KR20220065615A - 메틸린더론(methyllinderone)을 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메틸린더론(methyllinderone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물 및 건강기능식품 조성물; 및 이를 이용한 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 메틸린더론은 사이토카인(IL-6, IL-8)의 발현억제 및 NF-κB 전사 발현 억제를 통한 염증을 억제할 뿐만 아니라, 염증성 세포의 생성 및 침윤 억제, 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 생성 억제, 활성산소와 엘라스테이즈 저해 효과, Th2관련 사이토카인 IL-5 및 IL-13의 생성 억제, IgE 항체 생성 억제, 점액질 생성 억제 및 기도과민성 감소 효과가 우수한 바, 현재 사용되는 치료제의 부작용을 극복하고, 독성이 없으면서 치료효과가 탁월한 화합물로서 호흡기 질환의 예방, 치료 및 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

메틸린더론(methyllinderone)을 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising the methyllinderone for preventing or treating the respiratory disease}

본 발명은 메틸린더론(methyllinderone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물 및 건강기능식품 조성물; 및 이를 이용한 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstruction Pulmonary Disease, COPD)은 기침, 객담, 호흡 곤란, 호기 유속의 감소, 가스 교환의 장애 등 비가역적 기도 폐쇄를 보이는 만성 기도 질환으로서, 해마다 전세계적으로 그 발병 인구가 증가하고 있으며, 2020년에는 인류의 사망원인 중 3번째 원인이 될 것으로 예측된 바 있다(Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187:347-365; Am J Respir Crit Care Med, 2009, 180:396-406). 현재 COPD는 전 세계적으로 4번째 사망 원인이며 유병률과 사망률은 여전히 증가하고 있다. 과거 COPD를 만성기관지염과 폐기종으로 구분하였으나, 만성기관지염은 임상증상을 기준으로 정의되고 폐기종은 해부학적 기준에 의하여 구분되어, 같은 환자에서 두 가지를 동시에 가지고 있는 경우가 많고, 임상적으로 구분이 어렵기 때문에 COPD로 총괄하여 진단하고 있다(Eur Respir J, 2007, 30:993-1013; Respirology 1997, 2 Suppl 1:S1-4). 기관지 천식의 경우에도 천식의 지속 기간이 오래되어 기도 폐쇄가 비가역적 변화를 나타낸 경우에는 COPD에 포함시켜 이에 준하여 치료한다(Eur Respir J, 2007, 30:993-1013; Respirology 1997, 2 Suppl 1:S1-4). 질병이 진행됨에 따라 COPD 환자는 주로 호흡기 박테리아 및 바이러스 감염으로 인해 더욱 악화가 되기 때문에 환경에 취약할 수 밖에 없다.

COPD의 발병은 병리생리학적으로 기도의 벽을 두껍게 하고, 섬유화시키는 것을 특징으로 하는 기도 질환(또는 만성기관지염)이 있으며, 이는 염증 반응으로 이어진다. 염증 반응은 선천성 면역 세포(호중구, 대식세포)와 적응성 면역세포 (T 및 B 림프구)와 관련이 있지만, 기도 상피 세포를 포함한 구조 세포의 활성화도 포함한다. 흡입된 담배 연기는 NF-κB 경로 및 MAPKs 경로를 포함하는 전염증 경로의 활성화를 통해 폐 염증을 유도한다. 이러한 염증 세포들은 TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18 등의 다양한 염증성 사이토카인 및 조직 손상을 야기하는 여러 단백분해효소들을 생성한다(대한결핵 및 호흡기학회 호흡기학 서울: 군자출판사: 2007, p 301-5; Am J Respir Crit Care Med, 1997 155, 1441-1447; Am J Physiol Lung CellMol Physiol, 2010, 298:L262-L269). 담배 연기와 염증 세포로 인한 산화 스트레스는 COPD의 염증을 더욱 증폭시킨다(Kirkham and Barnes, 2013).

천식은 Th2 cytokines 생성, 호산구 침윤 및 점액 과분비로 기도과민성(AHR) 과호흡곤란을 일으키는 염증성 기도 폐쇄 질환이다. 이 질병은 보통 천명, 기침 및 호흡 곤란을 나타내며 알레르겐은 천식의 주요 원인으로 알려져 있다. 면역계의 활성화 및 조절 (Th2 면역 반응)을 조절하는 유전적 및 환경적인 요소는 천식의 병리 생리학의 주요한 요인이다. 이러한 천식은 전 세계 3억 5천 5백만 이상의 사람들에게 영향을 미치며 이 환자들은 대개 치료 과정에 어려움을 겪고 있다(Athari SS., 2019). 대부분의 천식은 알레르기성이며, 만성 기도염증(Chronic airway inflammation)과 기도 과민반응성(bronchial hyperresponsiveness)이 특징이다(Minoguchi K and Adachi M., 1999).

천식은 Th2(T helper 2)타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-5, 13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화되어 기도 및 기도 주변 조직으로 이동, 침윤하기 때문에 만성 염증질환으로도 인식되고 있다(Elias JA, et al., 2003). 천식을 앓고 있는 환자의 기관지에서 활성화된 호산구, 비만세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포는 다양한 염증매개인자들(시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비하면서 강력한 기관지 수축 작용에 관여한다(Maggi E., 1998; Pawankar R., 2001; Barnes PJ, et al., 1998).

천식 증상이 있는 경우, 기도 내에 CD4+ T 세포가 조절되고, 원인 알레르겐에 노출되었을 경우, Th2 면역반응은 증가되고 Th1 면역 반응은 억제되며 호산구의 침윤을 특징으로 하는 기도 염증이 일어난다. 그러므로 기관지 점막과 주변에 호산구, 단핵구 및 림프구 등의 다양한 염증세포가 침윤되며, 이들로부터 분비되는 IL-5, IL-13 등의 사이토카인이 증가한다.

이와 관련하여, 현재 사용되는 천식 치료 방법으로는 천식의 발병 기전을 응용한 기관지 확장제, 류코트리엔 개질제, 비만 세포 안정제 및 흡입용 글루코코르티코스테로이드(ICS) 등이 사용되고 있다. 그러나, 많은 환자들은 상술한 통상적인 약물에 대하여 부작용을 나타내고 있으며, 특히 다량의 ICS를 장기간 투여하면 전신 부작용이 유발될 수 있음이 보고되었다.

따라서, 장기적으로 안전하고 효과적인 치료법을 찾기 위해 천연물을 이용한 천식 치료제의 개발이 활발히 이루어지고 있으며, 예로서 회양목 추출물을 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물(한국 등록특허 제10-1715154호), 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환에 효과적인 포도근 추출물을 포함하는 조성물(한국 공개특허 제10-2009-0103239호) 등이 개발된 바 있다.

현재 COPD, 천식 등 질환의 진단, 경과 등을 보기 위한 수단으로 기관지폐포세척술(bronchoalveolar lavage: BAL)이 이용되는데, 이들 환자의 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid: BALF) 내에는 염증성 사이토카인, 활성 산소종, 류코트리엔, 활성화 보체 등 염증 매개 물질들이 증가하고, 정상 폐에서 5% 미만을 차지하는 호중구가 전체 세포의 80%를 차지할 정도로 증가한다(Am J Respir Crit Care Med 154(1): 76-81, 1996). 따라서, 효과가 뛰어나고 부작용이 적은 치료제의 개발이 절실히 필요하다. 또한 증상을 완화하는 대중요법의 한계를 극복하기 위하여 천식 및 COPD의 발병원인 및 기전에 입각한 치료제가 필요한 실정이다.

한편, 메틸린더론은 비목나무(Lindera erythrocarpa) 식물의 단일 물질로서 상기 유효성분을 포함하는 천식 및 COPD 치료제에 대한 내용이 개시되거나 교시된 문헌은 없었다.

이에 본 발명자들은, 인체에 부작용을 유발하지 않으면서 천식 및 COPD 질환 치료에 유용한 천연물질을 찾고자 노력한 결과, 비목나무의 메틸린더론(methyllinderone)을 획득하여 독성을 나타내지 않는 범위에서 그 활성에 대하여 연구하였으며, 천식 및 COPD를 억제하는 효과를 발견하여 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성시켰다.

본 발명의 목적은 메틸린더론(methyllinderone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 인간을 제외한 호흡기 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메틸린더론 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서는, 메틸린더론의 염증관련 사이토카인(IL-6, IL-8)의 발현 억제, NF-κB 전사활성의 억제, 점액질 생성억제, 기도과민성 경감 효과, 기관지 내 염증성 세포의 생성 억제 및 침윤 억제 효과, IgE 항체 생성 억제, Th2관련 사이토카인(IL-5, IL-13)의 발현 억제 효과를 확인하여, 메틸린더론이 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 용어, “메틸린더론(methyllinderone)”은 화학식 C₁₇H₁₆O₅을 갖는 분자량 300.310 g·mol^-1의 화합물로서, IUPAC 명칭으로 4,5-dimethoxy-2-[(2E)-1-methoxy-3-phenylprop-2-enylidene]cyclopent-4-ene-1,3-dione라고도 불린다.

본 발명의 메틸린더론은 비목나무(Lindera lucida)에서 분리된 활성물질로서, 하기의 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이의 이성체 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것일 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 조성물에 대하여 세포수준에서 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8의 생성억제 효과 및 NF-κB 전사활성 억제 효과를 통한 염증억제 효과를 확인하였으며(도 1 내지 3), COPD 마우스 모델에서 염증성 세포의 생성 및 침윤 억제, 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-6 생성 억제, 활성산소와 엘라스테이즈 저해 효과를 확인하였다 (도 4 내지 7). 또한 천식 마우스 모델에서 염증성 세포의 생성 및 침윤 억제, Th2관련 사이토카인 IL-5와 IL-13의 생성 억제, IgE 항체 생성 억제, 점액질 생성 억제 및 기도과민성 감소 효과를 확인하였다(도 8 내지 13).

본 발명의 메틸린더론은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염을 사용할 수 있다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 메틸린더론을 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속 염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다. 또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 메틸린더론 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 입체이성질체 등을 모두 포함한다.

본 발명의 용어, “호흡기 질환(respiratory disease)”이란 주로 폐 및 기도와 관련된 질환으로, 염증성 호흡기 질환을 의미할 수 있으며, 구체적으로 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstruction Pulmonary Disease, COPD)”이란 주로 흡연과 같이 유해입자나 가스의 흡입으로 인해 폐에 염증반응이 일어나고 이로 인해 비가역적으로 기도가 폐색되어 폐 기능이 서서히 저하되는 질환으로, 폐기종(Emphysema)과 만성 기관지염(Chronic bronchitis)을 통칭하여 만성폐쇄성 폐질환이라고 한다. 증상으로는 기침, 객담, 호흡 곤란, 호기 유속의 감소, 가스 교환의 장애 등 비가역적 기도 폐쇄를 보이는 특징이 있다.

본 발명의 일 구체예에서는 메틸린더론을 유효성분으로 포함하는 조성물의 COPD 마우스 모델에서 기관지 내 염증성 세포인 호중구(neutrophil) 또는 대식세포(macrophage)의 생성 억제효과 및 염증성 세포의 침윤 억제 효과를 확인할 수 있었으며, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다. 또한, 활성산소 및 엘레스테이즈 저해활성 효과를 확인함으로써 만성폐쇄성폐질환의 예방 또는 치료용도로 사용 가능함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 용어, “천식(asthma)”이란 은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 보다 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 바람직하게는 기관지성 천식일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서는 천식 마우스 모델에서 점액질 생성억제, 기도과민성 경감 효과, 기관지 내 염증성 세포인 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil), 대식세포(macrophage) 또는 림프구(lymphocyte)의 생성 억제효과 및 이러한 염증성 세포의 침윤 억제 효과를 확인할 수 있었으며, IgE 항체 생성 억제, Th2관련 사이토카인(IL-5, IL-13)의 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다. 또한, A549 세포에서의 세포생존율, IL-6 및 IL-8의 사이토카인 억제효과, NF-κB 전사인자 저해활성 효과를 확인할 수 있었다.

따라서, 상기의 결과들로서 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 천식의 예방 또는 치료용도로 사용 가능함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 호흡기 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "예방"은 상기 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 호흡기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있으며, 상기 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제 등이 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 또는 좌제 등이 사용될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

이때, 상기 호흡기 질환, 예방 및 치료는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 상기 약학 조성물을 도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어, "개체"는 호흡기 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 예방 또는 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 약학 조성물 은 일반적으로 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 메틸린더론, 호흡기 질환, 약학적으로 허용가능한 염, 예방은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어, "개선"은 본 발명의 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.

본 발명에서 상기 의약외품 조성물은 호흡기 질환의 예방 또는 개선 효과를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 바람직하게는 경구의 제형일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 구체적으로, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.

또 다른 하나의 양태는 메틸린더론 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이때, 상기 메틸린더론, 호흡기 질환, 개선 및 예방의 정의는 전술한 바와 같다.

상기 식품 조성물은 메틸린더론 뿐만 아니라 이의 식품학적으로 허용가능한 염의 형태로 포함될 수 있으며, 상기 염은 당업계에서 통상적으로 사용되는 형태일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하며, 일반약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있으므로, 호흡기 질환의 예방 또는 개선 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강기능(성)식품(health functional food)은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다.

여기서 '기능(성)'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용될 수 있다.

구체적으로, 상기 건강기능식품은 메틸린더론을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품으로 인정되는 제형이면 다양한 형태의 제형으로 제한 없이 제조될 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별하고 적절한 양으로 사용할 수 있다.

본 발명의 메틸린더론은 사이토카인(IL-6, IL-8)의 발현억제 및 NF-κB 전사 발현 억제를 통한 염증을 억제할 뿐만 아니라, 염증성 세포의 생성 및 침윤 억제, 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 생성 억제, 활성산소와 엘라스테이즈 저해 효과, Th2관련 사이토카인 IL-5 및 IL-13의 생성 억제, IgE 항체 생성 억제, 점액질 생성 억제 및 기도과민성 감소 효과가 우수한 바, 현재 사용되는 치료제의 부작용을 극복하고, 독성이 없으면서 치료효과가 탁월한 화합물로서 호흡기 질환의 예방, 치료 및 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 세포실험에서 메틸린더론의 사이토카인의 저해 활성을 ELISA를 통해 측정한 결과이다.
도 2는 세포실험에서 메틸린더론의 사이토카인의 저해 활성을 real-time PCR을 통해 측정한 결과이다.
도 3은 세포 실험에서 메틸린더론의 NF-κB의 저해 활성을 luciferase assay를 통해 확인한 결과이다.
도 4는 COPD 마우스 모델에서 메틸린더론의 기관지 폐포 세척액 내 염증세포 감소효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 COPD 마우스 모델에서 메틸린더론의 기관지폐포세척액 내 염증성 사이토카인 생성 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 6는 COPD 마우스 모델에서 메틸린더론의 기관지폐포세척액 내 활성산소와 엘라스테이즈 저해 효과를 나타낸 결과이다.
도 7는 COPD 마우스 모델에서 폐 조직 내의 메틸린더론의 염증세포 침윤 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 8는 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 기관지 폐포 세척액 내 염증세포 감소효과를 나타낸 결과이다.
도 9는 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 기관지폐포세척액 내 Th2 사이토카인 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 10는 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 혈청 내 총 IgE 및 난백알부민 특이 IgE의 분비에 대한 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 11는 천식 마우스 모델에서 폐 조직 내의 메틸린더론의 염증세포 침윤 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 12는 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 점액분비 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 13는 천식 마우스 모델에서 메틸린더론을 처리한 군과 처리하지 않은 대조군의 기관지 내 기도저항을 분석한 결과이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포생존율 조사

메틸린더론의 세포생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT 검색법은 96-웰 플레이트를 사용하여 검사 결과를 ELISA reader를 이용하여 많은 시료를 간단하게 판독할 수 있어 세포 독성 및 세포 증식 검색법으로 널리 사용되고 있으며, 세포의 대사과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 노란색의 수용성 MTT tetrazolium을 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 방법이다.

메틸린더론의 세포생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, A549 세포 (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells)를 소태아혈청(Fetal bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Welgene, 한국) 배지에 1 x 10⁵개/ml의 농도로 현탁하여 100μl씩 96-웰 플레이트에 접종하였다. 4시간 후에 시료를 각각의 농도로 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, MTT(5mg/ml)을 각 웰당 5μl씩 첨가하여 4시간 더 배양하였다. 그 후 배지를 제거 한 후 DMSO를 각 웰당 100μl씩 첨가하여 반응시킨 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 처리한 음성대조군 값을 100%로 하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였으며, 각 결과는 표 1에 도시하였다.

[수학식 1]

세포생존율(%) = [(추출물 처리한 OD₅₇₀ nm 값)/(음성 대조군 OD₅₇₀nm 값)]×100

메틸린더론이 세포생존율에 미치는 영향

시료명	μM	Viability (%)	±SD
	-	100.0	1.85
Methyl linderone	0.5	99.0	1.13
	1	100.6	3.41
	2	100.3	3.14
	4	99.1	3.91
	8	95.3	7.41

상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 메틸린더론은 각 농도에서 95%이상의 세포생존율을 보여 모두 세포독성에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 사이토카인 IL-6 및 IL-8 생성 저해 활성

2-1. ELISA를 활용한 사이토카인 활성 평가

메틸린더론의 천식과 관련된 사이토카인의 억제 효과를 알아보기 위하여, A549 세포 (human lung carcinoma epithelial cancer cell)를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 10% 첨가한 RPMI(Welgene, 한국) 배지에서 배양하였으며, PMA(10nM)로 유도된 IL-6와 IL-8 생성에 대한 메틸린더론의 억제율을 측정하였다. A549 세포를 2.5 x 10⁵ 개/ml 농도로 현탁하여 96-웰 플레이트에 100μl씩 접종한 후, 시료를 0.5, 1, 2, 4, 8μM의 농도로 처리하였다. 1시간 동안 배양한 후, 10nM의 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate: PMA)를 처리하여 16시간 동안 더 배양하였다. 그 후, 상등액을 회수하여 -70℃에 보관하였다.

IL-6와 IL-8 ELISA assay를 위하여 Human IL-6 ELISA kit(BD bioscience), IL-8 ELISA kit(R&D systems)를 사용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다.

그 결과 도 1에서 확인할 수 있듯이, 메틸린더론을 농도별 처리한 경우, IL-6와 IL-8 모두 농도의존적인 저해활성 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

2-2. real-time PCR을 활용한 사이토카인 활성 평가

RNA 수준에서의 메틸린더론의 사이토카인 감소 활성을 알아보기 위하여 real-time PCR을 진행하였다. A549 세포를 2.5 x 10⁵개/ml 농도로 현탁하여 12-웰 플레이트에 1ml씩 접종한 후, 시료를 각각 0.5, 1, 2, 4, 8μM의 농도로 처리하였다. 1시간 동안 배양한 후, 10nM의 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate:PMA)를 처리하여 6시간 동안 더 배양하였다. 그 후, 상등액을 제거한 후 Trizol법을 활용하여 RNA를 수득한 후 cDNA synthesis kit(TOYOBO, ReverTra Ace qPCR RT Master Mix) 프로토콜에 따라 cDNA를 제조하였다.

IL-6와 IL-8 real-time PCR을 위하여 primer를 제작하여 (Bioneer) 사용하였으며, real-time PCR 프로토콜에 따라 분석하였다.

그 결과 도 2에서 확인할 수 있듯이, 메틸린더론의 IL-6와 IL-8의 저해활성을 측정한 결과 농도의존적인 저해효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 3. NF-κB 전사인자 저해 활성

메틸린더론의 NF-κB 유전자 promoter의 전사 활성을 측정하기 위하여 A549 (Human lung carcinoma epithelial cell line) 세포에 NF-κB promoter-reporter construct를 일시적인 형질전환(transient transfection) 시킨 후 세포 추출물의 luciferase 활성을 측정하였다. DNA-리포펙타민 복합체(DNA-lipofectamine complex)는 0.1μg의 프로모터-리포터 구조 플라스미드(promoter-reporter construct plasmid)를 lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen)를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 제조하였다. DNA와 lipofectamine 2000이 complex를 이루는 과정에는 opti-MEM 배지 (Invitrogen)를 사용하였다. A549 세포는 DNA를 가하기 직전 세포의 수를 확인하여 12 well plate에 2.5 x 10⁵개(1 ml)의 배지에 준비하였다. DNA-lipofectamine complex를 A549 세포에 조심스럽게 섞은 후 37℃ 인큐베이터에서 6시간 반응시켰다. 이후 배지를 갈아주면서 형질전환이 된 세포를 찾는 작업을 진행하였고, luciferase test를 통해 NF-κB가 형질전환 된 A549 세포를 찾을 수 있었다. 반응이 끝난 A549 세포는 실험군에 따라 메틸린더론, 0.5, 1, 2, 4, 8μM 을 가한 후 PMA(10nM)를 처리하여 16시간 동안 배양하였다.

배양이 끝난 후 PBS로 세포를 1회 세척한 후 luciferase reagent(E1501, promega)를 각 well 당 적당량 가한 후 plate를 15분 shacking 해준 후 상층액(supernatant)을 얻어내 전사 활성을 측정하였다. Passive lysis buffer (E1941, promega)를 사용하였으며, luciferase 활성은 microplate luminometer (Tecan)을 이용하여 측정하였다. 모든 실험은 duplicate로 3회 실행하였다. 프로모터(Promoter) 전사활성은 대조군에 대한 상대적인 전사 활성을 형질전환 효율로 보정하여 나타내었으며 통계처리는 student`s t-test를 사용하였다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, A549-pGL4.32-NF-κB세포주에서 PMA를 처리한 군에 비해 메틸린더론을 처리한 군에서 농도의존적으로 NF-κB 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 기관지 염증이 유도된 COPD 마우스 모델 제조

COPD 마우스 모델에서의 메틸린더론의 항COPD 효과를 확인하기 위하여, 담배연기와 리포다당질로 유도된 COPD 마우스 모델을 제조하였다. 구체적으로, 평균 체중 20g 내외의 6주령 C57BL/6 수컷 생쥐를 ㈜코아텍으로부터 공급받아 1 주간의 적응기간을 가진 후 기본적인 신체검사상에서 이상이 관찰되지 않는 동물을 대상으로 하여, 6일 동안 마우스에 담배연기를 노출하였고 (smoking machine SciTech Korea) 5일차에 5㎍의 리포다당질 (Sigma L8274)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4)에 녹여 40μl을 비강에 주입하여 감작시켰다. 1-6일 차에 메틸린더론을 경구투여 하였고, 7일 차에 졸레틸 (50mg/kg, IP)(버박코리아)을 투여하여 마우스를 마취시킨 뒤 기관지 삽입술을 수행하여 총 1.4ml의 생리식염수로 기관지폐소세척을 취득하였다. 정상 대조군(NC)으로 담배연기에 노출되지 흡입하지 않은 군, COPD 유발군(COPD)으로 담배연기 흡입 및 리포다당질 투여하여 기관지 염증을 유도한 군, 비교군(ROF)으로 담배연기 흡입 1시간 전에 강력한 합성스테로이드인 로플루밀라스트(roflumilast, 5mg/kg, P.O)을 경구투여한 군, 실험군(B)으로 담배연기 흡입 1시간 전에 메틸린더론을 15mg/kg 투여한 실험군(B15), 메틸린더론을 30mg/kg 투여한 실험군 (B30)으로 나누어 실험을 진행하였으며 각 군당 5두의 흰 쥐를 사용하였다.

실시예 5. COPD 마우스 모델에서 메틸린더론의 염증성 세포 억제효과

호중구와 대식세포의 유입 증가는 COPD 발생 기전의 중요한 특징이므로, COPD 마우스에서 메틸린더론의 기관지 폐포 세척액 내의 염증성 세포의 억제효과를 확인하기 위해서 Diff quik® staining을 사용하여 각 세포를 구분하고 세포수를 측정하였다(도 4).

그 결과, 호중구 및 대식세포를 포함한 염증성 세포는 담배연기와 리포다당질로 유발된 COPD 마우스 폐포세척액에서 현저히 증가함을 확인할 수 있었으며, 메틸렌더론을 경구투여 한 실험군 B15 및 B30에서는 이러한 염증성 세포수의 감소효과를 확인할 수 있었다.

실시예 6. COPD 마우스 모델에서 메틸린더론의 염증서 사이토카인 억제 효과

COPD 마우스에서 메틸린더론의 기관지 폐포 세척액 내 TNF-α, IL-6의 억제효과를 확인하기 위해서 ELISA assay 기법을 사용하여 각각의 사이토카인을 정량 분석하였다. 여러 변수에 따른 평균값과 표준편차 (mean±S.D)을 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 Mann0whitney U 검정을 수행하여 분석하였으며, 통계적으로 P 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.

그 결과 도 5에서 볼 수 있듯이, 메틸린더론을 경구 투여한 실험군 B15 및 B30의 기관지 폐포 세척액 내 TNF-α, IL-6 수치는 COPD 유발군에 비해 유의적으로 감소되었으며, 이를 통해, 메틸린더론이 COPD 마우스에서 염증성 사이토카인의 억제 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 7. COPD 마우스 모델에서 메틸린더론의 활성산소와 엘라스테이즈 저해 효과

활성산소 (reactive oxygen species, ROS)와 엘라스테이즈 (elastase)는 COPD 발생기전에서 기관지 염증 및 폐기종을 유발한다.

이에 따라, 도 6과 같이 기관지폐포세척액 (BALF) 내의 ROS 생성과 elastase 활성을 측정한 결과, BALF 내 ROS 수치는 COPD 유발군에서 현저히 증가하였고 메틸린더론을 투여한 실험군, B15와 B30에서 농도의존적으로 유의하게 감소됨을 확인할 수 있었다. BALF 내 elastase 활성도도 COPD 유발군에서 현저히 증가하는 경향을 나타내었고 메틸린더론을 투여한 실험군, 특히 B30에서 유의적으로 감소됨을 확인하였다.

실시예 8. COPD 마우스 모델에서 메틸린더론의 염증세포 침윤 억제 효과

메틸린더론의 염증 세포 침윤에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 폐조직을 H&E staining solution으로 염색하여 기관지 주변의 염증성 세포의 침윤을 확인하였다.

도 7에서 볼 수 있듯이, 구체적으로 기관지 주변의 염증세포의 침윤은 담배연기와 리포다당질로 유도된 COPD 마우스에서 현저히 증가하였으나, 메틸린더론을 경구투여한 실험군(B15, B30)은 이러한 현저한 염증세포의 침윤을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 9. 기관지 천식이 유도된 천식 마우스 모델 제조

천식 마우스 모델에서의 메틸린더론의 항천식 효과를 확인하기 위하여, 난백 알부민을 이용하여 기관지 천식이 유도된 천식 마우스 모델을 제조하였다. 구체적으로, 평균 체중 20g 내외의 6주령 Balb/c 암컷 생쥐를 ㈜코아텍으로부터 공급받아 1 주간의 적응기간을 가진 후 기본적인 신체검사상에서 이상이 관찰되지 않는 동물을 대상으로 하여, 1일차에 3mg의 수산화알루미늄 (Sigma A8222)과 난백 알부민 30μg(Sigma A5503)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 200μl을 복강에 주입하여 감작시켰다. 8일차에 3mg의 수산화알루미늄(Sigma A8222)과 난백 알부민 60μg(Sigma A5503)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 200μl을 복강에 주입하여 감작시켰다. 10-14일 차에 메틸린더론을 경구투여 하였고, 12-14일 차에 nebulizer를 이용하여 난백 알부민을 마우스에게 흡입시켰다. 마지막 난백 알부민 흡입 24시간 뒤 기도과민성을 측정하였고, 48 시간 뒤에 졸레틸 (50mg/kg, IP)(버박코리아)을 투여하여 마우스를 마취시킨 뒤 기관지 삽입술을 수행하여 총 1.4ml의 생리식염수로 기관지폐소세척을 취득하였다. 정상 대조군(NC)으로 난백 알부민을 투여, 흡입하지 않은 군, 천식 유발군(OVA)으로 난백 알부민을 투여, 흡입하여 기관지 천식을 유도한 군, 비교군(DEX)으로 난백 알부민 흡입 1시간 전에 강력한 합성스테로이드인 덱사메타손(dexamethasone, 1mg/kg, IP) (Sigma S4902)을 투여한 군, 실험군(B)으로 난백 알부민 흡입 1시간 전에 메틸린더론을 15mg/kg 투여한 실험군(B15), 메틸린더론을 30mg/kg 투여한 실험군 (B30)으로 나누어 실험을 진행하였으며 각 군당 5두의 흰 쥐를 사용하였다.

실시예 10. 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 염증성 세포 억제효과

호산구와 대식세포의 유입 증가는 천식 발생 기전의 중요한 특징이므로, 천식 마우스에서 메틸린더론의 기관지 폐포 세척액 내의 염증성 세포의 억제효과를 확인하기 위해서 Diff quik® staining을 사용하여 각 세포를 구분하고 세포수를 측정하였다(도 8).

그 결과, 호산구, 호중구 및 대식세포를 포함한 염증성 세포는 난백 알부민으로 유발된 천식 마우스 폐포세척액에서 현저히 증가함을 확인할 수 있었으며, 메틸렌더론을 경구투여 한 실험군 B15 및 B30에서는 이러한 염증성 세포수의 감소효과를 확인할 수 있었다.

실시예 11. 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 Th2관련 사이토카인 억제 효과

천식 마우스에서 메틸린더론의 기관지 폐포 세척액 내 IL-5, IL-13의 억제효과를 확인하기 위해서 ELISA assay 기법을 사용하여 각각의 사이토카인을 정량 분석하였다. 여러 변수에 따른 평균값과 표준편차 (mean±S.D)을 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 Mann0whitney U 검정을 수행하여 분석하였으며, 통계적으로 P 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.

그 결과 도 9에서 볼 수 있듯이, 메틸린더론을 경구 투여한 실험군 B15 및 B30의 기관지 폐포 세척액 내 IL-5 수치는 천식 유발군에 비해 유의적으로 감소되었으며, 실험군 B30의 기관지 폐포 세척액 내 IL-13 수치도 천식 유발군에 비해 유의적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 메틸린더론이 천식 마우스에서 Th2 관련 사이토카인의 억제 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 12. 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 IgE 항체 생성 억제 효과

IgE는 기관지 천식에서 중요한 역할을 하는 것으로, 생체 내에서 알레르겐이 감작이 되면 특이 IgE 항체가 형성되어 혈중에 존재하거나 비만세포, 호염구 세포 표면에 부착하게 된다. 특히 알레르겐에 다시 노출되면 이 알레르겐이 비만 세포에 붙어있는 IgE에 결합되면서 많은 염증매개 물질이 분비되어 기도염증 및 기관지 수축을 일으킨다.

이전 연구들에서 혈중 IgE 농도가 기관지 천식의 중증도와 상관관계가 있음이 보고됨에 따라(Noah TL, et al., Clin Immunol 2000;97:43-49) 기관지 천식 발생에 IgE의 중요성이 인식되고 있다.

이에 따라, 도 10과 같이 혈청 내의 IgE 항체의 농도를 측정한 결과, 혈청 내 total IgE 항체 농도는 천식 유발군의 경우 236.66ng/ml에 비해 본 발명의 메틸린더론을 투여한 실험군 특히, B30에서는 141.15ng/ml로 유의하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, OVA-specific IgE 항체 농도는 천식 유발군 (5.76ng/ml)에 비해 본 발명의 메틸린더론을 투여한 실험군 B30에서 4.02ng/ml로 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 13. 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 염증세포 침윤 억제 효과

메틸린더론의 염증 세포 침윤에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 폐조직을 H&E staining solution으로 염색하여 기관지 주변의 염증성 세포의 침윤을 확인하였다.

도 11에서 볼 수 있듯이, 구체적으로 기관지 주변의 염증세포의 침윤은 난백알부민으로 유도된 천식 마우스에서 현저히 증가하였으나, 메틸린더론을 경구투여한 실험군(B15, B30)은 이러한 현저한 염증세포의 침윤을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 14. 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 점액질 생성 억제 효과

메틸린더론의 점액질 생성에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 폐조직을 PAS staining solution으로 염색하여 기관지 내 점액질의 생성을 확인하였다.

그 결과 도 12에서 볼 수 있듯이, 점액질의 생성은 난백알부민으로 유도된 천식 마우스에서 현저히 증가하였고 메틸린더론을 경구투여한 실험군(B15, B30)에서는 점액질 생성이 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다.

실시예 15. 천식 마우스 모델에서 메틸린더론의 기도과민성 억제 효과

메틸린더론의 기도과민성에 대한 효과를 확인하기 위하여 동물용 기도저항측정기(one chamber plethyamograhy)를 사용하여 기도저항성 Penh (enhanced pause)을 측정하였다. 구체적으로, Penh 값의 측정은 정상 호흡 상태에서 기저값을 측정한 후 PBS를 초음파분무기를 이용하여 3분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 메타콜린 (Sigma A2251)을 12, 25, 50mg/ml의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 나타내는 Pehn 값을 측정하여 평가하였다. 여러 변수에 따른 평균값과 표준편차 (mean±S.D)을 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 Mann-whitney U 검정을 수행하여 분석하였으며, 통계적으로 P 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.

그 결과 도 13에서 볼 수 있듯이, 천식 마우스 모델에서는 Pehn값이 증가되었으나, 메틸린더론의 경구투여한 실험군(B15, B30)에서는 Pehn값이 감소됨을 확인하여, 농도 의존적인 메틸린더론의 기도과민성 억제효과를 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 메틸린더론(methyllinderone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 염증성 호흡기 질환인 것인, 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식 또는 만성폐쇄성폐질환인 것인, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 TNF-α, IL-6 또는 IL-8의 사이토카인 생성 저해; 또는 NF-κB 전사활성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은, 염증성 세포의 생성 및 침윤 억제, 활성산소와 엘라스테이즈 저해, Th2관련 사이토카인 IL-5 또는 IL-13의 생성 억제, IgE 항체 생성 억제, 점액질 생성 억제 및 기도과민성 감소에서 선택되는 어느 하나 이상의 효과를 발휘하는 것인, 약학적 조성물.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 호흡기 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법.
   
8. 메틸린더론 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
   
9. 메틸린더론 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
   
   

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