CN115052630A - 用于治疗甲型流感感染的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于预防和治疗甲型流感感染的抗体、抗体组合物和方法。在某些实施方案中，单次施用本公开的抗体或抗体组合物对在整个流感季节防止和/或治疗甲型流感感染是有用的。

Description

用于治疗甲型流感感染的组合物和方法
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入本说明书。包含序列表的文本文件的名称是930485_413WO_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件为12.2KB，创建于2020年8月26日，并且通过EFS-Web以电子方式提交。
本公开涉及用于预防和治疗甲型流感感染的抗体组合物和方法。
背景
甲型流感是传染病，每年在世界各地爆发，导致每年约三百万至五百万例重症病例和约290000至650000例呼吸性死亡(WHO，Influenza(Seasonal)Fact sheet，2018年11月6日)。最常见的症状包括：突然发烧、咳嗽(通常是干咳)、头痛、肌肉和关节痛、严重不适(感觉不适)、咽喉痛和鼻漏。潜伏期从一天到四天不等，尽管症状通常在接触病毒后约两天开始。流感的并发症可能包括肺炎、鼻窦感染和现有健康问题的恶化，例如哮喘或心力衰竭、败血症或慢性基础疾病的恶化。
流感是由流感病毒造成的，流感病毒是正黏病毒科的一组抗原性和遗传多样性的病毒，其包含负义、单链、分段RNA基因组。在四种类型的流感病毒(A、B、C和D)中，有三种类型(A、B和C)影响人。甲型流感病毒是最致命的人病原体，导致最严重的疾病。甲型流感病毒可以基于存在的主要表面蛋白的不同亚型进行分类：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。至少有18种甲型流感亚型由其血凝素(“HA”)蛋白定义。HA可以分成两组。第1组包括H1亚型、H2亚型、H5亚型、H6亚型、H8亚型、H9亚型、H11亚型、H12亚型、H13亚型、H16亚型和H17亚型，第2类包括H3亚型、H4亚型、H7亚型、H10亚型、H14亚型和H15亚型。虽然所有亚型都存在于鸟类中，但大多数H1、H2和H3亚型会导致人类疾病。H5、H7和H9亚型在人类中造成散发性严重感染，并可能产生新流行病。甲型流感不断进化产生新的变种，这种现象称为抗原漂移。结果，针对过去的病毒产生的抗体对新的漂移病毒的保护性很差或者没有保护性。结果是，每年都必须生产新的疫苗来对抗预计会出现的H1和H3病毒，这个过程非常昂贵，而且并不总是有效的。这同样适用于H5流感疫苗的生产。
HA是甲型流感病毒的主要表面蛋白，其是中和由感染或疫苗接种引起的抗体的主要目标。HA负责将病毒与膜上具有唾液酸的细胞结合，例如上呼吸道细胞或红细胞。另外，在pH降低后，HA介导病毒包膜与核内体膜融合。HA是同源三聚体完整的膜糖蛋白。HA三聚体由三个相同单体组成，每个单体都由完整的HA0单多肽链制成，其中HA1和HA2区由2个二硫键连接。每个HA2区域均采用α螺旋卷盘绕结构，并主要形成HA的“茎”或“秆”区域，而HA1区是包含α/β结构混合的小球状结构域(HA的“头”区域)。球状HA头区介导与唾液酸受体的结合，而HA茎介导之后的病毒和细胞膜之间的融合，所述融合是由低pH在核内体中触发的。虽然免疫显性HA球状头区具有高可塑性，不同抗原位点经历恒定的抗原漂移，但是HA茎区在亚型中相对保守。目前的流感疫苗主要引起对抗免疫显性和可变HA头区的免疫应答，其比HA茎区进化更快(Kirkpatrick E，Qiu X，Wilson PC，Bahl J，Krammer F.The influenzavirus hemagglutinin head evolves faster than the stalk domain.Sci Rep.2018年7月11日；8(1)：10432)。因此，特定的流感疫苗通常只能提供不超过几年的保护，要求每年重新开发流感疫苗。
为了克服这些问题，最近开发了靶向HA茎部中保守位点的新型流感中和抗体作为流感病毒疗法。与靶向HA头区的抗体相比，这些靶向HA茎区的抗体通常中和得更广泛。广泛中和甲型流感抗体的概述提供于Corti D.和Lanzavecchia A.，Broadly neutralizingantiviral antibodies.Annu.Rev.Immunol.2013；31：705-742.Okuno等人，immunizedmice with influenza virus A/Okuda/57(H2N2)and isolated a monoclonal antibody(C179)that binds to a conserved conformational epitope in HA2 and neutralizesthe Group 1 H2，H1 and H5 subtype influenza A viruses in vitro and in vivo inanimal models(Okuno等人，1993；Smirnov等人，1999；Smirnov等人，2000)。靶向抗体的HA茎区的其他实例包括CR6261(Throsby M，van den Brink E，Jongeneelen M，Poon LLM，Alard P，Cornelissen L等人(2008)Heterosubtypic Neutralizing MonoclonalAntibodies Cross-Protective against H5N1 and H1N1 Recovered from Human IgM+Memory B Cells.PLoS ONE 3(12)：e3942.https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0003942；Friesen RHE，Koudstaal W，Koldijk MH，Weverling GJ，Brakenhoff JPJ，Lenting PJ等人(2010)New Class of Monoclonal Antibodies againstSevere Influenza：Prophylactic and Therapeutic Efficacy in Ferrets.PLoS ONE 5(2)：e9106.https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0009106)、F10(Sui J，Hwang WC，Perez S，Wei G，Aird D，Chen LM，Santelli E，Stec B，Cadwell G，Ali M，Wan H，MurakamiA，Yammanuru A，Han T，Cox NJ，Bankston LA，Donis RO，Liddington RC，Marasco WA(2009年3月)。″Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization ofavian and human influenza A viruses″.Nature Structural&Molecular Biology.16(3)：265-73.doi：10.1038/nsmb.1566)、CR8020(Ekiert DC，Friesen RHE，Bhabha G，KwaksT，Jongeneelen M等人，2011。A highly conserved neutralizing epitope on group 2influenza A viruses.Science 333(6044)：843-50)、FI6(Corti D，Voss J，Gamblin SJ，Codoni G，Macagno A等人，2011。A neutralizing antibody selected from plasmacells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins.Science333(6044)：850-56)和CR9114(Dreyfus C，Laursen NS，Kwaks T，Zuijdgeest D，Khayat R等人，2012。Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.Science337(6100)：1343-48)。
然而，能够与第1组和第2组亚型的HA茎区反应的抗体极其罕见，通常不能完全覆盖所有亚型。最近，描述了抗体MEDI8852，其中和第1组和第2组甲型流感病毒，能够中和一组抗原进化跨越＞80年的代表性病毒(Kallewaard NL，Corti D，Collins PJ等人，Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza ASubtypes.Cell.2016；166(3)：596-608；Paules，C.I.等人，The Hemagglutinin A StemAntibody MEDI8852 Prevents and Controls Disease and Limits Transmission ofPandemic Influenza Viruses.J Infect Dis 216，356-365，https：//doi.org/10.1093/infdis/jix292(2017))。MEDI8852显示能够与高度保守的表位结合，所述高度保守的表位显著不同于具有其他结构特征的茎反应性中和抗体(Kallewaard NL，Corti D，CollinsPJ，等人，Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing AllInfluenza A Subtypes.Cell.2016；166(3)：596-608)。
尽管不断努力，仍然需要可用于预防和/或治疗甲型流感的抗体组合物和方法。
具体实施方式
本公开提供包含中和甲型流感的抗体的药物组合物和使用那些组合物的方法。在某些实施方案中，药物组合物包含抗体，所述抗体在单次施用后，中和甲型流感并在对象中维持全身性暴露至少10周、至少15周和至少20周。在特定的实施方案中，当以预防有效量施用时，对象对抗体和药物组合物耐受良好。在其他实施方案中，当以治疗有效量施用时，对象对抗体和药物组合物耐受良好。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向具有感染甲型流感风险的对象施用根据本说明书的抗体组合物。在其他实施方案中，本文所述的方法包括向感染甲型流感的对象施用根据本说明书的抗体组合物。
虽然下文详细描述了中和甲型流感的抗体、包含那些抗体的药物组合物和使用这种组合物的方法，但是应理解的是，本公开不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解的是，本文使用的术语不意图限制本公开的范围。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在下文中，描述了本公开的各方面。虽然提供了某些实施方案，但应该理解的是，本公开的实施方案可以以任意方式和任意数量组合以创建另外的实施方案。不同描述的实施例和实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并包括将明确描述的实施方案与任意所公开主题相结合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的描述中公开了本申请中所有所述主题的任意排列和组合。
通过本公开，除非上下文另有要求，否则术语“包含”(或“具有”、“包括”等)，应理解为暗示包括所述的成员、比率、整数(在适当的情况下，包括其分数；例如，整数的十分之一和百分之一)、浓度或步骤，但不排除任意其他未陈述的成员、整数、浓度或步骤。
术语“基本上由......组成”不等同于“包含”，是指权利要求的特定材料或步骤，或指没有实质上影响要求保护的主题的基本特征的那些。例如，当结构域、区、模件或蛋白质的氨基酸序列包括延伸、缺失、突变或其组合(例如氨基末端或羧基末端或结构域之间的氨基酸)时，蛋白结构域、区或模件(例如，结合域)或蛋白质“基本上由”特定氨基酸序列“组成”，这些延伸、缺失、突变或其组合一共占结构域、区域、模件或蛋白质长度的至多20％(例如，至多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)，并且基本上不影响(即，不降低活性超过50％，例如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)结构域、区、模件或蛋白质的活性(例如，结合蛋白质的靶结合亲和力)。
术语“由......组成”是术语“包含”的特定实施方案，其中排除了任意其他未陈述的成员、整数或步骤。在本公开的上下文中，术语“包含”包括术语“由......组成”。因此，术语“包含”涵盖“包括”以及“由......组成”例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成、或可以包含其他东西，例如X+Y。
另外，应理解的是，本申请公开了来源于本文所述结构和取代基的各种组合的单个化合物或化合物组，其公开程度与每个化合物或化合物组单独说明的程度相同。因此，特定结构或特定取代基的选择在本公开的范围之内。
除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开的上下文中不使用数量词(包括在权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数。本文中对数值范围的引用仅旨在用作单独提到落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则将每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。说明书中的任意语言都不应被解释为表示对于实践本公开的主题必不可少的任意未要求保护的要素。
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在某些实施方案中，“基本上”是指与参考组合物、方法或用途相比，本公开的组合物、方法或用途的给定的量、效果、或活性，并且描述了量、效果或活性的减少不超过参考组合物、方法和用途的量、效果或活性的50％，例如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、或1％、或小于1％。
涉及数值x的术语“约”是指x±10％，例如x±5％，或x±7％，或x±10％，或x±12％，或x±15％，或x±20％。例如，在某些实施方案中，“约”表示指定范围、值或结构的±20％。
本文所用的术语“疾病”意在通常与术语“病症”和“症状”(如在医学状况中)同义，并可互换使用，因为所有这些都反映了人或动物身体或其一个部分的损害正常功能的异常状况，通常通过有区别的病症和症状来体现，并导致人或动物具有减少的存续时间或降低的生活质量。
如本文所用，术语“治疗有效的”是指足以给对象提供益处的如本文所述的药物组合物或抗体的性质或量。在本公开的上下文中，提供给对象的益处是治疗甲型流感感染。如本文所用，提及的“治疗”包括防治、预防、减少、改善和治疗。治疗的益处包括改善的临床结果；减轻或缓和与感染有关的症状；减少症状的发生；改善的生活质量；更长的无病状态；预防感染；缩减感染的程度和/或持续时间；稳定疾病状态；延迟疾病恶化；缓解；存活；延长存活；或其任意组合。因此，在某些实施方案中，“治疗有效的”包括治疗感染甲型流感的对象，以及防治或预防对象感染甲型流感。在预期的治疗是预防的情况下，术语“治疗有效的”和“预防有效的”可以互换使用。术语“对象”或“患者”在本文中可互换使用，以表示易受甲型流感感染或已经被甲型流感感染的人类对象。
在某些实施方案中，甲型流感病毒包括H1N1病毒、H3N2病毒、或这两者。
剂量通常相对于体重(即对象的体重)来表示。因此，以[g、mg、或其他单位]/kg(或g、mg等)表示的剂量可以指[g、mg、或其他单位]“每kg(或g、mg等)体重”，即使未明确提及术语“体重”。
术语“特异性结合”和类似引用不包括非特异性黏附。
如本文所用，术语“抗体”包括抗体的不同形式，其包括但不限于全部抗体(包含至少两个通过二硫键相互连接的重(H)链和两个轻(L)链(虽然应理解缺少轻链的重链抗体仍包含在术语“抗体”中))、具有或保持与由完整抗体识别的抗原靶分子结合的能力的抗体片段，例如scFv、Fab或F(ab′)2片段、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体和基因工程或其他工程化或修饰的抗体(例如变异或突变抗体、胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完整的人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性如双特异性抗体、双链抗体、三链抗体和四链抗体、串联双-scFv、串联三-scFv和本领域已知的其他抗体形式)，只要保持根据本公开的固有特性。因此，本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体，其包括完整抗体和其功能性(抗原结合的)抗体片段，包括片段抗原结合片段(Fab)、F(ab′)2片段、Fab′片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段，其包括单链可变区片段(scFv)，和单结构域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。在一些实施方案中，抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。例如，抗体是人单克隆抗体。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段(即包含或组成为保持与抗原结合的能力的抗体的抗原结合片段)。该术语还包括完整的或全长抗体，包括任意类别或其亚类的抗体，包括IgG及其亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgE、IgA和IgD。
因此，本公开的抗体可以是任意同种型(例如，IgA、IgG、IgM，也分别称为α、γ和μ重链)。例如，在某些实施方案中，抗体是IgG型。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类，例如IgG1。在一些实施方案中，抗体包含来自两个不同同种型的氨基酸序列(例如，恒定结构域氨基酸序列的交换)，例如包含恒定区的抗体，所述恒定区包含来自IgA抗体的氨基酸序列和来自IgG抗体的氨基酸序列。本公开的抗体可以包含κ或λ轻链。在一些实施方案中，抗体是IgG1型并包含κ轻链。
人抗体是已知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述动物在免疫后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整的抗体库或人抗体的选择。在这种生殖系突变小鼠中转移人生殖系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(参见例如Jakobovits，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等人，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等人，YearImmunol.7(1993)3340)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.，等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；和Boerner，P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。在一些实施方案中，人单克隆抗体通过使用改善的EBV-B细胞永生化来制备，如在Traggiai E，Becker S，Subbarao K，Kolesnikova L，Uematsu Y，Gismondo MR，Murphy BR，Rappuoli R，Lanzavecchia A.(2004)：An efficientmethod to make human monoclonal antibodies from memory B cells：potentneutralization of SARS coronavirus.Nat Med.10(8)：871-5中所描述的。
如本文所用，术语“可变区”(例如轻链可变区(VL)、重链可变区(VH))是指抗体轻链或抗体重链的可变区，其直接涉及使抗体与抗原结合。换句话说，术语″VL″或″VL”和″VH″或″VH”分别是指来自抗体轻链和抗体重链的可变结合区。
包含在本文所述的药物组合物和方法中的抗体通常包含重链(或重链可变区)上的(至少)三个互补性决定区(CDR)和轻链(或轻链可变区)上的(至少)三个CDR。互补性决定区(CDR)是高变区(″HVR″)；CDR与HVR同义)，存在于重链可变域和轻链可变域中。通常，重链的CDR和抗体的同源轻链共同形成抗原结合位点(并且通常共同赋予抗体的抗原特异性和/或结合亲和力)。通常，三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)在可变域中被框架序列分开。通常，每个抗原结合位点有六个CDR(重链：CDRH1、CDRH2和CDRH3；轻链：CDRL1、CDRL2和CDRL3)。例如，包含两个抗原结合位点的单抗体分子含有十二个CDR。重链和/或轻链上的CDR可以在一级氨基酸序列中被框架区分开，其中框架区(FR)是可变域中比CDR可变性(即，从一种抗体到另一种抗体(例如，从一种抗体到由相同等位基因或多个等位基因编码的另一种抗体))更小的区域。例如，链(或分别每条链)组成为由三个CDR隔开的四个框架区。在某些实施方案中，抗体VH包含四个FR和三个CDR，排列如下：FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4；并且抗体VL包含4个FR和三个CDR，如下：FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4。通常，VH和VL通过它们各自的CDR共同形成抗体结合位点，虽然应理解在一些情况下，结合位点可以由一个、两个、三个、四个或五个CDR形成或包含一个、两个、三个、四个或五个CDR。
确定了本公开的实例性抗体的重链和轻链的序列，其包含重链上三个不同的CDR和轻链上三个不同的CDR。CDR氨基酸的位置根据IMGT编号系统确定(IMGT：http：//www.imgt.org/；比较Lefranc，M.-P.等人(2009)Nucleic Acids Res.37，D1006-D1012)。
在一些实施方案中，抗体将存在于基本上不含其他多肽的药物组合物中，例如，其中少于90(重量)％，或少于60(重量)％，或少于50(重量)％的药物组合物由其他多肽构成。
根据本公开的抗体可以在人和/或非人(或异源)宿主例如小鼠中具有免疫原性。例如，抗体可以具有在非人宿主中具有免疫原性但在人宿主中不具有免疫原性的独特型。用于人的本公开抗体包括不能轻易从宿主例如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等中分离的抗体，并且通常不能通过人源化或从异种小鼠中获得。在某些实施方案中，根据本公开的抗体在人中不具有免疫原性或基本上不具有免疫原性。
如本文所用，“中和抗体”是可以中和，即预防、抑制、减少、阻碍或干扰病原体在宿主中引发和/或持久感染的能力的抗体。术语“中和抗体”和“中和的抗体”在本文可互换使用。
如本文所用，术语“突变”涉及与参考序列例如相应的基因组序列相比，核酸序列和/或氨基酸序列的变化。突变，例如与基因组序列相比，其可以是例如(天然存在的)体细胞突变、自发突变、诱导突变，例如由酶、化学物质或辐射引起的诱导突变，或通过定点诱变获得的突变(用于在核酸序列和/或氨基酸序列中进行特异性和有意改变的分子生物学方法)。因此，术语“突变”应理解为还包括在物理上进行突变，例如在核酸序列或氨基酸序列中进行突变。突变包括一个或多于一个核苷酸或氨基酸的取代、缺失和插入，以及几个连续核苷酸或氨基酸的倒位。为了实现氨基酸序列中的突变，可以将突变引入编码所述氨基酸序列的核苷酸序列中，以表达(重组)突变的多肽。可以例如通过例如定点诱变改变编码一个氨基酸的核酸分子的密码子以产生编码不同氨基酸的密码子来实现突变，或通过合成序列变体来实现，例如通过知晓编码多肽的核酸分子的核苷酸序列，并且通过设计包含编码该多肽的变体的核苷酸序列的核酸分子的合成而无需突变核酸分子的一个或多于一个核苷酸。
在本公开中引用了几个文件。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用其全部并入本文。本文中的任意内容均不得解释为承认本公开由于在先的公开无权提前公布。
应当理解的是，本公开不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本公开的范围，本公开的范围仅由所附的权利要求来限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
抗体
用于本文所述的药物组合物和方法的抗体可中和甲型流感病毒。另外，当以耐受良好的剂量向对象施用时，本公开的抗体显示出在延长的时间段内维持全身暴露的体内半衰期。在某些实施方案中，本文所述的抗体在单次施用后，中和甲型流感并在对象中维持全身性暴露一段时间，所述一段时间选自至少10周、至少15周和至少20周。在特定实施方案中，当与比较物或参考抗体相比时，包含在本公开的药物组合物和方法中的抗体显示出增加的效力，尽管与比较物或参考抗体相比，抗体的血浆浓度相似。
用于本文所述的药物组合物和方法的抗体与甲型流感病毒的血凝素结合，从而可以中和甲型流感病毒的感染。在特定实施方案中，根据本公开的抗体与甲型流感病毒血凝素(IAV HA)茎区的相同表位结合，如MEDI8852(Kallewaard NL，Corti D，Collins PJ，等人，Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza ASubtypes.Cell.2016；166(3)：596-608)，从而提供针对所有甲型流感亚型的各种甲型流感血清型的广泛保护。
另外，适合用于本公开的药物组合物和方法的抗体包括在重链恒定区(在CH3区)的两个突变：M428L和N434S。在本上下文中，氨基酸位置已根据领域认证的EU编号系统进行了编号。EU索引或如Kabat或EU编号中的EU索引是指EU抗体的编号(Edelman GM，Cunningham BA，Gall WE，Gottlieb PD，Rutishauser U，Waxdal MJ.The covalentstructure of an entire gammaG immunoglobulin molecule.Proc Natl Acad Sci U SA.1969；63(1)：78-85；Kabat E.A.，National Institutes of Health(U.S.)Office ofthe Director，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，5th edition，Bethesda，MD：U.S.Dept.of Health and Human Services，Public Health Service，National Institutes of Health，1991，在此通过引用全部并入)。
为了在实验室中研究和定量病毒感染性(或“中和”)，本领域技术人员知晓各种标准的“中和试验”。针对中和试验，动物病毒通常在细胞和/或细胞系中繁殖。例如，在中和试验中，在存在(或不存在)待测抗体的情况下，可以将培养的细胞与固定量的甲型流感病毒(IAV)一起孵育。例如作为读值，可以使用流式细胞仪。或者，也可以想到其他读值。
在一些实施方案中，本公开的抗体是人抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体是单克隆抗体。例如，本公开的抗体是人单克隆抗体。
本公开的抗体可以是任意同种型(例如，IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)。例如，抗体是IgG型。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类，例如IgG1。本公开的抗体可以具有κ或λ轻链。在一些实施方案中，抗体具有kappa(κ)轻链。在一些实施方案中，抗体是IgG1型的并具有κ轻链。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物和方法可以包括抗体，所述抗体包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中所述的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中所述的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及在重链恒定区中的突变M428L和N434S(根据EU编号)。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物和方法包括(分离的)抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有70％或大于70％(即71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列(分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3中所述的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6中所述的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列)。
通常根据参考序列(即如本文所述或引用的序列)的全长来计算序列同一性。如本文所指，百分比同一性可以例如使用BLAST使用由NCBI(美国国家生物技术信息中心；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数来确定[Blosum 62矩阵；空位开放罚分＝11，和空位延伸罚分＝1]。
“序列变体”具有改变的序列，其中将参考序列中的一个或多于一个氨基酸缺失或取代，或将一个或多于一个氨基酸插入参考氨基酸序列的序列中。改变的结果是，氨基酸序列变体具有与参考序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。作为实例，与参考序列至少70％相同的变体序列对参考序列的每100个氨基酸具有不超过30个改变，即缺失、插入或取代的任意组合。
通常，尽管可以具有非保守的氨基酸取代，但取代可以包括保守氨基酸取代，其中取代的氨基酸具有与参考序列中相应氨基酸相似的结构(如侧链)或化学性质。举例来说，保守氨基酸取代涉及用另一种氨基酸取代一种脂肪族氨基酸或疏水性氨基酸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；用另一种氨基酸取代一种含羟基的氨基酸如丝氨酸和苏氨酸；用另一种氨基酸取代一种酸性残基如谷氨酸或天冬氨酸；用另一种氨基酸取代一种含酰胺的残基如天冬酰胺和谷氨酰胺；用另一种氨基酸取代一种芳香族残基如苯丙氨酸和酪氨酸；用另一种氨基酸取代一种碱性残基例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并用另一种氨基酸取代一种小氨基酸如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和甘氨酸。
作为其他实例，保守取代包括存在于以下组之一的取代：第1组：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)；第二组：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或Z)；第三组：天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)；第四组：精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)：第五组：异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、蛋氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)；和第六组：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)。另外或替代地，氨基酸可以通过相似的功能、化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂肪族、芳香族或含硫)被分成保守取代组。例如，为了取代，脂肪族基团可以包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。其他保守取代组包括：含硫：Met和半胱氨酸(Cys或C)；酸性：Asp、Glu、Asn和Gln；小的脂族、非极性或微极性残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；极性、带负电的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大的脂族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和大的芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。其他信息可以在Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman and Company中找到。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百个或多于一百个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括氨基酸序列的N-末端或C-末端与报告分子或酶的融合。
“功能性变体”是指多肽或多核苷酸，其与本公开的亲本或参考化合物结构相似或基本上结构相似，但是组成上稍有不同(例如，一个碱基、原子或官能团不同、增添或去除)，使得多肽或编码的多肽能够以至少50％的效率执行亲本多肽的至少一种功能。在特定的实施方案中，功能性变体以选自至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的效率执行亲本多肽的至少一种功能。换句话说，与亲本或参考多肽相比，当本公开的多肽或编码的多肽的功能性变体在选定的试验中表现出不超过50％的性能降低时，例如用于测量结合亲和力的试验(例如，测量结合常数(Ka)或解离常数(KD)的
Figure BPA0000320867220000111
或四聚体染色)，所述功能性变体具有“相似的结合”、“相似的亲和力”或“相似的活性”。
如本文所用，“功能性部分”或“功能性片段”是指多肽或多核苷酸，其仅包含亲本或参考化合物的结构域、部分或片段，并且所述功能性部分或功能性片段的多肽或编码的多肽保持与亲本或参考化合物的结构域、部分或片段有关的至少50％的活性。在特定实施方案中，功能性部分或功能性片段保持与亲本多肽的结构域、部分或片段有关的至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的活性。在一些这类实施方案中，功能性部分或功能性片段另外提供了生物益处(例如效应子功能)。与亲本或参考多肽相比，当本公开的多肽或编码的多肽的功能性部分或功能性片段在选定的实验中表现出不超过50％的性能降低时，所述功能性部分或片段具有“相似的结合”或“相似的活性”。在特定实施方案中，与亲本或参考相比，相似的结合或相似的活性是指在亲和力方面的减少百分比不大于20％、不大于10％和不超过对数差异。
术语“分离的”表示将材料从其原来的环境(例如，如果是自然产生的，就是自然环境)中去除。例如，存在于活体动物中的自然产生的核酸或多肽是不分离的，但是从自然系统的一些或全部共存材料中分离的相同核酸或多肽是分离的。这样的核酸可以是载体的一部分和/或这样的核酸或多肽可以是组合物的一部分(例如细胞裂解物)，并且仍是分离的，因为这样的载体或组合物不是核酸或多肽的自然环境的一部分。
在某些实施方案中，药物组合物的抗体可以是“分离的”，例如，因为它从对象的体内环境中去除、分离或不与之相关。
术语“基因”表示参与产生多肽链的DNA或RNA片段；在特定的上下文中，它包括编码区之前和之后的区域(例如，5’非翻译区(UTR)和3’UTR)以及各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
将核酸分子插入到细胞的上下文中的术语“引入”表示“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸分子并入真核或原核细胞，其中核酸分子可以并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化进自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
如本文所用，术语“重组”(例如，重组抗体、重组蛋白、重组核酸等)是指通过重组手段来制备、表达、创造或分离的，并且不是自然产生的任意分子(抗体、蛋白质、核酸等)。“重组”可以与“工程化”或“非自然”同义使用，并且可以指生物、微生物、细胞、核酸分子、或载体，其包括至少一种基因改变或通过引入外源核酸分子来修饰，其中这类改变或修饰是基因工程(即人为干预)引入的。基因改变包括，例如，引入编码蛋白、融合蛋白或酶的可表达核酸分子的修饰，或其他核酸分子的增添、缺失、取代或细胞遗传物质的其他功能破坏。其他的修饰包括，例如，其中修饰改变多核苷酸、基因或操纵子的表达的非编码调控区。
如本文所用，“异源的”或“非内源的”或“外源的”是指不是宿主细胞或对象原生的任意基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性，或宿主细胞或对象原生的任意基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性已被改变。异源的、非内源的或外源的包括基因、蛋白质、化合物或核酸分子，其已经突变或以其他方式改变，使得天然和改变的基因、蛋白质、化合物或核酸分子之间的结构、活性或这两者不同。在某些实施方案中，异源的、非内源的或外源的基因、蛋白质或核酸分子可以不是宿主细胞或对象内源的，而是编码这些基因、蛋白质或核酸分子的核酸可以通过缀合、转化、转染、电穿孔等添加到宿主细胞中，其中添加的核酸分子可以整合到宿主细胞基因组中或可以作为染色体外遗传物质(作为质粒或其他自主复制载体)存在。术语“同源的”或“同源物”是指存在于或来源于宿主细胞、物种或株的基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。例如，编码多肽的异源或外源多核苷酸或基因可以与天然多核苷酸或基因同源，并且编码同源多肽或活性，但是多核苷酸或多肽可以具有改变的结构、序列、表达水平或其任意组合。
非内源的多核苷酸或基因以及编码的多肽或活性可以来自相同物种、不同物种或其组合。
如本文所用，术语“内源的”或“天然的”是指通常存在于宿主细胞或对象中的多核苷酸、基因、蛋白质、化合物、分子或活性。
如本文所用，术语“表达”是指基于核酸分子例如基因的编码序列产生多肽的过程。该过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任意组合。表达的核酸分子通常操作性连接到表达控制序列(例如启动子)。
术语“操作性连接”是指在单个核酸片段上两个或多于两个核酸分子连接从而使得一个核酸分子的功能受另一个影响。例如，当启动子能影响编码序列的表达时，启动子与该编码序列操作性连接(即所述编码序列在启动子的转录控制下)。“未连接”是指相关的遗传元件彼此之间没有紧密连接，一个元件的功能不影响另一个元件。
在一些实施方案中，适合用于本文提供的药物组合物和方法的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有与SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列75％或大于75％(即76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含具有与SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列75％或大于75％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在一些实施方案中，适合用于本文提供的药物组合物和方法的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有与SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列80％或大于80％(即81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含具有与SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列80％或大于80％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在一些实施方案中，适合用于本文提供的药物组合物和方法的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有与SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列85％或大于85％(即86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含具有与SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列85％或大于85％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有与SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列90％或大于90％(即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含具有与SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列90％或大于90％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在一些实施方案中，适合用于本文提供的药物组合物和方法的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有与SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列95％或大于95％(即95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含具有与SEQ IDNO：8中所述的氨基酸序列至少95％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。
在一些实施方案中，适合用于本文提供的药物组合物和方法的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含或组成为SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列，所述轻链可变区包含或组成为SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。
通常，有可能本文所述的抗体可以在Fc区(例如在CH2或CH3区)包含一个或多于一个其他的突变(除了M428L和N434S)。然而，在一些实施方案中，适合用于本文提供的药物组合物和方法的抗体不包含除了在其CH3区的M428L和N434S之外的任意其他突变(与相应的野生型CH3区相比)。在一些实施方案中，适合用于本文提供的药物组合物和方法的抗体不包含除了在其Fc区的M428L和N434S之外的任意其他突变(与相应的野生型Fc区相比)。如本文所用，术语“野生型”是指参考序列，例如天然存在的序列。作为具体实例，术语“野生型”可以指天然存在的发生率最高的序列。
在一些实施方案中，适合用于本文提供的药物组合物和方法的抗体包含重链和轻链，所述重链包含或组成为SEQ ID NO：9中所述的氨基酸序列，所述轻链包含或组成为SEQID NO：10中所述的氨基酸序列。例如，本公开的抗体可以包含重链和轻链，所述重链由SEQID NO：9中所述的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO：10中所述的氨基酸序列组成。
变体抗体也包括在本公开的范围内。因此，本申请中所述的序列的变体也包括在本公开的范围内。这种变体包括免疫应答过程中通过体内体细胞突变产生的天然变体，或在体外培养永生化B细胞克隆时产生的天然变体。或者，变体可以由于遗传密码的简并而产生，也可以由于转录或翻译中的错误而产生。
核酸
在另一个方面，本公开还提供包含编码如本文所述抗体的多核苷酸或其部分的核酸分子。核酸分子和/或多核苷酸的实例包括例如重组多核苷酸、载体、寡核苷酸、RNA分子例如rRNA、mRNA、miRNA、siRNA或tRNA，或DNA分子例如cDNA。核酸可以编码本公开的抗体的轻链和/或重链。换句话说，抗体的轻链和重链可以由相同的核酸分子(例如以双顺反子方式)编码。或者，抗体的轻链和重链可以由不同的核酸分子编码。
由于遗传密码的丰余机制，本公开还包括核酸序列的序列变体，其编码相同的氨基酸序列。因此，编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码抗体的多核苷酸(或完整核酸分子)可以优化以在宿主细胞中表达抗体。例如，核苷酸序列的密码子优化可以用于提高用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。此外，核酸分子可以包含异源元件(即不会天然出现在与抗体的(重或轻)链的编码序列相同的核酸分子上的元件)。例如，核酸分子可以包括异源启动子、异源增强子、异源UTR(例如，用于优化翻译/表达)、异源多聚腺苷酸尾等。
一些版本的核苷酸序列也可以包含内含子，以至内含子可通过共转录或转录后机制被去除。由于遗传密码的丰余或简并，或通过剪接，或这两者，不同的核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。
核酸分子是包含核酸组分的分子。术语核酸分子通常是指DNA(包括cDNA、基因组DNA和合成DNA)或RNA分子，它们可以是单链或双链的。如果是单链的，核酸分子可以是编码链或非编码链(反义链)。多核苷酸(包括寡核苷酸)及其片段可以例如通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生，或通过连接、切割、核酸内切酶作用或核酸外切酶作用中任意一种来产生。它可以与术语“多核苷酸”同义使用，即核酸分子可以由编码抗体的多核苷酸组成。或者，核酸分子还可以包含除了编码抗体的多核苷酸之外的其他元件。通常，核酸分子是包含或组成为核苷酸单体的聚合物，所述核苷酸单体通过糖/磷酸-骨架的磷酸二酯键彼此共价连接。术语“核酸分子”还包括修饰的核酸分子，例如碱基修饰、糖修饰或主链修饰等的DNA或RNA分子。
例如，核酸分子可以包括包含天然亚基(例如嘌呤或嘧啶碱基)和/或非天然亚基(例如吗啉环)的核苷酸。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，嘧啶碱基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这种键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯、酰苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等。
可以操纵核酸分子以插入、缺失或改变某些核酸序列。这种操作的变化包括但不限于引入限制位点、修改密码子使用、增添或优化转录和/或翻译调节序列等的变化。也可以改变核酸以改变编码的氨基酸。例如，在抗体的氨基酸序列中引入一个或多于一个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等)氨基酸取代、缺失和/或插入可能是有用的。这样的点突变可以修饰效应子功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等，可以引入氨基酸以连接共价基团(例如标记)，或可以引入标签(例如出于纯化目的)。或者，核酸序列中的突变可以是“沉默的”，即由于遗传密码的丰余而不反映在氨基酸序列中。通常，突变可以被引入特定位点或可以被随机引入，然后进行选择(例如分子进化)。例如，可以将编码本公开的(实例性)抗体的任意轻链或重链的一个或多于一个核酸随机或定向突变以在编码的氨基酸中引入不同的性质。这种变化可以是迭代过程的结果，其中保留了初始变化，并在其他核苷酸位置引入了新变化。此外，可以组合在独立步骤中实现的变化。
在一些实施方案中，编码抗体的多核苷酸(或(完整的)核酸分子)可以是密码子优化的。本领域技术人员意识到用于密码子优化的各种工具，例如以下所述的那些：Ju XinChin，Bevan Kai-Sheng Chung，Dong-Yup Lee，Codon Optimization OnLine(COOL)：aweb-based multi-objective optimization platform for synthetic gene design，Bioinformatics，第30卷，第15期，2014年8月1日，第2210-2212页；或：Grote A，Hiller K，Scheer M，Munch R，Nortemann B，Hempel DC，Jahn D，JCat：a novel tool to adaptcodon usage of a target gene to its potential expression host.Nucleic AcidsRes.2005 Jul 1；33(Web Server issue)：W526-31；或，例如，Genscript’s OptimumGeneTMalgorithm(如US 2011/0081708 A1中所述)；或GeneArt Gene Synthesis Tool(ThermoFisher Scientific)。密码子优化序列包括部分密码子优化(即优化至少一个密码子用于在宿主细胞中表达)的序列和完全密码子优化的那些序列。
本公开还提供了第一核酸分子和第二核酸分子的组合，其中所述第一核酸分子包含编码本公开的抗体的重链的多核苷酸；所述第二核酸分子包含编码相同抗体的相应轻链的多核苷酸。关于本公开的核酸分子的(一般)特征的以上描述因此适用于组合的第一核酸分子和第二核酸分子。例如，编码抗体的重链和/或轻链的一者或两者的多核苷酸可以是密码子优化的。
如本文所用，核酸序列或氨基酸序列“衍生自”指定的核酸、肽、多肽或蛋白质是指核酸、肽、多肽或蛋白质的来源。衍生自特定序列的核酸序列或氨基酸序列可以具有与衍生该序列或其一部分的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，由此“基本相同”包括如上定义的序列变体。衍生自特定肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列可以衍生自特定肽或蛋白质中的相应结构域。在本上下文中，“相应的”是指具有感兴趣的相同功能或特征。因此肽、蛋白质和核酸的“相应的”部分对于本领域普通技术人员而言是容易识别的。同样，“衍生自”另一个(例如“源”)序列的序列可以被本领域普通技术人员识别为其来源于源序列。
载体
进一步包含在本公开的范围内的是包含根据本公开的核酸分子的载体，例如表达载体。通常，载体包含如上所述的核酸分子。
本公开还提供第一载体和第二载体的组合，其中所述第一载体包含如上所述的第一核酸分子(用于核酸分子的合并)，所述第二载体包含如上所述的第二核酸分子(用于核酸分子的合并)。
载体通常是重组核酸分子，即自然界中不存在的核酸分子。因此，载体可以包含异源元件(即自然界不同来源的序列元件)。例如，载体可以包含多克隆位点、异源启动子、异源增强子、异源选择标记(以鉴别包含所述载体的细胞与不包含所述载体的细胞)等。在本公开的上下文中的载体适合于并入或包含所需的核酸序列。这样的载体可以是存储载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。存储载体是允许方便地存储核酸分子的载体。因此，载体可以包含对应于例如根据本公开的所需抗体(的重链和/或轻链)的序列。表达载体可用于产生表达产物，例如RNA如mRNA，或肽、多肽或蛋白质。例如，表达载体可以包含转录载体的序列段所需的序列，例如(异源)启动子序列。克隆载体通常是含有克隆位点的载体，其可用于将核酸序列并入到载体中。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适于将核酸分子转移到细胞或生物中的载体，例如病毒载体。在本公开的上下文中的载体可以是例如RNA载体或DNA载体。例如，在本申请意义上的载体包括克隆位点、选择标记例如抗生素抗性因子、和适合于载体复制的例如复制起点的序列。在本申请的上下文中的载体可以是质粒载体
细胞
在其他方面，本公开还提供表达根据本公开的抗体的细胞；和/或包含根据本公开的载体的细胞。
这种细胞的实例包括但不限于真核细胞，例如酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞；和原核细胞，包括大肠杆菌。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在某些这种实施方案中，细胞是哺乳动物细胞系，例如CHO细胞(例如DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，PNAS77：4216(1980)，CHO-KSV，ExpiCHO)、人胚肾细胞(例如HEK293T细胞)、PER.C6细胞、Y0细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、人肝细胞，例如Hepa RG细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。哺乳动物宿主细胞系的其他实例包括小鼠支持细胞(例如，TM4细胞)、SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、猴肾细胞(CV1)、人宫颈癌细胞(HELA)、人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)、肾上皮细胞(MDCK；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)、TRI细胞、MRC 5细胞和FS4细胞。适于抗体产生的哺乳动物宿主细胞系还包括例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，ed.，HumanaPress，Totowa，N.J.)，第255-268页(2003)中所述的那些。
在某些实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。肽在原核细胞如大肠杆菌中的表达已经很好地建立(参见例如Pluckthun，A.Bio/Technology 9：545-551(1991)。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于细菌中抗体的表达，参见例如美国专利第5648237号；第5789199号；和第5840523号。
对表达本公开的抗体有用的昆虫细胞是本领域已知的，包括例如草地贪夜蛾Sf9细胞、粉纹夜蛾BTI-TN5B1-4细胞和草地贪夜蛾SfSWT01“MimicTM”细胞。参见例如Palmberger等人，J.Biotechnol.153(3-4)：160-166(2011)。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。
真核微生物如丝状真菌或酵母也是克隆或表达编码蛋白质的载体的合适宿主，并且包括具有“人源化”糖基化途径从而产生具有部分或全部人糖基化模式的抗体的真菌菌株和酵母菌株。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)；Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
植物细胞也可以用作表达本公开的抗体的宿主。例如，PLANTIBODIESTM技术(描述于例如美国专利第5959177号；第6040498号；第6420548号；第7125978号；和第6417429号)利用转基因植物产生抗体。
与本公开相容的任意蛋白表达系统可以用于产生所公开的抗体。合适的表达系统包括转基因动物，其描述于Gene Expression Systems，Academic Press，eds.Fernandez等人，1999。
在特定实施方案中，可以用根据本说明书的载体和表达载体转染细胞。术语“转染”是指将核酸分子，例如DNA或RNA(例如mRNA)分子引入细胞，例如引入真核细胞中。在本说明书的上下文中，术语“转染”包括技术人员已知的用于将核酸分子引入细胞，例如真核细胞，包括哺乳动物细胞中的任意方法。这样的方法包括例如电穿孔、脂质体转染例如基于阳离子脂质和/或脂质体的脂质转染、磷酸钙沉淀、基于纳米颗粒的转染、基于病毒的转染、或基于阳离子聚合物例如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺等的转染。在某些实施方案中，引入是非病毒性的。
而且，根据本说明书，本公开的细胞可以用根据本说明书的载体稳定或瞬时转染，例如用于表达其抗体。在这样的实施方案中，用编码结合蛋白的本文所述载体稳定转染细胞。或者，可以用根据本公开的载体瞬时转染细胞，所述载体编码根据本说明书的抗体。在任意目前公开的实施方案中，多核苷酸对于宿主细胞可以是异源的。
在相关方面，本公开提供了用于产生抗体的方法，其中所述方法包括在足以产生抗体的条件和时间下培养本公开的宿主细胞。
因此，本公开还提供了异源性表达本公开的抗体的重组宿主细胞。例如，细胞的物种可以不同于全部或部分获得抗体的物种(例如，表达人抗体或工程化人抗体的CHO细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞的细胞类型天然条件下不表达抗体。而且，宿主细胞可以赋予结合蛋白翻译后修饰(PTM；例如糖基化或岩藻糖基化)，该结合蛋白不以结合蛋白的天然状态(或以工程化或衍生出对象结合蛋白的亲本结合蛋白的天然状态)存在。这种PTM可能导致功能差异(例如，免疫原性降低)。因此，由如本公开所述的宿主细胞产生的本公开的结合蛋白可以包括一个或多于一个翻译后修饰，其不同于天然状态的结合蛋白或亲本结合蛋白(例如，由CHO细胞产生的人抗体可以包括翻译后修饰，其不同于从人分离的和/或由天然人B细胞或浆细胞产生的抗体)。
抗体制备
适合用于本文所述的药物组合物和方法的抗体可以通过本领域已知的任意方式制备。例如，使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的常用方法是众所周知的(Kohler，G.和Milstein，C，.1975；Kozbar等人1983)。在一些实施方案中，使用WO2004/076677中描述的替代性EBV永生化方法。
在一些实施方案中，使用WO2004/076677所述的方法，其通过引用并入本文。在该方法中，产生本公开抗体的B细胞是由EBV和多克隆B细胞激活剂转化的。可以在转化步骤中任选地添加细胞生长和分化的其他刺激物，以进一步提高效率。这些刺激物可以是细胞因子，例如IL-2和IL-15。一方面，在永生化步骤中加入IL-2以进一步提高永生化效率，但是这种使用不是必需的。然后可以使用本领域已知的方法培养使用这些方法产生的永生化B细胞，并从中分离出抗体。
WO2010/046775中描述了另一种示例性方法。在这种方法中，将浆细胞进行有限数量的培养，或者在微孔培养板中作为单个浆细胞进行培养。可以从浆细胞培养物中分离出抗体。此外，可以使用本领域已知的方法从浆细胞培养物中提取RNA并进行PCR。可以通过RT-PCR(逆转录酶PCR)扩增抗体的VH和VL区、对其进行测序并克隆到表达载体中，然后将其转染到HEK293T细胞或其他宿主细胞中。表达载体中的核酸的克隆、宿主细胞的转染、转染的宿主细胞的培养以及所制备的抗体的分离可以使用本领域技术人员已知的任意方法来进行。
如果需要，可以使用过滤、离心和各种色谱方法例如HPLC或亲和色谱法进一步纯化抗体。包括用于产生药物级抗体的技术在内的用于纯化抗体例如单克隆抗体的技术在本领域中是公知的。
分子生物学的标准技术可用于制备编码本公开的抗体的DNA序列。所需的DNA序列可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成。可以适当使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
任意合适的宿主细胞/载体系统均可用于表达编码本公开抗体分子的DNA序列。真核生物例如哺乳动物，宿主细胞表达系统可以用于产生抗体分子，例如完整的抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括本文公开的那些，例如但不限于CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本公开还提供了用于产生抗体分子的过程，所述抗体分子可以包括在本文所述的药物组合物和方法中。在一个实施方案中，该过程包括在适于从编码本公开的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下，培养包含编码本公开核酸的载体的(异源)宿主细胞，并分离抗体分子。
为了产生包含重链和轻链的抗体，可以用编码轻链多肽的第一载体和编码重链多肽的第二载体的两种载体来转染细胞系。或者，可以使用包含编码轻链多肽和重链多肽的序列的一种载体。
可以通过(i)在宿主细胞中表达根据本公开的核酸序列，例如通过使用根据本公开的载体，和(ii)分离表达的抗体产物来产生如本文所述的抗体。此外，该方法可以包括(iii)纯化分离的抗体。可以筛选转化的B细胞和培养的浆细胞，以产生所需特异性或功能的抗体。
可以通过任意免疫试验例如ELISA、通过组织或细胞(包括转染细胞)的染色、通过中和试验或通过本领域已知的用于鉴定所需特异性或功能的许多其他方法中的一种，来进行筛选步骤。该试验可以基于对一种或多于一种抗原的简单识别进行选择，或者可以另外基于所需功能进行选择，例如以选择中和抗体而不仅仅是结合抗原的抗体，以选择能够改变靶细胞特征的抗体，所述靶细胞特征例如它们的信号级联、它们的形状、它们的生长速率、它们影响其他细胞的能力、它们对其他细胞或其他试剂或条件变化的影响的反应、它们的分化状态等。
然后可以从阳性转化的B细胞培养物中产生单个转化的B细胞克隆。用于从阳性细胞混合物中分离单个克隆的克隆步骤可以使用有限稀释、显微操作、通过细胞分选的单细胞沉积或本领域已知的其他方法来进行。
可以使用本领域已知的方法在HEK293T细胞或其他已知的宿主细胞中分离、克隆和表达来自培养的浆细胞的核酸。
本文所述的永生化B细胞克隆或转染的宿主细胞可以以多种方式使用，例如，作为单克隆抗体的来源，作为编码目标单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源，用于研究等。
本公开还提供了包含产生本公开的抗体的永生化B记忆细胞或转染的宿主细胞的组合物。
本公开的永生化B细胞克隆或培养的浆细胞还可以用作用于克隆抗体基因用于之后的重组表达的核酸来源。对于药物目的，来自重组来源的表达可能比来自B细胞或杂交瘤的表达更常见，例如，因稳定性、再现性、易于培养等缘故。
因此，本公开还提供了用于制备重组细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)从编码目标抗体的B细胞克隆或培养的浆细胞中获得一种或多于一种核酸(例如，重链和/或轻链mRNA)；(ii)将核酸插入到表达载体中，和(iii)将载体转染到(异源)宿主细胞中，以允许目标抗体在该宿主细胞中表达。
类似地，本公开还提供了用于制备重组细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)对来自B细胞克隆或培养的浆细胞的编码目标抗体的核酸进行测序；和(ii)使用来自步骤(i)的序列信息制备用于插入宿主细胞中的核酸，以允许目标抗体在该宿主细胞中表达。可以但不必须在步骤(i)和(ii)之间操作核酸，以引入限制位点、改变密码子使用，和/或优化转录和/或翻译调节序列。
此外，本公开还提供了制备转染宿主细胞的方法，该方法包括用一种或多于一种编码目标抗体的核酸来转染宿主细胞的步骤，其中所述核酸是衍生自本公开的永生化B细胞克隆或培养的浆细胞的核酸。因此，首先制备核酸然后使用它来转染宿主细胞的过程可以在不同时间由不同的人在不同地方(例如，在不同国家)进行。
然后，这些本公开的重组细胞可以用于表达和培养目的。它们特别适用于大规模药物生产的抗体表达。它们也可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任意合适的培养技术，包括但不限于静置培养、滚瓶培养、腹水、中空纤维生物反应器、模块化微型发酵罐、搅拌釜、微载体培养、陶瓷芯灌注等。
从B细胞或浆细胞获得免疫球蛋白基因并对其进行测序的方法是本领域众所周知的(例如参见Kuby免疫学第四章，第4版，2000)。
转染的宿主细胞可以包括本文公开的任意宿主细胞，包括例如真核细胞，其包括酵母细胞和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如CHO细胞、NS0细胞、人细胞如PER.C6或HKB-11细胞、骨髓瘤细胞或人肝细胞)以及植物细胞。在一些实施方案中，转染的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在一些实施方案中，表达宿主可以使本公开的抗体糖基化，特别是用本身在人体中没有免疫原性的糖类结构来糖基化。在一些实施方案中，转染的宿主细胞可能能够在无血清培养基中生长。在其他实施方案中，转染的宿主细胞可能能够在不存在动物源性产物的培养基中生长。也可以培养转染的宿主细胞以得到细胞系。
本公开还提供了用于制备一种或多于一种编码目标抗体的核酸分子(例如，重链基因或轻链基因)的方法，该方法包括以下步骤：(i)根据本公开制备永生化B细胞克隆或培养浆细胞；(ii)从B细胞克隆或培养的浆细胞获得编码目标抗体的核酸。而且，本公开提供了用于获得编码目标抗体的核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：(i)根据本公开制备永生化B细胞克隆或培养浆细胞；(ii)对来自B细胞克隆或培养的浆细胞的核酸进行测序，所述核酸编码目标抗体。
本公开还提供了制备编码目标抗体的核酸分子的方法，该方法包括获得从本公开的转化的B细胞克隆或培养的浆细胞获得的核酸的步骤。因此，首先获得B细胞克隆或培养的浆细胞，然后从B细胞克隆或培养的浆细胞获得核酸可以在不同时间由不同的人在不同地方(例如，在不同国家)进行。
本公开还包括用于制备根据本公开的抗体(例如用于医药用途)的方法，该方法包括以下步骤：(i)获得来自表达目标抗体的选定的B细胞克隆或培养的浆细胞的一种或多于一种核酸(例如，重链基因和轻链基因)和/或对其进行测序；(ii)将核酸插入表达载体或使用核酸序列来制备表达载体；(iii)转染可以表达目标抗体的宿主细胞；(iv)在表达目标抗体的条件下培养或继代培养转染的宿主细胞；和任选地(v)纯化目标抗体。
本公开还提供了制备目标抗体的方法，所述方法包括以下步骤：在表达目标抗体的条件下，培养或继代培养转染的宿主细胞群，例如稳定转染的宿主细胞群，和任选地纯化目标抗体，其中所述转染的宿主细胞已经通过以下步骤来制备：(i)提供编码选定的目标抗体的核酸，其由如以上所述制备的B细胞克隆或培养的浆细胞产生，(ii)将核酸插入表达载体，(iii)转染可以表达目标抗体的宿主细胞中的载体，和(iv)培养或继代培养包含插入核酸的转染的宿主细胞，以产生目标抗体。因此，首先制备重组宿主细胞然后培养它来表达抗体的过程可以在完全不同的时间由不同的人在不同地方(例如，在不同国家)进行。
药物组合物
本公开提供药物组合物(术语“药物组合物”和“抗体组合物”在本文可互换使用)，其包含中和甲型流感的抗体和药学上可接受的水性载剂。通常将载剂理解为适合于存储、运输、配制和/或施用化合物例如药物活性化合物，特别是根据本公开的抗体的材料。例如，载剂可以是生理上可接受的液体，其适合于存储、运输和/或施用药物活性化合物，特别是根据本公开的抗体。
制备本文所述的药物组合物用于注射或输注给患者(在本文中也称为对象，包括在预防性施用的上下文中)。在一些实施方案中，可以制备药物组合物用于静脉内、动脉内或心室内输注。在其他实施方案中，可以制备药物组合物用于静脉内、动脉内、心室内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内或皮下注射。在特定实施方案中，制备药物组合物用于肌肉(″IM″)注射。在具体的实施方案中，本文所述的药物组合物是药学上可接受的无菌水溶液，其表现出合适的pH、等渗性和稳定性，用于施用至人类对象。适合于本文所述的药物组合物的配制的水性载体包括水(例如，无菌水、USP注射用水)，以及等渗载体，例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐林格注射液。
根据本说明书的药物组合物含有选自根据本说明书的中和甲型流感的抗体。例如，在一些实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有抗体，所述抗体包含分别如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中所述的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中所述的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及在重链恒定区中的突变M428L和N434S(根据EU编号)。在其他实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有70％或大于70％(即70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有70％或大于70％同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列(分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中所述的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中所述的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列)。在其他实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有75％或大于75％(即75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有75％或大于75％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在其他实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有80％或大于80％(即80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有80％或大于80％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在其他实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有85％或大于85％(即85％、81％、85％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有85％或大于85％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在其他实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有包含重链可变区和轻链可变区的(分离的)抗体，所述重链可变区包括包含与SEQ ID NO：7具有90％或大于90％(即90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列的重链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有90％或大于90％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在一些实施方案中，本公开的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有95％或大于95％(即95％、96％、97％、98％、99％或大于99％)的同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO：8具有95％或大于95％的同一性的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。在其他实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列，其中保持如上定义的CDR序列。
在特定实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有包含根据SEQ ID NO：10的轻链氨基酸序列和根据SEQ ID NO：9的重链氨基酸序列的抗体。
在一些实施方案中，抗体或包含抗体的药物组合物的体外流感感染抑制IC90为约2.17μg/mL。
药物组合物包含充足的抗体材料以便于给患者施用治疗有效量抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含的抗体浓度选自100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL和200mg/mL。在其他实施方案中，药物组合物中包含抗体的浓度选自大于50mg/mL、大于75mg/mL、大于100mg/mL、大于125mg/mL、大于150mg/mL、大于175mg/mL、大于200mg/mL、大于225mg/mL和大于250mg/mL。在其他实施方案中，药物组合物包含抗体的浓度为50mg/mL至200mg/mL、75mg/mL至225mg/mL或100mg/mL至200mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物包含抗体的浓度为125mg/ml至150mg/ml。在其他实施方案中，药物组合物包含抗体的浓度为150mg/mL。
根据本说明书的药物组合物可以包含一种或多于一种缓冲液、表面活性剂或嵌段共聚合物、盐、稳定剂(例如糖醇、二糖或多糖稳定剂，和/或稳定氨基酸。另外，在需要或期望的情况下，本文所述的药物组合物可以配制成另外包含一种或多于一种抗氧化剂(例如抗坏血酸、蛋氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA))。
本公开的药物组合物表现出并维持的pH，维持抗体的生存力，同时也适合于注射或输注。本文所述的药物组合物通常pH为约5.5至约6.5，例如5.5至6.5。在一些实施方案中，药物组合物的pH为5.8至6.2，例如约6.0。在某些实施方案中，pH可以是5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
药物组合物可以包含缓冲剂以达到并维持所需的pH。适合用于本文所述的药物组合物的缓冲液包括例如乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。在特定实施方案中，药物组合物含有选自组氨酸缓冲液和磷酸盐缓冲液的缓冲液。在某些实施方案中，组合组可以包含组氨酸的浓度为10mM至40mM或20mM至40mM。例如，在具体实施方案中，根据本说明书的药物组合物含有组氨酸的浓度选自10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM或40mM。在其他实施方案中，药物组合物含有抗体的浓度为120mg/mL至160mg/mL(例如120mg/mL、125mg/mL、130mg/mL、135mg/mL、140mg/mL、145mg/mL、150mg/mL、155mg/mL或160mg/mL)，并且药物组合物包含组氨酸的浓度为20mM、25mM、30mM、35mM或40mM。在其他实施方案中，药物组合物包含抗体的浓度为约75mg/mL，并且包含组氨酸的浓度为约10mM。在某些实施方案中，当前公开的包含组氨酸缓冲液的药物组合物的pH为5.5至6.5，优选5.8至6.2，例如6。在具体的实施方案中，药物组合物的pH为6并包含组氨酸缓冲液。
本文所述的药物组合物还可以包含表面活性剂或三嵌段共聚物。表面活性剂，有时称作“洗涤剂”，可以提供一种或多于一种功能。例如，在水性抗体溶液中，表面活性剂用于保护抗体功能，帮助抗体或其他赋形剂溶解，和/或控制微生物生长。可以用于本文所述的药物组合物的表面活性剂包括例如聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯20(吐温20)和泊咯沙姆188。在一些实施方案中，药物组合物含有0.01％(重量/体积)至0.05％(重量/体积)(例如0.01％(重量/体积)、0.02％(重量/体积)、0.03％(重量/体积)、0.04％(重量/体积)或0.05％(重量/体积))的表面活性剂。在这种实施方案中，表面活性剂可以选自聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯20(吐温20)和泊咯沙姆188。在具体的实施方案中，本说明书的药物组合物含有0.01％(重量/体积)至0.05％(重量/体积)的聚山梨醇酯80(吐温80)或泊咯沙姆188。在其他实施方案中，本说明书的药物组合物含有0.02％(重量/体积)的聚山梨醇酯80(吐温80)或泊咯沙姆188。
根据本公开的药物组合物包含糖醇、二糖或多糖稳定剂，所述多糖稳定剂可以选自例如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和葡聚糖40。在特定的实施方案中，稳定剂是二糖。在某些实施方案中，药物组合物包含3.0％(重量/体积)至9.0％(重量/体积)，优选3.6％(重量/体积)至8.6％(重量/体积)，更优选4％(重量/体积)至6％(重量/体积)，例如4.3％(重量/体积)至6.3％(重量/体积)，例如5.3％(重量/体积)的二糖。在某些这种实施方案中，二糖是蔗糖。在一些实施方案中，药物组合物包含3.0％(重量/体积)、3.1％(重量/体积)、3.2％(重量/体积)、3.3％(重量/体积)、3.4％(重量/体积)、3.5％(重量/体积)、3.6％(重量/体积)、3.7％(重量/体积)、3.8％(重量/体积)、3.9％(重量/体积)、4.0％(重量/体积)、4.1％(重量/体积)、4.2％(重量/体积)、4.3％(重量/体积)、4.4％(重量/体积)、4.5％(重量/体积)、4.6％(重量/体积)、4.7％(重量/体积)、4.8％(重量/体积)、4.9％(重量/体积)、5.0％(重量/体积)、5.1％(重量/体积)、5.2％(重量/体积)、5.3％(重量/体积)、5.4％(重量/体积)、5.5％(重量/体积)、5.6％(重量/体积)、5.7％(重量/体积)、5.8％(重量/体积)、5.9％(重量/体积)、6.0％(重量/体积)、6.1％(重量/体积)、6.2％(重量/体积)、6.3％(重量/体积)、6.4％(重量/体积)、6.5％(重量/体积)、6.6％(重量/体积)、6.7％(重量/体积)、6.8％(重量/体积)、6.9％(重量/体积)、7.0％(重量/体积)、7.1％(重量/体积)、7.2％(重量/体积)、7.3％(重量/体积)、7.4％(重量/体积)、7.5％(重量/体积)、7.6％(重量/体积)、7.7％(重量/体积)、7.8％(重量/体积)、7.9％(重量/体积)、8.0％(重量/体积)、8.1％(重量/体积)、8.2％(重量/体积)、8.3％(重量/体积)、8.4％(重量/体积)、8.5％(重量/体积)、8.6％(重量/体积)、8.7％(重量/体积)、8.8％(重量/体积)、8.9％(重量/体积)或9.0％(重量/体积)的蔗糖，或由这些值中的任意两个限制的范围并包括这任意两个值。在某些实施方案中，药物组合物含有5.3％(重量/体积)的蔗糖。
在一些实施方案中，药物组合物适合于施用于哺乳动物，例如人类对象。在这种实施方案中，药物组合物是无菌的，并且可以特别地制备成无热原的。另外，药物组合物可以是对人等渗的。
在一些实施方案中，药物组合物的pH不小于5.5。在某些其他实施方案中，药物组合物不包含乙酸盐或柠檬酸盐。在某些实施方案中，药物组合物不包含盐，例如，在特定实施方案中，NaCl。在某些实施方案中，药物组合物不具有高离子强度。在某些实施方案中，药物组合物不是(i)包含磷酸盐缓冲液的和(ii)pH为7或大于7的。
可以制备本文所述的药物组合物用于直接施用至对象(即没有复溶或混合步骤)，或在向对象注射或输注之前，它们可以制备成冻干材料，在水性载剂中复溶。对于向对象的直接施用，根据本公开的药物组合物可以以例如预填充注射器、或瓶如玻璃瓶提供。在一些实施方案中，本公开的药物组合物以密闭容器提供。在一些实施方案中，组合物可以呈试剂盒形式，设计成使得组合的组合物在即将施用于对象之前被复溶。例如，冻干抗体可以以试剂盒形式与无菌水或无菌缓冲液一起提供。
药物治疗和用途
在其他方面，本公开提供了根据本公开的药物组合物在预防和/或治疗感染甲型流感病毒中的用途。在特定的实施方案中，本公开提供了用于预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法，其中所述方法包括：向有需要的对象施用治疗有效量的根据本公开的药物组合物。
在一些实施方案中，各种药代动力学(″PK″)参数用于描述或表征本文提供的方法和药物组合物。在本公开的上下文中，使用
Figure BPA0000320867220000281
8.2(Certara L.P.，Princeton，NJ)中的标准非房室方法推导出提及的与本文提供的方法有关的PK参数。结合实施例7中提及的人类临床研究，描述了关于收集抗体血清浓度以评估PK参数的其他细节。术语“t1/2”是指包含在施用于对象的药物组合物中的抗体的消除半衰期。术语“C最终”通常是指最后可测量的血浆浓度(即，在此之后，该物质在血浆中不存在可测量的浓度)。在本说明书的上下文中，“C最终”是指在施用药物组合物后第140天测量的血浆浓度。
感染甲型流感病毒的预防特别是指预防性设置，其中未诊断出对象感染甲型流感病毒(未进行诊断或诊断结果为阴性)和/或对象未显示出或经历感染甲型流感病毒的症状。感染甲型流感病毒的预防在受感染时具有严重疾病或并发症的较大风险的对象中特别有用，例如孕妇、儿童(例如59月龄以下的儿童)、老年人、慢性病(例如慢性心脏、肺、肾、代谢、神经发育、肝脏或血液疾病)患者和免疫抑制疾病(例如HIV/AIDS、接受化疗或类固醇或恶性肿瘤)患者。而且，感染甲型流感病毒的预防在具有患上甲型流感病毒感染的较高风险的对象中例如，由于暴露增加具有较高风险的对象中，例如在公共场所工作或停留的对象中，尤其是医护人员中也特别有用。
相反，在治疗设置中，对象通常感染甲型流感病毒、诊断出甲型流感病毒感染和/或显示出甲型流感病毒感染的症状。值得注意的是，甲型流感病毒感染的术语“治疗”和“疗法”/“治疗性”包括(完全)治愈以及减弱/减少甲型流感病毒感染和/或相关症状(例如，减弱/减少感染和/或症状的严重性、症状的数量、感染和/或症状的持续时间或其任意组合)。
本文所述的方法包括用于治疗诊断出甲型流感病毒感染的对象或显示出甲型流感病毒感染症状的对象中甲型流感病毒感染的方法，其中所述方法包括向对象施用治疗有效量的根据本公开的药物组合物。在用于治疗诊断出甲型流感或显示出甲型流感症状的对象的方法的某些实施方案中，在施用药物组合物后，对象经历(i)选自咳嗽、喉咙痛、鼻漏和充血的一种或多于一种呼吸道症状的数量和/或严重性减少，和/或(ii)选自发热、寒颤、肌痛、头痛、乏力和疲劳的一种或多于一种全身症状的数量和/或严重性减少。出于本公开和本文提供的方法描述的目的，术语“发烧”是指口腔温度＞38℃(100.4°F)。
本文所述的方法包括用于预防对象感染甲型流感病毒的方法，其中所述方法包括向对象施用治疗有效量的根据本公开的药物组合物。在用于预防感染甲型流感病毒的方法的某些实施方案中，在施用药物组合物后，对象在施用所述药物组合物后至少4周经历(i)选自咳嗽、喉咙痛、鼻漏和充血的一种或多于一种呼吸道症状的数量和/或严重性减少，和/或(ii)选自发热、寒颤、肌痛、头痛、乏力和疲劳的一种或多于一种全身症状的数量和/或严重性减少。在用于预防感染甲型流感病毒的方法的其他实施方案中，在施用药物组合物后，对象在施用所述药物组合物后至少12周经历(i)自咳嗽、喉咙痛、鼻漏和充血的一种或多于一种呼吸道症状的数量和/或严重性减少，和/或(ii)自发热、寒颤、肌痛、头痛、乏力和疲劳的一种或多于一种全身症状的数量和/或严重性减少。在用于预防感染甲型流感病毒的方法的其他实施方案中，在施用药物组合物后，对象在施用所述药物组合物后至少20周经历(i)选自咳嗽、喉咙痛、鼻漏和充血的一种或多于一种呼吸道症状的数量和/或严重性减少，和/或(ii)选自发热、寒颤、肌痛、头痛、乏力和疲劳的一种或多于一种全身症状的数量和/或严重性减少。在本文所述的用于预防感染甲型流感病毒的方法的一些实施方案中，施用药物组合物仅包括向对象施用治疗有效量的药物的单次季节性施用。在一些实施方案中，在单次施用后，施用药物组合物为对象提供根据本公开的甲型流感中和抗体的全身性暴露至少10周、至少15周和至少20周。
应理解的是，本文提及的症状数量和/或严重性的减少(这种减少是由于施用本公开的药物组合物)描述了与未接受所公开的药物组合物的参照对象的比较。参照对象可以是例如(i)较早时期(例如，先前的甲型流感病毒季节)的相同对象，(ii)相同或相似对象：年龄或年龄层；性别；妊娠状态；慢性医学疾病(例如慢性心脏、肺、肾、代谢、神经发育、肝脏或血液疾病)或缺少这些疾病；和/或免疫抑制疾病或缺少该疾病；或(iii)在甲型流感病毒季节，人群中的典型对象(例如，本地、地区或国家，包括相同或相似的年龄或年龄范围和/或一般健康状况)。预防可以通过例如在完整的甲型流感季节的部分期间或整个甲型流感季节期间未发展为确诊的甲型流感感染和/或缺少与甲型流感感染相关的症状来确定。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括向具有甲型流感感染的直接风险的对象施用治疗有效量的根据本公开的药物组合物。甲型流感感染的直接风险通常发生在甲型流感流行期间。已知甲型流感病毒循环并造成疾病的季节性流行(WHO，Influenza(Seasonal)Fact sheet，2018年11月6日)。在温带气候，季节性流行主要发生在冬天，而在热带地区，流感可能全年发生，导致爆发更不规律。例如，在北半球，甲型流感流行的风险在十一月、十二月、一月、二月和三月较高，而在南半球，甲型流感流行的风险在五月、六月、七月、八月和九月较高。
在一些实施方案中，根据本公开的药物组合物用于预防和/或治疗甲型流感病毒感染，其中在(可能的)甲型流感病毒感染前最多三个月，在(可能的)甲型流感病毒感染前最多一个月，在(可能的)甲型流感病毒感染前最多两周，或在(可能的)甲型流感病毒感染前最多一周施用药物组合物。在这种实施方案中，用于预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法包括向对象施用治疗有效量的药物组合物，其中在(可能的)甲型流感病毒感染前最多六个月(例如，包括在预期或可能暴露于甲型流感病毒之前最多六个月)，在(可能的)甲型流感病毒感染前最多三个月，在(可能的)甲型流感病毒感染前最多一个月，在(可能的)甲型流感病毒感染前最多两周，在(可能的)甲型流感病毒感染前最多一周施用药物组合物。在某些其他实施方案中，用于预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法包括向对象施用治疗有效量的药物组合物，其中在甲型流感感染的首发症状出现之前最多六天、最多五天、最多四天、最多三天、最多两天施用药物组合物。这种治疗方案可特别适合于使用药物组合物预防甲型流感感染。
在本文所述的方法的一些实施方案中，其中根据本公开的药物组合物用于预防，根据本公开的方法包括在流感季节开始之前1个月至2个月内，或在流感季节的前1个月至2个月内，向对象施用治疗有效量的根据本公开的药物组合物。
在本公开所述方法的一些实施方案中，在根据本公开的药物组合物的首次施用后，可以进行一次或多于一次后续施用。这种实施方案包括例如，包括以每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次和每六个月一次的间隔向对象施用治疗有效量的根据本说明书的药物组合物的方法。其他这种实施方案包括例如根据本公开的方法包括以每年一次和每年两次的间隔施用治疗有效量的根据本说明书的药物组合物。在其他这种实施方案中，根据本公开的方法包括以每年一次和每年两次或在一年、两年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年和十年的总治疗期内每年两次的间隔施用治疗有效量的根据本说明书的药物组合物。
在本文所述的每个方法中，施用治疗有效量(无论是为了预防、治疗还是两者)包括施用递送治疗有效剂量的甲型流感中和抗体的药物组合物的量。在一些实施方案中，施用治疗有效量的药物组合物涉及递送约50mg至约3000mg的抗体剂量。根据药物组合物中的抗体浓度，达到所需的抗体剂量可能需要多次注射或作为单次施用的一部分的输注。例如，如果对象要接受600mg的抗体剂量，并且在准备好的注射瓶中提供该药物组合物，该注射瓶中含有2ml包含浓度为150mg/ml的甲型流感中和抗体的水溶液，则施用600mg剂量将需要两次注射(每个注射瓶含有300mg抗体)。哪怕需要多次注射或输注以施用规定剂量，该剂量称为“单剂量”，并且认为该施用是“单次施用”。通常，如果需要多次注射或输注以施用规定的单剂量，那么在约5分钟或少于5分钟、约15分钟或少于15分钟、约30分钟或少于30分钟、约1小时或少于1小时、约2小时或少于2小时、约4小时或少于4小时、约6小时或少于6小时、约1天或少于1天、约1周或少于1周、或约1个月或少于1个月期间进行多次注射或输注。
在本文所述的方法的某些实施方案中，递送治疗有效剂量的根据本公开的抗体包括向对象递送单剂量为约60mg至约2500mg的甲型流感中和抗体。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向对象施用足以递送单剂量的甲型流感中和抗体的药物组合物的量，所述单剂量选自高达60mg剂量、高达300mg剂量、高达1200mg剂量、高达1800mg剂量、高达2000mg剂量和高达2500mg剂量。在其他实施方案中，本文所述的方法包括向对象递送足以提供单剂量的甲型流感中和抗体的药物组合物的量，所述单剂量选自60mg、300mg、1200mg和1800mg。在其他实施方案中，本文所述的方法包括向对象递送足以提供单剂量的甲型流感中和抗体的药物组合物的量，所述单剂量选自300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg和1200mg。
在本文所述的方法的特别的实施方案中，在单次施用后，药物组合物的施用为对象提供根据本公开的甲型流感中和抗体的全身性暴露至少10周、至少15周和至少20周。在特定的这种实施方案中，甲型流感中和抗体在人类对象中可以表现出大于40天的t1/2。例如，本文所述的方法、药物组合物和甲型流感中和抗体可以提供选自大于45天、大于50天、大于55天、大于60天和大于65天的甲型流感中和抗体的t1/2。在其他实施方案中，本文所述的方法、药物组合物和甲型流感中和抗体可以提供选自40天至70天、45天至65天和50天至60天的甲型流感中和抗体的t1/2。在其他实施方案中，本文所述的方法、药物组合物和甲型流感中和抗体可以提供选自50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天和68天中任一的甲型流感中和抗体的t1/2。
本文所述的预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法可以包括向对象施用足以递送60mg单剂量的甲型流感中和抗体的药物组合物的量。在某些这种实施方案中，递送60mg单剂量的甲型流感中和抗体在对象中提供抗体的全身性暴露持续很长一段时间，使得在施用之后，抗体以约1μg/mL至约4.5μg/mL的血清浓度在对象中存在高达140天。
本文所述的预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法可以包括向对象施用足以递送300mg单剂量的甲型流感中和抗体的药物组合物的量。在某些这种实施方案中，递送300mg单剂量的甲型流感中和抗体在对象中提供抗体的全身性暴露持续很长一段时间，使得在施用之后，抗体以约5μg/mL至约26.5μg/mL的血清浓度在对象中存在高达140天。
本文所述的预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法可以包括向对象施用足以递送1200mg单剂量的甲型流感中和抗体的药物组合物的量。在某些这种实施方案中，递送1200mg单剂量的甲型流感中和抗体在对象中提供抗体的全身性暴露持续很长一段时间，使得在施用之后，抗体以约27μg/mL至约110μg/mL的血清浓度在对象中存在高达140天。
本文所述的预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法可以包括向对象施用足以递送1800mg单剂量的甲型流感中和抗体的药物组合物的量。在某些这种实施方案中，递送1800mg单剂量的甲型流感中和抗体在对象中提供抗体的全身性暴露持续很长一段时间，使得在施用之后，抗体以约33.5μg/mL至约150μg/mL的血清浓度在对象中存在高达140天。
在本文所述的用于预防和/或治疗感染甲型流感病毒的任意方法中，药物组合物可以通过注射或输注施用。当通过输注施用时，可以通过例如静脉内、动脉内或心室内输注来施用药物组合物。当通过注射施用时，可以通过例如静脉内、动脉内、心室内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内或皮下注射来施用药物组合物。在本文所述的方法的特定实施方案中，通过肌肉(“IM”)注射来施用药物组合物。
在本文所述的用于预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法的特定实施方案中，当以本文所述的量和剂量施用时，对象对药物组合物和甲型流感中和抗体耐受良好。例如，在某些实施方案中，根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，本文所述的用于预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法不会导致对象经历不良事件(AE)。在其他实施方案中，根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，本文所述的用于预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法不会导致对象经历轻度不良事件(AE)。在其他实施方案中，根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，本文所述的用于预防和/或治疗感染甲型流感病毒的方法不会导致对象经历重度不良事件(AE)。
在用于预防和/或治疗感染流感的方法的特定实施方案中，对象的年龄为18岁至65岁。在某些这种实施方案中，对象的身体质量指数选自18kg/m2至32kg/m2和18kg/m2至35kg/m2。
联合疗法
在根据本公开的方法和用途中施用根据本公开的药物组合物可以单独进行或与辅剂(在本文中也称为“附加活性成分”)联合进行，所述辅剂可用于预防和/或治疗流感感染。
本公开包括施用根据本公开的药物组合物，其中在对治疗和/或预防流感有用的辅剂或另一种治疗方案之前、同时或之后向对象施用。与所述辅剂联合施用的所述药物组合物可以以同一或不同的组合物以及通过相同或不同的施用途径来施用。如本文所用，如“联合疗法”、“联合用药”、“联合施用”等表达是指(被“联合”施用的)药物的联合作用。为此，组合药物通常同时和/或在重叠的时间窗口内存在于作用部位。也有可能在施用另一种药物时，由其中一种药物产生的作用仍持续(即使药物本身可能不再以可检测的方式存在)，使得两种药物的作用可以相互作用。然而，药物在另一种药物之前很久(例如，大于一个月、两个月、三个月或一年)施用，使得当施用另一种药物时，它不再以可检测的水平存在(或其作用不再持续)，通常不认为是“联合”施用。例如，在不同的(例如连续的)流感季节施用的流感药物通常不“联合”施用。
所述其他治疗方案或辅剂可以是例如抗病毒物质。抗病毒物质(或“抗病毒剂”或“抗病毒药”)是指专门用于治疗病毒感染的药物种类。如用于细菌的抗生素，抗病毒物质可以是对抗各种病毒有用的广谱抗病毒物质或用于特定病毒的特异性抗病毒物质。不像大多数抗生素，抗病毒药通常不破坏其目标病原体；相反，它们通常抑制其发展。
因此，在本公开的另一方面，根据本公开的药物组合物与用于本文所述(医疗)用途的抗病毒物质联合(在之前、同时或在之后)施用。
通常，抗病毒物质可以是广谱抗病毒物质(对抗流感病毒和其他病毒有用)或流感病毒特异性抗病毒物质。在一些实施方案中，抗病毒物质不是抗体。例如，抗病毒物质可以是小分子药物。对预防和/或治疗流感有用的小分子抗病毒物质的实例描述于Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents.Theranostics.2017；7(4)：826-845。如Wu等人，2017中描述的，熟练的技术人员熟悉对预防和/或治疗流感有用的抗病毒物质。其他对流感有用的抗病毒物质描述于Davidson S.Treating Influenza Infection，From Now and Into theFuture.Front Immunol.2018；9：1946；和Koszalka P，Tilmanis D，Hurt AC.Influenzaantivirals currently in late-phase clinical trial.Influenza Other RespirViruses.2017；11(3)：240-246。
对预防和/或治疗流感有用的抗病毒物质包括(i)靶向流感病毒自身的功能性蛋白的药剂，和(ii)靶向宿主细胞如上皮细胞的药剂。
宿主细胞靶向药剂包括噻唑内酯(thiazolide)类广谱抗病毒物质、唾液酸酶融合蛋白、III型干扰素、Bcl-2(B细胞淋巴瘤2)抑制剂、蛋白酶抑制剂、V-ATP酶抑制剂和抗氧化剂。噻唑内酯类广谱抗病毒物质的实例包括硝唑尼特(NTZ)，其在血液中迅速脱乙酰形成活性代谢形式替唑尼特(TIZ)，第二代噻唑内酯类化合物，在结构上与NTZ相关，如RM5061。流感酶(DAS181)是唾液酸酶融合蛋白的实例。III型IFN包括例如IFNλ。Bcl-2抑制剂的非限制性实例包括ABT-737、ABT-263、ABT-199、WEHI-539和A-1331852(Davidson S.TreatingInfluenza Infection，From Now and Into the Future.Front Immunol.2018；9：1946)。蛋白酶抑制剂的实例包括萘莫司他、亮抑蛋白酶肽、ε-氨基己酸、卡莫司他和Aprotinin。V-ATP酶抑制剂包括NorakinR、ParkopanR、AntiparkinR和AkinetonR。抗氧化剂的实例是α-生育酚。
在一些实施方案中，抗病毒物质是靶向流感病毒本身的功能性蛋白的药剂。例如，抗病毒物质可以靶向流感病毒的功能性蛋白，其不是血凝素。通常，靶向流感病毒的功能性蛋白的抗病毒物质包括进入抑制剂、血凝素抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、流感聚合酶抑制剂(RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂)、核衣壳蛋白抑制剂、M2离子通道抑制剂和盐酸阿比朵尔。进入抑制剂的非限制性实例包括三萜衍生物，例如甘草酸(甘草甜素)和甘草次酸；皂苷；乌拉尔甘草皂苷M-Y(例如乌拉尔甘草皂苷M)；硫酸葡聚糖(DS)；水飞蓟素；姜黄素；和亲溶酶体剂，例如刀豆霉素A、巴弗洛霉素A1和氯喹。血凝素抑制剂的非限制性实例包括BMY-27709；stachyflin；天然产物，例如棉酚、芦丁、槲皮素、木番荔枝碱和茶黄素；三价糖肽类似物，例如描述于Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of small molecular inhibitors inthe development of anti-influenza virus agents.Theranostics.2017；7(4)：826-845的化合物1；罗汉松酸衍生物，例如描述于Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of smallmolecular inhibitors in the development of anti-influenza virusagents.Theranostics.2017；7(4)：826-845的化合物2；天然产物五环三萜，例如描述于WuX，Wu X，Sun Q等人，Progress of small molecular inhibitors in the development ofanti-influenza virus agents.Theranostics.2017；7(4)：826-84的化合物3；和异戊烯化吲哚二酮哌嗪类生物碱，例如新海胆灵B。核衣壳蛋白抑制剂的非限制性实例包括nucleozin、环己酰亚胺、萘普生和英加韦林。M2离子通道抑制剂的非限制性实例包括改善的M2抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺及其衍生物；以及非金刚烷衍生物，例如精胺、亚精胺、螺环哌啶和蒎烷胺衍生物。
在一些实施方案中，抗病毒物质选自神经氨酸酶(NA)抑制剂和流感聚合酶抑制剂(RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂)。神经氨酸酶(NA)抑制剂的非限制性实例包括扎那米韦；奥司他韦；那尼纳米韦；其衍生物，例如Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of smallmolecular inhibitors in the development of anti-influenza virusagents.Theranostics.2017；7(4)：826-845中所述的化合物4-10，和二聚扎那米韦缀合物(例如，如Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of small molecular inhibitors in thedevelopment of anti-influenza virus agents.Theranostics.2017；7(4)：826-845))中所述；苯甲酸衍生物(例如，如Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of small molecularinhibitors in the development of anti-influenza virusagents.Theranostics.2017；7(4)：826-845中所述；例如化合物11-14)；吡咯烷衍生物(例如，如Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of small molecular inhibitors in thedevelopment of anti-influenza virus agents.Theranostics.2017；7(4)：826-845中所述；例如化合物15-18)；银杏黄酮-唾液酸缀合物；黄烷酮类和类黄酮异黄芩素及其衍生物(例如，如Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of small molecular inhibitors in thedevelopment of anti-influenza virus agents.Theranostics.2017；7(4)：826-845中所述)；AV5080；和N取代的奥司他韦类似物(例如，如Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress ofsmall molecular inhibitors in the development of anti-influenza virusagents.Theranostics.2017；7(4)：826-845中所述)。流感聚合酶抑制剂(RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂)的非限制性实例包括RdRp干扰化合物，例如Wu X，Wu X，Sun Q等人，Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenzavirus agents.Theranostics.2017；7(4)：826-845所述的那些；PB2帽结合抑制剂，例如JNJ63623872(VX-787)；帽依赖的核酸内切酶抑制剂，例如巴洛沙韦马波西酯(S-033188)；PA核酸内切酶抑制剂；例如AL-794、EGCG及其脂肪族类似物、N-异羟肟酸和N-羟基酰亚胺、flutimide及其芳香族类似物、特特拉姆酸衍生物、L-742001、ANA-0、多酚儿茶素、苯乙基-苯基邻苯二甲酰亚胺类似物、大环双联苄、pyrimidinole、富勒烯，羟基喹啉酮、羟基吡啶酮、羟基哒嗪酮、含三羟基苯基的化合物、2-羟基苯甲酰胺、羟基嘧啶酮、β-二酮酸及其生物电子化合物、缩氧硫脲类药、双二羟基吲哚甲酰胺和吡啶并哌嗪二酮(Endo-1)；以及核苷和核碱基类似物抑制剂，如利巴韦林、法匹拉韦(T-705)、2′-脱氧-2′-氟鸟苷(2′-FdG)、2′-取代的carba-核苷类似物、6-甲基-7-取代-7-脱氮嘌呤核苷类似物和2′-脱氧-2′-氟胞苷(2′-FdC)。例如，抗病毒物质可以是扎那米韦、奥司他韦或巴洛沙韦。
因此，根据本公开的药物组合物可以包含一种或多于一种附加活性成分。根据本公开的甲型流感中和抗体可以作为附加活性成分(辅剂)存在于相同的药物组合物中。或者，根据本公开的甲型流感中和抗体和附加活性成分(辅剂)包含在不同的药物组合物中(例如，不在同一组合物中)。因此，如果设想了多于一种的附加活性成分(辅剂)，则根据本公开的每种附加活性成分(辅剂)和抗体或抗原结合片段可以包含在不同的药物组合物中。可以将这些不同的药物组合物组合/同时地或在不同的时间和/或用不同的施用途径进行施用。
根据本公开的甲型流感中和抗体和附加活性成分(辅剂)可以提供附加或协同治疗效果。术语“协同”用于描述两种或多于两种活性剂的联合效果，其大于每种相应活性剂的各个效果之和。因此，当两种或多于两种试剂的联合效应导致对活性或过程的“协同抑制”时，该活性或过程的抑制大于每种相应活性剂的抑制效果之和。术语“协同治疗效果”是指用两种或多于两种疗法的组合观察到的治疗效果，其中所述治疗效果(如许多参数中的任意一个所测量的)大于用相应的单独疗法观察到的单独治疗效果之和。
因此，本公开还提供了以下组合：(i)如本文所述的甲型流感中和抗体，和(ii)如上所述的抗病毒剂。
本公开包括以下实例性实施方案。
实施方案1、一种抗体，其包含分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中所述的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中所述的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；以及在重链恒定区中的突变M428L和N434S。
实施方案2、根据实施方案1所述的抗体，其中抗体与甲型流感病毒的血凝素结合。
实施方案3、根据实施方案1或2所述的抗体，其中抗体中和甲型流感病毒的感染。
实施方案4、根据实施方案3所述的抗体，其中抗体中和甲型流感感染的剂量不超过用对比抗体中和甲型流感所需剂量的一半，对比抗体与抗体的不同之处仅在于对比抗体不包含重链恒定区中的突变M428L和N434S。
实施方案5、根据实施方案4所述的抗体，其中剂量不超过用对比抗体中和甲型流感所需剂量的三分之一。
实施方案6、根据实施方案4或5所述的抗体，其中剂量不超过用对比抗体中和甲型流感所需剂量的五分之一。
实施方案7、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体是人抗体。
实施方案8、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
实施方案9、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体是IgG型。
实施方案10、根据实施方案6所述的抗体，其中抗体是IgG1型。
实施方案11、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体的轻链是κ轻链。
实施方案12、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有至少70％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中保持如实施方案1中定义的CDR序列。
实施方案13、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有至少75％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有至少75％同一性的氨基酸序列，其中保持如实施方案1中定义的CDR序列。
实施方案14、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中保持如实施方案1中定义的CDR序列。
实施方案15、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包与SEQ ID NO：7具有至少85％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有至少85％同一性的氨基酸序列，其中保持如实施方案1中定义的CDR序列。
实施方案16、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中保持如实施方案1中定义的CDR序列。
实施方案17、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：7具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：8具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中保持如实施方案1中定义的CDR序列。
实施方案18、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：7所述的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：8所述的氨基酸序列，其中保持如实施方案1中定义的CDR序列。
实施方案19、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体的CH3区除了M428L和N434S之外不包含任意其他的突变。
实施方案20、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体的Fc区除了M428L和N434S之外不包含任意其他的突变。
实施方案21、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO：9中所述的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO：10中所述的氨基酸序列。
实施方案22、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中抗体包含重链和轻链，所述重链由如SEQ ID NO：9中所述的氨基酸序列组成，所述轻链由如SEQ ID NO：10中所述的氨基酸序列组成。
实施方案23、根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其用于预防或治疗感染甲型流感病毒，其中，任选地，抗体或包含抗体的药物组合物的体外流感感染抑制IC90为约2.17μg/mL。
实施方案24、根据实施方案23中所述之用途的抗体，其中抗体是预防性施用的。
实施方案25、根据实施方案23或24中任一项所述之用途的抗体，其中待治疗的对象具有甲型流感感染的直接风险。
实施方案26、一种核酸分子，其包含编码根据实施方案1至22中任一项所述的抗体的多核苷酸。
实施方案27、一种载体，其包含实施方案26所述的核酸分子。
实施方案28、一种细胞，其表达实施方案1至22中任一项所述的抗体或包含根据实施方案27所述的载体。
实施方案29、一种药物组合物，其包含根据实施方案1至22中任一项所述的抗体、实施方案26所述的核酸、实施方案27所述的载体、或实施方案28所述的细胞以及任选地药学上可接受的稀释剂或载剂。
实施方案30、根据实施方案29所述的药物组合物，其包含抗体的浓度为150mg/mL。
实施方案31、根据实施方案30或31所述的药物组合物，其还包含水(例如USP注射用水或US无菌注射用水)。
实施方案32、根据实施方案38至40中任一项所述的药物组合物，在药物组合物中还包含组氨酸，任选地浓度为10mM至40mM，优选20mM。
实施方案33、根据实施方案29至32中任一项所述的药物组合物，其还包含任选地3.0％至9.0％(重量/体积)，优选3.6％至8.6％，更优选4％至6％的糖，例如二糖如蔗糖。
实施方案34、根据实施方案29至33中任一项所述的药物组合物，其还包含表面活性剂或三嵌段共聚物、任选地聚山梨醇酯或泊咯沙姆188，优选聚山梨醇酯80(PS80)，任选地为0.01％(重量/体积)至0.05％(重量/体积)，优选0.02％(重量/体积)。
实施方案35、根据实施方案29至34中任一项所述的药物组合物，其中药物组合物的pH为5.5至6.5、或5.8至6.2，或pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，优选6.0。
实施方案36、根据实施方案1至22中任一项所述的抗体、实施方案26所述的核酸、实施方案27所述的载体、实施方案28所述的细胞或实施方案29至35中任一项所述的药物组合物在制备用于预防、治疗或减少甲型流感病毒感染的药物中的用途。
实施方案37、根据实施方案1至22中任一项所述的抗体、实施方案26所述的核酸、实施方案27所述的载体、实施方案28所述的细胞或实施方案29至35中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗甲型流感病毒感染。
实施方案38、根据实施方案37所述之用途的抗体、核酸、载体、细胞或药物组合物的，其中抗体、核酸、载体、细胞或药物组合物是预防性施用的。
实施方案39、根据实施方案37或38所述之用途的抗体、核酸、载体、细胞或药物组合物，其中抗体、核酸、载体、细胞或组合物是与抗病毒物质联合施用的。
实施方案40、根据实施方案39所述之用途的抗体、核酸、载体、细胞或药物组合物，其中抗病毒物质选自神经氨酸酶抑制剂和流感聚合酶抑制剂。
实施方案41、根据实施方案39或40所述之用途的抗体、核酸、载体、细胞或药物组合物的用途，其中所述抗病毒物质选自奥司他韦、扎那米韦和巴洛沙韦。
实施方案42、一种如下的组合，
(i)根据实施方案1至22中任一项所述的抗体，和
(ii)抗病毒剂。
实施方案43、根据实施方案42所述的组合，其中抗病毒剂选自神经氨酸酶抑制剂和流感聚合酶抑制剂。
实施方案44、根据实施方案42或43所述的组合，其中抗病毒物质选自奥司他韦、扎那米韦和巴洛沙韦。
实施方案45、根据实施方案42至44中任一项所述组合用于预防或治疗甲型流感病毒感染。
实施方案46、一种减少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染的风险的方法，其包括：向需要的对象施用治疗有效量的根据实施方案1至22中任一项所述的抗体。
实施方案47、根据实施方案46所述的方法，其中抗体是预防性施用的。
实施方案48、根据实施方案46或47中任一项所述的方法，其中所述对象具有甲型流感感染的直接风险。
实施方案49、根据实施方案46至48中任一项所述的方法，其中抗体是与抗病毒物质联合施用的。
实施方案50、一种治疗或预防对象中甲型流感感染的方法，所述方法包括向对象施用单剂量的药物组合物，其包含根据实施方案1至22中任一项所述的抗体，其中任选地，所述抗体包含根据SEQ ID NO：10的轻链氨基酸序列和根据SEQ ID NO：9的重链氨基酸序列。
实施方案51、根据实施方案50所述的方法，其中药物组合物包含抗体的浓度为100mg/mL至200mg/mL，例如100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL，优选150mg/mL。
实施方案52、根据实施方案50或51所述的方法，其中所述单剂量包含每kg对象体重3mg、4mg、5mg、6mg或7mg的抗体，优选5mg的抗体。
实施方案53、根据实施方案50至52中任一项所述的方法，其中单剂量包含高达60mg、高达300mg、高达1200mg、高达1800mg或高达3000mg的抗体。
实施方案54、根据实施方案50至53中任一项所述的方法，其中抗体是以60mg、300mg、1200mg或1800mg的剂量施用的。
实施方案55、根据实施方案50至54中任一项所述的方法，其中抗体是以300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1100mg或1200mg的剂量施用的。
实施方案56、根据实施方案50至55中任一项所述的方法，其中对象是人。
实施方案57、根据实施方案50至56中任一项所述的方法，其中方法包括肌肉(IM)注射。
实施方案58、根据实施方案50至57中任一项所述的方法，其中药物组合物还包含水(例如USP注射用水或US无菌注射用水)。
实施方案59、根据实施方案50至58中任一项所述的方法，其中药物组合物还在组合物中包含组氨酸，任选地浓度为10mM至40mM，优选20mM。
实施方案60、根据实施方案50至59中任一项所述的方法，其中药物组合物还包含任选地3.0％(重量/体积)至9.0％(重量/体积)，优选3.6％(重量/体积)至8.6％(重量/体积)，更优选4％(重量/体积)至6％(重量/体积)的糖，例如二糖如蔗糖。
实施方案61、根据实施方案50至60中任一项所述的方法，其中药物组合物还包含表面活性剂或三嵌段共聚物、任选地聚山梨醇酯或泊咯沙姆188，优选聚山梨醇酯80(PS80)，任选地为0.01％(重量/体积)至0.05％(重量/体积)，优选0.02％(重量/体积)。
实施方案62、根据实施方案50至61中任一项所述的方法，其中药物组合物的pH为5.8至6.2、5.9至6.1，或5.8、5.9、6.0、6.1或6.2。
实施方案63、根据实施方案50至62中任一项所述的方法，其中单剂量包含或组成为每次注射0.8mL至4mL的药物组合物。
实施方案64、根据实施方案63所述的方法，其中单剂量包含或组成为每次注射0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL、1.4mL、1.5mL、1.6mL、1.7mL、1.8mL、1.9mL、2.0mL、2.1mL、2.2mL、2.3mL、2.4mL、2.5mL、2.6mL、2.7mL、2.8mL、2.9mL、3.0mL、3.1mL、3.2mL、3.3mL、3.4mL、3.5mL、3.6mL、3.7mL、3.8mL、3.9mL或4.0mL的药物组合物。
实施方案65、根据实施方案50至64中任一项所述的方法，其中在向对象施用药物组合物之后约4周、约12周和/或约20周，与在相同时间段内接受安慰剂或未接受甲型流感的治疗或疫苗的参照对象(例如性别、年龄、体重和/或健康状况相同的对象)相比，对象：(i)呼吸道症状的数量和/或严重性减少，所述呼吸道症状选自：咳嗽、咽喉痛、鼻漏、充血；或其任意组合，和/或(ii)全身症状的数量和/或严重性减少，所述全身症状选自：发烧[口腔温度＞38℃(100.4°F)]、寒颤、肌痛、头痛、乏力、疲劳；或其任意组合。
实施方案66、根据实施方案50至67中任一项所述的方法，其中对象的年龄为18岁至65岁和/或身体质量指数为18kg/m2至32kg/m2或为18kg/m2至35kg/m2。
实施方案67、根据实施方案50至66中任一项所述的方法，其中：(i)单剂量包含300mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量通过包含2mL药物组合物的单次注射来施用；(ii)单剂量包含1200mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量通过每次包含4mL组合物的两次注射来施用；(iii)单剂量包含1800mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量通过每次包含4mL药物组合物的三次注射来施用；或(iv)单剂量包含60mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量通过包含0.4mL药物组合物的一次注射来施用。
实施方案68、根据实施方案50至67中任一项所述的方法，其包括在六个月期间向对象施用一次药物组合物。
实施方案69、根据实施方案50至68中任一项所述的方法，其包括在十二个月期间向对象施用一次包含药物组合物的单剂量。
实施方案70、根据实施方案50至68中任一项所述的方法，其包括在六个月期间，例如每三个月一次，向对象施用两次药物组合物。
实施方案71、根据实施方案50至70中任一项所述的方法，其包括在流感季节开始之前(例如，在美国，流感季节可以在十月、十一月或十二月开始)1个月至2个月内，或在流感季节的前1至2个月内施用药物组合物。
实施方案72、根据实施方案50至71中任一项所述的方法，其中抗体或包含抗体的药物组合物的体外流感感染抑制IC90为约2.17μg/mL。
实施方案73、根据实施方案50至72中任一项所述的方法，其包括向对象施用单剂量的药物组合物，其中组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量通过包含2ml药物组合物的单次注射来施用，并且其中：(i)施用的药物组合物包含约60mg抗体，并且抗体在施用后以约1μg/mL至约7μg/mL的浓度在来自对象的血清中存在最多120天；(ii)施用的药物组合物包含约300mg抗体，并且抗体在施用后以约8μg/mL至约20μg/mL的浓度在来自对象的血清中存在最多120天；(iii)施用的药物组合物包含约1200mg抗体，并且抗体在施用后以约50μg/mL至约100μg/mL的浓度在来自对象的血清中存在最多120天；(iv)施用的药物组合物包含约1800mg抗体，并且抗体在施用后以约70μg/mL至约110μg/mL的浓度在来自对象的血清中存在最多120天；和/或(v)抗体在对象中的体内t1/2为49天至68天。
实施方案74、根据实施方案50至73中任一项所述的方法，其中药物组合物的抗体在人类对象中的体内t1/2为49天至68天，例如49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天或68天。
实施方案75、根据实施方案50至74中任一项所述的方法，其中根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，在施用单剂量的药物组合物后任选地最多140天，对象不会经历不良事件(AE)。
实施方案76、根据实施方案50至75中任一项所述的方法，其中根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，在施用单剂量的药物组合物后任选地最多140天，对象不会经历轻度不良事件(AE)。
实施方案77、根据实施方案50至76中任一项所述的方法，其中根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，在施用单剂量的药物组合物后任选地最多140天，对象不会经历重度不良事件(AE)。
实施方案78、根据实施方案50至77中任一项所述的方法，其中：(i)单剂量包含300mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且单剂量包括包含2mL药物组合物的单次注射；(ii)单剂量包含1200mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且单剂量包括每次包含4mL组合物的两次注射；(iii)单剂量包含1800mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且单剂量包括每次包含4mL药物组合物的三次注射；或(iv)单剂量包含60mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且单剂量包含0.4mL组合物。
实施方案79、一种包含抗体的药物组合物，所述抗体包含根据SEQ ID NO：10的轻链氨基酸序列和根据SEQ ID NO：9的重链氨基酸序列，其中抗体以100mg/mL至200mg/mL，例如100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL、或200mg/mL，优选150mg/mL的浓度存在于药物组合物中。
实施方案80、根据实施方案79所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含水(例如USP注射用水或US无菌注射用水)。
实施方案81、根据实施方案79或80所述的药物组合物，在药物组合物中还包含组氨酸，任选地浓度为10mM至40mM，优选20mM。
实施方案82、根据实施方案79至81中任一项所述的药物组合物，其还包含3.0％(重量/体积)至9.0％(重量/体积)，优选3.6％(重量/体积)至8.6％(重量/体积)，更优选4％(重量/体积)至6％(重量/体积)的糖，例如二糖，例如蔗糖。
实施方案83、根据实施方案79至82中任一项所述的药物组合物，其还包含表面活性剂或三嵌段共聚物、任选地聚山梨醇酯或泊咯沙姆188，优选聚山梨醇酯80(PS80)，任选地为0.01％(重量/体积)至0.05％(重量/体积)，优选0.02％(重量/体积)。
实施方案84、根据实施方案79至83中任一项所述的药物组合物，其中组合物的pH为5.5至6.5、或5.8至6.2，或pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，优选6.0。
实施方案85、一种瓶，其包含根据实施方案79至84中任一项所述的药物组合物，所述瓶优选玻璃瓶。
实施方案86、一种(例如，预填充的)注射器，其包含根据实施方案79至84中任一项所述的药物组合物。
附图的简要说明
在下文中，将给出附图的简要描述。这些附图旨在更详细地说明本公开。然而，它们无意以任意方式限制本公开的主题。
图1显示了实施例2的通过ELISA评估直到第56天猕猴血浆样品中人类抗体FluAB_MLNS(空心方块)和FluAB_wt(对比抗体；实心圆)的血浆浓度。
图2A至图2B显示了实施例3的FluAB_MLNS(动物C90142(2A)，C90190(2B))的血浆浓度，其使用抗CH2抗体ELISA以定量总人mAb或HA抗原结合ELISA以测定mAb的功能性来测量。图显示了在选定的时间点(第1天、21天、56天、86天和113天)总的人mAb定量和个体动物的HA结合之间的线性回归。
图3A至图3B显示了实施例4(3A)的使用ELISA测量的鼻拭子中人抗体FluAB_MLNS和FluAB_wt的浓度，并将其归一化为尿素含量；和(3B)人抗体FluAB_MLNS和FluAB_wt的生物分布，表示为％鼻拭子中尿素标准化浓度比血浆浓度。个体动物ID和接种的人抗体变体(FluAB_MLNS或FluAB_wt)如下所示。
图4A至图4E显示了实施例5的用1mg/kg(4B，4C，灰色符号)和0.3mg/kg(4D，4E，浅灰色符号)的FluAB_wt(4B，4D，圆)、FluAB_MLNS(4C，4E，方块)处理的Tg32小鼠或未处理的(4A，三角形)Tg32小鼠的累积体重随时间的变化；所有小鼠鼻内感染PR8病毒。显示了个体动物；粗黑线代表BW±SD的平均趋势。显示了每组的个体数。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001相对于单独对照组(A)，°p＜0.05，°°p＜0.01，所有相对于MEDI8852的相对时间点，具有Bonferroni多重测试校正的双向ANOVA。
图5A和图5B显示了实施例5的在未用任何药物(5B)、用FluAB_wt或FluAB_MLNS治疗的感染的Tg32雄性小鼠中，1mg/kg剂量(5A)和0.3mg/kg剂量(右图)之间的存活％比较。**p＜0.01相对于未处理的小鼠(对照)和FluAB_MLNS 0.3mg/kg；°°°p＜0.001相对于FluAB_wt，对数秩检验，Mantel-Cox方法。
图6显示了实施例5的注射抗体的循环水平。显示了感染前(第0天)和感染后6天在小鼠血清中测量的循环FluAB_wt(圆)和FluAB_MLNS(方块)的个体水平(μg/ml)。棒表示平均值±SD。
图7显示了实施例6的体外中和试验中使用的平板方案。
图8A至图8D显示了实施例6的单独的FluAB_MLNS和单独的奥司他韦对H1N1(8A，8C)和H3N2(8B，8D)病毒感染的中和活性。
图9A至图9B显示了实施例6的FluAB_MLNS和奥司他韦对H1(9A)和H3(9B)病毒感染的联合中和活性。数据显示单独的FluAB_MLNS和与异摩尔浓度的奥司他韦组合对MDCK细胞的H1N1(9A)和H3N2(9B)病毒感染的抑制分数。数据表示为三个重复值的平均值±SD，每个重复值在三个独立的培养平板中获得。
图10A至图10B显示了实施例6的组合的FluAB_MLNS与奥司他韦的中值效应图。将这两种化合物以指定的恒定比连续稀释，并加入到感染H1(10A)和H3(10B)病毒株的MDCK细胞中。还显示了从非恒定比(NCR)的选定组合中获得的值。
图11A至图11F显示了实施例6的FluAB_MLNS和奥司他韦对于H1N1病毒感染的合用指数。点代表在指定的恒定比下的实际实验点，其中累积的药物-药物浓度表示在一旁。虚线曲线显示了整个效应范围内的预测合用指数。
图12A至图12E显示了实施例6的FluAB_MLNS和奥司他韦对于H3N2病毒感染的合用指数。点代表在指定的恒定比下的实际实验点，其中累积的药物-药物浓度表示在一旁。虚线曲线显示了整个效应范围内的预测合用指数。
图13A至图13C显示了实施例6的FluAB_MLNS-奥司他韦组合对于H1N1病毒感染的等效应图。点显示了不同恒定比的FluAB_MLNS-奥司他韦组合的IC50、IC75和IC90值。显示了每个实验点的累积浓度。
图14A至图14C显示了实施例6的FluAB_MLNS-奥司他韦组合对于H3N2病毒感染的等效应图。点显示了不同恒定比的FluAB_MLNS-奥司他韦组合的IC50、IC75和IC90值。显示了每个实验点的累积浓度。
图15A至图15D显示了实施例6的单独的FluAB_MLNS和单独的扎那米韦对H1N1(15A，15C)和H3N2(15B，15D)病毒感染的中和活性。
图16A至图16B显示了实施例6的FluAB_MLNS和扎那米韦对H1(A)和H3(B)病毒感染的联合中和活性。数据显示了单独的FluAB_MLNS和与异摩尔浓度的扎那米韦组合对MDCK细胞的H1N1(A)和H3N2(B)病毒感染的抑制分数。数据表示为三个重复值的平均值±SD，每个重复值在三个独立的培养平板中获得。
图17A至图17B显示了实施例6的组合的FluAB_MLNS与扎那米韦的中值效应图。将这两种化合物以指定的恒定比连续稀释，并加入到感染H1(17A)和H3(17B)病毒株的MDCK细胞中。还显示了从非恒定比(NCR)的选定组合中获得的值。
图18A至图18D显示了实施例6的FluAB_MLNS和扎那米韦对于H1N1病毒感染的合用指数。点代表在指定的恒定比下的实际实验点，其中累积的药物-药物浓度表示在一旁。虚线曲线显示了整个效应范围内的预测合用指数。
图19A至图19D显示了实施例6的FluAB_MLNS和扎那米韦对于H3N2病毒感染的合用指数。点代表在指定的恒定比下的实际实验点，其中累积的药物-药物浓度表示在一旁。虚线曲线显示了整个效应范围内的预测合用指数。
图20A至图20C显示了实施例6的FluAB_MLNS-扎那米韦组合对于H1N1病毒感染的等效应图。点显示了不同恒定比的FluAB_MLNS-扎那米韦组合的IC50、IC75和IC90值。显示了每个实验点的累积浓度。
图21A至图21C显示了实施例6的FluAB_MLNS-扎那米韦组合对于H3N2病毒感染的等效应图。点显示了不同恒定比的FluAB_MLNS-扎那米韦组合的IC50、IC75和IC90值。显示了每个实验点的累积浓度。
图22A至图22D显示了实施例6的单独的FluAB_MLNS和巴洛沙韦对H1N1(22A，22C)和H3N2(22B，22D)病毒感染的中和活性。
图23A至图23B显示了实施例6的FluAB_MLNS和巴洛沙韦对H1(23A)和H3(23B)病毒感染的联合中和活性。数据显示单独的FluAB_MLNS和与异摩尔浓度的巴洛沙韦组合对MDCK细胞的H1N1(23A)和H3N2(23B)病毒感染的抑制分数。数据表示为三个重复值的平均值±SD，每个重复值在三个独立的培养平板中获得。
图24A至图24B显示了实施例6的组合的FluAB_MLNS与巴洛沙韦的中值效应图。将这两种化合物以指定的恒定比连续稀释，并加入到感染H1(24A)和H3(24B)病毒株的MDCK细胞中。还绘制了从非恒定比(NCR)的选定组合中获得的值。
图25A至图25F显示了实施例6的FluAB_MLNS与巴洛沙韦的合用指数。点代表在指定的恒定比下的实际实验点，其中累积的药物-药物浓度表示在一旁。虚线曲线显示了整个效应范围内的预测合用指数。
图26A至图26F显示了实施例6的FluAB_MLNS-巴洛沙韦组合的等效应图。点显示了不同恒定比的FluAB_MLNS-巴洛沙韦组合的IC50、IC75和IC90值。显示了每个实验点的累积浓度。
图27A和图27B显示了实施例7的FluAB_MLNS的临床研究中的患者评估时间表(实施例7中的“A部分”患者)。
图28A至图28B显示了实施例7的FluAB_MLNS的临床研究中的患者评估时间表(实施例7中的“B部分”患者)。
图29A至图29B显示了实施例7的FluAB_MLNS的临床研究中的患者评估时间表(实施例7中的“C部分”患者)。
图30显示了实施例7的用于FluAB_MLNS的临床研究中的流感样监测时间表。
图31显示了实施例7的用于FluAB_MLNS的临床研究中的药代动力学评估时间点。
图32显示了实施例7的用于FluAB_MLNS的临床研究中的实验室评估列表。
图33显示了具有发生流感相关并发症的高风险的人群。
图34和图35显示了根据实施例7中所述的临床试验施用了FluAB_MLNS的人类对象中FluAB_MLNS的血浆浓度。图34显示了分别接受的300mg和1200mg初始剂量的FluAB_MLNS达20周和12周的患者中的抗体血浆浓度。图35显示了在向对象施用300mg和1200mg剂量后最多6个月的FluAB_MLNS的预计抗体血清浓度。
图36显示了根据实施例7中所述的临床试验接受了FluAB_MLNS的人类对象中FluAB_MLNS的抗体血浆浓度。提供了接受60mg、300mg、1200mg和1800mg初始剂量的FluAB_MLNS的对象在施用后20周的抗体血清浓度。
图37提供了显示在实施例7中详述的临床研究中观察到的各种FluAB_MLNS PK参数的表。
图38A和图38B显示了在pH＝6.0(A)或pH＝7.4(B)下通过Octet测量的溶液中的人FcRn与固定化FluAB_MLNS或FluAB_wt的结合。时间点0秒表示从基线缓冲液切换到包含人FcRn的缓冲液。时间点420秒(垂直虚线)表示切换到相应pH的空白缓冲液。使用OctetRED96(ForteBio)实时测量缔合和解离曲线。
图39A和图39B显示了通过ELISA检测小鼠抗药IgG测得的ADA反应水平(A；棒代表处理组的平均值±SD)；以及静脉注射后14天测量的循环人IgG水平(X轴)和在相同时间点存在的ADA信号(Y轴)之间的相关分析(B)。显示了有效值的非参数斯皮尔曼相关系数。
图40显示了皮下(s.c.)注射FluAB_MLNS或FluAB_wt后ADA反应水平。数据表示为在皮下注射(n＝5/组)后三周获得的每个个体血清中检测到的ADA信号(OD 450nm)的值，所述血清在PBS中以1∶25预稀释，然后进一步连续稀释5倍。
实施例
在下文中，呈现了示出本公开的实施方案和方面的特定实施例。然而，本公开的范围不应受到本文所述的具体实施方案的限制。给出以下制备和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本公开。然而，本公开的范围不受示例性实施方案所限制。实际上，根据前述描述、附图和以下实施例，除本文所述的内容外，本公开的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。所有这些修改都落入所附权利要求内。
实施例1：根据本公开的抗体在食蟹猴中的安全性和耐受性
设计并制备了根据本公开的抗体，其包含(i)如SEQ ID NO 1-6中所述的CDR序列和(ii)重链恒定区中的两个突变M428L和N434S。更具体地，该抗体包含(i)如SEQ ID NO：7中所述的重链可变区(VH)序列和如SEQ ID NO：8中所述的轻链可变区(VL)序列，和(ii)重链恒定区中的两个突变M428L和N434S。甚至更具体地，该抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO：9中所述的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO：10中所述的氨基酸序列。该抗体在本文中称为“FluAB_MLNS”。
为了进行比较，使用了抗体“FluAB_wt”，其与抗体“FluAB_MLNS”的不同之处仅在于其在重链恒定区不包含突变M428L和N434S。因此，对比抗体“FluAB_wt”包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO：11中所述的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO：10中所述的氨基酸序列。
在60分钟的静脉输注中，向每个试验组的三只雌性食蟹猴(食蟹猕猴)单次静脉输注5mg/kg的体积为2.5ml/kg的FluAB_MLNS或FluAB_wt。在施用前和施用后的第7天和第21天收集用于临床化学和血液分析的血液或尿液。
FluAB_MLNS或FluAB_wt以5mg/kg的剂量静脉输注60分钟后，密切监测雌性食蟹猴的健康和体重，并定期采集血液和尿液。在静脉注射抗体后，除了一些动物在接种部位施用后24h出现挫伤和3天出现红皮病外，没有观察到不良事件。在整个研究中，所有动物一般都是健康的，表现出正常的摄食量，并且总体上体重正增长。与施用前的样品相比，施用后7天或21天的临床化学、血液学和尿分析参数正常。
总之，向食蟹猴单次静脉输注FluAB_MLNS或FluAB_wt不会诱导不良事件，并且通常耐受良好。
实施例2：血浆浓度和药代动力学的测定
这些实验旨在测定单次静脉注射后，与对比抗体FluAB_wt相比，测定血浆中根据本公开的抗体FluAB_MLNS的浓度、确定半衰期并比较其药代动力学。
施用前，使用免疫斑点试验测试动物对流感特异性抗体呈阴性。将血清反应阳性的动物排除在研究之外，因为预先存在的免疫可能会干扰该试验。此外，排除了产生抗药抗体(ADA)反应的动物。
在60分钟的静脉输注中，向每个试验组的三只雌性猕猴单次静脉输注5mg/kg的体积为2.5ml/kg的FluAB_MLNS或FluAB_wt。在施用前将血液收集在含有K2EDTA的试管中，并在施用后约1小时、6小时、24小时、96小时、168小时、504小时、840小时和1344小时(h)后加工成血浆用于药代动力学试验。
使用ELISA检测在体外测定抗体的血浆浓度。简而言之，将IAV-HA抗原(甲型流感病毒H1N1 A/California/07/2009血凝素蛋白抗原(带有His标签)；Sino Biologicals)在PBS中稀释至2μg/ml，并添加25μl至96孔平底1/2-面积ELISA板的孔中在4℃下包被过夜。包被后，使用自动化ELISA清洗机用添有0.05％吐温20(清洗溶液)的0.5x PBS将该平板洗涤两次。然后，在室温(RT)下用添有1％BSA(封闭溶液)的100μl/孔的PBS将平板封闭1h，然后洗涤两次。在4℃下将血浆样品以10000g离心10分钟，然后在96孔细胞培养板中的封闭溶液中稀释(1∶10，然后1∶30)至最终的1∶300稀释度。对用于定量的猕猴血浆的最小稀释度(1∶300)进行了测试和设置，以确保基质效应可以忽略不计。然后将样品以1∶2逐步稀释，重复三次，总共稀释12次。通过在来自所有试验动物的接种前血浆池中以1∶300稀释抗体至1μg/ml，类似地制备每种待测抗体的标准品，以模拟试验样品的基质。然后在封闭溶液中将标准品以1∶3逐步稀释，重复三次，总共稀释12次。将二十五μl制备好的样品或标准品加入到血凝素(HA)包被的孔中，并室温下孵育1h。洗涤四次后，将在封闭溶液中以1∶5000(终浓度0.16μg/ml)稀释的25μl山羊抗人-IgG HRP缀合物(AffiniPure F(ab′)2片段，Fcγ片段-特异的；Jackson ImmunoResearch)添加至每个孔用于检测，并在室温下孵育1h。洗涤四次后，通过向每个孔中加入40μl SureBlue TMB基质(Bioconcept)来使平板中的物质反应。在室温下孵育约7分钟至20分钟后，当显色反应达到稳定(最大OD约3.8)时，向每个孔中添加40μl的1％HCl以终止反应，并使用分光光度计在450nm处测量吸光度。
为了测定猕猴血浆中抗体的浓度，在Gen5软件(BioTek)中绘制来自ELISA数据的OD值相对于浓度的图。使用可变斜率模型、四个参数和以下方程进行非线性曲线拟合：Y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D)。对落在——由质量控制样品在标准曲线的上部、中部或下部范围内确定的——标准曲线的可预测分析范围内的样品稀释度的OD值进行内插法以定量样品。然后考虑样品的最终稀释度来确定抗体的血浆浓度。如果标准曲线的线性范围内有多于一个样品稀释度值，则使用这些值的平均值。使用WINNONLIN NONCOMPARTMENTAL ANALYSISPROGRAM(8.1.0.3530核心版本，Phoenix software，Certara)分析药代动力学(PK)数据，设置如下：模型：血浆数据，持续输注施用；非遗漏观测值的数量：8；稳态间隔Tau：1.00；施用时间：0.00；施用量：5.00mg/kg；输注时长：0.04天；计算方法：线性内插法的线性梯形法则：λ_z计算的权重：均匀加权；λ_z方法：寻找λ_z、对数回归的最佳拟合。使用Prism 7.0软件(GraphPad，La Jolla，CA，USA)进行绘图和统计分析(线性回归或离群值分析)。使用ROUT方法(Q＝1％)进行孤立点分析，有可能在任一方向上发现任意数量的离群值。
结果示于图1。对接种后56天取样的猕猴血浆样品的分析表明，与对比抗体FluAB_wt相比，根据本公开的抗体FluAB_MLNS具有延长的体内半衰期(图1)。使用WinNonLin的非房室分析，FluAB_MLNS的T1/2估计为19.5天，而对比抗体FluAB_wt的T1/2估计为11.6天。定量的下限为300ng/ml。
总之，与对比抗体FluAB_wt相比，FluAB_MLNS具有至少直到接种后56天内的延长的体内半衰期。
实施例3：体内长期稳定性
为了测试FluAB_MLNS随时间的体内稳定性和抗原结合能力，接种FluAB_MLNS组的药代动力学测量(如实施例2中所述)延长至接种后第86天和第113天。在接种后第1天、21天、56天、86天、113天，使用如实施例2中所述的血凝素(HA)ELISA结合定量功能性FluAB_MLNS。
而且，使用特异性抗CH2 ELISA对猕猴血浆中的总人抗体进行了定量，使用特异性结合人抗体CH2区的但不结合猴的抗体CH2区的捕获mAb，来定量猕猴血浆中的总人抗体。为了测量总的人IgG，从而定量猕猴血浆中总的接种的人抗体，使用了用对人IgG特异的小鼠抗CH2结构域(克隆R10Z8E9；Thermo Scientific)捕获的ELISA。经证实，该mAb不与猴IgG发生交叉反应。为了包被96孔平底1/2-面积ELISA板，将小鼠抗人IgG CH2以0.5μg/ml添加到PBS中，并在4℃下孵育过夜。然后，洗涤板，并在室温下加入100μl/孔的具有5％BSA的封闭溶液1h。通过将FluAB_MLNS在封闭溶液中稀释至1ng/ml来制备FluAB_MLNS标准品。然后将标准品在封闭溶液中以1∶1.5逐步稀释，一式两份，共稀释12步。在4℃下将猕猴血浆样品以10000g离心10分钟，并在封闭溶液中逐步稀释至最终的1∶1000、1∶5000或1∶15000。洗涤平板后，将25μl样品或标准品加入ELISA板中，并在室温下孵育1h。洗涤三次后，将25μl山羊抗人-IgG HRP(AffiniPure F(ab′)2片段，Fcγ片段-特异的；Jackson ImmunoResearch)以0.04μg/ml添加至具有1％BSA的封闭溶液中用于检测，并在室温下孵育45分钟。洗涤三次后，通过向每个孔中加入40μl SureBlue TMB基质(Bioconcept)使平板显色。在室温下孵育20分钟后，添加40μl的1％HCl以终止反应，在450nm处测量吸光度。
结果显示在图2A至图2B中。两种定量都在猕猴血浆中产生了相似的人抗体浓度(图2A至图2B)。通过额外的线性回归分析表明，对于选择的所有时间点，通过HA结合的定量和总抗CH2定量之间的关系遵循线性模式。因此，在体内86天和113天后，血浆中存在的FluAB_MLNS总量仍能与甲型流感病毒(IAV)的血凝素(HA)茎区结合。
总之，在研究扩展期间，FluAB_MLNS证明了功能性抗原结合，因此在直至接种后113天在体内具有良好的长期稳定性。
实施例4：鼻拭子中的抗体浓度和生物分布
为了测定FluAB_MLNS和对比抗体FluAB_wt在鼻黏液和血浆之间的生物分布，测定了鼻拭子中该抗体的浓度。为此，在施用FluAB_MLNS或对比抗体FluAB_wt后24小时、504小时和1344小时后，收集实施例2中所述的猕猴的鼻拭子。鼻拭子中抗体FluAB_MLNS和FluAB_wt的浓度基本上如用于血浆中测定的实施例2中所述进行测定，其具有以下小的改动：(A)ELISA板在室温下封闭2h；(b)用含有1％BSA的PBS以1∶2开始稀释鼻拭子样品，然后以1∶2逐步连续稀释，总共8个稀释点；(c)将鼻拭子培养基(RT MINI病毒运送培养基；Copan)用作分析基质对照。
为了消除抽汲过程中的差异或存在于每只动物中和在不同时间点(第1天、21天和56天)的鼻分泌物量的差异，将鼻拭子的结果归一化为尿素含量。尿素在血液之间自由扩散，在这些血浆或拭子样品中以相似的量存在(Lim et al.，2017，Antimicrob AgentsChemother 61(8)：e00279-17)。为此，按照制造商的程序，使用“尿素氮(BUN)比色检测试剂盒”(Invitrogen)定量测量尿素氮(BUN)。简而言之，样品在PBS中以1∶3稀释，并与试剂盒试剂A和B混合，并在室温下孵育30分钟。使用96孔酶标仪在450nm处读取氧化还原反应的有色产物。通过比较样品与BUN标准品来进行定量，所述BUN标准品与试剂盒一起提供并同等处理。
结果显示在图3A至图3B中。鼻拭子中归一化抗体的量随时间减少(图3A)。通过比较鼻腔与血浆浓度来测定生物分布，揭示了FluAB_MLNS和对比抗体FluAB_wt之间没有差异(图3B)，表明MLNS-Fc突变虽然延长了FluAB_MLNS在血浆中的半衰期，但没有增强抗体在鼻黏液中的生物分布。
总之，鼻拭子样品没有显示出mAb变体的鼻黏液和血浆之间的生物分布有任意显著差异。
实施例5：抗体FIuAB_MLNS对PR8感染的Tg32小鼠的预防活性
接下来，在致死的甲型流感感染的H1N1小鼠模型中测定了与抗体FluAB_wt相比，FluAB_MLNS的预防活性。
为了评价预防效果，给9周龄至14周龄的FcRn-/-hFcRn系32Tg小鼠(C57B6背景)静脉(i.v.)-注射(通过尾静脉)5ml/kg的含有FluAB_MLNS或对比抗体FluAB_wt的溶液，注射剂量为0.3mg/kg至1mg/kg。静脉注射后二十四小时，从小鼠尾静脉取血，以确定感染前的血清抗体水平。在感染后(p.i.)的第6天和第13天也重复取血。注射抗体的小鼠和未处理的小鼠都进行麻醉(异氟烷，在O2中4％，0.3L/分钟)，并通过在两个鼻孔中缓慢滴注50μl(25μl/每个)PBS进行鼻内(i.n.)攻击，所述PBS含有5小鼠致死剂量的百分之五十(5 MLD50，相当于1200 TCID50/小鼠)的甲型流感病毒(H1N1，A/Puerto Rico/8/34，如Cottey，R.，Rowe，C.A和Bender，B.S.(2001)，Influenza virus，Curr Protoc Immunol Chapter 19，Unit19.11-19.11.32中所述)。每只小鼠保持直立，其头部稍微向后倾斜约1分钟，以减少接种物从鼻孔滴落的可能性。手术后，反射恢复正常后，将动物放回笼子。每天监测小鼠的体重减轻和疾病症状，直到感染后第14天，如果小鼠体重减轻超过其初始体重的20％(其中0％设定在感染当天)或发病率分数达到4，则将它安乐死。表1详细说明了应用的发病率分数：
表1-PR8感染的小鼠的发病率评分
发病率评分 临床症状
1 健康的
2 颈部始终有褶皱的皮毛
3 立毛，可能更深的呼吸，警惕性降低
4 呼吸困难、颤抖和昏睡
5 步态异常，灵活性降低，消瘦，尾耳发绀
6 死亡
最终处死所有的动物以收集血清和肺。
血清制备：
将大约0.05ml的血液收集到含凝胶的试管中，并在室温下放置30分钟。将试管以5500rpm(3200×g)旋转5分钟，将血清转移到新试管中，并在-20℃下储存直到使用。
根据以下设计，进行了两个独立的实验：
表2-研究设计实验1：
组 动物的数量 IV处理 mAb剂量
1 4 - -
2 8 FluAB_wt 1mg/kg
3 4 FluAB_wt 0.3mg/kg
4 8 FluAB_MLNS 1mg/kg
5 4 FluAB_MLNS 0.3mg/kg
表3-研究设计实验2：
组 动物的数量 IV处理 mAb剂量
1 9 - -
2 10 FluAB_wt 0.3mg/kg
3 6 FluAB_MLNS 0.3mg/kg
ELISA定量循环mAb：
在第0天和第6天评估血清的循环抗体水平。简而言之，在4℃下用来自H1N1株A/California/07/09的重组血凝素(HA)将一半面积的ELISA板包被过夜(2ug/ml，在PBS中，25ul/孔)。封闭(PBS/1％BSA，100μl/孔，1小时室温)和使用ELISA洗涤液(PBST)进行2次洗涤(220ul/孔)后，加入血清稀释液(1mg/kg 1∶150的初始稀释液，0.3mg/kg 1∶50的初始稀释液)和抗体标准品(FluAB_MLNS和FluAB_wt，0.1ug/ml)，一式两份，并连续稀释(血清稀释液1∶2的10个点，抗体标准品1∶3的8个点)。在室温下孵育1.5小时后，用PBST洗涤平板4次，并在室温下与HRP标记的抗人第二抗体(0.16ug/ml，25ul/孔)进一步孵育1.5小时。用PBST洗涤4次后，用底物溶液(25ul/孔)对平板进行分配，显色14分钟并用1％的HCl(体积/体积，25ul/孔)封闭。最后用分光光度计在450nm处读取平板的读数，以进行信号定量。通过使用对数(激动剂)与应答的非线性回归模型(可变斜率模型，四个参数，GraphPad Prism)计算浓度值。
数据分析：
使用GraphPad Prism软件8.0版本(Macintosh，GraphPad软件，La JollaCalifornia USA，www.graphpad.com)绘制和分析数据。通过使用Bonferroni多重比较检验校正的普通双向ANOVA，评估连续变量的统计显著性差异(p＜0.05，95％置信区间)。使用Mantel-Cox方法的对数秩分析来比较存活数据(p＜0.05被认为是统计上显著的)。将上述两个独立实验的数据汇总。
结果：
在鼻内感染H1N1 PR8病毒攻击的前一天，在Tg32小鼠中通过静脉内施用FluAB_MLNS和FluAB_MLNS(1mg/kg和0.3mg/kg)来测试预防活性。结果显示在图4A至图6中。
如图4A至图4E所示，与未处理(4A)和注射FluAB_wt的(4B和4C)小鼠相比，用1mg/kg(4D)或0.3mg/kg(4E)FluAB_MLNS治疗的小鼠显示出较低的体重减轻。
在图5A和图5B所示的存活分析中证实，与FluAB_wt相比，FluAB_MLNS具有更好的保护活性。
如静脉内施用抗体后1天和7天所测量的，FluAB_MLNS和FluAB_wt之间的疗效差异与血清中不同循环抗体水平无关(图6)。值得注意的是，注射后14天没有检测到循环抗体的可检测水平(未显示)。
总之，与对比抗体FluAB_wt相比，FluAB_MLNS在Tg32小鼠中表现出更好的抗H1N1PR8鼻内病毒攻击的保护能力。疗效与循环抗体水平无关。这些数据表明，由Tg32小鼠表达的FluAB_MLNS与hFcRn的增强的相互作用也介导了与延长的抗体半衰期无关的体内效果，例如关于保护活性的功效增加。
实施例6：抗体FluAB_MLNS与各种抗病毒物质的组合
药物组合提供了增强药效的明显可能，同时降低选择耐药性的可能性。此外，假定的附加或协同效应可能会导致剂量节约的方法。目前FDA批准的流感药物包括神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和扎那米韦，以及最近批准的巴洛沙韦马波西尔，其属于核酸内切酶抑制剂类。
为了评估FluAB_MLNS与抗病毒物质奥司他韦、扎那米韦或巴洛沙韦马波西尔对H1N1和H3N2代表性病毒株的联合活性，进行了体外中和以评估所产生的抑制效果。采用中值效应图和合用指数(CI)的计算进行联合效应分析。
简而言之，将MDCK(Madin-Darby犬肾)细胞以30000个细胞/孔接种到96孔板(平底，黑色)中。将细胞在37℃、5％的CO2下培养过夜。二十四小时后，根据图7所示的平板方案，使用FluAB_MLNS(从166.7nM终末开始，9个水平点)和不同抗病毒物质(奥司他韦、扎那米韦或巴洛沙韦马波西尔)的交叉1∶2系列稀释(从125(扎那米韦为250)nM开始，7个垂直点)，制备4x抗体和抗病毒剂(奥司他韦、扎那米韦或巴洛沙韦马波西尔)在60μl感染培养基(MEM(Sigma Aldrich，货号M0644)+Glutamax(Invitrogen，41090-028)+1ug/ml TPCK-处理的胰蛋白酶(Worthington Biochemical#LS003750)+10ug/ml卡那霉素)中的稀释液。
对于每种组合，制备三个独立的平板，以便每种药物-药物组合比例有三份。在每个平板中包括单一化合物滴定(即，FluAB_MLNS的9个点和每种抗病毒剂的8个点)。制备60μl的120x TCID50的浓度的病毒溶液，在MEM中以1∶1进一步稀释或与FluAB_MLNS稀释液以1∶1混合，并在33℃下孵育1h。使用不含补充物的200μl/孔的MEM洗涤细胞2次，然后加入100μl单独的病毒或100μl的FluAB_MLNS/病毒混合物(100x TCID50/孔)，并在33℃、5％的CO2下孵育4小时。在加入100μl/孔的感染培养基后，在33℃、5％的CO2下进一步孵育细胞72小时。在感染后第3天，制备20μM MuNANA(4-MuNANA(2_-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经氨酸钠盐水合物(Sigma-Aldrich)#69587)在MuNANA缓冲液(MES 32.5mM/CaCl2 4mM，pH 6.5)中的溶液，50μl/孔分配在黑色96孔板中。将五十μl中和或单独的病毒滴定上清液转移到平板上，并在37℃下孵育60分钟。然后用100μl/孔的0.2M甘氨酸/50％EtOH(pH 10.7)终止反应。用荧光计(Bio-Tek)在460nm下定量荧光。
根据下式计算病毒中和的比例：
Figure BPA0000320867220000551
其中fx＝样品荧光信号(细胞+病毒+FluAB_MLNS+抗病毒物质)；fmin＝最小荧光信号(单独的细胞，没有病毒)；fmax＝最大荧光信号(只有细胞+病毒)。
根据Chou和Talalay方法(Chou TC，Talalay P：Quantitative analysis ofdose-effect relationships：the combined effects of multiple drugs or enzymeinhibitors.Adv.Enzyme Regul.1984，22：27-55)，使用中和部分数据用计算机进行药物-药物组合的剂量-效应关系定量分析。通过使用CompuSyn软件(ComboSyn Inc.，Paramus，NJ，USA)(Chou T-C：Theoretical basis，experimental design，and computerizedsimulation of synergism and antagonism in drug combination studies，Pharmacological Reviews 2006，58：621-681)获得合用指数、受影响的部分(Fa)和等效应图。
结果如图8A至图26F所示并在下文描述。
FluAB_MLNS和奥司他韦的组合
在H3N2株和H1N1株的两种病毒血清型代表上，在体外对FluAB_MLNS和奥司他韦中和甲型流感病毒的相对疗效效进行了比较。如图8A至图8D所示，当两种化合物分别与H3N3和H1N1病毒一起暴露时，单独测试的两种化合物都能够剂量依赖性地完全抑制细胞感染(图8A、图8B)。对于FluAB_MLNS(H3和H1株分别为17.9nM和15.6nM)和奥司他韦(H3和H1株分别为7nM和9.1nM)，由数据对数线性化后的中值效应图(图8C、图8D)计算得出的IC50值(如Chou TC，Talalay P：Quantitative analysis of dose-effect relationships：thecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Adv.EnzymeRegul.1984，22：27-55中所述)，确实在纳摩尔范围内。总体而言，在H3和H1病毒感染之间通过FluAB_MLNS测得的抑制反应方面没有显著差异，而H1N1病毒导致对奥司他韦的抑制作用略微更敏感。
为了测试FluAB_MLNS和奥司他韦的组合在中和MDCK细胞感染H3和H1病毒中的作用，以上述不同比例连续稀释两种化合物，并评估在不同药物浓度的存在下神经氨酸酶的酶活性(NA；作为对培养物中病毒内容物的读取)并与单一药物效果比较。用FluAB_MLNS测量的中和效果由于异摩尔浓度的第二化合物的同时存在而大大增强，因此表明对H3和H1病毒感染具有协同效应，而不是相加效应(图9A至图9B)。检测到H1和H3病毒对奥司他韦的抑制作用的敏感性略有不同。
为了精确定量各种药物组合比例的推定协同效应，根据中值效应原理进一步转化中和数据，并用上述的CompuSyn软件进行分析。在中值效应图中绘制了几种不同的FluAB_MLNS-奥司他韦组合恒定比的效果，如图10A至图10B所示。
CompuSyn软件将中值效应方程的对数变换应用于实验数据，并计算各种药物组合的效力(IC50)和所谓的合用指数(CI)。CI是Chou-Talalay(中值效应)方程推导出的参数，其考虑了质量作用定律的物理化学性质，并且是由药物1与药物2组合以获得特定效果的剂量部分除以单独的药物1和药物2获得相同效果的剂量的两个比之和得出的。根据这种数学算法，CI＝1表示相加作用，CI＜1表示协同作用，CI＞1表示拮抗作用。
如图11A至图11F和12A至图12E所示，对于所有测试的组合比例以及H1病毒(图11A至图11F)和H3病毒(图12A至图12E)，对于所有药物组合比例，抑制分数范围内的预测CI值描绘了远低于1的曲线，并且几乎所有组合的不同组合浓度的实际实验点也在1以下。总之，数据表明当FluAB_MLNS和奥司他韦组合时，具有协同作用。
同样的数据可以用等效应图来代替性地描述，所述等效应图比较了单一药物和组合药物的等效浓度。如图13和图14所示，对于H1(图13A至图13C)和H3(图14A至图14C)两者，三种不同组合比例的IC50、IC75和IC90值的分布远低于连接单一测试药物的相应IC50、IC75和IC90的等效线，表明一致的协同作用(而相加和拮抗作用将分别产生位于单一药物等效线上或上方的等效点)。
FluAB_MLNS和扎那米韦的组合
在H3N2和H1N1株的两种病毒血清型代表上，在体外也对FluAB_MLNS和扎那米韦中和甲型流感病毒的相对疗效进行了比较。如图15A至图15D所示，当两种化合物分别与H3N3和H1N1病毒一起暴露时，单独测试的两种化合物都能够剂量依赖性地完全抑制细胞感染。FluAB_MLNS的相对计算IC50值为23.1nM至24.4nM，扎那米韦为10.7nM至13.7nM。
对于MLNS和扎那米韦的联合效应，图16A至图16B显示，与奥司他韦相似，扎那米韦大大增强了FluAB_MLNS对H1和H3病毒的抑制能力。
协同作用的定量类似地用如上所述的CompuSyn和中值效应原理计算。图17A至图17B显示了FluAB_MLNS和扎那米韦的联合效应的中位数效应图。图18A至图18D和19A至图19D显示了FluAB_MLNS和扎那米韦的计算CI，清楚地表明两种药物对H1病毒(图18A至图18D)和H3病毒(图19A至图19D)的协同作用，如所有实验测试点的小于1的值所示。一致地，对于两种病毒株，等效应图显示了IC50、IC75和IC90值方面的强协同效应(如图20A至图20C和21A至图21C所示)，这些值都显著低于单一药物的IC值。
FluAB_MLNS和巴洛沙韦马波西尔的组合
最近批准的核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦马波西尔最初在H1和H3株上与单独的FluAB_MLNS进行了比较，类似于上文对奥司他韦和扎那米韦的描述。结果显示在图22A至图22D中。FluAB_MLNS的相对计算IC50值为20.1nM至15.4nM，巴洛沙韦马波西尔为4.9nM至2.3nM。
尽管与NA抑制剂相比，巴洛沙韦在抑制病毒复制方面具有不同的作用机制，但该药物仍然能够显著增强FluAB_MLNS的抑制能力，清楚地表明了协同效应(图23A至图23B)。使用不同组合比例获得的抑制数据用于用CompuSyn软件来计算和绘制中位数效应图，并如上所述计算药物-药物相互作用的类型(图24A至图24B)。FluAB_MLNS和巴洛沙韦马波西尔的计算CI(图25A至图25F)，清楚地表明两种药物对H1和H3病毒的协同作用，如大多数实验测试点的小于1的值所示。等效应图表明了IC50、IC75和IC90值上可靠和完全的协同效应(图26A至图26F)。
总之，不同的抗病毒剂，即NA抑制剂奥司他韦和扎那米韦以及核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦马波西尔，协同增强FluAB_MLNS对H1和H3株的中和能力。
实施例7：FluAB_MLNS的临床研究
进行了1/2期、随机、安慰剂对照研究，以评估FluAB_MLNS用于治疗和预防甲型流感疾病的安全性、耐受性、药代动力学、免疫原性和功效。FluAB_MLNS包含根据SEQ ID NO：10的轻链氨基酸序列和根据SEQ ID NO：9的重链氨基酸序列。该研究由3个部分组成：
A部分：双盲研究，用于评估100名健康成年对象中单次递增剂量的FluAB_MLNS的安全性、耐受性、药代动力学和免疫原性。
B部分：开放性研究，用于评估A部分中约30名至80名对象在首次施用(即在A部分中)约1年后进行第二次施用后的FluAB_MLNS的安全性、药代动力学和免疫原性。
C部分：随机、双盲、安慰剂对照研究，用于评估与安慰剂相比，FluAB_MLNS在治疗和预防甲型流感疾病方面的安全性、耐受性、功效、药代动力学和免疫原性。对象的数量最多为2760。该研究评估了与安慰剂相比，FluAB_MLNS对确诊甲型流感疾病的患者的甲型流感相关参数的效果。这些参数包括疾病的严重性、疾病持续时间、患有甲型流感疾病时鼻咽分泌物中病毒载量的量。另外，该研究还提供了：
·评估FluAB_MLNS对甲型流感疾病后宿主反应的潜在生物标志物的影响；
·监测患有甲型流感疾病的对象中病毒对FluAB_MLNS的耐药性的出现；
·评估对象遗传多态性与FluAB_MLNS作用机制和/或药代动力学之间的潜在关系；
·测量因甲型流感疾病而就诊的发生率；
·测量FluAB_MLNS对甲型流感疾病导致的离开工作的时间和生产力的影响。
FluAB_MLNS被评估用于预防健康成人因甲型流感引起的疾病，所述健康成人发生严重流感相关并发症的风险较低。FluAB_MLNS对多种季节性和大流行的甲型流感病毒株具有很高效的体外效力，有效预防动物模型中致命的甲型流感感染。另外，由FluAB_MLNS识别的表位在甲型流感病毒中是高度保守的，并且对体外耐药性的发展具有很高的阻隔。
这项随机、安慰剂对照、首次在人体中进行的1/2期联合研究设计用于评估FluAB_MLNS在没有流感感染严重并发症风险因素的健康成人中预防甲型流感疾病的安全性、耐受性、药代动力学(PK)和功效。本研究的A部分和B部分设计用于收集FluAB_MLNS的安全性和耐受性的信息，以及PK特征和抗药抗体(ADA)的产生的相关数据。该研究的C部分设计用于评估FluAB_MLNS在预防甲型流感疾病方面的疗效，并收集另外的安全性、耐受性和PK数据。潜在风险基于用mAb观察到的常见安全风险：过敏反应和其他严重过敏反应、免疫复合物疾病和注射部位相关的反应。
在甲型流感感染的存在下，理论上存在抗体介导的疾病加重(ADE)的风险。对对象进行重要潜在风险监测，包括在存在甲型流感感染时的安全性评估，并进行常规药物警戒和风险最小化活动。
这项研究包括年龄为18岁至64岁、没有来自流感感染的严重并发症的风险因素，没有接受即将到来的季节性流感的疫苗接种的健康成年人。
安慰剂是这项研究的对照。
为了充分评估FluAB_MLNS预防甲型流感疾病的能力，在流感季节之前施用研究药物。在本上下文中，在研究的A部分收集的数据预期足够进行安全性和PK的观察，以扩展到更大的健康成人群体。
选择了60mg至1800mg(60mg、300mg、1200mg、1800mg)的单一固定剂量递增范围的FluAB_MLNS肌肉注射施用用于本研究。人体中推荐的最高起始剂量为约5mg/kg或300mg固定剂量。
研究设计
这是对年龄为18岁至64岁的健康成人志愿者进行肌肉注射(IM)施用FluAB_MLNS的随机、安慰剂对照、1/2期研究，所述志愿者还没有为即将到来的季节接受流感疫苗接种。该研究设计用于评估FluAB_MLNS预防甲型流感疾病的安全性、耐受性、PK、免疫原性和功效。
该研究分3个部分进行：
·A部分：1期、双盲、单次递增剂量的FluAB_MLNS；
·B部分：FluAB_MLNS第二次施用之后的1期、开放性、安全性和PK；
·C部分：2期、双盲研究，用于评估FluAB_MLNS在预防社区获得性甲型流感疾病中的功效。
在研究的A部分收集的数据提供了安全性和PK观察，以扩展到更大的健康成人群体中，从而建立概念验证。安全管理计划，包括A部分中的SRC监督和C部分中的独立DMC，设计用于确保安全性数据的全面评估和潜在安全信号的早期检测。
当第一流感季节大约一半的数据可用时，进行安全性、功效和无效的中期分析。
在对象经历严重的流感疾病的情况下，如果研究者认为合适，则提供抗病毒治疗。
研究参与的持续时间
A部分：估计每名对象的包括筛选和随访的研究总时间约为13个月。
B部分：对于B部分，估计每名对象的研究总时间为约6个月，包括A部分和B部分一起总共最多为19个月。
C部分：估计每名对象的包括筛选和随访的研究总时间约为8个月。
A部分
4个组的25名对象，每个都接受由一次(或多于一次)肌内注射组成的单剂量的FluAB_MLNS安慰剂，以评估与安慰剂相比FluAB_MLNS的安全性和耐受性。4个组的施用方案如表A所示。
表A：A部分组的总结
Figure BPA0000320867220000601
合格的对象以4∶1的比例随机分为3个连续组，接受FluAB_MLNS或安慰剂。每个组中的前两名对象以1∶1的比例随机接受FluAB_MLNS或安慰剂。在对看守对象进行24小时的观察后，每组中的所有剩余对象在同一天进行施用，并在施用后48小时内留在临床研究地点。
第3天未消退的局部耐受性症状将一直持续观察直到解决或第14天(以先发生者为准)。局部耐受性参数包括注射部位的疼痛/压痛、肿胀、发红、挫伤和瘙痒。
在整个研究中，积极监测对象的流感样疾病(ILI)。从第3天开始，对象每周两次在电子设备上完成ILI症状监测问题。对象在研究中保持约一年，以完成安全性、PK和ADA评估。
结果：
一百名(100)对象接受了单剂量的FluAB_MLNS(N＝80)或安慰剂(N＝20)。收集了所有组的初步盲法安全性数据以及300mg组和1200mg组的PK数据。
在52周的指定就诊时间采集血清PK样品。使用在Meso Scale Discovery(MSD)平台上验证的电化学发光法测定FluAB_MLNS血清浓度。使用
Figure BPA0000320867220000611
(Certara L.P.，Princeton，NJ)的标准非房室法估计PK参数。使用描述性统计总结FluAB_MLNS的PK参数。
在整个研究中进行不良事件检测、临床实验检查、体检和ECG评估。在施用后约30分钟、2小时、12小时、24小时、48小时和1周进行注射部位耐受性评估。
用药耐受良好；6％(6/100)的对象经历轻度注射部位反应，这一般在48小时内消退。在用药后12周，大多数(110/112124/126；98.24％)的不良事件(AE)性质为轻度至中度，未报告严重的AE，且没有对象因AE而停止使用。基于可用的数据，300mg和1200mg的FluAB_MLNS暴露(C最大和AUC)以剂量成比例的方式增加。FluAB_MLNS的PK特征如图34所示，并与半衰期延长的IgG一致。PK收集持续到用药后52周(例如，图35)。
向健康对象肌肉注射高达1800mg的单剂量后，FluAB_MLNS耐受良好。FluAB_MLNS的初步PK特征允许每季用药一次。
第20周所有用药组的PK数据如图36和图37所示。观察到C最大和AUCD0-140以近似剂量成比例增加，并且t1/2(初步)估计为58天。
B部分
完成A部分的对象在研究访视结束时被揭盲。接受FluAB_MLNS的对象有机会允许参加B部分。合格的对象(≥30)在初始用药后12个月接受FluAB_MLNS的第二次用药(IM)，以在重复用药后评估FluAB_MLNS的免疫原性、安全性和PK。
对象在用药后在临床研究地点停留最少2小时，以评估FluAB_MLNS的安全性和局部耐受性，并在研究中保持24周，以完成安全性、PK和ADA的评估。
在B部分中，根据预定的停止规则决定暂停用药或停止个体对象服用研究药物。当满足停止规则时，暂停用药。继续在电子设备上完成对象的症状监测问题，一周两次，直到研究结束，以监测流感样疾病(ILI)。
C部分
C部分设计用于评估FluAB_MLNS在预防健康成人中的社区获得性甲型流感疾病方面的安全性和功效。在审查了从A部分收集的可用PK和安全性数据，包括组1最少45天和组2最少21天的可用安全性数据后，开始C部分的剂量选择和纳入。还审查了组3和组4中的可用安全性数据。
审查了来自A部分的PK数据，以确定C部分的剂量选择。在C部分中最多评估了两个剂量水平，以允许暴露-反应分析和用于进一步的3期研究的计量选择。选择用于C部分中评估的剂量考虑了来自A部分的可用的PK数据，以在用药后至少6个月维持8μg/mL的最小FluAB_MLNS血清浓度。随机选择最多1380名对象并招募，以接受FluAB_MLNS或安慰剂。
可以在C部分中评估一个或两个剂量水平。如果评估了两个剂量水平，则随机选择合格的对象在第1天以2(n＝460)∶2(n＝460)∶1(n＝230)∶1(n＝230)的比例接受FluAB_MLNS或安慰剂。如果评估了一个剂量水平，对象以1(n＝460)∶1(n＝460)的比例随机分配。每个剂量水平都有与注射次数和注射量匹配的安慰剂。对象在用药后在临床研究地点停留最少2小时，以评估FluAB_MLNS在注射部位的安全性和局部耐受性并完成评估。
在整个研究中，积极监测对象的ILI。对象每周在电子设备上完成两次ILI症状监测问题。经历ILI的对象完成临床评估、自我报告的流感症状严重性和WPAI问卷，并被随访。经历与ILI症状一致的对象，定义为：
·≥1呼吸道症状(咳嗽、咽喉痛、鼻漏、充血)
和
·≥1全身症状(发烧[口腔温度＞38℃(100.4°F)])、寒颤、肌痛、头痛、乏力、疲劳)
对于研究的所有部分，收集血样以确定抗药抗体(ADA)的存在/缺失和滴度。在合适时，样品还可以表征为对抗FluAB_MLNS抗体的中和潜力。
所有对象在接受研究药物后约4周和12周以及流感季节结束后约2周接受随访，以评估安全性、PK和ADA。如果剂量水平要求第二次注射FluAB_MLNS，则在第12周访视时进行第二次注射。对象在用药后在诊所停留最少2小时，以评估FluAB_MLNS在注射部位的安全性和局部耐受性。
当第一个流感季节约一半时间的数据可用于C部分并形成决定在季节结束时结束研究或在第二个流感季节继续招募的基础时，进行中期分析。
对于C部分，基于每个半球流感季节的大致结束时间来定义研究结束访视。对于南半球的参与国家，流感季节的结束定为九月30日，大约在十月中旬结束研究访视。对于北半球的参与国家，流感季节的结束定为四月30日，大约在五月中旬结束研究访视。
仅对于C部分，收集IgG的Fc受体(FcγR)和IgG1等位基因分型的Fc受体的血样，以评估与FluAB_MLNS作用机制或PK的潜在关系。向对象提供专门用于基因型评估的知情同意。
对象群体
在随机选择时对象年龄为18岁至64岁。对于A部分和B部分，对象为健康的男性和女性，无急性或慢性疾病。对于C部分，对象必须身体健康，由病史(例如，任意慢性疾病，如高血压、高脂血症、胃食管反流病、焦虑或抑郁症，必须服用稳定剂量的药物)，和体检、12导联ECG、生命体征和实验室值无具有临床意义的发现来确定。A部分和B部分的身体质量指数为18kg/m2至32kg/m2，C部分的身体质量指数为18kg/m2至35kg/m2。女性必须具有阴性妊娠试验或绝经后状态确认。女性伴侣有生育潜力的男性对象必须同意使用避孕，直到最后一次随访，或有无精子症证明的输精管结扎术。A部分和B部分的患者不吸烟。在施用研究药物之前，A部分的患者必须同意戒酒72小时并戒咖啡因24小时。B部分的患者在约12个月前接受FluAB_MLNS并完成A部分。
研究过程
A部分
筛选：
在第1天访视前不超过4周进行筛选，包括书面知情同意、资格确定、人口统计和病史的收集以及体检(包括生命体征)、实验室检测、12导联心电图(ECG)和A部分评估表中的其他评估(图27A至图27B)。
住院期间(第1天至第3天)：
所有对象在第1天进入临床研究地点，并在用药前至少禁闭12小时，在用药后48小时进行观察、实验室评估和PK采样。随机选择合格的对象以在第一天接受FluAB_MLNS或安慰剂。根据药代动力学时间点表采集血清和鼻咽PK样品(图31)。对象在第3天完成所有研究评估后出院。
随访期间：
对象返回临床研究地点，根据A部分评估时间表进行亲自评估(图27A至图27B)，包括但不限于体检(包括生命体征)、12导联ECG、实验室检测(包括安全性、PK和ADA)、审查AE和合并用药当合适时。根据药代动力学时间点表采集血清和鼻咽PK样品(图31)。对象在电子设备上完成ILI症状监测问题，每周两次，直到研究结束。如果对象经历ILI，则按照流感样疾病监测时间表，以与C部分相同的规定对其进行监测(图30)。
B部分
筛选：
所提供的研究的A部分和C部分的安全性、PK和功效的评估数据支持进一步的产品开发，接受FluAB_MLNS的对象可能能够进入B部分。对象随机分配在A部分研究结束访视时破盲，接受FluAB_MLNS的对象可能同意在初始用药后约12个月接受第二剂量的FluAB_MLNS的资格评估。根据B部分评估表(图28A至图28B)的筛选评估在第1天访视前不超过4周进行。
用药(第1天)：
合格的对象在第1天接受FluAB_MLNS用药。对象在用药后在诊所停留最少2小时，以评估FluAB_MLNS的安全性和局部耐受性，并按照B部分评估表完成评估(图28A至图28B)。
随访期间：
对象返回临床研究地点，根据B部分评估时间表进行在场评估(图28A至图28B)，包括但不限于体检(包括生命体征)、实验室检测(包括安全性、PK和ADA)、审查AE和合并用药当合适时。对象在电子设备上完成ILI症状监测问题，每周两次，直到研究结束。按照流感样疾病监测时间表，以与C部分相同的规定，对经历ILI的对象进行监测(图30)。
C部分
筛选：
在第1天访视前不超过4周进行筛选，包括书面知情同意、资格确定、人口统计和病史的收集以及体检(包括生命体征)、实验室检测、12导联心电图(ECG)和C部分评估表中的其他评估(图29A至图29B)。
用药(第1天)：
如果评估了两个剂量水平，则随机选择合格的对象在第1天以2(n＝460)∶2(n＝460)∶1(n＝230)∶1(n＝230)的比例接受FluAB_MLNS或安慰剂。如果评估了一个剂量水平，对象以1(n＝460)∶1(n＝460)的比例随机分配。如果所选剂量水平要求第二次注射FluAB_MLNS，则在第12周访视时进行第二次注射。每个剂量水平都将有与注射次数和注射体积匹配的安慰剂。对象在用药后在临床研究地点停留最少2小时，以评估注射部位的安全性和局部耐受性，并按照C部分评估表完成评估(图29A至图29B)。
随访期间：
对象返回临床研究地点，按照C部分评估表进行临床评估(附录4)。对象在电子设备上完成ILI症状监测问题，每周两次，直到研究结束。随访期间经历与ILI一致的症状(定义为≥1种呼吸道症状(咳嗽、咽喉痛、鼻漏、充血)和≥1种全身症状(发热、寒颤、肌痛、头痛、不适、疲劳)的对象应在发作当天报告症状，并按照流感样疾病监测表安排临床评估(图30)。
临床评估包括但不限于体检(包括生命体征)、实验室检测(包括安全性)、鼻咽拭子病毒学、血样PK和ADA，以及AE和合并用药审查当合适时。对象还自我报告流感症状严重性，并按照流感样疾病监测表完成WPAI调查问卷(图30)。WPAI是经过验证的、患者报告的、对缺勤(错过的工作时间)、出勤主义(工作效率降低)、工作效率损失和因特定健康问题导致的活动障碍的定量评估。患有ILI的对象完成关于ILI-D1和ILID8的6项WPAI问卷(参见图30)。
流感症状严重性问卷
对象对与流感相关的全身和呼吸道症状(即咳嗽、咽喉痛、头痛、鼻塞、发热或寒颤、肌肉或关节痛以及疲劳)进行自我评估。他们使用4分等级量表(0，无；1，轻度；2，中度；3，重度)对症状的严重性进行评分。在流感样疾病监测期间，从ILI-D1到ILI-D10(包括10天)每天两次在电子设备中捕获这些信息(图30)。
抗甲型流感抗体滴度
在研究的所有部分中，收集血样以根据A部分、B部分和C部分评估表(分别是图27A/27B、图28和图29)和图30中的流感样疾病监测表，用标准方法测定抗甲型流感抗体的滴度。实验室手册中提供了有关样品处理的详细信息。
耐药性监测
在研究的所有部分中，根据流感样疾病监测表(图30)，对接受研究药物并患有实验室确认的甲型流感病毒感染的所有对象进行了对可能出现的对FluAB_MLNS耐药的耐药性监测。对来自证实了甲型流感病毒感染的对象的鼻咽拭子样品进行HA基因的深度测序分析，以确定氨基酸变体。为了评估抗病毒物质耐药性的出现，尝试对实验室证实的甲型流感病毒感染对象进行病毒培养，并尝试对来自证实了IAV的对象培养的病毒进行FluAB_MLNS抗病毒活性的体外表型分析。对于不能培养IAV的对象，使用建立的反向遗传程序产生来自甲型流感病毒阳性对象的含有HA基因的重组病毒，并对重组病毒进行表型分析。
探索性生物标志物
对于C部分和ILI监测期间，将根据评估表(分别为图29A至图29B和图30)收集样品，以探索感染或宿主反应的潜在生物标志物。样品收集和处理的详细信息包含在实验室手册中。
基因分型
在进行任意样品收集之前，获得对象签名并注明日期的专门用于基因分型评估的知情同意。仅对于C部分，根据图29中的评估表收集IgG的Fc受体(FcγR)和IgG1等位基因分型的Fc受体的血样，以评估与FluAB_MLNS作用机制或PK的潜在关系。
产品
FluAB_MLNS以置于密封塞住的玻璃瓶中的300mg冻干固体提供。用USP注射用水重新配制至150mg/mL时，当施用时药物产品含有20mM组氨酸、5.3％蔗糖和0.02％PS80，pH为6。肌肉注射FluAB_MLNS。单位剂量基于体积(每次注射0.8mL至4mL)。不需要安全处理FluAB_MLNS的特殊程序。FluAB_MLNS储存在安全的温控环境中。
安慰剂是用于IM注射的无菌、不含防腐剂的0.9％生理盐水溶液。
统计方法
A部分和B部分
统计分析主要是描述性的。所有研究数据都显示在数据列表中。
当合适时，总结表将按组显示每个FluAB_MLNS剂量和安慰剂的结果。对于连续变量，呈现描述性统计数据，对于分类和有序变量，呈现频率和百分比。百分比基于用药组中无缺失值的数量。可以评估ADA对PK的影响以及与AE和SAE的关联。
C部分
功效分析的主要分析人群是全分析集(FAS)，包括所有接受任意量的研究药物的随机对象。主要功效终点是实验室证实的(通过RT-PCR)定义为≥1种呼吸道症状和≥1种全身症状的甲型流感疾病的对象比例。主要分析由基于方案定义的甲型流感疾病率降低的与安慰剂相比的FluAB_MLNS优效性检验组成。如果评估了两个剂量水平，则根据顺序检测原则在双侧0.05水平检验以下假设。如果无效假设未被驳回，则停止正式的顺序检测，并且只报告剩余假设的名义显著性：
1.基于方案定义的甲型流感疾病率，与安慰剂相比，FluAB_MLNS剂量水平2(高)的优越性
2.基于方案定义的甲型流感疾病率，与安慰剂相比，FluAB_MLNS剂量水平1(低)的优越性
如果在C部分中评估了两个剂量水平，则每个FluAB_MLNS组中460名对象的样品量和每个匹配安慰剂组的230名对象的样品量提供了大约80％的权重，以使用双侧0.05水平检验，分别检测安慰剂组和FluAB_MLNS组之间方案定义的降低70％的疾病率(从4.5％至1.35％)。招募了总共约1380名对象。
如果只评估一个剂量水平，则总共招募了约920名对象。FluAB_MLNS组中460名对象的样品量和安慰剂组中460名对象的样品量提供了约80％的权重，以使用双侧0.05水平检验，分别检测安慰剂组和VIR-2482组之间方案定义的降低70％的疾病率(从4.5％至1.35％)。
如果中期分析触发了额外对象的招募，如果评估了两个剂量水平，则大约1380名额外对象被招募。总研究样品量为约2760名对象。如果只评估一个剂量水平，则约920名额外对象被招募。总研究样品量为约1840名。FluAB_MLNS组中920名对象的样品量和安慰剂组中920名对象的样品量提供了大约80％的权重，以使用双侧0.05水平检验，分别检测安慰剂组和FluAB_MLNS组之间方案定义的降低70％的疾病率(从2.25％至0.675％)。
终点
A部分
主要终点是：
·通过治疗出现的不良事件(TEAE)的发生和临床评估来测量FluAB_MLNS的安全性和耐受性。
次要终点是：
·单剂量FluAB_MLNS血清PK参数(例如C最大、C最终、T最大、T最终、AUC无穷、AUC最终、％AUC推测、t1/2、λz、Vz/F、CL/F)。
·血清ADA对FluAB_MLNS的发生率和滴度(如果适用)。
探索性终点可能包括：
·单剂量FluAB_MLNS鼻咽分泌物PK参数(例如C最大、C最终、T最大、T最终、AUC无穷、AUC最终、％AUC推测、t1/2、λz、Vz/F、CL/F)。
B部分
主要终点是：
·ADA对FluAB_MLNS的发生率和滴度(如果适用)。
次要终点是：
·通过治疗出现的不良事件(TEAE)的发生和临床评估来测量FluAB_MLNS的安全性和耐受性。
·FluAB_MLNS血清PK参数(例如C最大、C最终、T最大、T最终、AUC无穷、AUC最终、％AUC推测、t1/2、λz、Vz/F、CL/F)。
C部分
主要终点是：
·通过治疗出现的不良事件(TEAE)的发生和临床评估来测量FluAB_MLNS的安全性和耐受性。
·功效：实验室证实的(通过RT-PCR)甲型流感疾病的对象比例，定义为≥1种呼吸道症状和≥1种全身症状。
次要终点是：
·经培养确认的甲型流感疾病的对象比例。
·对象报告的甲型流感引起的ILI体征和症状的严重性和持续时间。
·通过RT-qPCR和病毒培养对初始症状表现时鼻咽分泌物中存在的病毒载量的定量。
·血清中FluAB_MLNS的PK。
·ADA对FluAB_MLNS的发生率和滴度(如果适用)。
探索性终点可能包括：
·FluAB_MLNS对ILI出现后宿主反应的潜在生物标志物的影响。
·患有甲型流感疾病的对象对FluAB_MLNS的耐药性的出现。
·通过基因分型确定的FcR多态性以及与FluAB_MLNS作用机制和/或PK的潜在关系。
·通过基因分型确定的IgG1同种异型。
·ILI监测期间医疗访视的就诊率。
·甲型流感疾病导致的工作效率和活动障碍(WPAI)的测量。
在本实施例中术语的缩写和定义列表
ADA抗药抗体
ADE抗体依赖性增强
AE不良事件
ALT丙氨酸转氨酶
ALP碱性磷酸酶
AST天冬氨酸转氨酶
AUC曲线下的面积
BLQ低于定量限
BMI身体质量指数
BUN尿素氮
Clcr肌酐清除率
CMC化学、制造和控制
CTCAE不良事件的通用术语标准
DMC数据监测委员会
EC道德委员会
ECG心电图
eCRF电子病例报告表
EOS研究结束
ET提前结束
FcR IgG的Fc受体
FDA食品和药物管理局
GCP优质临床规范
GGTγ-谷氨酰转肽酶
GLP良好实验室规范
GMP良好生产规范
HA血凝素
HED人体等效剂量
Hgb血红蛋白
ICF知情同意书
ICH国际协调会议
IgG免疫球蛋白G
ILI流感样疾病
IM肌肉注射
IND试验性新药
INR国际标准化比率
IP试验用药品
IRB机构审查委员会
IV静脉内注射
IWRS交互式网络应答系统
LDH乳酸脱氢酶
LLN正常值下限
LLOQ定量下限
LLT低级术语
mAb单克隆抗体
MedDRA国际医学用语词典
NOAEL未观察到的反作用级
OTC场外交易
PK药代动力学
POC概念验证
RBC红血球
SAD单次递增剂量
SAE严重不良事件
SD标准偏差
SOC系统器官分类
SRC安全性审查委员会
SUSAR非预期严重不良反应
ULN正常值上限
WBC白血球
WHO世界卫生组织
WOCBP有生育潜力的女性
WPAI工作效率和活动障碍
实施例8：在不同pH下与人FcRn结合
使用生物膜层干涉技术(BLI)并排比较了FluAB_wt和FluAB_MLNS与新生的Fc受体(FcRn)的结合能力。为此，在Octet RED96仪器(生物膜层干涉技术，BLI，ForteBio)上测量了FluAB_wt和FluAB_MLNS与人FcRn的结合。用抗人Fab-CHI包被的生物传感器在室温下在动力学缓冲液中预水合10分钟。然后，人mAb(FluAB_wt或FluAB_MLNS)在pH 7.4的动力学缓冲液中以1μg/ml加载到生物传感器上30分钟。在pH＝7.4或pH＝6.0的动力学缓冲液(无菌过滤的0.01％无内毒素牛血清白蛋白、0.002％吐温-20(聚山梨醇酯20)、PBS中0.005％NaN3)中测量基线4分钟。然后将负载人mAb的传感器暴露于pH＝7.4或pH＝6.0的动力学缓冲液中1μg/ml的人FcRn溶液7分钟，以测量FcRn-mAb在不同环境中的结合(结合率)。然后在相同pH的动力学缓冲液中再测量解离另外5分钟(解离率)。所有步骤都是在30℃下以1000rpm搅拌的同时进行的。随着干涉图案的变化，实时测量结合和解离曲线。
如图38A和图38B所示，在酸性pH(pH 6.0)下，与FluAB_wt相比，FluAB_MLNS与人FcRn的结合亲和力更高，而在中性pH(pH 7.4)下，FluAB_MLNS和FluAB_wt都不结合FcRn。
实施例9：在抗体延伸表位中鉴定的多态性的表征
使用在A/Puerto Rico/8/34(PR8)背景下通过H1HA或H3HA反向遗传学产生的病毒，评估延伸表位的历史多态性对FluAB_MLNS中和活性的影响。
使用定点突变将单核苷酸多态性引入PR8 H1 HA或A/Aichi/2/68(Aichi)h-IApHW2000质粒。使用标准方法(例如，如Erich Hoffmann，Gabriele Neumann，YoshihiroKawaoka，Gerd Hobom，Robert G.Webster，2000，A DNA transfection system forgeneration of influenza A virus from eight plasmids.Proceedings of theNational Academy of Sciences，2000年5月，97(11)：61 08-6113；doi：-10.1073/pnas.t00-133697中所述)，用PR8主链上相关的H1或H3 HA拯救重组甲型流感病毒。
使用标准方法在MDCK细胞中评估中和活性。例如，可以在MDCK细胞，例如在96孔板中，评估中和活性。为此，可以在感染前24小时以30000个细胞/孔接种MCDK细胞。在加入MDCK细胞之前，抗体FluAB_MLNS可在37℃下与病毒孵育1小时。为此，可以在感染培养基中产生1∶2.5的9点连续稀释的FluAB_MLNS，并且可以重复三次测试每个稀释液(例如，50μg/mL至0.03μg/mL的终浓度)，并且可以在37℃下与120 TCID50的病毒一起孵育1小时。可以用PBS洗涤MDCK细胞两次，可以加入100pL/孔的病毒：抗体溶液，并且可以在37℃下孵育细胞4小时。4小时后，加入另外的100μL/孔的感染培养基。在37℃下孵育72小时后，可以提取病毒RNA并通过qRT-PCR进行测量，例如使用WHO引物(世界卫生组织，CDC protocol of real-time RT-PCR for influenza A H1N1.2009年4月28日)。IC50被表示为减少50％病毒复制的以μg/mL计的抗体浓度，并且可以使用对对照孔(没有病毒和只有病毒)归一化的数据的非线性4-参数逻辑拟合曲线来计算。
下表4显示了在延伸表位中FluAB_MLNS对HI和H3HA多态性的中和活性。
Figure BPA0000320867220000721
表4.Aichi＝A/Aichi/2/68；Geomean＝几何平均数；HA＝血凝素；NA＝不适用；PR8＝A/Puerto Rico/8/34 H1N1；wt＝野生型
对于编码H3 HA的病毒，FluAB_MLNS中和了具有突变HA1 P11S、HA2 D46N或HA2N49T的病毒，其IC50值与野生型病毒相似(IC50相对于野生型病毒变化＜2倍)。对于编码H1HA的病毒，FluAB_MLNS中和了编码HA2 N146D的病毒，其IC50值与野生型病毒相似(IC50相对于野生型病毒变化＜2倍)。另外，所用的PR8野生型株编码HA2多态性L38Q和D46N，并被FluAB_MLNS以4.7μg/mL的IC50值中和。总的来说，所有评估的多态性导致FluAB_MLNS相对于野生型病毒的IC50倍数变化＜2。总之，FluAB_MLNS有效地中和了延伸表位中所有评估的历史多态性(H3 HA：HA1 P11S，HA2 D46N，或HA2 N49TH1 HA：N146D)。
实施例10：Tg32小鼠的抗药抗体反应
关于M428L/N434S突变，最近有人担心所述突变会增加包含该突变的抗体的免疫原性(Brian C.Mackness，Julie A.Jaworski，Ekaterina Boudanova，Anna Park，DelphineValente，Christine Mauriac，Olivier Pasquier，Thorsten Schmidt，Mostafa Kabiri，Abdullah Kandira，Katarina
Figure BPA0000320867220000722
和Huawei Qiu(2019)Antibody Fc engineeringfor enhanced neonatal Fc receptor binding and prolonged circulation half-life，mAbs，11：7，1276-1288；Maeda A，Iwayanagi Y，Haraya K等人，Identification ofhuman IgG1 variant with enhanced FcRn binding and without increased bindingto rheumatoid factor autoantibody.MAbs.2017；9(5)：844-853)。
为了评估与亲代抗体FluAB_wt相比，抗体FluAB_MLNS的免疫原性，特别是抗药反应(抗药抗体；ADA)，向两个单独组(n＝5)的TG32小鼠(人FcRn的转基因)静脉注射5mg/kg的FluAB-MLNS或FluAB_wt单克隆抗体。为了评估注射的mAb的循环水平，然后在不同的时间点获得血样。在注射后第14天和第21天采集的样品用于通过特异性ELISA评估针对注射的人单克隆抗体的抗药抗体(ADA)反应。
简而言之，将纯化的FluAB_wt和FluAB_MLNS单克隆抗体以2g/ml包被在96孔板中。封闭后，将注射后14天和21天获得的处理动物的血清以1∶180稀释，在室温(RT)下孵育1.5h。洗涤后，将过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG F(ab’)2片段(0.16μg/ml)加入平板中，并在室温下孵育1.5h。然后用合适的基质显示ADA IgG(针对注射的抗体FluAB_wt和FluAB_MLNS的小鼠抗体)，并用分光光度计读取。显示的数据是在静脉施用抗体后第14天和第21天收集的每个个体血清(n＝5/组)中获得的OD值(450nm)。将来自原始Tg32小鼠(对照)的血清用作阴性对照。
结果显示在图39A和图39B中。令人惊讶的是，与FluAB-MLNS抗体反应的小鼠血清IgG的信号非常低，并且对应于在对照、未注射的动物中检测到的信号，而在静脉内注射后14天和21天，在注射了FluAB_wt的小鼠的血清中测量到的ADA反应却非常高(图39A)。此外，在注射后第14天测量的ADA水平与循环FluAB_wt的水平显著负相关(血清FluAB_wt水平由于小鼠针对FluAB_wt的抗体而降低)，而同时测量的循环FluAB-MLNS的水平实际上高得多且均一(图39B)。
总之，这些数据令人惊讶地表明了抗药反应(抗药抗体；ADA)，因此，与FluAB_wt相比，FluAB_MLNS的免疫原性降低。
实施例11：皮下注射后的抗药抗体反应和免疫原性
为了在更具免疫原性的设置中进一步证实这一令人惊讶的发现，给不同组的TG32小鼠(n＝5)皮下注射(s.c.)FluAB-MLNS或FluAB_wt(5mg/kg)，这通常被认为是更具免疫原性的施用途径。皮下施用三周后，在皮下注射FluAB_wt或FLuAB_MLNS的小鼠血清中，通过小鼠抗药特异性ELISA(如上文实施例10中所述)测量血清中的抗药抗体水平。作为阴性对照，使用10份来自原始未处理动物的血清。
结果示于图40。尽管有更多的免疫原性设置，但用FluAB-MLNS皮下处理的动物仍然没有产生体液免疫原性反应，这通过抗hIgG抗体的血清滴度与在未注射的对照动物的血清中检测到的血清滴度重叠得到证实。相反，用FluAB_wt处理的动物中的ADA滴度在所有处理的动物中是明显阳性和可测量的。在仅注射FluAB_wt的小鼠的血清中检测到注射的抗体的循环水平和抗hIgG内源性反应之间的负相关(未显示)。
这些数据令人惊讶地显示，与亲本抗体FluAB_wt相比，抗体FluAB_MLNS表现出较低的免疫原性。
实施例12：体外中和活性
FluAB_WT广泛中和甲型流感病毒的能力在两项独立研究中使用微量中和试验进行了体外评估。研究了1933年至2014年收集的52种甲型流感病毒分离株，代表了24种第1组(H1亚型、H2亚型、H5亚型、H6亚型和H9亚型)和28种第2组病毒(H3亚型和H7亚型)。在一项研究中，FluAB_WT以0.78μg/mL(0.12μg/mL至3.07μg/mL)的半数最大抑制浓度IC50中和了所有37种病毒。在另一项研究中，FluAB_WT中和了2010年至2014年分离的另外15种病毒株，其中值IC50为0.199μg/mL(0.067μg/mL至2.69μg/mL)。在这两项研究中，除了两种7∶1重组PR8病毒外，所有第1组和第2组病毒的中值IC50值是，第1组为0.1μg/mL，第2组为0.80μg/mL(分别为n＝24和n＝26)。总共检测了17种H1N1病毒，其中值IC50为0.28μg/mL，IC90为2.17μg/mL。因此，尽管有天然存在的抗原漂移，但FluAB_WT可提供一致的中和活性。这些数据也支持FluAB_MLNS的一致中和活性。
序列和SEQ ID编号表(序列表)：
Figure BPA0000320867220000751
Figure BPA0000320867220000761
本说明书或所附申请数据表中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开都以通过引用其全部并入本文，其程度为与本说明书没有矛盾。
2019年8月29日提交的美国临时申请62/893747、2020年3月23日提交的美国临时申请62/993519和2020年6月18日提交的美国临时申请63/040966通过引用全部并入本文。
从上文可以理解，尽管为了说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。
Figure IPA0000320867170000011
Figure IPA0000320867170000021
Figure IPA0000320867170000031
Figure IPA0000320867170000041
Figure IPA0000320867170000051
Figure IPA0000320867170000061

Claims (38)

1.一种治疗或预防对象中甲型流感感染的方法，所述方法包括向对象施用单剂量的包含抗体的药物组合物，其中抗体包含根据SEQ ID NO：10的轻链氨基酸序列和根据SEQ IDNO：9的重链氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中药物组合物以100mg/mL至200mg/mL，例如100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL，优选150mg/mL的浓度包含抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中单剂量包含每kg对象体重3mg、4mg、5mg、6mg或7mg的抗体，优选5mg的抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中单剂量包含高达60mg、高达300mg、高达1200mg、高达1800mg或高达3000mg的抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中单剂量包含高达60mg、高达70mg、高达80mg、高达90mg、高达100mg、高达200mg、高达300mg、高达400mg、高达500mg、高达600mg、高达700mg、高达800mg、高达900mg、高达1000mg、高达1100mg、高达1200mg、高达1300mg、高达1400mg、高达1500mg、高达1600mg、高达1700mg、高达1800mg、高达2000mg、高达2500mg或高达3000mg的抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中抗体是以60mg、300mg、1200mg或1800mg的剂量施用的。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中抗体是以300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1100mg或1200mg的剂量施用的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中：
(i)单剂量包含300mg的抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量是通过包含2mL药物组合物的单次注射来施用的；
(ii)单剂量包含1200mg的抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量是通过每次包含4mL药物组合物的两次注射来施用的；
(iii)单剂量包含1800mg的抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量是通过每次包含4mL药物组合物的三次注射来施用的；或
(iv)单剂量包含60mg的抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且剂量是通过包含0.4mL药物组合物的一次注射来施用的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中对象是人。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中方法包括肌肉(IM)注射。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中药物组合物还包含水(例如USP注射用水或US无菌注射用水)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中药物组合物还在药物组合物中包含组氨酸，任选地浓度为10mM至40mM，优选20mM。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中药物组合物还包含糖，例如二糖，例如蔗糖，任选地为3.0％(重量/体积)至9.0％(重量/体积)，优选为3.6％(重量/体积)至8.6％(重量/体积)，更优选为4％(重量/体积)至6％(重量/体积)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中药物组合物还包含表面活性剂或三嵌段共聚物、任选地聚山梨醇酯或泊咯沙姆188，优选聚山梨醇酯80(PS80)，任选地为0.01％(重量/体积)至0.05％(重量/体积)，优选为0.02％(重量/体积)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中药物组合物的pH为5.5至6.5、或5.8至6.2，或pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，优选6.0。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中单剂量包含每次注射0.8mL至4mL。
17.根据权利要求16所述的方法，其中单剂量包含或组成为每次注射0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL、1.4mL、1.5mL、1.6mL、1.7mL、1.8mL、1.9mL、2.0mL、2.1mL、2.2mL、2.3mL、2.4mL、2.5mL、2.6mL、2.7mL、2.8mL、2.9mL、3.0mL、3.1mL、3.2mL、3.3mL、3.4mL、3.5mL、3.6mL、3.7mL、3.8mL、3.9mL或4.0mL的组合物。
18.根据权利要求书1至17中任一项所述的方法，其中在向对象施用药物组合物之后约4周、约12周和/或约20周，对象与同期接受安慰剂或未接受甲型流感治疗或疫苗的参考对象相比：
(i)呼吸道症状的数量和/或严重性减少，所述呼吸道症状选自：咳嗽、咽喉痛、鼻漏、充血或其任意组合，和/或
(ii)全身症状的数量和/或严重性减少，所述全身症状选自：发烧[口腔温度＞38℃(100.4°F)]、寒颤、肌痛、头痛、乏力、疲劳或其任意组合。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中对象的年龄为18岁至65岁并且身体质量指数为18kg/m2至32kg/m2或18kg/m2至35kg/m2。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其包括在六个月期间向对象施用一次包含药物组合物的单剂量。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其包括在十二个月期间向对象施用一次包含药物组合物的单剂量。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其包括在六个月期间，例如每三个月一次，向对象施用两次包含药物组合物的单剂量。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其包括在流感季节开始前1个月至2个月内(即，30天内至60天内)，或在流感季节的前1个月至2个月内，施用包含药物组合物的单剂量。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中抗体或包含抗体的药物组合物的体外流感感染抑制IC90为约2.17μg/mL。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中：
(i)施用的药物组合物包含60mg抗体，并且抗体在施用后以约1μg/mL至约7μg/mL的浓度在来自对象的血清中存在最多120天；
(ii)施用的药物组合物包含300mg抗体，并且抗体在施用后以约8μg/mL至约20μg/mL的浓度在来自对象的血清中存在最多120天；
(iii)施用的药物组合物包含1200mg抗体，并且抗体在施用后以约50μg/mL至约100μg/mL的浓度在来自对象的血清中存在最多120天；
(iv)施用的药物组合物包含1800mg抗体，并且抗体在施用后以约70μg/mL至约110μg/mL的浓度在来自对象的血清中存在最多120天；和/或
(v)抗体在对象中的体内t1/2为49天至68天。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中药物组合物的抗体在人类对象中的体内t1/2为49天至68天，例如49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天或68天。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，在施用单剂量的药物组合物后任选地最多140天，对象不会经历不良事件(AE)。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，在施用单剂量的药物组合物后任选地最多140天，对象不会经历轻度不良事件(AE)。
29.根据权利要求书1至28中任一项所述的方法，其中根据通用不良事件术语标准(CTCAE)，在施用单剂量的药物组合物后任选地最多140天，对象不会经历重度不良事件(AE)。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中：
(i)单剂量包含300mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且单剂量包括包含2mL药物组合物的单次注射；
(ii)单剂量包含1200mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且单剂量包括每次包含4mL药物组合物的两次注射；
(iii)单剂量包含1800mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且单剂量包括每次包含4mL药物组合物的三次注射；或
(iv)单剂量包含60mg抗体，其中药物组合物以150mg/mL包含抗体，并且单剂量包含0.4mL药物组合物。
31.一种包含抗体的药物组合物，所述抗体包含根据SEQ ID NO：10的轻链氨基酸序列和根据SEQ ID NO：9的重链氨基酸序列，其中抗体以100mg/mL至200mg/mL，例如100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL、或200mg/mL，优选150mg/mL的浓度存在于组合物中。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中药物组合物还包含水(例如USP注射用水或US无菌注射用水)。
33.根据权利要求31或32所述的药物组合物，并且药物组合物还在组合物中包含组氨酸，任选地浓度为10mM至40mM，优选20mM。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含糖，例如二糖，例如蔗糖，任选地为3.0％(重量/体积)至9.0％(重量/体积)，优选3.6％(重量/体积)至8.6％(重量/体积)，更优选4％(重量/体积)至6％(重量/体积)。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的药物组合物，药物组合物还包含表面活性剂或三嵌段共聚物、任选地聚山梨醇酯或泊咯沙姆188，优选聚山梨醇酯80(PS80)，任选地0.01％(重量/体积)至0.05％(重量/体积)，优选0.02％(重量/体积)。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的药物组合物，其中组合物的pH为5.5至6.5、或5.8至6.2，或pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，优选6.0。
37.一种瓶，其包含根据权利要求31至36中任一项所述的药物组合物，所述瓶优选是玻璃瓶。
38.一种注射器，其包含根据权利要求31至36中任一项所述的药物组合物。
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