JP2022548071A - 網膜変性を治療するための新薬の開発につながる標的 - Google Patents

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Abstract

本発明は、被験体における網膜の疾患若しくは障害又は網膜変性の治療をするか又は寛解をさせる新規方法；及びＮｏｘ４、ラジカル酸素種の形成、セリンプロテアーゼ、ドーパミン受容体、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、ＡＭＰＫ、ＲＰＥ上皮間葉転換、ＲＰＥ脱分化、又は１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する１つ以上の化合物を投与することを含む、網膜色素上皮細胞の修復をする新規方法；及び該方法を施すためのキットに関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年９月１３日出願の米国仮特許出願第６２／８９９，８９９号の恩典を主張する。この特許出願の全内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
連邦支援の研究又は開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所、国立眼科学研究所によって、プロジェクト番号ＺＯｌ＃：ＥＹ０００５３２の下、政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
網膜は、脊椎動物の眼の内面に位置する、特殊な感光性神経組織の層である。角膜、水晶体、及び硝子体液を経て網膜に到達した光は、神経インパルスを誘発する化学的及び電気的な事象に変換される。光をこれら生物学的プロセスに変換するプロセスである伝達を担う細胞は、視細胞と呼ばれる特殊な神経細胞である。
網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、神経網膜と脈絡膜とを隔てる、哺乳類の眼における密集している六角形の細胞の分極している単層である。ＲＰＥにおける細胞は色素顆粒を含み、血液網膜関門を形成し、そして、視細胞と密接に相互作用して、水晶体が網膜に集光した光エネルギーを吸収することによって視覚機能を維持することにより、網膜生理において重要な役割を担っている。また、これら細胞は、イオン、水、及び代謝最終産物を網膜下腔から血液へと輸送し、ブドウ糖、レチナール、及び脂肪酸等の栄養素を血液から取り込み、これら栄養素を視細胞に送達する。
また、ＲＰＥ細胞は網膜の視覚サイクルの一部である。視細胞は、光子吸収後に形成されるオールトランスレチナールを再異性化して１１－シスレチナールに戻すことができないので、レチナールはＲＰＥに輸送され、そこで１１－シスレチナールに再異性化され、輸送して視細胞に戻される。
ＲＰＥは、視細胞の維持及び血管新生の制御において重要な役割を果たしており、生体内の様々なＲＰＥ機能不全は、視細胞の損傷及び失明を引き起こす可能性がある、色素性網膜炎、ＲＰＥ剥離、異形成、萎縮、網膜症、加齢性黄斑変性を含む黄斑のジストロフィー又は変性等の視力に影響を与える病気に関連している。
黄斑に二次的に影響を及ぼし得る一般的な網膜疾患としては、網膜剥離、病的近視、色素性網膜炎、糖尿病性網膜症、ＣＭＶ網膜炎、網膜血管閉塞症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、脈絡膜破裂、眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）、トキソプラズマ症、及びレーバー先天黒内障が挙げられる。上記のリストいずれも、網羅的ではない。
（加齢性）黄斑変性、シュタルガルト病及びシュタルガルト様疾患等の黄斑ジストロフィー、ベスト病（卵黄様黄斑ジストロフィー）、並びに成人卵黄様ジストロフィー又は色素性網膜炎のサブタイプ等の多くの眼科疾患は、網膜自体又はＲＰＥの変性又は劣化に関連する。ＲＰＥ細胞の網膜下移植によって、視細胞の回復視覚機能の維持を達成できることが動物モデルで実証されている（Ｃｏｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２：５，５３－５６；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１９９６：１５，１０６９－１０７７；Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１９９６：３７，２０４－２１１；Ｓａｕｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００２：１１４，３８９－４０１）。網膜変性疾患及び傷害の治療に使用することができるＲＰＥ細胞をヒト幹細胞等から生成する方法を見出すことが必要とされている。
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、高齢者集団における失明の最も一般的な原因である。ＡＭＤには、ＲＰＥが萎縮するドライ型及びＲＰＥを貫通する脈絡膜血管系が異常増殖するウェット型の２種類がある。ＲＰＥの機能不全は、疾患の病態及び進行に関連していたが、その理由は、視細胞を支えることができず、神経レチナール層の変性、ひいては視力喪失につながるためである。現在、ウェット型のＡＭＤに利用可能な治療法としては、レーザー凝固療法及び抗ＶＥＧＦ注射があるのみである。同様に、ＲＰＥ ＥＭＴ細胞における上皮の発現型が失われ、最終的に失明に至ることを特徴とする、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）並びに加齢性及び遺伝性の網膜変性のような網膜変性疾患に対する有効な治療は今日まで存在していない。
網膜変性の治療において有用な化合物及び方法が、継続して必要とされている。このような治療により、複数の病因に起因する網膜変性が予防されたり、割合が減少したりするであろう。
一態様では、本発明は、網膜疾患の治療をする方法であって、それを必要としている患者に、Ｎｏｘ４若しくは反応性酸素種形成を阻害するか、又はセリンプロテアーゼ、ドーパミン受容体、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、ＡＭＰＫ、ＲＰＥ上皮間葉転換、ＲＰＥ脱分化、若しくは１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、薬学的に有効な量の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む方法を提供する。
本発明の網膜疾患の治療をする方法の特定の実施形態では、網膜疾患は、黄斑又は周辺部網膜変性、網膜色素上皮萎縮、黄斑ジストロフィー、地図状萎縮、脈絡膜血管新生、シュタルガルト病、シュタルガルト様疾患、ベスト病、卵黄様黄斑ジストロフィー、成人卵黄様ジストロフィー、色素性網膜炎、増殖性硝子体網膜症、網膜剥離、病的近視、糖尿病性網膜症、ＣＭＶ網膜炎、閉塞性網膜血管疾患、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、脈絡膜破裂、眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）、トキソプラズマ症、又はレーバー先天性黒内障である。
本発明の網膜疾患の治療をする方法の他の実施形態では、化合物は、Ｎｏｘ４阻害剤（又は反応性酸素種阻害剤）である。本発明の網膜疾患の治療をする方法の更に他の実施形態では、化合物は、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、又は１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する。特定の実施形態では、化合物は、１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節し、該Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅは、ＣＤＣ４２及び／又はＲＡＣ１である。他の実施形態では、化合物は、ＡＭＰＫを調節する。更に他の実施形態では、化合物は、ＲＰＥ上皮間葉転換又はＲＰＥ脱分化を制御する。
本発明の網膜疾患の治療をする方法の特定の実施形態では、化合物は、アミノカプロン酸、Ｌ－７０１，３２４、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０塩酸塩、Ｍｅ－３，４－デホスタチン、Ｎ－メチル－１－デオキシノジリマイシン、Ｌ－７５０，６６７三塩酸塩、（＋）－ＭＫ－８０１マレイン酸水素塩、酒石酸ペンピジン、（－）－ナプロキセンナトリウム、塩酸ラロキシフェン、ＳＫＦ８３９５９臭化水素酸塩、Ｌ－６８７，３８４塩酸塩、７，７－ジメチル－（５Ｚ，８Ｚ）－エイコサジエン酸、ＳＰ－６００１２５、Ｒｏ４１－０９６０、塩酸アンシタビン、リスペリドン、テレンゼピン二塩酸塩、ＮＯ－７１１塩酸塩、Ｕ－９９１９４Ａマレイン酸塩、Ｓ（＋）－ラクロプリドＬ－酒石酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、カプトプリル、チオペラミドマレイン酸塩、アルプレノロール塩酸塩、リトドリン塩酸塩、プトレシン二塩酸塩、１－（２－メトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩、ＰＡＰＰ、Ｕ－６９５９３、ＡＧ－１４７８、リルゾール、メシル酸フェントラミン、ＤＢＯ－８３、ホルメスタン、カルバマゼピン、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、テルブタリンヘミ硫酸塩、ＵＫ１４３０４、ＧＲ１１３８０８、レフルノミド、アセチルチオコリン塩酸塩、スペルミジン、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソブチル）アミロライド、ＡＴＰＯ、アカデニシン、若しくはメトホルミン、又はこれらの組合せである。本発明の網膜疾患の治療をする方法の特定の実施形態では、化合物は、アミノカプロン酸；Ｌ－７４５，８７０；リルゾール；アカデニシン；メトホルミン、又はこれらの薬学的に許容し得る塩である。
本発明の網膜疾患の治療をする方法の幾つかの実施形態では、化合物は、医薬組成物の形態で投与され、該医薬組成物は、該化合物及び１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含む。
別の態様では、本発明は、網膜変性の治療をする方法であって、それを必要としている患者に、Ｎｏｘ４を阻害するか、又はＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、ＡＭＰＫ、ＲＰＥ上皮間葉転換、若しくはＲＰＥ脱分化、若しくは１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、薬学的に有効な量の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む方法を提供する。
本発明の網膜変性の治療をする方法の特定の実施形態では、化合物は、Ｎｏｘ４阻害剤（又は反応性酸素種阻害剤）である。本発明の網膜変性の治療をする方法の更に他の実施形態では、化合物は、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、又は１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する。特定の実施形態では、化合物は、１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節し、該Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅは、ＣＤＣ４２及び／又はＲＡＣ１である。他の実施形態では、化合物は、ＡＭＰＫを調節する。更に他の実施形態では、化合物は、ＲＰＥ上皮間葉転換又はＲＰＥ脱分化を制御する。
本発明の網膜変性の治療をする方法の特定の実施形態では、化合物は、アミノカプロン酸、Ｌ－７０１，３２４、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０塩酸塩、Ｍｅ－３，４－デホスタチン、Ｎ－メチル－１－デオキシノジリマイシン、Ｌ－７５０，６６７三塩酸塩、（＋）－ＭＫ－８０１マレイン酸水素塩、酒石酸ペンピジン、（－）－ナプロキセンナトリウム、塩酸ラロキシフェン、ＳＫＦ８３９５９臭化水素酸塩、Ｌ－６８７，３８４塩酸塩、７，７－ジメチル－（５Ｚ，８Ｚ）－エイコサジエン酸、ＳＰ－６００１２５、Ｒｏ４１－０９６０、塩酸アンシタビン、リスペリドン［確認して下さい」、テレンゼピン二塩酸塩、ＮＯ－７１１塩酸塩、Ｕ－９９１９４Ａマレイン酸塩、Ｓ（＋）－ラクロプリドＬ－酒石酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、カプトプリル、チオペラミドマレイン酸塩、アルプレノロール塩酸塩、リトドリン塩酸塩、プトレシン二塩酸塩、１－（２－メトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩、ＰＡＰＰ、Ｕ－６９５９３、ＡＧ－１４７８、リルゾール、メシル酸フェントラミン、ＤＢＯ－８３、ホルメスタン、カルバマゼピン、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、テルブタリンヘミ硫酸塩、ＵＫ１４３０４、ＧＲ１１３８０８、レフルノミド、アセチルチオコリン塩酸塩、スペルミジン、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソブチル）アミロライド、ＡＴＰＯ、アカデニシン、若しくはメトホルミン、又はこれらの組合せである。本発明の網膜変性の治療をする方法の特定の実施形態では、化合物は、アミノカプロン酸；Ｌ－７４５，８７０；リルゾール；アカデニシン；メトホルミン、又はこれらの薬学的に許容し得る塩である。
本発明の網膜変性の治療をする方法の幾つかの実施形態では、化合物は、医薬組成物の形態で投与され、該医薬組成物は、該化合物及び１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含む。
更に別の態様では、本発明は、網膜色素上皮細胞の修復をする方法であって、それを必要としている患者に、Ｎｏｘ４若しくは反応性酸素種形成を阻害するか、又はセリンプロテアーゼ、ドーパミン受容体、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、ＡＭＰＫ、ＲＰＥ上皮間葉転換、若しくはＲＰＥ脱分化、若しくは１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、薬学的に有効な量の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む、方法を提供する。
本発明の網膜色素上皮細胞の修復をする方法の特定の実施形態では、網膜疾患は、障害は、黄斑変性、網膜色素上皮萎縮、黄斑ジストロフィー、シュタルガルト病、シュタルガルト様疾患、ベスト病、卵黄様黄斑ジストロフィー、成人卵黄様ジストロフィー、色素性網膜炎、増殖性硝子体網膜症、網膜剥離、病的近視、糖尿病性網膜症、ＣＭＶ網膜炎、閉塞性網膜血管疾患、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、脈絡膜破裂、眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）、トキソプラズマ症、又はレーバー先天性黒内障である。
網膜色素上皮細胞の修復をする方法の他の実施形態では、化合物は、Ｎｏｘ４阻害剤である。本発明の網膜疾患の治療をする方法の更に他の実施形態では、化合物は、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、又は１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する。特定の実施形態では、化合物は、１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節し、該Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅは、ＣＤＣ４２及び／又はＲＡＣ１である。他の実施形態では、化合物は、ＡＭＰＫを調節する。更に他の実施形態では、化合物は、ＲＰＥ上皮間葉転換又はＲＰＥ脱分化を制御する。
網膜色素上皮細胞の修復をする方法の特定の実施形態では、化合物は、アミノカプロン酸、Ｌ－７０１，３２４、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０塩酸塩、Ｍｅ－３，４－デホスタチン、Ｎ－メチル－１－デオキシノジリマイシン、Ｌ－７５０，６６７三塩酸塩、（＋）－ＭＫ－８０１マレイン酸水素塩、酒石酸ペンピジン、（－）－ナプロキセンナトリウム、塩酸ラロキシフェン、ＳＫＦ８３９５９臭化水素酸塩、Ｌ－６８７，３８４塩酸塩、７，７－ジメチル－（５Ｚ，８Ｚ）－エイコサジエン酸、ＳＰ－６００１２５、Ｒｏ４１－０９６０、塩酸アンシタビン、リスペリドン［確認して下さい」、テレンゼピン二塩酸塩、ＮＯ－７１１塩酸塩、Ｕ－９９１９４Ａマレイン酸塩、Ｓ（＋）－ラクロプリドＬ－酒石酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、カプトプリル、チオペラミドマレイン酸塩、アルプレノロール塩酸塩、リトドリン塩酸塩、プトレシン二塩酸塩、１－（２－メトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩、ＰＡＰＰ、Ｕ－６９５９３、ＡＧ－１４７８、リルゾール、メシル酸フェントラミン、ＤＢＯ－８３、ホルメスタン、カルバマゼピン、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、テルブタリンヘミ硫酸塩、ＵＫ１４３０４、ＧＲ１１３８０８、レフルノミド、アセチルチオコリン塩酸塩、スペルミジン、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソブチル）アミロライド、ＡＴＰＯ、アカデニシン、若しくはメトホルミン、又はこれらの組合せである。 本発明の網膜疾患の治療をする方法の特定の実施形態では、化合物は、アミノカプロン酸；Ｌ－７４５，８７０；リルゾール；アカデニシン；メトホルミン、又はこれらの薬学的に許容し得る塩である。
網膜色素上皮細胞の修復の幾つかの実施形態では、化合物は、医薬組成物の形態で投与され、該医薬組成物は、該化合物及び１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含む。
別の態様では、本発明は、シュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法であって、それを必要としている患者に、薬学的有効量の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含み、該化合物が、アミノカプロン酸、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０、リルゾール、アカデニシン、又はメトホルミンである方法を提供する。本発明のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法の幾つかの実施形態では、化合物は、メトホルミン又はその薬学的に許容し得る塩である。
本発明のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法の幾つかの実施形態では、化合物は、医薬組成物の形態で投与され、該医薬組成物は、該化合物及び１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含む。
本発明のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法の特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される。
本発明のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法の特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される。
本発明の網膜疾患の治療をする方法の特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される。
本発明の網膜変性の治療をする方法の特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される。
本発明の網膜色素上皮細胞の変性の修復をする方法の特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される。
図１ａ～１ｓは、補体能力のあるヒト血清（ＣＣ－ＨＳ）が成熟ＲＰＥにおいてＡＭＤ様細胞エンドフェノタイプを誘導することを実証する各種試験データを示す。（ａ）研究全体を通して、Ｆ－アクチン（緑）及びβ－カテニン（赤）が細胞境界に共局在している成熟及び分極ｉＲＰＥ細胞を使用した、ｎ＝３。（ｂ～ｄ）ＣＣ－ＨＳで４８時間処理したｉＲＰＥは、補体能力のないヒト血清（ＣＩ－ＨＳ）と比較してＡＰＯＥ陽性ＲＰＥ下沈着物の有意な１０倍の増加を示した；ｎ＝１０、各株につき３つ技術的複製を有する異なるｉＲＰＥ株。（ｅ、ｆ）また、ＣＣ－ＨＳは、ナイルレッドによる染色によって観察したとき、ＣＩ－ＨＳ処理と比較して中性脂肪小滴をアップレギュレートした、ｎ＝３。（ｇ、ｈ）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により、ＲＰＥ下の層及び脂質沈着物がＣＣ－ＨＳ処理されたｉＲＰＥにのみ存在することが確認された（ｈにおける矢印）、ｎ＝１０。（ｉ、ｊ）Ｆ－アクチン染色（黄色）（Ｊにおける矢頭）から分かる通り、ＣＣ－ＨＳ処理によりｉＲＰＥで張線維が誘導され、ＲＰＥの六角形度が失われた（ｎ＝３）。（ｋ～ｏ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞における接合部の完全性の喪失。（ｋ、ｌ）別の接合マーカーＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（緑）と共染色した細胞質における密着接合マーカーＣＬＤＮ１６（赤）の誤局在した発現（Ｋと比較したＬにおける矢頭）、ｎ＝３。（ｍ、ｎ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥのＴＥＭにより、隣接するＲＰＥ細胞間の密着接合の消失が確認された（ｍにおける矢印と比較したときのｎにおける矢印）、ｎ＝３。（ｏ）ボックスプロットは、ＣＩ－ＨＳで処理した細胞に対して、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ単層ではＴＥＲ測定値が有意に３倍減少することを示す。（ｐ）貪食能の観点で評価した、ＣＣ－ＨＳで処理した細胞におけるｉＲＰＥ機能性の喪失を表す。ＣＣ－ＨＳ処理の結果、視細胞外節の取り込みが有意に６倍減少した。（ｑ～ｓ）ＣＣ－ＨＳ処理により、ＣＩ－ＨＳサンプルと比較して、ＡＴＰ及び１ｍＭ Ｋ＋等の生理的刺激に対するｉＲＰＥの応答の喪失が誘導された。健常細胞に対してストレスを受けたｉＲＰＥ細胞で変化した応答の代表的な痕跡を（ｑ及びｒ）に示す。 図２ａ～２ｇは、ＣＣ－ＨＳが誘導するＡＭＤ様細胞内エンドフェノタイプがＣ５ａ及びＣ３ａのシグナル伝達を通して機能する可能性が高いことを実証する各種試験データを示す。（ａ）ウェスタンブロットにより、補体受容体３ａ（Ｃ３ａＲ）及び補体受容体５ａ（Ｃ５ａＲ）がｉＲＰＥ細胞可溶化物の膜画分にのみ存在し、細胞質画分では発現しないことが確認され、肝臓及びＡＳ４９細胞株可溶化物が陽性対照として機能する。既知の膜タンパク質マーカーであるＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅが、ローディング対照として作用する。（ｂ、ｃ）Ｃ５ａＲ１、Ｃ３ａＲ１（赤）が、エズリン（緑、頂端突起マーカー、上図）とは共局在するが、Ｖ型コラーゲン（緑、基底マーカー、下図）とは共局在しないことから、ｉＲＰＥ細胞の頂端側に受容体が存在することが立証される。（ｄ～ｇ）ＣＩ－ＨＳ又はＣＣ－ＨＳで処理した３つの異なるｉＲＰＥ細胞株間でＷＢによって、ｉＲＰＥ細胞可溶化物中の総ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、及びリン酸化ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ－ＡＫＴのタンパク質レベルを調べ、定量を棒グラフで示す。 図３ａ～３ｋは、ＡＭＤ様細胞エンドフェノタイプを誘導することによって、ＮＦ－ｋＢ経路の活性化がＣ５ａＲ１及びＣ３ａＲ１のシグナル伝達の下流で作用することを実証する各種試験データを示す。（ａ～ｂ）ｉＲＰＥをＣＣ－ＨＳで処理すると、ＣＩ－ＨＳと比較して、ｐ６５サブユニット（赤で染色、ｂ）の細胞質から核への移行が誘導され、これはＮＦ－ｋＢ経路の活性化を示す。（ｃ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＮＦ－ｋＢ経路の標的及び経路の遺伝子の発現が増加することが、ｑＲＴ－ＰＣＲにより更に確認された。（ｄ、ｅ）ＣＣ－ＨＳで処理した細胞におけるＩＬ－８及びＩＬ－１８の頂端及び基底の分泌の増加が確認され、これは、経路の活性化を示唆している。（ｆ～ｈ）ｐ６５（赤）の核移行は、Ｃ３、Ｃ５、又はＣＦＤを枯渇させたヒト血清で処理したｉＲＰＥではみられず、これは、補体タンパク質Ｃ３及びＣ５が、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞におけるＮＦ－ｋＢの活性化において不可欠な役割を果たすことを示唆している。（ｉ～ｋ）ＮＦ－ｋＢ経路の負の制御因子であるＮＥＭＯに変異を有する患者のｉＲＰＥを調べて、ＮＦ－ｋＢ経路の役割を確認した。（ｉ）核におけるｐ６５の基礎レベルの増加を示す。（ｊ～ｋ）患者株は、より多くのＡＰＯＥ陽性ｉＲＰＥ下沈着物を示し、データの定量を図ｋに示す。 図４ａ～４ｊは、アナフィラトキシン補体がｉＲＰＥ細胞におけるオートファジーをダウンレギュレートすることを示す各種試験データを示す。（ａ～ｆ）オートファジータンパク質であるＬＣ３（赤、ａ、ｂ）及びＡＴＧ５（赤、ｄ、ｅ）は、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥと比較して、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥではダウンレギュレートされる。（ｃ、ｆ）ウェスタンブロットの定量から、ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルでは、ＣＩ－ＨＳで処理したサンプルと比較してＬＣ３－ＩＩ（ｉ）及びＡＴＧ５（１）の発現が２倍減少することが確認される。（ｇ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＣＩ－ＨＳで処理した細胞と比較して複数のオートファジー経路遺伝子の発現が３～６倍減少することが、ｑＲＴ－ＰＣＲにより明らかになった。（ｈ、ｉ）ｉＲＰＥにＣＣ－ＨＳ処理を施すと、オートファゴリソソームの蓄積が誘導されるが、ＣＩ－ＨＳ処理では誘導されない。（ｊ）ＣＣ－ＨＳ処理によるＬＣ３－ＩＩ発現の減少の誘導が、Ｃ５及びＣ３を枯渇させたヒト血清で処理したｉＲＰＥ又はＣＣ－ＨＳで処理したＣ５ａＲ＋Ｃ３ａＲがブロックされた細胞では生じないことが、ウェスタンブロットにより確認された。 図５ａ～５ｆは、タンパク質毒性ハイスループットスクリーニングによって、ｉＲＰＥの健康を回復させる薬物が同定されることを実証する各種試験データを示す。（ａ）ＣＩ－ＨＳ及び（ｂ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞におけるカルシウム応答曲線。（ｃ）Ａ２３１８７は、４８時間にわたってｉＲＰＥを死亡させるタンパク質毒性薬物である。１０μＭのＡ２３１８７濃度では、４８時間で約４０％の細胞が死亡する。ドットプロットは、２つの異なるセットの３８４ウェルプレートから得られた結果を示す。プレート３～６のｉＲＰＥは、１０ｕｍのＡ２３１８７及び４６μＭの１２８０種の薬学的活性化合物ライブラリー（ＬＯＰＡＣ）の薬物で処理し、一方、プレート７～１０では、ｉＲＰＥを１０μＭのＡ２３１８７及び９．２μＭのＬＯＰＡＣで処理した。ＣｅｌｌＴｉｔｒＧｌｏｗ（ＡＴＰ放出）アッセイを使用して細胞生存率をスコア化し、Ｙ軸にプロットした。なお、４６ｕｍの濃度では、ほとんどの薬物が細胞毒性であるが、一方、９．２μＭの濃度範囲では、約２０種の薬物が程度の差こそあれｉＲＰＥ細胞の生存率を改善した。（ｄ～ｆ）４種の薬物（Ｌ７４５，８７０－ｄ；リルゾール－ｅ；アミノカプロン酸－ｆ）の７点用量曲線は、３種のＡ２３１８７濃度（２．５μＭ、赤；５μＭ、青；及び１０μＭ、緑）にわたって２つのｉＲＰＥサンプル間で再現性のある細胞生存率を示す。 図６ａ～６ｋは、抗タンパク質毒性薬がＣＣ－ＨＳのｉＲＰＥに対する作用を改善し、ＲＰＥ細胞の健康及び機能を回復させることを実証する各種試験データを示す。（ａ～ｅ）ｉＲＰＥを薬物（リルゾール、Ｌ７４５，４７０、及びアミノカプロン酸）及びＣＣ－ＨＳで共処理すると、Ｎｆ－ｋＢのｐ６５サブユニット（赤）の核移行（ａ～ｅ）も、オートファジータンパク質であるＡＴＧ５（赤）の発現減少（ｆ～ｊ）も生じない。 図７ａ～７ｈは、抗タンパク質毒性薬が、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞においてＮＦ－ｋＢの活性化を抑制し、オートファジーをアップレギュレートすることを実証する示す各種試験データを示す。（ａ、ｂ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞をＬ－７４５，８７０（Ｌ－７４５）又はアミノカプロン酸（ＡＣＡ）で共処理すると、ＣＣ－ＨＳ及びビヒクルで処理した細胞と比較してナイルレッド陽性脂質小滴の量（ａ）及びフィビュリン３の発現（ｂ）が減少した。（ｃ～ｆ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞をＬ－７４５及びＡＣＡで共処理すると、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞（ｃ、ｄ）及びラット眼球のレーザー病変の境界におけるＲＰＥ細胞（ｅ、ｆ）の面積が減少し（ｃ、ｅ）、六角形度が改善した（ｄ、ｆ）。（ｇ、ｈ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞をＬ－７４５及びＡＣＡで共処理すると、単層ＴＥＲ（ｇ）及び貪食能（ｈ）が増加した。 図８ａ～８ｂは、ＣＩ－ＨＳ又はＣＣ－ＨＳで処理した後のｉＲＰＥ表現型の変化の模式図を示す。 図９ａ～９ｍは、補体能力のあるヒト血清（ＣＣ－ＨＳ）処理により基底ＲＰＥ沈着物が生じることを実証する各種試験データを示す。（ａ）経上皮抵抗（ＴＥＲ）の漸増は、ｉＲＰＥ単層膜の成熟度を示す。（ｂ）ＡＰＯＥ（赤）及びＣ５ａｂ（緑）で共染色した、ＣＣ－ＨＳで処理したトランスウェルメンブレン。（ｃ、ｄ）免疫染色により、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥと比較してフィビュリン３（緑）の発現が増加したことが明らかになる。（ｅ、ｆ）オイルレッドＯ染色（赤）により、ＣＣ－ＨＳ処理では、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥと比較して細胞内脂質小滴の数が多いことが明らかになった。（ｇ、ｈ）ｉＲＰＥの基底面の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）により、ＣＣ－ＨＳ処理後に層状沈着物が増加したことが明らかになる（赤色の矢頭）。（ｉ～ｌ）免疫染色は、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ（ｊ）及びＡＭＤ眼におけるＧＡ病変の境界（ｌ）において、いかなる細胞骨格構造も有しないビメンチン（赤）の発現の変化を示す。ＣＩ－ＨＳで処理した細胞（ｉ）及び非病変ＲＰＥ（ｋ）領域は、ビメンチンの細胞骨格発現を伴う組織化された正常な膜及び細胞質を示す。Ｆ－アクチン（緑）は、アクチン細胞骨格を標識する。（ｍ）電気生理学的データの定量により、ＣＣ－ＨＳ処理により安静状態下におけるＴＥＲが２．５倍低下し、１ｍのＭＫ及びＡＴＰ刺激下ではＴＥＲ変化が減少することが示される。 図１０ａ～１０ｍは、アナフィラトキシン補体タンパク質がｉＲＰＥにおけるＡＭＤ様細胞エンドフェノタイプを媒介することを実証する各種試験データを示す。（ａ）初代細胞及びｉＲＰＥ細胞におけるＣ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１のｍＲＮＡ発現レベル。注記：ｉＲＰＥ細胞ではＣ５ａＲ１の発現が約３０倍多い。両受容体の発現は、ＣＣ－ＨＳ処理により増加する。（ｂ）エズリン（緑、頂端マーカー）とは共局在するが、ＩＶ型コラーゲン（緑、基底マーカー）との共局在は非常に少ないことによって確認される通り、ｉＲＰＥ細胞の免疫染色から、ｉＲＰＥ細胞ではＣ３ａＲ１（左図、赤）及びＣ５ａＲ１（右図、赤）は主に頂端で発現する。（ｃ～ｆ）死体ヒト眼では、エズリン（緑、頂端マーカー）及びＩＶ型コラーゲン（緑、基底マーカー）と共局在していることによって確認される通り、Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１はいずれもＲＰＥ細胞の頂端側及び基底側で同様に発現する。また、ＲＰＥ細胞において、これらの受容体は顕著に細胞内で発現する。（ｇ～ｋ）タンパク質ＣＦＤ（Ｃ３及びＣ５の上流）、Ｃ３、Ｃ５を枯渇させたヒト血清で処理した、並びにＣＣ－ＨＳ＋Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１の受容体ブロッカーで共処理したｉＲＰＥ膜のＡＰＯＥ染色は、ＣＣ－ＨＳ処理と比較して全ての条件下でＡＰＯＥ発現が減少することを示す。（１、ｍ）Ｃ５及びＣ３のタンパク質を枯渇させたヒト血清で処理したｉＲＰＥの電気生理学的応答は、ＲＰＥ細胞の正常な電気的特性を示す。 図１１ａ～１１ｅは、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＣＩ－ＨＳで処理した細胞と比較してＮＦ－ｋＢ標的遺伝子がアップレギュレートされ、オートファジー遺伝子がダウンレギュレートされるとＲＮＡｓｅｑによって明らかになることを実証する各種試験データを示す。（ａ）３人の異なるドナーに由来するｉＲＰＥサンプルのＲＮＡｓｅｑデータのヒートマップから、ＣＩ－ＨＳ及びＣＣ－ＨＳ処理によるサンプルのクラスタリングが明らかになる。（ｂ）上位１０個の経路では、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ対ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥにおいて遺伝子発現パターンが統計的に異なる。（ｃ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥと比較してＮＦ－κＢ標的遺伝子がアップレギュレートされることが、ＲＮＡｓｅｑデータのヒートマップから明らかになる。（ｄ）免疫染色は、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＣＩ－ＨＳで処理した細胞と比較してＮＦ－κＢ標的遺伝子であるＲＥＬＢ（赤）及びＴＲＡＦ３（赤）の発現が増加することを示す。（ｅ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＮＦ－κＢ下流のサイトカインであるＩＬ－１８の頂端及び基底分泌が２倍アップレギュレートされる。 図１２ａ～１２ｆは、アナフィラトキシン補体がｉＲＰＥにおけるオートファジーをダウンレギュレートすることを実証する各種試験データを示す。（ａ、ｂ）ウェスタンブロットは、３人の異なるドナー由来のＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥサンプルにわたってオートファジータンパク質であるＡＴＧ５（ａ）、ＡＴＧ７（ａ）、及びＬＣ３－ＩＩ（ｂ）のレベルが低下することを示す。正規化にはβ－アクチンを使用した。（ｃ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥと比較してオートファジー経路遺伝子の発現が３～６倍減少する。（ｄ）ＴＥＭは、ｉＲＰＥにおいて、ＣＣ－ＨＳ処理ではオートファゴリソソーム（赤色の矢頭）が蓄積することを示す。（ｅ）ウェスタンブロットは、頂端側又は両側をＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥサンプルでのみＬＣ３－ＩＩ発現レベルが低下し、基底側のみを処理した場合には低下しないことを示す。正規化にはβ－アクチンを使用した。（ｆ）ウェスタンブロットは、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ、Ｃ５又はＣ３を枯渇させたヒト血清で処理したｉＲＰＥ、並びにＣＣ－ＨＳ及びＣ５ａＲ１＋Ｃ３ａＲ１受容体ブロッカーで共処理したｉＲＰＥ間でＬＣ３－ＩＩ発現レベルが同様であることを示した。正規化にはβ－アクチンを使用した。（ｇ～ｕ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞における、ＮＦ－ｋＢ経路の時間依存的活性化（ｇ～ｋ）、オートファジーのダウンレギュレーション（１～ｑ）、及びＡＰＯＥ沈着物の形成（ｒ～ｕ）。 図１２ａ～１２ｆは、アナフィラトキシン補体がｉＲＰＥにおけるオートファジーをダウンレギュレートすることを実証する各種試験データを示す。（ａ、ｂ）ウェスタンブロットは、３人の異なるドナー由来のＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥサンプルにわたってオートファジータンパク質であるＡＴＧ５（ａ）、ＡＴＧ７（ａ）、及びＬＣ３－ＩＩ（ｂ）のレベルが低下することを示す。正規化にはβ－アクチンを使用した。（ｃ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥと比較してオートファジー経路遺伝子の発現が３～６倍減少する。（ｄ）ＴＥＭは、ｉＲＰＥにおいて、ＣＣ－ＨＳ処理ではオートファゴリソソーム（赤色の矢頭）が蓄積することを示す。（ｅ）ウェスタンブロットは、頂端側又は両側をＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥサンプルでのみＬＣ３－ＩＩ発現レベルが低下し、基底側のみを処理した場合には低下しないことを示す。正規化にはβ－アクチンを使用した。（ｆ）ウェスタンブロットは、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ、Ｃ５又はＣ３を枯渇させたヒト血清で処理したｉＲＰＥ、並びにＣＣ－ＨＳ及びＣ５ａＲ１＋Ｃ３ａＲ１受容体ブロッカーで共処理したｉＲＰＥ間でＬＣ３－ＩＩ発現レベルが同様であることを示した。正規化にはβ－アクチンを使用した。（ｇ～ｕ）ＣＣ－ＨＳで処理したｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞における、ＮＦ－ｋＢ経路の時間依存的活性化（ｇ～ｋ）、オートファジーのダウンレギュレーション（１～ｑ）、及びＡＰＯＥ沈着物の形成（ｒ～ｕ）。 図１３ａ～１３ｇは、ｉＲＰＥ細胞を用いたタンパク質毒性ハイスループットスクリーニングを実証する各種試験データを示す。（ａ）９６時間では、Ａ２３１８７の３つの濃度（２．５μＭ、１０μＭ、２５μＭ）は全てｉＲＰＥ細胞に対して細胞毒性がある。（ｂ）１０枚のプレート全てにわたる平均相対光強度は、Ａ２３１８７で処理した全てのプレートで同様の結果を示し、これは、異なるプレート間でスクリーニングの再現性があることを示唆している。（ｃ）Ａ２３１８７による細胞殺傷率は、全てのプレートにわたって同程度であるが、９．２μＭの薬物で処理したプレートではわずかに減少しており、これは、このプレートでは細胞が生存していることを示唆する。（ｄ～ｆ）３種の異なるＡ２３１８７濃度（２．５μＭ－ｅ、１０μＭ－ｆ、２５μＭ－ｇ）及び（１０ｐＭ～１０μＭ）の範囲の７種の異なる濃度の薬物を使用した二次スクリーニングのヒートマップ。４つの選択された薬物の応答を強調する。（ｇ）フォローアップスクリーニングでヒットを検証するために一次スクリーニングから４５種の薬物を選択した。７点用量曲線の線形応答及び２つの異なるｉＲＰＥサンプル間の再現性に基づいて、フォローアップスクリーニングで４種の薬物（Ｌ７４５，８７０、ＡＧ－１４７８、リルゾール、及びアミノカプロン酸）を選択した。（ｈ）ＰＣＡプロットは、薬物及びＣＣ－ＨＳ、ＣＣ－ＨＳのみ、並びにＣＩ－ＨＳのみで処理したｉＲＰＥについて別々のクラスタリングを示す。（ｉ、ｊ）３人のドナー及び３つの処理群（ＣＩ－ＨＳ対ＣＣ－ＨＳ、ＣＣ－ＨＳ＋ビヒクル対ＣＣ－ＨＳ＋Ｌ，７４５，８７０又はＡＣＡ）由来のｉＲＰＥについてのＲＮＡ ｓｅｑデータのヒートマップは、薬物及びＣＣ－ＨＳで共処理したサンプルでは、ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルと比較してＮＦ－κＢ経路遺伝子のアップレギュレーションが反転し、オートファジー遺伝子のダウンレギュレーションが反転することを示す。 図１３ａ～１３ｇは、ｉＲＰＥ細胞を用いたタンパク質毒性ハイスループットスクリーニングを実証する各種試験データを示す。（ａ）９６時間では、Ａ２３１８７の３つの濃度（２．５μＭ、１０μＭ、２５μＭ）は全てｉＲＰＥ細胞に対して細胞毒性がある。（ｂ）１０枚のプレート全てにわたる平均相対光強度は、Ａ２３１８７で処理した全てのプレートで同様の結果を示し、これは、異なるプレート間でスクリーニングの再現性があることを示唆している。（ｃ）Ａ２３１８７による細胞殺傷率は、全てのプレートにわたって同程度であるが、９．２μＭの薬物で処理したプレートではわずかに減少しており、これは、このプレートでは細胞が生存していることを示唆する。（ｄ～ｆ）３種の異なるＡ２３１８７濃度（２．５μＭ－ｅ、１０μＭ－ｆ、２５μＭ－ｇ）及び（１０ｐＭ～１０μＭ）の範囲の７種の異なる濃度の薬物を使用した二次スクリーニングのヒートマップ。４つの選択された薬物の応答を強調する。（ｇ）フォローアップスクリーニングでヒットを検証するために一次スクリーニングから４５種の薬物を選択した。７点用量曲線の線形応答及び２つの異なるｉＲＰＥサンプル間の再現性に基づいて、フォローアップスクリーニングで４種の薬物（Ｌ７４５，８７０、ＡＧ－１４７８、リルゾール、及びアミノカプロン酸）を選択した。（ｈ）ＰＣＡプロットは、薬物及びＣＣ－ＨＳ、ＣＣ－ＨＳのみ、並びにＣＩ－ＨＳのみで処理したｉＲＰＥについて別々のクラスタリングを示す。（ｉ、ｊ）３人のドナー及び３つの処理群（ＣＩ－ＨＳ対ＣＣ－ＨＳ、ＣＣ－ＨＳ＋ビヒクル対ＣＣ－ＨＳ＋Ｌ，７４５，８７０又はＡＣＡ）由来のｉＲＰＥについてのＲＮＡ ｓｅｑデータのヒートマップは、薬物及びＣＣ－ＨＳで共処理したサンプルでは、ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルと比較してＮＦ－κＢ経路遺伝子のアップレギュレーションが反転し、オートファジー遺伝子のダウンレギュレーションが反転することを示す。 図１４ａ～１４ｉは、患者特異的ｉＰＳＣ－ＲＰＥが疾患の原因となる変異を保持していたことを実証する各種試験データを示す。（ａ）サンガー配列解析により、Ｌ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣにＳ１６３Ｒ変異が存在することが確認される。配列を上に示し、変異によって影響を受けた塩基を配列クロマトグラムにおいて黒い矢印で示す。ヘテロ接合性点変異（ＡＧＣ→ＡＧＣ、ＡＧＧ）は、ピーク内にピークとして現れる。ＤＮＡサンガーシークエンス用のプライマーについては、方法に記載する。（ｂ）指定のＲＰＥシグネチャー遺伝子のデルタＣｔ値のボックスプロット図。各ボックスは、少なくとも２人の異なる非罹患同胞又はＬ－ＯＲＤ患者ドナーからのｎ＝３のｉＰＳＣ－ＲＰＥから測定されたデルタＣｔの分布を表す。ボックスの底部及び頂部は、１０パーセンタイル及び９０パーセンタイルを規定する。ボックス内のバンドは、中央値を規定する。（ｃ）連続７日間にわたって視細胞外節を与えたｉＰＳＣ－ＲＰＥ単層の透過型電子顕微鏡写真。正常なＲＰＥの形態と、大量の頂端突起（黄色の矢印）、メラノソーム（マゼンタの矢印）、及び基底に局在する核（白色の矢印）を含む高度に分極した構造とを示す、非罹患同胞（上）及び患者（下）由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥのＴＥＭ。スケールバー：２μｍ。（ｄ）保持された六角形の形態及び大量の頂端突起を示す、非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥのＳＥＭ画像。（ｅ）非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥの細胞面積のボックスプロット。ｉＰＳＣ－ＲＰＥ単層を膜マーカー（ＡＤＩＰＯＲ１）で免疫染色して、細胞形態のマルチパラメトリック解析のために六角形状の輪郭を描いた。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、非罹患同胞（７９．８＋／－５７．５μｍ２）と比較して、平均サイズが大きく（１０７．７＋／－６８．５μｍ２）、より多様である傾向があった（ｐ＝０．００００２６）。同様の空間的不規則性は、ヒトＡＭＤドナーの眼でも報告されている。（ｆ）ＥＶＯＭ上皮電圧抵抗計（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いた経上皮抵抗測定によって、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞間の機能的密着接合の確立を測定した。疾患に関連するミスセンス変異は、ＲＰＥ単層の経上皮抵抗を変化させない。（ｇ）脱分化（上皮間葉転換）を受けるＲＰＥ細胞に多く存在する遺伝子の散布図から、Ｌ－ＯＲＤ患者細胞は、正常条件下では、ＲＰＥが罹病しているか又はストレスを受けたことを示唆する異常な表現型を示さないことが明らかになった。非供給（灰色で示す）患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおける脱分化（ＥＭＴ）関連遺伝子の発現は、非供給非罹患同胞の発現パターンに類似している。（ｈ）通常の培養条件に供された非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、同様のレベルのＡＰＯＥ基底沈着物を示す。スケールバー：５０μｍ。（ｉ）正常酸素圧条件下でｉＰＳＣ－ＲＰＥによって上清に放出されるＶＥＧＦをＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＲＰＥの高度に分極した構造は、ＶＥＧＦを含むタンパク質の方向性輸送及び分泌に関与している。当然ながら、非罹患同胞に由来するｉＰＳＣ－ＲＰＥ（灰色で示す）は、分極した様式でＶＥＧＦを主に基底に分泌した。Ｌ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、極性を失い、基底ＶＥＧＦ分泌が約５３．３％減少した（Ｐ＝０．０４６）。 図１５ａ～１５ｈは、Ｌ－ＯＲＤ患者由来のＲＰＥにおけるＣＴＲＰ５の発現及び局在を実証する各種試験データを示す。（ａ）Ｌ－ＯＲＤでは、Ｓ１６３Ｒ変異は、ＣＴＲＰ５（分泌タンパク質）及び膜ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＭＦＲＰ）をコードしてるバイシストロン性転写物に生じる。この変異は、いずれの転写物のｍＲＮＡ発現も変化させない。（ｂ）非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥからの細胞溶解物の代表的なウェスタンブロット。ＣＴＲＰ５は分泌タンパク質であるので、非罹患同胞における濃い２５ｋＤａのバンド（ＣＴＲＰ５）は、ＣＴＲＰ５が全細胞抽出物においてより多く保持されていることを示している可能性がある。（ｃ）β－アクチンに対して正規化したウエスタンブロット（細胞溶解物）の定量（ｐ＜０．０５）。（ｄ）非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者からのｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、４８時間後にＥＬＩＳＡによって測定したとき、ＣＴＲＰ５は頂端側に選択的に分泌されていた。非罹患同胞及び患者による分泌量の間に測定可能な差は認められなかった。基底培地ではごく微量のＣＴＲＰ５しか検出されなかった（データは示さない）。（ｅ）非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者からのｉＰＳＣ－ＲＰＥの免疫蛍光染色のＡｉｒｙｓｃａｎ共焦点顕微鏡画像。膜受容体ＡＤＩＰＯＲ１（緑で示す）は、ＣＴＲＰ５（赤で示す）、ＨＯＥＳＣＨＴ（核染色を青で示す）と共局在している。（ｆ）ネイティブ免疫標識ＡＤＩＰＯＲ１（６ｎｍ免疫金）及びＣＴＲＰ５（１２ｎｍ免疫金）のＴＥＭ画像から、受容体－リガンド相互作用（黒矢印で示す）のエビデンスが得られる。（ｇ）公開されている結晶構造を用いたＡＤＩＰＯＲ１（青で示す）とＣＴＲＰ５（緑で示す）との間のタンパク質－タンパク質相互作用の３次元モデル。（ｈ）セリン（極性）がアルゲニン（＋）に変異すると、残基の電荷が正に変化する。この正電荷は隣接するアルゲニン残基と反発すると予測され、その結果、高次構造が変化して変異型ＣＴＲＰ５のＡＤＩＰＯＲ１への結合親和性が低下する。 図１６ａ～１６ｆは、ＡＤＩＰＯＲ１に対するＣＴＲＰ５の拮抗作用が低下すると、Ｌ－ＯＲＤにおけるＡＭＰＫシグナル伝達が変化することを実証する各種試験データを示す。（ａ）ＥＬＩＳＡによって測定したホスホ－ＡＭＰＫレベルは、５％血清含有培地で培養したＬ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｎ＝１５；（１２０．６％±０．０７５））におけるベースライン活性が、非罹患同胞（Ｎ＝２１；１００％±０．０４）と比べて約２０．６％増加することを示す。（ｂ）アディポネクチンを含有する血清の存在下及び非存在下における組み換え型球状ＣＴＲＰ５のホスホ－ＡＭＰＫレベルに対する影響。データは、未処理状態（０ｕｇ／ｍＬ ｇＣＴＲＰ５）に対して正規化する。非罹患同胞では、天然リガンドであるアディポネクチンの非存在下（０％血清条件下）で０．２μｇ／ｍＬの組み換え型球状ＣＴＲＰ５を添加すると、ｐＡＭＰＫレベルが２０％低下することが明らかになった（Ｎ＝９；０．８１±０．０４）。この有意な減少は、ベースライン条件下では５％血清の存在によってマスクされる（Ｎ＝６；０．９９±０．０１）。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、０．２μｇ／ｍＬの組み換え型球状ＣＴＲＰ５の添加は、血清の非存在下（Ｎ＝６；０．９８±０１）でさえも、ｐ－ＡＭＰＫレベル（Ｎ＝６；１．１２±０．０９）に対して測定可能な影響を有しない。（ｃ）ｉＰＳＣ－ＲＰＥ由来のｐ－ＡＭＰＫレベルに対する組み換え型完全長ＣＴＲＰ５の用量応答効果。非罹患同胞（５ｈ ０％血清）では、組み換え型完全長ＣＴＲＰ５の濃度が増加するにつれて、処理（３０分）後にＡＭＰＫのリン酸化レベルが低下する。２５ｕｇ／ｍＬ ＣＴＲＰ５は、ｐ－ＡＭＰＫレベルを約５０％低下させる（Ｎ＝６、４７．８９％±０．１３）。患者のＲＰＥを同様の濃度の完全長ＣＴＲＰ５に曝露しても、ｐ－ＡＭＰＫレベルの測定可能な変化は誘発されなかった。（ｄ）血清の非存在下においてＡＭＰ：ＡＴＰ比を上昇させる条件では、非罹患同胞と比較して患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるｐ－ＡＭＰＫレベルが変化する。全てのデータは、０％血清含有条件に対して正規化する。２ｍＭのＡＭＰアナログであるＡＩＣＡＲ又は５００ｎＭのＡＴＰ産生を減少させるミトコンドリアアンカップラーであるＢＡＭ１５で３０分間処理すると、非罹患同胞ではＡＭＰＫレベルが更に上昇する。対照的に、患者ＲＰＥのｐ－ＡＭＰＫレベルは、ＡＭＰ又はＡＴＰのレベルの変化に対して非感受性である。しかし、３ｍＭメトホルミンで２週間処理すると、Ｌ－ＯＲＤ患者のＡＭＰ：ＡＴＰ比の変化に対する感受性が回復する。（ｅ）Ｌ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥでＡＭＰＫが上昇すると、ＰＥＤＦ－ＲのｍＲＮＡの発現が有意にアップレギュレートされる（約８倍）。（ｆ）免疫組織化学的検査によって、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、頂端膜に局在するＰＥＤＦ－Ｒタンパク質の発現上昇が確認された。 図１７ａ～１７ｆは、Ｌ－ＯＲＤ患者における脂質代謝の変化が神経保護シグナル伝達の減少の原因となることを実証する各種試験データを示す。（ａ）脂質リッチな外節が貪食細胞によって取り込まれ、ホスホリパーゼによって遊離脂肪酸に消化され、それをＲＰＥがケトン体生成及びＮＰＤ１等の神経保護脂質メディエーターの合成に利用する様子を描写した推定モデル。ヒトがん細胞株では、ｐ－ＡＭＰＫレベルが上昇すると、ホスホリパーゼＤ活性が抑制されることが示されており、Ｌ－ＯＲＤ患者において脂質取り込みが増加すると、ＤＨＡ由来のニューロプロテクチンＤ１の利用及び合成が減少し、未消化脂質が蓄積するという機序が提案されている。（ｂ）ｐｈ－Ｒｈｏｄｏで標識した外節の取り込みをＦＡＣＳによって定量して、非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者に由来するｉＰＳＣ－ＲＰＥの貪食率を比較した。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｎ＝１４；１１．８１±３．５５）の貪食による取り込みは、非罹患同胞（Ｎ＝１５；７．８６±３．９４）よりも３３％高かった。この脂質取り込みが増加する現象は、酸化ストレスに対する保護応答としてＲＰＥで報告されている。（ｃ、ｄ）全体的なＰＥＤＦ－Ｒの発現が有意に増加したにもかかわらず、Ｌ－ＯＲＤ患者のホスホリパーゼＡ２活性は、ＥＬＩＳＡによって非罹患同胞よりも４０％低いと測定された。（ｅ）ホスホリパーゼＡ２活性は、ｐＡＭＰＫレベルの上昇（ｎ＝６、血清飢餓により誘導）を受けた正常ｉＰＳＣ－ＲＰＥ（ｎ＝６）では有意に低下（約２６％）することが示される（ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＰＥＤＦの分極分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｌ－ＯＲＤ患者（Ｎ＝ｌ２）は、ＰＥＤＦの頂端分泌の減少（患者：９３９．６ｎｇ／ｍＬ／同胞：１２７７．２２ｎｇ／ｍＬ）及び基底分泌の増加（患者：９２．１６ｎｇ／ｍＬ／同胞：７５．９６ｎｇ／ｍＬ）を示し、その結果、ＰＥＤＦ比（Ａｐ／Ｂａ）（１０．１３±１．６３）が非罹患同胞（Ｎ＝１２、１９．８２±３．６７）と比べて有意に低下した（ｐ＝０．００１４）。データは、平均±ＳＥであり、３回の独立した実験の平均を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。ｆ）頂端分泌されたＤＨＡ由来の神経保護Ｄ１を、タンデム質量分析リピドミクス解析によって測定した。６日間かけて収集し、プールした非罹患同胞（Ｚ８：ｎ＝１２、９ｉ：ｎ＝１２）は、Ｌ－ＯＲＤ患者（Ｋ８：ｎ＝１２、Ｅ１：ｎ＝１２）よりも約１０倍多いＮＰＤ１を分泌した（ｐ＝０．００８９）。 図１８ａ～１８ｈは、Ｌ－ＯＲＤ患者のＲＰＥの上皮間葉転換に対する感受性の増加を実証する各種試験データを示す。（ａ、ｂ）６３倍の対物レンズを用いて全ての画像を撮影した。スケールバー＝２０μｍ。ｂ）以下の条件下で撮影した画像をシェイプメトリクス解析に供して、細胞面積の分布のボックスプロットを構築した（下側ひげ：データの５％、下側ヒンジ：データの２５％、中央線：中央値、上側ヒンジ：データの７５％、上側ひげ：データの９５％）。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｎ＝６画像、１３５．３７±１．７６μｍ）は、非罹患同胞（Ｎ＝５、９５．７７±１．６８μｍ）と比較して、細胞サイズ及びばらつきが大きい（ｐ＜２Ｅ－１６）。非罹患同胞では、視細胞供給中にメトホルミン処理を開始しても、未処理の非罹患同胞と比較して細胞面積（Ｎ＝７、９３．１４±１．５６μｍ）に非常に小さな影響しか与えなかった（ｐ＝０．５２）。しかし、３ｍＭのメトホルミンで処理した結果、患者の細胞面積（Ｎ＝７、１１７．９２±０．９６μｍ）は未処理の患者と比べて有意に減少した（ｐ＜２Ｅ－１６）。ダネットの多重比較検定を実施して、未処理の非罹患同胞又はＬ－ＯＲＤ患者のいずれかと比較した。（ｃ）７日間ＰＯＳを供給した後のｉＰＳＣ－ＲＰＥ単層のＡＰＯＥ染色された凍結切片の免疫蛍光顕微鏡写真。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、頂端及び基底のＡＰＯＥ沈着物（白色の矢印）の相対的比率が変化した。ＰＯＳ供給中にメトホルミンで処理されたＬ－ＯＲＤ患者では、頂端及び基底のＡＰＯＥ沈着物（黄色の矢印）の相対的比率が分配し直され、非罹患同胞に類似するようになった。（ｄ）ｃ）に示した画像と同様の画像のＡＰＯＥシグナルの積算密度の画像定量化。ＡＰＯＥシグナルの積算密度は、未処理のＬ－ＯＲＤ患者（Ｎ＝５；頂端：１８５．６９±５．４２；基底：４６．３８±２．５１）では、非罹患同胞（Ｎ＝４；頂端３０．８９±１２．０５；基底：８．４５±３．０９）と比較して有意に高い（頂端：ｐ＝７．７６Ｅ－６；基底：ｐ＝２．７１Ｅ－５）。メトホルミン処理された非罹患同胞（Ｎ＝８；頂端１１９．９８±２０．３６；基底：２３．５５±６．１７）と比較して、メトホルミン処理されたＬ－ＯＲＤ患者（Ｎ＝４；頂端７９．３０±３７．５１；基底：１３．５８±４．５８）との間に有意な差はなかった（頂端：ｐ＝０．３２；基底：ｐ＝０．３２）。画像は全て２０倍で撮影した。スケールバー＝５０μｍ。（ｆ）低酸素条件下（６時間）でのＶＥＧＦ分泌のＥＬＩＳＡ測定は、加齢性黄斑変性の病態生理に関与している脈絡膜血流の減少に類似しており、低酸素が駆動するＥＭＴに対するＬ－ＯＲＤのｉＰＳＣ－ＲＰＥの敏感性を決定する代謝性ストレス要因として機能する。図１ｉ）に示した正常酸素条件と同様に、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｎ＝１０；Ａｐ：１．８９±０．３０；Ｂａ：１．８±０．２４）は、非罹患同胞（Ｎ＝９；Ａｐ：０．７８±０．１６；Ｂａ：１．５９±０．３６）に比べて非分極的にＶＥＧＦを分泌する（Ａｐ：ｐ＝０．００５；Ｂａ：ｐ＝０．６３）。メトホルミンで前処理（２週間）すると、Ｌ－ＯＤ患者のＲＰＥ（Ｎ＝６、Ａｐ：０．５９±０．０９；Ｂａ：１．８±０．２４）は低酸素が駆動するＥＭＴから保護され、頂端／基底ＶＥＧＦ極性が未処理又はメトホルミン処理した非罹患同胞（Ｎ＝９、Ａｐ：０．９８±０．１６；Ｂａ：１．６４±０．３３）に近い状態に回復する（Ａｐ：ｐ＝０．０９；Ｂａ：ｐ＝０．６４）。（ｇ）非罹患同胞と比較した、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおける脱分化（ＥＭＴ）関連遺伝子の発現に対するＰＯＳ供給の効果。７日間ＰＯＳを供給すると（白色で示す）、非罹患同胞と比較してＬ－ＯＲＤ患者におけるＥＭＴ関連遺伝子の発現が増加する。７日間のＰＯＳ供給中にメトホルミン処理すると（赤色で示す）、ＥＭＴ関連遺伝子の発現が抑制される。破線は４倍の差を示す。ハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ及びＧＡＰＤＨ。（ｈ）メトホルミンが非滲出性加齢性黄斑変性の発症年齢を遅らせることを明らかにする後向き臨床研究の結果の表（３６２．５１／Ｈ３５．３１）。５０～５９歳の患者では、メトホルミンは発症年齢を５６歳（ｎ＝１５７、メトホルミンなし）から５８．５歳（ｎ＝１６、メトホルミンあり）に遅らせる（ｐ＝０．００１）。 図１９は、Ｌ－ＯＲＤ患者の遺伝子発現プロファイルが、ベースライン時のｐＡＭＰＫの活性化を制限する代償的な試みを示唆していることを実証するデータを示す。 図２０は、正常酸素圧下でメトホルミンがＬ－ＯＲＤ患者のＲＰＥにおけるＶＥＧＦの誤分極分泌を回復させることを実証するデータを示す。 図２１は、メトホルミン処理により、ＲＰＥによるベータ－ヒドロキシブチレートの頂端分泌が増加することを実証するデータを示す。 図２２ａ～２２ｂは、インビボにおけるＲＰＥ－ＥＭＴ及びＲＰＥ脱分化の特徴を模倣した機械的網膜損傷モデルを示す。 図２２ａ～２２ｂは、インビボにおけるＲＰＥ－ＥＭＴ及びＲＰＥ脱分化の特徴を模倣した機械的網膜損傷モデルを示す。 図２３ａ～２３ｂは、Ｎｏｘ４が無傷のＲＰＥに存在し、損傷したＲＰＥで高発現することを示すデータを示す。 図２３ａ～２３ｂは、Ｎｏｘ４が無傷のＲＰＥに存在し、損傷したＲＰＥで高発現することを示すデータを示す。 図２４は、ＮＯＸ４がＥＭＴマーカーとして知られている細胞骨格タンパク質と共局在することを実証するデータを示す。 図２５は、ＶＡＳ２８７０を用いてＮＯＸ４を薬理学的に阻害すると、ＥＭＴマーカーであるＳＭＡがダウンレギュレートされることを実証するデータを示す。 図２６Ａ～２６Ｃは、ｓｈＲＮＡを用いたＮＯＸ４のノックダウンを示すデータを示す。 図２６Ａ～２６Ｃは、ｓｈＲＮＡを用いたＮＯＸ４のノックダウンを示すデータを示す。 図２６Ａ～２６Ｃは、ｓｈＲＮＡを用いたＮＯＸ４のノックダウンを示すデータを示す。 図２７は、ｓｈＲＮＡを用いてＮＯＸ４をダウンレギュレートすると、損傷したＲＰＥにおける細胞遊走が減少することを示すデータを示す。 図２８Ａ～２８Ｃは、ｓｈＲＮＡを用いてＮＯＸ４をダウンレギュレートすると、ＥＭＴマーカーであるＺＥＢ１がダウンレギュレートされることを示すデータを示す。 図２８Ａ～２８Ｃは、ｓｈＲＮＡを用いてＮＯＸ４をダウンレギュレートすると、ＥＭＴマーカーであるＺＥＢ１がダウンレギュレートされることを示すデータを示す。 図２８Ａ～２８Ｃは、ｓｈＲＮＡを用いてＮＯＸ４をダウンレギュレートすると、ＥＭＴマーカーであるＺＥＢ１がダウンレギュレートされることを示すデータを示す。 図２９Ａ～２９Ｃは、ＮＯＸ４ ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子が、傷のついたＲＰＥにおいてネスチンを成功裏にダウンレギュレートすることを示すデータを示す。 図２９Ａ～２９Ｃは、ＮＯＸ４ ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子が、傷のついたＲＰＥにおいてネスチンを成功裏にダウンレギュレートすることを示すデータを示す。 図２９Ａ～２９Ｃは、ＮＯＸ４ ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子が、傷のついたＲＰＥにおいてネスチンを成功裏にダウンレギュレートすることを示すデータを示す。 図３０Ａ～３０Ｂは、ＮＯＸ４がＥＭＴマーカーの発現を有効にダウンレギュレートすることを示すデータを示す。 図３０Ａ～３０Ｂは、ＮＯＸ４がＥＭＴマーカーの発現を有効にダウンレギュレートすることを示すデータを示す。 図３１Ａ～３１Ｃは、ＲＰＥ細胞におけるＡＢＣＡ４の局在を示すデータを示す。Ａ：ＡＢＣＡ４のウェスタンブロット解析により、それが膜に局在することが確認される。ヒト初代（ｈｐ）ＲＰＥ、対照ｉＰＳＣ－ＲＰＥ、及び線維芽細胞（陰性対照）からの膜画分（Ｍ）及び細胞質画分（Ｃ）。Ｎａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅは、ＲＰＥ細胞における頂端膜タンパク質である。Ｂ：ＲＰＥ膜におけるＡＢＣＡ４及びＮａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅの共局在。Ｃ：ＲＰＥ細胞の正射影により、ＡＢＣＡ４及びＮａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅが頂端に共局在することが確認される。 図３２Ａ～３２Ｏは、シュタルガルトｉＲＰＥの特徴を示すデータを示す。Ａ～Ｂ：ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ａ）及びウェスタンブロット（Ｂ）によって、ｉＲＰＥ（ＡＢＣＡ４－／－由来、Ｃ１及びＣ２）にＡＢＣＡ４発現が存在しないことが分かる。ｉＰＳＣ－陰性対照（Ａ、Ｂ）、サル網膜－陽性対照（Ｂ）、対照１－ＡＢＣＡ４－／－ｉＲＰＥの同質遺伝子対照。Ｃ：サンガーシーケンシングにより、患者のｉＲＰＥに変異が存在することが確認される（６０８８ｂｐ位のエクソン４４におけるＣ＞Ｔ）。Ｄ～Ｅ：ｄｄ－ＰＣＲ（Ｄ）及びウェスタンブロット解析（Ｅ）による患者ｉＲＰＥにおけるＡＢＣＡ４の発現。Ｆ～Ｉ：対照及びシュタルガルトｉＲＰＥ単層膜のＴＥＭ画像は、頂端突起、頂端に位置するメラノソーム、密着接合、基底に位置する核を有する分極ＲＰＥを示す。健常ＲＰＥには、ＡＢＣＡ４－／－クローンに対する同質遺伝子対照１及び患者ｉＲＰＥに対する対照２（非罹患非罹患同胞）が含まれる。Ｏ：成熟ＲＰＥマーカーの免疫染色は、－／－ｉＲＰＥ及び対照細胞の発現が同様であることを示す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。 図３３Ａ～３３Ｎは、シュタルガルトｉＲＰＥで再現されたシュタルガルトの病態生理を示すデータを示す。Ａ～Ｇ：野生型ＰＯＳを供給したシュタルガルトｉＲＰＥは、脂質沈着物の増加（２～３倍）を示す。非供給（Ａ～Ｃ）及びＰＯＳ供給（Ｄ～Ｆ）におけるＲＰＥ内／下ボディパイ陽性沈着物の比較解析。シュタルガルトｉＲＰＥは、ＰＯＳに曝露されている間セラミド蓄積量の増加（２～３倍）を示した（Ｊ～Ｌ）。Ｇ：対照ｉＲＰＥと比較した、シュタルガルト－ｉＲＰＥにおける脂質沈着物（Ｍ）及びセラミド蓄積（Ｎ）の定量的解析。ここに提示される対照データ点は、ＡＢＣＡ４－／－クローンに対する同質遺伝子対照１及び患者に対する対照２からのｉＲＰＥの平均である。ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 図３４Ａ～３４Ｎは、補体ストレス下でのＡＢＣＡ４脂質ハンドリングにおけるＡＢＣＡ１ ＫＯの効果；ＡＢＣＡ１ ＫＤシュタルガルトｉＲＰＥにおける細胞内／下の脂質蓄積；及びＡＢＣＡ１の活性化によるシュタルガルトＲＰＥの脂質蓄積欠陥の回復を示すデータを示す。ＣＩ－ＨＳ（Ａ～Ｃ）及びＣＣ－ＨＳ（Ｄ～Ｆ）で処理したｉＲＰＥ細胞におけるボディパイ脂質陽性沈着物の画像。Ｇ：ＲＰＥ内／下の脂質陽性沈着物の定量的解析。健常ｉＲＰＥと比較して、シュタルガルトｉＲＰＥは、ボディパイ染色が２増加することを示す（ｐ．ｎｓ）。ＣＣ－ＨＳ（Ｈ－Ｊ）及びＣＣ－ＨＳ＋ＧＷ３９６５（Ｋ～Ｍ）で処理したｉＲＰＥ細胞のＲＰＥ内／下のボディパイ陽性沈着物の画像。１０μＭのＧＷ３９６５（ＡＢＣＡ１活性化剤）で処理したとき図Ｋ～Ｌで脂質沈着物が減少したことに留意すべきである。Ｎ：ＲＰＥ内／下のボディパイ陽性沈着物の定量的解析により、シュタルガルトｉＲＰＥにおける有意な減少が確認される。ここに提示される対照データ点は、ＡＢＣＡ４－／－クローンに対する同質遺伝子対照１及び患者に対する対照２（非罹患非罹患同胞）からのｉＲＰＥの平均である。ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 図３５Ａ～３５Ｂは、シュタルガルトｉＲＰＥ細胞におけるＰＯＳ消化の欠陥を実証するデータを示す。Ａ：シュタルガルト－ｉＲＰＥにおけるＰＯＳのクリアランスの欠陥及びリポフスチン様蓄積。フローサイトメトリーに基づく貪食アッセイにより、４時間目のシュタルガルト－ｉＲＰＥにおけるＰＯＳの取り込みは健常ｉＲＰＥと同様であることが明らかになる。Ｂ：シュタルガルト－ｉＲＰＥにおける消化率の低下。細胞にｐＨｒｄｈｏで標識されたＰＯＳを４時間供給し、４時間ＰＯＳで処理した後に培地で洗浄し、フローサイトメトリー解析用に４時間目及び２４時間目に回収した。健常ＲＰＥには、ＡＢＣＡ４－／－クローンに対する同質遺伝子対照１及び患者ｉＲＰＥに対する対照２が含まれる。＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図３６Ａ～３６Ｃは、メトホルミン処理が疾患表現型を寛解させることを実証するデータを示す。Ａ：シュタルガルトｉＲＰＥ細胞におけるセラミド発現を定量的に解析したところ、メトホルミンで処理したＰＯＳを供給したシュタルガルトｉＲＰＥにおいてセラミドの蓄積が劇的に減少することが示された。ここで提示される対照データ点は、ＡＢＣＡ４－／－クローンに対する同質遺伝子対照１及び患者Ｂに対する対照２からのｉＲＰＥの平均値である。Ｂ：メトホルミンで処理したＡｂｃａ４－／－マウスのボディパイで染色したＲＰＥ／脈絡膜のフラットマウント画像における脂質分布。Ｃ：脂質染色を定量することにより、メトホルミン処理したＡＢＣＡ４ ＫＯマウスでは沈着物が減少することが確認される。（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
以下は、本開示の実施において当業者を支援するために提供される詳細な説明である。当業者は、本開示の趣旨又は範囲から逸脱することなく本明細書に記載する実施形態において修正及び変更を行うことができる。本明細書において言及する全ての刊行物、特許出願、特許、図面、及び他の参照文献は、その全体が参照により明示的に援用される。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本開示を限定することを意図するものではない。
ある範囲の値が提供される場合、文脈において特に明確な規定がない限り（例えば、その範囲内の各炭素原子数が提供される、ある数の炭素原子を含有する基の場合）、その範囲の上限値と下限値の間にある、下限値の単位の１０分の１までの各介在値、及び指定の範囲内の任意の他の指定値又は介在値が本開示に包含されることが理解される。より小さな範囲に独立に含まれ得る、これらより小さな範囲の上限値及び下限値も本開示に包含されるが、ただし、指定の範囲内の任意の具体的に除外される限定に従う。指定の範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、これらの含まれる限界値のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
本明細書における詳細な説明及び特許請求の範囲内の全ての数値は、指定の値が「約」又は「およそ」によって修飾されており、当業者が予測する実験誤差及び変動を考慮に入れている。
本開示を説明するために以下の用語を使用する。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本開示を限定することを意図するものではない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、文脈において特に明確な規定がない限り、本明細書では、１つの又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）これら冠詞の文法上の目的語を指すために使用される。一例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。
語句「及び／又は」は、明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、このように等位結合される要素の「いずれか又は両方」を意味する、すなわち、一部の場合には連言的に存在し、そして、他の場合には選言的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」を用いて列挙される複数の要素も同様に、すなわち、このように等位結合される要素のうちの「１つ以上」であると解釈されるべきである。場合により、具体的に特定される要素と関連していようといまいと、「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が存在していてもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」に対する言及は、「含む」等のオープンエンドな言語と併用されたとき、一実施形態では、Ａのみ（場合によりＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（場合によりＡ以外の要素を含む）；更に別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（場合により他の要素を含む）等を指し得る。
明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「又は」は、上に定義した「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離するとき、「又は」又は「及び／又は」は、包含的であると解釈されるものとし、すなわち、多数の要素又は要素のリストのうちの少なくとも１つを含むだけでなく、１つ超も含み、そして、場合により追加の列挙されていない項目も含む。明らかに逆の意味を示す用語、例えば、「１つだけ」若しくは「正確に１つ」、又は特許請求の範囲で用いられるときの「からなる」のみが、多数の要素又は要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般的に、用語「又は」は、本明細書で使用するとき、「いずれか」、「１つ」、「１つだけ」、又は「正確に１つ」等の排他的な用語が前に記載されているとき、排他的選択肢（すなわち、「一方又は他方であるが両方ではない」）を示すとしか解釈されないものとする。
特許請求の範囲、並びに上記明細書では、全ての移行句、例えば、「含む」、「包含する」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「で構成される」等は、オープンエンドである、すなわち、含むがそれらに限定されないことを意味すると理解されるべきである。Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１１１．０３に記載の通り、移行句「からなる」及び「から本質的になる」のみが、それぞれ、クローズド又はセミクローズドな移行句であるものとする。特に「から本質的になる」に関して、「から本質的になる」は、本発明の化合物又は治療に重大な影響を与えることのない追加の成分に対してオープンエンドであるものとし、本発明の化合物を劣化させたり、その他の方法で本発明の化合物を動作不能にしたりする、本明細書に記載の治療における本発明の化合物の有効性を低下させる、又は本明細書に記載の治療の目的に反する有害な副作用を誘導する任意の追加の成分は除外するものとする。
明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、１つ以上の要素のリストを参照する語句「少なくとも１つ」は、要素のリスト内の要素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されているそれぞれの及び全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むものではなく、そして、要素のリスト内の要素の任意の組合せを除外するものでもないと理解されるべきである。また、この定義は、具体的に特定される要素に関連していようといまいと、語句「少なくとも１つの」が参照する要素のリスト内において具体的に特定される要素以外の要素が場合により存在し得ることを許容する。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は等価に「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は等価に「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ（場合により１つを超えるを含む）のＡが存在するが、Ｂは存在しない（そして、場合によりＢ以外の要素を含む）ことを指す場合もあり；別の実施形態では、少なくとも１つ（場合により１つを超えるを含む）のＢが存在するが、Ａは存在しない（そして、場合によりＡ以外の要素を含む）ことを指す場合もあり；更に別の実施形態では、少なくとも１つ（場合により１つを超えるを含む）のＡ及び少なくとも１つ（場合により１つを超えるを含む）のＢが存在する（そして、場合により他の要素を含む）ことを指す場合もある。
また、１つを超える工程又は行為を含む本明細書に記載する特定の方法では、該方法の工程又は行為の順序は、文脈上特に指定しない限り、必ずしも該方法の工程又は行為が列挙されている順序に限定されるものではないことを理解すべきである。
用語「共投与」及び「共投与する」又は「併用療法」は、ある程度、好ましくは有効量の治療剤が同時に患者内に存在する限り、同時投与（２つ以上の治療剤を同時に投与する）及び時差投与（追加の治療剤（複数可）の投与時点とは異なる時点で１つ以上の治療剤を投与する）の両方を指す。特定の好ましい態様では、本明細書に記載される本化合物のうちの１つ以上を、特に、上皮成長因子受容体を標的とする化学療法又は生物学的療法等の抗がん剤を含む少なくとも１つの追加の生物活性剤（例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、オシメルチニブ、又はこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つ等の上皮成長因子受容体阻害剤）と併用して共投与する。特に好ましい態様では、化合物の共投与によって、相乗的活性及び／又は療法（抗がん活性を含む）が得られる。
用語「化合物」とは、本明細書で使用するとき、特に指定しない限り、本明細書に開示する任意の特定の化学化合物を指し、そして、その互変異性体、位置異性体、幾何異性体、そして、適用可能な場合、光学異性体（鏡像異性体）及び他の立体異性体（ジアステレオマー）を含む立体異性体に加えて、文脈上適用可能な場合、その薬学的に許容し得る塩及び誘導体（プロドラッグ及び／又は重水素化形態を含む）を含む。企図される重水素化低分子とは、薬物分子に含有される水素原子のうちの１つ以上が重水素によって置換されているものである。
文脈におけるその使用において、化合物という用語は、一般的に、単一の化合物を指すだけでなく、立体異性体、位置異性体、及び／又は光学異性体（ラセミ混合物を含む）等の他の化合物、並びに開示する化合物の特定の鏡像異性体又は鏡像異性的に濃縮された混合物も含み得る。この用語は、文脈の中で、活性部位への化合物の投与及び送達を促進するように修飾されている化合物のプロドラッグ形態も指す。本化合物の説明においては、多数の置換基及び特にそれに関連する変数が記載されることに留意する。概して以下に記載する通り、本明細書に記載する分子は安定な化合物であることが当業者には理解される。結合が図示されているとき、二重結合及び単結合はいずれも、図示された化合物及び原子価の相互作用についての周知のルールの枠内で表されるか又は理解される。
用語「患者」又は「被験体」は、明細書全体を通して、本開示に係る組成物による処置（予防的処置を含む）が提供される動物、好ましくはヒト又はペットについて説明するために用いられる。ヒト患者等の特定の動物に特異的な感染症、病態、又は疾患状態の処置については、患者という用語は、イヌ若しくはネコ等のペット又はウマ、ウシ、ヒツジ等の家畜を含む特定の動物を指す。一般的に、本開示では、患者という用語は、特に指定しない限り又はこの用語の使用状況から暗示されない限り、ヒト患者を指す。
用語「有効」とは、その意図される用途の枠内で使用したときに意図される結果をもたらす化合物、組成物、又は成分の量について説明するために使用される。有効という用語は、本願に別途記載又は使用される他の有効量又は有効濃度の用語を全て包含する。
治療化合物
本発明は、網膜色素上皮の形態、及び状態、生存率、機能性を改善する、遺伝子又はタンパク質又は組織のｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡ又は長鎖非コードＲＮＡの発現を調節することができる化合物を提供する。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ４（Ｎｏｘ４）の機能及び／若しくは発現を阻害するか、又はラジカル酸素種の形成を阻害する化合物である。ＮｏｘファミリーのＮＡＤＰＨオキシダーゼは、ＮＡＤＰＨから分子状０２への電子伝達を触媒することによってＲＯＳを生成することがその唯一の既知の機能である酵素群である。触媒サブユニットＮｏｘの遺伝子は、げっ歯類では４つ（Ｎｏｘ１～４）同定されており、それぞれ組織特異的に発現し、細胞内シグナル伝達において異なる機能を有する（Ｌａｍｂｅｔｈ，２００４；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｉｅｎｄｌｉｎｇ，２００９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、セリンプロテアーゼ、ドーパミン受容体、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ、ＣＤＣ４２、及び／若しくはＲＡＣ１、又はこれらの組み合わせの発現を調節する化合物である。
特定の他の実施形態では、本発明の化合物は、ＡＭＰＫを制御する化合物である。
更に他の実施形態では、本発明の化合物は、ＲＰＥ上皮間葉転換又はＲＰＥ脱分化を調節する。
ＮＦ－κＢ（核因子活性化Ｂ細胞のカッパ軽鎖エンハンサー）は、ＤＮＡの転写、サイトカインの産生、及び細胞の生存を管理するタンパク質複合体である。ＮＦ－κＢは、ほぼ全ての動物細胞型にみられ、ストレス、サイトカイン、フリーラジカル、重金属、紫外線照射、酸化ＬＤＬ、及び細菌又はウイルスの抗原等の刺激に対する細胞応答に関与している。ＮＦ－κＢは、感染に対する免疫応答の制御において重要な役割を果たす。ＮＦ－κＢの不適当な制御は、がん、炎症及び自己免疫疾患、敗血症性ショック、ウイルス感染、並びに不適切な免疫発達に関係している。また、ＮＦ－κＢはシナプス可塑性及び記憶のプロセスにも関与している。
ｍＴＯＲは、タンパク質キナーゼのホスファチジルイノシトール３キナーゼ関連キナーゼファミリーのメンバーである。ｍＴＯＲは、他のタンパク質と連結し、異なる細胞プロセスを制御する２つの異なるタンパク質複合体であるｍＴＯＲ複合体１及びｍＴＯＲ複合体２のコア構成要素として機能する。
Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅは、全ての真核生物細胞において広範なシグナル伝達経路を管理する分子スイッチである。Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅは、細胞－細胞接着及び遊走の基盤となる動的なアクチン細胞骨格の組み立て及び再編成の中心となる。ヒトＣｄｃ４２は、細胞形態、細胞遊走、エンドサイトーシス、及び細胞周期進行を含む多様な細胞機能を管理するシグナル伝達経路を制御する、Ｒｈｏファミリーの低分子ＧＴＰａｓｅである。活性化されたＣｄｃ４２は、高次構造変化によってｐ２１活性化キナーゼＰＡＫ１及びＰＡＫ２を活性化し、次に、アクチン再編成を開始させ、細胞の接着、遊走、及び侵入を制御する。Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１としても知られているＲａｃ１は、低分子（～２１ｋＤａ）シグナル伝達Ｇタンパク質であり、ＧＴＰａｓｅのファミリーであるＲｈｏファミリーのＲａｃサブファミリーの一員である。Ｒａｃ１は、細胞周期、細胞－細胞接着、（アクチンネットワークを介した）運動性、及び上皮分化（上皮幹細胞の維持に必要であることが提唱されている）を含む多くの細胞プロセスの多面的な制御因子である。
セリンプロテアーゼは、エラスターゼ、プロテイナーゼ３、キモトリプシン、カテプシンＧ、トリプシン、トロンビン、プロリルオリゴペプチダーゼ等を含む酵素のクラスである。プロテアーゼ／アンチプロテアーゼの活性のバランスの崩壊が、多くの疾患状態の病態形成に関与している。セリンプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼを制御、特にダウンレギュレート又は阻害することができる化合物の大きなファミリーを包含する。
ドーパミン受容体は、脊椎動物の中枢神経系（ＣＮＳ）において顕著に存在するＧタンパク質共役型受容体のクラスである。ドーパミン受容体は、Ｇタンパク質カップリングだけではなく、異なるタンパク質（ドーパミン受容体相互作用タンパク質）との相互作用を介したシグナル伝達も通じて異なるエフェクターを活性化する。ドーパミン受容体には少なくとも５つのサブタイプ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、及びＤ５が存在する。ドーパミン受容体アンタゴニストは、ドーパミン受容体の発現を調節、特にダウンレギュレートすることができる化合物の大きなファミリーを包含する。
５’ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ又はＡＭＰＫ又は５’アデノシン一リン酸活性化タンパク質キナーゼは、主に細胞エネルギーが低いときにグルコース及び脂肪酸の取り込み及び酸化を活性化するために、細胞エネルギーの恒常性において役割を果たす酵素（ＥＣ２．７．１１．３１）である。該キナーゼは、高度に保存された真核生物タンパク質ファミリーに属し、そのオルソログは、それぞれ酵母及び植物におけるＳＮＦ１及びＳｎＲＫ１である。該キナーゼは、酵母からヒトまで保存されている、一緒になって機能性酵素を構成する３つのタンパク質（サブユニット）からなる。その構成要素のアイソフォームが存在することから、哺乳類では１２種のバージョンのＡＭＰＫが存在し、それぞれが異なる組織に局在し、異なる条件下で異なる機能を有し得る。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、ラジカル酸素種の形成を阻害するＮＯＸ４阻害剤化合物である。特定の他の実施形態では、本発明の化合物は、ＮＦ－ｋＢを阻害又はダウンレギュレートする。他の実施形態では、本発明の化合物は、セリンプロテアーゼを阻害又はダウンレギュレートする。特定の他の実施形態では、本発明の化合物は、ドーパミン受容体の発現を調節する。更に他の実施形態では、本発明の化合物は、ｍＴＯＲ又はＲｈｏ ＧＴＰａｓｅの発現を調節する。他の実施形態では、本発明の化合物は、補体受容体（Ｃ３ａＲ及びＣ５ａＲ）の発現を調節する。更に他の実施形態では、本発明の化合物は、オートファジーをアップレギュレートする。このような実施形態では、オートファジーがアップレギュレートされると、ＲＰＥの健康が改善され、ＡＰＯＥの沈着が減少する。他の実施形態では、本発明の化合物は、ＡＭＰＫを制御する。更に他の実施形態では、本発明の化合物は、ＲＰＥ上皮－間葉転換又はＲＰＥ脱分化を調節する。
特定の実施形態では、本発明の化合物としては、アミノカプロン酸、Ｌ－７０１，３２４、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０塩酸塩、Ｍｅ－３，４－デホスタチン、Ｎ－メチル－１－デオキシノジリマイシン、Ｌ－７５０，６６７三塩酸塩、（＋）－ＭＫ－８０１マレイン酸水素塩、酒石酸ペンピジン、（－）－ナプロキセンナトリウム、塩酸ラロキシフェン、ＳＫＦ８３９５９臭化水素酸塩、Ｌ－６８７，３８４塩酸塩、７，７－ジメチル－（５Ｚ，８Ｚ）－エイコサジエン酸、ＳＰ－６００１２５、Ｒｏ４１－０９６０、塩酸アンシタビン、リスペリドン、テレンゼピン二塩酸塩、ＮＯ－７１１塩酸塩、Ｕ－９９１９４Ａマレイン酸塩、Ｓ（＋）－ラクロプリドＬ－酒石酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、カプトプリル、チオペラミドマレイン酸塩、アルプレノロール塩酸塩、リトドリン塩酸塩、プトレシン二塩酸塩、１－（２－メトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩、ＰＡＰＰ、Ｕ－６９５９３、ＡＧ－１４７８、リルゾール、メシル酸フェントラミン、ＤＢＯ－８３、ホルメスタン、カルバマゼピン、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、テルブタリンヘミ硫酸塩、ＵＫ１４３０４、ＧＲ１１３８０８、レフルノミド、アセチルチオコリン塩酸塩、スペルミジン、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソブチル）アミロライド、ＡＴＰＯ、アカデニシン、若しくはメトホルミン、又はこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、Ｌ－７４５，８７０；リルゾール、アミノカプロン酸；Ｖａｓ２８７０；アカデニシン；メトホルミン、又はこれらの組み合わせである。更に他の特定の実施形態では、本発明の化合物は、メトホルミンである。
ＮＯＸ４阻害が望ましい場合の追加の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、ＮＯＸ４を阻害する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子又は１つ以上の抗体を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物の化合物は、ＮＯＸ４を阻害する抗体を産生させる１つ以上の生物活性剤を含む。
追加の実施形態では、本明細書は、その鏡像異性体、ジアステレオマー、溶媒和物、及び多形を含む本明細書に記載の化合物を提供し、その薬学的に許容し得る塩形態、例えば、酸塩及び塩基塩の形態も含む。
治療組成物
薬学的に有効な量の担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて、有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの化合物の組み合わせ、及び全て有効量の本明細書に別途記載される化合物のうちの１つ以上を含む医薬組成物は、本開示の更なる態様を表す。
本開示は、適用可能な場合、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容し得る塩、特に、酸又は塩基の付加塩を含む組成物を含む。この態様に従って有用な前述の塩基化合物の薬学的に許容し得る酸付加塩を調製するために使用される酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち、薬学的に許容し得るアニオンを含有する塩、例えば、数ある中でも、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩［すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３ナフトエート）］塩を形成するものである。
また、本開示に係る化合物又は誘導体の薬学的に許容し得る塩形態を生成するために、薬学的に許容し得る塩基付加塩を使用してもよい。性質上酸性である本化合物の薬学的に許容し得る塩基塩を調製するための試薬として用いることができる化学塩基は、このような化合物と非毒性の塩基塩を形成するものである。このような非毒性の塩基塩としては、数ある中でも、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウム、亜鉛、及びマグネシウム）等の薬学的に許容し得るカチオンに由来するもの、Ｎ－メチルグルカミン（メグルミン）等のアンモニウム又は水溶性アミンの付加塩、並びに薬学的に許容し得る有機アミンの低級アルカノールアンモニウム及び他の塩基の塩が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の化合物は、本開示に従って、経口、非経口、又は局所の経路によって単回用量又は分割用量で投与され得る。本開示に係る化合物の局所眼投与経路での投与を使用してもよい。活性化合物の投与は、連続（静脈内滴注）から１日数回の経口投与（例えば、Ｑ．Ｉ．Ｄ．）まで及び得、他の投与経路の中でも、経口、局所、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、経皮（浸透促進剤を含んでいてもよい）、頬側、舌下、及び坐剤の投与を含み得る。経口投与経路からの化合物の生物学的利用能を高めるために、腸溶性コーティングされた経口錠剤を使用してもよい。最も有効な剤形は、選択された具体的な剤の薬物動態及び患者における疾患の重症度に依存する。鼻腔内、気管内、又は肺に投与するためのスプレー、ミスト、又はエアロゾルとしての本開示に係る化合物の投与を使用してもよい。本開示に係る化合物の点眼剤、硝子体内注射、テノン嚢下注射、及び網膜下注射としての投与を使用してもよい。したがって、本開示はまた、有効量の本明細書に記載の化合物を、任意で薬学的に許容し得る担体、添加剤、又は賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物も目的とする。本開示に係る化合物は、即時放出、中間放出、又は持続若しくは制御放出の形態で投与され得る。持続又は制御放出の形態は、経口投与が好ましいが、坐剤及び経皮又は他の局所形態でも投与される。注射部位での化合物の放出を制御又は持続させるために、リポソームの形態での筋肉内注射を使用してもよい。
特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、局所眼投与経路によって投与される。このような実施形態では、本開示に係る化合物は、眼用医薬組成物として投与される。このような眼用医薬組成物は、眼に直接適用するために、点眼剤、ミスト剤、フロスト剤、フォーム剤、クリーム剤、軟膏剤、又は乳剤の形態で調製される。特定の実施形態では、組成物は、水性点眼剤として調製される。このような実施形態では、点眼剤は単相である。水性点眼剤に含有される本発明の化合物の濃度は、一般に０．０１Ｗ／Ｖ％以上、好ましくは０．１Ｗ／Ｖ％以上、より好ましくは０．５Ｗ／Ｖ％以上であり、かつ一般には２０Ｗ／Ｖ％以下、好ましくは１０Ｗ／Ｖ％以下、より好ましくは５Ｗ／Ｖ％以下であるが、これらに限定されない。実際に投与される本発明の化合物の量は、治療対象となる個体に依存し、顕著な副作用を伴うことなく所望の治療を達成するために最適化された量であることが好ましい。有効な用量は、当業者が十分に判断することができる。
本発明の点眼剤は、本発明の特徴及び点眼剤の安定性が損なわれない限り、必要に応じて点眼剤に一般に添加される添加剤を含有していてもよい。このような添加剤の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、グルコース、プロピレングリコール等の等張剤；リン酸バッファ、酢酸バッファ、ホウ酸バッファ、炭酸バッファ、クエン酸バッファ、トリスバッファ、グルタミン酸、ε－アミノカプロン酸等の緩衝剤；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、エデト酸ナトリウム、ホウ酸等の防腐剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の水溶性セルロース誘導体；コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等の増粘剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤；等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の化合物を含む点眼剤は、人工涙液に含有され得る１つ以上の他の成分、すなわち、アミノエチルスルホン酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、Ｌ－アスパラギン酸カリウム、Ｌ－アスパラギン酸マグネシウム、Ｌ－アスパラギン酸マグネシウムカリウム（等モル混合物）、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、無水炭酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、グルコース、及びメチルセルロースを更に含有していてもよい。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途等に応じて変動するが、添加剤の目的を達成できる濃度で添加すればよい。
本明細書に記載の組成物は、１つ以上の薬学的に許容し得る担体を用いて従来の方法で製剤化することができ、また、制御放出製剤で投与することができる。これら医薬組成物において使用され得る薬学的に許容し得る担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロラミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム等の塩又は電解質、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の組成物は、経口で、非経口で、吸入スプレーにより、局所的に、眼内に、眼表面に、直腸に、鼻腔に、頬側に、膣に、又は埋め込みリザーバーを介して投与され得る。用語「非経口」は、本明細書で使用するとき、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、硝子体内、網膜下、網膜、テノン嚢下、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内への注射又は注入技術を含む。好ましくは、組成物は、局所眼投与により、経口で、腹腔内に、又は静脈内に投与される。
本明細書に記載の組成物の無菌注射可能形態は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これら懸濁液は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、当技術分野において公知の技術に従って製剤化することができる。また、無菌注射可能製剤は、例えば１，３－ブタンジオール溶液等の非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液であってもよい。使用することができる許容し得るビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。更に、無菌固定油が、従来通り溶媒又は懸濁媒体として使用される。この目的のために、合成モノ－又はジ－グリセリドを含む、任意のブランドの固定油を使用してよい。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は、オリーブ油又はヒマシ油等の天然の薬学的に許容し得る油、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンと同様に、注射剤の調製において有用である。これら油溶液又は懸濁液は、Ｐｈ．Ｈｅｌｖ又は類似のアルコール等の長鎖アルコールの希釈剤又は分散剤を含有していてもよい。
本明細書に記載の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性の懸濁剤又は液剤を含むがこれらに限定されない任意の経口的に許容し得る剤形で経口投与することができる。経口用途の錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。また、典型的には、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤も添加される。カプセル形態で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口用途のための水性懸濁液が必要な場合、活性成分を乳化剤及び懸濁剤と合わせる。また、必要に応じて、特定の甘味剤、香料、又は着色剤を添加してもよい。特定の実施形態では、経口投与のための医薬組成物は、血液網膜関門を越えて化合物を送達するのを支援する製剤を含む。
あるいは、本明細書に記載の医薬組成物は、直腸投与のために坐剤の形態で投与してもよい。これらは、室温では固体であるが直腸温度では液体になるので直腸内で融解して薬物を放出する好適な非刺激性の賦形剤と剤を混合することで調製することができる。このような材料としては、カカオバター、ミツロウ、及びポリエチレングリコールが挙げられる。
また、本明細書に記載の医薬組成物は、局所的に投与してもよい。これら各領域又は器官ごとに好適な局所製剤が容易に調製される。下部腸管への局所適用は、直腸座剤製剤（上記参照）又は好適な浣腸製剤で行ってよい。また、局所的に許容し得る経皮パッチを使用してもよい。
局所適用の場合、医薬組成物は、１つ以上の担体に懸濁又は溶解した活性成分を含有する好適な軟膏に製剤化され得る。本開示の化合物の局所投与のための担体としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の特定の好ましい態様では、患者におけるステントで閉塞が生じるのを阻害するか又は確率を低下させるために、患者に外科的に移植されるステントに化合物をコーティングしてもよい。
あるいは、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容し得る担体に懸濁又は溶解した活性成分を含有する好適なローション剤又はクリーム剤に製剤化することもできる。好適な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。
眼に使用する場合、医薬組成物は、等張のｐＨが調整された滅菌生理食塩水中の微粉化懸濁液として、又は好ましくは、塩化ベンジルアルコニウム等の防腐剤を含むか又は含まない等張のｐＨが調整された滅菌生理食塩水溶液として製剤化され得る。あるいは、眼に使用する場合、医薬組成物をワセリン等の軟膏剤に製剤化してもよい。特定の実施形態では、眼部に又は局所的に眼に使用するための医薬組成物は、親油的に修飾された組成物及び移植可能な担体を含む。
本明細書に記載の医薬組成物は、鼻腔エアロゾル又は吸入によって投与されてもよい。このような組成物は、医薬製剤の技術分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコール若しくは他の好適な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の従来の可溶化若しくは分散剤を用いて、生理食塩水溶液として調製され得る。
単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる本明細書に記載の医薬組成物中の化合物の量は、治療されるホスト及び疾患、具体的な投与モードに応じて変動する。好ましくは、組成物は、単独で又は本開示に係る少なくとも１つの他の化合物と組み合わせて、約０．０５ミリグラム～約７５０ミリグラム以上、より好ましくは約１ミリグラム～約６００ミリグラム、更に好ましくは約１０ミリグラム～約５００ミリグラムの活性成分を含有するように製剤化すべきである。
任意の具体的な患者についての特定の投与量及び治療レジメンは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身的な健康、性別、食事、投与時間、排出速度、薬物の組み合わせ、及び主治医の判断、及び治療される具体的な疾患又は病態の重症度を含む様々な要因に依存することも理解すべきである。
本明細書に記載の方法に従って化合物を用いる療法を必要とする患者又は被験体は、単独で、又は本明細書で別途特定する他の既知の治療剤と組み合わせて、任意で薬学的に許容し得る担体又は希釈剤中の有効量の本開示に係る化合物（その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、又は多形体を含む）を患者（被験体）に投与することによって治療することができる。
これら化合物は、液体、クリーム、ゲル、若しくは固体の形態で又はエアゾール形態により、任意の適切な経路によって、例えば、経口で、非経口で、静脈内に、皮内に、皮下に、又は経皮を含む局所的に投与することができる。
活性化合物は、治療される患者において重篤な毒性作用を引き起こすことなく、所望の適応症に対して治療的に有効な量を患者に送達するのに十分な量で、薬学的に許容し得る担体又は希釈剤に含まれる。本明細書で述べる全ての条件に対する活性化合物の好ましい用量は、約１０ｎｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には１日当たりレシピエント／患者の体重１ｋｇ当たり０．５～約２５ｍｇの範囲である。典型的な局所投与量は、好適な担体中０．０１～５％ｗｔ／ｗｔの範囲である。
化合物は、単位剤形あたり１ｍｇ未満、１ｍｇ～３０００ｍｇ、好ましくは５～５００ｍｇの活性成分を含有するものを含むがこれらに限定されない、任意の好適な単位剤形で便利に投与される。多くの場合、約２５～２５０ｍｇの経口投与量が便利である。
活性成分は、好ましくは、活性化合物の血漿ピーク濃度が約０．００００１～３０ｍＭ、好ましくは約０．１～３０μＭとなるように投与される。これは、例えば、任意で生理食塩水若しくは水性媒体中の活性成分の溶液若しくは製剤を静脈内注射することにより達成してもよく、又は活性成分のボーラスとして投与してもよい。また、活性成分の有効血漿濃度を得るためには、経口投与が適している。
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、薬物の吸収、分布、不活化、及び排出の速度、並びに当業者に公知の他の要因に依存する。投与量の値は、緩和したい病態の重症度によっても変動することに留意すべきである。任意の特定の被験体について、特定の投与レジメンは、個々の必要性及び組成物を投与するか又は投与を監督する者の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであること、並びに本明細書に記載される濃度範囲は単なる例示であり、請求される組成物の範囲又は実施を限定することを意図するものではないことを更に理解すべきである。活性成分は一度に投与してもよく、様々な時間間隔で投与される多数のより少ない用量に分割してもよい。
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤又は可食性担体を含む。経口組成物は、ゼラチンカプセルに封入してもよく、又は圧縮して錠剤にしてもよい。経口治療用投与の目的のために、活性化合物又はそのプロドラッグ誘導体を賦形剤と共に配合し、そして、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用してよい。薬学的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント材料を組成物の一部として含めてもよい。
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分のいずれか又は類似の性質を有する化合物を含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、若しくはゼラチン等の結合剤；デンプン若しくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、若しくはコーンスターチ等の分散剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはＳｔｅｒｏｔｅ等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロース若しくはサッカリン等の甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香料等の着香剤。単位剤形がカプセル剤である場合、上記の種類の材料に加えて、脂肪油等の液体担体を含有していてもよい。更に、単位剤形は、投与単位の物理的形態を変更する他の様々な材料、例えば、砂糖、シェラック、又は腸溶性剤のコーティングを含有していてもよい。
活性化合物又はその薬学的に許容し得る塩は、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハ、チューインガム等の成分として投与してもよい。シロップ剤は、活性化合物に加えて、甘味剤としてのスクロース、並びに特定の防腐剤、色素及び着色料、並びに香料を含有し得る。
また、活性化合物又はその薬学的に許容し得る塩は、所望の作用を損なわない他の活性物質、又は所望の作用を補う物質、例えば、数ある中でも上皮成長因子受容体阻害剤、ＥＰＯ、ダルベポエチンアルファを含む抗がん剤と混合してもよい。本開示の特定の好ましい態様では、本開示に係る１つ以上の化合物は、本明細書に別途記載する通り、別の生物活性剤、又は抗生物質を含む創傷治癒剤と共投与される。
非経口、皮内、皮下、又は局所への適用のために用いられる液剤又は懸濁剤は、以下の成分を含んでいてよい：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒等の無菌希釈剤；例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸又は重硫酸ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩等のバッファ、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の浸透圧を調整するための剤。非経口製剤は、ガラス又はプラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジ、又は複数回投与用バイアルに封入してよい。
静脈内投与する場合、好ましい担体は、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
一実施形態では、活性化合物は、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤等、身体からの急速な排出に対して該化合物を保護する担体と共に調製される。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを用いてよい。このような製剤を調製する方法は、当業者には明らかである。
リポソーム懸濁液も、薬学的に許容し得る担体であり得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（これは、参照により全体が本明細書に援用される）に記載の通り、当業者に公知の方法に従って調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（複数可）（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、及びコレステロール）を無機溶剤に溶解させ、次いで、蒸発させて、乾燥した脂質の薄膜を容器の表面に残すことによって調製することができる。次いで、活性化合物の水溶液を容器に導入する。次いで、容器を手で旋回させて、容器の側面から脂質材料を遊離させ、脂質凝集体を分散させ、それによって、リポソーム懸濁液を形成する。
治療方法
更なる態様では、本明細書は、有効量の本明細書に記載の化合物又はその塩形態と、薬学的に許容し得る担体とを含む治療組成物を提供する。治療組成物は、患者又は被験体、例えば、ヒト等の動物における眼の疾患状態又は病態を治療するか又は寛解させるために使用することができる。治療組成物は、患者又は被験体、例えば、ヒト等の動物における網膜の障害又は病態を治療するか又は寛解させるために使用することができる。
用語「治療する」、「治療している」、及び「治療」等は、本明細書で使用するとき、眼の疾患状態又は病態の治療を含む、本化合物を投与することができる患者に対して利益を提供する任意の作用を指す。本明細書は、加齢性）黄斑変性、シュタルガルト病及びシュタルガルト様疾患等の黄斑ジストロフィー、ベスト病（卵黄様黄斑ジストロフィー）、及び成人卵黄様ジストロフィー、又は色素性網膜炎のサブタイプ等の眼疾患を治療するための、本明細書に記載の治療組成物を提供する。特定の実施形態では、方法は、任意で薬学的に許容し得る賦形剤、担体、アジュバント、別の生物活性剤、又はこれらの組み合わせを含む、有効量の本明細書に記載の化合物を投与することを含む。
追加の実施形態では、本明細書は、被験体又は患者、例えば、ヒト等の動物における眼の疾患、障害、又はその症状の治療をするか又は寛解をさせる方法であって、それを必要としている被験体に、有効量、例えば治療的に有効な量の本明細書に記載の化合物又はその塩形態と、薬学的に許容し得る賦形剤、担体、アジュバント、別の生物活性剤、又はこれらの組み合わせとを含む組成物を投与することを含み、該組成物が、該被験体における疾患若しくは障害又はその症状を治療するか又は寛解させるのに有効である方法を提供する。
追加の実施形態では、本明細書は、被験体又は患者、例えば、ヒト等の動物における網膜変性の治療をする方法であって、それを必要としている被験体に、有効量、例えば治療的に有効な量の本明細書に記載の化合物又はその塩形態と、薬学的に許容し得る賦形剤、担体、アジュバント、別の生物活性剤、又はこれらの組み合わせとを含む組成物を投与することを含み、該組成物が、該被験体における網膜変性の症状を治療するか又は寛解させるのに有効である方法を提供する。
追加の実施形態では、本明細書は、被験体又は患者、例えば、ヒト等の動物における網膜色素上皮細胞の修復をする方法であって、それを必要としている被験体に、有効量、例えば治療的に有効な量の本明細書に記載の化合物又はその塩形態と、薬学的に許容し得る賦形剤、担体、アジュバント、別の生物活性剤、又はこれらの組み合わせとを含む組成物を投与することを含み、該組成物が、該被験体における網膜色素上皮細胞の修復をするのに有効である方法を提供する。
追加の実施形態では、本明細書は、被験体又は患者、例えば、ヒト等の動物における黄斑変性の治療をする方法であって、それを必要としている被験体に、有効量、例えば治療的に有効な量の本明細書に記載の化合物又はその塩形態と、薬学的に許容し得る賦形剤、担体、アジュバント、別の生物活性剤、又はこれらの組み合わせとを含む組成物を投与することを含み、該組成物が、該被験体における黄斑変性の症状を治療するか又は寛解させるのに有効である方法を提供する。特定の実施形態では、黄斑変性は、加齢性黄斑変性である。他の実施形態では、黄斑変性は、萎縮性、新生血管、又は滲出性の黄斑変性である。他の実施形態では、黄斑変性は、早期黄斑変性、中間期黄斑変性、又は進行期黄斑変性である。具体的な実施形態では、本明細書は、被験体又は患者、例えば、ヒト等の動物における早期黄斑変性の治療をする方法であって、それを必要としている被験体に、有効量、例えば治療的に有効な量のメトホルミン又はその塩形態と、薬学的に許容し得る賦形剤、担体、アジュバント、別の生物活性剤、又はこれらの組み合わせとを含む組成物を投与することを含み、該組成物が、該被験体における早期黄斑変性の症状を治療するか又は寛解させるのに有効である方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、眼疾患の治療を、それを必要としているヒト患者においてするか、又は寛解を、それを必要としているヒト患者においてさせる方法であって、それを必要としている患者に、任意で別の生物活性剤と組み合わせて、有効量の本開示に係る化合物を投与することを含む方法を目的とする。
別の実施形態では、本明細書は、被験体又は患者、例えば、ヒト等の動物におけるシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法であって、それを必要としている被験体に、有効量、例えば治療的に有効な量の本明細書に記載の化合物又はその塩形態と、薬学的に許容し得る賦形剤、担体、アジュバント、別の生物活性剤、又はこれらの組み合わせとを含む組成物を投与することを含み、該組成物が、該被験体におけるシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の症状を治療するか又は寛解させるのに有効である方法を提供する。特定の実施形態では、シュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法は、有効量のメトホルミン又はその塩を投与することを含む。
用語「生物活性剤」は、そのために本化合物が使用される所望の治療、阻害、及び／又は予防／防止をもたらすのを支援する生物活性を有する剤として本化合物と組み合わせて使用される、本開示に係る化合物以外の剤を説明するために使用される。本明細書で使用するための好ましい生物活性剤としては、本化合物を使用又は投与した場合と同様の薬理活性を有する剤が挙げられる。
用語「薬学的に許容し得る塩」は、本明細書全体を通じて、適用可能な場合、化合物の溶解及び生物学的利用能を促進するために患者の消化管の消化液への化合物の溶解度を増加させるために提示される、本明細書に記載の化合物のうちの１つ以上の塩形態について説明するために使用される。薬学的に許容し得る塩には、適用可能な場合、薬学的に許容し得る無機又は有機の塩基及び酸に由来するものが含まれる。好適な塩としては、薬学分野で周知の多数の酸及び塩基の中でも、カリウム及びナトリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、及びアンモニウムの塩等のアルカリ土類金属に由来する塩が挙げられる。本開示に係るリン酸の中和塩としては、ナトリウム及びカリウムの塩が特に好ましい。
用語「薬学的に許容し得る誘導体」とは、本明細書全体を通じて、患者への投与時に本化合物又は本化合物の活性代謝物を直接的又は間接的に提供する、任意の薬学的に許容し得るプロドラッグ形態（エステル、アミド、他のプロドラッグ基等）を説明するために使用される。
キット
追加の態様では、本明細書は、医師が使用するときに、適切な量の本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、若しくは水和物の患者又は細胞への投与を簡略化することができるキットを提供する。
本発明の典型的なキットは、本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、若しくは水和物の１つ以上の単位剤形と、被験体又は細胞への投与についての説明書とを含む。本発明の典型的なキットは、それに加えて又はその代わりに、バルク量の本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、若しくは水和物を含有し得る。
本発明のキットは、本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、若しくは水和物を投与するために用いられる装置と、被験体又は細胞への投与についての説明書とを更に含んでいてもよい。このような装置の例としては、静脈内挿管装置、注射器、点滴バッグ、パッチ、外用ゲル、ポンプ、光分解から保護する容器、自己注射器、点眼器、及び吸入器等が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明のキットは、本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、若しくは水和物を含む溶液と、点眼器と、該溶液の被験体の眼への直接投与についての説明書とを含む。特定のこのような実施形態では、溶液は、追加の点眼器なしに直接液滴を分注することができるスポイトチップを含む容器で提供される。
本発明のキットは、活性成分として本発明の１つ以上の化合物を投与するために使用することができる薬学的に許容し得るビヒクルを更に含んでいてもよい。例えば、非経口投与のために再構成しなければならない固体形態で活性成分が提供される場合、キットは、活性成分を溶解させて非経口投与に好適な無粒子滅菌溶液を形成することができる好適なビヒクルの密閉容器を含み得る。薬学的に許容し得るビヒクルの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：注射ＵＳＰ用水；塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロース及び塩化ナトリウムの注射剤、並びに乳酸加リンゲル注射剤等であるがこれらに限定されない水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール等であるがこれらに限定されない水混和性ビヒクル；並びにコーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジル等であるがこれらに限定されない非水性ビヒクル。
実施例１－補体能力のある（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ヒト血清（ＣＣ－ＨＳ）は、成熟ｉＰＳＣ－ＲＰＥにおいてＡＭＤ様細胞エンドフェノタイプを誘導する
この解析には、５人の異なる健常個体由来のｉＰＳＣを使用した。既刊のプロトコル（Ｍａｙ－Ｓｉｍｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）を用いて、ｉＰＳＣを成熟ＲＰＥ細胞へと分化させた。細胞膜上のβ－カテニンの存在（Ｍａｙ－Ｓｉｍｅｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１８、図１Ａ）及び培養３週目に始まる単層の経上皮抵抗（ＴＥＲ）の漸増（ｐ＜２×１０－１６、３週目から４～６週目；図９Ａ）によって、ｉＲＰＥ細胞の成熟を確認した。初代ＲＰＥ細胞に関する既報（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐｉｌｇｒｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）と一致して、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥではＣＩ－ＨＳで処理した細胞と比較してＡＰＯＥ陽性ｉＲＰＥ下沈着物が５倍増加することが観察された（ｐ＜０．０００１；図１Ｂ～Ｄ）。ＡＭＤで眼にみられるドルーゼン沈着物と同様に（Ｍｕｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＡＳＥＢ Ｊ）、ＡＰＯＥ陽性沈着物は抗膜侵襲複合体（ＭＡＣ）抗体と共染色された（図９Ｂ）。また、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥでは、ドルーゼンマーカーであるフィブリン３がより高レベルで発現し（Ｍａｒｍｏｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；図９Ｃ、Ｄ）、中性脂質沈着物のＲＰＥ下染色（ナイルレッド）が増加し、トリグリセリド及びエステル化コレステロール沈着物の細胞内染色（オイルレッドＯ）が増加した（Ｐｉｌｇｒｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７；図１Ｅ、Ｆ及び９Ｅ、Ｆ）。細胞内脂質沈着物の存在は、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって更に確認された（図１Ｈの黄色い矢頭）。ＴＥＭ及び走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）では、ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルにおいて典型的なドーム状の外観を有する基底層沈着物の存在も確認された（赤矢頭、図１Ｇ、Ｈ及び９Ｇ、Ｈ）。まとめると、これら知見は、ＣＣ－ＨＳ処理が、ｉＲＰＥ細胞においてＡＭＤの幾つかの特徴的な疾患表現型を誘導するという主張を支持するものである。したがって、ＡＭＤの病態形成に関与するＲＰＥ細胞自律的な経路について調べ、より早い疾患段階で介入することができる薬物を発見するためのインビトロモデルを提供する。
ＣＣ－ＨＳで処理した細胞のＴＥＭでは、隣接するＲＰＥ細胞間の結合複合体の崩壊も明らかになった（図１Ｉ、Ｊの矢頭）。ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルにおける隣接するＲＰＥ細胞間の密着接合の完全性について更に調べるために、サンプルを密着接合及びアクチン細胞骨格のマーカーで染色した。重要なＲＰＥ密着接合タンパク質であるＣＬＤＮ１６（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）は、ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルでは、多くの場合、細胞境界から消失し、細胞内に局在していた（図１Ｋ、Ｌの矢頭）。Ｆ－アクチン染色により、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞における細胞内張線維が、特徴的な六角形の形態を保持することができていないことが示された（図１Ｍ、Ｎの矢頭）。ビメンチン免疫染色により、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞の脱分化が更に確認され、ビメンチンは、細胞膜から消失し、拡大、伸展した細胞の細胞質内にいかなる構造も有さずに存在していた（Ｔａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ，２０１０；図９Ｉ、Ｊ）。光干渉断層撮影法を用いて、患者の眼における上皮表現型の消失が報告されている（Ｃｕｒｃｉｏ ｅｔ ａｌ ２０１７）。この既報のＲＰＥ上皮表現型の消失が、ＣＣ－ＨＳ ｉＲＰＥモデルでみられる脱分化の表現型と一致するかどうかを調べるために、死体のＡＭＤ眼からのＲＰＥフラットマウントをビメンチン及びＦ－アクチンで免疫染色した（図９Ｋ、Ｌ）。ＧＡ病変の境界におけるＲＰＥ細胞の脱分化は、典型的な六角形の形態の消失を示すＦ－アクチン染色及びいかなる適切な構造も有さずに細胞質に存在するビメンチン免疫染色の増加によって確認され（図９Ｋ、Ｌ）、これにより、インビトロにおける所見が確認された。ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞が脱分化すると、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥと比較して、ＴＥＲが３倍減少した（ｐ＜１０－５）（図１Ｏ）。また、ＣＣ－ＨＳで処理した細胞は、視細胞外節（ＰＯＳ）を貪食する能力が６倍減少（ｐ＜１０－６）したことによって確認されるように、機能的成熟度が失われた（図１Ｐ）。更に、定常状態の経上皮電位（ＴＥＰ）の低下（４ｍＶ対０．２５ｍＶ、ｐ＜１０－４）、頂端Ｋ＋濃度を５ｍＭから１ｍＭに低下させる生理学的刺激に対する過分極応答の減少（２ｍＶ対０．５ｍＶ、ｐ＜０．０００１）、及び頂端ＡＴＰ刺激に対するごくわずかな脱分極応答（ｐ＜０．０３；図１Ｑ、Ｒ；９Ｍ）により実証されるように、ＣＣ－ＨＳで処理した細胞は、ＣＩ－ＨＳで処理した細胞と比較してその分極状態を失った。全体として、結果は、ＣＣ－ＨＳ処理が、ＡＭＤ ＲＰＥでみられる幾つかの顕著な特徴を誘導することが示され、最も注目すべきは、ＡＰＯＥ及び脂質を含有する細胞下沈着物の形成である。この研究は、ＣＣ－ＨＳ処理及びＲＰＥ下沈着物が、進行した疾患段階期につながると考えられる表現型である、細胞の脱分化につながる頂端－基底極性及び機能的成熟度の消失を伴う上皮表現型の変性と関連しているという従来の知見を広げるものである。
実施例２－ＣＣ－ＨＳが誘発するＡＭＤ疾患の表現型は、Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１のシグナル伝達を介して誘導される
ｉＲＰＥ細胞におけるＣＣ－ＨＳが誘発するＡＭＤ細胞表現型は、Ｃ３ａ－Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａ－Ｃ５ａＲ１のシグナル伝達が誘導する細胞内炎症誘発を介して補体経路のアナフィラトキシンアームによって生成されると仮定されていた（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｇｏｄｉｎｏ ａｎｄ Ｐｉｅｒｃｅ ２０１８）。ＲＮＡｓｅｑにより、ｉＲＰＥ細胞における両受容体の発現が確認され、Ｃ３ａＲ１に比べてＣ５ａＲ１は約３０倍高発現していた（図１０Ａ）。更に、両受容体の発現は、ＣＣ－ＨＳ処理により増加する。ウェスタンブロットにより、ｉＲＰＥ細胞の膜画分にＣ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１の受容体が局在することが確認された（図２Ａ）。頂端膜マーカーであるエズリンとは共局在化するが、基底膜マーカーであるＩＶ型コラーゲンとは共局在化しないことから、２つの補体タンパク質Ｃ３ａ及びＣ５ａの受容体が主に頂端に位置していることが示唆される（図２Ｂ、Ｃ、１０Ｂ）。ＣＣ－ＨＳがｉＲＰＥ細胞においてＣ３ａＲ及びＣ５ａＲのシグナル伝達を活性化することを確認するために、Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１の受容体の下流の２つの主要キナーゼ、ＡＫＴ及びＥＲＫ１／２のリン酸化についてサンプルを調べた（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ ａｎｄ Ｌａｍｂｒｉｓ ２０１０；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ ２０１５ Ｍｏｌ Ｖｉｓ；Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ ２０１７ Ｆｒｏｎｔ．Ｉｎ Ｉｍｍｕ．）。３人のドナーのｉＲＰＥサンプルにわたるＣＣ－ＨＳで処理したサンプルのウェスタンブロットは、ＣＣ－ＨＳで処理した細胞では、ＣＩ－ＨＳで処理した細胞と比較してｐＡＫＴ（ｐ＜０．０１）及びｐＥＲＫ１／２（ｐ＜０．０１）のレベルが２～４倍増加することを示した（図２Ｄ～Ｇ）。更に、Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１が主に頂端に局在することと一致して、頂端のみＣＣ－ＨＳで処理したところ、ＣＣ－ＨＳの頂端／基底複合処理と同様にＴＥＲが４．５～５倍低下した（ｐ＜１０－１６）。対照的に、基底のみＣＣ－ＨＳで処理したところ、ＴＥＲは２倍しか低下しなかった（ｐ＜１０－１６）（図２Ｈ）。ｉＲＰＥ細胞でのＡＭＤ細胞表現型の誘導におけるＣ５ａＲ１及びＣ３ａＲ１のシグナル伝達の役割を更に解明するために、枯渇血清及び受容体ブロッカー戦略を採用した。Ｃ３（ｐ＜０．０１）若しくはＣ５（ｐ＜０．０１）タンパク質を枯渇させた血清でｉＲＰＥ細胞を処理するか、又はＣＣ－ＨＳ血清中のＣ３ａＲ１（コンプスタチン、１０μＭ）及びＣ５ａＲ１（ＰＭＸ０５３、１０μＭ）のブロッカーを同時に使用すると（ｐ＜０．０１）、ＣＣ－ＨＳ＋ビヒクル処理と比べてＲＰＥ下ＡＰＯＥ沈着物が２倍減少した（図２１、１０Ｃ～Ｇ）。Ｃ３ａ及びＣ５ａの形成の上流制御因子である補体因子Ｄの枯渇でも、完全ＣＣ－ＨＳ培地と比較してＲＰＥ下ＡＰＯＥ沈着物が減少した（Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ｗａｒｄ ２０１１；図Ｓ２Ｃ、Ｄ）。同様に、ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルと比較して、Ｃ３（ｐ＜１０－１６）若しくはＣ５（ｐ＜１０－１６）を枯渇させた血清で又はＣ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１の受容体のブロッカー（それぞれ、コンプスタチン、１０μＭ及びＰＭＸ０５３、１０μＭ；ｐ＜１０－１６）を使用して処理したサンプルでは、５倍高いｉＲＰＥ単層ＴＥＲが観察された（図２Ｊ）。更に、Ｃ３及びＣ５のタンパク質を枯渇させた血清で処理したサンプルでは、ｉＲＰＥ単層の電気生理学的特性に変化はみられなかった（図１Ｑ、Ｒと１０Ｈ、Ｉを比較）。まとめると、主にＲＰＥ細胞の頂端表面を通じて生じるＣ３ａＲ１又はＣ５ａＲ１の補体受容体の刺激が、ｉＲＰＥ細胞においてＡＭＤ疾患表現型を誘発するために必要であることがデータから示唆された。
実施例３－Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１が誘導するＲＰＥ下沈着物は、ＮＦ－κＢの過活性化及びオートファジー経路のダウンレギュレーションにより媒介される
ＣＩ－ＨＳ及びＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞のＲＮＡｓｅｑ解析により、ＣＣ－ＨＳ処理によって誘導される全般的遺伝子発現パターンが劇的に異なることが解明された（図１１Ａ）。免疫細胞におけるアナフィラトキシン補体（Ｃ３ａ、Ｃ５ａ）の効果と一致して、ｉＲＰＥ細胞のＣＣ－ＨＳ処理によって最も変化したのはオートファジー（ｐ＜１０－６）及びＴＮＦ／ＮＦ－κＢ（ｐ＜１０－５）の経路であった（Ｆｒｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋｕｍａｒ ２０１９ Ｉｎｔ Ｒｅｖ ｏｆｌｍｍｕ；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８；図１１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。このことから、本発明者らは、ｉＲＰＥ細胞におけるＣ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１のシグナル伝達は、これら２つの経路を通じて機能しているという仮説を立てた。実際、ＣＣ－ＨＳ処理によりＮＦ－κＢのｐ６５（ＲＥＬＡ）サブユニットが核に移行し、これはその活性化を示唆している（Ｒａｙｅｔ ａｎｄ Ｇｅｌｉｎａｓ １９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；図３Ａ、Ｂ）。ＲＮＡｓｅｑ（図１１Ｂ、ｐ＜１０－５）、選択した標的遺伝子（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＥＧＲ２、ＮＦκＢ１Ａ、ＲＥＬ１、ＮＦκＢ１、ＳＮＡＰ２５；図３Ｃ、ｐ＜１０－１～ｐ＜１０－６）のｑＲＴ－ＰＣＲベースの検証、並びに２つのＮＦ－κＢ標的遺伝子ＲＥＬＢ及びＴＲＡＦ３の免疫染色（図１１Ｂ～Ｄ）により確認された通り、ｐ６５の核移行によりＮＦ－κＢ標的遺伝子の発現が４～６倍増加した（Ｔｉｌｂｏｒｇｈｓ ｅｔ ａｌ，２０１７）。更に、ＣＣ－ＨＳ処理により、ＮＫ－κＢ経路の炎症性サイトカインであるＩＬ－８（図３Ｄ、頂端ｐ＜０．０１、基底ｐ＜１０－５）及びＩＬ－１８（図１１Ｅ、頂端ｐ＜０．００５、基底ｐ＜０．００５）の分泌が倍加した。Ｃ３又はＣ５のタンパク質を枯渇させた血清で処理したｉＲＰＥ細胞ではｐ６５が核移行しないことから、ｉＲＰＥ細胞のＮＦ－κＢ経路の直接活性化におけるアナフィラトキシン補体の役割が更に確認された（図３Ｅ～Ｇ）。ＮＦ－κＢの活性化がＲＰＥ下ＡＰＯＥ沈着物の形成に直接つながるかどうかを判定するために、ＮＦ－κＢシグナル伝達の負の制御因子である遺伝子ＮＥＭＯにＥ３９１Ｘ変異を有する患者由来のｉＲＰＥ細胞を用いた（Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ－Ｒｕｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。文献と一致して、変異型ｉＲＰＥ細胞ではＣＩ－ＨＳ処理条件下でさえもｐ６５の核移行がみられた（図３Ｈ）。更に、変異型ｉＲＰＥ細胞では、ＣＩ－ＨＳ処理条件下において５～６倍多い（ｐ＜０．００１）ＲＰＥ下ＡＰＯＥ沈着物がみられた（図３１、Ｊ）。全体として、これら結果は、アナフィラトキシン補体によって誘発されるｉＲＰＥ細胞におけるＡＭＤ疾患表現型は、ＮＦ－ｋＢ経路の活性化を通して媒介される可能性が高いことを示す。
また、ＲＮＡｓｅｑ解析から、ＣＣ－ＨＳで処理した細胞におけるオートファジー経路の統計的に有意な（ｐ＜１０－６）欠陥が明らかになり（図１１Ｃ）、これは、文献に記載されているＡＭＤとＲＰＥにおけるオートファジー調節不全との間の関連（Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｇｏｌｅｓｔａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）によって裏付けられる。このことから、本発明者らは、ｉＲＰＥ細胞でのＣＣ－ＨＳが誘導するＡＭＤ細胞エンドフェノタイプにおけるオートファジーの役割について調べることにした。オートファジー制御に不可欠な遺伝子であるＡＴＧ５、ＡＴＧ７、及びＬＣ３－ＩＩは、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞において、ＣＩ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞と比較して全て３～４倍ダウンレギュレートされる（ｐ＜０．００５）ことが、免疫染色及びウェスタンブロット解析により明らかになった（図４Ａ～Ｉ；１２Ａ、Ｂ）。ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞では、重要なオートファジー経路遺伝子（例えば、ＡＴＧ３、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ４Ｂ、ＡＴＧ４Ｄ、ＢＣＬ２、ＬＡＭＰ１、ＳＱＳＴＭ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ）の発現がＣＩ－ＨＳ ｉＲＰＥ細胞と比較して４～１６倍ダウンレギュレートされることを示した（ｐ＜０．０１～１０－３）ｑＲＴ－ＰＣＲによって、これら結果が更に実証された（図１２Ｆ）。ＣＣ－ＨＳで処理した細胞における主要なオートファジー遺伝子の発現の減少は、オートファジーフラックスの減少を示唆し、これはＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞におけるオートファゴソームの蓄積の増加によって確認された（矢頭、図１２Ｅ）。
Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１が主に頂端に局在することと一致して、ｉＲＰＥの頂端側におけるＣＣ－ＨＳ処理は、細胞におけるオートファジーの主要なマーカーであるＬＣ３－ＩＩのダウンレギュレーションを誘発するのに十分であることが実証された（図４Ｊ、１２Ｃ；両側のＣＣ－ＨＳ処理と頂端のみのＣＣ－ＨＳ処理との間でｐ＝ｎｓ）。更に、ＣＣ－ＨＳで処理した細胞とは異なり、Ｃ３又はＣ５のタンパク質を枯渇させたＣＣ－ＨＳ血清で処理したｉＲＰＥ細胞は、オートファジーのダウンレギュレーションを誘導することができず、ＣＩ－ＨＳ血清と同様の挙動を示した（図４Ｋ、１２Ｄ、ｐ＜０．０５ ＣＩ－ＨＳ対ＣＣ－ＨＳ；ｐ＝ｎｓ ＣＩ－ＨＳ対Ｃ５枯渇又はＣ３枯渇ＣＣ－ＨＳ）。同様に、Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１のブロッカーと結合したＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞は、ＣＩ－ＨＳで処理したサンプルと同様の挙動を示し、ＬＣ３レベルの統計的に有意な低下は示さなかった（ｐ＝ｎｓ ＣＩ－ＨＳ対Ｃ３ａＲ＋Ｃ５ａＲブロッカー＋ＣＣ－ＨＳ；図４Ｋ、１２Ｄ）。全体として、これら結果から、アナフィラトキシン補体シグナル伝達Ｃ３ａＲ１及びＣ５ａＲ１が、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞においてオートファジーを阻害することが確認された。
ＲＰＥ下ドルーゼン沈着物の形成につながる一連の事象について更に理解するために、ｉＲＰＥ細胞にＣＣ－ＨＳを添加した後のＮＦ－κＢの活性化及びオートファジーのダウンレギュレーションの時間的解析を実施した。ＣＣ－ＨＳ添加後６時間以内に、ごく少数の細胞でｐ６５の核移行が明らかになり、２４時間を超えるとほとんどの細胞でこの移行がみられた（図１２ｇ～ｋ）。同様に、ＬＣ３－ＩＩのダウンレギュレーションは、ＣＣ－ＨＳ処理後６時間以内に直ちにみることができ、２４時間までに最高レベルに達した（図１２ｌ～ｑ）。対照的に、ＡＰＯＥ沈着物の明確な増加は４８時間の時点でしかみられず（図１２ｒ～ｕ）、このことは、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞では、ＮＦ－κＢのアップレギュレーション及びオートファジーのダウンレギュレーションがＡＰＯＥ沈着物の形成に先行していることを示唆している。
既に、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達及びオートファジーは、ＳＴＡＴ３活性に関連付けられている（Ｊｏｎｃｈｅｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。ＳＴＡＴ３の転写活性が低下すると、オートファジーがダウンレギュレートされると考えられている（Ｊｏｎｃｈｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルにおいてＳＴＡＴ３活性が変化したかどうかを調べるために、ＣＣ－ＨＳで処理したサンプル及びＣＩ－ＨＳで処理したサンプルにおけるＳＴＡＴ３のリン酸化を比較した。チロシン残基７０５でのＳＴＡＴ３のリン酸化は５～６倍ダウンレギュレートされ（ｐ＜０．００１）、これは、ＳＴＡＴ３の転写活性の低下を示唆している。ｉＲＰＥ細胞におけるＳＴＡＴ３活性の低下がＲＰＥ下ＡＰＯＥ沈着物の形成に直接つながるどうかを確認するために、ジョブ症候群の患者からＲＰＥ細胞を作製した。ＤＮＡ結合変異のため、これら細胞ではＳＴＡＴ３が転写的に不活性である。以前のデータと一致して、ＳＴＡＴ３変異体細胞では、ＣＩ－ＵＳ処理条件下であっても、対照細胞と比較して１０～１２倍多いＡＰＯＥ陽性ＲＰＥ下沈着物がみられた。これは、ＮＦ－ｋＢの過活性化の下流にあるＳＴＡＴ３のダウンレギュレーションもＡＰＯＥ沈着物の形成に寄与していることを示唆している。
実施例４－ｉＲＰＥ細胞保護薬を見つけるためのハイスループットスクリーニング
ｉＲＰＥのＣＣ－ＨＳ処理において高度に複雑な応答が誘発され、ＴＮＦ／ＮＦ－κＢ、オートファジー、糖質代謝、タンパク質分解、イオン恒常性、及び上皮表現型を含む複数の経路が細胞において影響を受けることが、ＲＮＡｓｅｑにより明らかになった（図１１Ｂ）。上皮表現型／ＲＰＥ脱分化の消失は主なＡＭＤ細胞表現型であり、ハイスループットスクリーニングの設定がより容易であると仮定した。ＲＰＥの脱分化を抑制し、細胞の上皮表現型を戻す薬物は、追加のＡＭＤ細胞エンドフェノタイプを回復させる機能も有する可能性がある。以下の３つの理由から、ＣＣ－ＨＳ血清の代わりにカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を用いて薬物スクリーニングを設計した：１）恐らく活性型補体タンパク質が液体ハンドラーチューブの壁に吸着されたため、培地交換に使用した液体ハンドラーチューブではＣＣ－ＨＳが活性を失った；２）Ａ２３１８７と同様に、ｉＲＰＥのＣＣ－ＨＳ処理でも細胞内カルシウム恒常性に欠陥が生じた。ＣＩ－ＨＳ及びＣＣ－ＨＳで処理した細胞におけるベースラインカルシウムレベルは同様であったが（１００～１２０ｎＭ；図５Ａ～Ｃ）、細胞内カルシウム貯蔵部位を活性化させ、細胞内カルシウムを増加させるＡＴＰ刺激は、２００ｎＭの増加を示したＣＩ－ＨＳで処理した細胞に比べて、ＣＣ－ＨＳで処理した細胞では著しく減弱した（８０ｎＭの増加）（図５Ａ～Ｃ、ｐ＜０．０５）；ＣＣ－ＨＳ処理と同様に、Ａ２３１８７処理はｉＲＰＥ細胞の死を引き起こした（図５Ｄ、図１３Ａ）。
９６時間では、３つの濃度（２．５、１０、２５μＭ）のＡ２３１８７は全て細胞に対して完全に毒性であったが、４８時間では、２．５μＭでは５０％の細胞が死亡し、１０μＭでは７０％の細胞が死亡した（図５Ｄ、Ｓ６Ａ）。細胞死の救済についてより大きな余裕が得られるため、薬物スクリーニングには１０μＭの濃度のＡ２３１８７を選択した。１２８０種の薬物を含む市販の薬学的活性化合物ライブラリー（ＬＯＰＡＣ）を２つの異なる濃度、９．２μＭ及び４６μＭでスクリーニングに使用した。３８４ウェルプレートで成熟させたｉＲＰＥ細胞に対してストレッサーである１０μＭ Ａ２３１８７と共に薬物処理を施し、４８時間後にＣｅｌｌＴｉｔｒＧｌｏアッセイを用いてＡＴＰ放出によって細胞死をスコア化した。Ａ２３１８７を含有する全てのアッセイプレートでシグナルの相対的な平均強度が同等であったことから、スクリーニングの一貫性及び再現性が確認された（図１３Ｂ）。薬物濃度の低い（９．２μＭ）プレート７～１０では、薬物濃度の高い（４６μＭ）プレートと比較して細胞死が少なかったことが、正規化された細胞死シグナルによって示された（図１３Ｃ）。実際、４６μＭではほとんどの薬物が細胞毒性であったが、９．２μＭでは４５種の薬物がＡ２３１８７で処理した細胞において細胞生存率の改善（４０％超）を示した（図１３Ｇ）。
薬物データをより綿密に解析した結果、３８４ウェルのレーンの幾つかにおけるアーチファクトが偽陽性シグナルの原因となった可能性があることが明らかになった（図１３Ｇの丸で囲んだ部分）。偽陽性と真のシグナルとを区別するために、２つの異なるｉＰＳＣ株由来のｉＲＰＥを用いて、４５種の薬物全てに対してフォローアップスクリーニングを実施した。フォローアップスクリーニングは、３つの異なるＡ２３１８７濃度（２．５、５、１０μＭ）で、１０ｎＭ～１ｍＭの範囲の７つの異なる濃度の薬物を用いて実施した（図１３Ｄ～Ｆ）。２種の薬物（Ｌ，７４５，８７０及びアミノカプロン酸（ＡＣＡ）；図５Ｅ、Ｆ）のみが２つのｉＲＰＥサンプルにわたって再現性のある細胞保護活性を示し、このことから、幾つかの３８４ウェルレーンにおける偽陽性結果の最初の所見が確認された（図１３Ｇ）。全体として、ＨＴＳスクリーニングによって、インビトロＡＭＤモデルで試験するための２つの薬物が得られた。
実施例５－Ｌ４５６，７８０及びアミノカプロン酸は、ｉＲＰＥ細胞においてＣＣ－ＨＳが誘導するＮＦ－ｋＢ活性化及びオートファジー抑制を反転させた
７点用量応答曲線（図５Ｄ～Ｆ）に基づき、両薬物のＩＣ５０用量（Ｌ４５６，７８０については６μＭ、アミノカプロン酸（ＡＣＡ）については３０μＭ）を選択して、ＣＣ－ＨＳと共にｉＲＰＥ細胞を共処理した。ｐ６５の免疫染色によって、ＣＣ－ＨＳ及びＬ７４５，８７０又はＣＣ－ＨＳ及びアミノカプロン酸で共処理したｉＲＰＥでは、ＣＣ－ＨＳ及びビヒクル（ＤＭＳＯ）で共処理したサンプルと比較して核局在が減少することが明らかになった（図６Ａ～Ｅ）。ｉＲＰＥをＣＣ－ＨＳ及びＬ，７４５，８７０又はアミノカプロン酸で共処理すると、ＣＣ－ＨＳ処理によって誘導された遺伝子発現の変化が反転し（図１３Ｈ、Ｉ）、ＣＣ－ＨＳ及びＤＭＳＯで共処理したサンプルと比較してＮＦ－κＢ経路遺伝子の発現が減少（最大１６倍）する（図１３１）ことが、ＲＮＡｓｅｑによって更に確認された。一貫して、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥにおいてダウンレギュレートされたオートファジー遺伝子は、ＣＣ－ＨＳ及び２つの薬物のいずれかで共処理したｉＲＰＥにおいてアップレギュレートされた（図６Ｆ～Ｊ；１３Ｊ、ＡＴＧ５の免疫染色によって確認（図６Ｆ～Ｊ）。全体として、これら結果から、ＨＴＳで見出された両細胞保護薬は、ＮＦ－κＢ経路を抑制し、オートファジーをアップレギュレートすることによって、ｉＲＰＥ細胞に対するＣＣ－ＨＳ処理の効果を反転できることが実証された。そこで、本発明者らは、ＲＰＥ－上皮表現型、機能、及びＡＭＤ細胞エンドフェノタイプに対するこれら薬物の効果について更に試験することにした。
実施例６－ＣＣ－ＨＳで処理した細胞におけるインビトロでの及びラットモデルにおけるインビボでのｉＲＰＥ上皮表現型の修復
死体の眼でみられ、インビトロモデルで観察されるＡＭＤ細胞表現型の重要な特徴は、ＲＰＥ下の脂質及びタンパク質リッチな沈着物、ドルーゼンマーカーの発現増加、並びに上皮表現型及びＲＰＥ機能性の喪失である。ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルと比較して、ＣＣ－ＨＳ及びＬ７４５，８７０又はＡＣＡで共処理したｉＲＰＥは、ナイルレッド染色によって測定したときに－ＲＰＥ脂質沈着物のレベルが４０～６０％低く（図７Ａ；ＣＣ－ＨＳ＋ビヒクル対ＣＣ－ＨＳ＋Ｌ，７４５，８７０、ｐ＜０．０１；ＣＣ－ＨＳ＋ビヒクル対ＣＣ－ＨＳ＋ＡＣＡ、ｐ＜０．０１）、フィブリン３の発現が４倍低かった（図７Ｂ；ＣＣ－ＨＳ＋ビヒクル対ＣＣ－ＨＳ＋ＡＣＡ、ｐ＜０．０１）。３０００～１３，０００個のＲＰＥ細胞を定量したところ、ＣＣ－ＨＳ＋ビヒクル処理と比較して、ＣＣ－ＨＳ及びＬ７４５，８７０で共処理した細胞は、１６２．２４ｕｍ２（ｐ＜０．０１）の平均面積及び８．２５の六角形度スコア（１０が完全な六角形を表す、ｐ＜１０－１５）を有しており、ＣＣ－ＨＳ及びＡＣＡで処理した細胞は、１０６．７２ｕｍ２（ｐ＜１０－１５）の平均面積及び８．５２の六角形度スコア（ｐ＜１０－１５）を有していた（図７Ｃ、Ｄ）。ＣＣ－ＨＳ＋ビヒクルのみで処理したｉＲＰＥ又はＣＣ－ＨＳ及び２つの薬物で共処理したｉＲＰＥのＲＮＡｓｅｑでも同様の結果が得られた。両薬物とも、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞における脱分化マーカーの発現を抑制（４～１０倍）することができた（図１３Ｈ）。
これら薬物のインビボでの活性を試験するために、ＲＰＥ脱分化のラットモデルを開発した。ラットＲＰＥの０．５ｍｍの領域を、マイクロパルスレーザーを用いて損傷させた。レーザーを照射した領域のＲＰＥ細胞を切除すると、細胞間の接触がなくなるので、レーザー病変の周囲の細胞が脱分化を受ける。これら細胞は、ＣＣ－ＨＳで処理したヒト細胞と同様に、ビメンチンが組織化されずに細胞質でより高発現した状態で拡大及び伸展するようになる。レーザー損傷時にラット眼の網膜下腔に２種の薬物のいずれかを注射することによって、ラットＲＰＥの脱分化に対する薬物の効果を試験した。レーザー病変周辺の４００～４０００個のＲＰＥ細胞の定量により、Ｌ７４５，８７０（ｐ＜１０－１５）及びＡＣＡ（ｐ＜１０－１５）を注射した細胞では、レーザー照射したＲＰＥと比較して面積が１～１．３倍小さい（ＡＣＡ＝３９７．５３ｕｍ２、Ｌ－７４５，８７０＝４３９．５５ｕｍ２、レーザー＝５３７．４３ｕｍ２）ことが明らかになった（図７Ｅ）。また、薬物処理により、六角形度スコアは、レーザー病変処理周辺の細胞における６．９１から、薬物注射処理なしでは７．４２、ＣＣ－ＨＳ＋Ｌ７４５，８７０処理ではＸまで改善した（ｐ＜１０－１４）（図７Ｆ）。これらインビボ実験により、これら２つの薬物の脱分化ＲＰＥ細胞の上皮表現型を修復する能力が確認された。
最後に、薬物が成熟ＲＰＥ表現型及びＲＰＥ機能性を回復させるかどうかについて調べた。薬物及びＣＣ－ＨＳで共処理したサンプルのＴＥＲは、ビヒクル＋ＣＣ－ＨＳで処理したサンプルと比較して２～３倍高く（ｐ＜１０－１５）、ＣＩ－ＨＳで処理した細胞のＴＥＲ値と同様であった（図７Ｇ）。同様に、両薬物の添加により、ＲＰＥ細胞の視細胞外節を貪食する能力は、ＣＣ－ＨＳ及びビヒクルで処理した細胞と比較して部分的に（最大２倍；ｐ＜１０－１５）回復した（図７Ｈ）。結論として、Ｌ－７４５，８７０及びアミノカプロン酸という薬物は、ＣＣ－ＨＳで処理したｉＲＰＥ細胞でみられるＡＭＤ細胞内表現型を反転させ、ＲＰＥの機能性及び上皮表現型を修復することが確認された（図８）。インビトロ及びインビボのデータは、ＡＭＤの発病を遅らせ、その進行を遅らせるためにこれら薬物を使用する可能性を支持する十分なエビデンスを提供する。
実施例７：Ｌ－ＯＲＤ及びＡＭＤの機序、並びに有効な治療法としてのメトホルミンの使用
本実験では、遅発性網膜変性に罹患した家族のメンバーと非罹患同胞から患者特異的ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）を作製し、ＲＰＥに分化させて、その根底にある疾患の機序について調べた。基本条件下では、患者及び対照被験体は、同様の玉石様形態を示し、ＲＰＥ特異的シグネチャー遺伝子の同様の発現パターンを共有しており、また、成熟ＲＰＥマーカーであるＲＰＥ－６５による染色で陽性であった。患者ＲＰＥのこの疾患の２つの主要な特徴：１）実証されているドルーゼンの成分であるＡＰＯＥの基底沈着量の増加及び２）ＣＮＶ形成の原因因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の過剰な頂端分泌を媒介する細胞機能が変化していることを実証することによって、このモデルがヒトの疾患表現型をインビトロで正確に再現することが確認された。ＣＴＲＰ５における変異との関係について調べたところ、疾患の原因となる表現型が観察された。文献で報告されているものとは対照的に、ＣＴＲＰ５は、患者と非罹患同胞との間で同等のレベルで発現及び分泌される。ＲＰＥにおけるその受容体は、ＭＦＲＰでもアディポネクチン受容体２でもなく、アディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）であると同定された。ＡＭＰＫは、ＡＤＰ：ＡＴＰの比率をモニタリングする、細胞のエネルギー状態のセンサーであり、リン酸化されると活性化される。患者ＲＰＥは、血清飢餓下に置かれると、エネルギー状態の変化に対して非感受性になることが示された。更に、このＡＭＰＫ活性の低下により、オメガ３系脂質（ＤＨＡ）を豊富に含む視細胞外節（ＰＯＳ）の利用が減少する。これは、ニューロプロテクチンＤ１（ＮＰＤ１）等のＤＨＡ由来の神経栄養因子の分泌減少によって顕在化する。本研究では、抗糖尿病薬であるメトホルミンが、細胞ストレスに対してＡＭＰＫを再感作（エネルギー恒常性を修復）し、ＰＯＳ利用を修復し、ＡＰＯＥ及びＶＥＧＦの両方の分泌を再分極させることによって患者ＲＰＥ細胞を回復させることが示される。メトホルミンが有効な臨床治療であるどうかを判定するために、糖尿病のためのメトホルミンで同時に処理されたＡＭＤ患者を対象に後向きコホート研究を実施したところ、メトホルミンは臨床転帰を統計的に改善し、発症年齢を２年遅らせることが見出された。まとめると、これら結果は、Ｌ－ＯＲＤ及びＡＭＤの根底にある疾患機序を解明し、現在治療法の選択肢のない「ドライ型ＡＭＤ」の患者に対してメトホルミンの眼内送達が有効な治療法であることを実証する。
Ｌ－ＯＲＤは、典型的には５０歳代～６０歳代に発症する希少遺伝性失明疾患であり、眼底における黄色がかった点状の沈着物及び暗順応の遅れ（夜盲症）を特徴とする。加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）とは異なり、視細胞変性が周辺部（杆体）から進行し、その後、中心の錐体視が徐々に失われ、完全な失明に至る。ＯＣＴにより、網膜下沈着物並びにＲＰＥ下沈着物を指し示すＲＰＥとブルッフ膜との間の分離の領域の存在が明らかになり、これは、観察された杆体機能の喪失が、その下にあるＲＰＥの機能不全又は死に続発する可能性があることを示唆している。ＡＭＤと同様に、疾患の後期の進行した段階は、しばしば脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）への進行を特徴とする（Ａｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｂｏｒｏｏａｈ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｃｕｋｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｍｉｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
遅発性網膜変性（Ｌ－ＯＲＤ）患者２名及び非罹患同胞２名から採取した皮膚線維芽細胞からｉＰＳＣを作製した。Ｃｙｔｏｔｕｎｅ ｉＰＳ ２．０ ｓｅｎｄａｉ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｋｉｔを用いて線維芽細胞の培養物を再プログラミングして、１ドナーあたり２クローンを作製した。全てのｉＰＳＣ株は、典型的なｉＰＳＣ形態を共有しており、多能性マーカー：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＳＳＥＡ４を発現しており、核型的に正常であった。インビトロの胚様体（ＥＢ）アッセイにより、３つの発生胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）の全てから細胞型に分化する能力が実証された。
８つのｉＰＳＣ－ＲＰＥ系統を２つのグループとみなした：４つの健常な非罹患同胞及び４つのＬ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ。この分類は、ドナー（遺伝的）及びクローンのばらつきと、分化及び細胞培養条件に固有の技術的なばらつきとを考慮したものであった。ｉＰＳＣを用いた遅発性神経変性疾患のモデル化は、体内時計をリセットする再プログラミングプロセスが原因で、多くの場合困難であることが証明されているので（Ｖｅｒａ ａｎｄ Ｓｔｕｄｅｒ，２０１５）、このアプローチを用いてデータをグループ化し、解析することにより、複数の患者及び対照間で比較を行って、疾患表現型に直接帰する可能性のある関連する統計的有意差のみを同定するための枠組みを提供した（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｖｉｔａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
インビトロモデルは臨床疾患表現型を再現する
患者株がＳ１６３Ｒ点変異を保持していることを確認するために、ｉＰＳＣの配列を決定した（図１４ａ）。既刊のプロトコルを使用して、ｉＰＳＣをＲＰＥ細胞に分化させ（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）、トランスウェルに播種したところ、そこで、成熟分極ＲＰＥのマーカー（ＴＹＲ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＲＬＢＰ１、ＤＣＴ、ＣＬＤＮ１９、ＧＰＮＭＢ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＢＥＳＴ１、ＴＹＲＰ１、及びＲＰＥ６５）を安定的に発現した（図１４ｂ）。透過型電子顕微鏡観察により、大量の頂端突起（黄色の矢印）、頂端に局在するメラノソーム（マゼンタの矢印）、基底に局在する核（白色の矢印）を有するＲＰＥ細胞の単一の単層が明らかになった（図１４ｃ）。Ｌ－ＯＲＤ患者及び非罹患同胞を比較した走査型電子顕微鏡画像は、トランスウェル上で成長したｉＰＳＣ－ＲＰＥが、古典的な六角形又は玉石状の外観をしていることを示しただけでなく、ＲＰＥ細胞のサイズ及び形状が組織分布的に異なることも明らかになり、これは、この不均一性がＬ－ＯＲＤ患者のＲＰＥの特徴であることを示唆している（図１４ｄ）。細胞サイズの分布に違いがあるかどうかを判定するために、周辺膜タンパク質（ＺＯ－１又はＡＤＩＰＯＲ１）が染色されたｉＰＳＣ－ＲＰＥに対して定量画像解析を実施して、細胞境界の輪郭を描いた。Ｌ－ＯＲＤ患者のＲＰＥでは、非罹患同胞と比較して、細胞面積が有意に大きく、より多様であることが見出された（図１４ｅ）。ＴＥＲ測定により、正常なＲＰＥ密着接合の形成が確認され（図１４ｆ）、ｌｏｒｄ患者特異的ｉＰＳＣ－ＲＰＥと非罹患同胞との間にはいかなる違いも明らかにならなかった。形態及び表現型の変化は、多くの場合、上皮細胞が細胞極性及び細胞接着を失う過程であるＲＰＥ脱分化と関連している。しかし、通常の培養（非ストレス）条件下では、Ｌ－ＯＲＤ患者ＲＰＥにおける脱分化に関連する遺伝子の発現パターンは、非罹患同胞で観察されたものに類似している（図１４ｇ）。同じ条件下で、細胞を溶解させ、そして、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と会合し、脂質輸送に関与することが示されている（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ，２００４）下層の基底アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）沈着物を染色し、分析したところ、Ｌ－ＯＲＤ患者は非罹患同胞に対して全体量及び分布がわずかに異なることが示された（図１４ｈ）。最後に、Ｌ－ＯＲＤ患者のＲＰＥは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の分極分泌の喪失を示した（図１４ｉ）。具体的には、Ｌ－ＯＲＤ患者ＲＰＥ（ｎ＝７）では、非罹患同胞（ｎ＝３）と比較して、基底ＶＥＧＦ分泌が約５０％減少した（ｐ＝０．０４６）。まとめると、これら結果は、ｉＰＳＣ－ＲＰＥモデルが、ＣＴＲＰ５における病原変異に関連する表現型の変化を保存していたことを示唆している。
ＣＴＲＰ５はＲＰＥ代謝の自己分泌制御因子である
Ｌ－ＯＲＤにおいてＳ１６３Ｒ点変異を有することが知られているＣＴＲＰ５タンパク質は、膜ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＭＦＲＰ）もコードしているバイシストロン性遺伝子によって生成される。点変異がＬ－ＯＲＤ患者におけるＣＴＲＰ５又はＭＦＲＰのｍＲＮＡ発現を変化させるかどうかを判定するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＣＴＲＰ５とＭＦＲＰとを比較したデルタＣｔ値は、異なるドナー及びクローン間で類似しており、これは、発現に患者特異的な差がないことを示す（図１５ａ）。興味深いことに、ＣＴＲＰ５のウェスタンブロットは、Ｌ－ＯＲＤ患者のＲＰＥの細胞溶解物においてタンパク質発現が減少することを示した（図１５ｂ）。図１５ｃ Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるＣＴＲＰ５タンパク質レベルをデンシトメトリーによって定量し、β－アクチンに対して正規化したところ、発現が７倍減少していることが示された。ＣＴＲＰ５のＥｌｉｓａ及びＷＢは、ＣＴＲＰ５が頂端に分泌されることを示す（図１５ｄ）。基底室からのＣＴＲＰ５の測定値は検出限界以下であった（データは示さない）。ＣＴＲＰ５における変異がＬ－ＯＲＤにおいて疾患表現型を生じさせる機序を特定するために、超解像顕微鏡を用いて、ＣＴＲＰ５のアディポネクチンに対する相同性（Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ｙａｍａｕｃｈｉ ａｎｄ Ｋａｄｏｗａｋｉ，２０１３）及び膜ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＭＦＲＰ）との報告されている相互作用（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．）に基づいて推定候補受容体をスクリーニングして、特異的リガンド－受容体相互作用を同定した。免疫蛍光共焦点顕微鏡観察により、ＣＴＲＰ５（赤色－リガンド）及びアディポネクチン受容体１（ＡＤＩＰＯＲ１、緑色－受容体）が共標識されることが明らかになった（図１５ｅ）。培養したヒトｉＰＳＣ－ＲＰＥのネイティブ免疫金標識により、ＣＴＲＰ５（１２ｎｍ）とＡＤＩＰＯＲ１（６ｎｍ）との相互作用が確認された（図１５ｆ）。図１５ｇは、確率論的な相互作用を求めるために３次元構造上の制約を考慮して、内在性膜タンパク質ＡＤＩＰＯＲ１（青）のモデル及びそのＣＴＲＰ５（青緑（ｔｅａｌ））との相互作用を示す。図１５ｇに示すように、ＣＴＲＰ５は、アディポネクチンと同様に、基本構造単位として三量体を形成するが、花束様の配置に類似している高次構造も形成する傾向がある（Ｔｕ ａｎｄ Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ，２０１２）。このモデルを用いて、Ｌ－ＯＲＤにおけるＳ１６３Ｒ変異のシミュレーションを行った。正に帯電しているアルギニンを獲得すると、ＡＤＩＰＯＲ１表面上の同様に帯電しているアルギニンが反発することによって、ＣＴＲＰ５とＡＤＩＰＯＲ１との静電相互作用が変化し、受容体に対する結合親和性が弱くなる（図１５ｈ）。
ＣＴＲＰ５は、細胞のエネルギー状態に対するＡＭＰＫの感受性を微調整する
アディポネクチン及びその受容体は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）依存的機序で脂質代謝を制御することが知られている。そこで、ＣＴＲＰ５における変異がＡＭＰＫの活性化、及びエネルギー恒常性を制御するシグナル伝達経路を変化させるかどうかを判定するために、以下の実験を設計した。
血清含有培地でのベースライン時、ＡＭＰＫ活性の尺度であるホスホ－ＡＭＰＫ（ｐ－ＡＭＰＫ）レベルは、非罹患同胞に比べてＬ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは２０％高かった（ｐ＜０．０５）（図１６ａ）。
そこで、図１６ｂでは、ｉＰＳＣ－ＲＰＥを、血清の存在下（＋）及び非存在下（－）で組換えＣＴＲＰ５球状体（０．２μｇ／ｍＬ ｇＣＴＲＰ５）と共に３０分間インキュベートして、ＡＭＰＫシグナル伝達におけるその役割を評価した。血清含有培地中の同胞及び患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥにｇＣＴＲＰ５を添加しても、ＡＭＰＫ活性は変化しなかった。しかし、血清枯渇培地では、ｇＣＴＲＰ５を添加すると、非罹患同胞ではｐ－ＡＭＰＫレベルが２０％低下したが、Ｌ－ＯＲＤ患者では低下しなかった（ｐ＜０．０５）。これらデータは、ＣＴＲＰ５が、ＡＭＰＫレベルを微調整して細胞のエネルギー需要を満たすための代謝ノブとして作用しているエビデンスを提供する。
ＡＤＩＰＯＲ１－ＣＴＲＰ５（受容体－リガンド）相互作用をより深く解明するために、漸増濃度の組換え完全長ＣＴＲＰ５を外添することにより、（無血清培地で）リガンド用量応答曲線を作成した（図１６ｃ）。非罹患同胞では、ＣＴＲＰ５の用量依存的な増加によりｐ－ＡＭＰＫレベルが有意に低下した（２５μｇ／ｍＬで約５０％減少、ｐ＜０．０５）が、一方、Ｌ－ＯＲＤ患者では、ＣＴＲＰ５の添加はＡＭＰＫ活性に影響を与えなかった。これら知見は、変異型ＣＴＲＰ５はネイティブＣＴＲＰ５と会合して複合体（高次構造）を形成し、これがその正常な生物活性を撹乱することを示唆している。
ＡＭＰＫは、細胞のエネルギー状態の感受性指標であり、ＡＭＰ又はＡＴＰのレベルによって正準的に活性化される（Ｈａｒｄｉｅ ａｎｄ Ｌｉｎ，２０１７）。したがって、ＡＭＰＫのリン酸化を刺激することが知られている条件（ＡＭＰ：ＡＴＰ比の増加）下での同胞及び患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥのＡＭＰＫ活性（無血清培地中）の特性評価を行った（図１６ｄ）。ｉＰＳＣ－ＲＰＥを血清枯渇培地で５時間インキュベートし（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００９）、続いて、ＡＩＣＡＲ（ＡＭＰアナログ）又はＢＡＭ１５（ＡＴＰ産生を減少させるミトコンドリアアンカプラー）に３０分間暴露した。予想通り、非罹患同胞に由来するｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、ＡＭＰ：ＡＴＰ比が増加するとＡＭＰＫが活性化された。興味深いことに、同実験条件下において、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、ＡＭＰレベルの変化もＡＴＰレベルの変化も感知することができなかった。これら知見は、ＡＭＰもＡＴＰも感知できないことが、Ｌ－ＯＲＤ患者における矛盾したＡＭＰＫの活性化の根底にある主要な機序であり、治療介入のための新規標的となる可能性があることを示唆している。
また、アディポネクチンは、セラミダーゼ活性を刺激して細胞の生存を促進することも知られている（Ｋａｄｏｗａｋｉ ａｎｄ Ｙａｍａｕｃｈｉ，２０１１）。Ｌａｋｋａｒａｊｕ博士の研究室によって報告された通り、ＲＰＥの頂端表面における過剰のセラミドは、細胞内補体（Ｃ３ａ）の生成及びＲＰＥ代謝のｍＴＯＲ再プログラミングにつながる病理学的特徴である可能性がある（Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。患者細胞におけるＡＭＰＫ活性化の増加と一致して、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるセラミドの免疫染色（正面図）では、非罹患同胞と比較して過剰のセラミドはみられず、このことは、上記ＡＭＰＫの欠陥がＬ－ＯＲＤにおける疾患の病態形成の主要なメディエーターである可能性があることを示唆している。
ＡＭＰＫは、Ｌ－ＯＲＤで観察される疾患表現型の原因となる可能性がある多くの代謝経路の中心的な制御因子である。ＡＭＰＫ関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルから、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥではＰＮＰＬＡ２（ＰＥＤＦ－Ｒ）が高発現することが明らかになった。興味深いことに、ｐ－ＡＭＰＫのレベルが上昇すると、骨格筋細胞においてＰＥＤＦ－Ｒの発現が増加することが報告されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。免疫組織化学的検査により、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、非罹患同胞と比較してＰＥＤＦ－Ｒ（赤）のタンパク質発現が増加していることが確認された（図１６ｆ）。まとめると、これら結果は、Ｌ－ＯＲＤ患者（ヒト）のＲＰＥでは、ＡＭＰＫによって撹乱されたＰＥＤＦ－Ｒのレベルが加齢による病理学的変化の原因である可能性がある（誘発する可能性がある）ことを示唆している。
Ｌ－ＯＲＤにおけるＡＭＰＫの上昇は、ＰＥＤＦ－Ｒが媒介する網膜神経保護を妨害する
ＲＰＥの病理がどのように生じるかを調べるために、ＰＥＤＦ－Ｒが媒介する神経栄養シグナル伝達及び血管新生阻害剤としてのその役割の観点から、Ｌ－ＯＲＤ患者及び非罹患同胞の比較研究を実施した。図１７ａは、ＣＴＲＰ５における変異が、加齢しているＲＰＥにおける正常な恒常性を破壊し、その結果、脂質の取り込み及び利用の不均衡を生じさせるモデルを表す。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、酸化ストレスが誘導するアポトーシスを補償することがＲＰＥ細胞において報告されている現象である貪食能の上昇を示す（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。脂質の取り込みの増加には、リン脂質を切断し、ＤＨＡ、エイコサノイド、及び神経保護Ｄ１（ＮＰＤ１）等の生物活性化合物の前駆体分子として機能する遊離脂肪酸を生成するホスホリパーゼＡ２活性の上昇が必要となる。しかし、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、ベースライン時のＡＭＰＫのレベルが上昇すると、ホスホリパーゼＡ２酵素活性が阻害され、これら神経保護因子の産生が阻止される。図１７ｂでは、ｐｈＲｏｄｏで標識した外節を供給したｉＰＳＣ－ＲＰＥのＦＡＣＳ解析により、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、非罹患同胞と比較して１．５倍多いＰＯＳを貪食することが明らかになった。脂質取り込みの増加にもかかわらず、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるベースライン時のホスホリパーゼａ２活性が約４０％低下しており、これはＡＭＰＫ活性の上昇によるものである可能性が高い（ｐ＜０．０５、図１７ｃ）。ｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、ホスホリパーゼＡ２の酵素活性は、ｐＡＭＰＫレベルに依存する（図１７ｄ）。ＷＴ ｉＰＳＣ－ＲＰＥにおいて血清飢餓によってｐＡＭＰＫレベルが上昇すると、ホスホリパーゼＡ２活性が約３０％（ｐ＜０．０５）低下し、これはＬ－ＯＲＤ患者で観察される病態に類似している。ＲＰＥにおいて、ＰＥＤＦは、主に頂端に分極して分泌される（Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｏｎｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかし、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、ＰＥＤＦ分泌のＰＥＤＦ比（Ａｐ／Ｂａ）は著しく低い（図１７ｅ）。ＰＥＤＦ－Ｒの酵素活性の低下と頂端のＰＥＤＦ量の減少とが相まって、ミトコンドリア機能（基礎呼吸、プロトン漏出、ＡＴＰ産生）が著しく低下し、神経保護Ｄ１（ＮＰＤ１）の頂端分泌が減少する（ｐ＜０．０５）。まとめると、これら結果は、Ｌ－ＯＲＤ患者における脂質代謝の変化が、いかにして視細胞のＰＥＤＦが媒介する神経保護の低下に寄与するかを示す。
メトホルミンは、ＡＭＰＫ及び病理学的表現型を再感作する
蓄積されつつあるエビデンスは、ＡＭＤを含む多くの疾患における共通の発症機序として脂質代謝の撹乱を示唆している（Ｂａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。これら代謝欠陥は、ＲＰＥ細胞の長期的な健康に関係している。ＲＰＥ細胞におけるＰＥＤＦ－Ｒ欠損の結果を判定するために、Ｌ－ＯＲＤのｉＰＳＣ－ＲＰＥ及び非罹患同胞に７日間視細胞外節（ＰＯＳ）を供給して、高脂肪が誘導する上皮障害を悪化させた。同時に、抗糖尿病薬であるメトホルミンの脂質減少作用（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）がＲＰＥの脱分化及び極性の消失を反転させることができるかどうかについて調べた。細胞境界を特定するためにＺＯ－１（緑）で染色し（図１８ａ）、ＲＥＳｈＡＰＥ（クラウドコンピューティングによる細胞形態計測分析装置）の自動画像解析アルゴリズムを使用してＲＰＥ細胞の形態計測分析を実施することにより、ＲＰＥ極性の重要な形態学的指標である細胞サイズを評価した。
患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥを、ＰＯＳ供給の初日から始めて毎日３ｍＭのメトホルミンで処理した（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＰＯＳを供給した患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、供給していない細胞と比較しても、細胞サイズ及びばらつきの増加を示した。強い空間的不規則性を示したヒトのＡＭＤ眼でも同様の形態計測が報告されている（Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．２０１６）。注目すべきことに、メトホルミン処理によって、患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるＰＯＳストレスが誘導する拡大は大きく抑制された（ｐ＜２ｅ－６）（図１８ｂ）。図１８ｃは、同様にＰＯＳを供給したｉＰＳＣ－ＲＰＥにおいて、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要構成成分であるアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）の分布が影響を受けることを示す。
非罹患同胞では、ＡＰＯＥは、ＲＰＥの頂端及び基底面から分泌されるが、主に頂端にあることが判明し（図１８ｃ、上）、そこで、脂質輸送において役割を果たしている可能性がある（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。対照的に、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、ＡＰＯＥレベルの上昇を示した。白色の矢印は、ＡＭＤにおけるＡＰＯＥリッチなドルーセン沈着物を連想させるＡＰＯＥ沈着物の基底における増加を示す（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。メトホルミンで処理した患者のＲＰＥでは、ＡＰＯＥを含有する基底沈着物（黄色の矢印）の蓄積が改善される。Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して、頂端及び基底のＡＰＯＥ陽性染色の周囲に矩形の関心領域を描き、局部的な平均積分強度を定量し、そのデータを図１８ｄにまとめる。
図１８ｅでは、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥをメトホルミンで前処理（１週間半）したところ、ＡＩＣＡＲ（ＡＭＰアナログ）に対する感受性が回復した。この結果は、メトホルミンが正常なエネルギー恒常性を修復し、臨床的価値を有する可能性があることを示唆している。
また、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、７日間ＰＯＳを供給することにより、８５個のＥＭＴ関連遺伝子の発現プロファイルが変化した（図１８ｇ）。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、非罹患同胞と比較して、上皮間葉転換に関連する５４の遺伝子（例えば、ＥＳＲ１、ＷＮＴ５ａ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＮＧ１１、ＴＭＥＦＦ１、ＢＭＰ７、及びＲＡＣ１）が＞４倍アップレギュレートされた（白）。対照的に、メトホルミンで処理したＬ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（マゼンタ）では、４２のＥＭＴ遺伝子（例えば、ＳＰＦ、ＤＳＣ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＶＳＰ１３Ａ、ＣＡＭＫ２Ｎ、ＴＧＦＢ１、ＢＭＰ１）が＜４倍ダウンレギュレートされた。まとめると、これらデータは、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥが、１）脂質ストレスが誘導する上皮間葉転換を受けやすく、２）メトホルミンがＡＭＰＫを再感作して、細胞サイズ、ＡＰＯＥ沈着、ＶＥＧＦ分泌、及び遺伝子発現における病理学的変化を軽減できることを示す。
更に、加齢に伴う低酸素微小環境も、同様に脂質代謝を変化させることが示されている（Ｋｕｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この撹乱がＬ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるＶＥＧＦ分泌をどのように制御するかについて特定するために、低酸素ストレス（３％Ｏ２、６時間）を使用した。正常酸素圧条件と同様に、Ｌ－ＯＲＤ患者は、脱分化（ＥＭＴ）の指標である頂端分泌レベルの上昇を伴う誤分極したＶＥＧＦ分泌を示した。メトホルミンで２４時間処理しても、この表現型を回復させるには不十分であり（データは示さない）、このことは、メトホルミンが主に遺伝子発現を変化させることによってその効果を発揮することを示唆している（図１８ｅ）。この仮説を支持して、メトホルミンで１週間半前処理すると、低酸素が誘導する頂端のＶＥＧＦ分泌が軽減され（ｐ＝０．００５）、ＶＥＧＦの極性が回復した（図１８ｆ）。
メトホルミンがＡＭＤの治療に有益であり得るという臨床エビデンスがあるかどうかを判定するために、ＡＭＤでＫａｉｓｅｒ Ｐｅｒｍａｎａｎｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌに通院している患者の後向きコホート研究を実施して、個体によるメトホルミン同時使用が診断に影響するかどうかについて試験した。一般的に早発性であるとみなされる（Ｓｃｈｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５）５０～５９歳の年齢層に属する個体については、本研究により、メトホルミンが発症年齢を丸２年有意に遅らせることが明らかになった（ｐ＝０．００１）。
まとめると、これら結果は、メトホルミン又はＡＭＰＫ感作薬がＲＰＥの表現型を修復し、ドライ型ＡＭＤの有望な治療薬となる可能性があることを示唆している。
実施例８－遅発性網膜変性患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥの解析により、健常ＲＰＥ表現型の制御におけるＡＭＰＫの役割を同定し、既知の２型糖尿病薬であるメトホルミンをＡＭＤ及び他の網膜変性疾患の有望な治療のために再利用することにつなげた。
遅発性網膜変性（Ｌ－ＯＲＤ）は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）等、より一般的な網膜変性と同じ臨床表現型（ドルーゼン様沈着物、疾患の後期に発生し得る脈絡膜血管新生）の多くを共有する希少遺伝性単一遺伝子性網膜ジストロフィーである。
Ｌ－ＯＲＤの根底にあるのは、グルコースの重要な制御因子である公知のアディポカインであり、アディポネクチンと構造が類似しているＣＴＲＰ５における変異であり、そして、脂質の代謝が変化した代謝は、網膜変性の多くの形態と関連している。
遅発性網膜変性又はＬ－ＯＲＤは、通常４０歳以降にＡＭＤに類似した病態を示す。Ｌ－ＯＲＤ患者には暗順応の遅れがあり、これは、視細胞及び視覚サイクルに問題があることを示している。更に、ドルーゼン様の沈着物を有し、これは、ＦＡＦにおいて高蛍光の沈着物として現れる。最終的には、ＯＣＴでみられる視細胞の内節及び外節が破壊される。
Ｌ－ＯＲＤは、ＲＰＥにおいて高発現するアディポネクチンパラログであるＣＴＲＰ５における単一ミスセンス変異によって引き起こされる。ＣＴＲＰ５の球状ドメインは、アディポネクチンと４０％相同であり、これは、細胞の代謝において可能性のある役割を示唆している。
細胞代謝の重要な指標となるのがＡＭＰＫであり、これは、ＡＴＰ／ＡＭＰの比をモニタリングし、栄養が枯渇している間リン酸化（活性化）される重要なエネルギーセンサーである。本発明者らは、患者は過活性のｐＡＭＰＫレベルを有していたので（データは示さない）、細胞がＡＴＰ及びＡＭＰにおける変化に対して非感受性になるという仮説を立てた。血清飢餓の条件下（３時間）では、Ｌ－ＯＲＤ患者及び非罹患同胞の両方で、ｐＡＭＰＫレベルがベースラインと比較して上昇する。
ＡＭＰアナログであるＡＩＣＡＲを添加（３０分）すると、非罹患同胞ではＡＭＰＫのリン酸化が更に刺激されるが、Ｌ－ＯＲＤ患者では刺激されない。ＡＴＰ産生を阻害するミトコンドリアアンカプラーであるＢＡＭ１５を添加（３０分）しても、非罹患同胞ではＡＭＰＫのリン酸化が更に刺激されるが、Ｌ－ＯＲＤ患者では刺激されない。事実、Ｌ－ＯＲＤ患者は、血清飢餓条件下ではＡＴＰ及びＡＭＰの変化に対して非感受性である。メトホルミン処理は、３ｍＭのメトホルミンを頂端及び基底培地に１週間半から２週間にわたって添加することからなっていた。メトホルミンで処理したＬ－ＯＲＤ患者は、血清飢餓の後、ＡＩＣＡＲに対する感受性を取り戻した。
遺伝子発現を通してＬ－ＯＲＤ患者におけるＡＭＰＫシグナル伝達経路の変化を更に評価したところ、関与する遺伝子の多くにおいて代償的なダウンレギュレーションが明らかになった。メトホルミン（３ｍＭ）で１週間半から２週間処理すると、一部の遺伝子は更に減少するが、他の遺伝子はアップレギュレートされる。特に、ＰＮＰＬＡ２（ＰＥＤＦ－Ｒ）が有意に増加する。ＲＰＥでは、ＰＥＤＦ－Ｒが、脂肪酸代謝において重要な役割を果たしている。
図１９では、Ｌ－ＯＲＤ患者の遺伝子発現プロファイルが、ベースライン時のｐＡＭＰＫの活性化を制限する代償的な試みを示唆していることが示されている。
非罹患同胞（Ｎ＝８）、Ｎ＝２名のドナーから
（２４Ｇから２つ、Ｚ８から２つ、Ｙ９から２つ、９ｉから２つ）
ＬＯＲＤ患者（Ｎ＝７）、Ｎ＝２名のドナーから
（ドナーＥ１から３つ、ドナーＫ８から４つ）、
メトホルミン患者（Ｎ＝４）、Ｎ＝２名のドナーから
ＲＰＥによるサイトカインの分極分泌は、その成熟及び分化した状態の特徴である。上皮間葉転換（ＥＭＴ）を促進する条件下では、ＲＰＥは、その形態を失い、その分泌が誤分極するようになる。ＲＰＥの脱分化は、ＡＭＤ等の網膜変性において頻繁に提案される機序である。典型的には、ＶＥＧＦは、ＲＰＥによって主に基底に分泌される。Ｌ－ＯＲＤ患者では、ＥＬＩＳＡによって評価したとき、ＶＥＧＦ分泌の極性が失われている。対照的に、メトホルミン（３ｍＭ）で１週間半から２週間処理すると、分極されたＶＥＧＦ分泌が回復し、これは、メトホルミンがＥＭＴ阻害を媒介している可能性があることを示唆している。これを図１９に示す。
未処理：
非罹患同胞
頂端Ｎ＝７
基底Ｎ＝３
Ｌ－ＯＲＤ患者
頂端Ｎ＝７
基底Ｎ＝３
図２０は、ＲＰＥによってＢ－ｈＢが生成されることを実証し、これは、貪食された視細胞外節から得られる脂肪酸（そのうちパルミチン酸が主成分である）を利用し、脂肪酸酸化と呼ばれるプロセスを通じて自己持続性代謝物を生成し、それによって、網膜にグルコースを残す。本発明者らは、脂肪酸酸化及びケトン体形成（Ｂ－ｈＢ）の増加が、網膜下腔における脂質蓄積の減少を引き起こし得ると仮定した。メトホルミン処理により、Ｌ－ＯＲＤ患者のＲＰＥによる頂端Ｂ－ｈＢ分泌が有意に２５％増加した。
メトホルミン処理は、３ｍＭのメトホルミンを頂端及び基底培地に１週間半から２週間添加することからなっていた。
各バープロットは、２人の異なるドナー（非罹患同胞又は患者）から収集したＮ＝１２の生物学的複製を表す。＊は、ｐ値＜０．０５を示す。
実施例９－メトホルミンは網膜変性疾患の発症年齢の中央値を遅らせる
医薬品「メトホルミン」（商品名：Ｆｏｒｔａｍｅｔ、Ｇｌｕｏｐｈａｇｅ、Ｇｌｕｍｅｔｚａ、Ｒｉｏｍｅｔ）は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の治療に広く使用されている。メトホルミンの安全性プロファイルは、欧米市場での長年にわたる使用に基づいて広く確立されている。メトホルミンは、糖尿病患者の血糖を減少させる強力な効果についてＡｒｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの子会社であるＲｏｎａによって英国で１９５８年に初めて販売され、その後、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼＡＭＰＫ酵素を活性化して細胞代謝及び血糖値を正常化することが見出された。
メトホルミンがＡＭＤの治療に有益であり得るという臨床エビデンスがあるかどうかを判定するために、ＡＭＤでＫａｉｓｅｒ Ｐｅｒｍａｎａｎｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌに通院している患者の後向きコホート研究を実施して、個体によるメトホルミン同時使用が診断に影響するかどうかについて試験した。一般的に早発性であるとみなされる（Ｓｃｈｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５）５０～５９歳の年齢層に属する個体については、本研究により、メトホルミンが発症年齢を丸２年有意に遅らせることが明らかになった（ｐ＝０．００１）。この研究の結果を図１４～１８に示す。
図１４ａ～１４ｉは、患者特異的ｉＰＳＣ－ＲＰＥが疾患の原因となる変異を保持していたことを実証する各種試験データを示す。ａ）サンガー配列解析により、Ｌ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣにＳ１６３Ｒ変異が存在することが確認された。配列を上に示し、変異によって影響を受けた塩基を配列クロマトグラムにおいて黒い矢印で示す。ヘテロ接合性点変異（ＡＧＣ→ＡＧＣ、ＡＧＧ）は、ピーク内にピークとして現れる。ＤＮＡサンガーシークエンス用のプライマーについては、方法に記載する。ｂ）指定のＲＰＥシグネチャー遺伝子のデルタＣｔ値のボックスプロット図。各ボックスは、少なくとも２人の異なる非罹患同胞又はＬ－ＯＲＤ患者ドナーからのｎ＝３のｉＰＳＣ－ＲＰＥから測定されたデルタＣｔの分布を表す。ボックスの底部及び頂部は、１０パーセンタイル及び９０パーセンタイルを規定する。ボックス内のバンドは、中央値を規定する。ｃ）連続７日間にわたって視細胞外節を与えたｉＰＳＣ－ＲＰＥ単層の透過型電子顕微鏡写真。正常なＲＰＥの形態と、大量の頂端突起（黄色の矢印）、メラノソーム（マゼンタの矢印）、基底に局在する核（白色の矢印）を含む高度に分極した構造とを示す、非罹患同胞（上）及び患者（下）由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥのＴＥＭ。スケールバー：２μｍ。ｄ）保持された六角形の形態及び大量の頂端突起を示す、非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥのＳＥＭ画像。ｅ）非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥの細胞面積のボックスプロット。ｉＰＳＣ－ＲＰＥ単層を膜マーカー（ＡＤＩＰＯＲ１）で免疫染色して、細胞形態のマルチパラメトリック解析のために六角形状の輪郭を描いた。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、非罹患同胞（７９．８＋／－５７．５μｍ２）と比較して、平均サイズが大きく（１０７．７＋／－６８．５μｍ２）、より多様である傾向があった（ｐ＝０．００００２６）。同様の空間的不規則性は、ヒトＡＭＤドナーの眼でも報告されている（Ｒａｓｈｉｄ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＲＰＥ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｅｅｔ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｄ Ｅｙｅｓ．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ８５４，７５７－７６３，（２０１６））。ｆ）ＥＶＯＭ上皮電圧抵抗計（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いた経上皮抵抗測定によって、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞間の機能的密着接合の確立を測定した。疾患に関連するミスセンス変異は、ＲＰＥ単層の経上皮抵抗を変化させない。ｇ）脱分化（上皮間葉転換）を受けるＲＰＥ細胞に多く存在する遺伝子の散布図から、Ｌ－ＯＲＤ患者細胞は、正常条件下では、ＲＰＥが罹病しているか又はストレスを受けたことを示唆する異常な表現型を示さないことが明らかになった。非供給（灰色で示す）患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおける脱分化（ＥＭＴ）関連遺伝子の発現は、非供給非罹患同胞の発現パターンに類似している。ｈ）通常の培養条件に供された非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、同様のレベルのＡＰＯＥ基底沈着物を示す。スケールバー：５０μｍ。ｉ）正常酸素圧条件下でｉＰＳＣ－ＲＰＥによって上清に放出されるＶＥＧＦをＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＲＰＥの高度に分極した構造は、ＶＥＧＦを含むタンパク質の方向性輸送及び分泌に関与している。当然ながら、非罹患同胞に由来するｉＰＳＣ－ＲＰＥ（灰色で示す）は、分極した様式でＶＥＧＦを主に基底に分泌した。Ｌ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥは、極性を失い、基底ＶＥＧＦ分泌が約５３．３％減少した（Ｐ＝０．０４６）。
図１５ａ～１５ｈは、Ｌ－ＯＲＤ患者由来のＲＰＥにおけるＣＴＲＰ５の発現及び局在を実証する各種試験データを示す。ａ）Ｌ－ＯＲＤでは、Ｓ１６３Ｒ変異は、ＣＴＲＰ５（分泌タンパク質）及び膜ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＭＦＲＰ）をコードしてるバイシストロン性転写物に生じる。この変異は、いずれの転写物のｍＲＮＡ発現も変化させない。ｂ）非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥからの細胞溶解物の代表的なウェスタンブロット。ＣＴＲＰ５は分泌タンパク質であるので、非罹患同胞における濃い２５ｋＤａのバンド（ＣＴＲＰ５）は、ＣＴＲＰ５が全細胞抽出物においてより多く保持されていることを示している可能性がある。ｃ）β－アクチンに対して正規化したウエスタンブロット（細胞溶解物）の定量（ｐ＜０．０５）。ｄ）非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者からのｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、４８時間後にＥＬＩＳＡによって測定したとき、ＣＴＲＰ５は頂端側に選択的に分泌されていた。非罹患同胞及び患者による分泌量の間に測定可能な差は認められなかった。基底培地ではごく微量のＣＴＲＰ５しか検出されなかった（データは示さない）。ｅ）非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者からのｉＰＳＣ－ＲＰＥの免疫蛍光染色のＡｉｒｙｓｃａｎ共焦点顕微鏡画像。膜受容体ＡＤＩＰＯＲ１（緑で示す）は、ＣＴＲＰ５（赤で示す）、ＨＯＥＳＣＨＴ（核染色を青で示す）と共局在している。ｆ）ネイティブ免疫標識ＡＤＩＰＯＲ１（６ｎｍ免疫金）及びＣＴＲＰ５（１２ｎｍ免疫金）のＴＥＭ画像から、受容体－リガンド相互作用（黒矢印で示す）のエビデンスが得られる。ｇ）公開されている結晶構造を用いたＡＤＩＰＯＲ１（青で示す）とＣＴＲＰ５（緑で示す）との間のタンパク質－タンパク質相互作用の３次元モデル。ｈ）セリン（極性）がアルゲニン（＋）に変異すると、残基の電荷が正に変化する。この正電荷は隣接するアルゲニン残基と反発すると予測され、その結果、高次構造が変化して変異型ＣＴＲＰ５のＡＤＩＰＯＲ１への結合親和性が低下する。
図１６ａ～１６ｆは、ＡＤＩＰＯＲ１に対するＣＴＲＰ５の拮抗作用が低下すると、Ｌ－ＯＲＤにおけるＡＭＰＫシグナル伝達が変化することを実証する各種試験データを示す。ａ）ＥＬＩＳＡによって測定したホスホ－ＡＭＰＫレベルは、５％血清含有培地で培養したＬ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｎ＝１５；（１２０．６％±０．０７５））におけるベースライン活性が、非罹患同胞（Ｎ＝２１；１００％±０．０４）と比べて約２０．６％増加することを示す。ｂ）アディポネクチンを含有する血清の存在下及び非存在下における組み換え型球状ＣＴＲＰ５のホスホ－ＡＭＰＫレベルに対する影響。データは、未処理状態（０ｕｇ／ｍＬ ｇＣＴＲＰ５）に対して正規化した。非罹患同胞では、天然リガンドであるアディポネクチンの非存在下（０％血清条件下）で０．２μｇ／ｍＬの組み換え型球状ＣＴＲＰ５を添加すると、ｐＡＭＰＫレベルが２０％低下することが明らかになった（Ｎ＝９；０．８１±０．０４）。この有意な減少は、ベースライン条件下では５％血清の存在によってマスクされる（Ｎ＝６；０．９９±０．０１）。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、０．２μｇ／ｍＬの組み換え型球状ＣＴＲＰ５の添加は、血清の非存在下（Ｎ＝６；０．９８±０１）でさえも、ｐ－ＡＭＰＫレベル（Ｎ＝６；１．１２±０．０９）に対して測定可能な影響を有しない。ｃ）ｉＰＳＣ－ＲＰＥ由来のｐ－ＡＭＰＫレベルに対する組み換え型完全長ＣＴＲＰ５の用量応答効果。非罹患同胞（５ｈ ０％血清）では、組み換え型完全長ＣＴＲＰ５の濃度が増加するにつれて、処理（３０分）後にＡＭＰＫのリン酸化レベルが低下する。２５ｕｇ／ｍＬ ＣＴＲＰ５は、ｐ－ＡＭＰＫレベルを約５０％低下させる（Ｎ＝６、４７．８９％±０．１３）。患者のＲＰＥを同様の濃度の完全長ＣＴＲＰ５に曝露しても、ｐ－ＡＭＰＫレベルの測定可能な変化は誘発されなかった。ｄ）血清の非存在下においてＡＭＰ：ＡＴＰ比を上昇させる条件では、非罹患同胞と比較して患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおけるｐ－ＡＭＰＫレベルが変化する。全てのデータは、０％血清含有条件に対して正規化する。２ｍＭのＡＭＰアナログであるＡＩＣＡＲ又は５００ｎＭのＡＴＰ産生を減少させるミトコンドリアアンカップラーであるＢＡＭ１５で３０分間処理すると、非罹患同胞ではＡＭＰＫレベルが更に上昇する。対照的に、患者ＲＰＥのｐ－ＡＭＰＫレベルは、ＡＭＰ又はＡＴＰのレベルの変化に対して非感受性である。しかし、３ｍＭメトホルミンで２週間処理すると、Ｌ－ＯＲＤ患者のＡＭＰ：ＡＴＰ比の変化に対する感受性が回復する。ｅ）Ｌ－ＯＲＤ患者由来のｉＰＳＣ－ＲＰＥでＡＭＰＫが上昇すると、ＰＥＤＦ－ＲのｍＲＮＡの発現が有意にアップレギュレートされる（約８倍）。ｆ）免疫組織化学的検査によって、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、頂端膜に局在するＰＥＤＦ－Ｒタンパク質の発現上昇が確認された。
図１７ａ～１７ｆは、Ｌ－ＯＲＤ患者における脂質代謝の変化が神経保護シグナル伝達の減少の原因となることを実証する各種試験データを示す。ａ）脂質リッチな外節が貪食細胞によって取り込まれ、ホスホリパーゼによって遊離脂肪酸に消化され、それをＲＰＥがケトン体生成及びＮＰＤ１等の神経保護脂質メディエーターの合成に利用する様子を描写した推定モデル。ヒトがん細胞株では、ｐ－ＡＭＰＫレベルが上昇すると、ホスホリパーゼＤ活性が抑制されることが示されており（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０，６９８６－６９９３，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１４．６２２５７１（２０１５）．）、Ｌ－ＯＲＤ患者において脂質取り込みが増加すると、ＤＨＡ由来のニューロプロテクチンＤ１の利用及び合成が減少し、未消化脂質が蓄積するという機序が提案されている。ｂ）ｐｈ－Ｒｈｏｄｏで標識した外節の取り込みをＦＡＣＳによって定量して、非罹患同胞及びＬ－ＯＲＤ患者に由来するｉＰＳＣ－ＲＰＥの貪食率を比較した。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｎ＝１４；１１．８１±３．５５）の貪食による取り込みは、非罹患同胞（Ｎ＝１５；７．８６±３．９４）よりも３３％高かった。この脂質取り込みが増加する現象は、酸化ストレスに対する保護応答としてＲＰＥで報告されている。（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎ Ｄｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ １０４，１３１５８－１３１６３，（２００７）．）。ｄ）全体的なＰＥＤＦ－Ｒの発現が有意に増加したにもかかわらず、Ｌ－ＯＲＤ患者のホスホリパーゼＡ２活性は、ＥＬＩＳＡによって非罹患同胞よりも４０％低いと測定された。ｅ）ホスホリパーゼＡ２活性は、ｐＡＭＰＫレベルの上昇（ｎ＝６、血清飢餓により誘導）を受けた正常ｉＰＳＣ－ＲＰＥ（ｎ＝６）では有意に低下（約２６％）することが示される（ｐ＜０．０５）。ｆ）ＰＥＤＦの分極分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。Ｌ－ＯＲＤ患者（Ｎ＝ｌ２）は、ＰＥＤＦの頂端分泌の減少（患者：９３９．６ｎｇ／ｍＬ／同胞：１２７７．２２ｎｇ／ｍＬ）及び基底分泌の増加（患者：９２．１６ｎｇ／ｍＬ／同胞：７５．９６ｎｇ／ｍＬ）を示し、その結果、ＰＥＤＦ比（Ａｐ／Ｂａ）（１０．１３±１．６３）が非罹患同胞（Ｎ＝１２、１９．８２±３．６７）と比べて有意に低下した（ｐ＝０．００１４）。データは、平均±ＳＥであり、３回の独立した実験の平均を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。ｆ）頂端分泌されたＤＨＡ由来の神経保護Ｄ１を、タンデム質量分析リピドミクス解析によって測定した。非罹患同胞（Ｚ８、９ｉ）は、Ｌ－ＯＲＤ患者（Ｋ８、Ｅ１）よりも約１０倍多いＮＰＤ１を分泌した（ｐ＝０．００８９）。
図１８ａ～１８ｈは、Ｌ－ＯＲＤ患者のＲＰＥの上皮間葉転換に対する感受性の増加を実証する各種試験データを示す。７日間連続で視細胞外節を供給した後のｉＰＳＣ－ＲＰＥの膜マーカーＺＯ－１（緑色で示す）の免疫蛍光染色を示す代表的な画像。６３倍の対物レンズを用いて全ての画像を撮影した。スケールバー＝２０μｍ。ｂ）（ａ）に記載の条件下で撮影した画像をシェイプメトリクス解析に供して、細胞面積の分布のボックスプロットを構築した（下側ひげ：データの５％、下側ヒンジ：データの２５％、中央線：中央値、上側ヒンジ：データの７５％、上側ひげ：データの９５％）。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｎ＝６画像、１３５．３７±１．７６μｍ）は、非罹患同胞（Ｎ＝５、９５．７７±１．６８μｍ）と比較して、細胞サイズ及びばらつきが大きい（ｐ＜２Ｅ－１６）。非罹患同胞では、視細胞供給中にメトホルミン処理を開始しても、未処理の非罹患同胞と比較して細胞面積（Ｎ＝７、９３．１４±１．５６μｍ）に非常に小さな影響しか与えなかった（ｐ＝０．５２）。しかし、３ｍＭのメトホルミンで処理した結果、患者の細胞面積（Ｎ＝７、１１７．９２±０．９６μｍ）は未処理の患者と比べて有意に減少した（ｐ＜２Ｅ－１６）。ダネットの多重比較検定を実施して、未処理の非罹患同胞又はＬ－ＯＲＤ患者のいずれかと比較した。ｃ）７日間ＰＯＳを供給した後のｉＰＳＣ－ＲＰＥ単層のＡＰＯＥ染色された凍結切片の免疫蛍光顕微鏡写真。Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、頂端及び基底のＡＰＯＥ沈着物（白色の矢印）の相対的比率が変化した。ＰＯＳ供給中にメトホルミンで処理されたＬ－ＯＲＤ患者では、頂端及び基底のＡＰＯＥ沈着物（黄色の矢印）の相対的比率が分配し直され、非罹患同胞に類似するようになった。ｄ）ｃ）に示した画像と同様の画像のＡＰＯＥシグナルの積算密度の画像定量化。ＡＰＯＥシグナルの積算密度は、未処理のＬ－ＯＲＤ患者（Ｎ＝５；頂端：１８５．６９±５．４２；基底：４６．３８±２．５１）では、非罹患同胞（Ｎ＝４；頂端３０．８９±１２．０５；基底：８．４５±３．０９）と比較して有意に高い（頂端：ｐ＝７．７６Ｅ－６；基底：ｐ＝２．７１Ｅ－５）。メトホルミン処理された非罹患同胞（Ｎ＝８；頂端１１９．９８±２０．３６；基底：２３．５５±６．１７）と比較して、メトホルミン処理されたＬ－ＯＲＤ患者（Ｎ＝４；頂端７９．３０±３７．５１；基底：１３．５８±４．５８）との間に有意な差はなかった（頂端：ｐ＝０．３２；基底：ｐ＝０．３２）。画像は全て２０倍で撮影した。スケールバー＝５０μｍ。ｆ）低酸素条件下（６時間）でのＶＥＧＦ分泌のＥＬＩＳＡ測定は、加齢性黄斑変性の病態生理に関与している脈絡膜血流の減少に類似しており（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎ Ｄ１ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ １０４，１３１５８－１３１６３，（２００７）．）、低酸素が駆動するＥＭＴに対するＬ－ＯＲＤのｉＰＳＣ－ＲＰＥの敏感性を決定する代謝性ストレス要因として機能する。図１ｉ）に示した正常酸素条件と同様に、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｎ＝１０；Ａｐ：１．８９±０．３０；Ｂａ：１．８±０．２４）は、非罹患同胞（Ｎ＝９；Ａｐ：０．７８±０．１６；Ｂａ：１．５９±０．３６）に比べて非分極的にＶＥＧＦを分泌する（Ａｐ：ｐ＝０．００５；Ｂａ：ｐ＝０．６３）。メトホルミンで前処理（２週間）すると、Ｌ－ＯＤ患者のＲＰＥ（Ｎ＝６、Ａｐ：０．５９±０．０９；Ｂａ：１．８±０．２４）は低酸素が駆動するＥＭＴから保護され、頂端／基底ＶＥＧＦ極性が未処理又はメトホルミン処理した非罹患同胞（Ｎ＝９、Ａｐ：０．９８±０．１６；Ｂａ：１．６４±０．３３）に近い状態に回復する（Ａｐ：ｐ＝０．０９；Ｂａ：ｐ＝０．６４）。ｇ）非罹患同胞と比較した、Ｌ－ＯＲＤ患者のｉＰＳＣ－ＲＰＥにおける脱分化（ＥＭＴ）関連遺伝子の発現に対するＰＯＳ供給の効果。７日間ＰＯＳを供給すると（白色で示す）、非罹患同胞と比較してＬ－ＯＲＤ患者におけるＥＭＴ関連遺伝子の発現が増加する。７日間のＰＯＳ供給中にメトホルミン処理すると（赤色で示す）、ＥＭＴ関連遺伝子の発現が抑制される。ｈ）メトホルミンが非滲出性加齢性黄斑変性の発症年齢を遅らせることを明らかにした後向き臨床研究の結果の表（３６２．５１／Ｈ３５．３１）。５０～５９歳の患者では、メトホルミンは発症年齢を５６歳（ｎ＝１５７、メトホルミンなし）から５８．５歳（ｎ＝１６、メトホルミンあり）に遅らせる（ｐ＝０．００１）。
実施例１０－網膜色素上皮（ＲＰＥ）障害においてＲＰＥの健常表現型を改善及び維持するための新規治療法
ＲＰＥに分化したときにＧＦＰを発現するレポーター誘導性人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株を用いて、ｉＰＳＣ－ＲＰＥの上皮表現型の維持に必要な候補の遺伝子及び経路を同定するためにｓｉＲＮＡスクリーニングを実施した。このアプローチを用いてＮＯＸ４を同定した。ＮＯＸ４はＮＡＤＰＨ酸化酵素であり、それを阻害すると、損傷を受けたＲＰＥ細胞の上皮表現型が強く促進される。
網膜の損傷によって、ＲＰＥの脱分化、増殖、及び遊走を特徴とするＲＰＥ－ＥＭＴが誘導される。図２２Ａ及び２２Ｂは、モデルにおける機械的損傷が、インビボにおけるＲＰＥ－ＥＭＴの特徴を模倣することができ、機械的損傷の後、ＲＰＥ細胞がＥＭＴを受けて、ＥＭＴの特徴的な形態及びマーカーを示すことを示した。
ＮＯＸ４はＮＡＤＰＨ酵素であり、その主な役割は反応性酸素種（ＲＯＳ）を発生させることである。ＮＯＸ４は、損傷したＲＰＥで高発現する。図２３Ａは、Ｎｏｘ４が無傷のＲＰＥに存在し、損傷したＲＰＥで高発現することを示す。また、図２３Ｂには、酸化されたときに蛍光を発する核色素を用いて、損傷したＲＰＥが無傷のＲＰＥに比べて高レベルのＲＯＳを発生させることが示されている。
図２４は、ＮＯＸ４がＥＭＴマーカーとして知られている細胞骨格タンパク質であるビメンチン及び平滑筋アクチン（ＳＭＡ）と共局在することを示し、ＮＯＸ４のＥＭＴマーカーとの会合は、ＥＭＴにおけるＮＯＸ４の役割を示唆するものである。
図２５は、ＶＡＳ２８７０を用いたＮＯＸ４の薬理学的阻害が、ＥＭＴマーカーであるＳＭＡをダウンレギュレートすることを示す。
図２６Ａ～２６Ｃは、ｓｈＲＮＡを用いることによるＮＯＸ４のノックダウンを示し、ＮＯＸ４のダウンレギュレーションに成功したことが確認される。
図２７は、ｓｈＲＮＡを用いたＮＯＸ４のダウンレギュレーションが、損傷したＲＰＥにおける細胞遊走を減少させたことを示す。図２８Ａ～２８Ｃに示すように、ＮＯＸ４がダウンレギュレートされると、ＥＭＴマーカーであるＺＥＢ１がダウンレギュレートされる。
図２９Ａ及び２９Ｂは、ＮＯＸ４ ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子が、傷のついたＲＰＥにおいてネスチンのダウンレギュレーションに成功することを示す。
ＮＯＸ４を薬理学的に阻害することによって、図３０Ａ及び図３０Ｂに示すように、Ｎｏｘ４の阻害によりＥＭＴマーカーの発現が有効にダウンレギュレートされることが確認された。
この実験の結果、ＮＯＸ４は、その発現がヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）の上皮表現型を調節する新規標的遺伝子であることが示された。ＮＯＸ４の活性を調節する薬理学的阻害剤は、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）等のＲＰＥ障害、加齢性及び遺伝性の網膜変性、並びにがんを治療するための治療薬として使用することができる。
実施例１１－メトホルミン処理はシュタルガルト病を寛解させる
シュタルガルト病は、米国で約３０，０００人が罹患している希少遺伝性網膜変性であり、現在治療法はない。萎縮した網膜色素上皮によって進行性視細胞（ＰＲ）死が誘導されると、患者の失明につながる。その病因において、シュタルガルトはＡＭＤと類似している。両疾患とも、ＲＰＥ下及びＲＰＥ内の沈着物並びにＲＰＥの萎縮を示す。しかし、多遺伝子性疾患であるＡＭＤとは異なりシュタルガルトは単遺伝子性疾患である。シュタルガルトは、主に、ＲＰＥにおける既知のコレステロール輸送体であるＡＢＣＡ１のオルソログであるＡＢＣＡ４遺伝子における変異によって引き起こされる［Ｂｒｉｇｇｓ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＡＢＣＲ（ＡＢＣＡ４）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｔａｒｇａｒｄｔ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｒ ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１．４２（１０）：ｐ．２２２９－２２３６；Ｒ Ｓｐａｒｒｒｏｗ，Ｊ．，Ｄ．Ｈｉｃｋｓ，ａｎｄ Ｃ．Ｐ Ｈａｍｅｌ，Ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０．１０（９）：ｐ．８０２－８２３．］。視力にはＲＰＥとＰＲ細胞との間の機能的な相互作用が必要であるため、ＲＰＥの萎縮は、多くの場合ＰＲの変性及び失明を急速に引き起こす［Ｒ Ｓｐａｒｒｒｏｗ，Ｊ．，Ｄ．Ｈｉｃｋｓ，ａｎｄ Ｃ．Ｐ Ｈａｍｅｌ，Ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０．１０（９）：ｐ．８０２－８２３．］。ＲＰＥ頂端表面タンパク質は、ＲＰＥ－ＰＲの機能的相互作用の媒介に必要である。細胞表面捕捉技術（ＣＳＣ）を用いて、分極ＲＰＥ単層の頂端及び基底表面のプロテオームを選択的に同定した。ＣＳＣは、ＲＰＥ細胞の頂端側に主に存在するＡＢＣＡ４を含む、これまで報告されていなかったＲＰＥ膜上の幾つかのタンパク質の同定に貢献した［Ｋｈｒｉｓｔｏｖ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｅｘｈｉｂｉｔｓ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｏｎ Ａｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｂａｓａｌ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅｏｍｅ．２０１８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｐ．２２３－２４７．］。ＲＰＥ細胞膜上のＡＢＣＡ４の発現をウェスタンブロットによって確認し（図３ｌＡ）、（図３ｌＢ、Ｃ）に示す通り、その頂端局在を免疫染色で確認した。この結果は、ＡＢＣＡ４はＰＲでしか発現せず、患者においてみられるＲＰＥの萎縮は、ＡＢＣＡ４の変異が原因でＰＯＳに蓄積された毒性物質を貪食するＲＰＥ細胞にのみ起因するものであるという現在の定説を疑うものであった［Ｍｏｌｄａｙ，Ｒ．Ｓ．，Ｍ．Ｚｈｏｎｇ，ａｎｄ Ｆ．Ｑｕａｚｉ，Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＡＢＣＡ４ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ Ｓｔａｒｇａｒｄｔ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，２００９；１７９１（７）：ｐ．５７３－５８３．，Ｍａｕｇｅｒｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲ）ｇｅｎｅ ａｒｅ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃａｕｓｅ ｏｆ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００．６７（４）：ｐ．９６０－９６６．］。
ＲＰＥにおけるＡＢＣＡ４の役割及び疾患の病態形成を解明するために、インビトロ疾患モデルとしてＡＢＣＡ４機能が完全に失われたシュタルガルトｉＰＳＣ由来のＲＰＥ（ｉＲＰＥ）を開発した（図３２）。本発明者らは、２つのＡＢＣＡ４－／－ｉＰＳＣ株を作製し、完全に成熟したＲＰＥ細胞（ＡＢＣＡ４－／－Ｃ１及びＡＢＣＡ４－／－Ｃ２；図３２）を誘導することに成功した。ｑＲＴ ＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、及びウェスタンブロットによって、ＡＢＣＡ４のノックアウトを確認した（図３２Ａ、Ｂ）。更に、シュタルガルト患者ｉＰＳＣ株を誘導し、成熟ＲＰＥ細胞に分化させた。サンガーシーケンシングにより、患者のｉＲＰＥに変異が存在することが確認された（６０８８ｂｐ位のエクソン４４におけるＣ＞Ｔ）（図３２Ｃ）。変異により、患者ｉＲＰＥにおける変異型ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡのナンセンスｍＲＮＡ崩壊が引き起こされることが、ｄｄＰＣＲ及びウェスタンブロット解析によって裏付けられた（図３２Ｄ～Ｅ）。分子的（図３２Ｊ～Ｏ）、構造的（図３２Ｆ～Ｉ）、及び機能的な検証の観点で、患者及びＡＢＣＡ４－／－ｉＲＰＥは対照ｉＲＰＥ単層と同様の挙動を示し（対照１－ＡＢＣＡ４－／－Ｃ１及びＣ２に対する同質遺伝子対照、対照２－患者ｉＲＰＥに対する非罹患同胞）（図３２Ｆ～Ｏ）、これは、ＡＢＣＡ４の機能喪失に起因する発生異常がＲＰＥに存在しないことを示唆している。
これら結果から、本発明者らは、成熟ｉＲＰＥ単層におけるＡＢＣＡ４の役割について調べることにした。ＡＢＣＡ４の変異がＲＰＥにおける細胞自律的な機能上の欠陥を引き起こすという仮説を立てた。この仮説を試験するために、シュタルガルトｉＲＰＥ（ＡＢＣＡ４－／－クローン及び患者）を野生型ＰＯＳで６日間処理し、細胞内及びＲＰＥ下の脂質沈着物の蓄積（疾患表現型のうちの１つ）を評価した。ボディパイ染色（脂質色素、ＢＯＤＩＰＹ５０５／５１５）を用いた細胞内／下の脂質沈着物の分析では、野生型ＰＯＳで処理したシュタルガルトＲＰＥにおいて脂質蓄積が２～３倍増加することが示され（図３３Ａ～ＣとＤ～Ｆとの比較、Ｇにおいて定量）、これは、シュタルガルトｉＲＰＥ細胞における細胞自律的な欠陥の仮説を支持するものである。視覚サイクルの毒性副産物（Ａ２Ｅ及びリポフスチン）の蓄積は補体シグナルに誘導される炎症を引き起こすことが知られているので、これら細胞自律的な欠陥が補体シグナル伝達の制御不全によって増強されるかどうかを調べるために、シュタルガルトｉＲＰＥを活性化ヒト血清（ＣＣ－ＨＳ）又は不活化ヒト血清（ＣＩ－ＨＳ）で処理した［Ｌｅｎｉｓ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｒｅｓｃｕｅｓ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｔａｒｇａｒｄｔ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１７．１１４（１５）：ｐ．３９８７－３９９２．］。既報と一致して、ＣＣ－ＨＳで４８時間処理すると、シュタルガルトｉＲＰＥでは対照細胞に対して細胞内及び細胞下の脂質沈着物の増加（２～３倍）が誘発された（図３３Ｇ、ＣＣ－ＨＳとＣＩ－ＨＳとを比較）。
色素性Ａｂｃａ４－／－マウスモデルでは、リポフスチンの蓄積によりＲＰＥの頂端側でセラミドが増加し、初期エンドソーム（ＥＥ）の生合成及び融合が誘導され、Ｃ３ａの増加によりオートファジーの主要制御因子であるラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）が活性化される［Ｋａｕｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｂｅｒｒａｎｔ ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１８．１１５（３６）：ｐ．９０１４－９０１９．］。Ａｂｃａ４－／－マウスモデルでみられるように、ＰＯＳレジメン及びＣＣ－ＨＳ処理に曝露したときに、シュタルガルトｉＲＰＥにおいて頂端のセラミド蓄積が４～５倍増加することが観察された。全体として、本研究は、ＡＢＣＡ４ ＫＯ及び患者のｉＲＰＥ細胞がシュタルガルト病の生理学的に関連するインビトロ疾患モデルとなること、そして、ＡＢＣＡ４の機能喪失がＲＰＥ細胞における細胞自律的な疾患表現型を誘発することを示した。疾患の病態形成におけるＡＢＣＡ４が駆動する機序について更に理解するために、この例では、コレステロール輸送に関与するＡＢＣＡ４ホモログであるＡＢＣＡ１に焦点を当てる。２つのタンパク質間のアミノ酸相同性が６４．５％であることは、ＡＢＣＡ４がコレステロール及び脂質の恒常性にも関与している可能性があることを示唆している［Ｑｕａｚｉ，Ｆ．ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｍｏｌｄａｙ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＡＢＣＡＪ，ＡＢＣＡ７，ａｎｄ ＡＢＣＡ４ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ－ｃａｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３．２８８（４８）：ｐ．３４４１４－３４４２６，Ｔａｎａｋａ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ＡＢＣＡＪ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｌａｒｇｅ ａｍｉｎｏ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００１．２８３（５）：ｐ．１０１９－１０２５，Ｓｔｏｒｔｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐａｉｒｅｄ ＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ｅｆｆｌｕｘ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（ＲＰＥ）ｌｅａｄｓ ｔｏ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｌｉｆｅ，２０１９．８：ｐ．ｅ４５１００．］。両ＡＢＣＡタンパク質が脂質ハンドリング経路を通して機能するかどうかを判定するために、シュタルガルトＲＰＥ細胞の疾患表現型の変化に対するＡＢＣＡ１の発現調節の効果を観察した。ＡＢＣＡ４ ｉＲＰＥ細胞でＡＢＣＡ１のｓｈＲＮＡノックダウンを実施し、細胞をＣＣ－ＨＳで処理した。ＡＢＣＡ１のＫＤは、ボディパイ染色でみられるように、ＡＢＣＡ４ ＲＰＥ細胞において脂質の沈着を悪化させた。（図３４Ａ～Ｇ）。対照的に、シュタルガルトＲＰＥ細胞における脂質蓄積の欠陥は、ＧＷ３９６５（ＡＢＣＡ１活性化因子）を用いたＡＢＣＡ１の過活性化によって回復した（図３４Ｈ～Ｎ）。
未消化の細胞脂質及び視覚サイクルの代謝物から形成される可能性が高い黄色がかった脂質リッチな沈着物であるリポフスチンは、シュタルガルト患者の眼に特徴的な特色である。リポフスチンの蓄積は、ＲＰＥの機能不全及びその萎縮と関連している［Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ２Ｅ，ａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ｏｆ ＲＰＥ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ：ｃａｎ ｉｔ ｃａｕｓｅ ＲＰＥ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ？，ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．２００３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｐ．２０５－２１１；Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｍ．Ｂｏｕｌｔｏｎ，ＲＰＥ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｙｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５．８０（５）：ｐ．５９５－６０６．］。これら結果から、ある薬物がＲＰＥにおけるリポフスチンの蓄積速度を低下させるか又はリポフスチンのクリアランスを増加させた場合、この疾患に関連するＲＰＥ及び網膜変性を遅らせることができる可能性があるという仮説が導かれた［Ｉｓｓａ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｒｇａｒｄｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ Ａｂｃａ４ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５．１１２（２７）：ｐ．８４１５－８４２０；Ｔａｎｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｒｇａｒｄｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，２０１７．１０１（１）：ｐ．２５－３０．］。収集したデータに基づき、脂質低下薬であるメトホルミン塩酸塩がＡＢＣＡ４患者に対する有望な治療介入として作用する可能性があると仮定した。メトホルミンは、ＡＭＰＫ経路を活性化することにより細胞の脂質代謝を増強し、エンドソームのＮａ＋／Ｈ＋交換体及びＶ－ＡＴＰａｓｅを介してリソソームのｐＨを低下させることによりリソソーム活性を高める、臨床的に承認された２型糖尿病薬である［Ｚｈａｎｇ，Ｃ．－Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＡＭＰＫ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２０１６．２４（４）：ｐ．５２１－５２２；Ｆｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｓｔａｔ３ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ＆ ｄｉｓｅａｓｅ，２０１４．５（２）：ｐ．ｅ１０８８－ｅ１０８８；Ｗａｎｇ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＯＬＥＴＦ ｒａｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ，２０１６．１２２：ｐ．１７０－１７８；Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ Ｇ０／Ｇｌ ｐｈａｓｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＡＭＰＫ／ｍＴＯＲＣ１ ａｎｄ ｍＴＯＲＣ２ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１８．３７（１）：ｐ．６３；Ａｎｕｒａｇ，Ｐ．ａｎｄ Ｃ．Ａｎｕｒａｄｈａ，Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｆｅｄ ｒａｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２００２．４（１）：ｐ．３６－４２；Ｋｉｍ，Ｊ．ａｎｄ Ｙ．Ｊ．Ｙｏｕ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｅｌｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ．ＩＵＢＭＢ ｌｉｆｅ，２０１７．６９（７）：ｐ．４５９－４６９．］。これら作用機序により、シュタルガルトＲＰＥ細胞がリポフスチンのクリアランスをより効率的に管理できるようになると予測される。メトホルミンがシュタルガルト患者における疾患表現型を寛解させる能力について試験し、シュタルガルトのマウス及びｉＲＰＥモデルにおいてその作用機序を発見するための臨床試験を提案した。このアプローチの意義は、ＲＰＥ細胞におけるＡＢＣＡ４のこれまで正当に評価されていなかった役割に依存している。シュタルガルトＰＯＳを用いずにＡＢＣＡ４変異型ｉＲＰＥにおいてシュタルガルト病の表現型を再現する能力は、これら細胞における細胞自律的な脂質代謝の欠陥を示唆していることは注目に値する。ＲＰＥの脂質代謝におけるＡＢＣＡ４のこの細胞自律的な役割の喪失は、シュタルガルト病の病態形成に寄与しているので、この経路の活性を改善することで疾患経過を変化させられる可能性がある。
シュタルガルトｉＲＰＥ細胞におけるＰＯＳ消化の欠陥。シュタルガルトｉＲＰＥ細胞における脂質及びセラミドの蓄積の増加は、潜在的なリソソームの欠陥、及びＲＰＥの萎縮を引き起こし、経時的に視細胞変性を誘発し得るＰＯＳを消化する能力の低下を示唆していた［Ｃａｒｒ，Ａ．－Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＰＥ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａｌ ａｓｓａｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ，２００９．１５：ｐ．２８３．］。シュタルガルトｉＲＰＥがＰＯＳ消化に欠陥があるかどうかを判定するために、ＡＢＣＡ４変異型及び対照のｉＲＰＥ細胞に、ｐＨＲｈｏｄｏ色素（リソゾーム内部でのみ蛍光を発する）で標識された野生型ＰＯＳ（１０／ＲＰＥ細胞）を４時間供給した。この色素標識は、ＰＯＳの取り込み（４時間ＰＯＳを供給した後に測定）と消化率（２４時間ＰＯＳを供給した後に測定）とを区別するのに役立った。シュタルガルトｉＲＰＥ細胞は、対照細胞と同様のＰＯＳ取り込み能力を示した（４時間時点）（図３５Ａ）。しかし、シュタルガルトｉＲＰＥでは、対照細胞と比較して消化率（２４時間時点）が５０～７０％低下することが観察された（図３５Ｂ）。これら結果から、ｉＲＰＥ細胞におけるＡＢＣＡ４変異は、エンドリソソーム機能不全を撹乱させ、これが脂質代謝の欠陥及び細胞機能不全の原因となる可能性が高いことが示唆された。
メトホルミン処理により、シュタルガルトｉＲＰＥ７における脂質沈着が改善される。シュタルガルトｉＲＰＥ細胞の野生型ＰＯＳを消化する能力の低下は、罹病細胞における脂質の恒常性の欠陥の中心にエンドリソソームの機能不全があることを示唆していた。メトホルミンは、リソソーム機能及び脂質代謝を改善する［Ｗａｎｇ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＯＬＥＴＦ ｒａｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ，２０１６．１２２：ｐ．１７０－１７８．，Ａｎｕｒａｇ，Ｐ．ａｎｄ Ｃ．Ａｎｕｒａｄｈａ，Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｆｅｄ ｒａｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２００２．４（１）：ｐ．３６－４２；Ｋｉｍ，Ｊ．ａｎｄ Ｙ．Ｊ．Ｙｏｕ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｅｌｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ．ＩＵＢＭＢ ｌｉｆｅ，２０１７．６９（７）：ｐ．４５９－４６９．］。メトホルミン処理により、シュタルガルトｉＲＰＥ細胞におけるリソソーム活性及び脂質代謝が改善され、それによって、セラミド及び脂質の蓄積が減少して、疾患表現型が寛解すると仮定した。メトホルミンの治療効果をインビトロ系で評価するために、シュタルガルト及び健常細胞を、ＲＰＥ培地＋ビヒクル又は３ｍＭメトホルミンを含有するＲＰＥ培地のいずれかにおいて連続６日間野生型ＰＯＳ（１０ ＰＯＳ／細胞）で処理した。ビヒクル処理したシュタルガルトｉＲＰＥと比較して、メトホルミン処理では、ＰＯＳを供給したシュタルガルトｉＲＰＥにおけるセラミドレベルが有意に低下（３～４倍）した（図３６Ａ）。メトホルミンをシュタルガルト病の有望な治療薬にするために、セラミド及び脂質リッチなＲＰＥ下沈着物を含むシュタルガルト網膜症の表現型を再現するＡｂｃａ４－／－マウスモデルで試験した［Ｋａｕｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｂｅｒｒａｎｔ ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１８．１１５（３６）：ｐ．９０１４－９０１９．， Ｉｓｓａ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｄｕｓ ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ａｂｃａ４－／－ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｔａｒｇａｒｄｔ ｄｉｓｅａｓｅ－ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ２Ｅ，ｒｅｔｉｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３．５４（８）：ｐ．５６０２－５６１２．］。ヒト用量と同等の４００ｍｇ／日又は８００ｍｇ／日のメトホルミンを３ヶ月間マウスに経口投与した。これら用量では、処理したマウスにおいて低血糖は生じなかった。処理した動物から回収した眼の質量分析は、ｉＲＰＥ／脈絡膜、網膜、及び血漿において同等の量のメトホルミンを示し、これは、薬物が標的組織に到達することを示唆している（データは示さない）。処理したＡｂｃａ４－／－マウスのＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントからのデータでは、メトホルミン処理によりＡｂｃａ４－／－マウスにおける脂質レベルが劇的に低下することが示された（図３６Ｂ～Ｃ）。これら結果から、メトホルミンがシュタルガルト及びＡＭＤ患者の有望な治療であるという仮説が確認された。
実施例１２－硝子体内注射、テノン嚢下注射、網膜下注射、及び局所眼治療法は、ＡＭＤ及びシュタルガルト病を寛解させる。
治療の有効性を確認するために、様々な投与方法を用いて実施例１～１１の処理を繰り返す。具体的には、硝子体内注射、テノン嚢下注射、網膜下注射、及び局所眼投与法を用いて、実施例１～１１の処理を繰り返す。これらの追加投与の結果から、これら投与方法を用いた治療の有効性が実証される。
参照による援用
本書に引用された全ての特許、公開特許出願、及び他の参照文献の全内容は、参照することにより全体が本明細書に明示的に援用される。
等価物
当業者は、単なるルーチンな実験を用いて、本明細書に記載する特定の実施形態及び方法に対する多くの等価物を認識するか又は解明することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書に記載する詳細な実施例及び実施形態は、例示目的のためだけに一例として与えられるものであって、本開示を限定するものであるとは全く考えられないことが理解される。それに鑑みた様々な変形又は変更が、当業者に示唆され、この出願の趣旨及び範囲内に含まれ、そして、添付の特許請求の範囲の範囲内であると考えられる。例えば、所望の効果を最適化するために成分の相対量を変更してもよく、追加成分を添加してもよく、及び／又は記載されている成分のうちの１つ以上を類似の成分に置換してもよい。本開示のシステム、方法、及びプロセスに関連する更なる有利な特徴及び機能は、添付の特許請求の範囲から明らかになる。更に、当業者は、単なるルーチンな実験を用いて、本明細書に記載する特定の実施形態及び方法に対する多くの等価物を認識するか又は解明することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (52)

  1. 網膜疾患の治療をする方法であって、それを必要としている患者に、Ｎｏｘ４若しくは反応性酸素種形成を阻害するか、又はセリンプロテアーゼ、ドーパミン受容体、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、ＡＭＰＫ、ＲＰＥ上皮間葉転換、ＲＰＥ脱分化、若しくは１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、薬学的に有効な量の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む方法。
  2. 前記網膜疾患が、黄斑又は周辺部網膜変性、地図状萎縮、脈絡膜血管新生、網膜色素上皮萎縮、黄斑ジストロフィー、シュタルガルト病、シュタルガルト様疾患、ベスト病、卵黄様黄斑ジストロフィー、成人卵黄様ジストロフィー、色素性網膜炎、増殖性硝子体網膜症、網膜剥離、病的近視、糖尿病性網膜症、ＣＭＶ網膜炎、閉塞性網膜血管疾患、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、脈絡膜破裂、眼ヒストプラスマ症（ＰＯＨＳ）、トキソプラズマ症、又はレーバー先天性黒内障である、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  3. 前記化合物が、Ｎｏｘ４阻害剤又は反応性酸素種形成の阻害剤である、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  4. 前記化合物が、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、又は１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  5. 前記化合物が、１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節し、前記Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅが、ＣＤＣ４２及び／又はＲＡＣ１である、請求項４に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  6. 前記化合物が、セリンプロテアーゼを阻害する、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  7. 前記化合物が、ＡＭＰＫを制御する、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  8. 前記化合物が、ドーパミン受容体を調節する、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  9. 前記ドーパミン受容体を調節する化合物が、ドーパミン受容体Ｄ４アンタゴニストである、請求項８に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  10. 前記化合物が、ＲＰＥ上皮間葉転換又はＲＰＥ脱分化を調節する、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  11. 前記化合物が、アミノカプロン酸、Ｌ－７０１，３２４、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０塩酸塩、Ｍｅ－３，４－デホスタチン、Ｎ－メチル－１－デオキシノジリマイシン、Ｌ－７５０，６６７三塩酸塩、（＋）－ＭＫ－８０１マレイン酸水素塩、酒石酸ペンピジン、（－）－ナプロキセンナトリウム、塩酸ラロキシフェン、ＳＫＦ８３９５９臭化水素酸塩、Ｌ－６８７，３８４塩酸塩、７，７－ジメチル－（５Ｚ，８Ｚ）－エイコサジエン酸、ＳＰ－６００１２５、Ｒｏ４１－０９６０、塩酸アンシタビン、リスペリドン、テレンゼピン二塩酸塩、ＮＯ－７１１塩酸塩、Ｕ－９９１９４Ａマレイン酸塩、Ｓ（＋）－ラクロプリドＬ－酒石酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、カプトプリル、チオペラミドマレイン酸塩、アルプレノロール塩酸塩、リトドリン塩酸塩、プトレシン二塩酸塩、１－（２－メトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩、ＰＡＰＰ、Ｕ－６９５９３、ＡＧ－１４７８、リルゾール、メシル酸フェントラミン、ＤＢＯ－８３、ホルメスタン、カルバマゼピン、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、テルブタリンヘミ硫酸塩、ＵＫ１４３０４、ＧＲ１１３８０８、レフルノミド、アセチルチオコリン塩酸塩、スペルミジン、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソブチル）アミロライド、ＡＴＰＯ、アカデニシン、若しくはメトホルミン、又はこれらの組合せである、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  12. 前記化合物が、アミノカプロン酸；Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０；リルゾール；アカデニシン；メトホルミン、又はこれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  13. 前記化合物が、医薬組成物の形態で投与され、前記医薬組成物が、前記化合物及び１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含む、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  14. 網膜変性の治療をする方法であって、それを必要としている患者に、Ｎｏｘ４若しくは反応性酸素種形成を阻害するか、又はセリンプロテアーゼ、ドーパミン受容体、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、若しくは１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、薬学的に有効な量の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む方法。
  15. 前記化合物が、Ｎｏｘ４阻害剤又は反応性酸素種形成の阻害剤である、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  16. 前記化合物が、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、又は１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  17. 前記化合物が、１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節し、前記Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅが、ＣＤＣ４２及び／又はＲＡＣ１である、請求項１６に記載の網膜変性の治療をする方法。
  18. 前記化合物が、セリンプロテアーゼを阻害する、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  19. 前記化合物が、ドーパミン受容体を調節する、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  20. 前記ドーパミン受容体を調節する化合物が、ドーパミン受容体Ｄ４アンタゴニストである、請求項１９に記載の網膜変性の治療をする方法。
  21. 前記化合物が、ＡＭＰＫを制御する、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  22. 前記化合物が、ＲＰＥ上皮間葉転換又はＲＰＥ脱分化を調節する、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  23. 前記化合物が、アミノカプロン酸、Ｌ－７０１，３２４、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０塩酸塩、Ｍｅ－３，４－デホスタチン、Ｎ－メチル－１－デオキシノジリマイシン、Ｌ－７５０，６６７三塩酸塩、（＋）－ＭＫ－８０１マレイン酸水素塩、酒石酸ペンピジン、（－）－ナプロキセンナトリウム、塩酸ラロキシフェン、ＳＫＦ８３９５９臭化水素酸塩、Ｌ－６８７，３８４塩酸塩、７，７－ジメチル－（５Ｚ，８Ｚ）－エイコサジエン酸、ＳＰ－６００１２５、Ｒｏ４１－０９６０、塩酸アンシタビン、リスペリドン、テレンゼピン二塩酸塩、ＮＯ－７１１塩酸塩、Ｕ－９９１９４Ａマレイン酸塩、Ｓ（＋）－ラクロプリドＬ－酒石酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、カプトプリル、チオペラミドマレイン酸塩、アルプレノロール塩酸塩、リトドリン塩酸塩、プトレシン二塩酸塩、１－（２－メトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩、ＰＡＰＰ、Ｕ－６９５９３、ＡＧ－１４７８、リルゾール、メシル酸フェントラミン、ＤＢＯ－８３、ホルメスタン、カルバマゼピン、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、テルブタリンヘミ硫酸塩、ＵＫ１４３０４、ＧＲ１１３８０８、レフルノミド、アセチルチオコリン塩酸塩、スペルミジン、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソブチル）アミロライド、ＡＴＰＯ、アカデニシン、若しくはメトホルミン、又はこれらの組合せである、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  24. 前記化合物が、アミノカプロン酸、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０、リルゾール、アカデニシン、メトホルミン、又はこれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項２３に記載の網膜変性の治療をする方法。
  25. 前記化合物が医薬組成物の形態で投与され、前記医薬組成物が、前記化合物及び１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含む、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  26. 網膜色素上皮細胞の変性の修復をする方法であって、それを必要としている患者に、Ｎｏｘ４若しくは反応性酸素種形成を阻害するか、又はセリンプロテアーゼ、ドーパミン受容体、ＮＦ-ｋＢ、ｍＴＯＲ、若しくは１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、薬学的に有効な量の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む方法。
  27. 前記化合物が、Ｎｏｘ４阻害剤又は反応性酸素種形成の阻害剤である、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  28. 前記化合物が、ＮＦ－ｋＢ、ｍＴＯＲ、又は１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節する、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  29. 前記化合物が、１つ以上のＲｈｏ ＧＴＰａｓｅを調節し、前記Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅが、ＣＤＣ４２及び／又はＲＡＣ１である、請求項２８に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  30. 前記化合物が、セリンプロテアーゼを阻害する、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  31. 前記化合物が、ドーパミン受容体を調節する、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  32. 前記ドーパミン受容体を調節する化合物が、ドーパミン受容体Ｄ４アンタゴニストである、請求項３１に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  33. 前記化合物が、ＡＭＰＫを制御する、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  34. 前記化合物が、ＲＰＥ上皮間葉転換又はＲＰＥ脱分化を調節する、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  35. 前記化合物が、アミノカプロン酸、Ｌ－７０１，３２４、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０塩酸塩、Ｍｅ－３，４－デホスタチン、Ｎ－メチル－１－デオキシノジリマイシン、Ｌ－７５０，６６７三塩酸塩、（＋）－ＭＫ－８０１マレイン酸水素塩、酒石酸ペンピジン、（－）－ナプロキセンナトリウム、塩酸ラロキシフェン、ＳＫＦ８３９５９臭化水素酸塩、Ｌ－６８７，３８４塩酸塩、７，７－ジメチル－（５Ｚ，８Ｚ）－エイコサジエン酸、ＳＰ－６００１２５、Ｒｏ４１－０９６０、塩酸アンシタビン、リスペリドン、テレンゼピン二塩酸塩、ＮＯ－７１１塩酸塩、Ｕ－９９１９４Ａマレイン酸塩、Ｓ（＋）－ラクロプリドＬ－酒石酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、カプトプリル、チオペラミドマレイン酸塩、アルプレノロール塩酸塩、リトドリン塩酸塩、プトレシン二塩酸塩、１－（２－メトキシフェニル）ピペラジン塩酸塩、ＰＡＰＰ、Ｕ－６９５９３、ＡＧ－１４７８、リルゾール、メシル酸フェントラミン、ＤＢＯ－８３、ホルメスタン、カルバマゼピン、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、テルブタリンヘミ硫酸塩、ＵＫ１４３０４、ＧＲ１１３８０８、レフルノミド、アセチルチオコリン塩酸塩、スペルミジン、５－（Ｎ－メチル－Ｎ－イソブチル）アミロライド、ＡＴＰＯ、アカデニシン、若しくはメトホルミン、又はこれらの組合せである、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  36. 前記化合物が、アミノカプロン酸、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０、リルゾール、アカデニシン、メトホルミン、又はこれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項３５に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  37. 前記化合物が医薬組成物の形態で投与され、前記医薬組成物が、前記化合物及び１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含む、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の修復をする方法。
  38. シュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法であって、それを必要としている患者に、薬学的有効量の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含み、前記化合物が、アミノカプロン酸、Ｖａｓ２８７０、Ｌ－７４５，８７０、リルゾール、アカデニシン、又はメトホルミンである方法。
  39. 前記化合物が、メトホルミン又はその薬学的に許容し得る塩である、請求項３８に記載のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法。
  40. 前記化合物が、医薬組成物の形態で投与され、前記医薬組成物が、前記化合物及び１つ以上の薬学的に許容し得る担体を含む、請求項３８に記載のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法。
  41. 前記化合物が、被験体の眼に局所的に投与される、請求項３８に記載のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法。
  42. 前記組成物が被験体の眼に局所的に投与される、請求項４０に記載のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法。
  43. 前記化合物が、硝子体内注射、テノン嚢下注射、又は網膜下注射を通して被験体に投与される、請求項３８に記載のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法。
  44. 前記組成物が、硝子体内注射、テノン嚢下注射、又は網膜下注射を通して被験体に投与される、請求項４０に記載のシュタルガルト病又はシュタルガルト様疾患の治療をする方法。
  45. 前記化合物が、被験体の眼に局所的に投与される、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  46. 前記組成物が、被験体の眼に局所的に投与される、請求項１３に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  47. 前記化合物が、硝子体内注射、テノン嚢下注射、又は網膜下注射を通して被験体に投与される、請求項１に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  48. 前記化合物が、硝子体内注射、テノン嚢下注射、又は網膜下注射を通して被験体に投与される、請求項１３に記載の網膜疾患の治療をする方法。
  49. 前記化合物が、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は前記化合物が、硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される、請求項１４に記載の網膜変性の治療をする方法。
  50. 前記組成物が、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は前記組成物が、硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される、請求項２５に記載の網膜変性の治療をする方法。
  51. 前記化合物が、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は前記化合物が、硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される、請求項２６に記載の網膜色素上皮細胞の変性の修復をする方法。
  52. 前記組成物が、被験体の眼に局所的に投与されるか、又は前記組成物が、硝子体内注射、テノン嚢下注射、若しくは網膜下注射を通して被験体に投与される、請求項３７に記載の網膜色素上皮細胞の変性の修復をする方法。
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