KR20220061999A - A형 인플루엔자 감염의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

A형 인플루엔자 감염의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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필립 에스. 팡
린 이. 코놀리
에릭 모가리안
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비르 바이오테크놀로지, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시는 A형 인플루엔자 감염의 예방 및 치료에 사용하기 위한 항체, 항체 조성물, 및 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 현재 개시된 항체 또는 항체 조성물의 단일 투여는 전체 독감 시즌 동안 A형 인플루엔자 감염을 보호 및/또는 치료하는 데 유용하다.

Description

A형 인플루엔자 감염의 치료를 위한 조성물 및 방법
서열목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 레퍼런스(reference)로 본원 명세서에 포함된다. 서열목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 930485_413WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 12.2 KB로 2020년 8월 26일에 생성되었으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고 있다.
본 개시는 A형 인플루엔자 감염의 예방 및 치료를 위한 항체 조성물 및 방법에 관한 것이다.
인플루엔자는 매년 전세계적으로 확산되어 매년 약 300만 내지 500만명의 중증 환자와 약 29만 내지 65만명의 호흡기 사망자가 발생하는 전염병이다(WHO, Influenza (Seasonal) Fact sheet, November 6, 2018). 가장 흔한 증상으로는 갑작스런 발열, 기침(보통 건조함), 두통, 근육 및 관절 통증, 심한 권태감(좋지 않은 느낌), 인후통 및 콧물이 있다. 잠복기는 1일 내지 4일 사이로 다양하지만, 일반적으로 바이러스에 노출된 약 2일 이후에 증상이 시작된다. 인플루엔자의 합병증에는 폐렴, 부비동 감염, 천식이나 심부전, 패혈증 또는 만성 기저 질환의 악화와 같은 기존 건강 문제의 악화가 포함될 수 있다.
인플루엔자는 인플루엔자 바이러스, 음성-반응(negative-sense), 단일가닥, 분절 RNA 게놈을 포함하는 오르소믹소바이러스(Orthomyxoviridae) 계통의 바이러스 그룹의 항원적으로 및 유전적으로 다양한 그룹에 의해 발생한다. 인플루엔자 바이러스의 네 가지 유형(A, B, C 및 D) 가운데, 세가지 유형(A, B 및 C)이 인간에 영향을 미친다. A형 인플루엔자형 바이러스는 가장 치명적인 인간 병원체이며 가장 심각한 질병을 유발한다. A형 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)와 같은 주요 표면 단백질의 여러 하위 유형의 존재에 따라 분류될 수 있다. 이들의 헤마글루티닌("HA") 단백질에 의해 정의되는 적어도 18개 A형 인플루엔자 하위유형이 있다. HA는 두 개의 그룹으로 분류될 수 있다. 그룹 1은 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 및 H17 하위 유형을 포함하며, 그룹 2는 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15 하위 유형을 포함한다. 모든 하위 유형이 조류(birds)에 존재하지만, 대부분 H1, H2 및 H3 하위 유형이 인간에게 질병을 유발한다. H5, H7 및 H9 하위 유형은 인간에게 산발적으로 심각한 감염을 일으키고 새로운 유행병을 일으킬 수 있다. A형 인플루엔자 바이러스는 지속적으로 진화하여 새로운 변이체를 생성하고, 이러한 현상을 항원 표류(antigenic drift)라고 한다. 결과적으로 과거 바이러스에 대한 반응으로 생성된 항체는 새로운 표류된 바이러스에 대해 거의 보호되지 않거나 전혀 보호되지 않는다. 그 결과 출현할 것으로 예상되는 H1 및 H3 바이러스에 대한 새로운 백신이 매년 생성되어야 하며, 이러한 과정은 비용이 많이 들뿐만 아니라 항상 효율적인 것은 아니다. H5 인플루엔자 백신 생산에도 동일하게 적용된다.
HA는 A형 인플루엔자 바이러스의 주요 표면 단백질이며, 이는 감염 또는 백신 접종에 의해 유도되는 중화 항체의 주요 표적이다. HA는 상부 호흡 기관 또는 적혈구의 세포와 같은 막에 시알산(sialic acid)이 있는 세포에 바이러스를 결합시키는 역할을 한다. 또한, HA는 pH가 감소된 이후 바이러스 외피와 엔도좀 막의 융합을 매개한다. HA는 동종삼량체(homotrimeric) 통합 막 당단백질이다. HA 삼량체는 3개의 동일한 단량체로 구성되며, 이들 각각은 2개의 이황화 브릿지로 연결된 HA1 및 HA2 영역이 있는 온전한 HA0 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성된다. 각 HA2 영역은 알파 나선 코일 구조를 채택하고 주로 HA의 "스템(stem)" 또는 "줄기(stalk)" 영역을 형성하는 반면, HA1 영역은 α/β 구조의 혼합을 포함하는 소형 구형 도메인이다(HA의 "헤드" 영역). 구형 HA 헤드 영역은 시알산 수용체에 대한 결합을 매개하는 한편, HA 스템은 낮은 pH에 의해 엔도좀에서 촉발되는 바이러스 및 세포막 사이의 후속 융합을 매개한다. 면역지배적인 HA 구형 헤드 도메인은 일정한 항원 드리프트를 겪는 별개의 항원 부위로 높은 가소성을 갖지만, HA 스템 영역은 하위 유형 가운데 상대적으로 보존된다. 현재 인플루엔자 백신은 HA의 줄기 영역보다 빠르게 진화하는 면역 우세 및 가변 HA 헤드 영역에 대해 면역 반응을 대부분 유도한다(Kirkpatrick E, Qiu X, Wilson PC, Bahl J, Krammer F. The influenza virus hemagglutinin head evolves faster than the stalk domain. Sci Rep. 2018 Jul 11;8(1):10432). 따라서, 특정 인플루엔자 백신은 일반적으로 몇 년 이상 보호하지 못하며 매년 인플루엔자 백신의 재개발이 필요하다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 최근 HA 줄기의 보존된 부위를 표적으로 하는 새로운 종류의 인플루엔자 중화 항체가 인플루엔자 바이러스 치료제로 개발되었다. HA의 줄기 영역을 표적으로 하는 이러한 항체는 일반적으로 HA의 머리 영역을 표적으로 하는 항체에 비해 보다 광범위하게 중화한다. 광범위한 중화 A형 인플루엔자 항체에 대한 개요는 Corti D. and Lanzavecchia A., Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annu. Rev. Immunol. 2013;31:705-742. Okuno et al. immunized mice with influenza virus A/Okuda/57 (H2N2) and isolated a monoclonal antibody (C179) that binds to a conserved conformational epitope in HA2 and neutralizes the Group 1 H2, H1 and H5 subtype influenza A viruses in vitro and in vivo in animal models (Okuno et al.,1993; Smirnov et al., 1999; Smirnov et al., 2000)에서 제공된다. HA-스템 영역을 표적으로 하는 항체의 추가적인 예시는 CR6261 (Throsby M, van den Brink E, Jongeneelen M, Poon LLM, Alard P, Cornelissen L, et al. (2008) Heterosubtypic Neutralizing Monoclonal Antibodies Cross-Protective against H5N1 and H1N1 Recovered from Human IgM+ Memory B Cells. PLoS ONE 3(12): e3942. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003942; Friesen RHE, Koudstaal W, Koldijk MH, Weverling GJ, Brakenhoff JPJ, Lenting PJ, et al. (2010) New Class of Monoclonal Antibodies against Severe Influenza: Prophylactic and Therapeutic Efficacy in Ferrets. PLoS ONE 5(2): e9106. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009106), F10 (Sui J, Hwang WC, Perez S, Wei G, Aird D, Chen LM, Santelli E, Stec B, Cadwell G, Ali M, Wan H, Murakami A, Yammanuru A, Han T, Cox NJ, Bankston LA, Donis RO, Liddington RC, Marasco WA (March 2009). "Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses". Nature Structural & Molecular Biology. 16 (3): 265-73. doi:10.1038/nsmb.1566), CR8020 (Ekiert DC, Friesen RHE, Bhabha G, Kwaks T, Jongeneelen M, et al. 2011. A highly conserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses. Science 333(6044):843-50), FI6 (Corti D, Voss J, Gamblin SJ, Codoni G, Macagno A, et al. 2011. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. Science 333(6044):850-56), 및 CR9114 (Dreyfus C, Laursen NS, Kwaks T, Zuijdgeest D, Khayat R, et al. 2012. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science 337(6100):1343-48)을 포함한다.
그러나, 그룹 1 및 2 하위 유형 모두의 HA 스템 영역과 반응할 수 있는 항체는 극히 드물며 모든 하위 유형을 완전히 포괄하지는 않는다. 최근에 항체 MEDI8852는 1군 및 2군 A형 인플루엔자 바이러스를 중화하고 80년 초과의 항원 진화에 걸쳐 있는 대표적인 바이러스 패널을 중화할 수 있다고 기술되었다(Kallewaard NL, Corti D, Collins PJ, et al. Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza A Subtypes. Cell. 2016;166(3):596-608; Paules, C. I. et al. The Hemagglutinin A Stem Antibody MEDI8852 Prevents and Controls Disease and Limits Transmission of Pandemic Influenza Viruses. J Infect Dis 216, 356-365, https://doi.org/10.1093/infdis/jix292 (2017)). MEDI8852는 구조적으로 특성화된 다른 줄기 반응성 중화 항체와 현저히 다른 고도로 보존된 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다(Kallewaard NL, Corti D, Collins PJ, et al. Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza A Subtypes. Cell. 2016;166(3):596-608).
지속적인 노력에도 불구하고, A형 인플루엔자의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 항체 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 개시가 해결하려는 과제는 A형 인플루엔자를 중화시키는 항체를 포함하는 약학적 조성물 및 이러한 조성물의 사용 방법을 제공하는 것이다.
상세한 설명
본 개시는 A형 인플루엔자를 중화시키는 항체를 포함하는 약학적 조성물 및 이러한 조성물의 사용 방법을 제공한다. 특정 실시 양태에서, 상기 약학적 조성물은 단일 투여 이후 적어도 10주, 적어도 15주, 적어도 20주로부터 선택된 기간 동안 대상체에서 A형 인플루엔자를 중화하고 전신 노출을 유지하는 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체 및 약학적 조성물은 예방적으로 효과적인 양으로 투여될 때 대상체에 의해 잘 용인된다(well-tolerated). 다른 실시 양태에서, 상기 항체 및 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 때 대상체에 의해 잘 용인된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 방법은 A형 인플루엔자에 의한 감염 위험이 있는 대상체에게 본 설명에 따른 항체 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 방법은 본 개시에 따른 항체 조성물을 A형 인플루엔자에 의해 감염된 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
A형 인플루엔자를 중화시키는 항체, 이러한 항체를 포함하는 약학적 조성물, 이러한 조성물을 사용하는 방법이 하기에 구체적으로 설명되어 있으나, 본 개시는 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 본 개시의 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
다음에서, 본 개시의 양태가 설명된다. 특정한 실시양태가 제공되지만, 본 개시의 실시양태는 추가적인 실시양태를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 설명된 실시예 및 실시양태는 본 개시를 명시적으로 설명된 실시양태로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 설명은 명시적으로 설명된 실시양태를 임의의 개시된 주제와 결합하는 실시양태를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에서 설명된 모든 주제의 임의의 순열 및 조합은 문맥이 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
본 개시 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 용어, 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"(또는 "갖는(having)", "갖는(has)", "포함하는(including)", "포함하다(includes)" 등)과 같은 변형은 명시된 구성요소, 비율, 정수(적절한 경우, 이의 분수; 예를 들어 정수의 10분의 1 및 100분의 1), 농도 또는 단계의 포함을 의미하는 것으로 이해되지만, 언급되지 않은 구성요소, 정수, 농도 또는 단계를 배제하지 않는다.
"본질적으로 구성되는(consisting essentially)"이라는 용어는 "포함하는(comprising)"과 동일하지 않으며, 청구범위의 특정한 물질 또는 단계를 의미하며, 청구항 발명의 기본 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역, 또는 모듈(예를 들어 결합 도메인) 또는 단백질은 도메인, 영역, 모듈, 또는 단백질의 아미노산 서열이 연장, 결실, 변이, 또는 이들의 조합(예를 들어 아미노- 또는 카르복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함할 때 특정한 아미노산 서열로 "본질적으로 구성"되며, 조합하여 최대 20%(예를 들어 거의 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)의 도메인, 영역, 모듈, 또는 단백질의 길이에 기여하며, 도메인(들), 영역(들), 모듈(들), 또는 단백질의 활성(예를 들어 결합 단백질의 표적 결합 친화성)에 실질적으로 영향을 주지 않는다(즉, 50% 이상, 예를 들어 40% 이상, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 활성을 감소시키지 않음).
"~로 구성된(consist of)"이라는 용어는 "포함하다"라는 용어의 특정한 실시예이며, 여기서 명시되지 않은 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계는 제외된다. 본 개시의 맥락에서, "포함하"라는 용어는 "~로 구성된"이라는 용어를 포함한다. 따라서 "포함하는(comprising)"이라는 용어는 "포함하는(including)"뿐만 아니라 "구성되는(consisting)"이라는 용어도 포함하며, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X로만 구성될 수 있거나 또는 추가의 것 예를 들어 X+Y를 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에 개시된 구조 및 치환기의 다양한 조합으로부터 유도된 개별 화합물, 또는 화합물 그룹은 각각의 화합물 또는 화합물 그룹이 각각 개시된 것과 같은 정도로 본 출원에 의해 개시된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 특정한 구조 또는 특정한 치환체의 선택은 본 개시의 범위 내에 있다.
본 개시를 설명하는 맥락(청구범위의 맥락 포함)에서 사용된 "a" 및 "an" 및 "the"와 유사한 참조는 본 명세서에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위를 언급하는 것은 해당 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 속기 방법으로서 역할을 할 뿐이다. 본 명세서에 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 명세서의 어떤 언어도 여기에 개시된 주제의 실행에 필수적인 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
"실질적으로"라는 단어는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 특정한 실시 양태에서, "실질적으로"는 참조 조성물, 방법, 또는 용도와 비교하여 본 개시의 조성물, 방법, 또는 용도의 주어진 양, 효과 또는 활성을 의미하며, 참조 조성물, 방법, 또는 용도의 양, 효과, 또는 활성의 50% 미만, 예를 들어 참조 조성물, 방법, 또는 용도의 양, 효과, 또는 활성의 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만 감소를 설명한다.
수치 x와 관련하여 용어 "약"은 x ± 10%, 예를 들어 x ± 5%, 또는 x ± 7%, 또는 x ± 10%, 또는 x ± 12%, 또는 x ± 15%, 또는 x ± 20%를 의미한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 "약"은 지시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "질병"이라는 용어는 모두 인간 또는 동물 신체의 비정상적인 상태 또는 정상적인 기능을 손상시키는 부분 중 하나의 비정상적인 상태를 반영한다는 점에서, 일반적으로 "장애" 및 "상태"(의학적 상태에서와 같이)라는 용어와 동의어로 의도되고 상호 교환적으로 사용되며, 통상적으로 징후 및 증상과 구별하여 나타내며, 인간 또는 동물의 수명 또는 삶의 질을 감소시킨다.
본원에 사용된 "치료학적으로 효과적인"이라는 용어는 대상체에게 이점을 제공하기에 충분한 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물 또는 항체의 성질 또는 양을 지칭한다. 본 개시의 맥락에서, 대상체에게 제공되는 이점은 인플루엔자 A 감염의 치료이다. 본원에 사용된 "치료"에 대한 언급은 예방, 예방, 약화, 개선 및 요법을 포함한다. 치료의 이점에는 개선된 임상 결과; 감염과 관련된 증상의 경감(lessening) 또는 완화(alleviation); 증상 발생 감소; 삶의 질 향상; 더 긴 무병 상태; 감염 예방; 감염 범위 및/또는 기간의 감소; 질병 상태의 안정화; 질병 진행 지연; 차도(remission); 생존; 장기 생존; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 따라서, 특정한 실시 양태에서, "치료학적으로 효과적"이라는 용어는 인플루엔자 A에 감염된 대상체의 치료뿐만 아니라 대상체에서 인플루엔자 A에 의한 감염의 예방(prevention) 또는 예방(prophylaxis)을 모두 포함한다. 의도된 치료가 예방인 경우, "치료적으로 효과적인" 및 "예방적으로 효과적인"이라는 용어는 혼용되어 사용될 수 있다. "대상체" 또는 "환자"라는 용어는 A형 인플루엔자에 감염되기 쉬운 또는 이미 A형 인플루엔자에 감염된 인간 대상체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
특정 실시양태에서, 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1 바이러스, H3N2 바이러스, 또는 둘 다를 포함한다.
투여량은 종종 체중(즉, 대상체의)과 관련하여 표시된다. 따라서, [g, mg 또는 기타 단위]/kg(또는 g, mg 등)으로 표시되는 투여량은 "kg(또는 g, mg 등) 체중당" [g, mg 또는 기타 단위]를 의미할 수 있으며, "체중"이라는 용어가 명시적으로 언급되지 않은 경우에도 의미할 수 있다.
"특이적으로 결합하는"이라는 용어 및 유사한 참조는 비특이적 접착을 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 "항체"라는 용어는 본 명세서에 따른 특징적인 특성을 보유하는 한, 전체 항체(이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두 개의 중쇄(H) 및 경쇄(L)(경쇄가 없는 중쇄 항체는 "항체"라는 용어에 여전히 포함되는 것으로 이해되어야 함), 온전한 항체에 의해 인식되는 항원 표적 분자에 결합하는 능력을 갖거나 보유하는 항체 단편, 예를 들어 scFv, Fab, 또는 F(ab')2 절편과 같은 것, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 재조합 항체, 유전적으로 및 다르게 조작되거나 변형된 항체(예를 들어 변이체 또는 돌연변이 항체, 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전히 인간 항체, 인간화 항체, 이종 접합체 항체, 다중 특이적, 예를 들어 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디, 탠덤 di-scFv, 탠덤 tri-scFv, 및 기술분야에 알려진 다른 항체 포맷)를 포함하는 항체의 다양한 형태를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 명세서에서 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 온전한 항체 및 단편 항원-결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 및 단일 도메인 항체(예를 들어 sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함하는 단일쇄 항체 단편을 포함하는 이의 기능적 (항원-결합) 항체 단편을 포함하는 다중클론 및 단일클론 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 예를 들어, 항체는 인간 단일클론 항체이다. 달리 언급되지 않는 한, "항체"라는 용어는 이의 기능적 항체 단편(즉 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하거나 이로 이루어짐)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG2, IgG4), IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함하는 이의 임의의 클래스 또는 서브클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포함한다.
따라서, 본 개시의 항체는 임의의 이소타입(isotype)일 수 있다(예를 들어, IgA, IgG, IgM, 각각 α, γ 및 μ 중쇄로도 지칭됨). 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체는 IgG 유형이다. IgG 이소타입 내에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스, 예를 들어 IgG1일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 2개의 상이한 이소형으로부터의 아미노산 서열 (예를 들어, 불변 도메인 아미노산 서열의 교환)을 포함하며, 예를 들어, IgA 항체로부터 아미노산 서열 및 IgG 항체로부터 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 항체이다. 본 개시의 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 타입이고 κ 경쇄를 포함한다.
인간 항체는 알려져 있다(van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한 면역화 시 내인성 면역글로불린 생산 없이 전체 레퍼토리 또는 인간 항체의 선택을 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어 마우스)에서 생산될 수 있다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 접종 시 인간 항체의 생산을 초래할 것이다(예를 들어 Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340 참조). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생산될 수 있다(Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Cole et al. 및 Boerner et al.의 기술들은 또한 인간 단일클론 항체의 제조에 활용 가능하다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 일부 실시양태에서, 인간 단일클론 항체들은 Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5에 설명된 개선된 EBV-B 세포 불멸화를 사용하여 제조된다.
본 명세서에 사용된 "가변 영역"(예를 들어, 경쇄의 가변 영역(VL), 중쇄의 가변 영역(VH))이라는 용어는 항체 경쇄 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭하며, 이는 항체가 항원에 결합하는 데 직접적으로 관여한다. 다시 말해, "VL" 또는 "VL" 및 "VH" 또는 "VH"는 각각 항체 경쇄 및 항체 중쇄로부터의 가변 결합 영역을 지칭한다.
본원에 기재된 약제학적 조성물 및 방법에 포함된 항체는 통상적으로 중쇄(또는 중쇄 가변 영역) 상의 (적어도) 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄(또는 경쇄 가변 영역) 상의 (적어도) 3개의 CDR을 포함한다. 상보성 결정 영역(CDR)은 초가변 영역("HVR")이다; CDR은 HVR과 동의어이며 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인에 존재한다. 통상적으로, 항체의 중쇄 및 동족(cognate) 경쇄의 CDR은 함께 항원 결합 부위를 형성한다(그리고 일반적으로 함께 항체의 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여한다). 일반적으로 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 가변 도메인에서 프레임워크 서열에 의해 분리된다. 일반적으로 각 항원 결합 부위에는 6개의 CDR이 있다(중쇄: CDRH1, CDRH2 및 CDRH3, 경쇄: CDRL1, CDRL2 및 CDRL3). 예를 들어, 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 단일 항체 분자는 12개의 CDR을 포함한다. 중쇄 및/또는 경쇄 상의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 1차 아미노산 서열에서 분리될 수 있으며, 이에 의해 프레임워크 영역(FR)은 CDR에 비해 가변 도메인에서 덜 가변적이다(즉, 하나의 항체에서 다른 항체로(예를 들어, 하나의 항체에서 동일한 대립유전자 또는 대립유전자들에 의해 암호화된 다른 항체로)). 예를 들어, 사슬(또는 각각의 사슬)은 3개의 CDR에 의해 분리된 4개의 프레임워크 영역으로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 VH는 하기와 같이 배열된 4개의 FR 및 3개의 CDR을 포함한다: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4; 그리고 항체 VL은 하기와 같이 4개의 FR 및 3개의 CDR을 포함한다: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4. 일반적으로, VH 및 VL은 함께 그들의 각각의 CDR을 통해 항원-결합 부위를 형성하지만, 일부 경우에, 결합 부위는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 CDR에 의해 형성될 수 있거나 또는 이들을 포함할 수 있다.
중쇄 상의 3개의 상이한 CDR 및 경쇄 상의 3개의 상이한 CDR을 포함하는, 본 개시의 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄의 서열을 결정하였다. CDR 아미노산의 위치는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된다 (IMGT: http://www.imgt.org/; cf. Lefranc, M.-P. et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012).
일부 실시양태에서, 항체는 다른 폴리펩티드가 실질적으로 없는 약학적 조성물, 예를 들어 약학적 조성물의 90% 미만(중량 기준), 또는 60% 미만, 또는 50% 미만이 다른 폴리펩타이드로 구성되는 경우에 존재할 것이다.
본 개시에 따른 항체는 인간 및/또는 비인간(또는 이종) 숙주, 예를 들어 마우스에서 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 항체는 인간이 아닌 숙주에서는 면역원성이지만 인간 숙주에서는 그렇지 않은 이디오토프(idiotope)를 가질 수 있다. 인간 사용을 위한 본 개시의 항체는 마우스, 염소, 토끼, 래트, 비영장류 포유동물 등과 같은 숙주로부터 쉽게 분리될 수 없고 일반적으로 인간화에 의해 또는 이종-마우스로부터 수득될 수 없는 것들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체는 인간에서 비-면역원성이거나 또는 실질적으로 비-면역원성이다.
본원에 사용된 "중화 항체"는 숙주에서 감염을 개시 및/또는 영속시키는 병원체의 능력을 중화, 즉 예방, 억제, 감소, 지연(impede) 또는 방해할 수 있는 것이다. "중화 항체" 및 "중화하는 항체" 또는 "중화하는 항체"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 "돌연변이"라는 용어는 참조 서열, 예를 들어 상응하는 게놈 서열과 비교하여 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열의 변화에 관한 것이다. 돌연변이, 예를 들어 게놈 서열과 비교하여, 예를 들어 (자연 발생) 체세포 돌연변이, 자발적 돌연변이, 유도 돌연변이, 예를 들어 효소, 화학 물질 또는 방사선에 의해 유도된 것, 위치 지정 돌연변이(핵산 서열 및/또는 아미노산 서열에서 특이적이고 의도적인 변화를 만드는 분자 생물학 방법)에 의해 수득된 돌연변이일 수 있다. 따라서, "돌연변이(mutation)" 또는 "돌연변이(mutating)"이라는 용어는 예를 들어 핵산 서열 또는 아미노산 서열에서 물리적으로 돌연변이를 만드는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환, 결실 및 삽입뿐만 아니라 여러 연속 뉴클레오티드 또는 아미노산의 역전을 포함한다. 아미노산 서열에서 돌연변이를 달성하기 위해, 돌연변이는 (재조합) 돌연변이된 폴리펩티드를 발현하기 위해 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 도입될 수 있다. 돌연변이는 예를 들어, 위치 지정 돌연변이 유발에 의해, 하나의 아미노산을 코딩하는 핵산 분자의 코돈이 다른 아미노산을 코딩하는 코돈으로 초래되거나, 또는 서열 변이체의 합성에 의해, 예를 들어 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 아는 것에 의해 및 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드를 돌연변이시킬 필요 없이 폴리펩타이드의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 합성을 설계함에 의해, 변환됨으로써 달성될 수 있다.
여러 문서가 본 개시에서 참조된다. 위 또는 아래에 상관없이 본 명세서에 참조된 각 문헌(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 지침 등 포함)은 그 전체가 참고문헌으로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 사전 공개로 인해 본 개시가 그러한 공개보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 개시는 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않고 이들은 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 개시의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
항체
본 명세서에 기재된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기 위한 항체는 A형 인플루엔자 바이러스를 중화시킨다. 또한, 본 개시의 항체는 내약성이 높은(well-tolerated) 투여량으로 대상체에게 투여될 때 장기간에 걸쳐 전신 노출을 유지하는 생체내(in vivo) 반감기를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 단일 투여 후 적어도 10주, 적어도 15주, 및 적어도 20주로부터 선택된 기간 동안 대상체에서 A형 인플루엔자를 중화하고 전신 노출을 유지한다. 특정 실시양태에서, 비교물질 또는 참조 항체와 비교할 때, 본 개시의 약학적 조성물 및 방법에 포함된 항체는 비교물질 또는 참조 항체와 비교하여 항체의 유사한 혈장 농도에도 불구하고 증가된 효능을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기 위한 항체는 A형 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소에 결합하여 A형 인플루엔자 바이러스의 감염을 중화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체는 MEDI8852와 동일한 A형 인플루엔자 바이러스 혈구응집소(IAV HA) 줄기 영역의 동일한 에피토프에 결합하며 (Kallewaard NL, Corti D, Collins PJ, et al. Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza A Subtypes. Cell. 2016;166(3):596-608), 따라서 모든 A형 인플루엔자 아형의 다양한 A형 인플루엔자 혈청형에 대한 광범위한 보호를 제공한다.
또한, 본 개시의 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 중쇄의 불변 영역(CH3 영역)에 2개의 돌연변이: M428L 및 N434S를 포함한다. 이러한 맥락에서, 아미노산 위치는 당업계에 인정된 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되었다. Kabat 또는 EU 넘버링에서와 같은 EU 인덱스 또는 EU 인덱스는 EU 항체의 넘버링을 나타낸다 (Edelman GM, Cunningham BA, Gall WE, Gottlieb PD, Rutishauser U, Waxdal MJ. The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969;63(1):78-85; Kabat E.A., National Institutes of Health (U.S.) Office of the Director, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edition, Bethesda, MD : U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1991, hereby entirely incorporated by reference).
실험실에서 바이러스 감염성(또는 "중화")을 연구하고 정량화하기 위해 당업자는 다양한 표준 "중화 분석"을 알고 있다. 중화 분석의 경우 동물 바이러스는 일반적으로 세포 및/또는 세포주에서 증식된다. 예를 들어, 중화 분석에서 배양된 세포는 테스트할 항체의 존재(또는 부재) 하에 고정된 양의 A형 인플루엔자 바이러스(IAV)와 함께 배양될 수 있다. 예를 들어 유세포 분석을 판독값(readout)으로 사용할 수 있다. 대안으로, 다른 판독값도 생각할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 항체는 단일클론 항체이다. 예를 들어, 본 개시의 항체는 인간 단일클론 항체이다.
본 개시의 항체는 임의의 이소타입(예를 들어, IgA, IgG, IgM, 즉 α, γ 또는 μ 중쇄)일 수 있다. 예를 들어, 항체는 IgG 유형이다. IgG 이소타입 내에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스, 예를 들어 IgG1일 수 있다. 본 개시의 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 카파(κ) 경쇄를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 유형이고 κ 경쇄를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물 및 방법은 각각 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3으로 제시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 각각 서열번호: 4, 서열번호: 5, 및 서열번호: 6으로 제시된 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 중쇄의 불변 영역 내 돌연변이 M428L 및 N434S (EU 넘버링에 따름)를 포함하는 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물 및 방법은 서열번호: 7에 70% 이상(즉 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (분리된) 항체를 포함하며, 여기서 상기 정의된 CDR 서열은 (서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3으로 각각 제시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 서열번호: 4, 서열번호: 5, 및 서열번호: 6으로 각각 제시된 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열) 유지된다.
서열 상동성은 일반적으로 참조 서열(즉 본 명세서에 인용되거나 참조된 서열)의 전체 길이와 관련하여 계산된다. 본 명세서에 언급된 백분율 상동성은 예를 들어 NCBI (the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11 and gap extension penalty=1]에 지정된 기본 매개변수를 사용하여 BLAST를 사용하여 결정될 수 있다.
"서열 변이체"는 참조 서열의 하나 이상의 아미노산이 결실 또는 치환되고/되거나 하나 이상의 아미노산이 참조 아미노산 서열의 서열에 삽입된 변형된 서열을 갖는다. 변형의 결과로, 아미노산 서열 변이체는 참조 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예시로서, 참조 서열과 적어도 70% 동일한 변이체 서열은 참조 서열의 100개 아미노산당 30개 이하의 변형, 즉 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 조합을 갖는다.
일반적으로, 비보존적인 아미노산 치환을 갖는 것이 가능하지만, 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 치환된 아미노산은 참조 서열에서 상응하는 아미노산과 유사한 구조적(예를 들어 측쇄) 또는 화학적 특성을 갖는다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 하나의 지방족 또는 소수성 아미노산의 치환, 예를 들어 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신을 다른 것으로; 하나의 하이드록실 포함 아미노산의 치환, 예를 들어 세린 및 트레오닌을 다른 것으로; 하나의 산성 잔기의 치환, 예를 들어 글루타믹산 또는 아스파르트산을 다른 것으로; 하나의 아미드 포함 잔기의 치환, 예를 들어 아스파라진 및 글루타민을 다른 것으로; 하나의 아로마틱 잔기의 치환, 예를 들어 페닐알라민 및 티로신을 다른 것으로; 하나의 염기성 잔기의 치환, 예를 들어 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 다른 것으로; 및 하나의 작은 아미노산의 치환, 예를 들어 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 및 글리신을 다른 것으로 치환을 포함한다.
추가적 예시로, 보존적 치환은 하기 그룹 중 하나에서 발견되는 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌 (Ala 또는 A), 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T); 그룹 2: 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 Z); 그룹 3: 아스파라진 (Asn 또는 N), 글루타민 (Gln 또는 Q); 그룹 4: 아르기닌 (Arg 또는 R), 리신 (Lys 또는 K), 히스티딘 (His 또는 H); 그룹 5: 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 발린 (Val 또는 V); 및 그룹 6: 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 티로신 (Tyr 또는 Y), 트립토판 (Trp 또는 W). 추가적으로 또는 대안으로, 아미노산은 유사한 기능, 화학 구조 또는 조성(예를 들어 산성, 염기성, 지방족, 방향족 또는 황 함유)에 따라 보존적 치환 그룹으로 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹핑은 치환을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile를 포함할 수 있다. 다른 보존적 치환기는 하기를 포함한다: 황-함유: Met 및 시스테인 (Cys 또는 C); 산성: Asp, Glu, Asn, 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, 및 Gly; 극성, 음전하를 띤 잔기 및 이들의 아미드: Asp, Asn, Glu, 및 Gln; 극성, 양전하를 띤 잔기: His, Arg, 및 Lys; 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, 및 Trp. 추가적인 정보는 Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company에서 찾을 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예시는 리포터 분자 또는 효소에 대한 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
"기능적 변이체"는 본 개시의 모체 또는 참조 화합물과 구조적으로 유사하거나 실질적으로 구조적으로 유사하지만 조성이 약간 다른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며(예를 들어, 하나의 염기, 원자 또는 기능기가 상이하거나, 첨가되거나, 제거됨), 폴리펩타이드 또는 암호화된 폴리펩타이드가 적어도 50% 효율로 모체 폴리펩타이드의 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있도록 한다. 특정 실시양태에서, 기능적 변이체는 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 효율성으로부터 선택된 효율성을 갖는 모체 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 수행한다. 다시 말해서, 본 개시의 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드의 기능적 변이체는 기능적 변이체가 모체 또는 참조 폴리펩타이드와 비교하여, 결합 친화도를 측정하기 위한 분석(예를 들어 결합(Ka) 또는 해리(KD) 상수를 측정하는 Biacore® 또는 사량체 염색)과 같은 선택된 분석에서 50% 이하의 성능 감소를 나타낼 때 "유사한 결합", "유사한 친화성" 또는 "유사한 활성"을 갖는다.
본원에 사용된 "기능적 부분" 또는 "기능적 단편"은 모체 또는 참조 화합물의 도메인, 부분 또는 단편만을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, 기능적 부분 또는 기능적 단편의 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드는 모체 또는 참조 화합물의 도메인, 부분 또는 단편과 관련된 적어도 50%의 활성을 보유한다. 특정 실시양태에서, 기능적 부분 또는 기능적 단편은 모체 폴리펩타이드의 도메인, 부분 또는 단편과 관련된 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100%의 활성을 보유한다. 일부 이러한 실시양태에서, 기능적 부분 또는 기능적 단편은 생물학적 이점(예를 들어, 효과기 기능)을 추가로 제공한다. 본 개시의 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드의 기능적 부분 또는 기능적 단편은 기능적 부분 또는 단편이 모체 또는 참조 폴리펩타이드와 비교하여 선택된 검정에서 50% 이하의 성능 감소를 나타낼 때 "유사한 결합" 또는 "유사한 활성"을 갖는다. 특정 실시양태에서, 유사한 결합 및 유사한 활성은 친화성과 관련하여 모체 또는 참조와 비교하여 20% 이하, 10% 이하, 및 로그 차이 이하로부터 선택된 감소 백분율을 지칭한다.
"단리된(isolated)"이라는 용어는 재료가 원래 환경(예를 들어 자연적으로 발생하는 경우 자연 환경)에서 제거되었음을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 핵산 또는 폴리펩타이드는 단리되지 않지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩타이드는 단리된다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고 및/또는 그러한 핵산 또는 폴리펩타이드는 조성물(예를 들어 세포 용해물)의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 핵산 또는 폴리펩타이드에 대하여 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된다.
특정 실시양태에서, 약학적 조성물의 항체는, 예를 들어 대상체의 생체내(in vivo) 환경으로부터 제거되거나, 분리되거나, 그렇지 않으면 연관되지 않는다는 점에서 "단리"될 수 있다.
"유전자"라는 용어는 폴리펩타이드 사슬 생성에 관여하는 DNA 또는 RNA의 단편을 의미하며; 특정 맥락에서, 여기에는 코딩 영역 앞뒤의 영역(예를 들어 5' 비번역 영역(UTR) 및 3' UTR)뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재(intervening) 서열(인트론)이 포함된다.
핵산 분자를 세포에 삽입하는 맥락에서 "도입된"이라는 용어는 "형질감염(transfection)", 또는 "형질전환(transformation)" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하고 진핵 또는 원핵 세포 내로 핵산 분자의 혼입에 대한 언급을 포함하며, 여기서 핵산 분자는 세포의 게놈(예를 들어 염색체, 플라스미드, 플라스티드(plastid) 또는 미토콘드리아 DNA)에 통합되거나, 자율(autonomous) 레플리콘으로 전환되거나, 일시적으로 발현될 수 있다(예를 들어 형질감염된 mRNA).
본 명세서에 사용된 "재조합"이라는 용어(예를 들어 재조합 항체, 재조합 단백질, 재조합 핵산 등)은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되며, 자연적으로 발생하지 않는 임의의 분자(항체, 단백질, 핵산 등)를 지칭한다. "재조합"은 "조작된" 또는 "비천연"과 동의어로 사용될 수 있으며 적어도 하나의 유전적 변형(alteration)을 포함하거나 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형(modified)된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 지칭할 수 있으며, 여기서 상기 변형(alteration) 또는 변형(modifications)은 유전 공학(즉 인간 개입)에 의해 도입된다. 유전적 변형에는 예를 들어 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 코딩하는 발현 가능한 핵산 분자를 도입하는 변형, 또는 세포 유전 물질의 기타 핵산 분자 추가, 결실, 치환 또는 기타 기능적 파괴가 포함된다. 추가 변형은 예를 들어 변형이 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 오페론의 발현을 변형하는 비암호화 조절 영역을 포함한다.
본원에 사용된 "이종성" 또는 "비-내인성" 또는 "외인성"은 숙주 세포 또는 대상체에 고유하지 않은 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자, 또는 활성, 또는 변형된 숙주 세포 또는 대상체에 고유한 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성을 지칭한다. 이종성, 비-내인성, 또는 외인성에는 돌연변이되거나 또는 그렇지 않으면 구조, 활성, 또는 이들 모두가 천연 및 변형된 유전자, 단백질, 화합물, 또는 핵산 분자 사이에서 다르게 변형된 유전자, 단백질, 화합물, 또는 핵산 분자가 포함된다. 특정 실시양태에서, 이종성, 비-내인성 또는 외인성 유전자, 단백질, 또는 핵산 분자는 숙주 세포 또는 대상체에 대해 내인성이 아닐 수 있지만, 대신 이러한 유전자, 단백질 또는 핵산 분자를 코딩하는 핵산이 접합, 형질전환, 형질감염, 전기천공 등에 의해 숙주 세포에 추가될 수 있고, 여기서 첨가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있거나 염색체외 유전 물질로서 존재할 수 있다(예를 들어, 플라스미드 또는 기타 자가 복제 벡터로). "상동성" 또는 "상동체"이라는 용어는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 유래된 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자, 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종성 또는 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 유전자에 상동성일 수 있고 상동성 폴리펩티드 또는 활성을 코딩할 수 있지만, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 변형된 구조, 서열, 발현 수준, 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.
비-내인성 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자 뿐만 아니라 암호화된 폴리펩타이드 또는 활성은 동일한 종, 상이한 종, 또는 이들의 조합으로부터 유래할 수 있다.
본원에 사용된 "내인성" 또는 "천연"이라는 용어는 숙주 세포 또는 대상체에 정상적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드, 유전자, 단백질, 화합물, 분자, 또는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 "발현"이라는 용어는 유전자와 같은 핵산 분자의 암호화 서열에 기초하여 폴리펩티드가 생성되는 과정을 의미한다. 상기 과정은 전사, 전사후 조절, 전사후 변형, 번역, 번역후 조절, 번역후 변형, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 발현된 핵산 분자는 통상적으로 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된다.
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 2개 이상의 핵산 분자의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 제어 하에 있음). "연결되지 않은"은 연관된 유전 요소가 서로 밀접하게 연관되어 있지 않고 하나의 기능이 다른 하나에 영향을 미치지 않음을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 서열번호: 7에 기재된 아미노산 서열에 대해 75% 이상 (즉, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 8에 기재된 아미노산 서열에 대해 75% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 정의된 CDR 서열은 유지된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 서열번호: 7에 기재된 아미노산 서열에 대해 80% 이상 (즉, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 8에 기재된 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 정의된 CDR 서열은 유지된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 서열번호: 7에 기재된 아미노산 서열에 대해 85% 이상 (즉, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 8에 기재된 아미노산 서열에 대해 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 정의된 CDR 서열은 유지된다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 항체는 서열번호: 7에 기재된 아미노산 서열에 대해 90% 이상 (즉, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 8에 기재된 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 정의된 CDR 서열은 유지된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 서열번호: 7에 기재된 아미노산 서열에 대해 95% 이상 (즉, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 8에 기재된 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 정의된 CDR 서열은 유지된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 서열번호: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 정의된 CDR 서열은 유지된다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 항체는 Fc 영역(예를 들어, CH2 또는 CH3 영역)에서 (M428L 및 N434S에 추가하여) 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 (각각의 야생형 CH3 영역과 비교하여) 그의 CH3 영역에서 M428L 및 N434S 외에 임의의 추가 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 (각각의 야생형 Fc 영역과 비교하여) 그의 Fc 영역에서 M428L 및 N434S 외에 임의의 추가 돌연변이를 포함하지 않는다. 본 명세서에 사용된 "야생형"이라는 용어는 예를 들어 자연에서 발생하는 참조 서열을 지칭한다. 구체적인 예시로서, "야생형"이라는 용어는 자연에서 가장 많이 발생하는 서열을 의미할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 항체는 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함할 수 있다.
변이체 항체도 본 개시의 범위 내에 포함된다. 따라서, 본 출원에 인용된 서열의 변이체도 본 개시의 범위 내에 포함된다. 이러한 변이체는 면역 반응 동안 인비보에서(in vivo) 또는 불멸화된 B 세포 클론의 배양 시 인비트로에서(in vitro) 체세포 돌연변이에 의해 생성된 천연 변이체를 포함한다. 그렇지 않으면, 변이체는 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)로 인해 발생하거나 전사 또는 번역의 오류로 인해 생성될 수 있다.
핵산
또 다른 측면에서, 본 개시는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자 및/또는 폴리뉴클레오티드의 예시는 예를 들어 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 올리고뉴클레오티드, rRNA와 같은 RNA 분자, mRNA, miRNA, siRAN 또는 tRNA 또는 cDNA와 같은 DNA 분자를 포함한다. 핵산은 본 개시의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 다시 말해, 항체의 경쇄 및 중쇄는 동일한 핵산 분자에 의해 (예를 들어, 바이시스트론 방식으로) 코딩될 수 있다. 대안적으로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 별개의 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다.
유전자 코드의 중복성(redundancy)으로 인해, 본 개시는 또한 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 서열 변이체를 포함한다. 따라서, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 항체(또는 완전한 핵산 분자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 항체의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 항체 생산을 위한 발현 시스템에서 번역 효율을 개선하는 데 사용될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 이종 요소(즉, 선천적으로 항체의 사슬(중쇄 또는 경쇄)에 대한 코딩 서열과 동일한 핵산 분자에서 발생하지 않는 요소)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 이종 프로모터, 이종 인핸서, 이종 UTR(예를 들어, 최적 번역/발현을 위해), 이종 폴리-A-꼬리 등을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 서열의 일부 버전은 또한 인트론(들)이 공동(co-) 전사 또는 후(post-) 전사 메커니즘을 통해 제거될 수 있는 정도로 인트론(들)을 포함할 수 있다. 상이한 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서, 또는 스플라이싱에 의해, 또는 둘 모두에 의해 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
핵산 분자는 핵산 구성요소를 포함하는 분자이다. 핵산 분자라는 용어는 일반적으로 단일 또는 이중 가닥일 수 있는 DNA(cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA 포함) 또는 RNA 분자를 지칭한다. 단일 가닥인 경우, 핵산 분자는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스 가닥)일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 포함) 및 이의 단편은 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 인비트로에서 번역에 의해 생성되거나, 또는 결찰(ligation), 절단(scission), 엔도뉴클레아제 작용 또는 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성될 수 있다. 이는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어와 동의어로 사용될 수 있으며, 즉 핵산 분자는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 또한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 외에 추가 요소를 포함할 수 있다. 전형적으로, 핵산 분자는 당/포스페이트-백본의 포스포디에스테르-결합에 의해 서로 공유적으로 연결된 뉴클레오티드 단량체를 포함하거나 이로 구성된 중합체이다. "핵산 분자"라는 용어는 또한 염기-변형된, 당-변형된 또는 백본-변형된 등과 같은 DNA 또는 RNA 분자와 같은 변형된 핵산 분자를 포함한다.
예를 들어, 핵산 분자는 천연 서브유닛(예를 들어 퓨린 또는 피리미딘 염기) 및/또는 비천연 서브유닛(예를 들어 모르폴린 고리)을 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 퓨린 염기에는 아데닌, 구아닌, 하이포잔틴 및 크산틴이 포함되고 피리미딘 염기에는 우라실, 티민 및 시토신이 포함된다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다.
핵산 분자는 특정 핵산 서열을 삽입, 삭제 또는 변경하도록 조작될 수 있다. 이러한 조작으로 인한 변경에는 제한 부위 도입, 코돈 사용 수정, 전사 및/또는 번역 조절 서열 추가 또는 최적화 등의 변경이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 암호화된 아미노산을 변경하기 위해 핵산을 변경하는 것도 가능하다. 예를 들어, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등) 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 항체의 아미노산 서열에 도입하는 것은 유용할 수 있다. 이러한 점 돌연변이는 이펙터 기능, 항원 결합 친화도, 번역 후 변형, 면역원성 등을 수정할 수 있고, 공유기(예를 들어 표지)의 부착을 위해 아미노산을 도입할 수 있거나 태그(예를 들어, 정제 목적을 위해)를 도입할 수 있다. 대안적으로, 핵산 서열의 돌연변이는 "침묵", 즉 유전자 코드의 중복으로 인해 아미노산 서열에 반영되지 않을 수 있다. 일반적으로 돌연변이는 특정 부위에 도입되거나 무작위로 도입된 후 선택(예를 들어 분자 진화)될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 (예시적인) 항체의 임의의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 코딩된 아미노산에 상이한 특성을 도입하도록 무작위로 또는 방향적으로(directionally) 돌연변이될 수 있다. 이러한 변화는 초기 변화가 유지되고 다른 뉴클레오티드 위치에 새로운 변화가 도입되는 반복적인 과정의 결과일 수 있다. 또한, 독립적인 단계에서 달성된 변경들이 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 (또는 (완전한) 핵산 분자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화될 수 있다. 통상의 기술자는 하기에 설명된 것과 같은 코돈 최적화를 위한 다양한 도구를 알고 있다: Ju Xin Chin, Bevan Kai-Sheng Chung, Dong-Yup Lee, Codon Optimization OnLine (COOL): a web-based multi-objective optimization platform for synthetic gene design, Bioinformatics, Volume 30, Issue 15, 1 August 2014, Pages 2210-2212; 또는: Grote A, Hiller K, Scheer M, Munch R, Nortemann B, Hempel DC, Jahn D, JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1;33(Web Server issue):W526-31; 또는 예를 들어 Genscript's OptimumGeneTM 알고리즘 (US 2011/0081708 A1에 기재됨); 또는 the GeneArt Gene Synthesis Tool (Thermo Fisher Scientific). 코돈 최적화된 서열은 부분적으로 코돈 최적화된 서열(즉, 적어도 하나의 코돈이 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화됨) 및 완전히 코돈 최적화된 서열을 포함한다.
본 개시는 또한 제1 및 제2 핵산 분자의 조합을 제공하며, 여기서 제1 핵산 분자는 본 개시의 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 제2 핵산 분자는 동일한 항체의 상응하는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 개시의 핵산 분자의 (일반적인) 특징에 관한 상기 설명은 조합의 제1 및 제2 핵산 분자에 따라서 적용된다. 예를 들어, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두는 코돈 최적화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 지정된 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 "유래된" 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 기원을 지칭한다. 특정 서열로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그것이 유래된 서열 또는 그의 일부와 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 이에 의해 "본질적으로 동일한"은 상기 정의된 바와 같은 서열 변이체를 포함한다. 특정 펩티드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 특정 펩티드 또는 단백질의 상응하는 도메인으로부터 유래될 수 있다. 이 맥락에서 "상응하는"은 동일한 기능 또는 관심 특성의 소유를 지칭한다. 따라서 펩티드, 단백질 및 핵산의 "상응하는" 부분은 당업자가 쉽게 식별할 수 있다. 유사하게, 다른(예를 들어, "소스(source)") 서열로부터 "유래된" 서열은 소스 서열에서 그의 기원을 갖는 것으로 당업자에 의해 식별될 수 있다.
벡터
본 개시의 범위 내에 추가로 포함되는 것은 본 개시에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예를 들어 발현 벡터이다. 일반적으로 벡터는 상기 설명한 핵산 분자를 포함한다.
본 개시는 또한 제1 및 제2 벡터의 조합을 제공하며, 여기서 제1 벡터는 (핵산 분자의 조합에 대해) 상기 기재된 바와 같은 제1 핵산 분자를 포함하고 제2 벡터는 (핵산 분자의 조합에 대해) 상기 기재된 바와 같은 제2 핵산 분자를 포함한다.
벡터는 일반적으로 재조합 핵산 분자, 즉 자연에서 발생하지 않는 핵산 분자이다. 따라서, 벡터는 이종 요소(즉, 자연에서 상이한 기원의 서열 요소)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 다중 클로닝 부위, 이종 프로모터, 이종 인핸서, 이종 선택 마커(상기 벡터를 포함하지 않는 세포와 비교하여 상기 벡터를 포함하는 세포를 확인하기 위해) 등을 포함할 수 있다. 본 개시의 맥락에서 벡터는 원하는 핵산 서열을 통합하거나 보유하기에 적합하다. 이러한 벡터는 저장 벡터, 발현 벡터, 클로닝 벡터, 전달 벡터 등일 수 있다. 저장 벡터는 핵산 분자의 편리한 저장을 가능하게 하는 벡터이다. 따라서, 벡터는 예를 들어, 본 개시에 따른 항체의 (중쇄 및/또는 경쇄)에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 RNA, mRNA, 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 발현 산물의 생산을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 (이종) 프로모터 서열과 같은 벡터의 서열 스트레치의 전사에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 클로닝 벡터는 통상적으로 핵산 서열을 벡터에 통합하는 데 사용될 수 있는 클로닝 부위를 포함하는 벡터이다. 클로닝 벡터는 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 박테리오파지 벡터일 수 있다. 전달 벡터는 핵산 분자를 세포 또는 유기체로 전달하는데 적합한 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다. 본 개시의 맥락에서 벡터는 예를 들어 RNA 벡터 또는 DNA 벡터일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 의미에서 벡터는 클로닝 부위, 항생제 내성 인자와 같은 선택 마커, 및 복제 기점과 같은 벡터의 증식에 적합한 서열을 포함한다. 본 출원의 맥락에서 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있다.
세포
추가적 측면에서, 본 개시는 또한 본 개시에 따른 항체를 발현하고; 및/또는 본 개시에 따른 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
이러한 세포의 예시는 진핵 세포, 예를 들어, 효모 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포; 및 E. coli를 포함하는 원핵 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 이러한 특정 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포주, 예컨대 CHO 세포 (예를 들어 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., PNAS 77:4216 (1980), CHO-KSV, ExpiCHO), 인간 배아 신장 세포 (예를 들어 HEK293T 세포), PER.C6 세포, Y0 세포, Sp2/0 세포. NS0 세포, 인간 간 세포, 예를 들어 Hepa RG 세포, 골수종 세포 또는 하이브리도마 세포이다. 포유동물 숙주 세포주의 다른 예시는 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 TM4 세포); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 원숭이 신장 세포(CV1); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 개 신장 세포(MDCK, 버팔로 랫 간 세포(BRL 3A); 마우스 유선 종양(MMT 060562); TRI 세포; MRC 5 세포 및 FS4 세포를 포함한다. 항체 생산에 적합한 포유동물 숙주 세포주는 또한 예를 들어 Yazaki and Wu,　Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)에 설명된 것들을 포함한다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 대장균(E.coli)과 같은 원핵 세포이다. E. coli와 같은 원핵 세포에서 펩티드의 발현은 잘 확립되어 있다(예를 들어, Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991) 참조). 예를 들어, 항체는 박테리아에서, 특히 글리코실화 시 생성될 수 있으며 Fc 이펙터 기능은 필요하지 않다.박테리아에서의 항체 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호; 제5,789,199호; 및 제5,840,523호를 참조한다.
본 개시의 항체를 발현시키는데 유용한 곤충 세포는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Spodoptera frugipera Sf9 세포, Trichoplusia ni BTI-TN5B1-4 세포, 및 Spodoptera frugipera SfSWT01 "MimicTM" 세포를 포함한다. 예를 들어 Palmberger et al., J. Biotechnol. 153(3-4):160-166 (2011) 참조. 특히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다.
사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 또한 단백질 코딩 벡터를 클로닝하거나 발현하기에 적합한 숙주이며, "인간화된" 글리코실화 경로를 갖는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산한다. Gerngross,　Nat. Biotech.　22:1409-1414 (2004); Li et al.,　Nat. Biotech.　24:210-215 (2006) 참조.
식물 세포는 또한 본 개시의 항체를 발현시키기 위한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, PLANTIBODIES?? technology (예를 들어 미국특허번호 제5,959,177호; 제6,040,498호; 제6,420,548호; 제7,125,978호; 및 제6,417,429호에 설명됨)은 항체를 생산하기 위해 형질전환 식물을 사용한다.
본 개시와 양립 가능한 임의의 단백질 발현 시스템은 개시된 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 발현 시스템은 Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999에 설명된 형질전환 동물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포는 발현 벡터를 갖는 본 설명에 따른 벡터로 형질감염될 수 있다. "형질감염"이라는 용어는 DNA 또는 RNA(예를 들어 mRNA) 분자와 같은 핵산 분자를 진핵 세포와 같은 세포로 도입하는 것을 의미한다. 본 설명의 맥락에서, "형질감염"이라는 용어는 핵산 분자를 포유동물 세포를 비롯한 진핵 세포와 같은 세포 내로 도입하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어 전기천공, 예를 들어 양이온성 지질 및/또는 리포솜을 기반으로 하는 리포펙션, 인산칼슘 침전, 나노입자 기반 형질감염, 바이러스 기반 형질감염, 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민 등과 같은 양이온성 중합체를 기반으로 하는 형질감염을 포함한다. 특정 실시양태에서, 도입은 비-바이러스성이다.
게다가, 본 개시의 세포는 본 명세서에 따른 벡터로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염될 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 따른 이의 항체를 발현하기 위해 형질감염될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 세포는 결합 단백질을 코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 벡터로 안정하게 형질감염된다. 그렇지 않으면, 세포는 본 명세서에 따른 항체를 인코딩하는 본 명세서에 따른 벡터로 일시적으로 형질감염될 수 있다. 임의의 현재 개시된 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 이종성일 수 있다.
관련 측면에서, 본 개시는 항체를 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 항체를 생성하기에 충분한 조건 및 시간 동안 본 개시의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
따라서, 본 개시는 또한 본 개시의 항체를 이종적으로 발현하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 세포는 항체가 완전히 또는 부분적으로 수득된 종과 상이한 종일 수 있다(예를 들어, 인간 항체 또는 조작된 인간 항체를 발현하는 CHO 세포). 일부 실시양태에서, 숙주 세포의 세포 유형은 자연에서 항체를 발현하지 않는다. 더욱이, 숙주 세포는 결합 단백질의 천연 상태에 (또는 대상 결합 단백질이 조작되거나 유래된 모체 결합 단백질의 천연 상태에) 존재하지 않는 결합 단백질에 전사 후 변형(PTM; 예를 들어 글리코실화 또는 푸코실화)을 부여할 수 있다. 이러한 PTM은 기능적 차이(예를 들어 면역원성 감소)를 초래할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 숙주 세포에 의해 생성되는 본 개시의 결합 단백질은 그의 천연 상태의 결합 단백질 또는 모체 결합 단백질과 다른 하나 이상의 전사 후 변형을 포함할 수 있다(예를 들어, CHO 세포에 의해 생산된 인간 항체는 인간으로부터 단리될 때 및/또는 천연 인간 B 세포 또는 형질 세포에 의해 생성될 때 항체와 구별되는 번역후 변형을 포함할 수 있다).
항체의 생산
본 명세서에 기재된 약학적 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 기술을 사용하여 단일클론 항체를 만드는 일반적인 방법론은 잘 알려져 있다 (Kohler, G. and Milstein, C,. 1975; Kozbar et al. 1983). 일부 실시양태에서, WO2004/076677에 기재된 대안적인 EBV 불멸화 방법이 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 참고로 포함되는 WO 2004/076677에 기재된 바와 같은 방법이 사용된다. 이 방법에서 본 개시의 항체를 생산하는 B 세포는 EBV 및 다중클론성 B 세포 활성화제로 형질전환된다. 세포 성장 및 분화의 추가 자극제는 효율을 더욱 향상시키기 위해 형질전환 단계 동안 선택적으로 첨가될 수 있다. 이러한 자극제는 IL 2 및 IL-15와 같은 사이토카인일 수 있다. 한 측면에서, IL-2는 불멸화의 효율성을 더욱 향상시키기 위해 불멸화 단계 동안 첨가되지만, 이의 사용이 필수적인 것은 아니다. 이러한 방법을 사용하여 생성된 불멸화된 B 세포는 이후 당업계에 공지된 방법 및 이로부터 단리된 항체를 사용하여 배양될 수 있다.
다른 예시된 방법은 WO 2010/046775에 기술되어 있다. 이 방법에서 형질 세포는 제한된 수로 배양되거나 마이크로웰 배양 플레이트에서 단일 형질 세포로 배양된다. 항체는 형질 세포 배양물에서 분리될 수 있다. 또한, 형질 세포 배양물로부터 RNA를 추출하고 당업계에 공지된 방법을 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. 항체의 VH 및 VL 영역은 RT-PCR(역전사효소 PCR)에 의해 증폭될 수 있고(역 전사효소 PCR), 시퀀싱되고 발현 벡터로 클로닝된 다음 HEK293T 세포 또는 다른 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. 발현 벡터에서 핵산의 클로닝, 숙주 세포의 형질감염, 형질감염된 숙주 세포의 배양 및 생산된 항체의 단리는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
항체는 원하는 경우 여과, 원심분리 및 HPLC 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 약학적 등급의 항체를 생산하는 기술을 포함하는 항체, 예를 들어 모노클로날 항체의 정제 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 본 개시의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 적절하게 사용할 수 있다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 개시의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 진핵생물, 예를 들어 포유동물의 숙주 세포 발현 시스템은 완전한 항체 분자와 같은 항체 분자의 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종 또는 하이브리도마 세포와 같으나 이에 제한되지 않는 본 명세서에 개시된 것들을 포함한다.
본 개시는 또한 본 명세서에 기재된 약학적 조성물 및 방법에 포함될 수 있는 항체 분자의 생산 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 본 개시의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 본 개시의 핵산을 코딩하는 벡터를 포함하는 (이종) 숙주 세포를 배양하고, 항체 분자를 단리하는 것을 포함한다.
중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체의 생산을 위해, 세포주는 2개의 벡터, 즉 경쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 제2 벡터로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 경쇄 폴리펩타이드 및 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 단일 벡터가 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는 (i) 예를 들어 본 개시에 따른 핵산 서열을 발현시키고, 예를 들어 본 개시에 따른 벡터를 사용하여 발현시키고, (ii) 발현된 항체 생성물을 단리시킴으로써 생산될 수 있다. 추가적으로, 상기 방법은 (iii) 단리된 항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환된 B 세포 및 배양된 형질 세포는 원하는 특이성 또는 기능의 항체를 생산하는 세포에 대해 스크리닝될 수 있다.
스크리닝 단계는 임의의 면역검정, 예를 들어 ELISA, 조직 또는 세포(형질감염된 세포 포함)의 염색, 중화 검정 또는 원하는 특이성 또는 기능을 확인하기 위해 당업계에 공지된 다수의 다른 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 상기 검정은 하나 이상의 항원에 대한 단순 인식을 기반으로 선택하거나, 원하는 기능을 추가적인 기반으로 선택할 수 있으며, 예를 들어 항원 결합 항체가 아닌 중화 항체를 선택하기 위해, 표적 세포의 특성, 예를 들어 그들의 신호 케스케이드, 그들의 모양, 그들의 성장 속도, 그들의 다른 세포에 영향을 미치는 능력, 다른 세포에 의한 영향, 다른 시약에 의한 영향, 조건 변화에 의한 영향에 대한 그들의 반응, 그들의 분화 상태를 변화시킬 수 있는 항체를 선택하기 위해 선택할 수 있다.
개별 형질전환된 B 세포 클론은 그 다음 양성 형질전환된 B 세포 배양물로부터 생산될 수 있다. 양성 세포의 혼합물로부터 개별 클론을 분리하기 위한 클로닝 단계는 제한 희석, 미세조작, 세포 분류에 의한 단일 세포 침착 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
배양된 형질 세포로부터의 핵산은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 HEK293T 세포 또는 기타 공지된 숙주 세포에서 단리, 클로닝 및 발현될 수 있다.
본 명세서에 기재된 불멸화된 B 세포 클론 또는 형질감염된 숙주 세포는 다양한 방식으로, 예를 들어 단일클론 항체의 공급원으로서, 관심 있는 단일클론 항체를 코딩하는 핵산(DNA 또는 mRNA)의 공급원으로서, 연구 등을 위해 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 본 개시에 따른 항체를 생성하는 불멸화된 B 기억 세포 또는 형질감염된 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시의 불멸화된 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포는 또한 후속 재조합 발현을 위한 항체 유전자의 클로닝을 위한 핵산의 공급원으로서 사용될 수 있다. 재조합 공급원으로부터의 발현은 예를 들어 안정성, 재현성, 배양 용이성 등의 이유로 B 세포 또는 하이브리도마로부터의 발현보다 약학적 목적으로 더 일반적일 수 있다.
따라서 본 개시는 또한 하기 단계를 포함하는 재조합 세포의 제조 방법을 제공한다: (i) 관심 항체를 코딩하는 B 세포 클론 또는 배양된 형질세포로부터 하나 이상의 핵산(예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄 mRNA)을 수득하는 단계; (ii) 핵산을 발현 벡터에 삽입하는 단계 및 (iii) 벡터를 (이종성) 숙주 세포에 형질감염시켜 해당 숙주 세포에서 관심 항체의 발현을 허용하는 단계.
유사하게, 본 개시는 또한 하기 단계를 포함하는 재조합 세포의 제조 방법을 제공한다: (i) 관심 항체를 코딩하는 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 핵산(들)을 시퀀싱하는 단계; 및 (ii) 숙주 세포에서 관심 항체의 발현을 허용하기 위해 숙주 세포 내로 삽입하기 위한 핵산(들)을 제조하기 위해 단계 (i)의 서열 정보를 사용하는 단계. 상기 핵산은 제한 부위를 도입하고, 코돈 사용을 변경하고, 및/또는 전사 및/또는 번역 조절 서열을 최적화하기 위해 단계 (i) 및 (ii) 사이에서 조작될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다.
또한, 본 개시는 또한 숙주 세포를 관심 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산으로 형질감염시키는 단계를 포함하는 형질감염된 숙주 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 핵산은 본 개시의 불멸화 B클론 또는 배양된 형질 세포로부터 유래된 핵산이다. 따라서 먼저 핵산(들)을 준비한 다음 이를 사용하여 숙주 세포를 형질감염시키는 절차는 다른 장소(예를 들어 다른 국가)의 다른 사람들에 의해 다른 시간에 수행될 수 있다.
본 개시의 이들 재조합 세포는 이후 발현 및 배양 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들은 대규모 약학적 생산을 위한 항체의 발현에 특히 유용하다. 이들은 또한 약학적 조성물의 활성 성분으로 사용될 수 있다. 정적 배양, 롤러 병 배양, 복수액(ascites fluid), 중공사형 생물반응기 카트리지, 모듈식 미니 발효기, 교반 탱크, 미세담체 배양, 세라믹 코어 관류 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 배양 기술이 사용될 수 있다.
B 세포 또는 형질 세포로부터 면역글로불린 유전자를 얻고 시퀀싱하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Chapter 4 of Kuby Immunology, 4th edition, 2000참조).
형질감염된 숙주 세포는 예를 들어 효모 및 동물 세포, 특히 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포, NS0 세포, PER.C6 또는 HKB 11 세포와 같은 인간 세포, 골수종 세포, 또는 인간 간세포)뿐만 아니라 식물 세포를 포함하는 진핵 세포를 포함하는 본원에 개시된 임의의 숙주 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 숙주 세포는 인간 세포와 같은 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 발현 숙주는 특히 그 자체가 인간에서 면역원성이 아닌 탄수화물 구조로 본 개시의 항체를 글리코실화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 숙주 세포는 무혈청 배지에서 성장할 수 있다. 추가 실시양태에서 형질감염된 숙주 세포는 동물 유래 생성물의 존재 없이 배양물에서 성장할 수 있다. 형질감염된 숙주 세포는 또한 세포주를 제공하기 위해 배양될 수 있다.
본 개시는 또한 하기 단계를 포함하는 관심 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어 중쇄 및 경쇄 유전자)를 제조하는 방법을 제공한다: (i) 본 개시에 따른 불멸화된 B 세포 클론을 제조하거나 형질세포를 배양하는 단계; (ii) B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 관심 항체를 코딩하는 핵산을 수득하는 단계. 또한, 본 개시는 하기 단계를 포함하는 관심 항체를 코딩하는 핵산 서열을 수득하는 방법을 제공한다: (i) 본 개시에 따른 불멸화된 B 세포 클론을 제조하거나 또는 형질 세포를 배양하는 단계; (ii) 관심 항체를 코딩하는 B 세포 또는 배양된 형질 세포로부터 핵산을 시퀀싱하는 단계.
본 개시는 본 개시의 형질전환된 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 수득된 핵산을 수득하는 단계를 포함하는, 관심 항체를 코딩하는 핵산 분자(들)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 따라서 먼저 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포를 얻은 다음, B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 핵산(들)을 얻는 절차는 다른 장소(예를 들어 다른 나라)에서 다른 사람들에 의해 다른 시간에 수행될 수 있다.
본 개시는 또한 하기 단계를 포함하는 본 개시에 따른 항체(예를 들어 약학적 용도를 위한)의 제조 방법을 포함한다: (i) 관심 항체를 발현하는 선택된 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 하나 이상의 핵산(예를 들어 중쇄 및 경쇄 유전자)을 수득 및/또는 시퀀싱하는 단계; (ii) 발현 벡터를 제조하기 위해 핵산(들)을 삽입하거나 핵산(들) 서열(들)을 사용하는 단계; (iii) 관심 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; (iv) 관심 항체가 발현되는 조건하에 형질감염된 숙주 세포를 배양 또는 계대배양하는 단계; 및 선택적으로 (v) 관심 항체를 정제하는 단계.
본 개시는 또한 하기 단계를 포함하는 관심 항체를 제조하는 방법을 제공한다: 관심 항체가 발현되는 조건 하에서 형질감염된 숙주 세포 집단, 예를 들어, 안정하게 형질감염된 숙주 세포 집단을 배양 또는 계대-배양하는 단계, 및 선택적으로 관심 항체를 정제하는 단계, 여기서 상기 형질감염된 숙주 세포 집단은 (i) 상기 설명된 바와 같이 제조된 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포에 의해 생산된 선택된 관심 항체를 코딩하는 핵산(들)을 제공하는 단계, (ii) 발현 벡터에 상기 핵산(들)을 삽입하는 단계, (iii) 관심 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포에 상기 벡터를 형질감염시키는 단계, (iv) 관심 항체를 생산하기 위해 삽입된 핵산을 포함하는 형질감염된 숙주 세포를 배양 또는 계대배양하는 단계에 의해 제조된다. 따라서 재조합 숙주 세포를 먼저 준비한 다음 항체를 발현하도록 배양하는 절차는 다른 장소(예를 들어 다른 국가)의 다른 사람들에 의해 매우 다른 시간에 수행될 수 있다.
약학적 조성물
본 개시는 A형 인플루엔자를 중화시키는 항체 및 약학적으로 허용되는 수성 비히클을 포함하는 약학적 조성물 ("약학적 조성물" 및 "항체 조성물"이라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용됨)을 제공한다. 비히클은 통상적으로 약학적 활성 화합물, 특히 본 개시에 따른 항체와 같은 화합물을 저장, 수송, 제형화 및/또는 투여하기에 적합한 물질인 것으로 이해된다. 예를 들어, 비히클은 약학적 활성 화합물, 특히 본 개시에 따른 항체를 저장, 수송 및/또는 투여하기에 적합한 생리학적으로 허용되는 액체일 수 있다.
본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 환자(본 명세서에서 대상체로도 지칭되며, 예방적 투여의 맥락에서 포함)로의 주사 또는 주입을 위해 제조된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 또는 뇌실내 주입을 위해 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 뇌실내, 골수내, 복강내, 척추강내, 뇌실내 또는 피하 주사를 위해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 근육내("IM") 주사용으로 제조된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 인간 대상체에 투여하기에 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 나타내는 약학적으로 허용되는 멸균 수용액이다. 본 명세서에 기재된 약학적 조성물의 제형화에 적합한 수성 비히클은 물(예를 들어, 멸균수, USP 주사용수)뿐만 아니라 등장성 비히클, 예를 들어 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 젖산 링거 주사제를 포함한다.
본 명세서에 따른 약학적 조성물은 본 명세서에 따른 A형 인플루엔자 중화 항체로부터 선택된 항체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호 3에 제시된 각각의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 서열번호: 4, 서열번호: 5, 및 서열번호 6에 제시된 각각의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 중쇄 불변 영역에 M428L 및 N434S (EU 넘버링에 따름) 돌연변이를 포함하는 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 서열번호: 7에 70% 이상(즉 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열(서열번호: 1, 서열번호: 2, 및 서열번호: 3으로 제시된 각각의 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 서열번호: 4, 서열번호: 5, 및 서열번호: 6으로 제시된 각각의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열)이 유지된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 서열번호: 7에 75% 이상(즉 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 75% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 서열번호: 7에 80% 이상(즉 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 서열번호: 7에 85% 이상(즉 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 서열번호: 7에 90% 이상(즉 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지된다. 일부 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체는 서열번호: 7에 95% 이상(즉 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지된다. 추가적 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지된다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 서열번호: 10에 따른 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 9에 따른 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물은 약 2.17 ㎍/mL의 감염 IC90의 인비트로 인플루엔자 억제를 갖는다.
약학적 조성물은 환자에게 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 촉진하게 하기에 충분한 항체 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 및 200 mg/mL로부터 선택된 농도로 포함된다. 다른 실시양태에서, 항체는 50 mg/mL 초과, 75 mg/mL 초과, 100 mg/mL 초과, 125 mg/mL 초과, 150 mg/mL 초과, 175 mg/mL 초과, 200 mg/mL 초과, 225 mg/mL 초과, 및 250 mg/mL 초과로부터 선택된 농도로 약학적 조성물에 포함된다. 다른 실시양태에서, 약학적 조성물은 50 mg/mL 내지 200 mg/mL의 범위, 75 mg/mL 내지 225 mg/mL의 범위, 또는 100 mg/mL 내지 200 mg/mL 범위로 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 항체를 125 mg/ml 내지 150 mg/ml 범위의 농도로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL의 농도로 포함한다.
본 명세서에 따른 약학적 조성물은 완충제, 계면활성제 또는 공블록 중합체, 염, 및 안정화제(예를 들어 당 알코올, 이당류 또는 다당류 안정화제, 및/또는 안정화 아미노산) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 필요하거나 원하는 경우, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 하나 이상의 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA))를 추가로 포함하도록 제형화될 수 있다.
본 개시의 약학적 조성물은 항체의 생존력을 유지하는 pH를 나타내고 유지하면서 또한 주사 또는 주입에 적합하다. 본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 일반적으로 약 5.5 내지 약 6.5 범위, 예를 들어 5.5 내지 6.5 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 5.8 내지 6.2 범위, 예를 들어 약 6.0의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, pH는 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5일 수 있다.
약학적 조성물은 원하는 pH를 달성하고 유지하기 위해 완충제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 약학적 조성물에 사용하기에 적합한 완충제는 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 숙시네이트, 포스페이트, 및 히드록시메틸아미노메탄(Tris) 완충제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 히스티딘 완충제 및 포스페이트 완충제로부터 선택된 완충제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 히스티딘은 10mM 내지 40mM 범위, 또는 20mM 내지 40mM 범위의 농도로 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 명세서에 따른 약학적 조성물은 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 또는 40 mM로부터 선택된 농도로 히스티딘을 포함한다. 추가적 실시양태에서, 약학적 조성물은 120 mg/mL 내지 160 mg/mL의 범위(예를 들어 120 mg/mL, 125 mg/mL, 130 mg/mL, 135 mg/mL, 140 mg/mL, 145 mg/mL, 150 mg/mL, 155 mg/mL, 또는 160 mg/mL)의 농도로 항체를 포함하며, 약학적 조성물, 및 히스티딘을 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 또는 40 mM의 농도로 포함한다. 다른 실시양태에서, 약학적 조성물은 약 75 mg/mL 농도의 항체를 포함하고 약 10 mM 농도의 히스티딘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 히스티딘 완충제를 포함하는 현재 개시된 약학적 조성물은 5.5 내지 6.5, 바람직하게는 5.8 내지 6.2, 예컨대 6의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 6의 pH를 갖고 히스티딘 완충제를 포함한다.
본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 또한 계면활성제 또는 삼블록 공중합체를 포함할 수 있다. 종종 "세제"라고도 하는 계면활성제는 하나 이상의 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 수성 항체 용액에서 계면활성제는 항체 기능성을 보존하고 항체 또는 기타 부형제의 용해를 돕고, 및/또는 미생물 성장을 조절하는 역할을 한다. 본 명세서에 기재된 약학적 조성물에 사용될 수 있는 계면활성제는 예를 들어 폴리소르베이트 80(트윈 80), 폴리소르베이트 20(트윈 20), 및 폴록사머 188을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 0.01% 내지 0.05% (w/v) (예를 들어 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 또는 0.05%) 범위의 계면활성제를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80(트윈 80), 폴리소르베이트 20(트윈 20), 및 폴록사머 188로부터 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 명세서의 약학적 조성물은 폴리소르베이트 80(트윈 80) 또는 폴록사머 188을 0.0% 내지 0.05% (w/v)의 범위로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서의 약학적 조성물은 폴리소르베이트 80(트윈 80) 또는 폴록사머 188을 0.02% (w/v)로 포함한다.
본 개시에 따른 약학적 조성물이 당알코올, 이당류 또는 다당류 안정화제를 포함하는 경우, 안정화제는 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 수크로스, 트레할로스, 및 덱스트란 40으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 안정화제는 이당류이다. 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 이당류를 3.0% 내지 9.0% (w/v) 범위, 바람직하게 3.6% 내지 8.6% 범위, 더욱 바람직하게 4% 내지 6% 범위, 예를 들어 4.3% 내지 6.3% 범위, 예를 들어 5.3%로 포함한다. 특정한 이러한 실시양태에서, 이당류는 수크로스이다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 수크로스를 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5%, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9%, 5.0%, 5.1%, 5.2%, 5.3%, 5.4%, 5.5%, 5.6%, 5.7%, 5.8%, 5.9%, 6.0%, 6.1%, 6.2%, 6.3%, 6.4%, 6.5%, 6.6%, 6.7%, 6.8%, 6.9%, 7.0%, 7.1%, 7.2%, 7.3%, 7.4%, 7.5%, 7.6%, 7.7%, 7.8%, 7.9%, 8.0%, 8.1%, 8.2%, 8.3%, 8.4%, 8.5%, 8.6%, 8.7%, 8.8%, 8.9%, 또는 9.0% (w/v)로 포함하며, 또는 이들 값의 임의의 2개를 경계로 하는 범위 내이거나 이들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 수크로스를 5.3% (w/v)로 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 포유동물, 예를 들어 인간 대상체에 투여하도록 조정된다. 이러한 실시양태에서, 약학적 조성물은 멸균되고, 발열원이 없도록 구체적으로 제조될 수 있다. 추가로, 약학적 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 5.5 미만의 pH를 갖지 않는다. 특정한 추가 실시양태에서, 약학적 조성물은 아세테이트 또는 시트레이트를 포함하지 않는다. 특정한 실시양태에서, 약학적 조성물은 염, 예를 들어 특정한 실시양태에서 NaCl을 포함하지 않는다. 특정한 실시양태에서, 약학적 조성물은 높은 이온 강도를 가지지 않는다. 특정한 실시양태에서, 약학적 조성물은 (i) 포스페이트 완충액을 포함하지 않고 (ii) 7 이상의 pH를 갖지 않는다.
본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 대상체에 직접 투여하기 위해 (즉 재구성 또는 혼합 단계 없이) 제조될 수 있거나, 대상체에 주사 또는 주입하기 전에 수성 비히클에서 재구성될 동결 건조된 물질로서 제조될 수 있다. 대상체에 직접 투여하기 위해, 본 개시에 따른 약학적 조성물은 예를 들어 미리 충전된 주사기 또는 유리 바이알과 같은 바이알에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서 본 개시의 약학적 조성물은 밀봉된 용기에 공급된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 조합된 조성물이 대상체에 투여되기 직전에 재구성되도록 설계된 키트 형태일 수 있다. 예를 들어 동결건조된 항체는 멸균수 또는 멸균 버퍼와 함께 키트 형태로 제공될 수 있다.
의학적 치료 및 용도
추가적 측면에서, 본 개시는 A형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에 본 개시에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 본 개시는 하기를 포함하는 방법으로 A형 인플루엔자 바이러스에 의해 감염의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다: 이를 필요로 하는 대상체에 본 개시에 따른 약학적 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 다양한 약동학("PK") 매개변수를 사용하여 본 명세서에 제공된 방법 및 약학적 조성물을 기술하거나 또는 특성화한다. 본 개시의 맥락에서, 본 명세서에 제공된 방법과 관련하여 참조된 PK 매개변수는 WinNonlin® 8.2 (Certara L.P., Princeton, NJ)의 표준 비구획 방법을 사용하여 유도된다. PK 매개변수를 평가하기 위한 항체 혈청 농도의 수집에 관한 추가 세부사항은 실시예 7에 언급된 인간 임상 연구와 관련하여 설명되어 있다. "t1/2"라는 용어는 대상체에 투여되는 약학적 조성물에 포함된 항체의 소실 반감기를 지칭한다. "Clast"라는 용어는 일반적으로 마지막 측정 가능한 혈장 농도를 나타낸다(즉 그 이후에 물질이 혈장에서 측정 가능한 농도로 존재하지 않음). 본 명세서의 맥락에서, "Clast"는 약학적 조성물의 투여 후 140일에 측정된 혈장 농도를 지칭한다.
A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방은 특히 예방적 환경을 의미하며, 여기서 대상체는 A형 인플루엔자 바이러스 감염으로 진단되지 않거나 (진단이 수행되지 않았거나 진단 결과가 음성) 및/또는 대상체가 A형 인플루엔자 바이러스의 감염 증상을 나타내거나 또는 경험하지 않는다. A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방은 임산부, 어린이(예를 들어 59개월 미만 어린이), 노인, 만성 의학적 상태를 갖는 개인(예를 들어 만성 심장, 폐, 신장, 대사, 신경발달, 간 또는 혈액 질환), 면역억제 상태를 갖는 개인(예를 들어 HIV/AIDS, 화학요법 또는 스테로이드 또는 악성 종양)와 같이, 감염시 심각한 질병 또는 합병증의 위험이 더 큰 대상에서 특히 유용하다. 게다가, A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방은 또한 예를 들어 노출 증가로 인해 A형 인플루엔자 감염에 걸릴 위험이 더 큰 대상, 예를 들어 공공장소에서 일하거나 체류하는 대상, 특히 의료 종사자에게 특히 유용하다.
대조적으로, 치료 환경에서, 대상체는 통상적으로 A형 인플루엔자 바이러스에 감염되고, A형 인플루엔자 바이러스 감염으로 진단되고, 및/또는 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 증상을 보인다. 참고로, A형 인플루엔자 바이러스 감염의 "치료(treatment)" 및 "치료(therapy)"/"치료의(therapeutic)"는 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (완전한) 치유뿐만 아니라 약화/감소를 포함한다(예를 들어 감염 및/또는 증상 중등도, 증상의 횟수, 감염 및/또는 증상의 기간, 또는 이의 임의의 조합의 약화/감소).
본 명세서에 기재된 방법은 A형 인플루엔자 바이러스 감염으로 진단된 대상체 또는 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 증상을 보이는 대상체에서 A형 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 방법은 본 개시에 따른 약학적 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. A형 인플루엔자로 진단되거나 그 증상을 보이는 대상체를 치료하는 방법의 특정 실시양태에서, 약학적 조성물의 투여 이후, 대상체는 (i) 기침, 인후통, 콧물, 및 울혈로부터 선택된 하나 이상의 호흡기 증상의 수 및/또는 중증도가 감소하며, 및/또는 (ii) 발열, 오한, 근육통, 두통, 권태감, 및 피로로부터 선택된 하나 이상의 전신 증상의 수 및/또는 중증도가 감소한다. 본 개시의 목적 및 본 명세서에 제공된 방법의 설명을 위해, "발열"이라는 용어는 구강 온도가 >38°C (100.4°F)인 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 방법은 대상체에서 A형 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하기 위한 방법을 포함하며, 여기서 상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 본 개시에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 방법의 특정 실시양태에서, 약학적 조성물의 투여 이후, 대상체는 (i) 기침, 인후통, 콧물, 및 울혈로부터 선택된 하나 이상의 호흡기 증상의 수 및/또는 중증도가 감소하며, 및/또는 (ii) 약학적 조성물의 투여 다음 적어도 4주 이후 발열, 오한, 근육통, 두통, 권태감, 및 피로로부터 선택된 하나 이상의 전신 증상의 수 및/또는 중증도가 감소한다. A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 방법의 다른 실시양태에서, 약학적 조성물의 투여 이후, 대상체는 (i) 기침, 인후통, 콧물, 및 울혈로부터 선택된 하나 이상의 호흡기 증상의 수 및/또는 중증도가 감소하며, 및/또는 (ii) 약학적 조성물의 투여 다음 적어도 12주 이후 발열, 오한, 근육통, 두통, 권태감, 및 피로로부터 선택된 하나 이상의 전신 증상의 수 및/또는 중증도가 감소한다. A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 방법의 또 다른 실시양태에서, 약학적 조성물의 투여 이후, 대상체는 (i) 기침, 인후통, 콧물, 및 울혈로부터 선택된 하나 이상의 호흡기 증상의 수 및/또는 중증도가 감소하며, 및/또는 (ii) 약학적 조성물의 투여 다음 적어도 20주 이후 발열, 오한, 근육통, 두통, 권태감, 및 피로로부터 선택된 하나 이상의 전신 증상의 수 및/또는 중증도가 감소한다. 본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 방법의 일부 실시양태에서, 약학적 조성물을 투여하는 것은 대상체에 치료학적 유효량의 약을 단일 계절 투여(seasonal administration)하는 것만 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물의 투여는 단일 투여 이후 적어도 10주, 적어도 15주, 및 적어도 20주로부터 선택된 기간 동안 본 개시에 따른 A형 인플루엔자 중화 항체의 전신 노출을 대상체에 제공한다.
현재 개시된 약학적 조성물의 투여로부터 감소된 증상의 감소된 수 및/또는 중증도에 대한 본 명세서의 언급은 개시된 약학적 조성물을 받지 않은 기준 대상체와의 비교를 설명하는 것으로 이해될 것이다. 기준 대상체는 예를 들어 (i) 이전 기간(예를 들어 이전 A형 인플루엔자 시즌) 동안 동일한 대상체, (ii) 동일하거나 유사한 대상: 연령 또는 연령 그룹; 성별; 임신 상태; 만성 의학적 상태(예를 들어 만성 심장, 폐, 신장, 대사, 신경발달, 간 또는 혈액 질환) 또는 이의 결핍; 및/또는 면역억제 상태 또는 이의 결핍; 또는 (iii) A형 인플루엔자 바이러스 시즌 동안 집단(예를 들어 동일하거나 유사한 연령 또는 연령 범위 및/또는 일반적인 건강 상태를 포함하는 구역(local), 지역(regional), 또는 국가(national)) 내 통상적인 대상체일 수 있다. 예방은 예를 들어 진단된 A형 인플루엔자 감염의 발병 실패 및/또는 전체 A형 인플루엔자 시즌의 일부 동안, 또는 전체 A형 인플루엔자 시즌 동안 A형 인플루엔자 감염과 관련된 증상의 결여에 의해 결정될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 A형 인플루엔자 감염의 즉각적인 위험이 있는 대상체에 본 개시에 따른 치료학적 유효량의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. A형 인플루엔자 감염의 즉각적인 위험은 A형 인플루엔자 유행 중에 통상적으로 발생한다. A형 인플루엔자 바이러스는 순환하며 질병의 계절적인 유행병을 일으키는 것으로 알려져 있다 (WHO, Influenza (Seasonal) Fact sheet, November 6, 2018). 온대 기후에서는 계절성 전염병이 주로 겨울에 발생하고, 열대 지방에서는 인플루엔자가 일년 내내 발생하여 더 불규칙하게 발병한다. 예를 들어, 북반구에서는 A형 인플루엔자 유행의 위험이 11월, 12월, 1월, 2월 및 3월에 높은 반면, 남반구에서는 A형 인플루엔자 유행의 위험이 5월, 6월, 7월, 8월 및 9월에 높다.
일부 실시양태에서, 본 개시에 따른 약학적 조성물은 A형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에 사용되며, 여기서 약학적 조성물은 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (가능한) 최대 3개월 전, A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (가능한) 최대 1개월 전, A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (가능한) 최대 2주 전, A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (가능한) 최대 1주 전에 투여된다. 이러한 실시양태에서, A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 대상체에 약학적 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 약학적 조성물은 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (가능한) 최대 6개월 전(예를 들어 A형 인플루엔자 바이러스에 대한 예상되는 또는 가능한 노출 전 최대 6개월 포함), A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (가능한) 최대 3개월 전, A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (가능한) 최대 2주 전, A형 인플루엔자 바이러스 감염의 (가능한) 최대 1주 전에 투여된다. 특정한 다른 실시양태에서, A형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 대상체에 치료학적 유효량의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 약학적 조성물은 A형 인플루엔자의 첫번째 증상이 나타나기 전 최대 6일, 최대 5일, 최대 4일, 최대 3일, 또는 최대 2일 전에 투여된다. 이러한 치료 스케쥴은 A형 인플루엔자 감염의 예방용 약학적 조성물의 사용에 특히 적합할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 본 개시에 따른 약학적 조성물이 예방을 위해 사용되는 경우, 본 개시에 따른 방법은 인플루엔자 시즌의 시작 전 1~2개월 이내에, 또는 인플루엔자 시즌의 첫 1~2개월 이내에 대상체에 본 개시에 따른 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 본 개시에 따른 약학적 조성물의 첫번째 투여 이후, 하나 이상의 후속 투여가 따를 수 있다. 이러한 실시양태는, 예를 들어 두달에 한번, 세달에 한번, 네달에 한번, 다섯달에 한번, 및 여섯달에 한번으로부터 선택된 간격으로 대상체에 본 명세서에 따른 약학적 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 다른 이러한 실시양태는 예를 들어 매년 1회 및 매년 2회로부터 선택된 간격으로 본 명세서에 따른 약학적 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 본 개시에 따른 방법을 포함한다. 또 다른 이러한 실시양태에서, 본 개시에 따른 방법은 매년 1회 및 매년 2회, 또는 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 및 10년으로부터 선택된 전체 치료 기간 동안 매년 2회로부터 선택된 간격으로 본 명세서에 따른 약학적 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 각각의 방법에서, 치료학적 유효량(예방, 치료, 또는 이들 모두의 목적이든 상관 없음)을 투여하는 것은 A형 인플루엔자 중화 항체의 치료학적 유효량을 전달하는 약학적 조성물의 양을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것은 약 50 mg 내지 약 3,000 mg 범위의 항체 투여량을 전달하는 것을 포함한다. 약학적 조성물 내 항체의 농도에 따라, 원하는 항체 투여량을 달성하는 것은 단일 투여의 일부로 다중 주사 또는 주입이 필요할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 600 mg의 항체 투여량을 투여 받고, 약학적 조성물이 150 mg/ml의 농도로 A형 인플루엔자 중화 항체를 포함하는 2ml의 수용액을 포함하는 준비된 주사 바이알에 제공되는 경우, 600 mg 투여량의 투여는 2회 주사를 요구할 것이다(각 주사 바이알은 300 mg의 항체를 포함한다). 정해진 용량을 투여하기 위해 여러 번 주사 또는 주입이 필요한 경우에도, 용량은 "단일 용량"이라고 지칭하며 투여는 "단일 투여"로 간주한다. 일반적으로, 단일 정의된 투여량을 투여하기 위해 다중 주사 또는 주입이 필요한 경우, 다중 주사 또는 주입은 약 5분 이하, 약 15분 이하, 약 30분 이하, 약 1시간 이하, 약 2시간 이하, 약 4시간 이하, 약 6시간 이하, 약 1일 이하, 약 1주일 이하, 또는 약 1달 이하의 기간 동안 투여된다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정한 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체의 치료학적 유효량을 전달하는 것은 A형 인플루엔자 중화 항체의 약 60 mg 내지 약 2,500 mg 범위인 단일 투여량을 대상체에 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 설명된 방법은 대상체에 A형 인플루엔자 중화 항체의 최대 60 mg의 투여량, 최대 300 mg의 투여량, 최대 1,200 mg의 투여량, 최대 1,800 mg의 투여량, 최대 2,000 mg의 투여량, 및 최대 2,500 mg의 투여량으로부터 선택된 단일 투여량을 전달하기에 충분한 약학적 조성물의 양을 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 설명된 방법은 대상체에 A형 인플루엔자 중화 항체의 60 mg, 300 mg, 1,200 mg, 및 1,800 mg으로부터 선택된 단일 투여량을 전달하기에 충분한 약학적 조성물의 양을 전달하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 설명된 방법은 대상체에 A형 인플루엔자 중화 항체의 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1,000 mg, 1,100 mg, 및 1,200 mg으로부터 선택된 단일 투여량을 제공하기에 충분한 약학적 조성물의 양을 전달하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법의 특정한 실시양태에서, 약학적 조성물의 투여는 단일 투여 이후 대상체에 적어도 10주, 적어도 15주, 및 적어도 20주로부터 선택된 기간 동안 본 개시에 따른 A형 인플루엔자 중화 항체의 전신 노출을 제공한다. 이러한 특정한 실시양태에서, A형 인플루엔자 중화 항체는 인간 대상체에서 40일 초과의 t1/2를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법, 약학적 조성물, 및 A형 인플루엔자 중화 항체는 45일 초과, 50일 초과, 55일 초과, 60일 초과, 65일 초과로부터 선택된 A형 인플루엔자 중화 항체의 t1/2을 제공할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법, 약학적 조성물, 및 A형 인플루엔자 중화 항체는 40 내지 70일 사이, 45 내지 65일 사이, 및 50 내지 60일 사이로부터 선택된 A형 인플루엔자 중화 항체의 t1/2를 제공할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법, 약학적 조성물, A형 인플루엔자 중화 항체는 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일, 및 68일 중 어느 하나로부터 선택된 A형 인플루엔자 중화 항체의 t1/2을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 60 mg의 A형 인플루엔자 중화 항체의 단일 용량을 대상체에게 전달하기에 충분한 양의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 특정 실시양태에서, A형 인플루엔자 중화 항체의 단일 60mg 용량의 전달은 투여 후 최대 140일 동안 항체가 약 1㎍/mL 내지 약 4.5㎍/mL의 혈청 농도로 대상체 내에 존재하도록 연장된 기간에 걸쳐 대상체 내 항체의 전신 노출을 제공한다.
본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 300 mg의 A형 인플루엔자 중화 항체의 단일 용량을 대상체에게 전달하기에 충분한 양의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 특정 실시양태에서, A형 인플루엔자 중화 항체의 단일 300mg 용량의 전달은 투여 후 최대 140일 동안 항체가 약 5㎍/mL 내지 약 26.5㎍/mL의 혈청 농도로 대상체 내에 존재하도록 연장된 기간에 걸쳐 대상체 내 항체의 전신 노출을 제공한다.
본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 1,200 mg의 A형 인플루엔자 중화 항체의 단일 용량을 대상체에게 전달하기에 충분한 양의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 특정 실시양태에서, A형 인플루엔자 중화 항체의 단일 1,200mg 용량의 전달은 투여 후 최대 140일 동안 항체가 약 27㎍/mL 내지 약 110 ㎍/mL의 혈청 농도로 대상체 내에 존재하도록 연장된 기간에 걸쳐 대상체 내 항체의 전신 노출을 제공한다.
본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 1,800 mg의 A형 인플루엔자 중화 항체의 단일 용량을 대상체에게 전달하기에 충분한 양의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 특정 실시양태에서, A형 인플루엔자 중화 항체의 단일 1,800mg 용량의 전달은 투여 후 최대 140일 동안 항체가 약 33.5㎍/mL 내지 약 150 ㎍/mL의 혈청 농도로 대상체 내에 존재하도록 연장된 기간에 걸쳐 대상체 내 항체의 전신 노출을 제공한다.
본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 임의의 방법에서, 약학적 조성물은 주사 또는 주입을 통해 투여될 수 있다. 주입에 의해 투여되는 경우, 약학적 조성물은 예를 들어 정맥내, 동맥내 또는 뇌실내 주입에 의해 투여될 수 있다. 주사에 의해 투여되는 경우, 약학적 조성물은 예를 들어 정맥내, 동맥내, 뇌실내, 골수내, 복강내, 척추강내, 뇌실내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 근육내("IM") 주사를 통해 투여된다.
본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법의 특정 실시양태에서, 약학적 조성물 및 A형 인플루엔자 중화 항체는 본 명세서에 기재된 양 및 용량으로 투여될 때 대상체에 의해 내약성이 우수하다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(CTCAE)에 따라 대상체가 유해 사례(AE)를 경험하게 하지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(CTCAE)에 따라 대상체가 중등도(moderate)의 유해 사례(AE)를 경험하게 하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법은 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(CTCAE)에 따라 대상체가 심각한 유해 사례(AE)를 경험하게 하지 않는다.
인플루엔자 감염의 예방 및/또는 치료 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 18세 내지 65세이다. 이러한 특정 실시양태에서, 대상체는 18 kg/m2 내지 32 kg/m2 의 범위 및 18 kg/m2 내지 35 kg/m2의 범위로부터 선택된 체질량 지수를 갖는다.
조합 요법
본 개시에 따른 방법 및 용도에서 본 개시에 따른 약학적 조성물의 투여는 단독 또는 인플루엔자 감염의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는 공동 작용제(또한 본 명세서에서 "추가 활성 성분"으로 지칭됨)와 조합하여 수행될 수 있다.
본 개시는 본 개시에 따른 약학적 조성물의 투여를 포함하며, 여기서 이는 인플루엔자 치료 및/또는 예방에 유용한 공동-작용제 또는 다른 치료 요법 이전, 이와 동시에 또는 이후에 대상체에게 투여된다. 상기 공동 작용제와 조합하여 투여되는 상기 약학적 조성물은 동일하거나 상이한 조성물(들) 및 동일하거나 상이한 투여 경로(들)로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "조합 요법", "조합 투여", "조합으로 투여" 등과 같은 표현은 약물의 복합 작용("병용" 투여됨)을 의미한다. 이를 위해 조합 약물은 일반적으로 작용 부위에 동시에 및/또는 겹치는 시간 창 내에 존재한다. 두 약물의 효과가 상호 작용할 수 있도록 다른 약물이 투여되는 동안 약물 중 하나의 효과가 여전히 진행 중일 수도 있다(약물 자체가 더 이상 검출 가능하지 않을 수도 있음). 그러나 다른 약물보다 훨씬 이전에(예를 들어 1개월, 2개월, 3개월 이상 또는 1년 이상) 투여되어 더 이상 검출 가능한 수준으로 존재하지 않는(또는 그 효과가 지속되지 않는) 약물은 다른 약물이 투여되는 경우 일반적으로 "조합"으로 투여되는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 별개의(예를 들어 연속적인) 인플루엔자 시즌에 투여되는 인플루엔자 약물(medications)은 일반적으로 "조합"으로 투여되지 않는다.
상기 다른 치료 요법 또는 공동 작용제는 예를 들어 항바이러스제(antiviral)일 수 있다. 항바이러스제(또는 "항바이러스제(antiviral agent)" 또는 "항바이러스 약물")는 바이러스 감염을 치료하기 위해 특별히 사용되는 약물 종류를 나타낸다. 박테리아에 대한 항생제와 마찬가지로 항바이러스제는 다양한 바이러스에 대해 유용한 광범위한 항바이러스제 또는 특정 바이러스에 사용되는 특정 항바이러스제일 수 있다. 대부분의 항생제와 달리 항바이러스 약물은 일반적으로 표적 병원체를 파괴하지 않으며; 대신 통상적으로 그들의 발달을 억제한다.
따라서, 본 개시의 또 다른 측면에서, 본 개시에 따른 약학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 (의학적) 용도를 위한 항바이러스제와 조합하여 (이전, 동시에 또는 후에) 투여된다.
일반적으로 항바이러스제는 광범위한 항바이러스제(인플루엔자 바이러스 및 기타 바이러스에 유용함) 또는 인플루엔자 바이러스 특이적 항바이러스제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항바이러스제는 항체가 아니다. 예를 들어, 항바이러스제는 소분자 약물일 수 있다. 인플루엔자 예방 및/또는 치료에 유용한 소분자 항바이러스제의 예시는 Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된다. Wu et al., 2017에 기술된 바와 같이, 통상의 기술자는 인플루엔자의 예방 및/또는 치료에 유용한 항바이러스제에 익숙하다. 인플루엔자에 유용한 추가적인 항바이러스제는 Davidson S. Treating Influenza Infection, From Now and Into the Future. Front Immunol. 2018;9:1946; and in: Koszalka P, Tilmanis D, Hurt AC. Influenza antivirals currently in late-phase clinical trial. Influenza Other Respir Viruses. 2017;11(3):240-246에 설명된다.
인플루엔자의 예방 및/또는 치료에 유용한 항바이러스제는 (i) 인플루엔자 바이러스 자체의 기능성 단백질을 표적으로 하는 제제 및 (ii) 숙주 세포, 예를 들어 상피를 표적으로 하는 제제를 포함한다.
숙주 세포 표적화제는 티아졸리드 계열의 광역 항바이러스제, 시알리다제 융합 단백질, III형 인터페론, Bcl-2(B 세포 림프종 2) 억제제, 프로테아제 억제제, V-ATPase 억제제 및 항산화제를 포함한다. 티아졸리드 계열의 광범위한 항바이러스제의 예시로는 혈액에서 활성 대사 형태 티조사니드(tizoxanide)(TIZ)로 빠르게 탈아세틸화되는 니타조사니드(nitazoxanide)(NTZ), 및 NTZ와 구조적으로 관련된 RM5061과 같은 2세대 티아졸리드 화합물을 포함한다. 플루다제(Fludase)(DAS181)는 시알리다제 융합 단백질의 예시이다. III형 IFN은 예를 들어 IFNl를 포함한다. Bcl-2 억제제의 비제한적인 예시는 ABT-737, ABT-263, ABT-199, WEHI-539 및 A-1331852를 포함한다 (Davidson S. Treating Influenza Infection, From Now and Into the Future. Front Immunol. 2018;9:1946). 프로테아제 억제제의 예시에는 나파모스타트, 류펩틴, 엡실론-아미노카프론산, 카모스타트 및 아프로티닌이 포함된다. V-ATPase 억제제에는 NorakinR, ParkopanR, AntiparkinR 및 AkinetonR이 포함된다. 항산화제의 예시로는 알파-토코페롤이 있다.
일부 실시양태에서, 항바이러스제는 인플루엔자 바이러스 자체의 기능성 단백질을 표적화하는 제제이다. 예를 들어, 항바이러스제는 혈구응집소가 아닌 인플루엔자 바이러스의 기능성 단백질을 표적으로 할 수 있다. 일반적으로, 인플루엔자 바이러스의 기능성 단백질을 표적으로 하는 항바이러스제는 진입 억제제, 혈구응집소 억제제, 뉴라미니다제 억제제, 인플루엔자 중합효소 억제제(RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp) 억제제), 뉴클레오캡시드 단백질 억제제, M2 이온 채널 억제제 및 아르비돌 염산염을 포함한다. 진입 억제제의 비제한적인 예시에는 글리시리진산(글리시리진) 및 글리시레틴산과 같은 트리테르페노이드 유도체; 사포닌; 우랄사포닌 M-Y(예를 들어 우랄사포닌 M); 덱스트란 설페이트(DS); 실리마린; 커큐민; 및 콘카나마이신 A(Concanamycin A), 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1) 및 클로로퀸과 같은 리소소모트로픽(lysosomotropic) 제제가 포함된다. 혈구응집소 억제제의 비제한적 예시에는 BMY-27709; 스타키플린; 고시폴(Gossypol), 루틴(Rutin), 퀘르세틴(Quercetin), 실로핀(Xylopine) 및 테아플라빈(Theaflavins)과 같은 천연 제품; Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 화합물 1과 같은 3가 글리코펩타이드 모방체; Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 화합물 2와 같은 포도카프릭산(podocarpic acid) 유도체; Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 화합물 3과 같은 천연물 펜타사이클릭 트리테르페노이드, 및 네오에키눌린 B와 같은 프레닐화 인돌 디케토피페라진 알칼로이드가 포함된다. 뉴클레오캡시드 단백질 억제제의 비제한적 예시는 뉴클레오진, 시클로헥시미드, 나프록센 및 잉가비린을 포함한다. M2 이온 채널 억제제의 비제한적인 예시는 승인된 M2 억제제인 아만타딘 및 리만타딘 및 이의 유도체; 뿐만 아니라 스페르민, 스페르미딘, 스피로피페리딘 및 피나나민 유도체와 같은 비-아다만탄 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항바이러스제는 뉴라미니다제(NA) 억제제 및 인플루엔자 중합효소 억제제(RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp) 억제제)로부터 선택된다. 뉴라미니다제(NA) 억제제의 비제한적 예시는 자나미비르; 오셀타미비르; 페라미비르; 라니나미비르; Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 화합물 4-10과 같은 이의 유도체; 및 이량체 자나미비르 접합체(예를 들어 Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 것); 벤조산 유도체 (예를 들어 Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 것; 예를 들어 화합물 11-14); 피롤리딘 유도체 (예를 들어 Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 것; 예를 들어 화합물 15 - 18); 징케틴-시알산 접합체; 플라바논 및 플라보노이드 이소쿠텔라레인 및 그 유도체 (예를 들어 Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 것); AV5080; 및 N-치환된 오셀타미비르 유사체 (예를 들어 Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 것)을 포함한다. 인플루엔자 중합효소 억제제 (RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp)) 억제제의 비제한적 예시는 RdRp 교란 화합물, 예를 들어 Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 설명된 것들; PB2 캡 결합 억제제, 예를 들어 JNJ63623872 (VX-787); 캡 의존성 엔도뉴클레아제 억제제, 예를 들어 발록사비르 말복실 (S-033188); PA 엔도뉴클레아제 억제제, 예를 들어 AL-794, EGCG 및 이의 지방족 유사체, N-히드록삼산 및 N-히드록시이미드, 플루티미드 및 그 방향족 유사체, 테트라민산 유도체, L-742,001, ANA-0, 폴리페놀릭 카테킨, 페네틸-페닐프탈리미드 유사체, 거대고리 비스비벤질, 피리미디놀, 풀러렌, 히드록시퀴놀리논, 히드록시피리디논, 히드록시피리다지논, 트리히드록시-페닐-함유 화합물, 2-히드록시-벤즈아미드, 히드록시-피리미디논, β-디케토산 및 이의 바이오이소스테릭(bioisosteric) 화합물, 티오세미카르바존, 비스디히드록시인돌-카르복사미드, 및 피리도-피페라진디온(Endo-1); 및 리바비린, 파비피라비르(T-705)와 같은 뉴클레오시드 및 핵염기 유사체 억제제, 2'-데옥시-2'-플루오로구아노신(2'-FdG), 2'-치환된 카르바-뉴클레오시드 유사체, 6-메틸-7-치환-7-데아자 퓨린 뉴클레오시드 유사체 및 2'-데옥시-2'-플루오로시티딘(2'-FdC)을 포함한다. 예를 들어, 항바이러스제는 자나미비르, 오셀타미비르 또는 발록사비르일 수 있다.
따라서, 본 개시에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 추가 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 개시에 따른 A형 인플루엔자 중화 항체는 추가 활성 성분(공작용제)과 동일한 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 대안적으로, 본 개시에 따른 A형 인플루엔자 중화 항체 및 추가 활성 성분(공동작용제)은 별개의 약학적 조성물에 포함된다(예를 들어, 동일한 조성물에 포함되지 않음). 따라서, 하나 이상의 추가 활성 성분(공동작용제)이 예상되는 경우, 본 개시에 따른 각각의 추가 활성 성분(공동작용제) 및 항체, 또는 항원 결합 단편은 상이한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 상이한 약학적 조성물은 조합/동시에 또는 별도의 시간에 및/또는 별도의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 개시에 따른 A형 인플루엔자 중화 항체 및 추가 활성 성분(공동 작용제)은 부가적 또는 시너지적 치료 효과를 제공할 수 있다. "시너지"이라는 용어는 각각의 활성제의 개별 효과의 합보다 더 큰 2개 이상의 활성제의 조합된 효과를 설명하는 데 사용된다. 따라서, 2종 이상의 제제의 조합된 효과가 활성 또는 과정의 "시너지적 억제"를 초래하는 경우, 활성 또는 과정의 억제가 각각의 각각의 활성제의 억제 효과의 합보다 더 큰 것으로 의도된다. "시너지적 치료 효과"라는 용어는 치료 효과(여러 매개변수 중 임의의 것에 의해 측정됨)가 각각의 개별 요법으로 관찰된 개별 치료 효과의 합보다 큰 두 가지 이상의 요법의 조합으로 관찰된 치료 효과를 나타낸다.
따라서, 본 개시는 또한 (i) 본 명세서에 기재된 A형 인플루엔자 중화 항체, 및 (ii) 상기 기재된 바와 같은 항바이러스제의 조합을 제공한다.
본 개시는 다음과 같은 예시적인 구현예(embodiments)들을 포함한다.
구현예 1. 각각 서열번호: 1, 서열번호: 2 및 서열번호: 3에 제시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 각각 서열번호: 4, 서열번호: 5 및 서열번호: 6에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및 중쇄의 불변 영역에서 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하는 항체.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 항체가 A형 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소에 결합하는 것인 항체.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 항체가 A형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염을 중화시키는 것인 항체.
구현예 4. 구현예 3에 있어서, 상기 항체는, 중쇄의 불변 영역에서 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하지 않는 점에서만 상기 항체와 다른 비교 항체로 A형 인플루엔자의 중화에 필요한 투여량의 절반을 초과하지 않는 투여량으로 A형 인플루엔자 감염을 중화시키는 것인 항체.
구현예 5. 구현예 4에 있어서, 상기 투여량은 상기 비교 항체로 A형 인플루엔자를 중화시키는데 필요한 투여량의 1/3을 초과하지 않는 항체.
구현예 6. 구현예 4 또는 5에 있어서, 상기 투여량은 상기 비교 항체로 A형 인플루엔자를 중화시키는데 필요한 투여량의 1/5을 초과하지 않는 항체.
구현예 7. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 항체인 항체.
구현예 8. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체가 단일클론 항체인 항체.
구현예 9. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체가 IgG 타입인 항체.
구현예 10. 구현예 6에 있어서, 항체가 IgG1 타입인 항체.
구현예 11. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체의 경쇄는 카파 경쇄인 항체.
구현예 12. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열번호: 7에 적어도 70% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 적어도 70% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR 서열은 구현예 1에 정의된 바와 같이 유지되는 항체.
구현예 13. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열번호: 7에 적어도 75% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 적어도 75% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR 서열은 구현예 1에 정의된 바와 같이 유지되는 항체.
구현예 14. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열번호: 7에 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR 서열은 구현예 1에 정의된 바와 같이 유지되는 항체.
구현예 15. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열번호: 7에 적어도 85% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 적어도 85% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR 서열은 구현예 1에 정의된 바와 같이 유지되는 항체.
구현예 16. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열번호: 7에 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR 서열은 구현예 1에 정의된 바와 같이 유지되는 항체.
구현예 17. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열번호: 7에 적어도 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 적어도 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR 서열은 구현예 1에 정의된 바와 같이 유지되는 항체.
구현예 18. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDR 서열은 구현예 1에 정의된 바와 같이 유지되는 항체.
구현예 19. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체의 CH3 영역은 M428L 및 N434S 외에 임의의 추가적인 돌연변이를 포함하지 않는 항체.
구현예 20. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체의 Fc 영역은 M428L 및 N434S 외에 임의의 추가적인 돌연변이를 포함하지 않는 항체.
구현예 21. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체가 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
구현예 22. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 항체가 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 갖는 항체.
구현예 23. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, A형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항체로서, 선택적으로 항체 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물은 인비트로에서(in vitro) 인플루엔자 감염 억제 IC90이 약 2.17μg/mL인 항체.
구현예 24. 구현예 23에 있어서, 항체가 예방적으로 투여되는 것인 항체.
구현예 25. 구현예 23 또는 24 중 어느 하나에 있어서, 치료될 대상체는 A형 인플루엔자 감염의 즉각적인 위험에 있는 항체.
구현예 26. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자.
구현예 27. 구현예 26의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
구현예 28. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 항체를 발현하거나, 또는 구현예 27의 벡터를 포함하는 세포.
구현예 29. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 항체, 구현예 26의 핵산, 구현예 27의 벡터, 또는 구현예 28의 세포, 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
구현예 30. 구현예 29에 있어서, 항체를 150 mg/mL로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 31. 구현예 30 또는 31에 있어서, 물(예를 들어 USP 주사용수, 또는 US 멸균 주사용수)을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 32. 구현예 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물에 히스티딘을 선택적으로 10 mM 내지 40 mM, 바람직하게 20 mM의 농도로 추가로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 33. 구현예 29 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 당, 예를 들어 이당류, 예를 들어 수크로스를 선택적으로 3.0% 내지 9.0% (w/v)의 범위, 바람직하게 3.6% 내지 8.6%의 범위, 더욱 바람직하게 4% 내지 6%의 범위로 추가로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 34. 구현예 29 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제, 예를 들어 삼중블록 공중합체, 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머 188, 바람직하게 폴리소르베이트 80(PS80)을 선택적으로 0.01% 내지 0.05% (w/v)의 범위, 바람직하게 0.02% (w/v)로 추가로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 35. 구현예 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 5.5 내지 6.5의 범위, 또는 5.8 내지 6.2의 범위의 pH 또는 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5, 바람직하게 6.0의 pH를 갖는 약학적 조성물.
구현예 36. A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방, 치료 또는 약화용 약제의 제조를 위한 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 항체, 구현예 26의 핵산, 구현예 27의 벡터, 구현예 28의 세포 또는 구현예 29 내지 35 중 어느 하나의 약학적 조성물의 용도.
구현예 37. A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 항체, 구현예 26의 핵산, 구현예 27의 벡터, 구현예 28의 세포 또는 구현예 29 내지 35 중 어느 하나의 약학적 조성물.
구현예 38. 구현예 37에 있어서, 상기 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학적 조성물은 예방적으로 투여되는 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
구현예 39. 구현예 37 또는 구현예 38에 있어서, 상기 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물은 항바이러스제와 조합하여 투여되는 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
구현예 40. 구현예 39에 있어서, 상기 항바이러스제는 뉴라미니다제 억제제 및 인플루엔자 중합효소 억제제로부터 선택되는 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
구현예 41. 구현예 39 또는 40에 있어서, 상기 항바이러스제는 오셀타미비르, 자나미비르 및 발록사비르로부터 선택되는 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학적 조성물.
구현예 42. (i) 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 항체, 및 (ii) 항바이러스제의 조합.
구현예 43. 구현예 42에 있어서, 상기 항바이러스제는 뉴라미니다제 억제제 및 인플루엔자 중합효소 억제제로부터 선택되는 조합.
구현예 44. 구현예 42 또는 43에 있어서, 상기 항바이러스제는 오셀타미비르, 자나미비르 및 발록사비르로부터 선택되는 조합.
구현예 45. A형 인플루엔자 바이러스의 감염 예방 또는 치료용 구현예 42 내지 44 중 어느 하나의 조합.
구현예 46. A형 인플루엔자 바이러스 감염을 감소시키거나 A형 인플루엔자 바이러스 감염의 위험을 낮추는 방법으로서, 치료적 유효량의 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 47. 구현예 46에 있어서, 항체는 예방적으로 투여되는 방법.
구현예 48. 구현예 46 또는 47에 있어서, 상기 대상체는 A형 인플루엔자 감염의 즉각적인 위험에 있는 방법.
구현예 49. 구현예 46 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 항체는 항바이러스제와 조합하여 투여되는 방법.
구현예 50. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 항체를 포함하는 약학적 조성물의 단일 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 A형 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 선택적으로 상기 항체는 서열번호: 10에 따른 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 9에 따른 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 방법.
구현예 51. 구현예 50 중 하나에 있어서, 약학적 조성물은 항체를 100 mg/mL 내지 200 mg/mL, 예를 들어 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 바람직하게 150 mg/mL의 농도로 포함하는 방법.
구현예 52. 구현예 50 또는 51에 있어서, 단일 투여량은 대상체의 kg 체중 당 3, 4, 5, 6, 또는 7, 바람직하게 5 mg의 항체를 포함하는 방법.
구현예 53. 구현예 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 단일 투여는 최대 60 mg, 최대 300 mg, 최대 1200 mg, 최대 1800 mg, 또는 최대 3000 mg의 항체를 포함하는 방법.
구현예 54. 구현예 50 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 항체는 60 mg, 300, 1200, 또는 1800 mg의 투여량으로 투여되는 방법.
구현예 55. 구현예 50 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 항체는 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1100, 또는 1200 mg의 투여량으로 투여되는 방법.
구현예 56. 구현예 50 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
구현예 57. 구현예 50 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 근육내(IM) 주사를 포함하는 방법.
구현예 58. 구현예 50 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 물(예를 들어 USP 주사용수, 또는 US 주사용 멸균수)을 추가로 포함하는 방법.
구현예 59. 구현예 50 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 조성물 내 히스티딘을, 선택적으로 10 mM 내지 40 mM, 바람직하게 20 mM의 농도로 추가로 포함하는 방법.
구현예 60. 구현예 50 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 당, 예를 들어 이당류, 예를 들어 수크로스를 선택적으로 3.0% 내지 9.0% (w/v)의 범위, 바람직하게 3.6% 내지 8.6%의 범위, 더욱 바람직하게 4% 내지 6%의 범위로 추가로 포함하는 방법.
구현예 61. 구현예 50 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 계면활성제 또는 삼중블록 공중합체, 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머 188, 바람직하게 폴리소르베이트 80(PS80)을 선택적으로 0.01% 내지 0.05% (w/v) 범위, 바람직하게 0.02% (w/v)로 추가로 포함하는 방법.
구현예 62. 구현예 50 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물은 5.8 내지 6.2 범위, 5.9 내지 6.1 범위, 또는 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 또는 6.2의 pH를 갖는 방법.
구현예 63. 구현예 50 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 단일 투여량은 주사당 약학적 조성물을 0.8 mL 내지 4 mL 포함하거나 또는 이로 구성된 방법.
구현예 64. 구현예 63에 있어서, 단일 투여량은 주사당 약학적 조성물의 0.8 mL, 0.9 mL, 1.0 mL, 1.1 mL, 1.2 mL, 1.3 mL, 1.4 mL, 1.5 mL, 1.6 mL, 1.7 mL, 1.8 mL, 1.9 mL, 2.0 mL, 2.1 mL, 2.2 mL, 2.3 mL, 2.4 mL, 2.5 mL, 2.6 mL, 2.7 mL, 2.8 mL, 2.9 mL, 3.0 mL, 3.1 mL, 3.2 mL, 3.3 mL, 3.4 mL, 3.5 mL, 3.6 mL, 3.7 mL, 3.8 mL, 3.9 mL, 또는 4.0 mL를 포함하거나 또는 이로 구성된 방법.
구현예 65. 구현예 50 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 약학적 조성물의 투여 약 4주, 약 12주, 및/또는 약 20주 이후 대상체는 (i) 기침, 인후통; 콧물; 울혈; 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 호흡기 증상의 수 및/또는 중증도가 감소되며, 및/또는 (ii) 동일한 기간에 플라시보를 받거나 A형 인플루엔자 요법 또는 백신을 받지 않은 기준 대상체(예를 들어 동일한 성별, 연령, 체중, 및/또는 일반 건강)에 비해, 열 [구강 온도 >38°C (100.4°F)]; 오한; 근육통; 두통; 불안; 피로; 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 전신 증상의 수 및/또는 중증도가 감소되는 방법.
구현예 66. 구현예 50 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 18세 내지 65세이며 및/또는 18 kg/m2 내지 32 kg/m2의 범위 또는 18 kg/m2 내지 35 kg/m2 범위의 체질량 지수를 갖는 방법.
구현예 67. 구현예 50 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 여기서: (i) 단일 투여량은 300 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 약학적 조성물의 2 mL를 포함하는 단일 주사에 의해 투여되며; (ii) 단일 투여량은 1200 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 조성물의 4 mL를 각각 포함하는 2회 주사로 투여되며; (iii) 단일 투여량은 1800 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 약학적 조성물의 4 mL를 각각 포함하는 3회 주사로 투여되며; 또는 (iv) 단일 투여량은 60 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 약학적 조성물의 0.4 mL를 포함하는 1회 주사로 투여되는 방법.
구현예 68. 구현예 50 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 6개월의 기간 동안 약학적 조성물을 대상체에 한번 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 69. 구현예 50 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 12개월의 기간 동안 약학적 조성물을 포함하는 단일 투여량을 대상체에 한번 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 70. 구현예 50 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 6개월이 기간 동안 대상체에게 2회, 예를 들어 3개월마다 1회 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
구현예 71. 구현예 50 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 인플루엔자 시즌이 시작되기(예를 들어 미국에서 독감 시즌은 10월, 11월 또는 12월에 시작될 수 있음) 이전 1~2개월 이내, 또는 인플루엔자 시즌의 첫 1~2개월 이내에 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법
구현예 72. 구현예 50 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 항체, 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물이 약 2.17 μg/mL의 인비트로 인플루엔자 감염 억제 IC90을 갖는 방법.
구현예 73. 구현예 50 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물의 단일 투여량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법에 있어서, 상기 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 약학적 조성물의 2 mL를 포함하는 단일 주사에 의해 투여되며, 여기서: (i) 투여된 약학적 조성물은 약 60 mg의 항체를 포함하며, 상기 항체는 투여 후 최대 120일 동안 약 1 μg/mL 내지 약 7 μg/mL의 농도로 대상체로부터 혈청에 존재하고; (ii) 투여된 약학적 조성물은 약 300 mg의 항체를 포함하며, 상기 항체는 투여 후 최대 120일 동안 약 8 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 농도로 대상체로부터 혈청에 존재하고; (iii) 투여된 약학적 조성물은 약 1200 mg의 항체를 포함하며, 상기 항체는 투여 후 최대 120일 동안 약 50 μg/mL 내지 약 100 μg/mL의 농도로 대상체로부터 혈청에 존재하고; (iv) 투여된 약학적 조성물은 약 1800 mg의 항체를 포함하며, 상기 항체는 투여 후 최대 120일 동안 약 70 μg/mL 내지 약 110 μg/mL의 농도로 대상체로부터 혈청에 존재하고; 및/또는 (v) 항체는 대상체에서 49 내지 68일의 인비보에서 t1/2를 갖는 방법.
구현예 74. 구현예 50 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물의 항체가 49일 내지 68일, 예컨대 49일, 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일 또는 68일에 인간 대상체 내 인비보에서(in vivo) t1/2를 갖는 방법.
구현예 75. 구현예 50 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 약학적 조성물의 단일 투여량이 투여된 이후 선택적으로 최대 140일 동안 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(CTCAE)에 따라 유해 사례(AE)를 경험하지 않는 방법.
구현예 76. 구현예 50 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 약학적 조성물의 단일 투여 후 선택적으로 최대 140일 동안 유해 사례에 대한 공통 용어 기준 (CTCAE)에 따라 중등도의 유해 사례(AE)를 경험하지 않는 방법.
구현예 77. 구현예 50 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 약학적 조성물의 단일 투여 후 선택적으로 최대 140일 동안 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(CTCAE)에 따라 심각한 유해 사례(AE)를 경험하지 않는 방법.
구현예 78, 구현예 50 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 여기서: (i) 단일 투여량은 300 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 150 mg/mL로 항체를 포함하며, 상기 단일 투여량은 2 mL의 약학적 조성물을 포함하는 단일 주사를 포함하며; (ii) 단일 투여량은 1200 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 150 mg/mL로 항체를 포함하며, 상기 단일 투여량은 각각 4 mL의 약학적 조성물을 포함하는 2회 주사를 포함하며; (iii) 단일 투여량은 1800 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 150 mg/mL로 항체를 포함하며, 상기 단일 투여량은 각각 4 mL의 약학적 조성물을 포함하는 3회 주사를 포함하며; 또는 (iv) 단일 투여량은 60 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 150 mg/mL로 항체를 포함하며, 상기 단일 투여량은 0.4 mL의 조성물을 포함하는 방법.
구현예 79. 서열번호: 10에 따른 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 9에 따른 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함하는 약학적 조성물에 있어서, 여기서 상기 항체는 100 mg/mL 내지 200 mg/mL의 범위, 예를 들어 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 바람직하게 150 mg/mL의 농도로 약학적 조성물 내에 존재하는 약학적 조성물.
구현예 80. 구현예 79에 있어서, 약학적 조성물은 물(예를 들어 USP 주사용수, 또는 US 멸균 주사용수)를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 81. 구현예 79 또는 80에 있어서, 조성물 내에 히스티딘을, 선택적으로 10 mM 내지 40 mM, 바람직하게 20 mM의 농도로 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 82. 구현예 79 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 당, 예를 들어 이당류, 예를 들어 수크로스를 3.0% 내지 9.0% (w/v), 바람직하게3.6% 내지 8.6%의 범위, 더욱 바람직하게 4% 내지 6%의 범위로 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 83. 구현예 79 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제 또는 삼중블록 공중합체, 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머 188, 바람직하게 폴리소르베이트 80 (PS80)을 선택적으로 0.01% 내지 0.05% (w/v) 범위로, 바람직하게 0.02% 추가로 포함하는 약학적 조성물.
구현예 84. 구현예 79 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 5.5 내지 6.5 범위 또는 5.8 내지 6.2 범위의 pH, 또는 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5, 바람직하게 6.0의 pH를 갖는 약학적 조성물.
구현예 85. 구현예 79 내지 84 중 어느 하나의 약학적 조성물을 포함하는 바람직하게는 유리, 바이알.
구현예 86. 구현예 79 내지 84 중 어느 하나의 약학적 조성물을 포함하는 (예를 들어 미리 충진된) 주사기.
본 개시의 항체 또는 항체 조성물의 단일 투여는 전체 독감 시즌 동안 A형 인플루엔자 감염을 보호 및/또는 치료하는데 유용하다.
하기에 첨부된 도면에 대한 간략한 설명이 제공된다. 도면은 본 개시를 보다 상세하게 예시하기 위한 것이다. 그러나, 이들은 어떤 식으로든 본 개시의 주제를 제한하도록 의도되지 않는다.
도 1은 56일까지 ELISA를 통해 평가된 원숭이(macaque) 혈장 샘플에서 인간 항체 FluAB_MLNS(열린 사각형) 및 FluAB_wt(비교 항체, 채워진 원)의 실시예 2 혈장 농도를 보여준다.
도 2A-2B는 전체 인간 mAb를 정량화하기 위한 항-CH2 항체 ELISA 또는 mAb의 기능성을 결정하기 위한 HA 항원-결합 ELISA를 사용하여 측정된 FluAB_MLNS(동물 C90142(2A), C90190(2B))의 실시예 3 혈장 농도를 보여준다. 그래프는 선택된 시점(1일, 21일, 56일, 86일 및 113일)에서 개별 동물에 대한 전체 인간 mAb 정량화와 HA 결합 사이의 선형 회귀를 보여준다.
도 3A-3B는 실시예 4(3A)에서 ELISA를 사용하여 측정하고 요소 함량에 대해 정규화된 비강 면봉에서 인간 항체 FluAB_MLNS 및 FluAB_wt의 농도를 나타내고; 및 (3B) 인간 항체 FluAB_MLNS 및 FluAB_wt의 생체 분포, 혈장 농도에 대한 비강 면봉에서 % 요소 정규화 농도로 표시됨. 개별 동물 ID 및 접종된 인간 항체 변이체(FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt)가 아래에 표시된다.
도 4A-4E는 실시예 5에 대해 1 mg/kg(4B, 4C, 회색 기호) 및 0.3 mg/kg(4D, 4E, 밝은 회색 기호) 또는 처리되지 않은 상태로 유지(4A, 삼각형)하여 FluAB_wt(4B, 4D, 원), FluAB_MLNS(4C, 4E, 사각형)로 처리된 Tg32 마우스에서 시간 경과에 따른 누적 체중 변화를 보여준다; PR8 바이러스로 비강내 감염된 모든 마우스. 개별 동물이 표시된다. 굵은 검은색 선은 BW±SD의 평균 경향을 나타낸다. 그룹당 개인 수가 표시된다. * p< 0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001 vs 대조군 단독 (A), ° p< 0.05, °° p< 0.01, 모두 vs MEDI8852의 상대적 시점들, 본페로니 다중 테스트 수정으로 2-웨이 ANOVA.
도 5A 및 5B는 실시예 5에 대해 아무것도 처리하지 않은 감염된 Tg32 수컷 마우스(5B), FluAB_wt, 또는 FluAB_MLNS에서 1 mg/kg 투여량(5A)과 0.3 mg/kg 투여량(오른쪽 패널) 사이의 생존 비교 %를 보여준다. ** p<0.01 vs 미처리 마우스(CTR) 및 FluAB_MLNS 0.3 mg/kg; °°° p<0.001 대 FluAB_wt, 로그 순위 분석, Mantel-Cox 방법.
도 6은 실시예 5에 대해 주입된 항체의 순환 수준을 나타낸다. 감염 직전(0일) 및 감염 6일 후의 마우스 혈청에서 측정된 순환 FluAB_wt(원) 및 FluAB_MLNS(사각형)의 개별 수준(μg/ml)이 표시된다. 막대는 평균±SD를 나타낸다.
도 7은 인비트로에서 중화 분석에 사용된 실시예 6에 대한 플레이트 계획을 보여준다.
도 8A-8D는 실시예 6에 대해 H1N1(8A, 8C) 및 H3N2(8B, 8D) 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르(Oseltamivir) 단독의 중화 활성을 보여준다.
도 9A-9B는 실시예 6에 대해 H1(9A) 및 H3(9B) 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합된 중화 활성을 보여준다. 데이터는 MDCK 세포의 H1N1(9A) 및 H3N2(9B) 바이러스 감염 모두에서 FluAB_MLNS 단독 및 이종몰 농도의 오셀타미비르와 조합하여 억제된 분획을 보여준다. 데이터는 3배 값의 평균±SD로 표시되며, 각 복제는 3개의 독립적인 배양 플레이트에서 획득된다.
도 10A-10B는 실시예 6에 대한 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르 조합의 중앙값 효과 플롯을 보여준다. 두 화합물을 표시된 일정한 비율로 연속 희석하고 H1(10A) 및 H3(10B) 바이러스 균주로 감염된 MDCK 세포에 첨가했다. 일정하지 않은 비율(NCR)에서 선택한 조합에서 얻은 값도 표시된다.
도 11A-11F는 실시예 6에 대해 H1N1 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합 지수를 보여준다. 점은 표시된 일정한 비율의 실제 실험 지점을 나타내며 옆으로 표시된 누적 약물-약물 농도를 나타낸다. 점선 곡선은 전체 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 보여준다.
도 12A-12E는 실시예 6에 대해 H3N2 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합 지수를 보여준다. 점은 표시된 일정한 비율의 실제 실험 지점을 나타내며 옆으로 표시된 누적 약물-약물 농도를 나타낸다. 점선 곡선은 전체 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 보여준다.
도 13A-13C는 실시예 6에 대해 H1N1 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합의 이소볼로그램(isobolograms)을 보여준다. 점은 서로 다른 일정한 비율의 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합에 대한 IC50, IC75 및 IC90 값을 보여준다. 각 실험 포인트에 대해 누적 농도가 표시된다.
도 14A-14C는 실시예 6에 대해 H3N2 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합의 이소볼로그램을 보여준다. 점은 서로 다른 일정한 비율의 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합에 대한 IC50, IC75 및 IC90 값을 보여준다. 각 실험 포인트에 대해 누적 농도가 표시된다.
도 15A-15D는 실시예 6에 대해 H1N1(15A, 15C) 및 H3N2(15B, 15D) 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 자나미비르 단독의 중화 활성을 보여준다.
도 16A-16B는 실시예 6에 대해 H1(A) 및 H3(B) 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합된 중화 활성을 보여준다. 데이터는 MDCK 세포의 H1N1(A) 및 H3N2(B) 바이러스 감염 모두에서 FluAB_MLNS 단독 및 자나미비르의 이종 농도와 조합에 의해 억제된 분획을 보여준다. 데이터는 3배 값의 평균±SD로 표시되며, 각 복제는 3개의 독립적인 배양 플레이트에서 획득된다.
도 17A-17B는 실시예 6에 대한 FluAB_MLNS 및 자나미비르 조합의 중앙값 효과 플롯을 보여준다. 두 화합물을 표시된 일정한 비율로 연속 희석하고 H1(17A) 및 H3(17B) 바이러스 균주로 감염된 MDCK 세포에 첨가했다. 일정하지 않은 비율(NCR)에서 선택한 조합에서 얻은 값도 표시된다.
도 18A-18D는 실시예 6에 대한 H1N1 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합 지수를 보여준다. 점은 표시된 일정한 비율의 실제 실험 지점을 나타내며 옆으로 표시된 누적 약물-약물 농도를 나타낸다. 점선 곡선은 전체 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 보여준다.
도 19A-19D는 실시예 6에 대해 H3N2 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합 지수를 보여준다. 점은 옆으로 표시된 누적 약물-약물 농도와 함께 표시된 일정한 비율의 실제 실험 지점을 나타낸다. 점선 곡선은 전체 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 보여준다.
도 20A-20C는 실시예 6에 대하여 H1N1 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS-자나미비르 조합의 이소볼로그램을 보여준다. 점은 서로 다른 일정한 비율의 FluAB_MLNS-자나미비르 조합에 대한 IC50, IC75 및 IC90 값을 보여준다. 각 실험 포인트에 대해 누적 농도가 표시된다.
도 21A-21C는 실시예 6에 대해 H3N2 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS-자나미비르 조합의 이소볼로그램을 보여준다. 점은 서로 다른 일정한 비율의 FluAB_MLNS-자나미비르 조합에 대한 IC50, IC75 및 IC90 값을 보여준다. 각 실험 포인트에 대해 누적된 농도가 표시된다.
도 22A-22D는 실시예 6에 대해 H1N1(22A, 22C) 및 H3N2(22B, 22D) 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 발록사비르 단독의 중화 활성을 보여준다.
도 23A-23B는 실시예 6에 대해 H1(23A) 및 H3(23B) 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 발록사비르의 조합된 중화 활성을 보여준다. 데이터는 MDCK 세포의 H1N1(23A) 및 H3N2(23B) 바이러스 감염 모두에서 FluAB_MLNS 단독 및 이형 농도의 발록사비르와 조합하여 억제된 분획을 보여준다. 데이터는 3배 값의 평균±SD로 표시되며, 각 복제는 3개의 독립적인 배양 플레이트에서 획득된다.
도 24A-24B는 실시예 6에 대하여 조합된 FluAB_MLNS 및 발록사비르의 중앙값 효과 플롯을 보여준다. 두 화합물을 표시된 일정한 비율로 연속 희석하고 H1(24A) 및 H3(24B) 바이러스 균주로 감염된 MDCK 세포에 첨가했다. 일정하지 않은 비율(NCR)에서 선택한 조합에서 얻은 값도 표시된다.
도 25A-25F는 실시예 6에 대한 FluAB_MLNS 및 발록사비르의 조합 지수를 보여준다. 점은 표시된 일정한 비율의 실제 실험 지점을 나타내며 옆으로 표시된 누적 약물-약물 농도를 나타낸다. 점선 곡선은 전체 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 보여준다.
도 26A-26F는 실시예 6에 대한 FluAB_MLNS-발록사비르 조합의 이소볼로그램을 보여준다. 점은 서로 다른 일정한 비율의 FluAB_MLNS-발록사비르 조합에 대한 IC50, IC75 및 IC90 값을 보여준다. 각 실험 포인트에 대해 누적 농도가 표시된다.
도 27A 및 27B는 실시예 7에 대한 FluAB_MLNS의 임상 연구에서 평가의 환자 일정(실시예 7에서 "파트 A" 환자)을 보여준다.
도 28A 및 28B는 실시예 7에 대한 FluAB_MLNS의 임상 연구에서 평가의 환자 일정(실시예 7에서 "파트 B" 환자)을 보여준다.
도 29A 및 29B는 실시예 7에 대한 FluAB_MLNS의 임상 연구에서 평가의 환자 일정(실시예 7에서 "파트 C" 환자)을 보여준다.
도 30은 실시예 7에 대한 FluAB_MLNS의 임상 연구에 사용된 인플루엔자 유사 모니터링 일정을 보여준다.
도 31은 실시예 7에 대한 FluAB_MLNS의 임상 연구에 사용된 약동학적 평가 시점을 보여준다.
도 32는 실시예 7에 대한 FluAB_MLNS의 임상 연구에 사용된 실험실 평가 목록을 보여준다.
도 33은 인플루엔자 관련 합병증 발병 위험이 높은 집단을 보여준다.
도 34 및 35는 실시예 7에 기재된 임상 시험에 따라 FluAB_MLNS를 투여받은 인간 대상체에서 FluAB_MLNS의 혈청 농도를 나타낸다. 도 34는 20주 및 12주까지 FluAB_MLNS의 초기 용량 300mg 및 1,200mg을 투여받은 환자의 항체 혈청 농도를 각각 나타낸다. 도 35는 대상체에게 300mg 및 1,200mg 용량을 투여한 후 최대 6개월까지 FluAB_MLNS의 예상 항체 혈청 농도를 보여준다.
도 36은 실시예 7에 기재된 임상 시험에 따라 FluAB_MLNS를 투여받는 인간 대상체에서 FluAB_MLNS의 항체 혈청 농도를 나타낸다. 투여 후 20주까지의 항체 혈청 농도는 60 mg, 300 mg, 1,200 mg, 및 1,800 mg의 FluAB_MLNS의 초기 용량 1,800mg을 수여한 대상체에 대해 제공된다.
도 37은 실시예 7에 자세히 설명된 임상 연구에서 관찰된 다양한 FluAB_MLNS PK 매개변수를 보여주는 표를 제공한다.
도 38A 및 38B는 pH=6.0(A) 또는 pH=7.4(B)에서 Octet에 의해 측정된 고정된 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt에 대한 용액 중 인간 FcRn의 결합을 보여준다. 시점 0초는 베이스 라인 버퍼에서 인간 FcRn을 함유하는 버퍼로의 전환을 나타낸다. 시점 420초(수직 점선)는 해당 pH에서 빈 버퍼로의 전환을 나타낸다. 결합 및 해리 프로파일은 Octet RED96(ForteBio)을 사용하여 실시간으로 측정되었다.
도 39A 및 39B는 마우스 항-약물 IgG를 검출하기 위해 ELISA에 의해 측정된 ADA 반응의 수준을 나타낸다(A; 막대는 처리군의 평균±SD를 나타냄); 및 i.v. 주사 후 14일에 측정된 순환 인간 IgG 수준(X축) 및 동일한 시점에 존재하는 ADA의 신호(Y축) 사이의 상관 분석(B)을 나타낸다. 비모수적(non-parametric) 스페르만(Spearman's)의 상관 계수는 유의한 값에 대해 표시된다.
도 40은 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt의 피하(s.c.) 주사 후 ADA 반응 수준을 보여준다. 데이터는 피하 주사(n=5/그룹) 후 3주 동안 얻고, PBS 1:25로 미리 희석한 다음 추가로 5배 연속 희석한 각 개별 혈청에서 검출된 ADA 신호(OD 450 nm)의 값으로 표시된다.
실시예
다음에서, 본 개시의 구현예 및 측면을 예시하는 특정 예시가 제시된다. 그러나, 본 개시는 여기에 기술된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되어서는 안 된다. 하기 제조예 및 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 보다 명확하게 이해하고 실시할 수 있도록 하기 위한 것이다. 그러나, 본 개시는 예시된 구현예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것 외에 본 개시의 다양한 변형은 전술한 설명, 첨부 도면 및 하기 실시예로부터 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구 범위에 속한다.
실시예 1: 사이노몰구스 마카크(cynomolgus macaques)에서 본 개시에 따른 항체의 안전성 및 내약성
(i) 서열번호: 1 내지 6에 제시된 CDR 서열 및 (ii) 중쇄 불변 영역에 2개의 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하는 본 개시에 따른 항체를 설계 및 생산하였다. 보다 구체적으로, 상기 항체는 (i) 서열번호: 7에 제시된 중쇄 가변영역(VH) 서열 및 서열번호: 8에 제시된 경쇄 가변영역(VL) 서열; 및 (ii) 중쇄 불변 영역에서 2개의 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함한다. 보다 더 구체적으로, 상기 항체는 서열번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 이러한 항체는 본 명세서에서 "FluAB_MLNS"로 지칭된다.
비교를 위해 항체 "FluAB_wt"가 사용되었으며, 이는 중쇄 불변 영역에 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하지 않는다는 점에서만 항체 "FluAB_MLNS"와 다르다. 따라서, 비교 항체 "FluAB_wt"는 서열번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
2.5 ml/kg 부피의 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt 5 mg/kg의 단일 정맥내 주입을 테스트 그룹당 3마리의 암컷 사이노몰구스 마카쿠(Macaca fascicularis)에 60분 동안 정맥내 주입했다. 임상 화학 및 혈액학적 분석을 위한 혈액 또는 소변을 투여 전 및 투여 후 7일 및 21일에 수집하였다.
FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt를 5mg/kg으로 60분간 정맥 주입한 후, 암컷 사이노몰구스 마카쿠의 건강과 체중을 면밀히 모니터링하고 정기적으로 혈액 및 소변 샘플을 채취했다. 항체의 정맥 주사 후 일부 동물의 접종 부위에서 투여 후 24시간 동안 멍이 들거나 3일 동안 홍피증이 발생한 것을 제외하고는 부작용이 관찰되지 않았다. 모든 동물은 일반적으로 건강했고 정상적인 음식 섭취를 보였고 연구 전반에 걸쳐 전반적으로 긍정적인 체중 증가를 보였다. 임상 화학, 혈액학 및 소변 검사 매개변수는 투여 전 샘플과 비교하여 투여 후 7일 또는 21일에 정상이었다.
요약하면, 사이노몰구스 마카쿠에 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt를 1회 정맥내 주입하는 것은 부작용을 유발하지 않았으며 일반적으로 잘 견딘다.
실시예 2: 혈장 농도 및 약동학 측정
이들 실험은 농도를 결정하고, 반감기를 설정하고, 단일 정맥내 주사 후 혈장에서 비교 항체 FluAB_wt와 비교하여 본 개시 FluAB_MLNS에 따른 항체의 약동학을 비교하는 것을 목표로 하였다.
투여 전에, 동물은 도트 면역결합 검정을 사용하여 인플루엔자-특이적 항체에 대해 음성인 것으로 시험되었다. 기존 면역이 이 테스트를 방해할 수 있으므로 혈청양성(Seropositive) 동물은 연구에서 제외되었다. 또한, 항-약물 항체(ADA) 반응을 나타내는 동물은 제외되었다.
2.5 ml/kg 부피의 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt 5 mg/kg의 단일 정맥내 주입이 테스트 그룹당 3마리의 암컷 원숭이에게 60분 동안 정맥내 주입으로 주어졌다. 투여 전 K2EDTA를 함유하는 튜브에 혈액을 수집하고 투여 후 대략 1, 6, 24, 96, 168, 504, 840 및 1344시간 후에 약동학 시험을 위해 혈장으로 처리하였다.
항체의 혈장 농도는 ELISA 검정을 사용하여 인비트로에서 측정하였다. 간단히 말해서, IAV-HA 항원(A형 인플루엔자 바이러스 H1N1 A/California/07/2009 Hemagglutinin Protein Antigen(His Tag 포함); Sino Biologicals)을 PBS에서 2μg/ml로 희석하고 25μl를 -4°C에서 밤새 코팅하기 위해 96-웰 플랫 바텀 ½-영역 ELISA 플레이트에 첨가했다. 코팅 후, 플레이트는 자동화된 ELISA 워셔를 사용하여 0.05% Tween20(세척 용액)이 보충된 0.5x PBS로 두 번 세척되었다. 그런 다음, 플레이트를 실온(RT)에서 1시간 동안 1% BSA(차단 용액)가 보충된 PBS 100μl/well로 차단한 다음 두 번 세척했다. 혈장 샘플을 4°C에서 10분 동안 10,000g에서 원심분리한 다음 96-웰 세포 배양 플레이트의 차단 용액에서 최종 1:300 희석을 위해 희석(1:10 및 1:30)했다. 정량에 사용된 원숭이 혈장의 최소 희석액(1:300)을 테스트하고 매트릭스 효과가 무시할 수 있는 수준인지 확인하도록 설정했다. 이어서, 샘플을 총 12 희석에 대해 3배(triplicates)로 1:2 단계적으로 희석하였다. 테스트할 각 항체에 대한 표준물은 테스트 샘플의 기질을 모방하여 모든 테스트 동물의 사전 접종 혈장 풀에서 항체를 1:300에서 1μg/ml로 희석하여 유사하게 준비했다. 이후 표준물을 3배로 차단 용액에서 1:3으로 단계적으로 희석하여 총 12회 희석했다. 25 μl의 준비된 샘플 또는 표준물을 혈구응집소(HA) 코팅된 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양했다. 4회 세척 후, 차단 용액 1:5'000(최종 농도 0.16㎍/ml)에 희석된 염소 항 인간-IgG HRP 접합체(AffiniPure F(ab')₂ 단편, Fcγ 단편-특이적; Jackson ImmunoResearch) 25㎕를 검출을 위해 웰당 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 4번의 세척 후, SureBlue TMB Substrate(Bioconcept)를 웰당 40μl씩 첨가하여 플레이트를 개발했다. 실온에서 7-20분 동안 배양한 후, 색 반응이 정체 상태(plateau)(최대 OD~3.8)에 도달하면 1% HCl 40 μl를 웰당 첨가하여 반응을 중지하고 분광 광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정했다.
사이노몰구스 혈장에서 항체의 농도를 측정하기 위해 ELISA 데이터의 OD 값을 Gen5 소프트웨어(BioTek)의 농도에 대해 플롯팅했다. 가변 기울기 모델, 4개의 매개변수 및 방정식: : Y=(A-D) / (1+ (X/C)^B) +D)을 사용하여 비선형 곡선 맞춤을 적용했다. - 곡선의 상위, 중간 또는 하위 범위에 있는 품질 관리 샘플에 의해 설정 실험에서 측정된 바와 같은 - 표준 곡선의 예측 가능한 분석 범위에 속하는 샘플 희석의 OD 값은 샘플을 정량화하기 위해 보간되었다(interpolated). 이후, 샘플의 최종 희석을 고려하여 항체의 혈장 농도를 측정하였다. 샘플 희석액의 값이 표준 곡선의 선형 범위 내에 두 개 이상인 경우, 해당 값의 평균이 사용되었다. 약동학(PK) 데이터는 하기 세팅과 함께 WINNONLIN NONCOMPARTMENTAL ANALYSIS PROGRAM (8.1.0.3530 Core Version, Phoenix software, Certara)을 사용하여 분석되었다: 모델: 혈장 데이터, 일정한 주입 투여; 결측되지 않은 관측치의 수: 8; 정상 상태 간격 타우(Steady state interval Tau): 1.00; 투여 시간: 0.00; 투여량: 5.00 mg/kg; 주입 기간: 0.04 일; 계산 방법: 선형 보간과 함께 선형 사다리꼴 (Linear Trapezoidal with Linear Interpolation); lambda_z 계산을 위한 가중치: 균일 가중치; Lambda_z 방법: lambda_z, 로그 회귀에 가장 적합한 것 찾기. 그래프 및 통계 분석(선형 회귀 또는 이상값 분석)은 Prism 7.0 소프트웨어(GraphPad, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. ROUT 방법(Q=1%)을 사용하여 이상값 분석을 수행했으며, 어느 방향으로든 임의의 이상값을 찾을 수 있는 가능성이 있다.
결과를 도 1에 나타내었다. 접종 후 56일까지 채취한 사이노몰구스 혈장 샘플의 분석은 본 개시에 따른 항체 FluAB_MLNS가 비교 항체 FluAB_wt와 비교하여 연장된 인비보 반감기를 가짐을 입증하였다(도 1). WinNonLin을 사용한 비구획 분석을 사용하여 T1/2는 FluAB_MLNS의 경우 19.5일로 추정된 반면, T1/2는 비교 항체 FluAB_wt의 경우 11.6일로 추정되었다. 정량의 하한은 300ng/ml였다.
요약하면, FluAB_MLNS는 접종 후 적어도 56일까지 비교 항체 FluAB_wt와 비교하여 연장된 인비보 반감기를 가졌다.
실시예 3: 인비보 장기 안정성
시간 경과에 따른 FluAB_MLNS 항원 결합의 인비보 안정성 및 기능성을 테스트하기 위해, FluAB_MLNS를 투여 받은 그룹의 약동학 측정(실시예 2에 기술됨)을 접종 후 86일 및 113일까지 연장했다. 접종 후 1, 21, 56, 86, 113일째에 실시예 2에 기재된 바와 같이 헤마글루티닌(HA) 결합 ELISA를 사용하여 기능성 FluAB_MLNS를 정량화하였다.
추가로, 마카쿠 혈장에서 총 인간 항체는 원숭이 Ab가 아닌 인간의 CH2 영역에 특이적으로 결합하는 포획 mAb를 사용하여 특이적 항-CH2 ELISA를 사용하여 정량화되었다. 총 인간 IgG를 측정하여 시노몰구스 혈장에서 총 접종된 인간 항체를 정량화하기 위해 인간 IgG(클론 R10Z8E9, Thermo Scientific)에 특이적인 마우스 항-CH2 도메인으로 캡처하는 ELISA를 사용했다. 이 mAb는 원숭이 IgG와 교차 반응하지 않는 것으로 확인되었다. 96-웰 평평한 바닥 ½-면적 ELISA 플레이트의 코팅을 위해, 마우스 항-인간 IgG CH2를 PBS에 0.5μg/ml로 첨가하고 4°C로 밤새 배양했다. 그런 다음, 플레이트를 세척하고 5% BSA가 포함된 100μl/웰 차단 용액을 실온에서 1시간 동안 첨가했다. FluAB_MLNS의 표준물은 차단 용액에서 FluAB_MLNS를 1ng/ml로 희석하여 준비했다. 그런 다음 표준물을 두배로 차단 용액에서 단계적으로 1:1.5로 희석하여 총 12회 희석했다. 시노몰구스 혈장 샘플을 4°C에서 10분 동안 10,000g에서 원심분리하고 차단 용액에서 최종 1:1,000, 1:5,000 또는 1:15,000으로 단계적으로 희석했다. 플레이트를 세척한 후, 25㎕의 샘플 또는 표준물을 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 3번의 세척 후, 0.04μg/ml의 염소 항 인간-IgG HRP(AffiniPure F(ab')₂ Fragment, Fcγ 단편-특이적; Jackson ImmunoResearch) 25μl를 검출을 위해 1% BSA가 포함된 차단 용액에 첨가하고 실온에서 45분 동안 배양했다. 세 번 세척한 후, SureBlue TMB Substrate(Bioconcept)를 웰당 40μl씩 첨가하여 플레이트를 발달시켰다. 실온에서 20분간 배양한 후 1% HCl 40㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 2A-2B에 나와 있다. 두 가지 정량화 모두 사이노몰구스 혈장에서 유사한 인간 항체 농도를 초래했다(도 2A-2B). 선형 회귀를 통한 추가 분석은 HA 결합을 통한 정량화와 전체 항-CH2 정량화 사이의 관계가 모든 선택된 시점에 대해 선형 패턴을 따랐음을 보여주었다. 결과적으로, 혈장에 존재하는 FluAB_MLNS의 총량은 인비보에서 86일 및 113일 후에도 A형 인플루엔자 바이러스(IAV)의 혈구응집소(HA) 줄기 영역에 결합하는 데 기능적이었다.
요약하면, FluAB_MLNS는 기능적 항원 결합을 나타내어 연구 연장 동안 접종 후 113일까지 인비보에서 우수한 장기 안정성을 보여주었다.
실시예 4: 비강 면봉 내 항체 농도 및 생체 분포
혈장에 대한 비강 점액 사이의 FluAB_MLNS 및 비교 항체 FluAB_wt의 생체분포를 측정하기 위해, 비강 면봉에서 항체의 농도를 측정했다. 이를 위해, 실시예 2에 기재된 마카쿠의 비강 면봉을 FluAB_MLNS 또는 비교 항체 FluAB_wt의 투여 24, 504 및 1344시간 후에 수집하였다. 비강 면봉에서 항체 FluAB_MLNS 및 FluAB_wt의 농도는 다음과 같은 약간의 개조를 통해 혈장에서 측정하기 위해 실시예 2에 기재된 바와 같이 본질적으로 측정하였다: (a) ELISA 플레이트를 실온에서 2시간 차단하였다; (b) 비강 면봉 샘플을 PBS 중 1% BSA로 1:2에서 시작하여 희석한 다음 총 8 희석 지점에 대해 단계적으로 1:2로 연속 희석했다; (c) 비강 면봉 배지(RT MINI Viral Transport Medium; Copan)를 분석 매트릭스 대조군으로 사용했다.
면봉 채취 절차 중, 또는 각 동물 및 다른 시점(1일, 21일 및 56일)에 존재하는 비강 분비물의 양의 차이를 제거하기 위해, 비강 면봉으로부터 결과를 요소 함량으로 정규화했다. 요소는 혈액 사이에서 자유롭게 확산되며, 이러한 혈장 또는 면봉 샘플에 걸쳐 유사한 양으로 존재한다(Lim et al., 2017, Antimicrob Agents Chemother 61(8):e00279-17). 이를 위해 Urea Nitrogen(BUN)은 "Urea Nitrogen(BUN) Colorimetric Detection Kit"(Invitrogen)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 정량적으로 측정하였다. 간단히 말해서, 샘플을 PBS에서 1:3으로 희석하고 키트 시약 A 및 B와 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양했다. 산화환원 반응의 착색된 생성물을 96-웰 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 키트와 함께 제공되고 동등하게 처리된 BUN 표준물과 샘플을 비교하여 정량화를 수행했다.
결과는 도 3A-3B에 나와 있다. 비강 면봉에서 정규화된 항체의 양은 시간이 지남에 따라 감소했다(도 3A). 비강과 혈장 농도를 비교하여 생체 분포를 측정한 결과 FluAB_MLNS와 비교 항체 FluAB_wt 사이에 차이가 없었으며(도 3B), 이는 MLNS-Fc 돌연변이가 혈장에서 FluAB_MLNS의 반감기를 연장하는 동안 비강 점액으로의 항체의 생체 분포를 향상시키지 않았음을 나타낸다.
요약하면, 비강 면봉 샘플은 mAb 변이체들 가운데 비강 점액과 혈장 사이의 생체 분포에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 5: PR8에 감염된 Tg32 마우스에서 항체 FluAB_MLNS의 예방 활성
다음으로, 치명적인 A형 인플루엔자 감염의 H1N1 쥐 모델에서 항체 FluAB_wt와 비교한 FluAB_MLNS의 예방 활성이 측정되었다.
예방적 효능을 평가하기 위해 9-14주령 FcRn-/- hFcRn 라인 32 Tg 마우스(C57B6 배경)에 0.3 내지 1 mg/kg 범위의 용량으로 FluAB_MLNS 또는 비교 항체 FluAB_wt를 포함하는 용액 5 ml/kg을 (꼬리 정맥을 통해) 정맥내(iv) 주사했다. i.v. 주사 24시간 이후, 마우스는 감염 전 혈청 항체 수준을 측정하기 위해 꼬리 정맥에서 채혈되었다. 출혈은 또한 감염 후(p.i.) 6일 및 13일에 반복되었다. 항체를 주사한 쥐 및 처리하지 않은 쥐 모두를 마취시키고 (이소플루란, O2에 4%, 0.3 L/min), A형 인필루엔자 바이러스 (H1N1, A/Puerto Rico/8/34, as described in Cottey, R., Rowe, C.A., and Bender, B.S. (2001). Influenza virus. Curr Protoc Immunol Chapter 19, Unit19.11-19.11.32)의 5 마리 쥐 치사 투여량 50% (5 MLD50, 1200 TCID50/mouse와 동등함) 를 포함하는 50 μl (25 μl/each)의 PBS로 양쪽 콧구멍으로 천천히 잠적(instillation)시킴으로써 비강내(i.n.) 접종하였다. 각 마우스는 콧구멍에서 접종물이 떨어질 가능성을 줄이기 위해 약 1분 동안 머리를 약간 뒤로 젖힌 상태로 똑바로 유지했다. 절차 후 및 교정 반사(righting reflex) 발생 시, 동물을 케이지로 되돌렸다. 마우스는 14일째 p.i.까지 체중 감소 및 질병 증상에 대해 매일 모니터링되었으며, 초기 체중의 20% 이상이 감량되거나(감염 당일 0%로 설정) 또는 이환율(morbidity) 점수 4에 도달하면 안락사된다. 표 1은 적용된 이환율 점수를 자세히 설명한다:
PR8-감염된 마우스의 이환율 점수
이환율 점수 임상 징후
1 건강함
2 목에 지속적으로 러플 퍼(ruffled fur)
3 입모(Piloerection), 심호흡 가능, 덜 경계함
4 힘든 호흡, 떨림 및 혼수상태
5 비정상적인 보행, 이동성 감소, 쇠약, 꼬리 귀청색증(tail-ears cyanosis)
6 죽음
모든 동물은 결국 혈청과 폐를 수집하기 위해 희생되었다.
혈청 제조:
약 0.05ml의 혈액을 겔 함유 튜브에 수집하고 실온에서 30분 동안 방치했다. 튜브를 5500rpm(3200 x g)에서 5분 동안 회전시키고 혈청을 새 튜브로 옮기고 사용할 때까지 -20°C에서 보관했다.
다음 설계에 따라 두 가지 독립적인 실험을 수행했다.
연구 설계 실험 1:
그룹 동물의 N IV 처리 mAb 투여량 15
1 4 - -
2 8 FluAB_wt 1 mg/kg
3 4 FluAB_wt 0.3 mg/kg
4 8 FluAB_MLNS 1 mg/kg
5 4 FluAB_MLNS 0.3 mg/kg 20
연구 설계 실험 2:
그룹 동물의 N IV 처리 mAb 투여량
1 9 - -
2 10 FluAB_wt 0.3 mg/kg 25
3 6 FluAB_MLNS 0.3 mg/kg
순환 mAb의 ELISA 정량화:
혈청은 0일 및 6일째에 순환 항체의 수준에 대해 평가되었다. 간단히 말해서, 절반 영역 ELISA 플레이트를 4°C에서 밤새 H1N1 균주 A/California/07/09 (2 ug/ml, PBS 내, 25 ul/well)로부터 재조합 혈구응집소(HA)로 코팅했다. 차단 (PBS/1% BSA, 100 ml/well, 1시간 실온) 및 ELISA 세척 용액 (PBST)로 2회 세척 (220 ul/well) 후, 혈청의 두 희석액 (1 mg/kg의 경우 초기 희석액 1:150, 0.3 mg/kg의 경우 1:50) 및 항체 표준물 (FluAB_MLNS and FluAB_wt, 0.1 ug/ml)을 2배로 첨가하고 (25 ul/well) 연속 희석했다 (혈청 희석의 경우 1:2 10점(point)까지, 항체 표준물의 경우 1:3 8점까지). 1.5 시간 실시간 배양 후, 플레이틀 PBST로 4회 세척하고 HRP-표지된 항-인간 2차 항체 (0.16 ug/ml, 25 ul/well)로 실온에서 1.5 시간 추가 배양했다. PBST로 4회 세척 후, 플레이트를 기질 용액 (25 ul/well)으로 분배하고, 14분 동안 발달시키고 1% HCl (v/v, 25 ul/well)로 차단했다. 신호 정량화를 위해 분광 광도계를 사용하여 450 nm에서 플레이트를 최종적으로 판독했다. 농도 값은 log(작용제) 대 반응의 비선형 회귀 모델(가변 기울기 모델, 4개의 매개변수, GraphPad Prism)을 사용하여 계산되었다.
데이터 분석:
맥킨토시용 GraphPad Prism software version 8.0, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com를 사용하여 데이터를 플롯하고(plotted) 분석했다. 연속변수는 본페로니 다중 비교 검정으로 보정된 일반 2-way ANOVA를 사용하여 통계적으로 유의한 차이(p<0.05, 95% 신뢰 구간)에 대해 평가했다. 생존 데이터는 Mantel-Cox 방법(p<0.05 통계적으로 유의한 것으로 간주됨)으로 로그 순위 분석을 사용하여 비교되었다. 상기 설명된 두 가지 독립적인 실험 데이터를 통합했다.
결과:
예방적 활성은 비강내 감염을 통한 H1N1 PR8 바이러스 접종 1일 전에 Tg32 마우스에서 FluAB_MLNS 및 FluAB_MLNS (1 및 0.3 mg/kg)의 i.v. 투여로 평가되었다. 결과는 도 4A-6에 나타내었다.
도 4A-4E에 도시된 바와 같이, 1 mg/kg (4D) 또는 0.3 mg/kg (4E)의 FluAB_MLNS로 처리된 마우스는 처리되지 않은(4A) 및 FluAB_wt-주사된 (4B 및 4C) 마우스와 비교하여 낮은 체중 감소를 나타냈다.
FluAB_wt와 비교하여 FluAB_MLNS의 더 나은 보호 활성은 도 5A 및 5B에 표시된 생존 분석에서 확인되었다.
FluAB_MLNS 및 FluAB_wt 간의 효능 차이는 항체의 i.v. 투여 1일 및 7일째에 측정된 것처럼 혈청에서 순환 항체의 수준 차이와 상관 관계가 없었다 (도 6). 참고로, 순환 항체의 검출 가능한 수준은 주사 후 14일에 측정되지 않았다(표시되지 않음).
요약하면, FluAB_MLNS는 Tg32 마우스에서 비교 항체 FluAB_wt보다 H1N1 PR8 비강 내 바이러스 접종에 대한 더 나은 보호 능력을 보여주었다. 효능은 순환하는 항체 수준과 무관했다. 이러한 데이터는 Tg32 마우스에 의해 발현된 hFcRn과 FluAB_MLNS의 향상된 상호작용이 보호 활성에 관한 증가된 효능과 같은 연장된 항체 반감기와 관련이 없는 인비보(in vivo) 효과도 매개함을 시사한다.
실시예 6: 다양한 항바이러스제와 항체 FluAB_MLNS의 조합
약물 조합은 내성을 선택할 확률을 줄이면서 효능을 향상시킬 수 있는 분명한 기회를 제공한다. 더욱이 추정되는 첨가제 또는 시너지 효과는 투여량-절약(sparing) 접근 방법으로 귀결될 수 있다. 현재 FDA 승인을 받은 인플루엔자 치료제는 뉴라미니다제 억제제 오셀타미비르, 자나미비르뿐만 아니라 최근 승인된 엔도뉴클레아제 억제제 계열에 속하는 발록사비르 마르복실을 포함한다.
H1N1 및 H3N2 대표 바이러스 균주 모두에 대한 항바이러스제인 오셀타미비르, 자나미비르 또는 발록사비르 마르복실과 FluAB_MLNS의 결합 활성을 평가하기 위해, 인비트로 중화를 수행하여 결과 억제 효과를 평가했다. 결합 효과의 분석은 중앙효과도(median-effect plot)와 결합지수(CI) 계산을 이용하여 수행하였다.
간단히, MDCK (Madin-Darby 개 신장) 세포를 30,000개 세포/well로 96-웰 플레이트(평평한 바닥, 검은색)에 접종했다. 세포를 37°C 5% CO2에서 밤새 배양했다. 24시간 이후, 60 μl 감염 배지 (MEM (Sigma Aldrich, cat. n. M0644) + Glutamax (Invitrogen, 41090-028) + 1 ug/ml TPCK-처리된 트립신 (Worthington Biochemical #LS003750) + 10 ug/ml 카나마이신) 내 4x 항체 및 항바이러스제(오셀타미비르, 자나미비르 또는 발록사비르 마르복실) 희석물을 도 7에 기새된 플레이트 구성표에 따라 FluAB_MLNS (166.7 nM 최종에서 시작, 9개 수평 지점)의 십자형 1:2 계열 희석 및 다양한 항바이러스제(오셀타미비르, 자나미비르 또는 발록사비르 마르복실), 125 nM에서 시작(자나미비르는 250 nM에서 시작)하여 7개 수직 지점까지)를 사용하여 제조하였다.
각 조합에 대해 3개의 독립적인 플레이트를 제조하여, 각각의 약물-약물 조합 비율을 3회 반복했다. 단일 화합물 적정(즉, FluAB_MLNS, 9개 지점 및 각 항바이러스제, 8개 지점)이 각 플레이트에 포함되었다. 바이러스 용액을 60μl의 TCID50의 120배 농도로 제조하고, MEM에서 1:1로 추가 희석하거나 FluAB_MLNS 희석액과 1:1로 혼합하고 33°C에서 1시간 배양했다. 세포를 보충제 없이 200 μl /well MEM을 사용하여 2회 세척한 다음, 100 μl의 바이러스 단독 또는 100 μl의 FluAB_MLNS/바이러스 혼합물(100x TCID50/well)를 첨가하고 33°C 5% CO2에서 4시간 배양했다. 100 μl/well의 감염 배지를 첨가한 후, 세포를 33℃ 5% CO2에서 72시간 동안 추가로 배양하였다. 감염 후 3일째에, 20 μM MuNANA (4-MUNANA (2_-(4-메틸엄벨리페릴)--D-N-아세틸뉴라미닉산 소듐염 하이드레이트 (Sigma-Aldrich) #69587) 용액을 MuNANA 완충액 (MES 32.5 mM/CaCl2 4mM, pH 6.5)에서 제조하고 50 μl/well을 검은색 96웰 플레이트에 분배하였다. 중화 또는 바이러스 단독 적정 상층액 50μl를 플레이트로 옮기고 37°C에서 60분 동안 배양했다. 그 다음 반응을 100 μl/well 0.2 M 글리신/50% EtOH, pH 10.7로 중단시켰다. 형광 측정기(Bio-Tek)를 사용하여 460 nm에서 형광을 정량화했다.
바이러스 중화 비율은 다음 공식에 따라 계산되었다:
Figure pct00001
여기서 fx = 샘플 형광 신호(세포 + 바이러스 + FluAB_MLNS + 항바이러스); fmin = 최소 형광 신호(세포 단독, 바이러스 없음); fmax = 최대 형광 신호(세포 + 바이러스만).
중화 분획 데이터는 Chou 및 Talalay 방법에 따라 약물-약물 조합에 대한 용량-효과 관계의 정량적 분석을 계산하는 데 사용되었다 (Chou TC, Talalay P: Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 1984, 22:27-55). 조합 지수, 영향을 받는 분율(Fa) 및 이소볼로그램 조합은 CompuSyn 소프트웨어를 사용하여 얻었다 (ComboSyn Inc., Paramus, NJ, USA) (Chou T-C: Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews 2006, 58:621-681).
결과는 도 8A - 26F에 나와 있으며 아래에 설명되어 있다.
FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합
A형 인플루엔자 바이러스를 중화시키기 위한 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 상대적인 효능은 H3N2 및 H1N1 균주 모두에 대한 두 가지 바이러스 혈청형 대표에 대해 인비트로에서 비교되었다. 도 8A-8D에 나타낸 바와 같이, 별도로 시험된 두 화합물은 H3N3 및 H1N1 바이러스와 함께 독립적으로 노출되었을 때 용량 의존적으로 세포 감염을 완전히 억제할 수 있었다(도 8A, 8B). 데이터 로그 선형화(Chou TC, Talalay P: Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 1984, 22:27-55에 설명된 바와 같음) 이후 중앙값 효과 플롯(도 8C, 8D)로부터 계산된 IC50 값은 실제로 FluAB_MLNS (각각 H3 및 H1 균주에 대해 17.9 및 15.6 nM) 및 오셀타미비르 (각각 H3 및 H1 균주에 대해 7 및 9.1 nM) 모두에 대해 나노몰 범위에 있다. 전반적으로, H3과 H1 바이러스 감염 사이에 FluAB_MLNS에 의한 억제 반응의 측면에서 실질적인 차이가 측정되지 않은 반면, H1N1 바이러스는 오셀타미비르의 억제 효과에 약간 더 민감한 결과를 보였다.
H3 및 H1 바이러스로 MDCK 세포의 감염을 중화하는 데 FluAB_MLNS와 오셀타미비르의 조합 효과를 테스트하기 위해, 두 화합물을 위에서 설명한 대로 서로 다른 비율로 연속적으로 희석하고 다른 약물 농도의 존재 하에 뉴라미니다제(NA; 배양물 내 바이러스 함량을 판독)의 효소 활성을 평가하고 단일 약물 효과와 비교했다. FluAB_MLNS로 측정된 중화 효과는 두번째 화합물의 헤테로몰 농도의 동시 존재에 의해 크게 향상되어, H3 및 H1 바이러스 감염 모두에 대한 상가적(addictive) 효과보다는 시너지 효과를 시사한다 (도 9A-9B). 오셀타미비르의 억제 작용에 대한 H1 및 H3 바이러스의 약간 다른 감수성이 감지되었다.
다양한 약물 조합 비율의 추정 시너지 효과를 정확하게 정량화하기 위해, 중화 데이터를 중앙값 효과 원리에 따라 추가로 변환하고 위에서 설명한 대로 CompuSyn 소프트웨어로 분석했다. 여러 가지 다른 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합 상수 비율의 효과는 도 10A-10B에 나타난 바와 같이 중앙값 효과 플롯에 표시되었다.
CompuSyn 소프트웨어는 중간 효과 방정식의 대수 변환을 실험 데이터에 적용하고 다양한 약물 조합의 효능(IC50)과 이른바 조합 지수(CI)를 모두 계산한다. CI는 질량 작용 법칙의 물리화학적 특성을 고려한 Chou-Talalay(중간값-효과) 방정식 파생 매개변수로, 특정한 효과를 달성하기 위해 제2 약물과 조합한 제1 약물 용량 부분 사이에 두 비율의 합을 동일한 효과를 얻기 위해 단일 제1 및 제2 약물의 투여량으로 나눈 결과이다. 이 수학적 알고리즘에 따르면, CI=1은 상가적(addictive) 효과를 나타내며, CI<1은 시너지를 나타내?m CI>1은 길항 작용을 나타낸다.
도 11A-11F 및 12A-12E에 나타낸 바와 같이, H1(도 11A-11F) 및 H3 바이러스(도 12A-12E) 모두에 대해 테스트된 모든 조합 비율에 대해, 억제된 분획 범위에 걸쳐 예측된 CI 값은 모든 약물 조합 비율에 대해 1보다 훨씬 낮은 곡선을 설명했으며 다양한 조합 농도의 실제 실험 지점도 거의 모든 조합에 대해 1 미만의 범위였다. 종합하면, 이 데이터는 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르를 조합했을 때 시너지 효과를 나타낸다.
동일한 데이터는 단일 및 복합 약물의 등능 농도를 비교하는 이소볼로그램 플롯으로 대안적으로 설명할 수 있다. 도 13 및 14에 나타난 바와 같이, 세 가지 다른 조합에 대한 IC50, IC75, 및 IC90 값의 분포는 H1(도 13A-13C) 및 H3(도 14A-14C) 모두에 대해 테스트된 단일 약물의 각각의 IC50, IC75, 및 IC90을 연결하는 아이소볼 라인(isobole lines)보다 훨씬 낮으며, 일관된 시너지를 나타낸다(첨가제와 길항 작용은 각각 단일 약물 이소볼(isobole)에(onto) 또는 위에(over) 국한된 등가점(equipotency points)을 생성함).
FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합
A형 인플루엔자 바이러스를 중화하기 위한 FluAB_MLNS 및 자나미비르의 상대적 효능은 H3N2 및 H1N1 균주 모두에 대한 두 가지 바이러스 혈청형 대표에 대해 인비트로에서도 비교되었다. 도 15A-15D에 나타낸 바와 같이, 별도로 시험된 두 화합물은 H3N3 및 H1N1 바이러스와 함께 독립적으로 노출되었을 때 용량 의존적으로 세포 감염을 완전히 억제할 수 있었다. 상대적으로 계산된 IC50 값은 FluAB_MLNS의 경우 23.1-24.4 nM이고 자나미비르의 경우 10.7-13.7 nM이었다.
FluAB_MLNS와 자나미비르의 결합 효과에 대해 도 16A-16B는 오셀타미비르와 유사하게 자나미비르가 H1 및 H3 바이러스 모두에 대한 FluAB_MLNS의 억제 능력을 크게 향상시킨다는 것을 보여준다.
시너지 효과의 정량화는 위에서 설명한 바와 같이 CompuSyn 및 중앙값 효과 원리로 유사하게 계산되었습니다. FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합된 효과에 대한 중앙값 효과 플롯은 도 17A-17B에 나와 있다. FluAB_MLNS 및 자나미비르에 대해 계산된 CI는 도 18A-18D 및 19A-19D에 나타냈으며, 테스트된 모든 실험 지점에 대해 1보다 낮은 값으로 표시된 바와 같이, H1(도 18A-18D) 및 H3(도 19A-19D) 모두에서 두 약물 사이에서 시너지 효과를 명확하게 나타낸다. 일관되게, 두 바이러스 균주 모두에서, 이소볼로그램은 IC50, IC75, 및 IC90 값(도 20A-2C 및 21A-21C에 표시)에 걸쳐 강력한 시너지 효과를 나타내며, 이는 모두 단일 약물의 IC 값보다 상당히 낮다.
FluAB_MLNS 및 발록사비르 마르복실의 조합
최근에 승인된 엔도뉴클레아제 억제제 발록사비르 마르복실은 처음에 오셀타미비르 및 자나미비르에 대해 위에서 설명한 것과 유사하게 H1 및 H3 균주 모두에서 FluAB_MLNS 단독과 비교되었다. 결과는 도 22A-22D에 나타냈다. 상대적으로 계산된 IC50 값은 FluAB_MLNS의 경우 20.1-15.4 nM이고 발록사비르 마르복실의 경우 4.9-2.3 nM이었다.
발록사비르는 NA 억제제와 비교하여 바이러스 복제를 억제하는 작용 기전이 다르지만, 약물은 여전히 FluAB_MLNS의 억제 능력을 강력하게 향상시킬 수 있으며, 이는 분명히 시너지 효과를 나타낸다(도 23A-23B). 다른 조합 비율로 얻은 억제 데이터를 사용하여 CompuSyn 소프트웨어로 중앙값 효과를 계산 및 플롯하고 상기 설명한 바와 같이 약물-약물 상호작용 유형을 계산했다(도 24A-24B). FluAB_MLNS 및 발록사비르 마르복실에 대해 계산된 CI(도 25A-25F)는 테스트된 대부분의 실험 지점에 대해 1보다 낮은 값으로 표시된 바와 같이, H1 및 H3 바이러스 모두에서 두 약물 사이의 상승 효과를 분명히 나타낸다. 아이소볼로그램은 IC50, IC75, 및 IC90 값에 걸쳐 강력하고 완전한 시너지 효과를 나타낸다(도 26A-26F).
요약하면, H1 및 H3 균주에 대한 FluAB_MLNS의 중화 능력은 서로 다른 항바이러스제, 즉 NA 억제제인 오셀타미비르 및 자나미비르뿐만 아니라 엔도뉴클레아제 억제제인 발록사비르-마르복실에 의해 시너지적으로 향상된다.
실시예 7: FluAB_MLNS의 임상 연구
A형 인플루엔자 A 질환의 치료 및 예방을 위한 FluAB_MLNS의 안전성, 내약성, 약동학, 면역원성 및 효능을 평가하기 위해 1/2상, 무작위, 위약 대조 연구가 수행된다. FluAB_MLNS는 서열번호: 10에 따른 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 9에 따른 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 본 연구는 세 부분으로 구성된다:
파트 A: 100명의 건강한 성인 대상에서 FluAB_MLNS 단일 상승 용량의 안전성, 내약성, 약동학 및 면역원성을 평가하기 위한 이중 맹검 연구.
파트 B: 파트 A의 약 30-80명의 피험자를 대상으로 초기 용량(즉, 파트 A)에서 약 1년 후에 제공된 두 번째 투여 후 FluAB_MLNS의 안전성, 약동학 및 면역원성을 평가하기 위한 공개 라벨 연구.
파트 C: A형 인플루엔자 질환의 치료 및 예방을 위해 위약과 비교하여 FluAB_MLNS의 안전성, 내약성, 효능, 약동학 및 면역원성을 평가하기 위한 무작위, 이중 맹검 위약 대조 연구. 대상의 수는 최대 2,760이다. 본 연구는 A형 인플루엔자 질환이 확인된 대상에서 A형 인플루엔자 관련 매개변수에 대해 위약과 비교한 FluAB_MLNS의 효과를 평가한다. 이러한 매개변수에는 질병의 중증도, 질병의 지속 기간, A형 인플루엔자 질환에 걸렸을 때 비인두 분비물의 바이러스 부하 크기가 포함된다. 또한 본 연구는 다음을 제공한다:
· A형 인플루엔자 질환 후 숙주 반응에 대한 잠재적 바이오마커에 대한 FluAB_MLNS의 효과 평가;
· A형 인플루엔자 질환이 있는 피험자에서 FluAB_MLNS에 대한 바이러스 내성 출현 모니터링;
· 대상체 유전적 다형성과 FluAB_MLNS 작용 및/또는 약동학 메커니즘 간의 잠재적 관계를 평가;
· A형 인플루엔자 질환으로 인한 의료 방문 빈도 측정;
· FluAB_MLNS가 A형 인플루엔자로 인한 퇴근 시간과 생산성에 미치는 영향을 측정.
FluAB_MLNS는 심각한 인플루엔자 관련 합병증 발병 위험이 낮은 건강한 성인에서 A형 인플루엔자로 인한 질병 예방에 대해 평가된다. FluAB_MLNS는 다양한 계절성 및 유행성 A형 인플루엔자 바이러스에 대해 인비트로 효능이 높으며 동물 모델에서 기타 치명적인 A형 인플루엔자 감염을 예방하는 데 효과적이다. 또한, FluAB_MLNS에 의해 인식되는 에피토프는 A형 인플루엔자 바이러스 중에서 고도로 보존되어 있고 인비트로에서 내성 발달에 대한 높은 장벽을 갖는다.
이 무작위, 위약 대조, 인간 최초, 결합 1/2상 연구는 인플루엔자 감염으로부터 심각한 합병증에 대한 위험 요인이 없는 건강한 성인에서 A형 인플루엔자 질환 예방을 위한 FluAB_MLNS의 안전성, 내약성, 약동학(PK) 및 효능을 평가하도록 설계되었다. 본 연구의 파트 A와 B는 FluAB_MLNS의 안전성과 내약성에 대한 정보뿐만 아니라 PK 프로필 및 항약물 항체(ADA) 생성에 대한 관련 데이터를 수집하도록 설계되었다. 본 연구의 파트 C는 A형 인플루엔자 질환 예방에 있어 FluAB_MLNS의 효능을 평가하고 추가적인 안전성, 내약성 및 PK 데이터를 수집하도록 설계되었다. 잠재적 위험은 아나필락시스 및 기타 심각한 알레르기 반응, 면역 복합 질환 및 주사 부위 관련 반응과 같은 mAb에서 관찰되는 일반적인 안전 위험을 기반으로 한다.
A형 인플루엔자 감염이 있는 경우, 질병의 항체 매개 증진(ADE)의 이론적 위험이 있다. A형 인플루엔자 감염이 있는 경우의 안전성 평가와 일상적인 약물 감시를 포함하여 중요한 잠재적 위험에 대해 대상체를 모니터링하고 위험 최소화 활동이 수행된다.
본 연구는 다가오는 계절 인플루엔자 백신접종을 받지 않은 인플루엔자 감염으로 인한 심각한 합병증의 위험 요소가 없는 18세에서 64세 사이의 건강한 성인을 포함한다.
위약은 이 연구의 대조군이다.
FluAB_MLNS가 A형 인플루엔자 질환을 예방하는 능력을 적절하게 평가하기 위해, 연구 약물 투여는 인플루엔자 시즌 전에 실시한다. 이러한 맥락에서, 본 연구의 파트 A 동안 수집된 데이터는 더 많은 건강한 성인 인구로 확장하기 위해 안전성 및 PK에 대한 충분한 관찰을 제공할 것으로 예상된다.
IM 투여된 FluAB_MLNS의 60~1800mg(60, 300, 1200, 1800mg)의 단일 고정 용량 증량 범위가 연구를 위해 선택되었다. 인간에게 권장되는 최고 시작 용량은 약 5mg/kg 또는 300mg 고정 용량이다.
연구 설계
본 연구는 다음 시즌에 인플루엔자 백신접종을 받지 않은 18세에서 64세 사이의 건강한 성인 지원자에게 근육 내(IM) 투여한 FluAB_MLNS의 무작위, 위약 대조, 1/2상 연구이다. 본 연구는 A형 인플루엔자 질환 예방에 있어 FluAB_MLNS의 안전성, 내약성, 약동학, 면역원성 및 효능을 평가하도록 설계되었다.
본 연구는 3개 파트로 수행된다:
· 파트 A: 1상, 이중 맹검, 단일 상승 용량의 FluAB_MLNS;
· 파트 B: FluAB_MLNS의 두 번째 투여 후 1상, 공개 라벨, 안전성 및 PK;
· 파트 C: 지역사회 획득 A형 인플루엔자 질환 예방에 대한 FluAB_MLNS의 효능을 평가하기 위한 2상, 이중 맹검 연구.
본 연구의 파트 A 동안 수집된 데이터는 개념 증명을 확립하기 위해 더 많은 건강한 성인 인구로 확장하기 위한 안전성 및 PK의 관찰을 제공한다. 파트 A의 SRC 감독과 파트 C의 독립적인 DMC를 포함한 안전 관리 계획은 안전 데이터의 철저한 평가와 잠재적인 안전 신호의 조기 감지를 보장하도록 설계되었다.
첫 번째 인플루엔자 시즌의 약 절반에 대한 데이터를 사용할 수 있게 되면 안전성, 유효성 및 무익성(futility)에 대한 중간 분석이 수행된다.
대상체가 심각한 인플루엔자 질환을 경험하는 경우, 조사자가 적절하다고 판단하는 경우 항바이러스 요법이 제공된다.
연구 참여 기간
파트 A: 스크리닝 및 추적 관찰을 포함하여 각 대상에 대한 예상 총 연구 시간은 약 13개월이다.
파트 B: 각 대상에 대한 예상 총 연구 시간은 파트 B의 경우 약 6개월, 파트 A와 B를 모두 포함하여 총 최대 19개월이다.
파트 C: 스크리닝 및 추적 관찰을 포함하여 각 대상에 대한 예상 총 연구 시간은 약 8개월이다.
파트 A
25명의 대상으로 구성된 4개 집단은 각각 위약과 비교하여 FluAB_MLNS의 안전성과 내약성을 평가하기 위해 1회(또는 그 이상) 근육내(IM) 주사로 구성된 FluAB_MLNS 위약의 단일 용량을 받았다. 4개 집단에 대한 투여 요법은 표 A에 나와 있다.
표 A: 파트 A 집단의 요약
Figure pct00002
적격 대상자는 FluAB_MLNS 또는 위약을 투여받기 위해 4:1 비율로 무작위 배정된 3개의 순차적 집단에 등록되었다. 각 집단의 처음 두 피험자는 FluAB_MLNS 또는 위약을 받기 위해 1:1로 무작위 배정되었다. 24시간의 감시 대상 관찰 후, 각 집단 내의 모든 나머지 대상들은 같은 날에 투여되었고 투여 후 48시간 동안 임상 조사 장소에 남아 있었다.
3일째에 해결되지 않은 국소 내약성 증상은 해결(resolution) 또는 14일째(둘 중 먼저 발생하는 것)까지 추적된다. 국소 내약성 매개변수에는 주사 부위의 통증/압통, 부기, 발적, 멍, 및 가려움증이 포함된다.
대상은 연구 전반에 걸쳐 인플루엔자 유사 질병(ILI)에 대해 적극적으로 모니터링된다. 3일차부터 대상은 일주일에 두 번 전자 장치에서 ILI 증상 감시 질문을 완료한다. 대상은 안전성, PK 및 ADA에 대한 평가를 완료하기 위해 약 1년 동안 연구에 남아 있다.
결과:
백(100)명의 대상이 FluAB_MLNS(N=80) 또는 위약(N=20)의 단일 용량을 받았다. 모든 집단에 대한 예비 맹검 안전성 데이터 및 300 및 1200 mg 집단에 대한 PK 데이터가 수집되었다.
혈청 PK 샘플은 52주 동안 지정된 방문에서 수집되었다. FluAB_MLNS 혈청 농도는 Meso Scale Discovery(MSD) 플랫폼에서 검증된 전기화학발광 방법을 사용하여 결정되었다. PK 매개변수는 WinNonlin® 8.2(Certara L.P., Princeton, NJ)의 표준 비구획 방법을 사용하여 추정되었다. FluAB_MLNS PK 매개변수는 기술 통계를 사용하여 요약되었다.
연구 전반에 걸쳐 부작용 모니터링, 임상 실험실 검사, 신체 검사 및 ECG 평가를 수행했다. 주사 부위 내약성 평가는 투여 후 대략 30분, 2시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 1주 후에 수행되었다.
투약(dosing)은 잘 내약되었다. 대상의 6%(6/100)는 경미한 주사 부위 반응을 경험했으며 일반적으로 48시간 이내에 해결되었다. 투여 후 12주 동안, 부작용(AE)의 대다수(110/112124/126; 98.24%)는 본질적으로 경증 내지 중등도였으며, 심각한 AE는 보고되지 않았으며, AE로 인해 중단된 대상도 없었다. 사용 가능한 데이터를 기반으로 하여, FluAB_MLNS의 300~1200mg 사이의 노출(Cmax 및 AUC)이 용량 비례 방식으로 증가했다. FluAB_MLNS의 PK 프로필은 도 34에 나타나 있으며, 반감기 연장된 IgG와 일치한다. PK 수집은 투여 후 52주까지 계속된다(예를 들어 도 35).
FluAB_MLNS는 건강한 대상에서 최대 1800mg의 단일 IM 투여 후에 내약성이 우수했다. FluAB_MLNS의 예비 PK 프로필은 시즌 투여당 한 번 가능하다.
20주차까지의 모든 투여 그룹에 대한 PK 데이터가 도 36 및 37에 제시되어 있다. Cmax 및 AUCD0-140의 대략적인 용량 비례 증가가 관찰되었고, t1/2는 대략 58일에 추정(예비)된다.
파트 B
파트 A를 완료한 대상은 연구 종료 방문 시 맹검 해제된다. FluAB_MLNS를 받은 대상은 파트 B 참여에 동의할 기회가 있다. 적격 대상(≥30)은 반복 투여 후 FluAB_MLNS의 면역원성, 안전성 및 PK를 평가하기 위해 초기 용량 후 약 12개월 후에 FluAB_MLNS의 두 번째 용량(IM)을 받는다.
대상은 투여 후 최소 2시간 동안 임상 조사 장소에 남아 FluAB_MLNS의 안전성 및 국소 내약성을 평가하고 안전성, PK 및 ADA의 평가를 완료하기 위해 24주 동안 연구에 남아 있다.
파트 B의 연구 약물의 투여를 중단하거나 개별 대상을 중단하기 위한 결정은 미리 결정된 중단 규칙에 따라 내려진다. 중단 규칙이 충족되면 투여가 일시 중지된다. 대상은 인플루엔자 유사 질환(ILI)을 모니터링하기 위해 연구가 끝날 때까지 일주일에 두 번 전자 장치에서 증상 감시 질문을 계속 완료한다.
파트 C
파트 C는 건강한 성인의 지역사회 획득 A형 인플루엔자 질환 예방에 있어 FluAB_MLNS의 안전성과 효능을 평가하기 위해 설계되었다. 파트 C의 용량 선택 및 등록은 집단 1에서 최소 45일, 집단 2에서 최소 21일 동안 사용 가능한 안전성 데이터를 포함하여 파트 A에서 수집된 안전성 데이터 및 사용 가능한 PK 후 시작된다. 집단 3 및 4로부터 사용 가능한 안전성 데이터도 검토된다.
파트 A로부터 PK 데이터를 검토하여 파트 C에 대한 용량 선택을 결정한다. 추가 3상 연구를 위한 노출-반응 분석 및 용량 선택을 허용하기 위해 파트 C에서 최대 2개의 용량 수준을 평가한다. 파트 C에서 평가를 위해 선택한 용량은 투여 후 최소 6개월 동안 최소 FluAB_MLNS 혈청 농도를 8μg/mL로 유지하기 위해 파트 A로부터 사용 가능한 PK 데이터를 고려한다. 최대 1380명의 대상이 FluAB_MLNS 또는 위약을 받도록 무작위화되고 등록된다.
파트 C에서 1개 또는 2개의 용량 수준을 평가할 수 있다. 2개의 용량 수준을 평가하는 경우, 적격 대상은 무작위 배정되어 1일째에 FluAB_MLNS 또는 위약을 2(n=460):2(n=460):1(n=230 ):1(n=230)의 비율로 받는다. 하나의 용량 수준이 평가되는 경우, 대상은 1(n=460):1(n=460) 비율로 무작위화된다. 각 용량 수준에는 주사 횟수 및 부피에 대해 일치하는 위약이 있다. 대상은 주사 부위(들)에서 FluAB_MLNS의 안전성 및 국소 내약성을 평가하고 평가를 완료하기 위해 투여 후 최소 2시간 동안 임상 조사 장소에 남았다.
대상은 연구 전반에 걸쳐 ILI에 대해 적극적으로 모니터링된다. 대상은 전자 장치에서 일주일에 두 번 ILI 증상 감시 질문을 완료한다. ILI를 경험하는 대상은 임상 내 평가, 자가 보고된 인플루엔자 증상 중증도 및 WPAI 설문지를 완료하고 후속 조치를 취했다. 다음과 같이 정의되는 ILI와 일치하는 증상을 경험하는 대상:
· ≥1 호흡기 증상(기침, 인후통, 콧물, 울혈)
및
· ≥1 전신 증상(발열[구강 온도 >38°C(100.4°F)], 오한, 근육통, 두통, 권태감, 피로)
연구의 모든 부분에 대해 혈액 샘플을 수집하여 항-약물 항체(ADA)의 존재/부재 및 역가를 결정했다. 샘플은 또한 항-FluAB_MLNS 항체의 중화 가능성을 적절하게 특성화할 수도 있다.
모든 대상은 안전성, PK 및 ADA의 평가를 위해 연구 약물을 받은 후 약 4주 및 12주 후에 그리고 인플루엔자 시즌이 끝난 후 약 2주 후에 후속 방문이 있었다. 용량 수준이 FluAB_MLNS의 두 번째 주사가 필요한 경우, 두 번째 주사는 12주차 방문에 투여된다. 대상은 주사 부위(들)에서 FluAB_MLNS의 안전성 및 국소 내약성을 평가하기 위해 투여 후 최소 2시간 동안 클리닉에 남았다.
중간 분석은 첫 번째 인플루엔자 시즌의 약 절반에 대한 데이터가 파트 C에 제공될 때 수행되고, 시즌이 끝날 때 연구를 종료하거나 두 번째 인플루엔자 시즌에 계속 등록하기로 결정하는 근거를 형성한다.
파트 C의 경우 연구 방문의 종료는 각 반구의 대략적인 독감 시즌 종료를 기준으로 정의된다. 남반구 참여 국가의 경우, 독감 시즌 종료는 9월 30일로 정의되며, 연구 방문의 종료는 대략 10월 중순까지 완료된다. 북반구 참여 국가의 경우, 독감 시즌 종료는 4월 30일로 정의되며, 연구 방문의 종료는 대략 5월 중순까지 완료된다.
파트 C의 경우에만, IgG(FcγR) 및 IgG1 대립 유전자 유전자형에 대한 Fc 수용체에 대한 혈액 샘플을 수집하여 FluAB_MLNS 작용 기전 또는 PK와의 잠재적 관계를 평가한다. 대상에게는 특히 유전자형 평가를 위한 사전 동의(informed consent)가 제공된다.
대상 집단(Subject Population)
대상은 무작위화 당시 18세 내지 64세였다. 대상은 파트 A 및 B에 대한 급성 또는 만성 질환이 없는 건강한 남성 및 여성이다. 파트 C의 경우, 대상은 건강 상태가 양호해야 하고 병력에서 결정되어야 하며(예를 들어 고혈압, 고지혈증, 위식도 역류 질환, 불안 또는 우울증과 같은 만성 질환은 안정적인 용량의 약물을 복용해야 함), 신체 검사, 12-리드 ECG, 바이탈 사인 및 실험실 값으로부터 임상적으로 유의한 결과가 없어야 한다. 체질량 지수는 파트 A와 B의 경우 18kg/m2 ~ 32kg/m2이고 파트 C의 경우 18kg/m2 ~ 35kg/m2이다. 여성은 임신 테스트 음성 또는 폐경 후 상태의 확인이 있어야 한다. 가임기 여성 파트너가 있는 남성 대상은 마지막 후속 방문까지 피임 사용에 동의하거나 무정자증이 기록된 정관 절제술에 동의해야 한다. 파트 A와 B의 환자는 비흡연자이다. 파트 A의 환자는 연구 약물 투여 전에 72시간 동안 알코올 및 24시간 동안 카페인을 금하는 데 동의해야 한다. 파트 B의 환자는 약 12개월 전에 FluAB_MLNS를 받고 파트 A를 완료했다.
연구 절차
파트 A
스크리닝:
스크리닝은 1일차 방문 이전 4주 이내에 수행되었으며 서면 동의서, 적격성 결정, 인구 통계 및 병력 수집뿐만 아니라 신체 검사(바이탈 포함), 실험실 테스트, 12-리드 심전도(ECG) 및 파트 A 평가 일정에 따른 기타 평가(그림 27A-27B)가 포함된다.
입원 기간 (-1일 내지 3일):
모든 대상은 -1일에 임상 조사 장소에 입원하였고 관찰, 실험실 평가 및 PK 샘플링을 위해 투여 전 적어도 12시간 동안 및 투여 후 48시간 동안 감금되었다. 적격 대상은 제1일에 FluAB_MLNS 또는 위약을 투여받도록 무작위화되었다. 약동학적 시점 일정에 따라 혈청 및 비인두 PK 샘플을 채취했다(도 31). 대상은 모든 연구 평가가 3일에 수행된 후 퇴원했다.
후속조치 기간:
대상은 신체 검사(바이탈 포함), 12-리드 ECG, 실험실 테스트(안전성, PK 및 ADA), 적절한 경우 AE 및 수반되는 약물의 검토를 포함하나 이에 제한되지 않는 파트 A 평가 일정(도 27AA-27B)에 따라 대면 평가를 위해 임상 조사 장소로 돌아갔다. 혈청 및 비인두 PK 샘플은 약동학적 시점 일정에 따라 채취되었다(도 31). 대상들은 연구가 끝날 때까지 일주일에 두 번 전자 장치에서 ILI 증상 감시 질문을 완료했다. 대상이 ILI를 경험한 경우 인플루엔자 유사 질환 모니터링 일정에 따라 파트 C와 동일한 제공(provisions)에 따라 모니터링되었다(도 30).
파트 B
스크리닝:
추가 제품 개발을 지원하는 연구 파트 A 및 C의 안전성, PK 및 효능 데이터 평가를 제공하면, FluAB_MLNS를 받은 대상은 파트 B로 진행할 수 있다. 대상 무작위 배정은 파트 A 연구 종료 방문 시 맹검 해제되고, FluAB_MLNS를 받은 대상은 최초 투여 후 약 12개월 후에 FluAB_MLNS의 두 번째 투여를 받을 자격이 있는지 평가하는 데 동의할 수 있다. 파트 B 평가 일정(도 28A-28B)에 따른 스크리닝 평가는 제1일 방문 이전 4주 이내에 수행된다.
투여 (제1일):
적격 대상은 제1일에 투여량 FluAB_MLNS를 받는다. 대상은 FluAB_MLNS의 안전성 및 국소 내약성을 평가하고 파트 B 평가 일정(도 28A-28B)에 따른 완전한 평가를 평가하기 위해 투여 후 최소 2시간 동안 클리닉에 남아 있다.
후속 조치 기간:
대상은 신체 검사(바이탈 포함), 실험실 테스트(안전성, PK 및 ADA 포함), 적절한 경우 AE 및 수반되는 약물의 검토를 포함하나 이에 제한되지 않는 파트 B 평가 일정(도 28A-28B)에 따라 대면 평가를 위해 임상 조사 장소로 돌아간다. 대상은 연구 종료까지 일주일에 두 번 전자 장치에서 ILI 증상 감시 질문을 완료한다. ILI를 경험하는 대상은 인플루엔자 유사 질환 모니터링 일정(도 30)에 따라 파트 C와 동일한 제공에 따라 모니터링된다.
파트 C
스크리닝:
스크리닝은 1일차 방문 전 4주 이내에 수행되며, 서면 동의서, 적격성 결정, 인구 통계 및 병력 수집뿐만 아니라 신체 검사(바이탈 포함), 실험실 테스트, 12-리드 심전도(ECG) 및 파트 C 평가 일정에 따른 기타 평가(도 29A-29B)를 포함한다.
투여 (제1일):
두 가지 용량 수준이 평가되면, 적격 대상은 1일차에 FluAB_MLNS 또는 위약을 2(n=460):2(n=460):1(n=230):1(n=230) 비율로 투여하도록 무작위화된다. 하나의 용량 수준이 평가되면, 대상은 1(n=460):1(n=460) 비율로 무작위화된다. 선택된 용량 수준에서 FluAB_MLNS의 두 번째 주사가 필요한 경우, 두 번째 주사는 12주 방문 시에 투여된다. 각 용량 수준에는 주사 횟수 및 용량에 대해 일치하는 위약이 있다. 대상은 주사 부위(들)의 안전성 및 국소 내약성을 평가하고 파트 C 평가 일정(도 29A-29B)에 따라 평가를 완료하기 위해 투여 후 최소 2시간 동안 임상 조사 장소에 남아 있다.
후속 조치 기간:
대상은 파트 C 평가 일정(부록 4)에 따라 임상 내 평가를 위해 임상 조사 장소로 돌아간다. 대상은 연구 종료까지 일주일에 두 번 전자 장치에서 ILI 증상 감시 질문을 완료한다. 추적 관찰 중 호흡기 증상(기침, 인후통, 콧물, 울혈)이 1개 이상이고 전신 증상(발열, 오한, 근육통, 두통, 권태감, 피로)이 1개 이상으로 정의되는 ILI와 일치하는 증상을 경험하는 대상은 발병한 당일에 증상을 보고해야 하고 인플루엔자 유사 질환 모니터링 일정(도 30)에 따라 임상 내 평가를 준비한다.
임상 내 평가에는 신체 검사(바이탈 사인 포함), 실험실 테스트(안전성 포함), 바이러스학(virology)을 위한 비인두 면봉 채취, PK 및 ADA에 대한 혈액 샘플, 적절한 경우 AE 및 병용 약물의 검토가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 대상은 또한 인플루엔자 증상 중증도를 자가 보고하고 인플루엔자 유사 질환 모니터링 일정(도 30)에 따라 WPAI 설문지를 작성한다. WPAI는 특정 건강 문제로 인한 결근(absenteeism)(결근 시간), 프리젠티이즘(presenteeism)(업무 효율성 감소), 업무 생산성 손실 및 활동 손상에 대한 검증되고 환자 보고된 정량적 평가이다.
ILI를 나타내는 대상은 ILI-D1 및 ILID8에 대한 6개 항목 WPAI 설문지를 작성한다(도 30 참조).
인플루엔자 증상 심각도 설문지
대상은 인플루엔자와 관련된 전신 및 호흡기 증상(즉, 기침, 인후통, 두통, 코 막힘, 발열 또는 오한, 근육 또는 관절 통증, 피로)에 대한 자가 평가를 수행한다. 그들은 4점 평가 척도(0, 없음, 1, 경미함, 2, 보통, 3, 심함)를 사용하여 그들의 증상의 심각성을 채점한다. 이 이러한 정보는 인플루엔자 유사 질환 모니터링 기간 동안 ILI-D1에서 ILI-D10(10일 포함)까지 매일 두 번 전자 장치에 캡처된다(도 30).
항-A형 인플루엔자 항체 역가
본 연구의 모든 부분에서, 혈액 샘플을 수집하여 파트 A, B 및 C 평가 일정(각각 도 27A/27B, 28 및 29) 및 도 30 내 인플루엔자-유사 질환 모니터링 일정에 따른 표준 방법을 사용하여 항-A형 인플루엔자 항체 역가를 측정한다. 샘플 처리에 대한 세부 정보는 실험실 매뉴얼(Laboratory Manual)에 제공된다.
저항 감시
본 연구의 모든 부분에서, 인플루엔자 유사 질환 모니터링 일정(도 30)에 따라 연구 약물을 투여받고 실험실에서 확인된 A형 인플루엔자 바이러스 감염이 있는 모든 대상에 대해 F luAB_MLNS에 대한 내성의 잠재적 출현에 대한 내성 감시가 수행된다. A형 인플루엔자 바이러스 감염이 확인된 대상의 비인두 면봉 샘플은 아미노산 변이체를 결정하기 위해 HA 유전자의 심층 시퀀싱 분석을 받는다. 항바이러스 내성의 출현을 평가하기 위해, 실험실에서 A형 인플루엔자 바이러스 감염이 확인된 대상에서 바이러스 배양을 시도하고 확인된 IAV가 있는 대상체에서 배양된 바이러스에 대한 FluAB_MLNS의 항바이러스 활성의 인비트로 표현형 분석을 시도한다. IAV가 배양될 수 없는 대상의 경우, A형 인플루엔자 바이러스 양성 대상의 HA 유전자를 포함하는 재조합 바이러스는 확립된 역유전적 절차를 사용하여 생성되고 재조합 바이러스는 표현형 분석을 받는다.
탐색적 바이오마커
파트 C의 경우 및 ILI 모니터링 동안, 감염 또는 숙주 반응의 잠재적 바이오마커를 탐색하기 위해 평가 일정(각각 도 29A-29B 및 30)에 따라 샘플을 수집할 것이다. 샘플 수집 및 처리에 대한 세부 정보는 실험실 설명서에 포함되어 있다.
유전자형
임의의 샘플 수집을 수행하기 전에 특히 유전자형 평가에 대한 피험자의 서명 및 날짜 정보 동의를 얻었다. 파트 C의 경우에만, FluAB_MLNS 작용 기전 또는 PK와의 잠재적 관계를 평가하기 위해 도 29의 평가 일정에 따라 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR) 및 IgG1 대립형질 유전자형에 대한 혈액 샘플을 수집한다.
제품
FluAB_MLNS는 밀폐된 마개가 있는 유리 바이알에 300mg 동결건조된 고체로 제공된다. USP 주사용수를 사용하여 150 mg/mL로 재구성할 때, 투여되는 약물 제품은 pH 6에서 20mM 히스티딘, 5.3% 수크로스 및 0.02% PS80을 포함한다. FluAB_MLNS는 근육내 주사된다. 단위 용량은 부피를 기준으로 한다(주사당 0.8mL 내지 4mL). FluAB_MLNS의 안전한 취급을 위한 특별한 절차는 필요하지 않다. FluAB_MLNS는 안전한 온도 제어 환경에 저장된다.
위약은 IM 주사용 멸균, 방부제가 없는 생리 식염수 0.9% 용액이다.
통계적 방법
파트 A 및 파트 B
통계 분석은 주로 설명적이다. 모든 연구 데이터는 데이터 목록에 표시된다.
요약 표는 적절한 경우 각 FluAB_MLNS 용량 및 위약에 대한 집단별 결과를 제시한다. 연속형 변수에 대해서는 기술적(descriptive) 통계량이 제시되고, 범주형 및 순서형 변수에 대해서는 빈도와 백분율이 제시된다. 백분율은 용량 그룹에서 결측되지 않은 값의 수를 기반으로 한다. PK에 대한 ADA의 영향 및 AE 및 SAE와의 연관성을 평가할 수 있다.
파트 C
효능 분석을 위한 1차 분석 모집단은 전체 분석 세트(FAS)이며, 이는 임의의 양의 연구 약물을 받는 모든 무작위 대상을 포함한다. 1차 유효성 종점은 1 이상의 호흡기 및 1 이상의 전신 증상으로 정의되는 실험실에서 확인된(RT-PCR에 의해) A형 인플루엔자 질환이 있는 대상자의 비율이다. 1차 분석은 프로토콜 정의 A형 인플루엔자 발병률 감소를 기반으로 한 FluAB_MLNS의 위약 대비 우월성 테스트로 구성된다. 두 가지 투여량 수준을 평가한다면, 2-사이드(2-sided) 0.05 수준에서 순차검증원칙에 따라 다음과 같은 가설을 검정한다. 귀무(null) 가설이 기각되지 않으면, 형식 순차 테스트가 중단되고, 나머지 가설에 대해 명목상 유의성만 보고된다:
1. A형 인플루엔자 발병률로 정의된 프로토콜을 기반으로 한 FluAB_MLNS 용량 수준 2(높음)의 위약 대비 우월성
2. A형 인플루엔자 발병률로 정의된 프로토콜을 기반으로 한 FluAB_MLNS 용량 수준 1(낮음)의 위약 대비 우월성
파트 C에서 두 가지 용량 수준을 평가하는 경우, 각 FluAB_MLNS 그룹의 460명의 대상 및 일치하는 각 위약 그룹의 230명의 대상의 샘플 크기는 2-사이드 0.05-수준 테스트를 사용하여 위약 그룹 및 FluAB_MLNS 그룹 사이의 프로토콜 정의된 질병률(4.5% 내지 1.35%)에서 70% 감소를 감지하기 위해 약 80%의 검정력(power)을 제공한다. 총 약 1380명의 대상이 등록되었다.
하나의 용량 수준만 평가하는 경우, 총 약 920명의 대상이 등록된다. FluAB_MLNS 그룹의 460명의 대상과 위약 그룹의 460명의 대상의 샘플 크기는 2-사이드 0.05-수준 테스트를 사용하여 위약 그룹과 VIR-2482 사이에서 각각 프로토콜 정의된 질병률(4.5% 내지 1.35%)에서 70% 감소를 감지하기 위해 약 80%의 검정력(power)을 제공한다.
중간 분석이 추가 대상의 등록을 유발하는 경우, 두 가지 용량 수준이 평가되는 경우 약 1380명의 추가 대상이 등록된다. 총 연구 샘플 크기는 약 2760명의 대상이다. 하나의 용량 수준만 평가되는 경우, 약 920명의 추가 대상이 등록된다. 총 연구 샘플 크기는 약 1840명이다. FluAB_MLNS 그룹의 920명의 대상과 위약 그룹의 920명의 대상으로 구성된 샘플 크기는 2-사이드 0.05-수준 테스트를 사용하여 플라시보 그룹 및 FluAB_MLNS 그룹 사이에서 각각 프로토콜 정의된 질병률(2.25% 내지 0.675%)의 70% 감소를 탐지하는 약 80% 검정력을 제공한다.
종점(Endpoints)
파트 A
1차 종점은 다음과 같다:
· 치료-응급 부작용(TEAE) 발생률 및 임상 평가로 측정된 FluAB_MLNS의 안전성 및 내약성
2차 종점은 다음과 같다:
· 단일 용량 FluAB_MLNS 혈청 PK 파라미터 (예를 들어, Cmax, Clast, Tmax, Tlast, AUCinf, AUClast, %AUCexp, t1/2, λz, Vz/F, CL/F)
· FluAB_MLNS에 대한 혈청 ADA의 발생률 및 역가(해당되는 경우)
탐색(exploratory) 종점은 다음을 포함할 수 있다:
· 단일 용량 FluAB_MLNS 비인두 분비 PK 매개변수 (예를 들어, Cmax, Clast, Tmax, Tlast, AUCinf, AUClast, %AUCexp, t1/2, λz, Vz/F, CL/F)
파트 B
1차 종점은 다음과 같다:
· FluAB_MLNS에 대한 ADA의 발생률 및 역가(해당되는 경우)
2차 종점은 다음과 같다:
· 치료-응급 부작용(TEAE) 발생률 및 임상 평가로 측정한 FluAB_MLNS의 안전성 및 내약성
· FluAB_MLNS 혈청 PK 매개변수 (예를 들어, Cmax, Clast, Tmax, Tlast, AUCinf, AUClast, %AUCexp, t1/2, λz, Vz/F, CL/F)
파트 C
1차 종점은 다음과 같다:
· 치료 후 발생하는 유해 사례(TEAE) 발생률 및 임상 평가로 측정한 FluAB_MLNS의 안전성 및 내약성.
· 효능: ≥1 호흡기 및 ≥1 전신 증상으로 정의된, 실험실에서 확인된(RT-PCR에 의해) A형 인플루엔자 A 질환이 있는 대상의 비율
2차 종점은 다음과 같다:
· 배양물-확인된 A형 인플루엔자 질환을 갖는 대상의 비율
· A형 인플루엔자로 인한 ILI의 피험자가 보고한 징후 및 증상의 심각도 및 기간
· RT-qPCR 및 바이러스 배양에 의한 초기 증상 발현 시 비인두 분비물에 존재하는 바이러스 부하의 정량화
· 혈청 내 FluAB_MLNS의 PK
· FluAB_MLNS에 대한 ADA의 발생률 및 역가(해당되는 경우)
탐색 종점은 다음을 포함할 수 있다:
· ILI 제시 후 숙주 반응에 대한 잠재적 바이오마커에 대한 FluAB_MLNS의 효과
· A형 인플루엔자 질환이 있는 대상에서 FluAB_MLNS에 대한 바이러스 내성 발생
· 유전자형 및 FluAB_MLNS 작용 기전 및/또는 PK와의 잠재적 관계에 의해 결정된 FcR 다형성
· 유전자형에 의해 결정된 IgG1 알로타입(allotypes)
· ILI 모니터링 기간 동안 의료적으로 참석한 의료(healthcare) 방문 비율
· A형 인플루엔자 질환으로 인한 업무 생산성 및 활동 장애(WPAI) 측정
이러한 실시예에서 용어의 약어 및 정의의 목록
ADA 항약물 항체
ADE 항체 의존성 강화
AE 부작용
ALT 알라닌 아미노전이효소
ALP 알칼리 인산분해효소
AST 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제
AUC 곡선 아래의 면적
BLQ 정량 한계 미만
BMI 체질량 지수
BUN 혈액 요소 질소
CLcr 크레아티닌 청소율
CMC 화학, 제조, 및 제어
CTCAE 부작용(Adverse Events)에 대한 공통 용어 기준
DMC 데이터 모니터링 위원회
EC 윤리 위원회
ECG 심전도
eCRF 전자 사례 보고서 양식
EOS 연구 종료
ET 조기 종료
FcR IgG에 대한 Fc 수용체
FDA 식품의약국
GCP 우수 임상 사례
GGT 감마 글루타밀 전이효소
GLP 우수 실험실 관행
GMP 우수 제조 관행
HA 헤마글루티닌
HED 인간 동등 용량(equivalent dose)
Hgb 헤모글로빈
ICF 사전 동의서
ICH 조화에 관한 국제 회의(International Conference on Harmonisation)
IgG 면역 글로불린 G
ILI 인플루엔자 유사 질환
IM 근육내
IND 연구용 신약
INR 국제 표준화 비율
IP 조사 제품
IRB 기관 심사 위원회
IV 정맥 주사
IWRS 대화형 웹 응답 시스템
LDH 젖산 탈수소효소
LLN 정상의 하한
LLOQ 정량의 하한
LLT 하위 수준 용어(Lower-Level Term)
mAb 단일클론 항체
MedDra 규제 활동을 위한 의학 사전
NOAEL 관찰된 부작용 수준 없음
OTC 일반의약품(over-the-counter)
PK 약동학
POC 개념 증명
RBC 적혈구
SAD 단일 상승 용량
SAE 심각한 부작용
SD 표준편차
SOC 시스템 오르간 클래스
SRC 안전성 검토 위원회
SUSAR 의심되는 예상치 못한 심각한 부작용
ULN 정상의 상한
WBC 백혈구
WHO 세계보건기구
WOCBP 가임기 여성
WPAI 작업 생산성 및 활동 장애
실시예 8: 여러 pH에서 인간 FcRn에 결합
FluAB_wt 및 FluAB_MLNS는 생물층 간섭계(biolayer interferometry, BLI)를 사용하여 신생(neonatal) Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 능력에 대해 나란히 비교되었다. 이를 위해, 인간 FcRn에 대한 FluAB_wt 및 FluAB_MLNS의 결합을 Octet RED96 기기(biolayer interferometry, BLI, ForteBio)에서 측정하였다. 항-인간 Fab-CHI로 코팅된 바이오센서는 실온에서 10분 동안 운동(kinetic) 완충액에서 미리 수화되었다. 그 다음, 인간 mAb(FluAB_wt 또는 FluAB_MLNS)를 바이오센서에 30분 동안 pH 7.4의 운동 완충액에서 1㎍/ml로 로딩했다. 기준선은 4분 동안 pH=7.4 또는 pH=6.0에서 운동 완충액(멸균 여과된 0.01% 내독소가 없는 소 혈청 알부민, 0.002% Tween-20(폴리소르베이트 20), PBS 중 0.005% NaN3)에서 측정되었다. 이후, 인간 mAb-로딩된 센서를 pH=7.4 또는 pH=6.0의 운동 완충액 중 1㎍/ml의 인간 FcRn 용액에 7분 동안 노출시켜 상이한 환경(속도에 따라)에서 FcRn-mAb의 결합을 측정하였다. 이어서, 해리(dissociation)를 운동 완충액에서 동일한 pH에서 추가 5분 동안 측정하였다(오프 속도(off rate)). 모든 단계는 30℃에서 1000rpm으로 교반하면서 수행하였다. 결합 및 해리 프로파일은 간섭 패턴의 변화로 실시간으로 측정되었다.
도 38A 및 38B에 나타낸 바와 같이, FluAB_MLNS는 산성 pH(pH 6.0)에서 FluAB_wt와 비교하여 더 높은 친화도로 인간 FcRn에 결합한 반면, FluAB_MLNS 및 FluAB_wt는 중성 pH(pH 7.4)에서 FcRn에 결합하지 않았다.
실시예 9: 항체의 확장된 에피토프에서 확인된 다형성의 특성화
확장된 에피토프의 역사적 다형성은 A/Puerto Rico/8/34 (PR8) 배경에서 H1 HA 또는 H3 HA로 역유전학에 의해 생성된 바이러스를 사용하여 FluAB_MLNS의 중화 활성에 미치는 영향을 평가했다.
단일 뉴클레오티드 다형성은 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 PR8 H1 HA 또는 A/Aichi/2/68(Aichi) h-IA pHW2000 플라스미드에 도입되었다. 재조합 A형 인플루엔자 바이러스는 표준 방법을 사용하여 PR8 백본에서 관련 H1 또는 H3 HA와 함께 구조되었다(예를 들어, Erich Hoffmann, Gabriele Neumann, Yoshihiro Kawaoka, Gerd Hobom, Robert G. Webster, 2000, A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences May 2000, 97 (11): 61 08-6113; doi: -10.1073/pnas.t 00-133697에 설명됨).
중화 활성은 표준 방법을 사용하여 MDCK 세포에서 평가되었다. 예를 들어, 중화 활성은 MDCK 세포에서, 예를 들어 96 웰 플레이트에서 평가될 수 있다. 이를 위해 MCDK 세포는 감염 24시간 전에 30,000개 세포/웰로 시딩될 수 있다. 항체 FluAB_MLNS는 MDCK 세포에 추가하기 전에 37°C에서 1시간 동안 바이러스와 함께 배양할 수 있다. 이를 위해 FluAB_MLNS의 1:2.5 9점 연속 희석액을 감염 배지에서 생성하고 각 희석액을 3중으로 테스트할 수 있으며(예를 들어, 50μg/mL - 0.03μg/mL 최종 농도), 37°C에서 1시간 동안 바이러스의 120 TCID50과 함께 배양할 수 있다. MDCK 세포를 PBS로 2회 세척할 수 있고, 100 pl/웰의 바이러스:항체 용액을 첨가할 수 있고, 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양할 수 있다. 4시간 후, 추가 100μL/웰의 감염 배지를 세포에 첨가할 수 있다. 37°C에서 72시간 배양 후, 바이러스 RNA를 추출하고 qRT-PCR로 측정할 수 있으며, 예를 들어 WHO 프라이머(세계 보건 기구. A형 인플루엔자 H1N1에 대한 실시간 RT-PCR의 CDC 프로토콜. 2009년 4월 28일)를 사용하여 측정할 수 있다. IC50은 바이러스 복제의 50%를 감소시키는 μg/mL 단위의 항체 농도로 표시되며, 대조군 웰(바이러스 없음 및 바이러스 단독)에 대해 정규화된 데이터의 비선형 4-매개변수 로지스틱 적합 곡선을 사용하여 계산될 수 있다.
확장된 에피토프에서 HI 및 H3 HA 다형성에 대한 FluAB_MLNS의 중화 활성을 하기 표 4에 나타내었다.
바이러스 HA에 아미노산 변화 FluAB_MLNS
기하평균(Geomean) 중화 IC 50 (μg/mL) WT 바이러스에 대한 배수 변화
PR8:Aichi HA wt 야생형 5.6 NA
PR8:Aichi HA P11S P11S 9.5 1.7
PR8:Aichi HA D46N D46N 3.3 0.6
PR8:Aichi HA N49T N49T 5.0 0.9
PR8 wt 야생형 4.7 NA
PR8 HA N146D N146D 5.5 1.2
표 4. Aichi = A/Aichi/2/68; 기하평균(Geomean) = 기하평균(geometric mean); HA = 혈구응집소; NA = 해당 없음; PR8 = A/Puerto Rico/8/34 H1N1; wt = 야생형
H3 HA를 코딩하는 바이러스의 경우, IC50 값을 갖는 돌연변이 HA1 P11S, HA2 D46N, 또는 HA2 N49T와 함께 FluAB_MLNS 중화된 바이러스는 야생형 바이러스와 유사하다 (야생형 바이러스에 비해 IC50의 <2배 변화). H1 HA를 코딩하는 바이러스의 경우, FluAB_MLNS는 야생형 바이러스와 유사한 IC50- 값으로(야생형 바이러스에 비해 IC50의 <2배 변화) HA2 N146D를 코딩하는 바이러스를 중화했다. 추가적으로, 사용된 PR8 야생형 균주는 HA2 다형성 L38Q 및 D46N을 코딩하고 FluAB_MLNS에 의해 4.7 μg/mL의 IC50- 값으로 중화되었다. 전반적으로, 평가된 모든 다형성은 FluAB_MLNS에 대한 야생형 바이러스에 비해 <2의 IC50 배수 변화를 초래했다. 요약하면, FluAB_MLNS는 확장된 에피토프(H3 HA: HA1 P11S, HA2 D46N, 또는 HA2 N49T; H1 HA: N146D)에서 평가된 모든 역사적(historical) 다형성을 효과적으로 중화했다.
실시예 10: Tg32 마우스에서 항-약물 항체 반응
M428L/N434S 돌연변이와 관련하여 최근 상기 돌연변이가 이러한 돌연변이를 포함하는 항체의 면역원성을 증가시킨다는 우려가 제기되었다(Brian C. Mackness, Julie A. Jaworski, Ekaterina Boudanova, Anna Park, Delphine Valente, Christine Mauriac, Olivier Pasquier, Thorsten Schmidt, Mostafa Kabiri, Abdullah Kandira, Katarina Rado??eviζ & Huawei Qiu (2019) Antibody Fc engineering for enhanced neonatal Fc receptor binding and prolonged circulation half-life, mAbs, 11:7, 1276-1288; Maeda A, Iwayanagi Y, Haraya K, et al. Identification of human IgG1 variant with enhanced FcRn binding and without increased binding to rheumatoid factor autoantibody. MAbs. 2017;9(5):844-853).
면역원성, 특히 항체 FluAB_MLNS의 항약물 반응(항약물 항체; ADA)을 이의 모(parental) 항체 FluAB_wt와 비교하여 평가하기 위해, TG32 마우스(인간 FcRn에 대해 형질전환됨)의 2개의 개별 그룹(n=5)이 5 mg/kg의 FluAB-MLNS 또는 FluAB_wt 단일클론 항체로 i.v. 주사되었다. 주사된 mAbs의 순환 수준을 평가하기 위해, 혈액 샘플을 다른 시점에서 얻었다. 주사 후 14일 및 21일에 채취한 샘플을 사용하여 주사된 인간 단일클론에 대한 항약물 항체(ADA) 반응을 특이적 ELISA를 통해 평가하였다.
간단히 말해서, 정제된 FluAB_wt 및 FluAB_MLNS 단일클론 항체는 2 μg/ml로 96 웰 플레이트에서 코팅되었다. 차단 후, 주사 후 14일 및 21이ㄹ에 얻은 처리된 동물로부터 혈청을 1:180으로 희석하여 실온에서 1.5 시간 동안 배양했다. 세척 이후, 퍼옥시다제 표지된 염소 항-마우스 IgG F(ab')2 단편 (0.16 μg/ml)을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1.5시간 배양했다. 이후 ADA IgG (주사된 항체 FluAB_wt 및 FluAB_MLNS)에 대한 쥣과 항체)를 적절한 기질로 밝혀내고 분광광도계로 판독했다. 제시된 데이터는 항체 i.v. 투여 이후 14일 및 21일에 수집된 각각의 개별 혈청(n=5/그룹)에서 수득된 OD 값(450 nm)이다. 나이브 Tg32 마우스(ctrl)로부터 혈청은 음성대조군으로 사용되었다.
결과를 도 39A 및 39B에 나타내었다. 놀랍게도, FluAB-MLNS 항체에 대해 반응하는 쥣과 혈청 IgG의 신호는 매우 낮았고 대조군, 비주사된 동물에서 검출된 신호에 해당하는 반면, FluAB_wt를 주사한 쥐의 혈청에서 측정된 ADA 반응은 대신 i.v. 주사 14일 및 21일 이후 모두에서 유의하게 높았다(도 39A). 또한, 주사 후 14일에 측정된 ADA의 수준은 순환하는 FluAB_wt의 수준(FluAB_wt에 대한 쥣과 항체로 인해 감소된 혈청 FluAB_wt 수준)과 유의하고 역으로 상관 관계가 있는 반면, 동시에 측정된 순환하는 FluAB-MLNS의 수준은 실제로 훨씬 더 높고 균질했다(도 39B).
요약하면, 이들 데이터는 놀랍게도 항-약물 반응(항-약물 항체; ADA), 및 이에 따른 FluAB_MLNS의 면역원성이 FluAB_wt에 비해 감소했음을 가리킨다.
실시예 11: s.c. 투여 이후 항-약물 항체 반응 및 면역원성
더 많은 면역원성 설정에서 이러한 놀라운 발견을 추가로 확인하기 위해, TG32 마우스의 개별 그룹(n=5)에 FluAB-MLNS 또는 FluAB_wt (5 mg/kg)를 피하(s.c.) 주사했으며, 이는 일반적으로 보다 면역원성인 투여 경로로 간주된다. s.c. 투여 3주 이후, 항-약물 항체의 수준은 FluAB_wt 또는 FLuAB_MLNS로 s.c. 주사된 마우스의 혈청에서 마우스 항-약물 특이적 ELISA(실시예 10에서 상기 설명된 것과 같음)에 의해 혈청에서 측정된다. 음성대조군으로 나이브, 미처리 동물의 10개 혈청의 풀을 사용했다.
결과는 도 40에 제시되어 있다. 더 많은 면역원성 셋팅에도 불구하고, FluAB-MLNS로 s.c. 처리된 동물들은 체액성 면역원성 반응을 시작(mount)하지 않았으며, 주사되지 않은 대조군 동물의 혈청에서 검출된 것과 중복되는 항-hIgG 항체의 혈청 역가에 의해 확인된 바와 같다. 역으로, FluAB_wt로 처리된 동물에서 ADA 역가는 명확하게 양성이었고 모든 처리된 동물에서 측정 가능했다. 주입된 항체의 순환 수준 및 항 hIgG 내인성 반응 사이의 역 상관관계는 FluAB_wt만 주사된 마우스의 혈청에서 검출되었다(나타내지 않음).
이러한 데이터는 놀랍게도 항체 FluAB_MLNS가 이의 모 항체 FluAB_wt에 비해 더 적은 면역원성을 나타내는 것을 보여준다.
실시예 12: 인비트로 중화 활성
A형 인플루엔자 바이러스를 광범위하게 중화하는 FluAB_WT의 능력은 미세중화 분석을 사용하는 두 개의 개별 연구에서 인비트로에서 평가되었다. 1933년 내지 2014년 사이에 수집된 52개의 A형 인플루엔자 단리물의 패널이 연구되었으며, 이는 24개의 그룹 1(아형(subptyoes) H1, H2, H5, H6, 및 H9) 및 28개의 그룹 2 바이러스(아형 H3 및 H7)를 나타낸다. 한 연구에서, FluAB_WT는 0.78 μg/mL의 중간값 절반-최대 억제 농도 IC50 (0.12 내지 3.07 μg/mL의 범위)로 모든 37개 바이러스를 중화했다. 다른 연구에서, FluAB_WT는 0.199 μg/mL의 중간값 IC50을 갖는(0.067 내지 2.69 μg/mL 범위) 2010년 내지 2014년 사이에 단리된 15개의 추가적인 바이러스 균주들을 중화했다. 두 연구에서 2개의 7:1 재조합 PR8 바이러스를 제외한 모든 그룹 1 및 그룹 2 바이러스에 대한 중간값 IC50은 그룹 1의 경우 0.1 μg/mL이며 그룹 2 바이러스의 경우 0.80 μg/mL이다(각각 n=24 및 n=26). 총 17개의 H1N1 바이러스가 0.28 μg/mL의 중간값 IC50 및 2.17 μg/mL의 IC90으로 테스트되었다. 따라서 FluAB_WT는 자연적으로 발생하는 항원 드리프트에도 불구하고 일관된 중화 활성을 제공할 수 있다. 이러한 데이터는 또한 FluAB_MLNS에 대한 일관된 중화 활성을 뒷받침한다.
서열 및 서열번호(서열목록)의 표:
서열번호 서열 비고
FluAB_MLNS
서열번호: 1 SYNAVWN CDRH1
서열번호: 2 RTYYRSGWYNDYAESVKS CDRH2
서열번호: 3 SGHITVFGVNVDAFDM CDRH3
서열번호: 4 RTSQSLSSYTH CDRL1
서열번호: 5 AASSRGS CDRL2
서열번호: 6 QQSRT CDRL3
서열번호: 7 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSS VH
서열번호: 8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK VL
서열번호: 9 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV L HEALH S HYTQKSLSLSPGK 중쇄
서열번호: 10 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 경쇄
FluAB_wt
서열번호: 11 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNVDAFDMWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV M HEALH N HYTQKSLSLSPGK 중쇄
본 명세서 또는 첨부된 출원 데이터 시트에 언급된 모든 미국특허, 미국특허출원 간행물, 미국특허출원, 외국특허, 외국특허출원, 및 비특허 간행물은 본 발명의 설명과 일치하지 않는 범위까지 이들의 전체가 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Vir Biotechnology, Inc. Pang, Phillip S. Connolly, Lynne E. Mogalian, Erik <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF INFLUENZA INFECTION <130> 930485.413WO / IMP223952 <140> PCT <141> 2020-08-28 <150> US 63/040,966 <151> 2020-06-18 <150> US 62/993,519 <151> 2020-03-23 <150> US 62/893,747 <151> 2019-08-29 <160> 11 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic seqeunce CDRH1 <400> 1 Ser Tyr Asn Ala Val Trp Asn 1 5 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic seqeunce CDRH2 <400> 2 Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Glu Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic seqeunce CDRH3 <400> 3 Ser Gly His Ile Thr Val Phe Gly Val Asn Val Asp Ala Phe Asp Met 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic seqeunce CDRL1 <400> 4 Arg Thr Ser Gln Ser Leu Ser Ser Tyr Thr His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 10 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic seqeunce Light chain <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr His Trp Tyr 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5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Asn Ala Val Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Glu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly His Ile Thr Val Phe Gly Val Asn Val 100 105 110 Asp Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135 140 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 170 175 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 195 200 205 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 210 215 220 Arg Val Glu 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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

Claims (38)

  1. 서열번호: 10에 따른 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 9에 따른 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함하는 약학적 조성물의 단일 투여량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 A형 인플루엔자 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 100 mg/mL 내지 200 mg/mL의 범위, 예를 들어 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 바람직하게 150 mg/mL의 농도로 항체를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단일 투여량은 대상의 체중 kg 당 3, 4, 5, 6, 또는 7, 바람직하게 5 mg의 항체를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 투여량은 최대 60 mg, 최대 300 mg, 최대 1200 mg, 최대 1800 mg, 또는 최대 3000 mg의 항체를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 투여량은 최대 60 mg, 최대 70 mg, 최대 80 mg, 최대 90 mg, 최대 100 mg, 최대 200 mg, 최대 300 mg, 최대 400 mg, 최대 500 mg, 최대 600 mg, 최대 700 mg, 최대 800 mg, 최대 900 mg, 최대 1000 mg, 최대 1100 mg, 최대 1200 mg, 최대 1300 mg, 최대 1400 mg, 최대 1500 mg, 최대 1600 mg, 최대 1700 mg, 최대 1800 mg, 최대 2,000 mg, 최대 2,500 mg, 또는 최대 3000 mg의 항체를 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 60 mg, 300 mg, 1200 mg, 또는 1800 mg의 투여량으로 투여되는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1100 mg, 또는 1200 mg의 투여량으로 투여되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 단일 투여량은 300 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 2 mL의 약학적 조성물을 포함하는 단일 주사로 투여되거나;
    (ii) 단일 투여량은 1200 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 4 mL의 약학적 조성물을 각각 포함하는 2회 주사로 투여되거나;
    (iii) 단일 투여량은 1800 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 4 mL의 약학적 조성물을 각각 포함하는 3회 주사로 투여되거나; 또는
    (iv) 단일 투여량은 60 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 투여량은 0.4 mL의 약학적 조성물을 포함하는 1회 주사로 투여되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 인간인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 근육내(IM) 주사를 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 물(예를 들어 USP 주사용수, 또는 US 멸균 주사용수)을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 약학적 조성물에 히스티딘, 선택적으로 10 mM 내지 40 mM 범위, 바람직하게 20 mM의 농도로 히스티딘을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 당, 예를 들어 이당류, 예를 들어 수크로스를, 선택적으로 3.0% 내지 9.0% (w/v)의 범위, 바람직하게 3.6% 내지 8.6%의 범위, 더욱 바람직하게 4% 내지 6%의 범위로 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 계면활성제 또는 삼중블록 공중합체, 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머 188, 바람직하게 폴리소르베이트 80 (PS80)을, 선택적으로 0.01% 내지 0.05%(w/v)의 범위로, 바람직하게 0.02%(w/v)로 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물은 5.5 내지 6.5 범위, 또는 5.8 내지 6.2 범위의 pH, 또는 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5, 바람직하게 6.0의 pH를 갖는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 투여는 주사당 0.8 mL 내지 4 mL를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단일 투여는 주사당 0.8 mL, 0.9 mL, 1.0 mL, 1.1 mL, 1.2 mL, 1.3 mL, 1.4 mL, 1.5 mL, 1.6 mL, 1.7 mL, 1.8 mL, 1.9 mL, 2.0 mL, 2.1 mL, 2.2 mL, 2.3 mL, 2.4 mL, 2.5 mL, 2.6 mL, 2.7 mL, 2.8 mL, 2.9 mL, 3.0 mL, 3.1 mL, 3.2 mL, 3.3 mL, 3.4 mL, 3.5 mL, 3.6 mL, 3.7 mL, 3.8 mL, 3.9 mL, 또는 4.0 mL의 조성물을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항에 있어서, 대상에 약학적 조성물을 투여하고 약 4주, 약 12주, 및/또는 약 20주 이후, 상기 대상은 위약을 투여 받거나 A형 인플루엔자에 대한 치료 또는 백신을 투여 받지 않은 동일한 기간 동안의 참조 대상과 비교하여:
    (i) 기침, 인후통; 콧물; 울혈; 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 호흡기 증상의 수 및/또는 중증도가 감소되며; 및/또는
    (ii) 발열 [구강 온도 >38°C (100.4°F)]; 오한; 근육통; 두통; 권태; 피로; 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 전신 증상의 수 및/또는 중증도가 감소되는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 18세 내지 65세이고 체질량 지수가 18 kg/m2 내지 32 kg/m2의 범위 또는 18 kg/m2 내지 35 kg/m2 범위인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물을 포함하는 단일 투여량을 6개월 기간 동안 대상에게 1회 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물을 포함하는 단일 투여량을 12개월 기간 동안 대상에게 1회 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물을 포함하는 단일 투여량을 6개월 기간 동안 2회, 예를 들어 매 3개월마다 1회 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 시즌의 시작 전 1~2개월 이내에(즉 30일 이내 내지 60일 이내), 또는 인플루엔자 시즌의 첫 1~2개월 이내에 약학적 조성물을 포함하는 단일 투여량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 또는 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물은 인비트로(in vitro)에서 약 2.17 μg/mL의 인플루엔자 감염 억제 IC90를 갖는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 투여되는 약학적 조성물은 60 mg의 항체를 포함하며, 상기 항체는 투여 이후 최대 120일까지 약 1 μg/mL 내지 약 7 μg/mL의 농도로 대상으로부터 혈청에 존재;
    (ii) 투여되는 약학적 조성물은 300 mg의 항체를 포함하며, 상기 항체는 투여 이후 최대 120일까지 약 8 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 농도로 대상으로부터 혈청에 존재;
    (iii) 투여되는 약학적 조성물은 1200 mg의 항체를 포함하며, 상기 항체는 투여 이후 최대 120일까지 약 50 μg/mL 내지 약 100 μg/mL의 농도로 대상으로부터 혈청에 존재;
    (iv) 투여되는 약학적 조성물은 1800 mg의 항체를 포함하며, 상기 항체는 투여 이후 최대 120일까지 약 70 μg/mL 내지 약 110 μg/mL의 농도로 대상으로부터 혈청에 존재; 및/또는
    (v) 상기 항체는 대상에서 49 내지 68일의 인비보(in vivo) t1/2를 갖는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물의 항체는 49 내지 68일, 예를 들어 49일, 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일, 또는 68일의 인간 대상에서 인비보(in vivo) t1/2를 갖는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 약학적 조성물의 단일 투여량이 투여된 후, 선택적으로 최대 140일 동안, 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events, CTCAE)에 따른 유해 사례(AE)를 경험하지 않는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 약학적 조성물의 단일 투여량이 투여된 후, 선택적으로 최대 140일 동안, 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(CTCAE)에 따른 중등도(moderate)의 유해 사례(AE)를 경험하지 않는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 약학적 조성물의 단일 투여량이 투여된 후, 선택적으로 최대 140일 동안, 유해 사례에 대한 공통 용어 기준(CTCAE)에 따른 심각한 유해 사례(AE)를 경험하지 않는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 단일 투여량은 300 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 단일 투여량은 2 mL의 약학적 조성물의 단일 주사를 포함하거나;
    (ii) 단일 투여량은 1200 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 단일 투여량은 4 mL의 약학적 조성물을 각각 포함하는 2회 주사를 포함하거나;
    (iii) 단일 투여량은 1800 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 단일 투여량은 4 mL의 약학적 조성물을 각각 포함하는 3회 주사를 포함하거나; 또는
    (iv) 단일 투여량은 60 mg의 항체를 포함하며, 약학적 조성물은 항체를 150 mg/mL로 포함하며, 상기 단일 투여량은 0.4 mL의 약학적 조성물을 포함하는 방법.
  31. 서열번호: 10에 따른 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 9에 따른 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함하는 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체는 100 mg/mL 내지 200 mg/mL의 범위, 예를 들어 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 또는 200 mg/mL, 바람직하게 150 mg/mL의 농도로 조성물 내에 존재하는 약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 물(예를 들어 USP 주사용수, 또는 US 멸균 주사용수)를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 추가로 상기 약학적 조성물은 히스티딘, 선택적으로 조성물 내 10 mM 내지 40 mM 범위, 바람직하게 20mM의 농도로 히스티딘을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 당, 예를 들어 이당류, 예를 들어 수크로스를, 선택적으로 3.0% 내지 9.0% (w/v), 바람직하게 3.6% 내지 8.6%의 범위, 보다 바람직하게 4% 내지 6%의 범위로 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 계면활성제 또는 삼중블록 공중합체, 선택적으로 폴리소르베이트 또는 폴록사머 188, 바람직하게 폴리소르베이트 80 (PS80)을, 선택적으로 0.01% 내지 0.05% (w/v)의 범위, 바람직하게 0.02%로 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 5.5 내지 6.5 범위, 또는 5.8 내지 6.2 범위의 pH, 또는 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5, 바람직하게 6.0의 pH를 갖는 약학적 조성물.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는 바이알, 바람직하게 유리 바이알.
  38. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는 주사기.
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