성, 및 암과 같은 RPE 장애를 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다.
실시예 11 - 메트포르민 치료는 스타르가르트의 질환을 개선시킨다.
스타르가르트 질환은 미국에서 ∼30,000명의 사람들이 고통받는 희귀 유전성 망막의 변성으로, 현재 치료법이 없다. 위축된 망막의 색소 상피(RPE)에 의해 유도되는 진행성 광수용기(PR) 세포 사멸은 환자에서 시력 손실을 유도한다. 그의 병인학에 있어서, 스타르가르트는 AMD와 유사하다. 이들 두 질환은 RPE-아래 및 내부 침적물 및 RPE 위축증을 보여준다. 그러나 스타르가르트는 다유전자성 질환인 AMD와 달리 단성 질환이다. 스타르가르트는 유전자 ABCA4(RPE에서 공지된 콜레스테롤 수송체인 ABCA1의 동원체)에서의 돌연변이에 의해 주로 발생된다[브리그스(Briggs, C.E.) 등의 문헌 "스타르가르트 황반 변성 또는 추상체-간상체 변성을 앓는 환자의 ABCR(ABCA4)에서의 돌연변이(Mutations in ABCR(ABCA4) in patients with Stargardt macular degeneration or cone-rod degeneration). Investigative ophthalmology & visual science, 2001. 42(10): p. 2229-2236"; 스패로우(R Sparrrow, J.), 힉스(D. Hicks), 및 하멜(C. P Hamel)의 문헌 "건강 및 질환에서의 망막의 색소 상피(The retinal pigment epithelium in health and disease). Current molecular medicine, 2010. 10(9): p. 802-823"]. RPE 및 PR 세포 사이의 기능적 상호작용이 시력을 위해 필요하고; 이와 같이, 위축된 RPE는 많은 경우에 PR 변성 및 실명을 빠르게 유도한다[스패로우(R Sparrrow, J.), 힉스(D. Hicks), 및 하멜(C. P Hamel)의 문헌 "건강 및 질환에서의 망막의 색소 상피(The retinal pigment epithelium in health and disease). Current molecular medicine, 2010. 10(9): p. 802-823"]. RPE 상단 표면 단백질은 RPE-PR 기능적 상호작용을 중재하기 위해 필요하다. 세포 표면 포획 기술(CSC: cell surface capturing technology)을 사용하여 분극화된 RPE 단일층의 상단 및 하단 표면 프로테옴(proteome)을 선택적으로 식별하였다. CSC는 RPE 세포의 상단측 상에 우세하게 존재하는, ABCA4를 비롯하여 RPE 막 상에서 이전에 보고되지 않았던 몇몇 단백질을 식별하는 것을 보조하였다[크리스토브(Khristov, V.) 등의 문헌 "분극화된 인간 망막의 색소 상피는 상단 및 하단 혈장 막에서 별개의 표면 프로테옴을 나타낸다(Polarized Human Retinal Pigment Epithelium Exhibits Distinct Surface Proteome on Apical and Basal Plasma Membranes), The Surfaceome. 2018, Springer p. 223-247.]. RPE 세포 막 상의 ABCA4 발현을 웨스턴 블롯에 의해 확인하였고(도 31A), 도시된 바와 같이 면역염색에 의해 이는 상단에 편재화되었다(도 31B, C). 이러한 결과는, ABCA4가 PR에서 독점적으로 발현되고, 환자에서 보여지는 RPE 위축증은 ABCA4 돌연변이로 인하여 POS에 축적된 독성 물질에 대하여 식세포작용을 하는 RPE 세포에만 기인한다는 현재의 정설에 대한 도전이었다[몰데이(Molday, R.S.), 종(M. Zhong), 및 쿠아지(F. Quazi)의 문헌 "광수용기 ABC 수송체 ABCA4의 지질 수송 및 스타르가르트 황반 변성에서의 역할(The role of the photoreceptor ABC transporter ABCA4 in lipid transport and Stargardt macular degeneration). Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2009; 1791(7): p. 573-583"; 마우게리(Maugeri, A.) 등의 문헌 "ABCA4(ABCR) 유전자에서의 돌연변이는 상염색체 열성의 추상체-간상체 이영양증의 주요 원인이다(Mutations in the ABCA4(ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy)". The American Journal of Human Genetics, 2000. 67(4): p. 960-966"].
RPE 및 질환 발병에서 ABCA4의 역할을 자세히 설명하기 위해, ABCA4 기능이 완전히 손실된 스타르가르트 iPSC-유래된 RPE(iRPE)를 시험관내 질환 모델로서 개발하였다(도 32). 본 발명자들은 성공적으로 2개의 ABCA4-/- iPSC 세포주를 생성하였고 완전히 성숙한 RPE 세포(ABCA4-/- Cl 및 ABCA4-/- C2; 도 32)를 유도하였다. ABCA4 넉아웃을 qRT PCR, ddPCR, 및 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다(도 32A, B). 또한, 스타르가르트 환자 iPSC 세포주를 유도하였고 성숙한 RPE 세포로 분화시켰다. 생어 서열분석은 환자-iRPE에서 돌연변이(6088bp 위치에서 엑손 44에서 C>T)의 존재를 확인하였다(도 32C). ddPCR 및 웨스턴 블롯 분석은 돌연변이가 환자-iRPE에서 돌연변이체 ABCA4 mRNA의 넌센스(non-sense) mRNA 쇠퇴를 일으킴을 확증한다(도 32D-E). 분자적(도 32J-O), 구조적(도 32F-I), 및 기능적 확인에 있어서, 환자 및 ABCA4-/- iRPE은 대조군 iRPE 단일층(대조군 1 - ABCA4-/- C1&C2에 대한 동종계 대조군, 대조군 2 - 환자 iRPE에 대한 영향받지 않는 형제자매)과 유사하게 행동하였고(도 32F-O), 이는 ABCA4 기능 손실에 기인하여 RPE에서 발달상의 결함이 없음을 시사한다.
이들 결과는 본 발명자들이 성숙한 iRPE 단일층에서의 ABCA4의 역할을 연구하도록 촉구한다. ABCA4 돌연변이가 RPE에서 세포 자율적 기능적 결함을 유도한다는 가설이 세워졌다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 스타르가르트 iRPE(ABCA4-/- 클론 및 환자)를 야생형 POS에 의해 6일 동안 처리하고 세포내 및 RPE-아래 지질 침적물의 축적(질환 표현형중 하나)을 평가하였다. 보디피 염색(액체 염료, 보디피505/515)을 사용하여 세포내/아래의 지질 침적물에 대해 분석한 결과 야생형 POS 처리된 스타르가르트 RPE에서 지질 축적이 2 내지 3배 증가하였고(도 33A-C를 D-F와 비교함, G에서 정량화), 이는 스타르가르트 iRPE 세포에서의 세포 자율적 결함에 대한 가설을 지지한다. 시각 회로의 독성 부산물(A2E 및 리포푸신)의 축적이 보체 신호생성 유도된 염증을 일으키는 것으로 공지되어 있으므로 이들 세포 자율적 결함이 조절되지 않은 보체 신호생성에 의해 증진되는지의 여부를 연구하기 위해, 스타르가르트 iRPE를 활성화된 인간 혈청(CC-HS) 또는 비활성화된 인간 혈청(CI-HS)에 의해 처리하였다[레니스(Lenis, T.L.) 등의 문헌 "망막의 색소 상피에서 보체 조절은 스타르가르트 질환의 마우스 모델에서 광수용기 변성을 구제한다(Complement modulation in the retinal pigment epithelium rescues photoreceptor degeneration in a mouse model of Stargardt disease). Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017. 114(15): p. 3987-3992"]. 이전의 보고와 일치하게, CC-HS의 48-시간 처리는 스타르가르트 iRPE 대 대조 세포에서 세포내/아래의 지질 침적물의 증가(2 내지 3배)를 촉발시켰다(도 33G, CC-HS 대 CI-HS를 비교함).
착색된 Abca4-/- 마우스 모델에서, 리포푸신 축적은 세라미드를 RPE의 상단측에서 증가시켜서 초기 엔도솜(EE: early endosome) 생물발생 및 융합을 유도하고, C3a를 증가시켜서 자가포식의 주된 조절자인 라파마이신의 기계적 표적(mTOR: mechanistic target of rapamycin)을 활성화시켰다[카우어(Kaur, G.) 등의 문헌 "비정상적 초기 엔도솜 생물발생은 황반 변성의 모델에서 망막의 색소 상피에서 보체 활성화을 중재한다(Aberrant early endosome biogenesis mediates complement activation in the retinal pigment epithelium in models of macular degeneratoni). Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018. 115(36): p. 9014-9019"]. Abca4-/- 마우스 모델에서 보여지는 바와 같이, 스타르가르트 iRPE에서 상단 세라미드 축적의 4 내지 5배 증가가 POS 섭생 및 CC-HS 처리에 노출되었을 경우 관찰되었다. 전체적으로, 이러한 작업은 ABCA4 KO 및 환자 iRPE 세포가 스타르가르트 질환에 대한 생리학적으로 관련된 시험관내 질환 모델을 나타내고, ABCA4 기능 손실이 RPE 세포에서 세포 자율적 질환 표현형을 촉발시킴을 보여주었다. 추가로 질환 발병에서의 ABCA4 구동된 기작을 이해하기 위하여, 본 실시예는 콜레스테롤 수송에 관여하는 ABCA4 상동체인 ABCA1에 초점을 맞추었다. 두 단백질 사이의 64.5% 아미노산 상동성은, ABCA4가 콜레스테롤 및 지질 울혈에 관여될 수 있음을 시사한다[쿠아지(Quazi, F.) 및 몰데이(R.S. Molday)의 문헌 "차등적 인지질 기질, 및 ATP-결합 카세트 단백질 ABCA1, ABCA7, 및 ABCA4 및 질환-유발 돌연변이에 의한 지향적 수송(Differential phospholipid substrates and directional transport by ATP-binding cassette proteins ABCA1, ABCA7, and ABCA4 and disease-causing mutants). Journal of Biological Chemistry, 2013. 288(48): p. 34414-34426"; 다나카(Tanaka, A.R.) 등의 문헌 "인간 ABCA1은 쇼그렌 증후군의 에피토프에 상동성인 큰 아미노-말단 세포외 도메인을 함유한다(Human ABCA1 contains a large amino-terminal extracellular domain homologous to an epitope of Sjogren's Syndrome). Biochemical and biophysical research communications, 2001. 283(5): p. 1019-1025"; 스토르티(Storti, F.) 등의 문헌 "마우스 망막의 색소 상피(RPE)에서 손상된 ABCA1/ABCG1-중재된 지질 유출은 망막의 변성을 유도한다(Impaired ABCA1/ABCG1-mediated lipid efflux in the mouse retinal pigment epithelium(RPE) leads to retinal degeneration). Elife, 2019. 8: p. e45100"]. ABCA 단백질 둘다가 지질 취급 경로를 통해 작용하는지의 여부를 결정하기 위해, 스타르가르트 RPE 세포에서 질환 표현형의 변화에 미치는 ABCA1 발현 조절 효과를 관찰하였다. ABCA4 iRPE 세포에서 ABCA1의 shRNA 넉다운을 수행하고, 세포를 CC-HS에 의해 처리하였다. ABCA1 KD는 보디피 염색에 의해 보여지는 바와 같이 ABCA4 RPE 세포에서 지질 침적물을 악화시켰다(도 34A-G). 대조적으로, 스타르가르트 RPE 세포에서 지질 축적 결함은 GW3965(ABCA1 활성화제)를 사용하여 ABCA1 과활성화에 의해 구제되었다(도 34H-N).
아마도 소화되지 않은 세포의 지질 및 시각 회로 대사산물로부터 형성된 황색빛의 지질-풍부한 침적물인 리포푸신은 스타르가르트 환자 눈의 특유의 세부 특징이다. 리포푸신 축적은 RPE 기능부전 및 그의 위축증과 연관되어 왔다[스패로우(Sparrow, J.R.) 등의 문헌 "RPE 리포푸신의 형광단, A2E: 이는 RPE 변성을 일으킬 수 있는가?(A2E, a fluorophore of RPE lipofuscin: can it cause RPE degeneration?). Retinal Degenerations 2003, Springer p. 205-211"; 스패로우(Sparrow, J.R.) 및 불턴(M. Boulton)의 문헌 "RPE 리포푸신 및 망막 병리학에서 이의 역할(RPE liposuscin and its role in retinal pathobiology). Experimental eye research, 2005. 80(5): p. 595-606"]. 이들 결과는 약물이 리포푸신 축적 속도를 감소시키거나 RPE에서 리포푸신 소거를 증가시킬 수 있고, 이는 상기 질환과 연관된 RPE 및 망막의 변성을 가능하게는 지연시킬 수 있다는 가설을 유도하였다[이사(Issa, P.C.) 등의 문헌 "Abca4 넉아웃 마우스에서 비타민 A 이량체화의 저해를 통한 스타르가르트 표현형의 구제(Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization). Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015. 112(27): p. 8415-8420"; 탄나(Tanna, P.) 등의 문헌 "스타르가르트 질환: 임상적 세부 특징, 분자 유전학, 동물 모델 및 치료학적 선택지(Stargardt disease: clinical features, molecular genetics, animal models and therapeutic options). British Journal of Ophthalmology, 2017. 101(1): p. 25-30"]. 수집된 데이터에 기초하여, 지질-저하 약물-메트포르민 염산염은 ABCA4 환자를 위한 잠재적인 치료학적 중재로서 작용할 수 있다는 가설이 세워졌다. 메트포르민은 AMPK 경로를 활성화시킴으로써 세포의 지질 대사작용을 증진시키고 V-ATP아제 및 엔도솜의 Na+/H+ 교환체를 통해 리소좀 pH를 감소시킴으로써 리소좀 활성을 증가시키는 타입 2 당뇨병을 위한 임상적으로 승인된 약제이다[장(Zhang, C.S.) 등의 문헌 "메트포르민은 리소좀 경로를 통해 AMPK를 활성화시킨다(Metformin activates AMPK through the lysosomal pathway). Cell metabolism, 2016. 24(4): p. 521-522"; 펭(Feng, Y.) 등의 문헌 "메트포르민은 Stat3 신호생성을 하향조절함으로써 식도의 편평상피 세포에서 자가포식 및 아폽토시스를 촉진시킨다(Metformin promotes autophagy and apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma by downregulating Stat3 signaling). Cell death & disease, 2014. 5(2): p. e1088-e1088"; 왕(Wang) 등의 문헌 "메트포르민은 OLETF 래트에서 미크로솜 트리글리세라이드 전달 단백질의 발현을 감소시킴으로써 지질 대사 장애를 향상시킨다(Metformin improves lipid metabolism disorders through reducing the expression of microsomal triglyceride transfer protein in OLETF rats). Diabetes research and clinical practice, 2016. 122: p. 170-178"; 왕(Wang, Y.) 등의 문헌 "메트포르민은 AMPK/mTORC1 및 mTORC2 경로를 표적화함으로써 골수종에서 자가포식 및 G0/G1 상 세포 주기 정지를 유도한다(Metformin induces autophagy and G0/G1 phase cell cycle arrest in myeloma by targeting the AMPK/mTORCl and mTORC2 pathways). Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2018. 37(1): p. 63"; 아누락(Anurag, P.) 및 아누라드하(C. Anuradha)의 문헌 "메트포르민은 고 프럭토스-공급된 래트에서 지질 대사작용을 향상시키고 지질 과산화를 약화시킨다(Metformin improves lipid metabolism and attenuates lipid peroxidation in high fructose-fed rats). Diabetes, Obesity and Metabolism, 2002. 4(1): p. 36-42"; 김(Kim, J.) 및 유(Y.J. You)의 문헌 "메트포르민에 의한 세포소기관 작용의 조절(Regulation of organelle function by Metformin). IUBMB life, 2017. 69(7): p. 459-469"]. 이들 작용 기작은 스타르가르트 RPE 세포가 리포푸신 소거를 더욱 효율적으로 처리할 수 있게 하는 것으로 예측된다. 질환 표현형을 스타르가르트 환자에서 개선시키는 메트포르민의 능력을 시험하고 스타르가르트-마우스 및 iRPE 모델에서 그의 작용 기작을 밝혀내고자 임상 시험이 제안되었다. 이러한 접근법의 의의는 RPE 세포에서 ABCA4의 이전에 제대로 인정되지 않은 역할에 있다. 스타르가르트 POS를 사용하지 않고 ABCA4 돌연변이체 iRPE에서 스타르가르트 질환 표현형을 반복해내는 능력이 이들 세포에서 세포-자율적 지질 대사작용 결함을 시사한다는 점은 주목할만 하다. RPE 지질 대사작용에서 ABCA4의 이러한 세포 자율적 역할의 손실은 스타르가르트 질환 병리에 기여하고 이러한 경로의 활성의 향상은 질환 경로를 변경시킬 수 있다.
스타르가르트 iRPE 세포에서의 POS 소화 결함. 스타르가르트 iRPE 세포에서의 증가된 지질 및 세라미드 축적은 잠재적 리소좀 결함, 및 시간이 지나면서 RPE 위축증을 유도하고 광수용기 변성을 촉발시킬 수 있는 POS를 소화하는 능력의 감소를 시사하였다[카르(Carr, A.J.) 등의 문헌 "신규한 인간 망막의 검정을 사용하여 인간 배아 줄기 세포-유래된 RPE 세포에 의한 식세포작용의 분자적 특징 및 기능적 분석(Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cell using a novel human retinal assay). Molecular vision, 2009. 15: p. 283"]. 스타르가르트 iRPE가 POS 소화에 있어서 결함이 있는지의 여부를 결정하기 위해, ABCA4 돌연변이체 및 대조 iRPE 세포에게 pHRhodo 염료(리소좀 내부에서만 형광을 나타냄) 표지화된 야생형 POS(10/RPE 세포)를 4시간 동안 공급하였다. 염료 표지는 POS 섭취(POS를 공급한지 4시간 후에 측정함) 및 소화율(POS를 공급한지 24시간 후에 측정함)을 구별하는 것을 도왔다. 스타르가르트 iRPE 세포는 대조 세포로서 POS를 섭취하는 유사한 능력을 보여주었다(4시간 시점)(도 35A). 그러나, 대조 세포와 비교할 경우 스타르가르트 iRPE에서 50 내지 70% 감소된 소화율(24시간 시점)을 관찰하였다(도 35B). 이들 결과는 iRPE 세포에서의 ABCA4 돌연변이가 파괴된 엔도-리소좀 기능부전을 초래하여, 아마도 결함적 지질 대사작용 및 세포의 기능부전에 기여함을 시사한다.
메트포르민 치료는 스타르가르트 iRPE에서 지질 침적물을 개선시킨다.
야생형 POS를 소화하는 스타르가르트 iRPE 세포의 감소된 능력은 엔도리소좀 기능부전이 질환을 갖는 세포에서 지질 항상성 결함의 중심에 있음을 시사하였다. 메트포르민은 리소좀 기능 및 지질 대사작용을 향상시킨다[왕(Wang) 등의 문헌 "메트포르민은 OLETF 래트에서 미크로솜 트리글리세라이드 전달 단백질의 발현을 감소시킴으로써 지질 대사작용 장애를 향상시킨다(Metformin improves lipid metabolism disorders through reducing the expression of microsomal triglyceride transfer protein in OLETF rats). Diabetes research and clinical practice, 2016. 122: p. 170-178"; 아누락(Anurag, P.) 및 아누라드하(C. Anuradha)의 문헌 "메트포르민은 고 프럭토스-공급된 래트에서 지질 대사작용을 향상시키고 지질 과산화를 약화시킨다(Metformin improves lipid metabolism and attenuates lipid peroxidation in high fructose-fed rats). Diabetes, Obesity and Metabolism, 2002. 4(1): p. 36-42"; 김(Kim, J.) 및 유(Y.J. You)의 문헌 "메트포르민에 의한 세포소기관 기능의 조절(Regulation of organelle function by Metformin). IUBMB life, 2017. 69(7): p. 459-469"]. 메트포르민 치료는 스타르가르트 iRPE 세포에서 리소좀의 활성 및 지질 대사작용을 향상시키고, 이에 따라 세라미드 및 지질 축적을 감소시켜 질환 표현형을 개선시킬 것이라는 가설이 세워졌다. 시험관내 시스템에서 메트포르민의 치료학적 효과를 평가하기 위해, 스타르가르트 세포 및 건강한 세포를 RPE 배지 + 비히클중의 또는 3 mM 메트포르민이 함유된 RPE 배지중의 야생형 POS(10 POS/세포)에 의해 연속적으로 6일 동안 처리하였다. 비히클 처리된 스타르가르트 iRPE와 비교할 경우, 메트포르민 치료는 POS 공급된 스타르가르트 iRPE에서 세라미드 수준을 유의적으로(3 내지 4배) 감소시켰다(도 36A). 스타르가르트 질환의 잠재적 치료로서 메트포르민을 전환시키기 위해, 이를 세라미드 및 지질-풍부한 RPE-아래 침적물을 포함하여 스타르가르트 망막증의 표현형을 재현하는 Abca4-/- 마우스 모델에서 시험하였다[카우어(Kaur, G.) 등의 문헌 "비정상적 초기 엔도솜 생물발생은 황반 변성의 모델에서 망막의 색소 상피에서 보체 활성화을 중재한다(Aberrant early endosome biogenesis mediates complement activation in the retinal pigment epithelium in models of macular degeneratoni). Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018. 115(36): p. 9014-9019"; 이사(Issa, P.C.) 등의 문헌 "스타르가르트 질환의 Abca4-/- 마우스 모델에서의 안저 자가형광 - A2E의 축적, 망막의 기능, 및 조직학과의 상관관계(Fundus autofluorescence in the Abca4-/- mouse model of Stargardt disease - correlation with accumulation of A2E, rentinal function, and histology). Investigative ophthalmology & visual science, 2013. 54(8): p. 5602-5612"]. 마우스에게 인간 용량에 비교할 수 있는 400 또는 800 mg/일의 경구 메트포르민 용량을 3개월 동안 제공하였다. 이들 용량은 치료된 마우스에서 저혈당증을 유도하지 않는다. 치료된 동물로부터 수집된 눈의 질량-분광분석은 비교가능한 양의 메트포르민 iRPE/맥락막, 망막, 및 혈장을 보여주었고, 이는 약물이 표적 조직에 도달함을 시사한다(데이터는 제시되지 않음). 치료된 Abca4-/- 마우스의 RPE/맥락막 플랫-마운트로부터의 본 발명자들의 데이터는 Abca4-/- 마우스에서 메트포르민 치료가 지질 수준을 급격히 감소시켰음을 보여주었다(도 36B-C). 이들 결과는 스타르가르트 및 AMD 환자의 잠재적 치료로서의 메트포르민에 대한 가설을 확인시켜 주었다.
실시예 12 - 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 망막하 주사, 및 국부 안구 치료 방법은 AMD 및 스타르가르트 질환을 개선시킨다.
치료의 효험을 확인하기 위해, 다양한 투여 방법을 사용하여 실시예 1 내지 11의 치료를 반복하였다. 특별히, 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 망막하 주사 및 국부 안구 투여 방법을 사용하여 실시예 1 내지 11의 치료를 반복하였다. 이들 추가적인 투여의 결과는 이들 투여 방법을 사용하는 치료 효험을 입증한다.
참조문헌으로서 혼입
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 기타 참조문헌은 본원에 이들의 전체가 참고로 명백히 혼입된다.
균등사항
당분야의 숙련가라면 단지 통상적인 실험을 사용함으로써 본원에 기재된 특정 실시태양 및 방법에 대한 많은 균등사항을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등사항은 하기 청구범위의 범주에 의해 포괄되고자 한다.
본원에 기재된 상세한 예 및 실시태양은 단지 예시적인 목적을 위해 예로서 제공되고, 본 개시내용에 대하여 제한하는 것으로 전혀 고려되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이의 견지에서 다양한 변형 또는 변경이 당분야의 숙련가에게 제안될 것이고, 본 출원의 취지 및 권한내에 포함되며, 첨부된 청구범위의 범주내에서 고려된다. 예를 들면, 구성성분의 상대적인 양은 원하는 효과를 최적화시키기 위해 다양할 수 있고, 추가적인 구성성분이 첨가되고/되거나, 유사한 구성성분이 기재된 구성성분중 하나 이상에 대해 대체될 수 있다. 본 개시내용의 시스템, 방법, 및 과정과 연관된 추가적인 유리한 세부 특징 및 기능은 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다. 게다가, 당분야의 숙련가라면 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 개시내용의 특정 실시태양에 대한 많은 균등사항을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등사항은 하기 청구범위에 의해 포괄되고자 한다.

Claims (52)

  1. NADPH-산화효소 4(Nox4) 또는 활성 산소 종 형성을 저해하거나, 또는 세린 단백질 분해 효소, 도파민 수용기, 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인헨서(NF-κB: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell), 라파마이신의 기계적 표적(mTOR: mechanistic target of rapamycin), 5' 아데노신 일인산염-활성화된 단백질 키나아제(AMPK), 망막의 색소 상피(RPE: retinal pigment epithelium) 상피 간엽 이행, RPE 역분화, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는 약학적 효과량의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 망막의 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는,
    망막의 질환을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    망막의 질환이 황반 또는 말초 망막의 변성, 지도모양 위축증, 맥락막의 신생혈관 증식, 망막의 색소 상피 위축증, 황반 이영양증, 스타르가르트 질환(Stargardt's disease), 스타르가르트-유사 질환, 베스트병(Best disease), 난황형 황반 이영양증, 성인 난황형 이영양증, 망막 색소변성, 증식성 유리체망막증, 망막의 박리, 병적 근시, 당뇨병성 망막증, CMV 망막염, 폐색성 망막 혈관 질환, 미숙아 망막증(ROP: retinopathy of prematurity), 맥락막 파열, 눈 히스토플라스마 증후군(POHS: ocular histoplasmosis syndrome), 톡소플라스마증(toxoplasmosis), 및 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis)로 구성된 군에서 선택되는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    화합물이 Nox4 저해제 또는 활성 산소 종 형성의 저해제인, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    화합물이 NF-κB, mTOR, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    화합물이 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하고, 여기서 Rho GTP 가수분해 효소가 CDC42 및/또는 RAC1인, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    화합물이 세린 단백질 분해 효소를 저해하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    화합물이 AMPK를 조절하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    화합물이 도파민 수용기를 조절하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    도파민 수용기를 조절하는 화합물이 도파민 수용기 D4 길항물질인, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    화합물이 RPE 상피 간엽 이행 또는 RPE 역분화를 조절하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    화합물이 아미노카프로산(Aminocapropic acid), L-701,324, Vas2870, L-745,870 염산염, Me-3,4-데포스타틴(dephostatin), N-메틸-1-데옥시노지리마이신(deoxynojirimycin), L-750,667 트리하이드로클로라이드, (+)-MK-801 말레산 수소, 펨피딘(Pempidine) 타르타르산염, (-)-나프록센(Naproxen) 나트륨, 랄록시펜(Raloxifene) 염산염, SKF 83959 브롬화수소산염, L-687,384 염산염, 7,7-디메틸-(5Z,8Z)-에이코사디에노산, SP-600125, Ro41-0960, 안시타빈(Ancitabine) 염산염, 리스페리돈(Risperidone), 텔렌제핀(Telenzepine) 중염산염, NO-711 염산염, U-99194A 말레산염, S(+)-라클로프라이드(Raclopride) L-타르타르산염, 피렌제핀(Pirenzepine) 중염산염, 캅토프릴(Captopril), 티오페라미드(Thioperamide) 말레산염, 알프레놀올(Alprenolol) 염산염, 리토드린(Ritodrine) 염산염, 푸트레신(Putrescine) 중염산염, 1-(2-메톡시페닐)피페라진 염산염, PAPP, U-69593, AG-1478, 리루졸(riluzole), 펜톨아민(Phentolamine) 메실산염, DBO-83, 포르메스탄(Formestane), 카르바마제핀(Carbamazepine), 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오르화물 염산염, 터부탈린(Terbutaline) 헤미황산염, UK 14304, GR 113808, 레플루노미드(Leflunomide), 아세틸티오콜린(Acetylthiocholine) 염화물, 스페르미딘(spermidine), 5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드(amiloride), ATPO, 아카데니신(Acadenisine) 및 메트포르민(Metformin), 및 이의 조합물로 구성된 군에서 선택되는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    화합물이 아미노카프로산; Vas2870, L-745,870; 리루졸; 아카데니신; 메트포르민 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    화합물을 약학 조성물의 형태로 투여하고, 여기서 약학 조성물이 화합물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  14. Nox4 또는 활성 산소 종 형성을 저해하거나, 또는 세린 단백질 분해 효소, 도파민 수용기, NF-κB, mTOR, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는 약학적 효과량의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 망막의 변성의 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는,
    망막의 변성을 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    화합물이 Nox4 저해제 또는 활성 산소 종 형성의 저해제인, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    화합물이 NF-κB, mTOR, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    화합물이 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하고, 여기서 Rho GTP 가수분해 효소가 CDC42 및/또는 RAC1인, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    화합물이 세린 단백질 분해 효소를 저해하는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  19. 제14항에 있어서,
    화합물이 도파민 수용기를 조절하는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    도파민 수용기를 조절하는 화합물이 도파민 수용기 D4 길항물질인, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  21. 제14항에 있어서,
    화합물이 AMPK를 조절하는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  22. 제14항에 있어서,
    화합물이 RPE 상피 간엽 이행 또는 RPE 역분화를 조절하는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  23. 제14항에 있어서,
    화합물이 아미노카프로산, L-701,324, Vas2870, L-745,870 염산염, Me-3,4-데포스타틴, N-메틸-1-데옥시노지리마이신, L-750,667 트리하이드로클로라이드, (+)-MK-801 말레산 수소, 펨피딘 타르타르산염, (-)-나프록센 나트륨, 랄록시펜 염산염, SKF 83959 브롬화수소산염, L-687,384 염산염, 7,7-디메틸-(5Z,8Z)-에이코사디에노산, SP-600125, Ro41-0960, 안시타빈 염산염, 리스페리돈, 텔렌제핀 중염산염, NO-711 염산염, U-99194A 말레산염, S(+)-라클로프라이드 L-타르타르산염, 피렌제핀 중염산염, 캅토프릴, 티오페라미드 말레산염, 알프레놀올 염산염, 리토드린 염산염, 푸트레신 중염산염, 1-(2-메톡시페닐)피페라진 염산염, PAPP, U-69593, AG-1478, 리루졸, 펜톨아민 메실산염, DBO-83, 포르메스탄, 카르바마제핀, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오르화물 염산염, 터부탈린 헤미황산염, UK 14304, GR 113808, 레플루노미드, 아세틸티오콜린 염화물, 스페르미딘, 5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드, ATPO, 아카데니신 및 메트포르민, 및 이의 조합물로 구성된 군에서 선택되는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    화합물이 아미노카프로산, Vas2870, L-745,870, 리루졸, 아카데니신, 메트포르민 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  25. 제14항에 있어서,
    화합물을 약학 조성물의 형태로 투여하고, 여기서 약학 조성물이 화합물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  26. Nox4 또는 활성 산소 종 형성을 저해하거나, 또는 세린 단백질 분해 효소, 도파민 수용기, NF-κB, mTOR, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는 약학적 효과량의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 망막의 색소 상피 세포 변성의 복원이 필요한 환자에게 투여함을 포함하는,
    망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    화합물이 Nox4 저해제 또는 활성 산소 종 형성의 저해제인, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    화합물이 NF-κB, mTOR, 또는 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    화합물이 1종 이상의 Rho GTP 가수분해 효소를 조절하고, 여기서 Rho GTP 가수분해 효소가 CDC42 및/또는 RAC1인, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  30. 제26항에 있어서,
    화합물이 세린 단백질 분해 효소를 저해하는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  31. 제26항에 있어서,
    화합물이 도파민 수용기를 조절하는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    도파민 수용기를 조절하는 화합물이 도파민 수용기 D4 길항물질인, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  33. 제26항에 있어서,
    화합물이 AMPK를 조절하는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  34. 제26항에 있어서,
    화합물이 RPE 상피 간엽 이행 또는 RPE 역분화를 조절하는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  35. 제26항에 있어서,
    화합물이 아미노카프로산, L-701,324, Vas2870, L-745,870 염산염, Me-3,4-데포스타틴, N-메틸-1-데옥시노지리마이신, L-750,667 트리하이드로클로라이드, (+)-MK-801 말레산 수소, 펨피딘 타르타르산염, (-)-나프록센 나트륨, 랄록시펜 염산염, SKF 83959 브롬화수소산염, L-687,384 염산염, 7,7-디메틸-(5Z,8Z)-에이코사디에노산, SP-600125, Ro41-0960, 안시타빈 염산염, 리스페리돈, 텔렌제핀 중염산염, NO-711 염산염, U-99194A 말레산염, S(+)-라클로프라이드 L-타르타르산염, 피렌제핀 중염산염, 캅토프릴, 티오페라미드 말레산염, 알프레놀올 염산염, 리토드린 염산염, 푸트레신 중염산염, 1-(2-메톡시페닐)피페라진 염산염, PAPP, U-69593, AG-1478, 리루졸, 펜톨아민 메실산염, DBO-83, 포르메스탄, 카르바마제핀, 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오르화물 염산염, 터부탈린 헤미황산염, UK 14304, GR 113808, 레플루노미드, 아세틸티오콜린 염화물, 스페르미딘, 5-(N-메틸-N-이소부틸)아밀로라이드, ATPO, 아카데니신 및 메트포르민, 및 이의 조합물로 구성된 군에서 선택되는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    화합물이 아미노카프로산, Vas2870, L-745,870, 리루졸, 아카데니신, 메트포르민 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  37. 제26항에 있어서,
    화합물을 약학 조성물의 형태로 투여하고, 여기서 약학 조성물이 화합물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  38. 약학적 효과량의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하고, 여기서 화합물이 아미노카프로산, Vas2870, L-745,870, 리루졸, 아카데니신, 및 메트포르민으로 구성된 군에서 선택되는,
    스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    화합물이 메트포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인, 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    화합물을 약학 조성물의 형태로 투여하고, 여기서 약학 조성물이 화합물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법.
  41. 제38항에 있어서,
    화합물을 피험체의 눈에 국부적으로 투여하는, 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    조성물을 피험체의 눈에 국부적으로 투여하는, 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법.
  43. 제38항에 있어서,
    화합물을 유리체내 주사, 테논낭하(sub-tenon) 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여하는, 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법.
  44. 제40항에 있어서,
    조성물을 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여하는, 스타르가르트 질환 또는 스타르가르트-유사 질환을 치료하는 방법.
  45. 제1항에 있어서,
    화합물을 피험체의 눈에 국부적으로 투여하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  46. 제13항에 있어서,
    조성물을 피험체의 눈에 국부적으로 투여하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  47. 제1항에 있어서,
    화합물을 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  48. 제13항에 있어서,
    화합물을 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체의 눈에 투여하는, 망막의 질환을 치료하는 방법.
  49. 제14항에 있어서,
    화합물을 피험체의 눈에 국부적으로 투여하거나, 또는 화합물을 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여하는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  50. 제25항에 있어서,
    조성물을 피험체의 눈에 국부적으로 투여하거나, 또는 조성물을 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여하는, 망막의 변성을 치료하는 방법.
  51. 제26항에 있어서,
    화합물을 피험체의 눈에 국부적으로 투여하거나, 또는 화합물을 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여하는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
  52. 제37항에 있어서,
    조성물을 피험체의 눈에 국부적으로 투여하거나, 또는 조성물을 유리체내 주사, 테논낭하 주사, 또는 망막하 주사를 통해 피험체에게 투여하는, 망막의 색소 상피 세포 변성을 복원시키는 방법.
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