CN114650813A - 用以治疗视网膜变性的可药化靶标 - Google Patents

用以治疗视网膜变性的可药化靶标 Download PDF

Info

Publication number
CN114650813A
CN114650813A CN202080075532.5A CN202080075532A CN114650813A CN 114650813 A CN114650813 A CN 114650813A CN 202080075532 A CN202080075532 A CN 202080075532A CN 114650813 A CN114650813 A CN 114650813A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
rpe
retinal
treating
hydrochloride
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080075532.5A
Other languages
English (en)
Inventor
卡皮尔·巴蒂
卡拉·亚迪拉·巴博萨萨巴内罗
贾斯汀·仁远·张
巴伦杜·谢哈尔·贾哈
鲁奇·夏尔马
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
US Department of Health and Human Services
Original Assignee
US Department of Health and Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by US Department of Health and Human Services filed Critical US Department of Health and Human Services
Publication of CN114650813A publication Critical patent/CN114650813A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/14—Quaternary ammonium compounds, e.g. edrophonium, choline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/15—Oximes (>C=N—O—); Hydrazines (>N—N<); Hydrazones (>N—N=) ; Imines (C—N=C)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/201—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having one or two double bonds, e.g. oleic, linoleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/265—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carbonic, thiocarbonic, or thiocarboxylic acids, e.g. thioacetic acid, xanthogenic acid, trithiocarbonic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/401—Proline; Derivatives thereof, e.g. captopril
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/416—1,2-Diazoles condensed with carbocyclic ring systems, e.g. indazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/417—Imidazole-alkylamines, e.g. histamine, phentolamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/438—The ring being spiro-condensed with carbocyclic or heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/451—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine having a carbocyclic group directly attached to the heterocyclic ring, e.g. glutethimide, meperidine, loperamide, phencyclidine, piminodine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4535—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a heterocyclic ring having sulfur as a ring hetero atom, e.g. pizotifen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/46—8-Azabicyclo [3.2.1] octane; Derivatives thereof, e.g. atropine, cocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4704—2-Quinolinones, e.g. carbostyril
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A61K31/568—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone
    • A61K31/5685—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone having an oxo group in position 17, e.g. androsterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及治疗或改善对象中的视网膜疾病或病症或视网膜变性的新的方法，以及恢复视网膜色素上皮细胞的新的方法，包括施用调节Nox4、自由基氧物质的形成、丝氨酸蛋白酶、多巴胺受体、NF‑κB、mTOR、AMPK、RPE上皮‑间充质转化、RPE去分化或一种或多种Rho GTP酶的一种或多种化合物；以及用于施用所述方法的试剂盒。

Description

用以治疗视网膜变性的可药化靶标
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年9月13日递交的第62/899,899号美国临时专利申请的权益。本专利申请的完整内容通过引用整体并入本文。
关于联邦赞助的研究或开发的申明
本发明根据美国国立卫生研究院-国立眼科研究所(the National Institutesof Health,National Eye Institute)授予的项目标号Z01#:EY000532，在政府支助下进行。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
视网膜是位于脊椎动物眼睛内表面处的一层专门的光敏神经组织。在通过角膜、晶状体和玻璃体液后到达视网膜的光被转化为触发神经冲动的化学和电事件。负责转导的细胞、将光转化为这些生物过程的过程是专门的神经元，称为感光细胞。
视网膜色素上皮(RPE)是哺乳动物眼睛中密集排列的六边形细胞的极化单层，其将神经视网膜与脉络膜分开。RPE中的细胞含有色素颗粒，并通过形成血视网膜屏障和与光感受器密切相互作用以通过吸收视网膜上的晶状体聚焦的光能来维持视觉功能，从而在视网膜生理学中发挥关键作用。这些细胞还将离子、水和代谢终产物从视网膜下空间输送到血液中，并从血液中吸收诸如葡萄糖、视黄醇和脂肪酸等营养物质，并将这些营养物质输送到光感受器。
RPE细胞也是视网膜视觉循环的一部分：由于光感受器无法将光子吸收后形成的全反式视黄醛重新异构化回11-顺式视黄醛，因此视黄醛被转运到RPE，其中其被重新异构化为11-顺式视黄醛，并运回光感受器。
RPE在光感受器维持和血管生成调节中发挥重要作用，体内的各种RPE功能障碍与改变视力的疾病有关，如视网膜色素变性、RPE脱离、异型增生、萎缩、视网膜病变、黄斑营养不良或变性，包括与年龄相关的黄斑变性，其可导致光感受器损伤和失明。
可能继发性地影响黄斑的常见视网膜疾病包括视网膜脱离、病理性近视、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变、CMV视网膜炎、阻塞性视网膜血管病、早产儿视网膜病变(ROP)、脉络膜破裂、眼组织胞质菌病综合征(POHS)、弓形虫病和Leber先天性黑蒙。以上列表都不是详尽无遗的。
许多眼科疾病，如(年龄相关的)黄斑变性、黄斑营养不良如Stargardt病和Stargardt样病、Best病(卵黄状黄斑营养不良)和成人型卵黄状营养不良或视网膜色素变性亚型，与视网膜本身或RPE的变性或恶化有关。已经在动物模型中证明，可以通过RPE细胞的视网膜下移植来实现光感受器的拯救和视觉功能的保存(Coffey etal.Nat.Neurosci.2002:5,53-56；Lin et al.Curr.Eye Res.1996:15,1069-1077；Littleet al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1996:37,204-211；Sauve et al.Neuroscience2002:114,389-401)。需要找到产生可用于治疗视网膜变性疾病和损伤的RPE细胞，如从人类干细胞中产生RPE细胞的方法。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人群失明的最常见原因。有两种类型的AMD，一种导致RPE萎缩的干型和一种导致穿透RPE的脉络膜血管异常生长的湿型。功能失调的RPE与疾病病理和进展有关，因为它无法支持光感受器，导致神经视网膜层变性，从而导致视力丧失。目前只有湿型AMD可用的治疗方法，其包括激光凝固疗法和抗VEGF注射。同样，迄今为止，对于视网膜退行性疾病，如增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)和年龄相关和遗传性视网膜变性，没有有效的治疗方法，其特征是RPE EMT细胞中上皮表型的丧失，最终导致失明。
继续需要可用于治疗视网膜变性的化合物和方法。这种治疗将预防或降低由多种病因引起的视网膜变性的发生率。
发明概述
一方面，本发明提供了治疗视网膜疾病的方法，包括向有需要的患者施用药学有效量的化合物，或其药学上可接受的盐，该化合物或其盐抑制Nox4或活性氧物质形成，或调节丝氨酸蛋白酶、多巴胺受体、NF-κB、mTOR、AMPK、RPE上皮-间充质转化、RPE去分化或一种或多种Rho GTP酶。
在本发明的治疗视网膜疾病的方法的某些实施方案中，视网膜疾病是黄斑或周边视网膜变性、视网膜色素上皮细胞萎缩、黄斑营养不良、地图状萎缩、脉络膜新生血管、Stargardt病、Stargardt样病、Best病、卵黄状黄斑营养不良、成人型卵黄状营养不良、视网膜色素变性、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜脱离、病理性近视、糖尿病性视网膜病变、CMV视网膜炎、阻塞性视网膜血管病、早产儿视网膜病变(ROP)、脉络膜破裂、眼组织胞质菌病综合征(POHS)、弓形虫病或Leber先天性黑蒙。
在本发明的治疗视网膜疾病的方法的其他实施方案中，化合物是Nox4抑制剂(或活性氧物质抑制剂)。在本发明的治疗视网膜疾病的方法的其他实施方案中，化合物调节NF-κB、mTOR或一种或多种RhoGTP酶。在具体的实施方案中，化合物调节一种或多种Rho GTP酶，所述Rho GTP酶是CDC42和/或RAC1。在其他实施方案中，其中化合物调节AMPK。在其他实施方案中，化合物调节RPE上皮-间充质转化或RPE去分化。
在本发明的治疗视网膜疾病的方法的某些实施方案中，化合物是氨基己酸、L-701,324、Vas2870、L-745,870盐酸盐、Me-3,4-dephostatin、N-甲基-l-脱氧野尻霉素、L-750,667三盐酸盐、(+)-MK-801氢马来酸盐、酒石酸五甲哌啶、(-)-萘普生钠、雷洛昔芬盐酸盐、SKF 83959氢溴酸盐、L-687,384盐酸盐、7,7-二甲基-(5Z,8Z)-二十碳二烯酸、SP-600125、Ro41-0960、安西他滨盐酸盐、利培酮、替仑西平二盐酸盐、NO-711盐酸盐、U-99194A马来酸盐、S(+)-雷氯必利L-酒石酸盐、哌仑西平二盐酸盐、卡托普利、硫丙咪胺马来酸盐、阿普洛尔盐酸盐、利托君盐酸盐、腐胺二盐酸盐、l-(2-甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐、PAPP、U-69593、AG-1478、利鲁唑、甲磺酸酚妥拉明、DBO-83、福美司坦、卡马西平、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐、硫酸特布他林、UK 14304、GR 113808、来氟米特、氯化乙酰硫代胆碱、亚精胺、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、ATPO、Acadenisine或二甲双胍，或以上的组合。在本发明的治疗视网膜疾病的方法的特定实施方案中，化合物是氨基己酸；L-745,870；利鲁唑；Acadenisine；二甲双胍或以上的药学上可接受的盐。
在本发明的治疗视网膜疾病的方法的一些实施方案中，化合物以药物组合物的形式施用，其中所述药物组合物包含所述化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供了治疗视网膜变性的方法，包括向有需要的患者施用药学有效量的化合物或其药学上可接受的盐，该化合物或其盐抑制Nox4，或调节NF-κB、mTOR、AMPK、RPE上皮-间充质转化或RPE去分化，或一种或多种Rho GTP酶。
在本发明的治疗视网膜变性的方法的某些实施方案中，化合物是Nox4抑制剂(或活性氧物质抑制剂)。在本发明的治疗视网膜变性的方法的其他实施方案中，化合物调节NF-κB、mTOR或一种或多种RhoGTP酶。在具体的实施方案中，化合物调节一种或多种Rho GTP酶，所述Rho GTP酶是CDC42和/或RAC1。在其他实施方案中，其中所述化合物调节AMPK。在其他实施方案中，化合物调节RPE上皮-间充质转化或RPE去分化。
在本发明的治疗视网膜变性的方法的某些实施方案中，化合物是氨基己酸、L-701,324、Vas2870、L-745,870盐酸盐、Me-3,4-dephostatin、N-甲基-l-脱氧野尻霉素、L-750,667三盐酸盐、(+)-MK-801氢马来酸盐、酒石酸五甲哌啶、(-)-萘普生钠、雷洛昔芬盐酸盐、SKF 83959氢溴酸盐、L-687,384盐酸盐、7,7-二甲基-(5Z,8Z)-二十碳二烯酸、SP-600125、Ro41-0960、安西他滨盐酸盐、利培酮[请确认]、替仑西平二盐酸盐、NO-711盐酸盐、U-99194A马来酸盐、S(+)-雷氯必利L-酒石酸盐、哌仑西平二盐酸盐、卡托普利、硫丙咪胺马来酸盐、阿普洛尔盐酸盐、利托君盐酸盐、腐胺二盐酸盐、l-(2-甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐、PAPP、U-69593、AG-1478、利鲁唑、甲磺酸酚妥拉明、DBO-83、福美司坦、卡马西平、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐、硫酸特布他林、UK 14304、GR 113808、来氟米特、氯化乙酰硫代胆碱、亚精胺、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、ATPO、Acadenisine或二甲双胍，或者以上的组合。在本发明的治疗视网膜变性的方法的特定实施方案中，化合物是氨基己酸；L-745,870；利鲁唑；Acadenisine；二甲双胍或以上的药学上可接受的盐。
在本发明的治疗视网膜变性的方法的一些实施方案中，化合物以药物组合物的形式施用，其中所述药物组合物包含化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
又一方面，本发明提供了恢复视网膜色素上皮细胞的方法，包括向有需要的患者施用药学有效量的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物或其盐抑制Nox4或活性氧物质形成，或调节丝氨酸蛋白酶、多巴胺受体、NF-κB、mTOR、AMPK、RPE上皮-间充质转化或RPE去分化或一种或多种Rho GTP酶。
在本发明的恢复视网膜色素上皮细胞的方法的某些实施方案中，视网膜疾病是病症是黄斑变性、视网膜色素上皮细胞萎缩、黄斑营养不良、Stargardt病、Stargardt样病、Best病、卵黄状黄斑营养不良、成人型卵黄状营养不良、视网膜色素变性、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜脱离、病理性近视、糖尿病性视网膜病变、CMV视网膜炎、阻塞性视网膜血管病、早产儿视网膜病变(ROP)、脉络膜破裂、眼组织胞质菌病综合征(POHS)、弓形虫病或Leber先天性黑蒙。
在恢复视网膜色素上皮细胞的方法的其他实施方案中，化合物是Nox4抑制剂。在本发明的治疗视网膜疾病的方法的其他实施方案中，化合物调节NF-κB、mTOR或一种或多种Rho GTP酶。在具体的实施方案中，化合物调节一种或多种Rho GTP酶，所述Rho GTP酶是CDC42和/或RAC1。在其他实施方案中，其中所述化合物调节AMPK。在其他实施方案中，化合物调节RPE上皮-间充质转化或RPE去分化。
在恢复视网膜色素上皮细胞的方法的某些实施方案中，化合物是氨基己酸、L-701,324、Vas2870、L-745,870盐酸盐、Me-3,4-dephostatin、N-甲基-l-脱氧野尻霉素、L-750,667三盐酸盐、(+)-MK-801氢马来酸盐、酒石酸五甲哌啶、(-)-萘普生钠、雷洛昔芬盐酸盐、SKF 83959氢溴酸盐、L-687,384盐酸盐、7,7-二甲基-(5Z,8Z)-二十碳二烯酸、SP-600125、Ro41-0960、安西他滨盐酸盐、利培酮[请确认]、替仑西平二盐酸盐、NO-711盐酸盐、U-99194A马来酸盐、S(+)-雷氯必利L-酒石酸盐、哌仑西平二盐酸盐、卡托普利、硫丙咪胺马来酸盐、阿普洛尔盐酸盐、利托君盐酸盐、腐胺二盐酸盐、l-(2-甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐、PAPP、U-69593、AG-1478、利鲁唑、甲磺酸酚妥拉明、DBO-83、福美司坦、卡马西平、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐、硫酸特布他林、UK 14304、GR 113808、来氟米特、氯化乙酰硫代胆碱、亚精胺、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、ATPO、Acadenisine或二甲双胍，或以上的组合。在本发明的治疗视网膜疾病的方法的特定实施方案中，化合物是氨基己酸；L-745,870；利鲁唑；Acadenisine；二甲双胍或者以上的药学上可接受的盐。
在恢复视网膜色素上皮细胞的一些实施方案中，化合物以药物组合物的形式施用，其中所述药物组合物包含化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供了治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法，包括向有需要的患者施用药学有效量的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是氨基己酸、Vas2870、L-745,870、利鲁唑、Acadenisine或二甲双胍。在本发明的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法的一些实施方案中，化合物是二甲双胍或其药学上可接受的盐。
在本发明的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法的一些实施方案中，化合物以药物组合物的形式施用，其中所述药物组合物包含所述化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法的特定实施方案中，本发明的化合物或组合物经局部施用至对象的眼睛，或者通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至对象。
在本发明的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法的特定实施方案中，本发明的化合物或组合物经局部施用至对象的眼睛，或者通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至对象。
在本发明的治疗视网膜疾病的方法的特定实施方案中，本发明的化合物或组合物经局部施用至对象的眼睛，或者通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至对象。
在本发明的治疗视网膜变性的方法的特定实施方案中，本发明的化合物或组合物经局部施用至对象的眼睛，或者通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至对象。
在本发明的恢复视网膜色素上皮细胞变性的方法的特定实施方案中，本发明的化合物或组合物经局部施用至对象的眼睛，或者通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至对象。
附图的简要说明
图1的A至S描绘了证明补体感受态人血清(CC-HS)在成熟iRPE中诱导AMD样细胞内表型的各种测试数据。(A)在整个研究过程中使用了具有共定位在细胞边界的F-肌动蛋白(绿色)和β-连环蛋白(红色)的成熟和极化iRPE细胞，n＝3。(B-D)与补体功能不全的人血清(CI-HS)相比，用CC-HS处理48h的iRPE显示APOE阳性RPE下沉积物显著增加了10倍；n＝10种不同的iRPE系，每个系有三个技术重复。(E、F)与CI-HS处理相比，CC-HS也上调了中性脂滴，如通过用尼罗红染色观察到的，n＝3。(G、H)透射电子显微镜(TEM)证实RPE下层状和脂质沉积物仅存在于CC-HS处理的iRPE中(H中的箭头)，n＝10。(I、J)CC-HS处理引起了iRPE中的应力纤维，如通过F-肌动蛋白染色(黄色)(J中的箭头)所示，和RPE六边形丧失，n＝3。(K-O)CC-HS处理的iRPE细胞中的连接完整性丧失。(K、L)细胞质中与另一种连接标记Na+/K+ATP酶(绿色)共染的紧密连接标记CLDN16(红色)的错误定位表达(L中的箭头，与K相比)，n＝3。(M、N)CC-HS处理的iRPE的TEM证实了相邻RPE细胞之间紧密连接的消失(当与M中的箭头相比时，N中的箭头)，n＝3。(O)箱线图显示，相对于CI-HS处理的细胞，CC-HS处理的iRPE单层的TER测量值显著降低了三倍。(P)表示CC-HS处理的细胞中iRPE功能的丧失，如在吞噬能力方面评估的。CC-HS处理导致光感受器外段吸收显著下降六倍。(Q-S)当与CI-HS样品相比时，CC-HS处理导致iRPE对生理刺激如ATP和1mM K+的反应丧失。在(Q和R)中显示了应激iRPE细胞相对于健康细胞的反应改变的代表性迹线。
图2的A至G描绘了证明CC-HS诱导的AMD样细胞内表型可能通过C5a和C3a信号传导起作用的各种测试数据。(A)Western印迹证实补体受体3a(C3aR)和补体受体5a(C5aR)仅存在于iRPE细胞裂解物的膜部分中，在细胞质部分中没有表达，肝脏和A549细胞系裂解物用作阳性对照。Na+/K+ATP酶，一种已知的膜蛋白标记物，可作为上样对照。(B、C)C5aRl、C3aRl(红色)与埃兹蛋白(绿色，顶端突起标记，上图)，而不与胶原蛋白V(绿色，基底标记，下图)的共定位验证了iRPE细胞顶侧上受体的存在。(D-G)通过WB在CI-HS或CC-HS中处理的三种不同的iRPE细胞系中检查了iRPE细胞溶解物中的总ERK1/2、AKT和磷酸化的p-ERKl/2、p-AKT蛋白水平，定量结果显示在条形图中。
图3的A至K描绘了各种测试数据，其证明NF-κB途径的激活通过诱导AMD样细胞内苯酚类型在C5aR1和C3aR1信号传导下游起作用。(A-B)与CI-HS相比，用CC-HS处理iRPE诱导了p65亚基从胞质溶胶到细胞核的易位(染成红色，B)，表明NF-κB通路的激活。(C)qRT-PCR进一步证实了CC-HS处理的iRPE中NF-κB通路的靶基因和通路基因的表达增加。(D、E)证实在CC-HS处理的细胞中IL-8和IL-18的顶端和基底分泌增加，表明通路的激活。(F-H)在用C3、C5或CFD耗尽的人血清处理的iRPE中未观察到p65的核易位(红色)，表明补体蛋白C3和C5在CC-HS处理的iRPE细胞中的NF-κB的激活中具有不可或缺的作用。(I-K)检查来自NEMO(NF-κB通路的负调节因子)突变患者的iRPE，以确认NF-κB通路的作用。(I)显示细胞核中p65的基础水平增加，(J-K)患者系显示更多APOE阳性亚iRPE沉积，并且数据的量化如图K所示。
图4的A至J描绘了表明过敏毒素补体下调iRPE细胞中的自噬的各种测试数据。(A-F)与CI-HS处理的iRPE相比，自噬蛋白LC3(红色，A、B)和ATG 5(红色，D、E)在CC-HS处理的iRPE中下调。(C、F)Western印迹的定量证实，与CI-HS处理的样品相比，CC-HS处理的样品中LC3-II(I)和ATG5(L)的表达降低了2倍。(G)qRT-PCR揭示与CI-HS处理的细胞相比，CC-HS处理的iRPE中多个自噬途径基因的表达降低了3-6倍。(H、I)iRPE上CC-HS处理诱导自噬溶酶体的积累，但CI-HS处理不诱导。(J)Western印迹证实了用CC-HS处理诱导的LC3-II表达降低在用C5和C3耗尽的人血清或用CC-HS处理的C5aR+C3aR阻断的细胞处理的iRPE中不存在。
图5的A至F描绘了证明蛋白质毒性高通量筛选鉴定了拯救iRPE健康的药物的各种测试数据。(A)CI-HS中的钙响应曲线和(B)CC-HS处理的iRPE细胞。(C)A23187是一种蛋白质毒性药物，其在48h时间段内杀死iRPE。10mM A23187浓度在48h内杀死约40％的细胞。点图显示来自两组不同384孔板的结果。用10um A23187和46uM 1280药物活性药物库(LOPAC)药物处理板3-6iRPE，而在板7-10中，用10uM A23187和9.2uM LOPAC处理iRPE。使用CellTitrGlow(ATP释放)测定对细胞存活百分比进行评分，并绘制在Y轴上。注意，在46um浓度下，大多数药物具有细胞毒性，而在9.2uM浓度范围内，约20种药物不同程度地提高了iRPE细胞存活率。(D-F)四种药物的七点剂量曲线(L745,870-D；利鲁唑-E；氨基己酸-F)显示两个iRPE样品、超过三种不同的A23187浓度之间可重复的细胞存活率(2.5uM，红色；5uM，蓝色；和10uM，绿色)。
图6的A至K描绘了证明抗蛋白毒性药物改善CC-HS对iRPE的作用并拯救RPE细胞健康和功能的各种测试数据。(A-E)iRPE与药物(利鲁唑、L745,470和氨基己酸)和CC-HS的共同治疗不会导致NF-κB(红色)的p65亚基的细胞核易位(A-E)，或自噬蛋白ATG5(红色)的表达降低(F-J)。
图7的A至H描绘了表明抗蛋白毒性药物抑制NF-κB活化并上调CC-HS处理的iRPE细胞中的自噬的各种测试数据。(A、B)与CC-HS和媒介物处理的细胞相比，CC-HS处理的iRPE细胞与L-745,870(L-745)或氨基己酸(ACA)的共同治疗减少了尼罗红阳性脂滴的量(A)和腓骨蛋白3的表达(B)。(C-F)用L-745和ACA共同治疗CC-HS处理的iRPE细胞减少了CC-HS处理的iRPE细胞(C、D)的面积(C、E)并改善了六边形(D、F)，以及大鼠眼睛激光损伤边缘处的RPE细胞(E、F)。(G、H)用L-745和ACA共同治疗CC-HS处理的iRPE细胞增加了单层TER(G)和吞噬能力(H)。
图8的A至B描绘了CI-HS或CC-HS处理后iRPE表型变化的示意图。
图9的A至M描绘了表明补体感受态人血清(CC-HS)处理导致基底RPE沉积的各种测试数据。(A)跨上皮电阻(TER)的逐渐增加表明iRPE单层成熟。(B)APOE(红色)和C5ab(绿色)的CC-HS处理的transwell膜共染色。(C、D)免疫染色显示，与CI-HS处理的iRPE相比，CC-HS处理的iRPE中腓骨蛋白3(绿色)表达增加。(E、F)油红O染色(红色)揭示与CI-HS处理的iRPE相比，CC-HS处理的细胞内脂滴数量更多。(G,H)iRPE基底面的扫描电子显微照片(SEM)揭示CC-HS处理后层状沉积物增加(红色箭头)。(I-L)免疫染色显示波形蛋白(红色)表达改变，在CC-HS处理的iRPE中(J)和AMD眼中GA病变的边界处(L)没有任何细胞骨架结构。CI-HS处理的细胞(I)和非病变RPE(K)区域显示正常的膜和以波形蛋白的细胞骨架表达组织的细胞质。F-肌动蛋白(绿色)标记肌动蛋白细胞骨架。(M)电生理数据的量化表明，CC-HS处理导致静息态下TER降低2.5x，并在1mMK和ATP刺激下抑制TER变化。
图10的A至M描绘了证明过敏毒素补体蛋白介导iRPE中的AMD样细胞内表型的各种测试数据。(A)原代细胞和iRPE细胞中C3aR1和C5aR1的mRNA表达水平。注意，iRPE细胞中C5aR1的表达高出～30x。两种受体的表达随着CC-HS处理而增加。(B)在iRPE细胞中具有显著的C3aRl(左图，红色)和C5aRl(右图，红色)顶端表达的iRPE细胞的免疫染色，如通过与埃兹蛋白共定位(绿色，顶端标记)确认的，并且利用胶原蛋白IV(绿色，基底标记)最小。(C-F)在人尸体的眼中，C3aR1和C5aR1在RPE细胞的顶端和基底侧上都有相似的表达，如通过与埃兹蛋白(绿色，顶端标记)和胶原蛋白IV(绿色，基底标记)共定位确认的。这些受体在RPE细胞中也有显著的细胞内表达。(G-K)与CC-HS处理相比，用耗尽蛋白CFD(C3和C5的上游)、C3、C5的人血清，和共同处理的CC-HS加C3aRl和C5aRl的受体阻断剂处理的iRPE膜的APOE染色在所有条件下都显示降低的APOE表达。(L、M)用耗尽C5和C3蛋白的人血清处理的iRPE的电生理反应显示RPE细胞的正常电特性。
图11的A至E描绘了表明RNAseq识别出相比CI-HS处理的细胞，CC-HS处理的iRPE中NF-κB靶基因的上调和自噬基因的下调的各种测试数据。(A)来自三个不同供体来源的iRPE样本的RNAseq数据的热图揭示了通过CI-HS和CC-HS处理对样本的聚类。(B)CI-HS相比CC-HS处理的iRPE中的前十个途径在统计学上不同的基因表达模式。(C)RNAseq数据的热图确定了与CI-HS处理的iRPE相比，CC-HS处理的iRPE中NF-KB靶基因的上调。(D)免疫染色显示，与CI-HS处理的细胞相比，CC-HS处理的iRPE中NF-KB靶基因RELB(红色)和TRAF3(红色)的表达增加。(E)CC-HS处理的iRPE中IL-18(一种NF-KB下游细胞因子)的顶端和基底分泌物的两倍上调。
图12的A至F描绘了证明过敏毒素补体下调iRPE中的自噬的各种测试数据。(A、B)Western印迹显示，三种不同供体来源的CC-HS处理的iRPE样品中自噬蛋白ATG5(A)、ATG7(A)和LC3-II(B)的水平降低。β-肌动蛋白用于标准化。(C)与CI-HS处理的iRPE相比，CC-HS处理的iRPE中自噬通路基因的表达降低了3-6倍。(D)TEM显示在CC-HS处理中，在iRPE上自噬溶酶体(红色箭头)的积累。(E)Western印迹显示LC3-II表达水平仅在顶端侧或两侧上用CC-HS处理的iRPE样品中降低，而不是仅在基底侧上进行处理时。β-肌动蛋白用于标准化。(F)Western印迹显示在CI-HS处理的iRPE、用C5或C3耗尽的人血清处理的iRPE和用CC-HS和C5aR1+C3aR1受体阻断剂共同处理的iRPE中，LC3-II表达水平相似。β-肌动蛋白用于标准化。(G-U)CC-HS处理的iPSC-RPE细胞中NF-κB途径的时间依赖性激活(G-K)、自噬下调(L-Q)和APOE沉积物形成(R-U)。
图13的A至G描绘了证明用iRPE细胞进行蛋白毒性高通量筛选的各种测试数据。(A)在96h，所有三种浓度的A23187(2.5μM、10μM、25μM)对iRPE细胞都具有细胞毒性。(B)所有10个板的平均相对光强度在用A23187处理的所有板上显示相似的结果，表明不同板之间的筛选重现性。(C)A23187杀死的细胞百分比在所有板中相似，用9.2mM药物处理的板中略有降低，表明那些板中的细胞存活。(D-F)使用三种不同的A23187浓度(2.5μM-E、10μM-F、25μM-G)和范围为(10pM-10μM)的七种不同浓度的药物进行二次筛选的热图。突出显示了四种选定药物的反应。(G)从初级筛选中选择45种药物用于后续筛选中的命中验证。基于线性响应七点剂量曲线和两个不同iRPE样本之间的重现性在后续筛选中四种药物(L745,870、AG-1478、利鲁唑和氨基己酸)。(H)PCA图显示了用药物和CC-HS、仅CC-HS和仅CI-HS处理的iRPE的单独的聚类。(I、J)来源于三个供体和三个处理组(CI-HS相对于CC-HS、CC-HS+媒介物相对于CC-HS+L,745,870或ACA)的iRPE的RNA seq数据的热图显示了与用CC-HS处理的样本相比，在用药物和CC-HS共同处理的样品中NF-κB通路基因的上调的逆转和自噬基因下调的逆转。
图14的a至i描绘了表明患者特异性iPSC-RPE保留了引起疾病的突变的各种测试数据。(a)Sanger测序分析证实在来源于L-ORD患者的iPSCs中存在S163R突变。序列显示在顶部，并且受突变影响的碱基在序列色谱图上通过黑色箭头表示。杂合点突变(AGC->AGC，AGG)表现为峰内峰。用于DNA sanger测序的引物在方法中进行了描述。(b)所示RPE特征基因的ΔCt值的箱线图。每个箱代表从至少2个不同的未受影响的兄弟姐妹或L-ORD患者供体的n＝3个iPSC-RPE测量的ΔCt的分布。箱的底部和顶部定义了第10和第90百分位数。箱内的条带定义了中值。(c)连续7天提供光感受器外段的iPSC-RPE单层的透射电子显微镜图像。来源于未受影响的兄弟姐妹(上图)和患者(下图)的iPSC-RPE的TEM，其显示正常的RPE形态和高度极化的结构，包括丰富的顶端突起(黄色箭头)、黑素体(洋红色箭头)和位于基底的细胞核(白色箭头)。比例尺：2μm。(d)来源于未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的SEM图像，显示保留的六边形形态和丰富的顶端突起。(e)来源于未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的细胞面积的箱形图。用膜标记(ADIPOR1)对iPSC-RPE单层进行免疫染色，以勾勒出它们的六边形形状，用于细胞形态的多参数分析。L-ORD患者iPSC-RPE的平均大小趋于更大(107.7+/-68.5μm2)，并且与未受影响的兄弟姐妹(79.8+/-57.5μm2)相比变化更大(p＝0.000026)。在人类AMD供体的眼睛中已经报告了类似的空间不规则性。(f)通过使用EVOM上皮伏欧计(World Precisions Instruments)的跨上皮电阻测量来测量iPSC-RPE细胞之间功能性紧密连接的建立。与疾病相关的错义突变不会改变RPE单层的跨上皮抗性。(g)经历去分化(上皮间充质转化)的RPE细胞中富集的基因的散点图显示，在正常条件下，L-ORD患者细胞不会显示异常表型，指示患病或受压的RPE。未进食(以灰色显示)患者iPSC-RPEs中的去分化(EMT)相关基因的表达类似于未进食的未受影响的兄弟姐妹的表达模式。(h)来源于未受影响的兄弟姐妹的iPSC-RPE和经受正常培养条件的L-ORD患者显示相似水平的APOE基底沉积。比例尺：50μm。(i)通过ELISA测量在常氧条件下iPSC-RPE释放到上清液中的VEGF。RPE的高度极化结构负责包括VEGF在内的蛋白质的载体转运和分泌。天然地，来源于未受影响的兄弟姐妹(以灰色显示)的iPSC-RPE以极化，主要是基底方式分泌VEGF。L-ORD患者来源的iPSC-RPE表现出极性丧失，基底VEGF分泌减少约～53.3％(P＝0.046)。
图15的a至h描绘了证明CTRP5在L-ORD患者来源的RPE中的表达和定位的各种测试数据。(a)在L-ORD中，S163R突变发生在编码CTRP5(一种分泌蛋白)和卷曲膜相关蛋白(MFRP)的双顺反子转录物中。该突变不会改变任一转录物的mRNA表达。(b)来自未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的细胞裂解物的代表性western印迹。由于CTRP5是一种分泌蛋白，未受影响的兄弟姐妹中的强25kDa条带(CTRP5)可能表明CTRP5在全细胞提取物中保留程度更高。(c)标准化为β-肌动蛋白的western印迹(细胞裂解物)的定量(p<0.05)。(d)在来自未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE中，48小时后CTRP5选择性地分泌到顶侧，如通过ELISA测量的。在由未受影响的兄弟姐妹和患者分泌的量之间没有观察到可测量的差异。在基础培养基中检测到可忽略不计的CTRP5量(数据未显示)。(e)来自未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的免疫荧光染色的Airyscan共聚焦显微镜图像。膜受体ADIPOR1(以绿色显示)与CTRP5(以红色显示)、HOESCHT(以蓝色显示的核染色)共定位。(f)天然免疫标记的ADIPOR1(6nm免疫金)和CTRP5(12nm免疫金)的TEM图像提供了受体-配体相互作用(用黑色箭头表示)的证据。(g)使用已发表的晶体结构的ADIPOR1(以蓝色显示)和CTRP5(以绿色显示)之间的蛋白质-蛋白质相互作用的3-D模型。(h)丝氨酸(极性)到精氨酸(+)突变改变了残基的电荷，使其带正电荷。预计这种正电荷会排斥相邻的精氨酸残基并导致构象变化，从而降低突变CTRP5与ADIPOR1的结合亲和力。
图16的a至f描绘了表明CTRP5对ADIPOR1的拮抗降低导致L-ORD中的AMPK信号传导改变的各种测试数据。(a)通过ELISA测定的磷酸化AMPK水平表明，与未受影响的兄弟姐妹相比，在含5％血清的培养基中培养的L-ORD患者iPSC-RPE(N＝15；(120.6％±0.075)的基线活性增加约20.6％(N＝21；100％±0.04)。(b)在存在和不存在含有脂联素的血清的情况下，重组球状CTRP5对磷酸化AMPK水平的影响。将数据标准化为未处理的条件(0ug/mLgCTRP5)。在未受影响的兄弟姐妹中，在不存在天然配体脂联素的情况下(在0％血清条件下)添加0.2μg/mL重组球状CTRP5揭示pAMPK水平降低20％(N＝9；0.81±0.04)。这种显著下降被基线条件下5％血清的存在所掩盖(N＝6；0.99±0.01)。在L-ORD患者iPSC-RPE中，添加0.2μg/mL重组球状CTRP5对p-AMPK水平没有可测量的影响(N＝6；1.12±0.09)，即使在没有血清的情况下(N＝6；0.98±01)。(c)重组全长CTRP5对iPSC-RPE来源的p-AMPK水平的剂量反应效应。在未受影响的兄弟姐妹(5h 0％血清)中，AMPK的磷酸化水平在用增加浓度的重组全长CTRP5处理(30min)后降低。25ug/mL CTRP5导致p-AMPK水平降低～50％(N＝6，47.89％±0.13)。接受相似浓度的全长CTRP5的患者RPE在p-AMPK水平上没有引起可测量的变化。(d)在没有血清的情况下提高AMP:ATP比率的条件导致相比未受影响的兄弟姐妹，患者来源的iPSC-RPE中p-AMPK水平的改变。所有数据均标准化为含0％血清的条件。用2mMAICAR(一种AMP类似物)或500nMBAM15(一种减少ATP产生的线粒体解偶联剂)处理30min，导致未受影响的兄弟姐妹的AMPK水平进一步升高。相比之下，患者RPE的p-AMPK水平对AMP或ATP水平的变化不敏感。然而，用3mM二甲双胍治疗两周恢复了L-ORD患者对AMP:ATP比率变化的敏感性。(e)L-ORD患者来源的iPSC-RPE中升高的AMPK导致PEDF-R的mRNA表达显着上调(～8倍)。(f)免疫组织化学证实了L-ORD患者iPSC-RPE中定位于顶膜的PEDF-R蛋白表达升高。
图17的a至f描绘了证明L-ORD患者中脂质代谢改变有助于减少神经保护信号传导的各种测试数据。(a)描述富含脂质的外段的吞噬摄取及其被磷脂酶消化成游离脂肪酸的假定模型，RPE利用这些游离脂肪酸进行酮生成和神经保护性脂质介质如NPD1的合成。在人类癌细胞系中，升高的p-AMPK水平已被证明可抑制磷脂酶D的活性，并且是提出的机制，通过该机制，L-ORD患者的脂质摄取增加会导致DHA来源的神经保护素D1的利用和合成减少以及未消化脂质的积累。(b)通过FACS量化ph-Rhodo标记的外段的摄取，以比较来源于未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的吞噬率。L-ORD患者iPSC-RPE(N＝14；11.81±3.55)的吞噬细胞摄取比未受影响的兄弟姐妹(N＝15；7.86±3.94)高33％。这种脂质摄取增加的现象已在RPE中被报道为对氧化应激的保护性反应。(c,d)尽管整体PEDF-R表达显著增加，但通过ELISA测量的L-ORD患者磷脂酶A2活性比未受影响的兄弟姐妹降低了40％。(e)在经受pAMPK水平升高(n＝6，通过血清饥饿诱导)的正常iPSC-RPE(n＝6)中，磷脂酶A2活性显著降低(～26％)(p<0.05)。(f)通过ELISA测定PEDF的极化分泌。L-ORD患者(N＝12)表现出PEDF的顶端分泌减少(患者：939.6ng/mL/兄弟姐妹：1277.22ng/mL)和基底分泌增加(患者：92.16ng/mL/同胞：75.96ng/mL)，导致与未受影响的兄弟姐妹(N＝12，19.82±3.67)(p＝0.0014)相比，PEDF比率(Ap/Ba)(10.13±1.63)显著降低。数据为均值±SE，且代表3次独立实验的均值。*表示p<0.05。f)通过串联质谱脂质组学分析测量顶端分泌的DHA来源的神经保护D1。在6天内收集和汇集的未受影响的兄弟姐妹(Z8：n＝12，9i：n＝12)分泌的NPD1比L-ORD患者多约～10倍(K8:n＝12，El:n＝12)(p＝0.0089)。
图18的a至h描绘了证明L-ORD患者RPE对上皮-间质转化的敏感性增加的各种测试数据。(a、b)所有图像均使用63x物镜获得。比例尺＝20μm.B)对在描述的条件下获得的图像进行形状测量分析，以构建细胞区域分布的箱线图(下须线：5％的数据，下枢纽：25％的数据，中线：中位数、上枢纽：75％的数据，上须线：95％的数据)。L-ORD患者iPSC-RPE(N＝6张图像，135.37±1.76μm)相比未受影响的兄弟姐妹(N＝5，95.77±1.68μm)具有增加的细胞大小和可变性(p<2E-16)。在未受影响的兄弟姐妹中，与未治疗的未受影响的兄弟姐妹相比，在光感受器提供期间开始的二甲双胍治疗对细胞面积的影响最小(N＝7，93.14±1.56μm)(p＝0.52)。然而，与未治疗的患者相比，3mM二甲双胍治疗导致患者细胞面积显著减少(N＝7，117.92±0.96μm)(p<2E-16)。进行Dunnett多重比较检验以比较未治疗的未受影响的兄弟姐妹或L-ORD患者的比较。(c)7天POS提供后APOE染色的iPSC-RPE单层冷冻切片的免疫荧光显微镜图像。L-ORD患者iPSC-RPE表现出顶端和基底APOE沉积的相对比例改变(白色箭头)。在POS提供期间用二甲双胍治疗的L-ORD患者导致顶端和基底APOE沉积的相对比例重新分布(黄色箭头)，类似于未受影响的兄弟姐妹。(d)图像的APOE信号综合密度的图像量化，类似于(c)中所示的那些。相比未受影响的兄弟姐妹(N＝4；顶端30.89±12.05；基底：8.45±3.09)(顶端p＝7.76E-6；基底：p＝2.71E-5)，未治疗的L-ORD患者(N＝5；顶端：185.69±5.42；基底：46.38±2.51)的APOE信号的综合密度显著更高。二甲双胍治疗的L-ORD患者(N＝4；顶端79.30±37.51；基底：13.58±4.58)相比二甲双胍治疗的未受影响的兄弟姐妹(N＝8；顶端119.98±20.36；基底：23.55±6.17)(顶端：p＝0.32；基底：p＝0.32)之间无显著差异。所有图像均以20x拍摄。比例尺＝50μm。(f)模拟脉络膜血流减少的缺氧条件下(6h)VEGF分泌的ELISA测量，与年龄相关性黄斑变性的病理生理学有关，并用作确定L-ORD iPSC-RPE对缺氧驱动的EMT的易感性的代谢应激源。与图1i)所示的常氧条件相似，与未受影响的兄弟姐妹(N＝9；Ap:0.78±0.16；Ba:1.59±0.36)(Ap:p＝0.005；Ba:p＝0.63)相比，L-ORD患者iPSC-RPE(N＝10；Ap:1.89±0.30；Ba:1.8±0.24)以非极化方式分泌VEGF。用二甲双胍预先治疗(2周)可保护L-ORD患者RPE(N＝6；Ap:0.59±0.09；Ba:1.8±0.24)免受缺氧驱动的EMT的影响，并恢复与未治疗或二甲双胍治疗的未受影响的兄弟姐妹(N＝9；Ap:0.98+0.16；Ba:1.64±0.33)(Ap:p＝0.09；Ba:p＝0.64)相似的顶端/基底VEGF极性。(g)与未受影响的兄弟姐妹相比，POS提供对L-ORD患者iPSC-RPE中去分化(EMT)相关基因表达的影响。与未受影响的兄弟姐妹相比，7天POS提供(以白色显示)导致L-ORD患者中EMT相关基因的表达增加。7天POS提供期间的二甲双胍治疗(以红色显示)抑制EMT相关基因的表达。虚线表示4倍差异。管家基因：ACTB和GAPDH。(h)来自回顾性临床研究的结果的表格揭示，二甲双胍可延缓非渗出性年龄相关性黄斑变性的发病年龄(362.51/H35.31)。在50-59岁的患者中，二甲双胍可将发病年龄从56岁(n＝157，无二甲双胍)延迟至58.5岁(n＝16，使用二甲双胍)(p＝0.001)。
图19描绘了证明L-ORD患者的基因表达谱表明在基线时限制pAMPK活化的补偿性尝试的数据。
图20描绘了证明二甲双胍在常氧下拯救L-ORD患者RPE中VEGF的错误极化分泌的数据。
图21描绘了证明二甲双胍治疗增加了RPE的β-羟基丁酸顶端分泌的数据。
图22A至图22B描绘了在体内模拟RPE-EMT和RPE去分化特征的机械性视网膜损伤的模型
图23A至图23B描绘了显示Nox4存在于完整RPE中并在受损RPE中高度表达的数据
图24描绘了证明NOX4与称为EMT标记的细胞骨架蛋白共定位的数据。
图25描绘了证明使用VAS2870对NOX4的药理学抑制下调作为EMT标志物的SMA的数据。
图26A至图26C描绘了显示使用shRNA敲低NOX4的数据。
图27描绘了显示使用shRNA下调NOX4减少了受损RPE中的细胞迁移的数据。
图28A至图28C描绘了显示使用shRNA下调NOX4下调作为EMT标志物的ZEB1的数据。
图29A至图29C描绘了显示NOX4shRNA慢病毒颗粒成功下调划痕RPE中的巢蛋白的数据。
图30A至图30B描绘了显示NOX4有效下调EMT标志物表达的数据。
图31的A至C描绘了证明ABCA4在RPE细胞中定位的数据。A：ABCA4的Western印迹分析证实了它的膜定位。来自人原代(hp)RPE、对照iPSC-RPE和成纤维细胞(阴性对照)的膜(M)和细胞质部分(C)。Na/K ATP酶是RPE细胞中的一种顶膜蛋白。B：RPE膜上的ABCA4和Na/KATP酶共定位。C：RPE细胞的正交投影证实了ABCA4和Na/K ATP酶的顶端共定位。
图32的A至O描绘了展示Stargardt iRPE表征的数据。A-B：通过qRT-PCR(A)和Western印迹(B)观察到iRPE(来源于ABCA4-/-、Cl和C2)中不存在ABCA4表达。iPSC-阴性对照(A、B)；猴视网膜-阳性对照(B)，ABCA4-/-iRPE的对照1-等基因对照。C：Sanger测序证实患者iRPE中存在突变(外显子44中6088bp位置处的C>T)。D-E：通过dd-PCR(D)和Western印迹分析(E)在患者iRPE中表达ABCA4。F-I：对照和Stargardt iRPE单分子层的TEM图像显示具有顶端突起、顶端定位的黑素体、紧密连接和基底定位的核的极化RPE。健康的RPE包括ABCA4-/-克隆的等基因对照1和患者iRPE的对照2(未受影响的未受影响的兄弟姐妹)。O：成熟RPE标记的免疫染色显示-/-iRPE和对照细胞的表达相似。**p<0.01；***p<0.001。
图33的A至N描绘了证明在Stargardt iRPE中复制的Stargardt病理生理学的数据。A-G：提供Stargardt iRPE的野生型POS表现出增加(2-3倍)的脂质沉积。未提供(A-C)和提供POS(D-F)中RPE内/RPE下bodipy阳性沉积物的比较分析。Stargardt iRPE在暴露于POS时表现出增加(2-3倍)的神经酰胺积累(J-L)。G：与对照iRPE相比，Stargardt-iRPE中脂质沉积物(M)和Creamide积累(N)的定量分析。此处提供的对照数据点是来自ABCA4-/-克隆的等基因对照1和患者的对照2的iRPE平均值。p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。
图34的A至N描绘了显示补体应力下ABCA1KO在ABCA4脂质处理中的作用的数据；ABCA1KD Stargardt iRPE中的细胞内/亚细胞脂质积累；并且ABCA1激活拯救了StargardtRPE中的脂质积累缺陷。CI-HS(A-C)和CC-HS(D-F)处理的iRPE细胞中bodipy脂质阳性沉积物的图像。G：RPE内/RPE下脂质阳性沉积物的定量分析。与健康iRPE相比，Stargardt iRPE的bodipy染色(p.ns)增加了2。CC-HS(H-J)和CC-HS+GW 3965(K-M)处理的iRPE细胞的RPE内/RPE下bodipy阳性沉积物图像注意当用10mM GW 3965(ABCA1激活剂)处理时图K-L中的脂质沉积减少。N：对RPE内/RPE下bodipy阳性沉积物的定量分析证实了stargardt iRPE的显着下降。此处提供的对照数据点是来自ABCA4-/-克隆的等基因对照1和患者的对照2(未受影响的未受影响的兄弟姐妹)的iRPE平均值。p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。
图35的A至B描绘了证明Stargardt iRPE细胞中POS消化缺陷的数据。A：Stargardt-iRPE中POS和脂褐质样积累的清除缺陷。基于流式细胞术的吞噬作用测定揭示Stargardt-iRPE在4h时与健康iRPE的POS摄取相似。B：Stargardt-iRPE中降低的消化率。用pHrdho标记的POS供给细胞4小时，并在POS处理4h后用培养基洗涤，并在4h和24h收集用于流式细胞术分析。健康RPE包括ABCA4-/-克隆的等基因对照1和患者iRPE的对照2。***p<0.001)。
图36的A至C描绘了证明二甲双胍治疗改善疾病表型的数据。A：对Stargardt iRPE细胞中神经酰胺表达的定量分析表明，用二甲双胍处理的POS供给的Stargardt iRPE中其积累显著减少。此处提供的对照数据点是来自ABCA4-/-克隆的等基因对照1和患者的对照2的iRPE平均值B：用二甲双胍治疗的Abca4-/-小鼠的用bodipy染色的RPE/脉络膜的平装图像中的脂质分布。C：脂质染色的定量证实二甲双胍治疗的ABCA4KO小鼠的沉积物减少。(***p<0.001,****p<0.0001)。
发明详述
以下是提供以帮助本领域技术人员实施本公开的详细描述。本领域普通技术人员可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下对本文描述的实施方案进行修改和变化。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、附图和其他参考文献均明确地通过引用整体并入本文中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案并且不旨在限制本公开。
在提供数值范围的情况下，应理解在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定(如在包含多个碳原子的基团的情况下，在这种情况下每个碳原子数落入提供的范围内)，以及该规定范围内的任何其他规定或中间值均都包含在本公开内容中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，也包括在本公开范围内，受所述范围内任何具体排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制中的两个中任一个的范围也包括在本公开中。
本文的详细描述和权利要求中的所有数值均以“约(about)”或“大约(approximately)”指示值进行修饰，并考虑了本领域普通技术人员预期的实验误差和变化。
以下术语用于描述本公开。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案并且不旨在限制本公开。
如本文和所附权利要求中使用的冠词“a”和“an”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)，除非上下文另有明确说明。例如，“一个元素(anelement)”意指一个元素或多于一个元素。
如本文在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的元素中的“一个或两个”，即，在一些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即如此结合的“一个或多个”元素。除了通过“和/或”从句具体标识的元素之外，可以任选地存在其他元素，无论是否与那些具体标识的元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包括”之类的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一实施方案中可以仅指A(任选地包括除B外的元素)；在另一实施方案中，仅指B(任选地包括除A外的元素)；在又一实施方案中，指A和B两者(任选地包括其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求书中使用的，“或”应理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为包括性的，即包括至少一个，但也包括多个元素或元素列表中的多于一个，以及任选地另外的未列出的项目。只有明确指出相比之下的术语，如“仅一个””或“刚好一个”，或者当在权利要求中使用时，“由...组成”将指包含多个元素或元素列表中的刚好一个元素。一般而言，当前面带有排他性术语，如“任何一个”、“其中一个”、“只有一个”或“刚好一个”时，本文使用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个但不是两者”)。
在权利要求以及上述说明书中，所有过渡性短语如“包含(comprising)”、“包括(including)”、“携带(carrying)”、“具有(having)”、“含有(containing)”、“涉及(involving)”、“持有(holding)”、“由……组成(composed of)”等应被理解为是开放式的，即意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡短语“由……组成(consisting of)”和“基本上由……组成(consisting essentially of)”应分别是封闭或半封闭过渡短语。特别地，关于“基本上由……组成(consistingessentially of)”，“基本上由……组成(consisting essentially of)”对于不会实质上影响本发明的化合物或治疗的另外的组合物应是开放性的，并且应排除将降低本发明的化合物在本文所述的治疗中的有效性，或将诱导与本文所述治疗的目标相比之下的有害副作用的任何另外的组合物。
如本文在说明书和权利要求书中使用的，提及一个或多个元素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括在元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所指的元素列表中具体标识的元素之外的元素，无论是否与那些具体标识的元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一实施方案中可以指至少一个，任选地包括多于一个A，不存在B(并且任选地包括除B之外的元素)；在另一实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个B，不存在A(并且任选地包括除A之外的元素)；在又一实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个A，和至少一个，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其它元素)；等等。
还应理解，在本文所述的某些包括多于一个步骤或动作的方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述该方法的步骤或动作的顺序，除非上下文另有说明。
术语“共同给予(co-administration)”和“共同施用(co-administering)”或“联合治疗”是指同时施用(两种或更多种治疗剂同时施用)和时变施用(在与施用另外一种或多种治疗剂不同的时间施用一种或多种治疗剂)，只要治疗剂在一定程度上，优选以有效量同时存在于患者中。在某些优选的方面，本文所述的一种或多种本发明化合物与至少一种另外的生物活性剂联合施用，尤其包括抗癌剂，如靶向表皮生长因子受体的化学疗法或生物疗法(例如，表皮生长因子受体抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、凡德他尼、necitumamab(耐昔妥珠单抗)、奥希替尼或以上的组合中的至少一种)。在特别优选的方面，化合物的共同施用导致协同活性和/或治疗，包括抗癌活性。
除非另有说明，否则本文所用的术语“化合物”是指本文公开的任何特定化合物，并且包括其互变异构体、区域异构体、几何异构体，以及在适用的情况下立体异构体，包括其光学异构体(对映异构体)和其他立体异构体(非对映异构体)，以及药学上可接受的盐和衍生物，在上下文中适用的情况下包括其前药和/或氘代形式。所考虑的氘代小分子是其中药物分子中所含的一个或多个氢原子已被氘取代的那些。
在其在上下文中的使用中，术语化合物通常是指单一化合物，但也可以包括其他化合物，如立体异构体、区域异构体和/或光学异构体(包括外消旋混合物)以及公开的化合物的特定对映异构体或对映异构体富集的混合物。在上下文中，该术语还指化合物的前药形式，其已被修饰以促进将化合物施用和递送至活性部位。注意，在描述本发明化合物时，描述了许多取代基和与其相关的变量等。普通技术人员应当理解，本文描述的分子是下文中一般描述的稳定化合物。当显示键时，双键和单键均在所示化合物和价相互作用的众所周知的规则的范围内表示或理解。
术语“患者”或“对象”在整个说明书中用于描述动物，优选人或驯养动物，向其提供具有根据本公开的组合物的治疗，包括预防性治疗。为了治疗对特定动物如人类患者具有特异性的那些感染、病况或疾病状态，术语患者是指该特定动物，包括诸如狗或猫之类的驯养动物或诸如马、奶牛、绵羊之类的农场动物等。一般而言，在本公开中，术语患者是指人类患者，除非从使用该术语的上下文中另有说明或暗示。
术语“有效的”用于描述当在其预期用途的上下文中使用时产生预期结果的化合物、组合物或成份的量。术语有效包含在本申请中另外描述或使用的所有其他有效量或有效浓度术语。
治疗化合物
本发明提供了能够调节基因，或蛋白质或组织miRNAs或mRNAs或长链非编码RNA表达的化合物，其改善视网膜色素上皮细胞的形态和状况、活力、功能。
在某些实施方案中，本发明的化合物是抑制NADPH-氧化酶4(Nox4)功能和/或表达或抑制自由基氧物质形成的化合物。Nox家族的NADPH氧化酶是一组酶，其唯一已知的功能是通过催化电子从NADPH转移到分子O2来产生ROS。已经鉴定了催化亚基Nox(Nox 1-4)的四个啮齿动物基因，每个基因具有细胞内信号传导中的组织特异性表达和不同功能(Lambeth,2004；Brown和Griendling,2009；Zhang et al.,2010)。
在某些实施方案中，本发明的化合物是调节丝氨酸蛋白酶、多巴胺受体、NF-κB、mTOR、Rho GTP酶、CDC42和/或RAC1，或以上的组合的表达的化合物。
在某些其他的实施方案中，本发明的化合物是调节AMPK的化合物。
在其他实施方案中，本发明的化合物调节RPE上皮-间充质转化或RPE去分化。
NF-κB(活化的B细胞的核因子κ-轻链增强子)是一种蛋白质复合物，其可控制DNA转录、细胞因子产生和细胞存活。NF-κB存在于几乎所有动物细胞类型中，并参与细胞对诸如应力、细胞因子、自由基、重金属、紫外线照射、氧化LDL和细菌或病毒抗原等刺激的反应。NF-κB在调节对感染的免疫反应中起关键作用。NF-κB的不正确调节与癌症、炎症和自身免疫性疾病、感染性休克、病毒感染和不正确的免疫发育有关。NF-κB也与突触可塑性和记忆过程有关。
mTOR是蛋白激酶的磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶家族的成员。mTOR与其他蛋白质连接，并作为两种不同蛋白质复合物mTOR复合物1和mTOR复合物2的核心成分，它们调节不同的细胞过程。
Rho GTP酶是控制所有真核细胞中多种信号转导途径的分子开关。Rho GTP酶对动态肌动蛋白细胞骨架组装和重排至关重要，后者是细胞间粘附和迁移的基础。人Cdc42是Rho家族的一种小GTP酶，其调节控制多种细胞功能的信号传导通路，包括细胞形态、细胞迁移、内吞作用和细胞周期进程。激活的Cdc42通过p21激活的激酶PAK1和PAK2的构象变化激活，其进而启动肌动蛋白重组并调节细胞粘附、迁移和侵袭。Rac1，也称为Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1，是一种小的(～21kDa)信号传导G蛋白，并且是GTP酶的家族Rho家族的Rac亚家族的成员。Rac1是许多细胞过程的多效调节剂，包括细胞周期、细胞间粘附、运动(通过肌动蛋白网络)和上皮分化(被认为是维持表皮干细胞所必需的)。
丝氨酸蛋白酶是一类酶，其包括弹性蛋白酶、蛋白酶3、糜蛋白酶、组织蛋白酶G、胰蛋白酶、凝血酶、脯氨酰寡肽酶等。蛋白酶/抗蛋白酶活性平衡的破坏与许多疾病状态的发病机制有关。丝氨酸蛋白酶抑制剂包括一大家族的能够调节，特别是下调或抑制丝氨酸蛋白酶的化合物。
多巴胺受体是一类在脊椎动物中枢神经系统(CNS)中突出的G蛋白偶联受体。多巴胺受体不仅通过G蛋白偶联激活不同的效应器，而且通过不同的蛋白(多巴胺受体相互作用蛋白)相互作用传导信号。这里至少有五种多巴胺受体亚型，D1、D2、D3、D4和D5。多巴胺受体拮抗剂包括一大家族的能够调节，特别是下调多巴胺受体表达的化合物。
5'AMP活化蛋白激酶或AMPK或5'腺苷一磷酸活化蛋白激酶是在细胞能量稳态中发挥作用的酶(EC 2.7.11.31)，主要用于在细胞能量较低时激活葡萄糖和脂肪酸的摄取和氧化。它属于高度保守的真核蛋白家族，并且其直系同源物分别是酵母和植物中的SNF1和SnRK1。它由三种蛋白质(亚基)组成，它们共同构成一种功能性酶，从酵母到人类都是保守的。由于其成分的异构体的存在，在哺乳动物中存在12种AMPK版本，每一种都可以具有不同的组织定位，并且在不同的条件下具有不同的功能。
在某些实施方案中，本发明的化合物是抑制自由基氧物质形成的NOX4抑制剂化合物。在某些其他实施方案中，本发明的化合物抑制或下调NF-κB。在其他实施方案中，本发明的化合物抑制或下调丝氨酸蛋白酶。在某些其他实施方案中，本发明的化合物调节多巴胺受体的表达。在其他实施方案中，本发明的化合物调节mTOR或Rho GTP酶的表达。在其他实施方案中，本发明的化合物调节补体受体(C3aR和C5aR)的表达。在其他实施方案中，本发明的化合物上调自噬。在这样的实施方案中，自噬的上调改善了RPE健康并减少了APOE沉积。在其他实施方案中，本发明的化合物调节AMPK。在其他实施方案中，本发明的化合物调节RPE上皮-间充质转化或RPE去分化。
在特定的实施方案中，本发明的化合物包括但不限于氨基己酸、L-701,324、Vas2870、L-745,870盐酸盐、Me-3,4-dephostatin、N-甲基-l-脱氧野尻霉素、L-750,667三盐酸盐、(+)-MK-801氢马来酸盐、酒石酸五甲哌啶、(-)-萘普生钠、雷洛昔芬盐酸盐、SKF83959氢溴酸盐、L-687,384盐酸盐、7,7-二甲基-(5Z,8Z)-二十碳二烯酸、SP-600125、Ro41-0960、安西他滨盐酸盐、利培酮、替仑西平二盐酸盐、NO-711盐酸盐、U-99194A马来酸盐、S(+)-雷氯必利L-酒石酸盐、哌仑西平二盐酸盐、卡托普利、硫丙咪胺马来酸盐、阿普洛尔盐酸盐、利托君盐酸盐、腐胺二盐酸盐、1-(2-甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐、PAPP、U-69593、AG-1478、利鲁唑、甲磺酸酚妥拉明、DBO-83、福美司坦、卡马西平、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐、硫酸特布他林、UK 14304、GR 113808、来氟米特、氯化乙酰硫代胆碱、亚精胺、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、ATPO、Acadenisine或二甲双胍，或以上的组合。
在特定的实施方案中，本发明的化合物是L-745,870；利鲁唑、氨基己酸；Vas2870；Acadenisine；二甲双胍，或以上的组合。在其他特定的实施方案中，本发明的化合物是二甲双胍。
在另外的实施方案中，当需要抑制NOX4时，本发明的化合物或组合物包括一种或多种抑制NOX4的siRNA分子或一种或多种抗体。在某些实施方案中，本发明的组合物的化合物包括一种或多种生物活性剂，其导致产生抑制NOX4的抗体。
在另外的实施方案中，描述提供了如本文所述的化合物，包括它们的对映异构体、非对映异构体、溶剂化物和多晶型物，包括其药学上可接受的盐形式，例如酸和碱盐形式。
治疗组合物
包含有效量的至少一种如本文所述的化合物和一种或多种本文另外描述的化合物的组合的药物组合物，均以有效量，与药学有效量的载体、添加剂或赋形剂组合，代表了本公开的另一方面。
在适用的情况下，本公开包括包含如本文所述的化合物的药学上可接受的盐，特别是酸或碱加成盐的组合物。用于制备根据本方面有用的上述碱化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成无毒酸加成盐的那些，即含有药学上可接受的阴离子的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸盐)]盐等。
药学上可接受的碱加成盐也可用于产生根据本公开的化合物或衍生物的药学上可接受的盐形式。可用作制备酸性性质的本发明化合物的药学上可接受的碱盐的试剂的化学碱是与此类化合物形成无毒碱盐的那些。此类无毒碱盐包括但不限于来源于此类药理学上可接受的阳离子的那些，如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙、锌和镁)、铵或水溶性胺加成盐如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)，以及药学上可接受的有机胺的低级链烷醇铵和其他碱盐等。
根据本公开，本文所述的化合物可以通过口服、肠胃外或局部途径以单剂量或分剂量施用。也可以使用根据本公开的化合物以局部眼部施用途径施用。活性化合物的施用范围可以从连续(静脉滴注)到每天数次经口施用(例如，Q.I.D.)，并且可以包括经口、局部、肠胃外、肌内、静脉内、皮下、透皮(其可以包括渗透增强剂)、口腔、舌下和栓剂施用，以及其他施用途径。肠溶包衣口服片剂也可用于提高化合物从经口施用途径的生物利用度。最有效的剂型将取决于所选特定药剂的药代动力学以及患者疾病的严重程度。也可以使用根据本公开的化合物作为喷雾剂、薄雾剂或气雾剂施用，用于鼻内、气管内或肺部施用。也可以使用根据本公开的化合物作为滴眼剂、玻璃体内注射剂、筋膜下注射剂和视网膜下注射剂的施用。因此，本公开还涉及药物组合物，其包含有效量的如本文所述的化合物，任选地与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合。根据本公开的化合物可以立即释放、中间释放或持续或控制释放形式施用。缓释或控释形式优选经口施用，但也以栓剂和透皮或其他局部形式施用。脂质体形式的肌内注射也可用于控制或维持化合物在注射部位的释放。
在特定实施方案中，本文所述的化合物通过局部眼部施用途径施用。在这样的实施方案中，根据本公开的化合物作为眼用药物组合物施用。此类眼用药物组合物制备成滴眼剂、雾剂、霜剂、泡沫剂、乳膏剂、软膏剂或乳剂的形式用于直接施用于眼睛。在特定实施方案中，组合物被制备为水性滴眼剂。在这样的实施方案中，滴眼剂是单相的。水性滴眼剂中包含的本发明化合物的浓度通常为但不限于不低于0.01W/V％，优选不低于0.1W/V％，更优选不低于0.5W/V％，并且通常不超过20W/V％，优选不超过10W/V％，且更优选不超过5W/V％。实际施用的本发明化合物的量取决于要接受治疗的个体，并且优选是优化的量以实现所需的治疗而不伴随明显的副作用。本领域普通技术人员可以充分确定有效剂量。
本发明的滴眼剂可以根据需要含有通常添加到滴眼剂中的添加剂，只要不损害本发明的特性和滴眼剂的稳定性。这种添加剂的实例包括但不限于等渗剂，如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等；缓冲剂如磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、tris缓冲剂、谷氨酸、ε-氨基己酸等；防腐剂如苯扎氯铵、苄索氯铵、葡萄糖酸氯己定、氯丁醇、苯甲醇、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸酯、依地酸钠、硼酸等；稳定剂如亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯等；水溶性纤维素衍生物如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素等；增稠剂如硫酸软骨素钠、透明质酸钠、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；pH调节剂如盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等；等等。在特定实施方案中，包含本发明化合物的滴眼剂还可包含一种或多种可包含在人工泪液中的其他成分，即氨基乙基磺酸、硫酸软骨素钠、L-天冬氨酸钾、L-天冬氨酸镁、L-天冬氨酸钾镁(等摩尔混合物)、碳酸氢钠、碳酸钠、氯化钾、氯化钙、氯化钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、干燥碳酸钠、硫酸镁、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、葡萄糖和甲基纤维素。虽然这些添加物的添加量根据要添加的添加物的种类、用途等不同而不同，但它们只要以能够实现添加物的目的的浓度添加即可。
如本文所述的组合物可以使用一种或多种药学上可接受的载体以常规方式配制，并且也可以以控释制剂的形式施用。可用于这些药物组合物的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸醇溶蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
如本文所述的组合物可以经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、眼内、眼表、直肠、鼻腔、口腔、阴道或经由植入的储库施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、玻璃体内、视网膜下、视网膜、筋膜下、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，组合物通过局部眼部施用、经口、腹膜内或静脉内施用。
如本文所述的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是于无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为于1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，如天然药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液还可以包含长链醇稀释剂或分散剂，如Ph.Helv或类似的醇。
如本文所述的药物组合物可以任何经口可接受的剂型经口施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在经口使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，如硬脂酸镁。对于胶囊形式的经口施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当经口施用需要水性混悬剂时，将活性成分与乳化剂和助悬剂组合。如果需要，也可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。在某些实施方案中，用于经口施用的药物组合物包括有助于将化合物递送穿过血-视网膜屏障的制剂。
可选地，如本文所述的药物组合物可以以栓剂的形式施用，以用于直肠施用。这些可以通过将试剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，并因此会在直肠中熔化以释放药物。此类物质包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
如本文所述的药物组合物也可以局部施用。很容易为这些区域或器官中的每一个制备合适的局部制剂。可以在直肠栓剂制剂(见上文)或合适的灌肠剂制剂中实现下肠道的局部施用。也可以使用局部可接受的透皮贴剂。
对于局部施用，药物组合物可以在合适的软膏剂中配制，该软膏剂含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性成分。用于本公开化合物的局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。在本公开的某些优选方面，可以将化合物涂覆到要通过外科手术植入患者中的支架上，以抑制或降低患者支架中发生闭塞的可能性。
可选地，药物组合物可以在合适的洗剂或乳膏剂中配制，其含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼科用途，药物组合物可以配制成于等渗的、经pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选地配制成于等渗的、经pH调节的无菌盐水中的溶液，它们含有或不含防腐剂如氯苄烷铵(benzylalkonium chloride)。可选地，对于眼科用途，药物组合物可配制成软膏如凡士林。在某些实施方案中，用于眼部或局部眼部使用的药物组合物包括亲脂改性的组合物和可移植载体。
如本文所述的药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入施用。此类组合物根据药物制剂领域中众所周知的技术制备并且可以制备成于盐水中的溶液，采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以提高生物利用度、碳氟化合物和/或其他常规增溶剂或分散剂。
如本文所述的药物组合物中可与载体物质组合以产生单一剂型的化合物的量将根据所治疗的宿主和疾病、特定的施用方式而变化。优选地，组合物应配制成含有单独或与至少一种根据本公开的其他化合物组合的约0.05毫克至约750毫克或更多，更优选约1毫克至约600毫克，且甚至更优选约10毫克至约500毫克的活性成分。
还应理解，任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合和治疗医生的判断，以及正在治疗的特定疾病或病况的严重程度。
可以通过向患者(对象)施用有效量的根据本公开的化合物来治疗需要使用根据本文所述方法的化合物进行治疗的患者或对象，包括其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物，任选地于药学上可接受的载体或稀释剂中，单独或与本文另外确定的其他已知治疗剂组合。
这些化合物可以通过任何合适的途径施用，例如经口、肠胃外、静脉内、皮内、皮下或局部施用，包括透皮、以液体、乳膏、凝胶或固体形式，或通过气雾剂形式。
活性化合物包含在药学上可接受的载体或稀释剂中，其量足以向患者递送对所需适应症有治疗效果的量，而不会对所治疗的患者造成严重的毒性作用。对于所有本文提及的病况，活性化合物的优选剂量范围为约10ng/kg至300mg/kg，优选每天0.1-100mg/kg，更通常每天每千克接受者/患者体重0.5至约25mg。在合适的载体中，典型的局部剂量范围为0.01％-5％wt/wt。
该化合物方便地以任何合适的单位剂型施用，包括但不限于每单位剂型含有少于1mg、1mg至3000mg，优选5-500mg活性成分的剂型。约25-250mg的经口剂量通常是方便的。
优选施用活性成分以实现约0.00001-30mM，优选约0.1-30mM的活性化合物的峰值血浆浓度。这可以例如通过静脉内注射活性成分的溶液或制剂来实现，任选地于盐水或水性介质中，或作为活性成分的团注施用。经口施用也适合产生活性剂的有效血浆浓度。
药物组合物中活性化合物的浓度将取决于药物的吸收、分布、失活和排泄速率以及本领域技术人员已知的其他因素。需要注意的是，剂量值也将随着要缓解的病况的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定对象，应根据个体施用和给予组合物或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整特定的剂量方案，并且本文所述的浓度范围仅是示例性的，且并不旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。活性成分可以一次施用，或者可以分成多个较小的剂量以不同的时间间隔施用。
经口组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以封装在明胶胶囊中或压制成片剂。为了经口治疗施用的目的，活性化合物或其前药衍生物可以与赋形剂结合并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。药学相容的粘合剂和/或佐剂物质可以作为组合物的一部分包括在内。
片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有以下任何成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、分散剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。当剂量单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体如脂肪油。另外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位物理形式的各种其他物质，例如糖、虫胶或肠溶剂的包衣。
活性化合物或其药学上可接受的盐可以作为酏剂、悬浮液、糖浆、薄片剂(wafer)、口香糖等的组分施用。除了活性化合物外，糖浆还可以含有蔗糖作为甜味剂和某些防腐剂、染料和色素和香料。
活性化合物或其药学上可接受的盐也可以与不损害所需作用的其他活性物质混合，或与补充所需作用的物质混合，如抗癌剂，包括表皮生长因子受体抑制剂、EPO和darbapoietin alfa等。在本公开的某些优选方面，根据本公开的一种或多种化合物与另一种生物活性剂或伤口愈合剂，包括抗生素共同施用，如本文另外描述的。
用于肠胃外、皮内、皮下或局部施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠外制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
如果经静脉内施用，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一实施方案中，活性化合物与将保护化合物免于从体内快速清除的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。
脂质体悬浮液也可以是药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如第4,522,811号美国专利中所述(其通过引用整体并入本文中)。例如，可以通过将合适的脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶解在无机溶剂中，然后将其蒸发，留下干燥的脂质薄膜在容器的表面上来制备脂质体制剂。然后将活性化合物的水溶液引入容器中。然后用手旋转容器以从容器的侧面释放脂质物质并分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。
治疗方法
在另一个方面，本说明书提供了治疗组合物，其包含有效量的如本文所述的化合物或其盐形式，以及药学上可接受的载体。治疗组合物可用于治疗或改善患者或对象，例如动物如人的眼科疾病状态或病况。治疗组合物可用于治疗或改善患者或对象，例如动物如人的视网膜病症或病况。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”等是指为可以给予本发明化合物的患者提供益处的任何作用，包括治疗眼科疾病状态或病况。本说明书提供了如本文所述的用于治疗眼科疾病的治疗组合物，如年龄相关的)黄斑变性、黄斑营养不良如Stargardt病和Stargardt样病、Best病(卵黄状黄斑营养不良)和成人型卵黄状营养不良或视网膜色素变性的亚型。在某些实施方案中，该方法包括施用有效量的如本文所述的化合物，任选地包括药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、另一种生物活性剂或以上的组合。
在另外的实施方案中，本说明书提供了用于治疗或改善对象或患者，例如动物如人中的眼科疾病、病症或其症状的方法，包括向有需要的对象施用组合物，其包含有效量的，例如治疗有效量的本文所述的化合物或其盐形式，以及药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、另一种生物活性剂或以上的组合，其中所述组合物有效治疗或改善对象中的疾病或病症或其症状。
在另外的实施方案中，本说明书提供了用于治疗对象或患者，例如动物如人中的视网膜变性的方法，包括向有需要的对象施用组合物，其包含有效量的，例如治疗有效量的本文所述的化合物或其盐形式，以及药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、另一种生物活性剂或以上的组合，其中所述组合物有效治疗或改善对象中的视网膜变性的症状。
在另外的实施方案中，本说明书提供了用于恢复对象或患者，例如动物如人中的视网膜色素上皮细胞的方法，包括向有需要的对象施用组合物，其包含有效量的，例如治疗有效量的本文所述的化合物或其盐形式，以及药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、另一种生物活性剂或以上的组合，其中所述组合物有效恢复对象中的视网膜色素上皮细胞。
在另外的实施方案中，本说明书提供了用于治疗对象或患者，例如动物如人中的黄斑变性的方法，包括向有需要的对象施用组合物，其包含有效量，例如治疗有效量的本文所述的化合物或其盐形式，以及药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、另一种生物活性剂或以上的组合，其中所述组合物有效治疗或改善对象中的黄斑变性症状。在具体的实施方案中，黄斑变性是年龄相关性黄斑变性。在其他实施方案中，黄斑变性是萎缩性、新生血管性或渗出性黄斑变性。在其他实施方案中，黄斑变性是早期黄斑变性、中期黄斑变性或晚期黄斑变性。在特定的实施方案中，本说明书提供了用于治疗对象或患者，例如动物如人中的早期黄斑变性的方法，包括向有需要的对象施用组合物，其包含有效量的，例如治疗有效量的二甲双胍或其盐形式，以及药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、另一种生物活性剂或以上的组合，其中所述组合物有效治疗或改善对象中的早期黄斑变性的症状。
在另一实施方案中，本公开涉及治疗或改善有需要的人类患者中的眼科疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的根据本公开的化合物，任选地与另一种生物活性剂组合。
在另一实施方案中，本说明书提供了用于治疗对象或患者，例如动物如人中的Stargardt病或Stargardt样病的方法，包括向有需要的对象施用组合物，其包含有效量的，例如，治疗有效量的本文所述的化合物或其盐形式，以及药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、另一种生物活性剂或以上的组合，其中所述组合物有效治疗或改善对象中的Stargardt病或Stargardt样病。在特定的实施方案中，用于治疗Stargard病或Stargard样病的方法包括施用有效量的二甲双胍或其盐。
术语“生物活性剂”用于描述除根据本公开的化合物之外的试剂，其与本发明化合物组合用作具有生物活性的试剂以帮助实现使用本发明化合物的预期的治疗、抑制和/或防治/预防。用于本文的优选生物活性剂包括具有与使用或施用本发明化合物相似的药理活性的那些试剂。
在适用情况下，术语“药学上可接受的盐”在整个说明书中用于描述一种或多种本文所述化合物的盐形式，提供其以用于增加化合物在患者胃肠道胃液中的溶解度，以便促进化合物的溶解和生物利用度。在适用情况下，药学上可接受的盐包括来源于药学上可接受的无机或有机碱和酸的那些。合适的盐包括来源于碱金属如钾和钠、碱土金属如钙、镁和铵盐，以及制药领域熟知的许多其他酸和碱的那些。特别优选钠盐和钾盐作为根据本公开的磷酸盐的中和盐。
术语“药学上可接受的衍生物”在整个说明书中用于描述任何药学上可接受的前药形式(如酯、酰胺或其他前药基团)，其在给予患者后直接或间接地提供本发明化合物或本发明化合物的活性代谢物。
试剂盒
另一方面，本说明书提供了试剂盒，当医生使用该试剂盒时，可以简化将适量的本发明化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物给予患者或细胞的过程。
本发明的典型试剂盒包含本发明化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物的一种或多种单位剂型，以及用于向对象或细胞施用的说明书。本发明的典型试剂盒还可以或可选地包含大量的本发明化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
本发明的试剂盒还可以包含用于本发明化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物的施用的装置，以及用于向对象或细胞施用的说明书。这种装置的实例包括但不限于静脉插管装置、注射器、滴注袋、贴片、局部凝胶、泵、提供光降解保护的容器、自动注射器、滴眼器和吸入器。
在特定的实施方案中，本发明的试剂盒包含溶液，该溶液包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物、滴眼器和用于将溶液直接施用至对象眼睛的说明书。在某些此类实施方案中，溶液被提供在包括滴管尖端的容器中，该滴管尖端可以直接分配滴剂而无需额外的滴管。
本发明的试剂盒还可以包含可用于施用作为活性成分的一种或多种本发明化合物的药学上可接受的媒介物。例如，如果活性成分以必须重构以用于肠胃外施用的固体形式提供，则试剂盒可包含合适媒介物的密封容器，其中活性成分可溶解以形成适合肠胃外施用的不含颗粒的无菌溶液。药学上可接受的媒介物的实例包括但不限于：注射USP用水；水性媒介物，诸如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液和乳酸林格氏注射液；与水混溶的媒介物，诸如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性媒介物，诸如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
实施例
实施例1-补体感受态人血清(CC-HS)在成熟iPSC-RPE中诱导AMD样细胞内表型
将来源于五个不同健康个体的iPSCs用于该分析。使用先前公布的方案(May-Simera et al.,2018,Sharma et al.,2019)将iPSCs分化为成熟的RPE细胞。iRPE细胞的成熟度通过细胞膜上β-连环蛋白的存在(May-Simera et al.,2018,图1的A)，并且通过从培养的第3周开始逐渐增加单层的跨上皮电阻(TER)(p<2x10-16，第3周至第4-6周；图9的A)得到证实。与已发表的原代RPE细胞报告一致(Johnson et al.,2011；Pilgrim et al.,2017)，与CI-HS处理过的细胞相比，在CC-HS处理的iRPE中观察到APOE阳性亚iRPE沉积物增加了五倍(p<0.0001；图1的B-D)。类似于在AMD眼睛中看到的玻璃疣沉积物(Mullins etal.,2000FASEB J)，APOE阳性沉积物与抗膜攻击复合物(MAC)抗体共染色(图9的B)。CC-HS处理的iRPE也表达高水平的玻璃膜疣标记物腓骨蛋白3(Marmostein et al.,2002；图9的C、D)、对中性脂质沉积物增加的RPE下染色(尼罗红)和对甘油三酯和酯化的胆固醇沉积物增加的细胞内染色(油红O)(Pilgrim et al.,2017；图1的E、F和图9的E、F)。CC-HS处理的iRPE细胞的透射电子显微镜(TEM)进一步证实了细胞内脂质沉积物的存在(图1的H中的黄色箭头)。TEM和扫描电子显微镜(SEM)还验证了在CC-HS处理的样品中存在具有典型圆顶形外观的基底层状沉积物(红色箭头图1的G、H和图9的G、H)。总之，这些发现支持CC-HS治疗在iRPE细胞中诱导AMD的几种特征性疾病表型的说法。因此，提供了一个体外模型来研究参与AMD发病机制的RPE细胞自主通路，并发现可以在早期疾病阶段进行干预的药物。
CC-HS处理的细胞的TEM还揭示相邻RPE.细胞之间的解体的连接复合物(图1的I、J中的箭头)。为了进一步研究CC-HS处理的样品中相邻RPE细胞之间紧密连接的完整性，对样品进行了紧密连接和肌动蛋白细胞骨架标记的染色。CLDN16——一种关键的RPE紧密连接蛋白(Wang et al.,2010)，在CC-HS处理的样本中经常从细胞边界缺失并定位于细胞内(图1的K、L中的箭头)。F-肌动蛋白染色显示了未能保持其特征性六边形形态的CC-HS处理的iRPE细胞中的细胞内应力纤维(图1的M、N中的箭头)。波形蛋白免疫染色进一步证实了CC-HS处理的iRPE细胞的去分化，其中波形蛋白从细胞膜中缺失并且在扩大的、伸展出的细胞的细胞质中没有任何结构存在(Tamiya et al.,2010；图9的I、J)。使用光学相干断层扫描报告了患者眼睛中上皮表型的丧失(Curcio et al 2017)。为了检查先前报道的RPE上皮细胞表型缺失是否与CC-HS iRPE模型中看到的去分化表型一致，将来自尸体AMD眼睛的RPE-flatmounts对波形蛋白和F-肌动蛋白进行了免疫染色(图9的K、L)。通过F-肌动蛋白染色证实了GA病变边缘处RPE细胞的去分化，其显示典型六边形形态的丧失和细胞质中存在的波形蛋白免疫染色增加，而没有任何适当的结构(图9的K、L)，证实了体外观察。与CI-HS处理的iRPE相比，CC-HS处理的iRPE细胞的去分化导致TER减少3倍(p<10-5)(图10)。它还导致CC-HS处理的细胞功能成熟度的丧失，这通过吞噬光感受器外段(POS)的能力降低6倍(p<10-6)来证实(图1的P)。另外，与CI-HS处理的细胞相比，CC-HS处理的细胞失去了它们的极化状态，如通过降低的稳态跨上皮电位(TEP)(4mV v/s 0.25mV,p<10-4)、对将顶端K+浓度从5mM降低到1mM的生理刺激的超极化反应降低(2mV v/s 0.5mV,p<0.0001)，以及对顶端ATP刺激的去极化反应可忽略不计(p<0.03；图1的Q、R；图9的M)所证实的。总体而言，结果表明CC-HS处理诱导了AMD RPE中的几个标志性特征；最值得注意的是，APOE和含脂质的亚细胞沉积物的形成。这项工作扩展了先前的知识，即CC-HS治疗和RPE下沉积物与上皮表型变性相关，伴随顶端-基底极性的丧失和功能成熟导致细胞去分化，这种表型被认为会导致晚期疾病阶段。
实施例2-通过C3aRl和C5aRl信号传导诱导CC-HS触发的AMD疾病表型
据推测，iRPE细胞中CC-HS触发的AMD细胞表型是由补体途径的过敏毒素臂经由C3a-C3aRl和C5a-C5aRl信号传导诱导的细胞内炎症产生的(Femandez-Godino和Pierce2018)。RNAseq证实了两种受体在iRPE细胞中的表达，与C3aR1相比，C5aR1的表达高～30x(图10的A)。此外，两种受体的表达都随着CC-HS处理而增加。Western印迹证实C3aR1和C5aR1受体定位于iRPE细胞的膜部分中(图2的A)。它们与顶端膜标记埃兹蛋白共定位，但不与基底膜标记胶原IV共定位，这表明两种补体蛋白C3a和C5a的受体主要位于顶端(图2的B、C、图10的B)。为了验证CC-HS激活iRPE细胞中的C3aR和C5aR信号传导，检查了样品中AKT和ERK1/2的磷酸化，它们是C3aR1和C5aR1受体下游的两种关键激酶(Hajishengallis和Lambris 2010；Zhu et al 2015 Mol Vis；Busch et al 2017 Front.In Immu.)。三个供体iRPE样品中的CC-HS处理样品的Western印迹显示，与CI-HS处理的细胞相比，CC-HS处理的细胞中pAKT(p<0.01)和pERK1/2(p<0.01)水平增加了2-4x(图2的D-G)。此外，与C3aR1和C5aR1的主要顶端定位一致，CC-HS的仅顶端处理引起4.5-5x TER下降(p<10-16)，类似于CC-HS的组合顶端/基底处理。相比之下，CC-HS的仅基底处理仅导致2x TER下降(p<10-16)(图2的H)。为了进一步剖析C5aR1和C3aR1信号传导在iRPE细胞中诱导AMD细胞表型的作用，采用了耗尽的血清和受体阻滞剂策略。用耗尽C3(p<0.01)或C5(p<0.01)蛋白的血清处理iRPE细胞，或同时使用于CC-HS血清中的C3aRl(坎普他汀,10mM)和C5aRl(PMX053,10mM)的阻断剂(p<0.01)，导致RPE下APOE沉积物与CC-HS加媒介物处理相比低2x(图21、图10的C-G)。与完全CC-HS培养基相比，补体因子D(C3a和C5a形成的上游调节剂)的消耗也导致较低的RPE下APOE沉积(Sharma和Ward 2011；图S2C、D)。类似地，与CC-HS处理的样品相比，在用C3(p<10-16)或C5(p<10-16)耗尽的血清或使用C3aR1和C5aR1受体的阻断剂(康普他汀，10mM和PMX053，分别为10mM；p<10-16)处理的样品中观察到iRPE单层TER高5x(图2的J)。此外，在用C3和C5蛋白耗尽的血清处理的样品中，iRPE单层的电生理特性没有变化(比较图1的Q、R与图10的H、I)。总之，数据表明主要通过RPE细胞的顶端表面发生的C3aR1或C5aR1补体受体的刺激是触发iRPE细胞中的AMD疾病表型所必需的。
实施例3-C3aR1和C5aR1诱导的RPE下沉积物是通过NF-κB的过度活化和自噬通路的下调介导的
CI-HS和CC-HS处理的iRPE细胞的RNAseq分析揭示了由CC-HS处理诱导的显著不同的全局基因表达模式(图11的A)。与过敏毒素补体(C3a、C5a)在免疫细胞中的作用一致，通过CC-HS处理iRPE细胞，自噬(p<10-6)和TNF/NF-κB(p<10-5)途径改变最大(Freeley et al,2016；Kumar 2019 Int Rev of Immu；Nguyen et ah,2018；图11的B、C、D)。这导致我们假设iRPE细胞中的C3aR1和C5aR1信号传导通过这两种途径起作用。CC-HS处理确实导致NF-κB的p65(RELA)亚基易位到细胞核，表明它的激活(Rayet和Gelinas 1999,Oncogene；图3的A、B)。p65的核易位导致NF-κB靶基因的表达增加4-6x(Tilborghs et al.,2017)，如通过RNAseq(图11的B,p<10-5)、选择的靶基因的基于qRT-PCR的验证(例如IL-6、IL-8、GADD45B、EGR2、NFKBIA、RELl、NFKBI、SNAP25；图3的C，p<10-1至p<10-6)，以及两个NF-κB靶基因RELB和TRAF3(图11的B-D)的免疫染色所证实的。此外，CC-HS处理使NK-κB途径的炎性细胞因子IL-8(图3的D，顶端p<0.01，基底p<10-5)和IL-18(图11的E，顶端p<0.005，基底p<0.005)的分泌加倍。在用C3或C5蛋白耗尽的血清处理的iRPE细胞中缺乏p65的核易位进一步证实了过敏毒素补体在iRPE细胞中直接激活NF-κB途径中的作用(图3的E-G)。为了确定NF-κB激活是否直接导致RPE下APOE沉积物的形成，使用了来源于在NEMO基因中具有E391X突变患者的iRPE细胞，这是NF-κB信号传导的负调节剂(Zilberman-Rudenko et al,2016)。与文献一致，即使在CI-HS处理条件下，在突变iRPE细胞中也观察到p65的核易位(图3的H)。此外，在CI-HS处理条件下，在突变iRPE细胞中观察到高5-6x(p<0.001)的RPE下APOE沉积物(图3的I、J)。总体而言，这些结果表明过敏毒素补体触发的iRPE细胞中的AMD疾病表型可能是通过激活NF-κB途径介导的。
RNAseq分析还揭示了CC-HS处理的细胞中自噬途径的统计学显著(p<10-6)的缺陷(图11的C)，这得到了AMD与RPE中自噬失调之间的文献联系的支持(Sinha et al.,2016；Golestaneh et al.,2017)。这促使我们研究iRPE细胞中自噬在CC-HS诱导的AMD细胞内表型中的作用。免疫染色和Western印迹分析揭示出，与CI-HS处理的iRPE细胞相比，CC-HS处理的iRPE细胞中对自噬调节不可或缺的基因ATG5、ATG7和LC3-II均下调3-4x(p<0.005)(图4的A-I；图12的A、B)。qRT-PCR进一步证实了这些结果，其显示与CI-HS iRPE细胞相比，CC-HS处理的iRPE细胞中的关键自噬途径基因(例如ATG3、ATG12、ATG4B、ATG4D、BCL2、LAMP1、SQSTM1、MAP1LC3A、MAP1LC3B)表达的4-16倍下调(p<0.01-10-3)(图12的F)。CC-HS处理的细胞中关键自噬基因的表达降低表明自噬通量降低，这通过CC-HS处理的iRPE细胞中自噬体的积累增加得到证实(箭头，图12的E)。
与C3aR1和C5aR1的主要顶端定位一致，证明在iRPE顶端侧处理CC-HS足以触发细胞中LC3-II(自噬的主要标志物)的下调(图4的J、图12的C；p＝ns在两侧CC-HS之间且仅顶端CC-HS处理)。此外，与CC-HS处理的细胞不同，用C3或C5蛋白耗尽的CC-HS血清处理的iRPE细胞不能诱导自噬下调，并且其行为与CI-HS血清相似(图4的K、图12的D，p<0.05CI-HS相对于CC-HS；p＝ns CI-HS相对于C5耗尽的或C3耗尽的CC-HS)。类似地，用CC-HS与C3aR1和C5aR1阻断剂联合处理的iRPE细胞的表现与CI-HS处理的样品相似，并且没有显示出LC3水平的统计学显著的降低(p＝ns CI-HS相对于C3aR+C5aR阻断剂+CC-HS；图4的K、图12的D)。总之，这些结果证实过敏毒素补体信号传导C3aR1和C5aR1抑制CC-HS处理的iRPE细胞中的自噬。
为了进一步了解导致RPE下玻璃疣沉积物形成的事件序列，对iRPE细胞添加CC-HS后NF-κB活化和自噬下调进行了时间分析。在添加CC-HS的6小时内，p65的核易位仅在少数细胞中很明显，而在24小时内，这种易位在大多数细胞中可见(图12的G-K)。类似地，可以在CC-HS处理后6小时内立即观察到LC3-II下调，到24小时时达到最高水平(图12的L-Q)。相比之下，仅在48小时时间点观察到APOE沉积的明显增加(图12的R-U)，表明NF-κB上调和自噬下调先于CC-HS处理的iRPE细胞中APOE沉积的形成。
此前，已将NF-κB信号传导和自噬与STAT3活性相关联(Jonchere et al.,2015)。降低的STAT3转录活性被认为会导致自噬下调(Jonchere et al.,2015)。为了检查CC-HS处理的样品中STAT3的活性是否发生变化，比较了CC-HS和CI-HS处理的样品中的STAT3磷酸化。STAT3在酪氨酸残基705处的磷酸化下调了5-6x(p<0.001)，表明STAT3的转录活性降低。为了确认iRPE细胞中STAT3活性降低是否直接导致RPE下APOE沉积形成，生成了来自Job综合征患者的RPE细胞。由于DNA结合突变，STAT3在这些细胞中没有转录活性。与之前的数据一致，即使在CI-US处理条件下，与对照细胞相比，在STAT3突变细胞中也观察到APOE阳性RPE下沉积物高出10-12x。这表明NF-κB过度活化下游的STAT3下调也有助于APOE沉积物的形成。
实施例4-发现iRPE细胞保护药物的高通量筛选
RNAseq揭示了在iRPE的CC-HS治疗中触发的高度复杂的反应——具有多种途径，包括TNF/NF-κB、自噬、碳水化合物代谢、蛋白质降解、离子稳态和细胞中受影响的上皮表型(图11的B)。据推测，上皮表型/RPE去分化的丧失是关键的AMD细胞表型，并且更容易建立高通量筛选。抑制RPE去分化和恢复细胞中上皮表型的药物也可能有助于挽救额外的AMD细胞内表型。药物筛选是使用钙离子载体A23187而非CC-HS血清设计的，原因有以下三个：1)CC-HS在用于培养基更换的液体处理管中失去活性，可能是因为活性补体蛋白被吸收在液体处理管的壁上；2)与A23187类似，iRPE的CC-HS治疗也导致细胞内钙稳态缺陷。尽管CI-HS和CC-HS处理的细胞中的基线钙水平相似(100-120nM；图5的A-C)，但与显示增加200nM的CI-HS处理的细胞相比，在CC-HS处理的细胞中导致细胞内钙储存激活和细胞内钙增加的ATP刺激被显著抑制(80nM增加)(图5的A-C，p<0.05)；与CC-HS处理类似，A23187处理导致iRPE细胞死亡(图5的D、图13的A)。
在96小时时，所有三种浓度的A23187(2.5、10、25mM)都对细胞具有完全毒性，但在48小时时，2.5mM会导致50％的细胞死亡，并且10mM会导致70％的细胞死亡(图5的D、S6A)。选择10mM浓度的A23187用于药物筛选，因为它为细胞死亡拯救提供了更大的余量。将具有1280种药物的市售药物活性化合物库(LOPAC)以两种不同的浓度9.2mM和46mM用于筛选。向384孔板中成熟的iRPE细胞中加入药物治疗和压力源10mM A23187，并在48小时后使用CellTitrGlo测定通过ATP释放对细胞死亡进行评分。包含A23187的所有测定板中可比较的相对平均信号强度证实了筛选的一致性和重现性(图13的B)。标准化的细胞死亡信号显示，与具有较高药物浓度(46mM)的板相比，具有较低药物浓度(9.2mM)的板7-10具有减少的细胞死亡(图13的C)。事实上，在46mM下，大多数药物具有细胞毒性，而在9.2mM下，45种药物在A23187处理的细胞中表现出改善(超过40％)的细胞存活率(图13的G)。
对药物数据的进一步分析揭示了一些384孔泳道中的潜在伪影可能导致假阳性信号(在图13的G中圈出)。为了区分假阳性和真实信号，使用来源于两个不同iPSC系的iRPE对所有45种药物进行了后续筛选。后续筛选是在三种不同的A23187浓度(2.5、5、10mM)和范围为10nM-1mM的七种不同浓度的药物下进行的(图13的D-F)。只有两种药物(L,745,870和氨基己酸(ACA)；图5的E、F)在两个iRPE样品中表现出可重复的细胞保护活性，证实了在几个384孔泳道中初步观察到的假阳性效应(图13的G)。总体而言，HTS筛选提供了两种药物用于体外AMD模型中的测试。
实施例5-L456,780和氨基己酸揭示出iRPE细胞中CC-HS诱导的NF-κB激活和自噬抑制
根据七点剂量反应曲线(图5的D-F)，选择两种药物的IC50剂量(L456,780为6mM，且氨基己酸(ACA)为30mM)来共同治疗iRPE细胞与CC-HS。p65的免疫染色揭示出与CC-HS和媒介物(DMSO)共同处理的样品相比，与CC-HS和L745,870或CC-HS和氨基己酸共同处理的iRPE中的核定位减少(图6的A-E)。RNAseq进一步证实与CC-HS和DMSO共同处理的样品相比，iRPE与CC-HS和L,745,870或氨基己酸的共同处理逆转了由CC-HS处理诱导的基因表达变化(图13的H、I)，并降低了(高达16倍)NF-κB通路基因的表达(图13的I)。一致地，在CC-HS处理的iRPE中下调的自噬基因在与CC-HS和两种药物中的任何一种共同处理的iRPE中上调(图6的F-J；图13的J，如通过ATG5的免疫染色证实的(图6的F-J)，总体而言，这些结果表明，在HTS中发现的两种细胞保护药物都能够通过抑制NF-κB通路和上调自噬来逆转CC-HS治疗对iRPE细胞的影响。这促使我们进一步测试这些药物对RPE上皮表型、功能和AMD细胞内表型的影响。
实施例6-CC-HS处理的细胞中iRPE上皮表型的体外恢复和大鼠模型中iRPE上皮表型的体内恢复
在尸体眼中观察到的并且在体外模型中观察到的AMD细胞表型的关键标志是RPE下脂质和富含蛋白质的沉积物、玻璃疣标志物的表达增加以及上皮表型和RPE功能的丧失。与CC-HS处理的样品相比，用CC-HS和L745,870或ACA共同处理的iRPE的RPE脂质沉积水平降低了40％-60％，如通过尼罗红染色测量的(图7的A；CC-HS+媒介物相对于CC-HS+L,745,870,p<0.01；CC-HS+媒介物相对于CC-HS+ACA,p<0.01)，并且腓骨蛋白3的表达降低4倍(图7的B；CC-HS+媒介物相对于CC-HS+ACA,p<0.01)。对3000-13,000个RPE细胞的定量揭示，与CC-HS+媒介物处理相比，用CC-HS和L745,870共同处理的细胞具有的平均面积为162.24um2(p<0.01)，并且六边形得分为8.25(其中10代表完美的六边形，p<10-15)，并且用CC-HS和ACA处理的细胞具有的平均面积为106.72um2(p<10-15)，并且六边形得分为8.52(p<10-15)(图7的C、D)。仅用CC-HS加媒介物处理或用CC-HS和两种药物共同处理的iRPE的RNAseq获得了类似的结果。两种药物都能够抑制(4-10倍)CC-HS处理的iRPE细胞中去分化标志物的表达(图13的H)。
为了测试这些药物的体内活性，开发了RPE去分化大鼠模型。使用微脉冲激光损坏了0.5mm的大鼠RPE区域。激光照射区域中的RPE细胞被消融，导致激光损伤周围的细胞由于细胞间接触的丧失而发生去分化。这些细胞随着波形蛋白的无组织的更高细胞质表达而变大和拉长，类似于CC-HS处理的人类细胞。药物对大鼠RPE去分化的影响是通过在激光损伤时将两种药物中的任何一种注射到大鼠眼部的视网膜下空间中来测试的。对激光损伤周围400-4000个RPE细胞的定量揭示出(ACA＝397.53um2，L-745,870＝439.55um2，激光＝537.43um2)与激光RPE相比，L745,870(p<10-15)和ACA(p<10-15)注射的细胞中的面积小1-1.3倍(图7的E)。在CC-HS+L745、870治疗中，药物治疗还将六边形评分从激光损伤处理周围的细胞中的6.91提高到7.42到无药物注射处理到CC-HS+L745,870处理中的X(p<10-14)(图7的F)。这些体内实验证实了这两种药物恢复去分化RPE细胞上皮表型的能力。
最后，检查药物是否拯救了成熟的RPE表型和RPE功能。与用媒介物+CC-HS处理的样品相比，用药物和CC-HS共同处理的样品的TER高2-3x(p<10-15)，与CI-HS处理的细胞的TER值相似(图7的G)。类似地，与用CC-HS和媒介物处理的细胞相比，两种药物的添加部分拯救了(高达2x；p<10-15)RPE细胞吞噬光感受器外段的能力(图7的H)。总之，这些结果证实，药物L,745,870和氨基己酸逆转了在CC-HS处理的iRPE细胞中观察到的AMD细胞内表型，并恢复了RPE功能和上皮表型(图8)。体外和体内数据提供了足够的证据来支持这些药物的潜在用途，以延迟AMD疾病的发生并减缓其进展。
实施例7-L-ORD和AMD的机制及二甲双胍作为有效治疗的用途-
在本实验中，从患有迟发性视网膜变性的家庭成员及其未受影响的兄弟姐妹产生患者特异性iPSCs(诱导的多能干细胞)，并将其分化为RPE，以研究潜在的疾病机制。在基础条件下，患者和对照对象表现出相似的鹅卵石样形态，并具有相似的RPE特异性特征基因的表达模式，并且对RPE-65(一种成熟的RPE标记物)染色也呈阳性。通过证明患者-RPE改变了介导该疾病的两个关键特征的细胞功能，该模型被验证在体外准确地概括了人类疾病表型：1)APOE的基底沉积升高，这是玻璃疣的一种已证实的成分，以及2)血管内皮生长因子(VEGF)的顶端过度分泌，其是CNV形成的致病因素。研究了CTRP5突变和观察致病表型之间的关系。与文献中报道的相比之下，CTRP5在患者和未受影响的兄弟姐妹之间的表达和分泌水平相当。它在RPE上的受体被鉴定为脂联素受体1(AdipoR1)，并且不是MFRP或脂联素受体2。AMPK是细胞能量状态的传感器，监测ADP:ATP比率，并在磷酸化后被激活。患者RPE被证明在置于血清饥饿状态下时对能量状态的变化不敏感。另外，这种AMPK活性的降低导致富含omega-3脂质(DHA)的光感受器外段(POS)的利用率降低。这表现为DHA衍生的神经营养因子衍生的如神经保护素D1(NPD1)的分泌减少。在这项研究中，抗糖尿病药物二甲双胍通过使AMPK对细胞应激重新敏感(恢复能量稳态)、恢复POS利用率和重新极化APOE和VEGF的分泌物来拯救患者的RPE细胞。为了确定二甲双胍是否可能是一种有效的临床治疗，对同时用二甲双胍治疗糖尿病的AMD患者进行了回顾性队列研究，且发现二甲双胍在统计学上改善了临床结果并将发病年龄推迟了两年。综上所述，这些结果阐明了构成L-ORD和AMD基础的疾病机制，并证明二甲双胍的眼部递送对于目前没有治疗选择的“干性AMD”患者是一种有效的治疗方法。
L-ORD是一种罕见的遗传性致盲病症，通常在几十年内出现，且其特征是眼底中的微黄色点状沉积物和延迟的暗适应(夜盲症)。与年龄相关性黄斑变性(AMD)不同，光感受器变性从周边(视杆)发展，随后逐渐丧失中央视锥体视力，导致总视力丧失。OCT揭示出存在视网膜下沉积物以及RPE和Bruch膜之间的分离区域，表明RPE下沉积，表明观察到的视杆功能丧失可能继发于潜在RPE的功能障碍或死亡。与AMD相似，疾病的后期、晚期阶段通常以进展为脉络膜新生血管(CNV)为标志(Aye et al.,2010；Borooah et al.,2009；Cukras etal.,2016；Jacobson et al.,2014；Kuntz et al.,1996；Milam et al.,2000)。
iPSCs来源于采自两名患有迟发性视网膜变性(L-ORD)的患者和两名未受影响的兄弟姐妹的皮肤成纤维细胞。使用Cytotune iPS 2.0 sendai重编程试剂盒对成纤维细胞培养物进行重编程，每个供体产生2个克隆。所有iPSC系都具有典型的iPSC形态，表达多能性标志物：OCT4、NANOG、SOX2和SSEA4，并且核型正常。体外拟胚体(EB)测定证明了从所有三个发育胚层(外胚层、内胚层、中胚层)分化成细胞类型的能力。
8个iPSC-RPE系被视为两组：4个健康未受影响的兄弟姐妹和4个L-ORD患者iPSC-RPE。该分组考虑了供体(遗传)和克隆变异性以及分化和细胞培养条件固有的技术变异性。由于利用iPSCs建模迟发性神经退行性疾病通常被证明是困难的(Vera和Studer,2015)，这是由于重编程过程会重置生物钟，因此使用这种方法对数据进行分组和分析提供了一个框架，可以在多个患者和对照之间进行比较，以仅确定可直接归因于疾病表型的相关统计学显著差异(Schuster et al.,2015；Vitale et al.,2012)。
体外模型重复临床疾病表型
对iPSCs进行测序以验证患者系保留了S163R点突变(图14的a)。使用先前发布的方案，将iPSCs分化为RPE细胞(Sharma et al.,2019a)并接种到transwells上，在那里它们稳定表达成熟极化RPE的标记物(TYR、PAX6、MITF、RLBP1、DCT、CLDN19、GPNMB、ALDH1A3、BEST1、TYRP1和RPE65)(图14的b)。透射电子显微镜揭示出具有丰富的顶端突起的单一单层RPE细胞(黄色箭头)、顶端定位的黑素体(洋红色箭头)和基底定位的细胞核(白色箭头)(图14的c)。比较L-ORD患者和未受影响的兄弟姐妹的扫描电子图像显示，在transwells上生长的iPSC-RPE呈现经典的六边形或鹅卵石外观，但也揭示了RPE细胞大小和形状的地形差异，表明这种异质性是L-ORD患者RPE的一个特征(图14的d)。为了确定是否存在细胞大小分布的差异，对用外周膜蛋白(ZO-1或ADIPOR1)染色的iPSC-RPE进行定量图像分析以勾勒细胞边界。与未受影响的兄弟姐妹相比，发现L-ORD患者RPE中的细胞面积显著更大且变化更大(图14的e)。TER测量证实了正常RPE紧密连接的形成(图14的f)，并且没有揭示lord患者特异性iPSC-RPE和未受影响的健康兄弟姐妹之间的任何差异。形态学和表型变化通常与RPE去分化有关——上皮细胞失去其细胞极性和细胞粘附的过程。然而，在正常培养(非应激)条件下，L-ORD患者RPE中与去分化相关的基因表达模式与在未受影响的兄弟姐妹中观察到的相似(图14的g)。在相同条件下，将细胞裂解，并对已被证明与高密度脂蛋白(HDLs)相关并与脂质运输有关(Ishida et al.,2004)的基础基底载脂蛋白E(APOE)沉积物进行染色和分析，表明L-ORD患者相对于未受影响的兄弟姐妹的总体数量和分布略有不同(图14的h)。最后，L-ORD患者RPE表现出血管内皮生长因子(VEGF)的极化分泌丧失(图14的i)。特别地，与未受影响的兄弟姐妹(n＝3)相比，L-ORD患者RPE(n＝7)的基底VEGF分泌减少了约50％(p＝0.046)。总之，这些结果表明iPSC-RPE模型保留了与CTRP5中致病突变相关的表型变化。
CTRP5是RPE代谢的自分泌调节物
已知在L-ORD中具有S163R点突变的CTRP5蛋白由也编码膜卷曲相关蛋白(MFRP)的双顺反子基因产生。进行qRT-PCR以确定点突变是否改变了L-ORD患者中CTRP5或MFRP的mRNA表达。比较CTRP5和MFRP的ΔCt值在不同供体和克隆之间是相似的，表明在表达中没有患者特异性差异(图15的a)。有趣的是，CTRP5的蛋白质印迹表明L-ORD患者RPE的细胞裂解物中的蛋白质表达降低(图15的b)。图15的c通过光密度测定法定量L-ORD患者iPSC-RPE中的CTRP5蛋白水平并标准化为β-肌动蛋白，且表明表达下降7倍。CTRP5Elisa和WBs表明CTRP5是顶端分泌的(图15的d)。从基底室测得的CTRP5低于检测限(数据未显示)。为了确定CTRP5突变导致L-ORD疾病表型的机制，使用超分辨率显微镜鉴定了特定的配体-受体相互作用，以基于CTRP5与脂联素的同源性(Yamauchi et al.,2014；Yamauchi and Kadowaki,2013)及其报导的与膜卷曲相关蛋白(MFRP)的相互作用(Mandal et ak,2006；Shu et ak,2006)筛选推定的候选受体。免疫荧光共聚焦显微镜揭示了CTRP5(红色-配体)与脂联素受体1(ADIPOR1，绿色-受体)的共标记(图15的e)。培养的人iPSC-RPE的天然免疫金标记证实了CTRP5(12nm)和ADIPOR1(6nm)相互作用(图15的f)。图15的g显示了整合膜蛋白ADIPOR1(蓝色)及其与CTRP5(蓝绿色)相互作用的模型，考虑到3D结构约束以确定概率相互作用。如图15的g所示，与脂联素一样，CTRP5形成三聚体作为其基本结构单元，但也倾向于形成类似于花束状排列的更高阶结构(Tu和Palczewski,2012)。该模型用于模拟L-ORD中的S163R突变。带正电精氨酸的获得通过排斥ADIPOR1表面上类似带电的精氨酸而改变CTRP5与ADIPOR1的静电相互作用——削弱其与受体的结合亲和力(图15的h)。
CTRP5微调AMPK对细胞能量状态的敏感性
已知脂联素及其受体以AMP活化蛋白激酶(AMPK)依赖性机制调节脂质代谢。因此，以下实验旨在确定CTRP5中的突变是否改变了AMPK激活和调节能量稳态的信号传导通路。
在含血清培养基的基线处，与未受影响的兄弟姐妹相比，L-ORD患者iPSC-RPE的磷酸化-AMPK(p-AMPK)(AMPK活性的量度)的水平高出20％(p<0.05)(图16的a)。
因此，在图16的b中，在血清存在(+)和不存在(-)的情况下，将iPSC-RPE与重组CTRP5球状形式(0.2μg/mL gCTRP5)一起孵育30分钟，以评估其在AMPK信号传导中的作用。在含有血清的培养基中将gCTRP5添加到来自兄弟姐妹和患者的iPSC-RPE中不会改变AMPK活性。然而，在血清剥夺培养基中，添加gCTRP5导致未受影响的兄弟姐妹的p-AMPK水平降低20％，但在L-ORD患者中则没有(p<0.05)。这些数据提供了证据，即CTRP5作为代谢旋钮可微调AMPK水平以满足细胞的能量需求。
为了更好地阐明ADIPOR1-CTRP5(受体-配体)相互作用，通过外源添加增加浓度的重组全长CTRP5来执行rmed配体剂量反应曲线(在无血清培养基中)(图16的c)。在未受影响的兄弟姐妹中，CTRP5的剂量依赖性增加导致p-AMPK水平显著降低(在25μg/mL下降低～50％，p<0.05)，而在L-ORD患者中，添加CTRP5对AMPK活性无影响。这些发现表明，突变CTRP5与天然CTRP5结合并形成扰乱其正常生物活性的复合物(更高阶的结构)。
AMPK是细胞能量状态的敏感指标，并且典型地由AMP或ATP水平激活(Hardie和Lin,2017)。因此，表征了兄弟姐妹和患者iPSC-RPE在已知刺激AMPK磷酸化的条件(增加的AMP:ATP比率)下的AMPK活性(在无血清培养基中)(图16的d)。将iPSC-RPE在不含血清的培养基中孵育5小时(Park et al.,2009)，然后暴露于AICAR(AMP类似物)或BAM 15(线粒体解偶联剂以减少ATP产生)30分钟。正如预期的那样，在来源于未受影响的兄弟姐妹的iPSC-RPE中，AMP:ATP比率激活的AMPK增加。有趣的是，在相同的实验条件下，L-ORD患者iPSC-RPE无法感测AMP或ATP水平的变化。这些发现表明，无法感测AMP或ATP是L-ORD患者中AMPK激活不一致的关键机制，并且可能是治疗干预的新靶点。
脂联素还已知可以刺激神经酰胺酶活性以促进细胞存活(Kadowaki和Yamauchi,2011)。正如Lakkaraju博士的实验室所报道的，RPE顶端表面处的过量神经酰胺可能是导致细胞内补体(C3a)生成和RPE代谢的mTOR重编程的病理特征(Kaur et al.,2018)。与患者细胞中AMPK活化增加一致，与未受影响的兄弟姐妹相比，L-ORD患者iPSC-RPE中神经酰胺的免疫染色(正面图像)未揭示过多的神经酰胺，这意味着上述AMPK缺陷可能是L-ORD疾病发病机制的主要介质。
AMPK是多种代谢途径的中心调节剂，其可能导致L-ORD中观察到的疾病表型。AMPK相关基因的基因表达谱显示PNPLA2(PEDF-R)在L-ORD患者的iPSC-RPE中高度表达。有趣的是，据报道，p-AMPK水平升高会增加骨骼肌细胞中PEDF-R的表达(Wu et al.,2017)。免疫组织化学证实与未受影响的兄弟姐妹相比，L-ORD患者iPSC-RPE中PEDF-R(红色)的蛋白质表达增加(图16的f)。总的来说，这些结果表明，AMPK扰动的PEDF-R水平可能有助于(可以触发)L-ORD患者(人)RPE中与年龄相关的病理变化。
L-ORD中升高的AMPK破坏PEDF-R介导的视网膜神经保护
为了研究RPE病理如何发生，在PEDF-R介导的神经营养信号传导及其作为血管生成抑制剂的作用的背景下，对L-ORD患者和未受影响的兄弟姐妹进行了比较研究。图17的a展示了一个模型，通过该模型，CTRP5中的突变破坏了老化RPE中的正常稳态，导致脂质摄取和利用的不平衡。L-ORD患者iPSC-RPE表现出升高的吞噬能力，据报道这种现象在RPE细胞中可补偿氧化应激诱导的细胞凋亡(Mukherjee et al.,2007)。增加的脂质摄取需要增加磷脂酶A2的活性，以裂解磷脂，并产生充当生物活性化合物如DHA、类花生酸和神经保护D1(NPD1)的前体分子的游离脂肪酸。然而，在L-ORD患者iPSC-RPE中，基线AMPK水平升高会抑制磷脂酶-A2酶活性，从而阻碍这些神经保护因子的产生。在图17的b中，iPSC-RPE供给的phRodo标记的外段的FACS分析揭示，与未受影响的兄弟姐妹相比，L-ORD患者iPSC-RPE吞噬POS要多出1.5倍。尽管脂质摄入增加，但L-ORD患者iPSC-RPE基线处的磷脂酶a2活性降低了～40％，可能是由于AMPK活性增加(p<0.05，图17的c)。在iPSC-RPE中，磷脂酶A2的酶活性取决于pAMPK水平(图17的d)。WTiPSC-RPE中血清饥饿导致的pAMPK水平升高使磷脂酶A2活性降低～30％(p<0.05)，这与在L-ORD患者中观察到的情况相似。在RPE中，PEDF以极化方式分泌，主要是顶端(Maminishkis et al.,2006；Sonoda et al.,2009)。然而，L-ORD患者iPSC-RPE中PEDF分泌的PEDF比率(Ap/Ba)显著降低(图17的e)。总之，较低的PEDF-R酶活性与减少的顶端PEDF量一起导致线粒体功能(基底呼吸、质子泄漏、atp产生)显著降低和神经保护D1(NPD1)顶端分泌减少(p<0.05)。总的来说，这些结果证明了L-ORD患者脂质代谢的改变如何有助于减少PEDF介导的光感受器的神经保护。
二甲双胍使AMPK和病理表型重新敏感
越来越多的证据表明，脂质代谢紊乱是包括AMD在内的许多疾病的常见致病机制(Ban et al.,2018；Xu et al.,2018)。这些代谢缺陷与RPE细胞的长期健康有关。为了确定RPE细胞中PEDF-R缺乏的后果，对L-ORD iPSC-RPE和未受影响的兄弟姐妹进行7天的光感受器外段(POS)供给，以加剧高脂肪诱导的上皮损伤。同时，研究了二甲双胍——一种抗糖尿病药物(Schneider et a,1990)的降脂作用是否可以逆转RPE去分化和极性丧失。细胞大小是RPE极性的关键形态学指标，通过染色ZO-1(绿色)对其进行评估以识别细胞边界(图18的a)，并在REShAPE(一种基于云计算的细胞形态分析仪)中采用自动图像分析算法来进行RPE细胞的形态计量分析。
从POS供给的第一天开始，每天用3mM二甲双胍治疗患者iPSC-RPE(Fan et al.,2015；Kim et al.,2011)。即使与未供给的细胞相比，供给POS的患者iPSC-RPE也表现出增加的细胞大小和变异性。在人类AMD眼睛中也报道了类似的形态测量，这些眼睛也表现出强烈的空间不规则性(Rashid et al.,2016)。值得注意的是，二甲双胍治疗在很大程度上阻止了POS应激诱导的患者iPSC-RPE增大(p<2e-6)(图18的b)。图18的c显示，在类似POS供给的iPSC-RPE中，载脂蛋白E(APOE)的分布受到影响，载脂蛋白E(APOE)是极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)的主要成分。
在未受影响的兄弟姐妹中，APOE从RPE的顶端和基底表面分泌，但被发现主要在顶端(图18的c，上图)，其中它可能在脂质运输中发挥作用(Ishida et al.,2004)。相比之下，L-ORD患者iPSC-RPE的APOE水平出现升高。白色箭头表示APOE沉积物的基底增加，这让人想起AMD中富含APOE的玻璃疣沉积物(Johnson et al.,2011)。用二甲双胍治疗的患者RPE改善了含有APOE的基底沉积物的积累(黄色箭头)。将Image J用于在顶端和基底APOE阳性染色周围绘制一个矩形目标区域，以量化局部平均综合强度，且数据总结在图18的d中。
在图18的e中，将L-ORD患者iPSC-RPE用二甲双胍预处理(11/2周)导致对AICAR(AMP类似物)的敏感性恢复。这一结果表明二甲双胍恢复了正常的能量稳态，并可能具有临床价值。
7天的POS供给也改变了L-ORD患者iPSC-RPE中85个EMT相关基因的表达谱(图18的g)。与未受影响的兄弟姐妹相比，L-ORD患者iPSC-RPE上调了54个与上皮-间质转化相关的基因(例如ESR1、WNT5a、PDGFRB、GNG11、TMEFF1、BMP7和RAC1)>4倍(白色)。相比之下，用二甲双胍治疗的L-ORD患者(洋红色)iPSC-RPE下调了42个EMT<4倍的基因(例如SPF、DSC2、COL3A1、VSP13A、CAMK2N、TGFB1、BMP1)。总之，这些数据表明L-ORD患者iPSC-RPE 1)易受脂质应激诱导的上皮间质转化影响，和2)二甲双胍可以使AMPK重新敏感，从而减轻细胞大小、APOE沉积、VEGF分泌和基因表达的病理变化。
另外，伴随衰老的低氧微环境已显示出类似地改变脂质代谢(Kurihara et a,2016)。采用缺氧应激(3％O2，6h)来确定这种扰动如何调节L-ORD患者iPSC-RPE中的VEGF分泌。与常氧条件相似，L-ORD患者表现出错误极化的VEGF分泌，其中顶端分泌水平升高，这是去分化(EMT)的指标。用二甲双胍治疗24小时不足以拯救这种表型(数据未显示)，表明二甲双胍主要通过改变基因表达发挥其作用(图18的e)。为支持这一假设，用二甲双胍预处理11/2周可减轻缺氧诱导的顶端VEGF分泌(p＝0.005)并恢复VEGF极性(图18的f)。
为了确定是否有临床证据表明二甲双胍可能有益于AMD的治疗，对就诊于KaiserPermanante Medical的AMD患者进行了回顾性队列研究，以测试个体同时使用二甲双胍是否会影响诊断。对于属于50-59岁年龄组的个体，通常被认为是早发性(Schick et al.,2015)，本研究揭示二甲双胍显著延迟了2整年的发病年龄(p＝0.001)。
总的来说，这些结果表明二甲双胍或AMPK致敏药物可以恢复RPE表型，并成为干性AMD的潜在治疗方法。
实施例8-对来自迟发性视网膜变性患者的iPSC-RPE的分析确定了AMPK在调节健康RPE表型中的作用，并导致重新利用二甲双胍(已知的2型糖尿病药物)，以用于AMD和其他视网膜退行性疾病的潜在治疗。
迟发性视网膜变性(L-ORD)是一种罕见的遗传性单基因视网膜营养不良，其与更常见的视网膜变性具有许多相同的临床表型，如年龄相关性黄斑变性(AMD)(可在病症晚期发展的玻璃疣样沉积物、脉络膜新生血管形成)。
L-ORD的基础是CTRP5中的突变，其在结构上与脂联素相似，脂联素是一种已知的脂肪因子，是葡萄糖和脂质代谢的重要调节因子——改变的代谢与多种形式的视网膜变性有关。
迟发性视网膜变性或L-ORD通常在40岁之后呈现与AMD相似的病理学。L-ORD患者具有延迟的暗适应，这表明光感受器和视觉周期存在问题。此外，它们有玻璃疣样沉积物，在FAF上显示为高荧光沉积物。最后，他们破坏了在OCT中看到的内部和外部感光器部分。
L-ORD是由CTRP5中的一个错义突变引起的，CTRP5是一种在RPE中高度表达的脂联素旁系同源物。CTRP5的球状结构域与脂联素有40％的同源性，表明可能在细胞代谢中发挥作用。
细胞代谢的一个关键读出是AMPK，它是一种关键能量传感器，可监测ATP/AMP的比率，并在营养缺乏期间被磷酸化(激活)。发明人假设由于患者具有过度活跃的pAMPK水平(数据未显示)，细胞将变得对ATP和AMP的变化不敏感。在血清饥饿(3h)的条件下，与L-ORD患者和未受影响的兄弟姐妹中的基线相比，pAMPK水平升高。
添加AICAR(30分钟)(AMP类似物)，会刺激未受影响的兄弟姐妹中AMPK的进一步磷酸化，但在L-ORD患者中则不会。添加BAM15(30min)(抑制ATP产生的线粒体解偶联剂)也进一步刺激未受影响的兄弟姐妹中AMPK的磷酸化，但在L-ORD患者中则不会。实际上，L-ORD患者在血清饥饿条件下对ATP或AMP的变化不敏感。二甲双胍治疗包括将3mM二甲双胍添加到顶端和基底培养基中，持续11/2-2周。用二甲双胍治疗的L-ORD患者在血清饥饿后恢复了对AICAR的敏感性。
通过基因表达进一步评估了L-ORD患者中AMPK信号传导通路的改变，揭示了许多相关基因的代偿性下调。用二甲双胍(3mM)治疗11/2-2周会导致一些基因进一步减少，但在其他基因种会上调。特别地，PNPLA2(PEDF-R)显著增加。在RPE中，PEDF-R在脂肪酸代谢中起重要作用。
在图19中，显示L-ORD患者的基因表达谱表明在基线下限制pAMPK激活的补偿性尝试。
未受影响的兄弟姐妹(N＝8)，来自N＝2名供体
(2个来自24G，2个来自Z8，2个来自Y9，2个来自9i)
LORD-患者(N＝7)，来自N＝2名供体
(3个来自供体E1，4个来自供体K8)
二甲双胍患者(N＝4)，来自N＝2名供体
RPE细胞因子的极化分泌是其成熟和分化状态的标志。在促进上皮-间充质转化(EMT)的条件下，RPE会失去其形态，并且其分泌变得错误极化。RPE的去分化是视网膜变性如AMD中经常提出的机制。通常，VEGF主要由RPE基底分泌。在L-ORD患者中，如通过ELISA评估的，VEGF分泌的极性丧失。相比之下，用二甲双胍(3mM)治疗11/2-2周导致拯救极化的VEGF分泌，这表明二甲双胍可能介导EMT抑制。这显示在图19中。
未治疗的：
未受影响的兄弟姐妹
顶端N＝7
基底N＝3
L-ORD患者
顶端N＝7
基底N＝3
图20表明B-hB是由RPE产生的，RPE利用来源于吞噬的光感受器外段的脂肪酸(其中棕榈酸酯是主要成分)，并通过称为脂肪酸氧化的过程产生自我维持的代谢物，从而为视网膜节省葡萄糖。发明人假设增加脂肪酸氧化和酮体形成(B-hB)可能导致视网膜下空间中脂质积累减少。二甲双胍治疗导致L-ORD患者RPE的顶端B-hB分泌显著增加25％。
二甲双胍治疗包括将3mM二甲双胍添加到顶端和基底培养基中，持续11/2-2周。
每个条形图代表从2名不同供体(未受影响的兄弟姐妹或患者)汇编的N＝12个生物学重复。*表示p值<0.05。
实施例9-二甲双胍延迟视网膜退行性疾病的中位发病年龄
药物二甲双胍(品牌名称：Fortamet、Gluophage、Glumetza、Riomet)被广泛用于治疗2型糖尿病(T2D)。基于多年在美国和欧洲市场的使用，二甲双胍的安全性已得到广泛认可。二甲双胍因其对降低糖尿病患者血糖的有效作用，于1958年由Aron实验室的子公司Rona在英国首次上市，后来发现它可以激活AMP激活的蛋白激酶AMPK酶以使细胞代谢和血糖水平正常化。
为了确定是否有临床证据表明二甲双胍可能有益于AMD的治疗，对就诊于KaiserPermanante Medical的AMD患者进行了回顾性队列研究，以测试个体同时使用二甲双胍是否会影响诊断。对于属于50-59岁年龄组的个体，通常被认为是早发型(Schick et a,2015)，这项研究揭示二甲双胍显著延迟了2整岁的发病年龄(p＝0.001)。本研究结果如图14至图18所示。
图14的a至图14的i描绘了表明患者特异性iPSC-RPE保留了致病突变的各种测试数据。a)Sanger测序分析证实了来源于L-ORD患者的iPSCs中存在S163R突变。序列显示在顶部，且受突变影响的碱基在序列色谱图上用黑色箭头表示。杂合点突变(AGC->AGC,AGG)表现为峰中峰。用于DNA sanger测序的引物在方法中进行了描述。b)所示RPE特征基因的ΔCt值的箱线图。每个框代表从来自至少2个不同的未受影响的兄弟姐妹或L-ORD患者供体的n＝3个iPSC-RPE测量的ΔCt的分布。箱的底部和顶部定义了第10和第90个百分位数。箱内的条带定义了中值。c)连续7天供给光感受器外段的iPSC-RPE单层的透射电子显微镜图像。iPSC-RPE的TEM来源于未受影响的兄弟姐妹(上图)和患者(下图)，显示了正常的RPE形态和高度极化的结构，包括丰富的顶端突起(黄色箭头)、黑素体(洋红色箭头)和位于基底的细胞核(白色箭头)。比例尺：2μm。d)来源于未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的SEM图像，显示了保留的六边形形态和丰富的顶端突起。e)来源于未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE细胞面积的箱线图。用膜标记(ADIPOR1)对iPSC-RPE单层进行免疫染色，以勾勒出它们的六边形形状，用于细胞形态的多参数分析。L-ORD患者iPSC-RPE的平均大小倾向于更大(107.7+/-68.5μm2)，并且与未受影响的兄弟姐妹(79.8+/-57.5μm2)相比变化更大(p＝0.000026)。在人类AMD供体的眼睛中也报告了类似的空间不规则性(Rashid,A.et al.RPE Cell and Sheet Properties in Normal and Diseased Eyes.Adv Exp MedBiol 854,757-763,(2016))。f)通过使用EVOM上皮伏欧计(World PrecisionsInstruments)的跨上皮电阻测量来测量iPSC-RPE细胞之间的功能性紧密连接的建立。与疾病相关的错义突变不会改变RPE单层的跨上皮电阻。g)富含经历去分化(上皮-间充质转化)的RPE细胞的基因散点图揭示在正常条件下，L-ORD患者细胞不显示指示患病或受压RPE的异常表型。未供给(以灰色显示)患者iPSC-RPEs中去分化(EMT)相关基因的表达类似于未供给的未受影响的兄弟姐妹的表达模式。h)来源于未受影响的兄弟姐妹的iPSC-RPE和在正常培养条件下的L-ORD患者显示相似的APOE基底沉积物水平。比例尺：50μm。i)通过ELISA测量常氧条件下iPSC-RPE释放到上清液中的VEGF。RPE的高度极化结构负责包括VEGF在内的蛋白质的载体转运和分泌。天然情况下，来源于未受影响的兄弟姐妹(以灰色显示)的iPSC-RPE以极化方式，主要是基底分泌VEGF。L-ORD患者来源的iPSC-RPE表现出极性丧失，基底VEGF分泌减少约～53.3％(P＝0.046)。
图15的a至图15的h描绘了证明CTRP5在L-ORD患者来源的RPE中的表达和定位的各种测试数据。a)在L-ORD中，S163R突变发生在编码CTRP5(一种分泌蛋白)和膜卷曲相关蛋白(MFRP)的双顺反子转录物中。该突变不会改变任一转录物的mRNA表达。b)来自未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的细胞裂解物的代表性western印迹。由于CTRP5是一种分泌蛋白，未受影响的兄弟姐妹中的25kDa强条带(CTRP5)可能表明CTRP5在整个细胞提取物中保留程度更高。c)标准化为β-肌动蛋白的western印迹(细胞裂解物)的定量(p<0.05)。d)48小时后在来自未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE中CTRP5被选择性分泌到顶侧，如通过ELISA测量的。在未受影响的兄弟姐妹和患者的分泌量之间没有观察到可测量的差异。在基础培养基中检测到可忽略不计量的CTRP5(数据未显示)。e)来自未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的免疫荧光染色的Airyscan共聚焦显微镜图像。膜受体ADIPOR1(以绿色显示)与CTRP5(以红色显示)、HOESCHT(以蓝色显示的核染色)共定位。f)天然免疫标记的ADIPOR1(6nm免疫金)和CTRP5(12nm免疫金)的TEM图像提供了受体-配体相互作用(用黑色箭头表示)的证据。g)使用已发表的晶体结构的ADIPOR1(以蓝色显示)和CTRP5(以绿色显示)之间的蛋白质间相互作用的3-D模型。h)丝氨酸(极性)到精氨酸(+)突变改变了残基的电荷，使其带正电。预计这种正电荷会排斥相邻的精氨酸残基并导致构象变化，从而降低突变CTRP5与ADIPOR1的结合亲和力。
图16的a至图16的f描绘了表明CTRP5对ADIPOR1的拮抗降低导致L-ORD中的AMPK信号传导改变的各种测试数据。a)通过ELISA测定的磷酸-AMPK水平表明，与未受影响的兄弟姐妹(N＝21；100％±0.04)相比，于含5％血清的培养基中培养的L-ORD患者iPSC-RPE(N＝15；(120.6％±0.075)中的基线活性增加了约20.6％。b)在存在和不存在含有脂联素的血清的情况下，重组球状CTRP5对磷酸-AMPK水平的影响。数据被标准化为未处理条件(0ug/mLgCTRP5)。在未受影响的兄弟姐妹中，在不存在天然配体脂联素的情况下(在0％血清条件下)添加0.2mg/mL重组球状CTRP5揭示pAMPK水平降低20％(N＝9；0.81±0.04)。这种显著下降被基线条件下5％血清的存在所掩盖(N＝6；0.99±0.01)。在L-ORD患者iPSC-RPE中，添加0.2μg/mL重组球状CTRP5对p-AMPK水平没有可测量的影响(N＝6；1.12±0.09)，即使在没有血清的情况下(N＝6；0.98±01)。c)重组全长CTRP5对iPSC-RPE来源的p-AMPK水平的剂量反应效应。在未受影响的兄弟姐妹(5h 0％血清)中，AMPK的磷酸化水平在治疗(30min)后随着重组全长CTRP5浓度的增加而降低。25ug/mL CTRP5导致p-AMPK水平降低～50％(N＝6,47.89％-±0.13)。接受相似浓度的全长CTRP5的患者RPE在p-AMPK水平上没有引起可测量的变化。d)相比不受影响的兄弟姐妹，在不存在血清下升高AMP:ATP比率的条件导致来源于iPSC-RPE患者p-AMPK水平的变化。所有数据均标准化为含0％血清的条件。用2mM AICAR(一种AMP类似物)或500nM BAM15(一种减少ATP产生的线粒体解偶联剂)处理30min，导致未受影响的兄弟姐妹的AMPK水平进一步升高。相比之下，患者RPE的p-AMPK水平对AMP或ATP水平的变化不敏感。然而，用3mM二甲双胍治疗两周可恢复L-ORD患者对AMP:ATP比率变化的敏感性。e)L-ORD患者来源的iPSC-RPE中升高的AMPK导致PEDF-R的mRNA表达显著上调(～8倍)。f)免疫组织化学证实L-ORD患者iPSC-RPE中定位于顶端膜的PEDF-R蛋白表达升高。
图17的a至图17的f描绘了表明L-ORD患者中改变的脂质代谢有助于减少神经保护信号传导的各种测试数据。a)描绘富含脂质的外段的吞噬摄取和它们被磷脂酶消化成RPE用于酮生成和神经保护性脂质介质如NPD1的合成的游离脂肪酸的假定模型。在人类癌细胞系中，升高的p-AMPK水平已被证明可抑制磷脂酶D活性(Mukhopadhyay,S.etal.Reciprocal regulation of AMP-activated protein kinase and phospholipaseD.J Biol Chem 290,6986-6993,doi:10.1074/jbc.Ml 14.622571(2015))，并且是提出的机制，通过该机制增加L-ORD患者的脂质摄取导致DHA来源的神经保护素D1的利用和合成减少以及未消化脂质的积累。b)通过FACS量化ph-Rhodo标记的外段的摄取，以比较来源于未受影响的兄弟姐妹和L-ORD患者的iPSC-RPE的吞噬率。L-ORD患者iPSC-RPE(N＝14；11.81±3.55)的吞噬细胞摄取比未受影响的兄弟姐妹(N＝15；7.86±3.94)高33％。这种脂质摄取增加的现象已在RPE中被报道为对氧化应激的保护性反应。(Mukherjee,P.K.etal.Photoreceptor external segment phagocytosis attenuates oxidative stress-induced Apoptosis with concomitantneuroprotectin D1synthesis.Proc Natl AcadSci U S A 104,13158-13163,(2007))。d)尽管总体PEDF-R表达显著增加，但通过ELISA测量L-ORD患者磷脂酶A2活性比未受影响的兄弟姐妹低40％。e)在pAMPK水平升高(n＝6，通过血清饥饿诱导)的正常iPSC-RPE(n＝6)中，显示磷脂酶A2活性显著降低(～26％)(p<0.05)。f)通过ELISA测定PEDF的极化分泌。L-ORD患者(N＝12)表现出顶端PEDF分泌减少(患者：939.6ng/mL/兄弟姐妹：1277.22ng/mL)和基底分泌增加(患者：92.16ng/mL/兄弟姐妹：75.96ng/mL)，导致与未受影响的兄弟姐妹(N＝12,19.82±3.67)相比，PEDF比率(Ap/Ba)(10.13±1.63)显著降低(p＝0.0014)。数据为平均值±SE，代表3次独立实验的平均值。*表示p<0.05。f)通过串联质谱脂质组学分析测量顶端分泌的DHA来源的神经保护D1。未受影响的兄弟姐妹(Z8,9i)分泌的NPD1大约是L-ORD患者(K8,E1)的～10倍(p＝0.0089)。
图18的a至图18的h描绘了证明L-ORD患者RPE对上皮-间充质转化的易感性增加的各种测试数据。显示连续7天供给光感受器外段后iPSC-RPE的膜标记ZO-1(以绿色显示)的免疫荧光染色的代表性图像。所有图像均使用63x物镜获得。比例尺＝20μm。b)对(a)中所述条件下获得的图像进行形状测量分析，以构建细胞面积分布的箱线图(下须线：5％的数据，下枢纽：25％的数据，中线：中值，上枢纽：75％的数据，上须线：95％的数据)。与未受影响的兄弟姐妹(N＝5,95.77±1.68μm)相比，L-ORD患者iPSC-RPE(N＝6张图像，135.37±1.76μm)具有增加的细胞大小和变异性(p<2E-16)。在未受影响的兄弟姐妹中，与未治疗的未受影响的兄弟姐妹相比，在光感受器供给期间开始的二甲双胍治疗对细胞面积(N＝7,93.14±1.56μm)的影响最小(p＝0.52)。然而，与未治疗的患者相比，3mM二甲双胍治疗导致患者细胞面积(N＝7,117.92±0.96μm)显著减少(p<2E-16)。进行Dunnett多重比较检验以与未治疗的未受影响的兄弟姐妹或L-ORD患者进行比较。c)在7天POS供给后APOE染色的iPSC-RPE单层冷冻切片的免疫荧光显微镜图像。L-ORD患者iPSC-RPE表现出顶端和基底APOE沉积的相对比例改变(白色箭头)。在POS供给期间用二甲双胍治疗的L-ORD患者导致顶端和基底APOE沉积(黄色箭头)的相对比例重新分布，类似于未受影响的兄弟姐妹。d)图像的APOE信号的综合密度的图像量化，类似于c)中所示的那些。相比未治疗的兄弟姐妹(N＝4；顶端：30.89±12.05；基底：8.45±3.09)，未治疗的L-ORD患者(N＝5；顶端：185.69±5.42；基底：46.38±2.51)的APOE信号的综合密度显著更高(顶端：p＝7.76E-6；基底：p＝2.71E-5)。二甲双胍治疗的L-ORD患者(N＝4；顶端：79.30±37.51；基底：13.58±4.58)相比二甲双胍治疗的未受影响的兄弟姐妹(N＝8；顶端：119.98±20.36；基底：23.55±6.17)之间无显著差异(顶端：p＝0.32；基底：p＝0.32)。所有图像以20x拍摄。比例尺＝50μm。f)在模拟脉络膜血流减少的缺氧条件下(6h)，VEGF分泌的ELISA测量与年龄相关性黄斑变性的病理生理学有关(Mukherjee,P.K.et al.Photoreceptor outer segment phagocytosis attenuatesoxidative stress-induced apoptosis with concomitant neuroprotectinD1synthesis.Proc Natl Acad Sci U S A 104,13158-13163,(2007))，并用作代谢压力源以确定L-ORD iPSC-RPE对低氧驱动的EMT的易感性。与图1i)所示的常氧条件相似，L-ORD患者iPSC-RPE(N＝10；Ap:1.89±0.30；Ba:1.8±0.24)与未受影响的兄弟姐妹(N＝9；Ap:0.78±0.16；Ba:1.59±0.36)相比以非极化的方式分泌VEGF(Ap:p＝0.005；Ba:p＝0.63)。用二甲双胍预先治疗(2周)可保护L-ORD患者RPE(N＝6；Ap:0.59±0.09；Ba:1.8±0.24)免受低氧驱动的EMT的影响，并恢复与未治疗或二甲双胍治疗的未受影响的兄弟姐妹(N＝9；Ap:0.98+0.16；Ba:1.64±0.33)相似的顶端/基底VEGF极性(Ap:p＝0.09；Ba:p＝0.64)。g)与未受影响的兄弟姐妹相比，POS供给对L-ORD患者iPSC-RPE中去分化(EMT)相关基因表达的影响。与未受影响的兄弟姐妹相比，7天POS供给(以白色显示)导致L-ORD患者中EMT相关基因的表达增加。在7天POS供给期间二甲双胍治疗(以红色显示)抑制EMT相关基因的表达。h)来自回顾性临床研究结果的表揭示二甲双胍可延缓非渗出性年龄相关性黄斑变性的发病年龄(362.51/H35.31)。在50-59岁的患者中，二甲双胍可将发病年龄从56岁(n＝157，无二甲双胍)延迟至58.5岁(n＝16，有二甲双胍)(p＝0.001)。
实施例10-改善和维持RPE病症中的视网膜色素上皮(RPE)健康表型的新疗法。
进行siRNA筛选以鉴定维持iPSC-RPE上皮表型所需的候选基因和途径；使用报告基因诱导的多能干(iPS)细胞系，该细胞系在分化为RPE时表达GFP。通过这种方法，可以识别出NOX4。NOX4是一种NADPH氧化酶，其抑制作用强烈促进受损RPE细胞的上皮表型
视网膜损伤诱导RPE-EMT，其特征在于RPE的去分化、增殖和迁移。图22A和图22B显示模型中的机械损伤能够模拟体内RPE-EMT的特征；并且在机械损伤后，RPE细胞经历EMT，显示了EMT的特征形态和标志物。
NOX4是一种NADPH酶，且其主要作用是产生活性氧物质(ROS)。NOX4在损伤的RPE中高度表达。图23A显示Nox4存在于完整的RPE中，并在损伤的RPE中高度表达。而且，在图23B中，通过使用氧化时变为荧光的核染料，与完整的RPE相比，损伤的RPE产生了增加水平的ROS。
图24显示NOX4与称为EMT标记、波形蛋白和平滑肌肌动蛋白(SMA)的细胞骨架蛋白共定位，NOX4与EMT标记的关联表明NOX4在EMT中的作用。
图25显示使用VAS2870对NOX4的药理学抑制下调SMA——一种EMT标志物。
图26A至图26C显示通过使用shRNA敲低NOX4并证实NOX4成功下调。
图27显示使用shRNA下调NOX4减少了受损RPE中的细胞迁移。NOX4的下调下调了ZEB 1(一种EMT标记)，如图28A至图28C所示。
图29A和图29B显示NOX4shRNA慢病毒颗粒成功下调划痕RPE中的巢蛋白
通过对NOX4进行药理抑制，证实了对Nox4的抑制有效地下调了EMT标志物的表达，如图30A和图30B所示。
作为该实验的结果，表明NOX4是一种新的靶基因，其表达调节人视网膜色素上皮(RPE)的上皮表型。调节NOX4活性的药理抑制剂可用作治疗RPE病症的治疗方法，如增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、年龄相关和遗传性视网膜变性和癌症。
实施例11-二甲双胍治疗改善Stargardt病
Stargardt病是一种罕见的遗传性视网膜变性，在美国影响～30,000人，目前尚无治疗方法。萎缩的视网膜色素上皮(RPE)诱导的进行性光感受器(PR)细胞死亡导致患者视力丧失。在病因学上，Stargardt与AMD相似。这两种疾病都表现出RPE下和RPE内沉积和RPE萎缩。但Stargadrt是一种单基因疾病，不像AMD是一种多基因疾病。Stargardt主要由ABCA4基因突变引起，后者是ABCA1的直系同源物，ABCA1是RPE中已知的一种胆固醇转运蛋白[Briggs,C.E.,et al.,Mutations in ABCR(ABCA4)in patients with Stargardtmacular degeneration or cone-rod degeneration.Investigative ophthalmology&visual science,2001.42(10):2229-2236页；R Sparrrow,J.,D.Hicks,和C.P Hamel,Theretinal pigment epithelium in health and disease.Current molecular medicine,2010.10(9):802-823页]。视觉需要RPE和PR细胞之间的功能相互作用；因此，在许多情况下，萎缩的RPE会迅速导致PR变性和失明[R Sparrrow,J.,D.Hicks,和C.P Hamel,Theretinal pigment epithelium in health and disease.Current molecular medicine,2010.10(9):802-823页]。RPE顶端表面蛋白是介导RPE-PR功能相互作用所必需的。将细胞表面捕获技术(CSC)用于选择性识别极化的RPE单层的顶端和基底表面蛋白质组。CSC帮助鉴定了RPE膜上数种以前未报道的蛋白质，包括ABCA4，主要存在于RPE细胞的顶侧上[Khristov,V.,et al.,Polarized Human Retinal Pigment Epithelium ExhibitsDistinct Surface Proteome on Apical and Basal Plasma Membranes,in TheSurfaceome.2018,Springer 223-247页]。RPE细胞膜上的ABCA4表达通过Western印迹确认(图31的A)，并利用免疫染色确认其顶端定位，如(图31的B、C)所示。这一结果挑战了目前ABCA4仅在PRs中表达的教条，并且在患者中看到的RPE萎缩完全是由于RPE细胞吞噬了由于ABCA4突变而积聚在POS中的有毒物质[Molday,R.S.,M.Zhong,和F.Quazi,The role ofthe photoreceptor ABC transporter ABCA4 in lipid transport and Stargardtmacular degeneration.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular and CellBiology of Lipids,2009；1791(7):573-583页,Maugeri,A.,et al.,Mutations in theABCA4(ABCR)gene are the major cause of autosomal recessive cone-roddystrophy.The American Journal of Human Genetics,2000.67(4):960-966页]。
为了阐明ABCA4在RPE和疾病发病机制中的作用，开发了ABCA4功能完全丧失的wStargardt iPSC来源的RPE(iRPE)作为体外疾病模型(图32)。我们成功地生成了两个ABCA4-/-iPSC系并衍生出完全成熟的RPE细胞(ABCA4-/-C1和ABCA4-/-C2；图32)。通过qRTPCR、ddPCR和Western印迹证实ABCA4敲出(图32的A、B)。另外，还衍生了Stargardt患者iPSC系并分化为成熟的RPE细胞。Sanger测序证实在患者-iRPE中存在突变(外显子44中6088bp位置处的C>T)(图32的C)。ddPCR和Western印迹分析证实突变造成患者-iRPE中突变ABCA4mRNA的无义mRNA衰变(图32的D-E)。在分子(图32的J-O)、结构(图32的F-I)和功能验证方面，患者和ABCA4-/-iRPE的行为类似于对照iRPE单层(对照1-ABCA4-/-C1&C2的等基因对照，对照2-患者iRPE的未受影响的兄弟姐妹)(图32的F-O)，表明由于ABCA4功能丧失，RPE没有发育缺陷。
这些结果促使发明人研究ABCA4在成熟iRPE单层中的作用。假设ABCA4突变导致RPE中的细胞自主功能缺陷。为了检验这一假设，将Stargardt iRPE(ABCA4-/-克隆和患者)用野生型POS治疗6天，并评估了细胞内和RPE下脂质沉积物(疾病表型之一)的积累。使用BODIPY染色(脂质染料，BODIPY505/515)分析细胞内/细胞下脂质沉积表明野生型POS处理的Stargardt RPE中脂质积累增加了2-3倍(比较图33的A-C与D-F，G中的量化)，支持Stargardt iRPE细胞中细胞自主缺陷的假设。为了研究这些细胞自主缺陷是否因补体信号传导失调而增强，因为已知视觉周期的有毒副产物(A2E和脂褐质)的积累会造成补体信号传导诱导的炎症，将Stargardt iRPE用活化的人血清(CC-HS)或灭活的人血清(CI-HS)治疗[Lenis,T.L.,et al.,Complement modulation in the retinal pigment epitheliumrescues photoreceptor degeneration in a mouse model of Stargardtdisease.Proceedings of the National Academy of Sciences,2017.114(15):3987-3992页]。与之前的报告一致，CC-HS的48小时处理引发Stargardt iRPE相对于对照细胞中的细胞内和细胞下脂质沉积增加(2-3倍)(图33的G，比较CC-HS相对于CI-HS)。
在有色Abca4-/-小鼠模型中，脂褐质积累导致RPE顶侧的神经酰胺增加，诱导早期内体(EE)生物发生和融合，并增加C3a，从而激活雷帕霉素的机械靶点(mTOR)，mTOR是自噬的一种主要调节剂[Kaur,G.,et al.,Aberrant early endosome biogenesis mediatescomplement activation in the retinal pigment epithelium in models of maculardegeneration.Proceedings of the National Academy of Sciences,2018.115(36):9014-9019页]。如在Abca4-/-小鼠模型中所见，当暴露于POS方案和CC-HS治疗时，观察到Stargardt iRPE中顶端神经酰胺积累增加4-5倍。总体而言，这项工作表明ABCA4KO和患者iRPE细胞代表了Stargardt病的生理相关体外疾病模型，并且ABCA4功能丧失触发RPE细胞中的细胞自主疾病表型。为了进一步了解疾病发病机制中ABCA4驱动的机制，本实施例重点关注ABCA1(ABCA4同源物)参与胆固醇转运。两种蛋白质之间64.5％的氨基酸同源性表明ABCA4也可能参与胆固醇和脂质止血[Quazi,F.和R.S.Molday,Differentialphospholipid substrates and directional transport by ATP-binding cassetteproteins ABCA1,ABCA7,and ABCA4 and disease-causing mutants.Journal ofBiological Chemistry,2013.288(48):34414-34426页,Tanaka,A.R.,et al.,HumanABCA1 contains a large amino-terminal extracellular domain homologous to anepitope of Sjogren's Syndrome.Biochemical and biophysical researchcommunications,2001.283(5):1019-1025页,Storti,F.,et al.,Impaired ABC A1/ABCG1-mediated lipid efflux in the mouse retinal pigment epithelium(RPE)leadsto retinal degeneration.Elife,2019.8:e45100页]。为了确定两种ABCA蛋白是否通过脂质处理途径起作用，观察了调节ABCA1表达对改变Stargardt RPE细胞中疾病表型的影响。对ABCA4iRPE细胞中的ABCA1进行shRNA敲低，并用CC-HS处理细胞。如通过BODIPY染色所见，ABCA1KD加剧了ABCA4RPE细胞中的脂质沉积(图34的A-G)。相比之下，通过使用GW3965(ABCA1激活剂)的ABCA1过度激活来拯救Stargardt RPE细胞中的脂质积累缺陷(图34的H-N)。
脂褐质是一种淡黄色的富含脂质的沉积物，可能由未消化的细胞脂质和视觉周期代谢物形成，是Stargardt患者眼睛的特征。脂褐质积累与RPE功能障碍及其萎缩有关[Sparrow,J.R.,et al.,A2E,afluorophore of RPE lipofuscin:can it cause RPEdegeneration？,Retinal Degenerations.2003,Springer 205-211页；Sparrow,J.R.和M.Boulton,RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology.Experimentaleye research,2005.80(5):595-606页]。这些结果导致假设药物降低RPE中的脂褐质积累率或增加RPE中的脂褐质清除率——它可能延缓与这种疾病相关的RPE和视网膜变性[Issa,P.C.,et al.,Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout micethrough inhibition of vitamin A dimerization.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2015.112(27):8415-8420页；Tanna,P.,et al.,Stargardtdisease:clinical features,molecular genetics,animal models and therapeuticoptions.British Journal of Ophthalmology,2017.101(1):25-30页]。基于收集到的数据，推测降脂药物盐酸二甲双胍可以作为ABCA4患者的潜在治疗干预措施。二甲双胍是一种临床批准的2型糖尿病药物，其通过激活AMPK途径而增强细胞脂质代谢，并经由内体Na+/H+交换剂和V-ATP酶通过降低溶酶体pH来增加溶酶体活性[Zhang,C.-S.,et al.,Metforminactivates AMPK through the lysosomal pathway.Cell metabolism,2016.24(4):521-522页；Feng,Y.,et al.,Metformin promotes autophagy and apoptosis in esophagealsquamous cell carcinoma by downregulating Stat3 signaling.Cell death&disease,2014.5(2):el088-el088页；Wang,N.,et al.,Metformin improves lipid metabolismdisorders through reducing the expression of microsomal triglyceride transferprotein in OLETF rats.Diabetes research and clinical practice,2016.122:170-178页；Wang,Y.,et al.,Metformin induces autophagy and G0/G1phase cell cyclearrest in myeloma by targeting the AMPKJmTORCl and mTORC2pathways.Journal ofExperimental&Clinical Cancer Research,2018.37(1):63页；Anurag,P.和C.Anuradha,Metformin improves lipid metabolism and attenuates lipid peroxidation in highfructose-fed rats.Diabetes,Obesity and Metabolism,2002.4(1):36-42页；Kim,J.和Y.J.You,Regulation of organelle function by metformin.IUBMB life,2017.69(7):459-469页]。预计这些作用机制将使Stargardt RPE细胞能够更有效地管理脂褐质清除。提出了一项临床试验以测试二甲双胍改善Stargardt患者疾病表型的能力，并发现其在Stargardt小鼠和iRPE模型中的作用机制。这种方法的重要性依赖于以前被低估的ABCA4在RPE细胞中的作用。值得注意的是，在不使用Stargardt POS的情况下，在ABCA4突变iRPE中概括Stargardt病表型的能力表明这些细胞中存在细胞自主脂质代谢缺陷。ABCA4在RPE脂质代谢中的这种细胞自主作用的丧失有助于Stargardt病的病理学，并且该途径活性的改善可能会改变疾病进程。
Stargardt iRPE细胞中的POS消化缺陷。Stargardt iRPE细胞中脂质和神经酰胺积累增加表明潜在的溶酶体缺陷和消化POS的能力降低，这可能导致RPE萎缩并随着时间的推移引发光感受器变性[Carr,A.-J.,et al.,Molecular characterization andfunctional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPEcells using a novel human retinal assay.Molecular vision,2009.15:283页]。为了确定Stargardt iRPE在POS消化中是否有缺陷，将ABCA4突变体和对照iRPE细胞用pHRhodo染料(仅在溶酶体内发出荧光)标记的野生型POS(10/RPE细胞)供给4小时。染料标记有助于区分POS摄取(在POS供给4小时后测量)和消化率(在POS供给24小时后测量)。StargardtiRPE细胞显示出与对照细胞相似的POS摄取能力(4h时间点)(图35的A)。然而，与对照细胞相比，在Stargardt iRPE(图35的B)中观察到消化率降低50％-70％(24h时间点)。这些结果表明iRPE细胞中的ABCA4突变造成内溶酶体功能障碍，可能导致脂质代谢缺陷和细胞功能障碍。
二甲双胍处理改善了Stargardt IRPE中的脂质沉积。Stargardt iRPE细胞消化野生型POS的能力降低表明内溶酶体功能障碍是患病细胞脂质稳态缺陷的核心。二甲双胍改善了溶酶体功能和脂质代谢[Wang,N.,et al.,Metformin improves lipid metabolismdisorders through reducing the expression of microsomal triglyceride transferprotein in OLETF rats.Diabetes research and clinical practice,2016.122:170-178页,Anurag,P.和C.Anuradha,Metformin improves lipid metabolism andattenuates lipid peroxidation in high fructose-fed rats.Diabetes,Obesity andMetabolism,2002.4(1):36-42页；Kim,J.和Y.J.You,Regulation of organelle functionby metformin.IUBMB life,2017.69(7):459-469页]。据推测，二甲双胍治疗将改善Stargardt iRPE细胞中的溶酶体活性和脂质代谢，从而减少神经酰胺和脂质积累以改善疾病表型。为了评估二甲双胍在体外系统中的治疗效果，将Stargardt和健康细胞在RPE培养基+媒介物或含有3mM二甲双胍的RPE培养基中用野生型POS(10POS/细胞)连续处理6天。与媒介物处理的Stargardt iRPE相比，二甲双胍处理显著降低了(3-4倍)POS供给的Stargardt iRPE中的神经酰胺水平(图36的A)。为了将二甲双胍转化为Stargardt病的潜在治疗方法，在Abca4-/-小鼠模型中对其进行了测试，该模型概括了Stargardt视网膜病变的表型，包括神经酰胺和富含脂质的RPE下沉积物[Kaur,G.,et al.,Aberrant earlyendosome biogenesis mediates complement activation in the retinal pigmentepithelium in models of macular degeneration.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2018.115(36):9014-9019页,Issa,P.C.,et al.,Fundusautofluorescence in the Abca4-/-mouse model of Stargardt disease—correlationwith accumulation of A2E,retinal function,and histology.Investigativeophthalmology&visual science,2013.54(8):5602-5612页]。小鼠接受400或800mg/天的口服二甲双胍剂量3个月——与人类剂量相当。这些剂量不会导致治疗小鼠出现低血糖。从治疗动物收集的眼睛的质谱分析显示，二甲双胍iRPE/脉络膜、视网膜和血浆的量相当，表明药物到达了靶组织(数据未显示)。我们来自经治疗的Abca4-/-小鼠的RPE/脉络膜平装的数据显示二甲双胍治疗显著降低了Abca4-/-小鼠中的脂质水平(图36的B-C)。这些结果证实了二甲双胍作为Stargardt和AMD患者的潜在治疗方法的假设。
实施例12-玻璃体内注射、筋膜下注射、视网膜下注射和局部眼部治疗方法改善AMD和Stargardt病
为了确认治疗效果，使用多种施用方法重复实施例1-11的治疗。特别地，使用玻璃体内注射、筋膜下注射、视网膜下注射和局部眼部施用方法重复实施例1-11的治疗。这些另外施用的结果证明了使用这些施用方法的治疗效果。
通过引用并入本文
本文引用的所有专利、公开的专利申请和其他参考文献的全部内容均在此通过引用明确地整体并入本文中。
等效物
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的具体实施方案和方法的许多等效物。这样的等效物旨在包含在所附权利要求的范围内。
应当理解，本文描述的详细实例和实施方案仅出于说明目的以实例的方式给出，并且不以任何方式被认为是对本公开的限制。鉴于其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员并且包括在本申请的精神和范围内，并且被认为在所附权利要求的范围内。例如，可以改变成分的相对量以优化所需的效果，可以添加另外的成分，和/或类似的成分可以替代一种或多种所述的成分。与本公开的系统、方法和过程相关联的另外的有利特征和功能将从所附权利要求中显而易见。此外，本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本公开的特定实施方案的许多等效物。这些等效物旨在被以下权利要求所涵盖。

Claims (52)

1.治疗视网膜疾病的方法，包括向有需要的患者施用药学有效量的化合物，或其药学上可接受的盐，所述化合物或其盐抑制Nox4或活性氧物质形成，或调节丝氨酸蛋白酶、多巴胺受体、NF-κB、mTOR、AMPK、RPE上皮-间充质转化、RPE去分化、或一种或多种Rho GTP酶。
2.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述视网膜疾病是黄斑或周边视网膜变性、地图状萎缩、脉络膜新生血管、视网膜色素上皮细胞萎缩、黄斑营养不良、Stargardt病、Stargardt样病、Best病、卵黄状黄斑营养不良、成人型卵黄状营养不良、视网膜色素变性、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜脱离、病理性近视、糖尿病性视网膜病变、CMV视网膜炎、阻塞性视网膜血管病、早产儿视网膜病变(ROP)、脉络膜破裂、眼组织胞质菌病综合征(POHS)、弓形虫病或Leber先天性黑蒙。
3.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物是Nox4抑制剂或活性氧物质形成的抑制剂。
4.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物调节NF-κB、mTOR、或一种或多种Rho GTP酶。
5.如权利要求4所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物调节一种或多种RhoGTP酶，其中所述Rho GTP酶是CDC42和/或RACl。
6.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物抑制丝氨酸蛋白酶。
7.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物调节AMPK。
8.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物调节多巴胺受体。
9.如权利要求8所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述调节多巴胺受体的化合物是多巴胺受体D4拮抗剂。
10.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物调节RPE上皮-间充质转化或RPE去分化。
11.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物是氨基己酸、L-701,324、Vas2870、L-745,870盐酸盐、Me-3,4-dephostatin、N-甲基-l-脱氧野尻霉素、L-750,667三盐酸盐、(+)-MK-801氢马来酸盐、酒石酸五甲哌啶、(-)-萘普生钠、雷洛昔芬盐酸盐、SKF 83959氢溴酸盐、L-687,384盐酸盐、7,7-二甲基-(5Z,8Z)-二十碳二烯酸、SP-600125、Ro 41-0960、安西他滨盐酸盐、利培酮、替仑西平二盐酸盐、NO-711盐酸盐、U-99194A马来酸盐、S(+)-雷氯必利L-酒石酸盐、哌仑西平二盐酸盐、卡托普利、硫丙咪胺马来酸盐、阿普洛尔盐酸盐、利托君盐酸盐、腐胺二盐酸盐、l-(2-甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐、PAPP、U-69593、AG-1478、利鲁唑、甲磺酸酚妥拉明、DBO-83、福美司坦、卡马西平、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐、硫酸特布他林、UK 14304、GR 113808、来氟米特、氯化乙酰硫代胆碱、亚精胺、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、ATPO、Acadenisine或二甲双胍，或者以上的组合。
12.如权利要求11所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物是氨基己酸；Vas2870、L-745,870；利鲁唑；Acadenisine；二甲双胍或者以上的药学上可接受的盐。
13.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物以药物组合物的形式施用，其中所述药物组合物包括所述化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
14.治疗视网膜变性的方法，包括向有需要的患者施用药学有效量的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物或其盐抑制Nox4或活性氧物质形成，或调节丝氨酸蛋白酶、多巴胺受体、NF-κB、mTOR、或一种或多种Rho GTP酶。
15.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物是Nox4抑制剂或活性氧物质形成的抑制剂。
16.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物调节NF-κB、mTOR、或一种或多种Rho GTP酶。
17.如权利要求16所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物调节一种或多种RhoGTP酶，其中所述Rho GTP酶是CDC42和/或RAC1。
18.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物抑制丝氨酸蛋白酶。
19.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物调节多巴胺受体。
20.如权利要求19所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述调节多巴胺受体的化合物是多巴胺受体D4拮抗剂。
21.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物调节AMPK。
22.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物调节RPE上皮-间充质转化或RPE去分化。
23.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物是氨基己酸、L-701,324、Vas2870、L-745,870盐酸盐、Me-3,4-dephostatin、N-甲基-l-脱氧野尻霉素、L-750,667三盐酸盐、(+)-MK-801氢马来酸盐、酒石酸五甲哌啶、(-)-萘普生钠、雷洛昔芬盐酸盐、SKF 83959氢溴酸盐、L-687,384盐酸盐、7,7-二甲基-(5Z,8Z)-二十碳二烯酸、SP-600125、Ro 41-0960、安西他滨盐酸盐、利培酮、替仑西平二盐酸盐、NO-711盐酸盐、U-99194A马来酸盐、S(+)-雷氯必利L-酒石酸盐、哌仑西平二盐酸盐、卡托普利、硫丙咪胺马来酸盐、阿普洛尔盐酸盐、利托君盐酸盐、腐胺二盐酸盐、l-(2-甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐、PAPP、U-69593、AG-1478、利鲁唑、甲磺酸酚妥拉明、DBO-83、福美司坦、卡马西平、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐、硫酸特布他林、UK 14304、GR 113808、来氟米特、氯化乙酰硫代胆碱、亚精胺、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、ATPO、Acadenisine或二甲双胍，或者以上的组合。
24.如权利要求23所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物是氨基己酸、Vas2870、L-745,870、利鲁唑、Acadenisine、二甲双胍或者以上的药学上可接受的盐。
25.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物以药物组合物的形式施用，其中所述药物组合物包含所述化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
26.恢复视网膜色素上皮细胞变性的方法，包括向有需要的患者施用药学有效量的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物或其盐抑制Nox4或活性氧物质形成，或调节丝氨酸蛋白酶、多巴胺受体、NF-κB、mTOR、或一种或多种Rho GTP酶。
27.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物是Nox4抑制剂或活性氧物质形成的抑制剂。
28.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物调节NF-κB、mTOR或一种或多种Rho GTP酶。
29.如权利要求28所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物调节一种或多种Rho GTP酶，其中所述Rho GTP酶是CDC42和/或RAC1。
30.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物抑制丝氨酸蛋白酶。
31.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物调节多巴胺受体。
32.如权利要求31所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述调节多巴胺受体的化合物是多巴胺受体D4拮抗剂。
33.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物调节AMPK。
34.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物调节RPE上皮-间充质转化或RPE去分化。
35.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物是氨基己酸、L-701,324、Vas2870、L-745,870盐酸盐、Me-3,4-dephostatin、N-甲基-1-脱氧野尻霉素、L-750,667三盐酸盐、(+)-MK-801氢马来酸盐、酒石酸五甲哌啶、(-)-萘普生钠、雷洛昔芬盐酸盐、SKF 83959氢溴酸盐、L-687,384盐酸盐、7,7-二甲基-(5Z,8Z)-二十碳二烯酸、SP-600125、Ro 41-0960、安西他滨盐酸盐、利培酮、替仑西平二盐酸盐、NO-711盐酸盐、U-99194A马来酸盐、S(+)-雷氯必利L-酒石酸盐、哌仑西平二盐酸盐、卡托普利、硫丙咪胺马来酸盐、阿普洛尔盐酸盐、利托君盐酸盐、腐胺二盐酸盐、l-(2-甲氧基苯基)哌嗪盐酸盐、PAPP、U-69593、AG-1478、利鲁唑、甲磺酸酚妥拉明、DBO-83、福美司坦、卡马西平、4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐、硫酸特布他林、UK 14304、GR 113808、来氟米特、氯化乙酰硫代胆碱、亚精胺、5-(N-甲基-N-异丁基)阿米洛利、ATPO、Acadenisine或二甲双胍，或者以上的组合。
36.如权利要求35所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物是氨基己酸、Vas2870、L-745,870、利鲁唑、Acadenisine、二甲双胍或者以上的药学上可接受的盐。
37.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞的方法，其中所述化合物以药物组合物的形式施用，其中所述药物组合物包括所述化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
38.治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法，包括向有需要的患者施用药学有效量的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是氨基己酸、Vas2870、L-745,870、利鲁唑、Acadenisine或二甲双胍。
39.如权利要求38所述的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法，其中所述化合物是二甲双胍或其药学上可接受的盐。
40.如权利要求38所述的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法，其中所述化合物以药物组合物的形式施用，其中所述药物组合物包含所述化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
41.如权利要求38所述的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法，其中所述化合物经局部施用至所述对象的眼睛。
42.如权利要求40所述的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法，其中所述组合物经局部施用至所述对象的眼睛。
43.如权利要求38所述的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法，其中所述化合物通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至所述对象。
44.如权利要求40所述的治疗Stargardt病或Stargardt样病的方法，其中所述组合物通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至所述对象。
45.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物经局部施用至所述对象的眼睛。
46.如权利要求13所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述组合物经局部施用至所述对象的眼睛。
47.如权利要求1所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至所述对象。
48.如权利要求13所述的治疗视网膜疾病的方法，其中所述化合物通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至所述对象。
49.如权利要求14所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述化合物经局部施用至所述对象的眼睛，或者其中所述化合物通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至所述对象。
50.如权利要求25所述的治疗视网膜变性的方法，其中所述组合物经局部施用至所述对象的眼睛，或者其中所述组合物通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至所述对象。
51.如权利要求26所述的恢复视网膜色素上皮细胞变性的方法，其中所述化合物经局部施用至所述对象的眼睛，或者其中所述化合物通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至所述对象。
52.如权利要求37所述的恢复视网膜色素上皮细胞变性的方法，其中所述组合物经局部施用至所述对象的眼睛，或者其中所述组合物通过玻璃体内注射、筋膜下注射或视网膜下注射施用至所述对象。
CN202080075532.5A 2019-09-13 2020-09-11 用以治疗视网膜变性的可药化靶标 Pending CN114650813A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962899899P 2019-09-13 2019-09-13
US62/899,899 2019-09-13
PCT/US2020/050540 WO2021050980A1 (en) 2019-09-13 2020-09-11 Druggable target to treat retinal degeneration

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114650813A true CN114650813A (zh) 2022-06-21

Family

ID=72644998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080075532.5A Pending CN114650813A (zh) 2019-09-13 2020-09-11 用以治疗视网膜变性的可药化靶标

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220339127A1 (zh)
EP (1) EP4027985A1 (zh)
JP (1) JP2022548071A (zh)
KR (1) KR20220070232A (zh)
CN (1) CN114650813A (zh)
AU (1) AU2020346064A1 (zh)
BR (1) BR112022004515A2 (zh)
CA (1) CA3151011A1 (zh)
MX (1) MX2022003027A (zh)
WO (1) WO2021050980A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022023956A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 The Joan and Irwin Jacobs Technion-Cornell Institute System and method for on-phase microscopy
KR102629963B1 (ko) * 2021-09-23 2024-01-29 순천향대학교 산학협력단 mTOR 활성화제를 포함하는 안질환 치료용 조성물 및 이의 용도
CN114099683B (zh) * 2021-12-28 2022-12-16 首都医科大学附属北京同仁医院 Nox2特异性抑制剂在制备视网膜变性药物中的应用
WO2023201312A2 (en) * 2022-04-14 2023-10-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of treating ocular fibrotic pathologies
CN115068456A (zh) * 2022-05-18 2022-09-20 中山大学中山眼科中心 二甲双胍在制备预防、治疗眼部疾病的药物中的用途及其剂型和制备方法
WO2023229993A1 (en) * 2022-05-25 2023-11-30 Curative Biotechnology, Inc. Ophthalmic formulation capable of delivering metformin to choroid rpe and retina
KR20230169735A (ko) 2022-06-09 2023-12-18 에스케이온 주식회사 배터리용 볼트 및 배터리 모듈

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006122249A2 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Bausch & Lomb Incorporated Use of plasmin for preventing of reducing the rate of the progression of non-proliferative diabetic retinopathy and the treatment of other ocular conditions
US20170042926A1 (en) * 2014-01-02 2017-02-16 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Treating ocular neovascularization

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006122249A2 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Bausch & Lomb Incorporated Use of plasmin for preventing of reducing the rate of the progression of non-proliferative diabetic retinopathy and the treatment of other ocular conditions
US20170042926A1 (en) * 2014-01-02 2017-02-16 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Treating ocular neovascularization

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMILY E. BROWN等: "The Common Antidiabetic Drug Metformin Reduces Odds of Developing Age-Related Macular Degeneration", 《IOVS.ARVOJOURNALS.ORG》, vol. 60, no. 5, pages 1470 - 1477 *
XU, LEI等: "Stimulation of AMPK prevents degeneration of photoreceptors and the retinal pigment epithelium", 《PNAS》, vol. 115, no. 41, pages 10475 - 10480 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3151011A1 (en) 2021-03-18
US20220339127A1 (en) 2022-10-27
KR20220070232A (ko) 2022-05-30
WO2021050980A1 (en) 2021-03-18
AU2020346064A1 (en) 2022-04-14
BR112022004515A2 (pt) 2022-05-31
EP4027985A1 (en) 2022-07-20
MX2022003027A (es) 2022-06-14
JP2022548071A (ja) 2022-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114650813A (zh) 用以治疗视网膜变性的可药化靶标
US20200289607A1 (en) Compositions and methods of treatment of corneal endothelium disorders
Santin et al. Oxidative stress by monoamine oxidase-A impairs transcription factor EB activation and autophagosome clearance, leading to cardiomyocyte necrosis and heart failure
Pflugfelder et al. Matrix metalloproteinase-9 knockout confers resistance to corneal epithelial barrier disruption in experimental dry eye
US20230338343A9 (en) Novel anti-aging agents and methods to identify them
US10888556B2 (en) Method for treating myopia with an nsaid and an anti-muscarinic agent
Gamberi et al. Activation of autophagy by globular adiponectin is required for muscle differentiation
Yu et al. Subcellular distribution and activity of mechanistic target of rapamycin in aged retinal pigment epithelium
RU2647438C2 (ru) Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей
Huang et al. AZD6738 decreases intraocular pressure and inhibits fibrotic response in trabecular meshwork through CHK1/P53 pathway
CN110099688A (zh) 骨骼肌肥大诱导物
DurCristiano Glaucoma: biological mechanism and its clinical translation
WO2015138391A1 (en) Methods of treating glaucoma using amp-activated protein kinase (ampk) activators
US11717513B2 (en) Mirabegron for the treatment of retinal diseases
WO2014028886A1 (en) Nutlin-3a for treatment of proliferative vitreoretinopathy
AU2013204219B2 (en) Novel anti-aging agents and methods to identify them
US20240082221A1 (en) Compositions and methods for the identification of compounds that protect against lipofuscin cytotoxicity
US20230381186A1 (en) Compounds and Methods for Treating or Preventing Anterior Segment Ocular Disorders and/or Retinal Degenerations
Modaresinejad et al. Endoplasmic reticulum stress delays choroid development in the HCAR1 knock-out mouse
CN111939163A (zh) 葛杜宁在制备预防和治疗亨廷顿病药物中的用途
AU2018357829A1 (en) Peptide-based proteasome inhibitors for treating conditions mediated by senescent cells and for treating cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination