KR20220031023A - 신규한 인트론 단편 - Google Patents
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Abstract
신규한 인트론 단편이 제공된다. 상기 인트론 단편은 다양한 유형의 프로모터 및 스플라이싱 공여체와 조합시에도 유전자 발현을 증가시키는 능력을 유지하면서 전장 인트론에 의해 달성되는 수준과 동등하거나 그보다 더 높은 수준으로 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 특히 상기 인트론 단편은 크기가 제한된 유전 정보 전달 시스템, 예를 들어 아데노-연관 바이러스(AAV) 및 랍도바이러스에서 사용시 더 큰 외래 유전자의 담지를 가능하게 한다. 따라서 상기 인트론 단편의 사용은 치료용 유전자의 범위를 확장할 것으로 기대된다.
Description
본 개시 내용은 외래 유전자의 발현량을 증가시킬 수 있는 신규한 인트론 단편(즉, 비번역(untranslated) 핵산 서열)에 관한 것이다.
진핵생물의 pre-mRNA는 실제 유전 정보를 담고 있는 엑손(exon)들과 엑손 사이에 존재하는 인트론(intron)들로 구성되며 3'-말단에는 poly A 서열이 존재한다. 인트론은 mRNA 대체 스플라이싱(alternative splicing)에 영향을 미치고, 단백질 생산량을 조절한다(Huh, G.S., et al., "Regulation of Alternative pre-mRNA Splicing by a Novel Repeated Hexanucleotide Element," Genes Dev 8(13):1561-74 (Jul. 1994); Parenteau, J., et al., "Introns Within Ribosomal Protein Genes Regulate the Production and Function of Yeast Ribosomes," Cell 147(2):320-31 (Oct. 2011)). 또한 인트론이 포함된 외래 유전자(transgenes)는 생쥐에서 인트론이 없는 경우에 비해 10배 내지 100배 더 효율적으로 전사되며, 나아가 생존에 영향을 준다고 보고되었다(Brinster, R.L., et al., "Introns Increase Transcriptional Efficiency in Transgenic Mice,"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85(3):836-40 (Feb. 1988); Parenteau, J., et al., "Introns Are Mediators of Cell Response to Starvation," Nature 565(7741):612-617 (Jan. 2019)). 이 중, 인트론에 의한 단백질 생산량 증가는 인트론 매개 증강(intron-mediated enhancement, IME)라고 불리는데, 이러한 IME 효과를 보기 위하여 사용되는 인트론은 대부분 상당히 길기 때문에, 실제 사용에 있어 제약이 있다. 일례로 최근 유전자치료용 전달체로 주목받고 있는 아데노부속바이러스(adeno-associated virus, AAV)의 경우 최대 4.7 kbp 길이의 유전 정보만을 삽입할 수 있기 때문에 긴 길이의 인트론을 사용할 경우 전달할 수 있는 유전자의 범위가 매우 제한된다. 따라서, 단백질 발현 증가 능력은 유지하면서도 짧은 인트론 단편을 발굴하여 AAV 벡터에 적용할 수 있다면 매우 바람직할 수 있다.
관련 출원에 대한 상호 참조 사항
본 출원은 2020년 7월 8일자 출원된 한국특허출원 제10-2020-0084038호 및 2021년 7월 1일자 출원된 미국특허출원 제17/365,884호의 우선권을 주장하며, 그 전문이 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 명세서는 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 비번역 핵산 서열을 포함하되, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제1서열을 포함하지 않는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본 명세서는 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 비번역 핵산 서열을 포함하되, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제1서열을 포함하지 않는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제3서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제3서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본 명세서는 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 비번역 핵산 서열을 포함하되, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제1서열을 포함하지 않는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제2서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제2서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 5' 말단("5' 영역")에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 5' 영역에 서열목록 제1서열 내 1번째 내지 873번째 위치에 해당하는 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 3' 말단("3' 영역")에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 비번역 핵산 서열은 (i) 서열목록 제1서열의 871번째 내지 924번째(즉, 서열목록 제58서열), (ii) 서열목록 제1서열의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제59서열), (iii) 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제60서열), (iv) 서열목록 제1서열의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제61서열), (v) 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제2서열), (vi) 서열목록 제1서열의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제63서열), (vii) 서열목록 제1서열 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제64서열), (viii) 서열목록 제1서열의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제65서열), (ix) 서열목록 제1서열의 801번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제66서열), (x) 서열목록 제1서열의 751번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제67서열), (xi) 서열목록 제1서열의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제68서열), (xii) 서열목록 제1서열의 701번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제69서열), (xiii) 서열목록 제1서열의 651번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제70서열), (xiv) 서열목록 제1서열의 601번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제71서열), (xv) 서열목록 제1서열의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제72서열), (xvi) 서열목록 제1서열의 551번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제73서열) 또는 (xvii) 서열목록 제1서열의 501번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제74서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 외래 유전자를 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 폴리펩타이드로 번역될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 비번역 핵산 서열은 번역시 기준 발현 대비 상기 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 것으로, 상기 기준 발현은 비번역 핵산 서열이 없는 상태 및/또는 서열목록 제1서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 상태에서 번역시 해당 외래 유전자의 발현을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 외래 유전자의 발현을 기준 발현보다 적어도 약 1배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배 또는 적어도 약 10배 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 프로모터를 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF-1α 프로모터, β-액틴 프로모터, GAPDH 프로모터, HSP70 프로모터, GRP78 프로모터, eIF4a 프로모터, AAT 프로모터, TTR 프로모터, GFAP 프로모터, SV40 프로모터, SYN1 프로모터, GRK 프로모터, Rho 프로모터 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 프로모터는 EF-1α 프로모터이다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α 프로모터는 서열목록 제7서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CMV 프로모터는 서열목록 제5서열 또는 제6서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 프로모터는 β-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 β-액틴 프로모터는 서열목록 제8서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 인핸서를 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인핸서는 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, SV40 초기 인핸서, 아데노바이러스 5 E1A 인핸서, HBV 인핸서-1 조절 영역(Eh-1), HPV-16 또는 -18 E6/7 긴 조절 영역(long control region, LCR), HIV-1 긴 반복말단(long terminal repeat, LTR) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인핸서는 CMV 인핸서이다. 일부 양태에서, 상기 CMV 인핸서는 서열목록 제4서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 스플라이싱 공여체(splicing donor) 서열을 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 스플라이싱 공여체 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 상류에 연결된다. 일부 양태에서, 상기 스플라이싱 공여체 서열은 서열목록 제9서열 또는 제10서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 EF-1α 엑손 2(E2) 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α 엑손 2(E2) 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제11서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 사이토메갈로바이러스(CMV) 엑손 1(E1) 서열, EF-1α E1 서열, β-액틴 E1 서열 또는 이들의 임의의 조합을 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CMV E1 서열은 서열목록 제12서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E1 서열은 서열목록 제13서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 β-액틴 E1 서열은 서열목록 제14서열 또는 제15서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 면역세포에 특이적인 microRNA(miRNA)에 대한 적어도 하나의 타겟 서열(target sequence)을 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 miRNA는 miR142-3p, miR142-5p 또는 2개 모두를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어(antagomir), 소헤어핀 RNA(shRNA) 분자, 소방해 RNA(siRNA) 분자, 라이보자임, 펩타이드 핵산(PNA) 올리고뉴클레오타이드, 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열은 miR142-3p 또는 miR142-5p의 전장 또는 일부 서열에 상보적이다. 일부 양태에서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열은 서열목록 제16서열 또는 서열목록 제17서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 적어도 2개의 타겟 서열, 적어도 3개의 타겟 서열, 적어도 4개의 타겟 서열, 적어도 5개의 타겟 서열, 적어도 6개의 타겟 서열, 적어도 7개의 타겟 서열, 적어도 8개의 타겟 서열, 적어도 9개의 타겟 서열 또는 적어도 10개의 타겟 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 타겟 서열 중 2개 이상은 동일하다. 일부 양태에서, 상기 타겟 서열은 서로 다르다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, WPRE) 서열을 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 WPRE 서열은 서열목록 제18서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 폴리아데닐화(pA) 서열을 더 포함한다. 일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열목록 제19서열 내지 제22서열 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
상기 폴리뉴클레오타이드가 외래 유전자를 포함하는 경우, 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 야생형 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 변이체, 융합 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, RNA-기반 분자 또는 이들의 임의의 조합을 코딩한다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 융합 단백질을 코딩한다. 일부 양태에서, 상기 융합 단백질은 혈관 내피세포 성장 인자("VEGF")의 저해제를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 VEGF의 저해제는 애플리버셉트(aflibercept)를 포함한다. 상기 외래 유전자가 RNA-기반 분자인 경우, 일부 양태에서, 상기 RNA-기반 분자는 miRNA, shRNA, siRNA, 라이보자임 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 재조합 발현 구축물(recombinant expression construct)이다.
본 명세서는 또한 (i) 외래 유전자 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 조절 요소가 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 서열목록 제4서열에 나타낸 CMV 인핸서; (2) 서열목록 제5서열 또는 제6서열에 나타낸 CMV 프로모터 서열, 서열목록 제7서열에 나타낸 EF-1α 프로모터 서열 또는 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열로부터 선택되는 프로모터; (3) 서열목록 제12서열에 나타낸 CMV E1 서열, 서열목록 제13서열에 나타낸 EF-1α E1 서열 또는 서열목록 제14서열 또는 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 E1 서열로부터 선택되는 엑손 1(E1) 서열; (4) 서열목록 제9서열 또는 제10서열에 나타낸 스플라이싱 공여체 서열; (5) 서열목록 제2서열, 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 비번역 핵산 서열; 및 (6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α E2 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 명세서는 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스(예를 들어 유전자 조작된 아데노바이러스), 아데노-연관 바이러스(AAV), 렌티바이러스, SV40-형 바이러스, 폴리오마바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 유두종 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 백시니아 바이러스, 소아마비 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이러스 벡터는 AAV이다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 유전자 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 외래 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 발현에 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 명세서는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들 또는 벡터들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 명세서는 또한 본 명세서에 기재된 벡터들 중 임의의 벡터 및 rep과 cap 유전자를 함유한 구축물로 세포를 형질도입하는 것을 포함하는 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 생산된 재조합 바이러스 입자를 분리하는 것을 더 포함한다.
본 명세서는 상기 방법에 의해 생산된 재조합 바이러스 입자를 제공한다. 본 명세서는 또한 (a) 캡시드 단백질 및 (b) 본 명세서에 기재된 벡터들 중 임의의 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 재조합 바이러스 입자는 아데노-연관 바이러스(AVV)이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh10이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV2이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV8이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV5이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV9이다.
본 개시 내용은 또한 (a) 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들, 세포들 또는 재조합 바이러스 입자들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 재조합 바이러스 입자; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서는 또한 재조합 아데노-연관 바이러스 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 재조합 아데노-연관 바이러스 입자가 (a) AAV 8형 캡시드 단백질 및 (b) (i) 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외래 유전자 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결되고 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 서열목록 제4서열에 나타낸 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 서열; (2) 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열; (3) 서열목록 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열; (4) 서열목록 제10서열에 나타낸 치킨 β-액틴 인트론의 스플라이싱 공여체 서열; (5) 서열목록 제2서열, 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 비번역 핵산 서열; 및 (6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함하는 조절 요소;를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서는 재조합 아데노-연관 바이러스 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안과 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 재조합 아데노-연관 바이러스 입자가 (a) AAV 8형 캡시드 단백질 및 (b) (i) 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외래 유전자 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결되고 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 서열목록 제4서열에 나타낸 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 서열; (2) 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열; (3) 서열목록 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열; (4) 서열목록 제10서열에 나타낸 치킨 β-액틴 인트론의 스플라이싱 공여체 서열; (5) 서열목록 제2서열, 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 비번역 핵산 서열; 및 (6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함하는 조절 요소;를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 상기 안과 질환은 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 신생혈관형성(choroidal neovascularization), 황반변성(macular degeneration), 망막변성(retinal degeneration), 황반부종(macular edema), 망막부종(retinal edema), 황반부기(macula tumentia) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함한다.
본 명세서는 세포에서 외래 유전자의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포를 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들 또는 재조합 바이러스 입자들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스 입자와 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 접촉을 생체내에서 진행한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 접촉 전에 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스 입자를 대상에 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 접촉을 생체외에서 진행한다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자의 발현은 기준 세포에서의 해당 발현에 비해 적어도 약 1배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배 또는 적어도 약 10배 증가하는 것으로, 상기 기준 세포는 상기 비번역 핵산 서열이 결여되어 있거나 서열목록 제1서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스 입자와 접촉된다.
본 명세서는 필요로 하는 대상에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들 또는 재조합 바이러스 입자들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스 입자를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 안과 질환을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 안과 질환은 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 추가 치료제를 상기 대상에 투여하는 것을 포함한다.
양태
제1양태. 서열목록 제1서열에 나타낸 EF-1α 인트론 서열 내 뉴클레오타이드 중 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드가 결실되어 있는(truncated) 서열을 포함하는 외래 유전자 발현용 신장 인자-1 알파(EF-1α) 인트론 단편으로서, (a) 상기 EF-1α 인트론 단편이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 874번째 내지 924번째 위치의 뉴클레오타이드를 필수적으로 포함하고 (b) 상기 EF-1α 인트론 단편이 발현 구축물 내에 존재시 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 874번째 내지 924번째 위치의 뉴클레오타이드로만 이루어진 인트론 단편 대비 외래 유전자 발현을 증가시키는 EF-1α 인트론 단편.
제2양태. 제1양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 873번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제3양태. 제2양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 870번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제4양태. 제3양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 860번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제5양태. 제4양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 851번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제6양태. 제5양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 850번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제7양태. 제6양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 829번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제8양태. 제7양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 820번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제9양태. 제8양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 810번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제10양태. 제9양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 800번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제11양태. 제10양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 750번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제12양태. 제11양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 720번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제13양태. 제12양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 700번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제14양태. 제13양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 650번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제15양태. 제14양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 600번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제16양태. 제15양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 569번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제17양태. 제16양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 550번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제18양태. 제17양태에 있어서, 상기 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 결실이 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 500번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 뉴클레오타이드의 결실, 상기 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실 또는 상기 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제19양태. 제7양태에 있어서, 상기 EF-1α 인트론 단편이 서열목록 제2서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제20양태. 제5양태에 있어서, 상기 EF-1α 인트론 단편이 서열목록 제3서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 EF-1α 인트론 단편.
제21양태. (a) 외래 유전자 및 (b) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결되고 인핸서, 프로모터 및 제1양태에 따른 EF-1α 인트론 단편을 포함하는 조절 요소를 포함하는 외래 유전자 발현용 재조합 발현 구축물로서, 상기 외래 유전자가 숙주 세포에서 전사 및 번역되는 재조합 발현 구축물.
제22양태. 제21양태에 있어서, 상기 인핸서는 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서인 재조합 발현 구축물.
제23양태. 제22양태에 있어서, 상기 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서가 서열목록 제4서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제24양태. 제21양태에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF-1α 프로모터 및 β-액틴 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 발현 구축물.
제25양태. 제24양태에 있어서, 상기 CMV 프로모터가 서열목록 제5서열 또는 제6서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제26양태. 제24양태에 있어서, 상기 EF-1α 프로모터가 서열목록 제7서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제27양태. 제24양태에 있어서, 상기 β-액틴 프로모터가 서열목록 제8서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제28양태. 제21양태에 있어서, 상기 EF-1α 인트론 단편의 상류에 스플라이싱 공여체 서열이 연결되어 있는 재조합 발현 구축물.
제29양태. 제28양태에 있어서, 상기 스플라이싱 공여체 서열이 서열목록 제9서열 또는 제10서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제30양태. 제21양태에 있어서, 상기 재조합 발현 구축물이 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제31양태. 제30양태에 있어서, 상기 EF-1α E2 서열이 서열목록 제11서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제32양태. 제21양태에 있어서, 상기 재조합 발현 구축물이 사이토메갈로바이러스(CMV), EF-1α 또는 β-액틴 엑손 1(E1) 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제33양태. 제32양태에 있어서, 상기 CMV E1 서열이 서열목록 제12서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제34양태. 제32양태에 있어서, 상기 EF-1α E1 서열이 서열목록 제13서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제35양태. 제32양태에 있어서, 상기 β-액틴 E1 서열이 서열목록 제14서열 또는 제15서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제36양태. 제21양태에 있어서, 면역세포에 특이적인 microRNA(miRNA)에 대한 하나 이상의 타겟 서열을 더 포함하는 재조합 발현 구축물.
제37양태. 제36양태에 있어서, 상기 miRNA가 miR142-3p 또는 miR142-5인 재조합 발현 구축물.
제38양태. 제36양태에 있어서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열이 miR142-3p 또는 miR142-5p의 전장 또는 일부 서열에 상보적인 서열을 가진 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어, 소헤어핀 RNA(shRNA) 분자, 소방해 RNA(siRNA) 분자, 라이보자임, 펩타이드 핵산(PNA) 올리고뉴클레오타이드 및 잠금 핵산(LNA) 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 발현 구축물.
제39양태. 제38양태에 있어서, 상기 miR142-3p에 대한 타겟 서열이 서열목록 제16서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제40양태. 제38양태에 있어서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열의 수가 2 내지 6개인 재조합 발현 구축물.
제41양태. 제40양태에 있어서, 상기 miR142-3p에 대한 타겟 서열이 서열목록 제17서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제42양태. 제21양태에 있어서, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE) 서열을 더 포함하는 재조합 발현 구축물.
제43양태. 제42양태에 있어서, 상기 WPRE 서열이 서열목록 제18서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제44양태. 제21양태에 있어서, 하나 이상의 폴리아데닐화(pA) 서열을 더 포함하는 재조합 발현 구축물.
제45양태. 제44양태에 있어서, 상기 폴리아데닐화 서열이 서열목록 제19서열 내지 제22서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 발현 구축물.
제46양태. 제21양태에 있어서, 상기 조절 요소가 1) 서열목록 제4서열에 나타낸 CMV 인핸서 서열, (2) 서열목록 제5서열 또는 제6서열에 나타낸 CMV 프로모터 서열, 서열목록 제7서열에 나타낸 EF-1α 프로모터 서열 또는 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열로부터 선택되는 프로모터 서열; (3) 서열목록 제12서열에 나타낸 CMV E1 서열, 서열목록 제13서열에 나타낸 EF-1α E1 서열 또는 서열목록 제14서열 또는 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 E1 서열, (4) 서열목록 제9서열 또는 제10서열에 나타낸 스플라이싱 공여체 서열; (5) 청구범위 제1항에 따른 EF-1α 인트론 단편 서열 및 (6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α E2 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제47양태. 제21양태에 있어서, 상기 외래 유전자가 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물.
제48양태. 제21양태에 따른 재조합 발현 구축물로 형질도입된 숙주 세포.
제49양태. 제21양태에 따른 재조합 발현 구축물 및 rep과 cap 유전자를 함유한 구축물로 숙주 세포를 형질도입하는 것을 포함하는 재조합 바이러스를 생산하기 위한 방법.
제50양태. (a) 캡시드 단백질 및 (b) 제21양태에 따른 재조합 발현 구축물을 포함하는 재조합 바이러스.
제51양태. 제50양태에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 아데노-연관 바이러스(AVV)인 재조합 바이러스.
제52양태. 제51양태에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh10인 재조합 바이러스.
제53양태. 제21양태에 따른 재조합 발현 구축물 또는 제50양태에 따른 재조합 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물.
제54양태. 제53양태에 있어서, 상기 조성물이 안과 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용되는 약제학적 조성물.
제55양태. 제54양태에 있어서, 상기 안과 질환이 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종 및 황반부기로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제56양태. 제21양태에 따른 재조합 발현 구축물 또는 제50양태에 따른 재조합 바이러스의 치료용 용도.
제57양태. 재조합 아데노-연관 바이러스 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안과 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 재조합 아데노-연관 바이러스가 (a) AAV 8형 캡시드 단백질 및 (b) 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외래 유전자 및 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결되고 1) 서열목록 제4서열에 나타낸 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 서열, 2) 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열, 3) 서열목록 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열, 4) 서열목록 제10서열에 나타낸 치킨 β-액틴 인트론의 스플라이싱 공여체 서열, 5) 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 829번째 위치의 뉴클레오타이드 중 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드가 결실되어 있고 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 830번째 내지 924번째 위치의 뉴클레오타이드가 필수적으로 존재하는 EF-1α 인트론 단편 및 (6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함하는 조절 요소를 포함하는 외래 유전자 발현용 재조합 발현 구축물을 포함하는 약제학적 조성물.
본 개시 내용은 일반적으로 비번역 핵산 서열(본 명세서에서는 "인트론"이라고도 함) 및 외래 유전자 발현을 위한 이러한 서열의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 출원인은 EF-1α 인트론 서열의 특정 단편이 외래 유전자 발현을 증가시키는 우수한 능력을 나타낸다는 것을 확인하였다. 본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 이들 EF-1α 인트론 단편은 외래 유전자 발현을 증가시키는 데 있어서 전장 EF-1α 인트론과 대등한 수준 또는 그 이상이다. 본 개시 내용의 추가 양태들은 본 출원 전체에 걸쳐 제공되어 있다.
본 명세서에 개시된 개시 내용의 이해를 용이하게 하기 위해서 다수의 용어 및 문구를 정의하기로 한다. 추가 정의들은 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
I. 정의
본 개시 내용 전반에 걸쳐, 용어 "한" 또는 "어떤" 실체는 그 실체의 하나 이상을 말하는 것으로; 예를 들어, "한 폴리펩타이드"는 하나 이상의 폴리펩타이드를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "한"(또는 "어떤"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본 명세서에서 혼용될 수 있다.
또한 본 명세서에서 사용하는 "및/또는"은 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각을 나머지 다른 특징 또는 구성요소와 함께 또는 단독으로 구체적인 개시로서 간주되어야 한다. 이에 따라 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용하는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용하는 용어 "및/또는"은 다음과 같은 양태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
하나의 숫자 또는 일련의 숫자 앞에 있는 용어 "적어도"는 용어 "적어도" 다음에 오는 숫자 및 문맥상 명백하게 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 숫자 또는 정수들을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자 내 뉴클레오타이드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들어, "21개 뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 18개 뉴클레오타이드"는 18개, 19개, 20개 또는 21개 뉴클레오타이드가 소정의 특성을 가진다는 것을 의미한다. 일련의 숫자 또는 범위 앞에 "적어도"가 있으면 "적어도"가 상기 일련의 또는 범위의 숫자 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다. "적어도"는 또한 정수로 국한되지 않는다(예를 들어 "적어도 5%"는 유효 숫자의 개수를 고려하는 것 없이 5.0%, 5.1%, 5.18%를 포함한다).
본 명세서에서 양태들을 용어 "포함하는"으로 기재하면 "이루어지는" 및/또는 "필수적으로 이루어지는"의 관점으로 기재된 다른 유사한 양태 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용하는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시 내용과 관련된 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed, 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 당업자에게 본 개시 내용에서 사용되고 있는 용어들 중 다수의 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 이들의 Systeme International de Unites(SI)에서 인정한 형태로 표시된다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측으로부터 우측으로 쓰여진다. 본 명세서에서 제공된 표제는 개시 내용의 다양한 양태들의 제한이 아니며 이들은 전체적으로 명세서를 참조한 것일 수 있다. 따라서 바로 아래에 정의된 용어들은 명세서를 전체적으로 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
본 명세서에서 용어 "약"은 거의, 대략, 가량 또는 그의 영역 내를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우에 기재되어 있는 수치의 위와 아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 명시된 값의 위와 아래의 수치를 예를 들어 위 또는 아래(더 높거나 더 낮은) 10%의 변화량만큼 변경할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "아데노-연관 바이러스"(AAV)는 AAV 1형, AAV 2형, AAV 3형(3A형 및 3B형 포함), AAV 4형, AAV 5형, AAV 6형, AAV 7형, AAV 8형, AAV 9형, AAV 10형, AAV 11형, AAV 12형, AAV 13형, AAVrh.74, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, Gao 등(J. Virol. 78:6381 (2004)) 및 Moris 등(Virol. 33:375 (2004))이 개시하고 있는 AAV 혈청형 및 계통 분기 및 그 외 현재 알려져 있거나 이후 발견된 다른 AAV를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, FIELDS 등. VIROLOGY, volume 2, chaptor 69(4th ed., Lippincott-Raven Publishers)를 참조할 것. 일부 양태에서, "AAV"는 공지된 AAV의 파생물들을 포함한다. 일부 양태에서, "AAV"는 변형 또는 인공 AAV를 포함한다.
용어 "투여", "투여하는" 및 이들의 문법적 변형 형태들은 약제학적으로 허용되는 경로를 통해 대상에 조성물(예를 들어 본 명세서에 기재된 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드)을 도입하는 것을 지칭한다. 조성물은 종양내, 경구, 폐내, 비강내, 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 척추강내, 안구 주위(periocular) 또는 국소 투여를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 대상에 도입된다. 투여는 자가 투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다. 조성물 또는 제제는 적합한 투여 경로를 통해 그의 의도된 기능을 발휘한다. 예를 들어 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 제제를 대상의 정맥에 도입함으로써 투여된다.
본 명세서에서 사용하는 "CEE" 구축물은 CMV 인핸서, EF-1α 프로모터 및 EF-1α 인트론 단편을 포함한다. "CE" 구축물은 CMV 인핸서 및 EF-1α 프로모터를 포함하지만 인트론 단편을 포함하지는 않는다(예를 들어 EF-1α 인트론 단편을 포함하지 않음). "CAE" 구축물은 CMV 인핸서, 치킨 β-액틴 프로모터 및 EF-1α 인트론 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 "CAG" 구축물은 CMV 인핸서, 치킨 β-액틴 프로모터 및 치킨 β-액틴/토끼 β-글로빈 하이브리드 인트론 단편을 포함한다. "CA" 구축물은 CMV 인핸서 및 치킨 β-액틴 프로모터를 포함하지만 인트론 단편을 포함하지는 않는다(예를 들어 EF-1α 인트론 단편을 포함하지 않음). 도 4A, 5A 및 5C를 참조할 것.
본 명세서에서 사용하는 용어 "보존된"은 비교할 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변하지 않고 나타나는 것들인 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 지칭한다. 상대적으로 보존되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 서열 내 다른 위치에서 나타나는 뉴클레오타이드 또는 아미노산보다 더 관련이 있는 서열 중에서 보존되는 것들이다.
일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 100% 동일한 경우에는 "완전히 보존된" 또는 "동일한" 것이라고 말한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일 또는 적어도 95% 동일한 경우에는 "고도로 보존된" 것이라고 말한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 경우에 "고도로 보존된" 것이라고 말한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 30% 동일, 적어도 40% 동일, 적어도 50% 동일, 적어도 60% 동일, 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일 또는 적어도 90% 동일 또는 적어도 95% 동일한 경우에 "보존된" 것이라고 말한다. 일부 양태에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 30% 동일, 약 40% 동일, 약 50% 동일, 약 60% 동일, 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일 또는 약 99% 동일한 경우에 "보존된" 것이라고 말한다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 적용되거나 그의 일부, 영역 또는 특징부에 적용될 수 있다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 규칙에 의해 서로 연관되는 2개 이상의 올리고머(즉, 각각 핵염기 서열을 포함) 또는 올리고머와 타겟 유전자 사이를 지칭한다. 예를 들어 핵염기 서열 "T-G-A(5'→3')"는 핵염기 서열 "A-C-T(3'→5')"에 상보적이다. 염기쌍 규칙에 따라 소정의 핵염기 서열의 모든 핵염기보다 적은 수가 다른 핵염기 서열과 일치하면, 상보성은 "부분적"인 것일 수 있다. 예를 들어 일부 양태에서, 소정의 핵염기 서열 및 다른 핵염기 서열 사이의 상보성은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%일 수 있다. 따라서 특정 양태에서, 용어 "상보적"은 타겟 핵산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 일치 또는 상보성을 지칭한다. 또는 예시를 계속하기 위해서 소정의 핵염기 서열 및 다른 핵염기 서열 간 "완전한" 또는 "완벽한"(100%) 상보성이 있을 수 있다. 일부 양태에서, 핵염기 서열 간의 상보성 정도는 서열 간 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
본 명세서에서 사용하는 표현 "연속 또는 비연속 뉴클레오타이드가 결실된다"는 야생형(또는 원래의) 서열에 비해 결실의 결과로서 남아있는 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 의도하지만, 임의의 결실 과정을 포함하는 것을 의도하는 것은 아니다. 상기 용어는 "연속 뉴클레오타이드의 결실", "결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 비연속 뉴클레오타이드의 결실" 및 "결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입"을 포함할 수 있다. 예를 들어 뉴클레오타이드 서열 "A-T-G-C-C-G-T-C"의 경우에, 연속 뉴클레오타이드의 결실은 "A-_-_-_-C-G-T-C"와 같이 하나 이상의 연속 뉴클레오타이드의 결실을 포함하고, 비연속 뉴클레오타이드의 결실은 "A-_-G-_-C-G-T-_"와 같이 하나 이상의 뉴클레오타이드가 결실된 뉴클레오타이드 사이에 결실되지 않은 채로 남아 있는 것을 의미하며, 결실된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드의 위치에 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드의 삽입은 "A-A-G-_-C-G-T-G"와 같이 원래의 뉴클레오타이드와 서로 다른 하나 이상의 뉴클레오타이드가 결실된 뉴클레오타이드의 위치에 삽입되는 것을 의미한다.
용어 "하류(downstream)"는 기준 뉴클레오타이드 서열에 대해 3'에 위치해 있는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 특정 양태에서, 하류 뉴클레오타이드 서열은 전사의 시작점 이후의 서열과 관련이 있다. 예를 들어 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 시작 부위의 하류에 위치해 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "인핸서"는 증강된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부의 경우에 또 다른 조절 서열에 대한 그의 배향과 무관하게 작용할 수 있는 DNA의 부분을 지칭한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협력하여 또는 추가로 작용할 수 있다.
용어 "부형제" 및 "담체"는 호환적으로 사용되며, 약제학적 조성물에 첨가되어 복합체(compound), 예를 들어 본 명세서에 기재된 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 투여를 더욱 용이하게 하는 불활성 물질을 지칭한다.
용어 "엑손"은 단백질을 코딩하는 핵산의 소정 부분 또는 전처리된(또는 전구체) RNA의 어느 부분을 스플라이싱에 의해 제거한 후 RNA 분자의 성숙한 형태에서 나타나는 핵산 서열을 지칭한다. 상기 성숙한 RNA 분자는 메신저 RNA(mRNA)이거나 또는 rRNA 또는 tRNA와 같은 비코딩 RNA의 기능적 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생성하는 과정을 지칭한다. 이는 폴리뉴클레오타이드를 메신저 RNA(mRNA)로 전사하고 mRNA를 폴리펩타이드로 번역하는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 발현은 "유전자 산물"을 생성한다. 본 명세서에서 사용하는 유전자 산물은 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생성된 RNA와 같은 핵산일 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 유전자 산물은 전사체로부터 번역되는 핵산 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자 산물은 전사후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱에 의한 핵산 또는 번역후 변형, 예를 들어 인산화, 메틸화, 글리코실화, 지질 추가, 다른 단백질 소단위체와의 회합 또는 단백질 가수분해 절단에 의한 폴리펩타이드를 더 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "동일성"은 폴리머 분자들, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 분자들 사이에서 전체 모노머 보존을 지칭한다. 어떠한 추가 수식어도 사용하지 않은 용어 "동일한", 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 A는 폴리뉴클레오타이드 B와 동일하다는 것은 폴리뉴클레오타이드 서열이 100% 동일(100%의 서열 동일성)하다는 것을 의미한다. 2개의 서열이 예를 들어 "70% 동일"이라고 기재하는 것은 이들을 예를 들어 "70%의 서열 동일성"을 갖는 것으로 기재하는 것과 같다.
예를 들어 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 동일성(퍼센트) 계산은 최적의 비교 목적을 위해 상기 2개의 서열을 정렬시켜 수행할 수 있다(예를 들어 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 2개 모두에 갭(gap)을 도입할 수 있고 비교 목적으로 동일하지 않은 서열은 무시할 수 있다). 특정 양태에서, 비교 목적으로 정렬한 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다. 이후, 대응하는 아미노산 위치의 아미노산을 또는 폴리뉴클레오타이드의 경우에는 염기를 비교한다.
제1 서열 내 특정 위치를 제2 서열 내 해당 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드가 차지하는 경우, 상기 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간 동일성(퍼센트)은 상기 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입할 필요가 있는 갭의 수 및 상기 갭 각각의 길이를 고려하여 상기 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열 비교 및 2개의 서열 간 동일성(퍼센트)의 결정은 수학 알고리즘을 이용하여 이루어질 수 있다.
서로 다른 서열(예를 들어 폴리뉴클레오타이드 서열)을 정렬하기 위해 사용할 수 있는 적합한 소프트웨어 프로그램은 여러 공급처로부터 입수 가능하다. 서열 동일성(퍼센트)을 결정하기 위해 적합한 하나의 프로그램은 미국정부의 국립생명공학정보센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수할 수 있는 BLAST 프로그램 제품군의 일부인 bl2seq이다. bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 2개의 서열 간 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하기 위해 사용되는 반면에, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하기 위해 사용된다. 다른 적합한 프로그램으로는 예를 들어 생물정보학 프로그램 EMBOSS 제품군의 일부이고 또한 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 생물정보학 연구소(EBI)로부터 입수할 수 있는 Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher가 있다.
서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같이 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 기준 서열과 정렬해 있는 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 타겟 서열 내 서로 다른 영역은 각각 이들 자체의 서열 동일성(퍼센트)을 가질 수 있다. 서열 동일성(퍼센트) 값은 가장 가까운 소수점 첫째자리로 반올림/반내림한다는 점에 유의한다. 예를 들어 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 반내림하고 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 반올림한다. 또한 길이 값은 항상 정수일 것이라는 점에 유의한다.
특정 양태에서, 제1 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 제2 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 동일성(퍼센트, %ID)은 %ID = 100 × (Y/Z)로서 계산되는데,여기서 Y는 상기 제1 및 제2 서열의 정렬에 있어서(육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬했을 때) 동일한 일치로서 점수화한 아미노산 잔기(또는 핵염기)의 수이고 Z는 상기 제2 서열 내 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 길면, 상기 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성(퍼센트)은 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성(퍼센트)보다 높을 것이다.
당업자라면 서열 동일성(퍼센트)을 계산하기 위한 서열 정렬의 생성이 1차 서열 데이터에 의해 전적으로 처리되는 이원(binary) 서열-서열 비교에 한정되지 않는다는 점을 이해할 것이다. 또한 서열 데이터를 구조 데이터(예를 들어 결정학적 단백질 구조), 기능 데이터(예를 들어 돌연변이의 위치) 또는 계통 발생 데이터와 같은 이종의 출처(heterogeneous sources)로부터의 데이터와 통합함으로써 서열 정렬이 이루어질 수 있음을 이해될 것이다. 이종의 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 이루게 하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용 가능하고 이와 달리 예를 들어 EBI로부터도 이용 가능한 T-Coffee이다. 또한 서열 동일성(퍼센트)을 계산하기 위해 사용되는 최종 정렬은 자동 또는 수동으로 체계화될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "인트론"은 유전자가 생산하는 단백질의 일부를 코딩하지 않고 세포핵으로부터 내보내기 전에 유전자로부터 전사되는 mRNA로부터 스플라이싱되는 유전자 내 DNA의 부분(개재 서열)을 지칭한다. "인트론 서열"은 인트론의 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 서열은 본 명세서에서 "비번역 핵산 서열"이라고도 한다. 이에 따라 인트론은 코딩 서열(엑손)과 함께 전사되지만 성숙 mRNA가 형성되는 동안 제거되는 DNA 서열의 영역들이다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "인트론 단편"은 전장 EF-1α 인트론 A 서열로부터 유래되는 단편(즉, 예를 들어 서열목록 제1서열에 나타낸 것과 같은 EF-1α의 제1 인트론)을 지칭한다. 상기 단편은 전장 EF-1α 인트론을 제외하는 의미이다. 일부 양태에서, 상기 "인트론 단편"은 EF-1α 인트론 A의 모든 뉴클레오타이드가 결여되어 있는 대응하는 구축물로 달성되는 발현 수준을 초과하는 발현 수준을 달성하는데 필요한 최소수의 뉴클레오타이드 또는 구성을 포함한다. 따라서 본 개시 내용의 인트론 단편(본 명세서에서는 "비번역 핵산 서열"이라고도 함)은 EF-1α 인트론의 단편을 포함하고 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 인트론 단편(즉, 비번역 핵산 서열)은 외래 유전자의 전사를 증가시켜 상기 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 인트론 단편은 비번역 조절 요소일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "단리된", "정제된", "추출된" 및 이들의 문법적 변형 형태들은 호환적으로 사용되며 하나 이상의 정제 과정을 거친 본 개시 내용의 원하는 조성물, 예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 제제의 상태를 지칭한다. 일부 양태에서, 본 명세서에서 사용하는 단리 또는 정제는 오염물을 함유한 샘플로부터 본 개시 내용의 조성물, 예를 들어 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 제거 또는 일부 제거(예를 들어 분획물)하는 과정이다.
일부 양태에서, 단리된 조성물은 검출 가능한 바람직하지 않은 활성을 갖지 않거나 또는 이와 달리 바람직하지 않은 활성의 수준 또는 양이 허용되는 수준 또는 양 이하이다. 다른 양태에서, 단리된 조성물은 허용되는 양 및/또는 농도 및/또는 활성 이상으로 본 개시 내용의 원하는 조성물의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 상기 단리된 조성물은 상기 조성물이 얻어지는 출발 물질에 비해 농축된 것이다. 이러한 농축은 출발 물질에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999%이거나 또는 99.9999%보다 클 수 있다.
일부 양태에서, 단리된 제제에는 실질적으로 잔류 생물학적 산물이 없다. 일부 양태에서, 상기 단리된 제제에는 임의의 생물학적 오염 물질이 100%, 적어도 약 99%, 적어도 약 98%, 적어도 약 97%, 적어도 약 96%, 적어도 약 95%, 적어도 약 95%, 적어도 약 94%, 적어도 약 93%, 적어도 약 92%, 적어도 약 91% 또는 적어도 약 90% 없다. 잔류 생물학적 산물은 비생물적(abiotic) 물질(화학물질 포함) 또는 원치 않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사산물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "연결된(linked)"은 제2 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 각각 공유 또는 비공유 결합된(joined) 제1 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 상기 제1 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 제2 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 직접 결합 또는 병치될 수 있거나, 이와 다르게 개재 서열이 상기 제1 서열을 제2 서열에 공유 결합시킬 수 있다. 용어 "연결된"은 5'-말단 또는 3'-말단에서 제2 폴리뉴클레오타이드 서열에 제1 폴리뉴클레오타이드 서열의 융합(fusion)을 의미할 뿐만 아니라 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 전체 서열(또는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열)을 제2 폴리뉴클레오타이드 서열(또는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열) 내 임의의 2개의 뉴클레오타이드에 각각 삽입하는 것을 포함한다. 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 상기 링커는 예를 들어 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "황반변성"은 황반이 변성되거나 기능적 활성을 상실한 임의의 수의 장애 및 병태를 지칭한다. 상기 변성 또는 기능적 활성의 상실은 예를 들어 세포사멸, 세포 증식 감소, 정상적인 생물학적 기능 상실 또는 이들의 조합의 결과로서 일어날 수 있다. 황반변성은 세포 및/또는 황반의 세포외 기질의 구조적 완전성 변화, 정상 세포 및/또는 세포외 기질 구성의 변화 및/또는 황반 세포의 기능 상실로 이어질 수 있고/또는 이들로서 발현될 수 있다. 상기 세포는 RPE 세포, 광수용체 및/또는 모세혈관 내피 세포를 포함한 황반 내 또는 근방에 정상적으로 존재하는 임의의 세포 유형일 수 있다. 연령-관련 황반변성은 황반변성 중 가장 흔하지만 용어 "황반변성"은 노인이 아닌 환자의 황반변성을 반드시 배제하는 것은 아니다. 황반변성의 비제한적인 예는: 연령-관련 황반변성(습성 또는 건성); 베스트(Best) 황반 이영양증, 소르스비(Sorsby) 안저 이영양증, 말라티아 레벤티네스(Malattia Leventinese), 도인(Doyne) 벌집 모양 망막 이영양증, 스타가르트병(Stargardt disease)(스타가르트 황반 이영양증, 청소년 황반변성 또는 노란점 안저(fundus flavimaculatus)라고도 함) 및 색소 상피 박리 관련 황반변성을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "연령-관련 황반변성"(AMD)은 일반적으로 노인에게 영향을 미치고 망막의 중앙부(즉, 황반) 손상으로 인한 중심시 상실과 관련된 망막병증을 의미한다. AMD는 일반적으로 황반(주로 망막 색소 상피(RPE)와 그 밑에 있는 맥락막 사이) 내 드루젠(아밀로이드 베타와 같은 세포외 단백질 및 지질의 축적)이라고 하는 황색을 띠는 불용성 세포외 침착물의 점진적인 축적 또는 응집을 특징으로 한다. 황반 내 이들 침착물의 축적 또는 응집은 황반을 점차 악화시켜 중심시 손상을 초래할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "황반"은 중앙의 고해상도 색각을 담당하는 망막의 중심부를 의미한다.
산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애 및 염증 과정을 포함한 몇몇 이론들이 제안되었지만 연령-관련 황반변성의 병인은 잘 알려져 있지 않다. 손상된 세포 성분의 생성과 분해 사이의 불균형은 예를 들어 세포내 리포푸신과 세포외 드루젠과 같은 유해 산물의 축적으로 이어진다. 초기 위축은 AMD의 초기 단계에서 지도 모양 위축에 선행하는 망막 색소 상피(RPE) 박층화 또는 탈색의 영역에 의해 구분된다. AMD의 진행 단계에서 RPE의 위축(지도 모양 위축) 및/또는 새로운 혈관의 발달(혈관신생)은 광수용체의 사멸과 중심시 상실을 초래한다. 건성(비삼출성) AMD에서 드루젠이라고 하는 세포 파편이 망막과 맥락막 사이에 축적되어 망막에 위축과 흉터가 생긴다. 더 중증인 습성(삼출성) AMD에서는 혈관이 망막 뒤의 맥락막에서 성장하여(혈관신생) 삼출물과 체액이 누액되고 출혈을 유발할 수도 있다.
존재하는 드루젠의 정도에 따라 AMD는 3개의 주요 단계로 분류될 수 있다: (i) 초기, (ii) 중기 및 (iii) 진행기 또는 후기. 초기 AMD는 여러 개의 작은(예를 들어 직경이 약 63 미크론 미만인) 드루젠 또는 몇 개의 중간 크기의(예를 들어 직경이 약 63 내지 124 미크론인) 드루젠이 존재하는 것을 특징으로 한다. 초기 단계 중에 환자는 시력 상실이 없으면서 분명한 증상이 없다. 중기는 많은 중간 크기의 드루젠 또는 하나 이상의 큰(예를 들어 직경이 약 125 미크론을 초과하는) 드루젠이 존재하는 것을 특징으로 한다. 이 단계 중에 몇몇 환자는 시야 중앙에 흐릿한 반점을 경험하기 시작할 수 있다. 진행기 또는 후기 AMD는 망막 조직의 넓은 면적의 손상으로 중앙의 사각 지대와 결국에는 중심시 상실을 일으키는 것을 특징으로 한다. 손상 유형(예를 들어 혈관신생의 유무)을 토대로 진행기 또는 후기 AMD는 다음과 같은 2개의 하위 유형으로 더 나눌 수 있다: (i) 지도 모양 위축(위축성 AMD라고도 함) 및 (ii) 습성 AMD(신생혈관성 또는 삼출성 AMD라고도 함).
AMD에는 2가지 주요 형태인 (i) 건성 AMD 및 (ii) 습성 AMD가 있다. 달리 특정하지 않는 한, 용어 "연령-관련 황반변성"은 건성 AMD 및 습성 AMD 모두를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "연령-관련 황반변성"은 또한 원인에 관계없이 모든 유형의 연령-관련 황반변성과 연령-관련 황반변성의 임의 및 모든 증상들을 포함한다. 황반변성(예를 들어 연령-관련 황반변성)과 관련한 증상의 비제한적인 예는: 중심시 상실, 왜곡, 조영제 감도 감소, 시야 흐림, 저조도 적응의 어려움, 갑작스런 발병 및 증상의 급속 악화 및 색각 감소를 포함한다. 일부 양태에서, 황반변성(예를 들어 연령-관련 황반변성)은 황반부종(즉, 황반 위 또는 아래에 체액과 단백질 침착물의 포집으로 인한 황반 종창)을 일으킬 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "건성 AMD"(위축성 연령-관련 황반변성 또는 비-삼출성 AMD라고도 함)는 습성(혈관신생성) AMD가 아닌 모든 형태의 AMD를 지칭한다. 이는 초기 및 중기 형태의 AMD뿐만 아니라 지도 모양 위축으로 알려진 진행기 형태의 건성 AMD를 포함한다. 건성 AMD 환자는 더 이른 초기에서 최소 증상을 갖는 경향이 있고; 시각 기능 상실은 증상이 지도 모양 위축으로 진행되는 경우에 더 자주 발생한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "습성 AMD"(혈관신생성 연령-관련 황반변성 또는 삼출성 AMD라고도 함)은 망막 혈관신생의 존재를 특징으로 하는 망막 증상을 지칭하는 것으로, 가장 진행된 형태의 AMD이다. 습성 AMD에서 혈관은 브루크막(Bruch's membrane)의 결함을 통해 맥락막 모세혈관 및 일부의 경우에는 하부의 망막 색소 상피(맥락막 신생혈관 형성 또는 혈관신생)로부터 성장한다. 이들 혈관으로부터 빠져나가는 장액성 또는 출혈성 삼출물의 조직화는 신경망막의 부수적 변성, 망막 색소 상피의 박리 및 파열, 유리체 출혈 및 중심시의 영구 손상과 함께 황반 부위의 섬유 혈관 흉터 생성을 일으킬 수 있다.
용어 "miRNA", "miR" 및 "microRNA"는 호환적으로 사용되며 RNA-기반 유전자 조절에 관여하는 진핵생물에서 발견되는 microRNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 전구체로부터 처리된 단일-가닥 RNA 분자를 지칭하기 위해서 사용될 것이다. 일부 양태에서, 용어 "안티센스 올리고머"는 본 개시 내용의 microRNA 분자를 기술하기 위해서 사용될 수도 있다. 본 개시 내용과 관련이 있는 miRNA 및 이의 서열의 명칭은 본 명세서에 제공되어 있다. microRNA는 불완전한 염기쌍을 통해 타겟 mRNA를 인식하고 상기 타겟 mRNA에 결합하여 상기 타겟 mRNA의 불안정화 또는 번역 저해로 이어짐으로써 타겟 유전자 발현을 하향 조절한다. 반대로, miRNA 결합 부위를 포함하는 분자(일반적으로 miRNA의 시드 영역(seed region)에 상보적인 서열을 포함하는 분자)를 통한 miRNA 타겟화는 miRNA-유도 번역 저해를 감소시키거나 저해하여 타겟 유전자의 상향 조절로 나타날 수 있다.
"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오타이드 서열", "폴리뉴클레오타이드" 및 이들의 문법적 변형 형태들은 호환적으로 사용되며 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오타이드의 서열을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 5'로부터 3' 방향으로 표시되어 있다. 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 분자 또는 리보핵산(RNA) 분자일 수 있다. 뉴클레오타이드 염기는 본 명세서에 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 이노신(I) 및 우라실(U)과 같은 단일 문자 코드로 표시되어 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 원하는 기능을 수행하도록 인접하여 위치함을 의미한다. 예를 들어, 특정 프로모터가 코딩 서열(예를 들어 외래 유전자)의 전사를 개시하는 데 도움을 주는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 영역과 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한은 프로모터와 코딩 영역이 반드시 인접하여 위치할 필요는 없다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체", "약제학적으로 허용되는 부형제" 및 이들의 문법적 변형 형태들은 미국연방정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 인간을 포함한 동물에서 사용하기 위해 미국 약전에 등재된 모든 제제들 뿐 아니라 대상에 조성물 투여를 못하게 할 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 발생을 일으키지 않고 투여된 복합체의 생물학적 활성 및 특성을 없어지게 하지 않는 모든 담체 또는 희석제를 포함한다. 약제학적 조성물을 제조하는데 유용하고 일반적으로 안전하고 무독성이며 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "약제학적 조성물"은 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제와 같은 하나 이상의 다른 화학 성분과 혼합 또는 섞거나 상기 화학 성분에 현탁된 본 명세서에 기재된 조성물들(예를 들어 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 및/또는 재조합 바이러스) 중 하나 이상을 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "프로모터" 및 "프로모터 서열"은 호환적인 것으로 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치해 있다. 프로모터는 전체가 천연 유전자로부터 유래되거나 자연에서 발견되는 서로 다른 프로모터로부터 유래된 서로 다른 요소들로 구성될 수 있거나 또는 나아가 합성 DNA 부분을 포함할 수도 있다. 당업자라면 서로 다른 프로모터가 서로 다른 조직 또는 세포 유형에서 또는 서로 다른 발생 단계에서 또는 서로 다른 환경 또는 생리적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 점을 이해한다. 대부분의 숙주 세포 유형에서 유전자가 대부분 발현되도록 하는 프로모터를 통상적으로 "구성적(constitutive) 프로모터"라고 한다. 특정 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"라고 한다. 특정 발생 또는 세포 분화 단계에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "발생-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"라고 한다. 프로모터를 유도하는 작용제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 빛 등으로 세포를 노출 또는 처리한 후 유도되고 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절성 프로모터"라고 한다. 또한 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되어 있는 것은 아니었기 때문에 서로 다른 길이의 DNA 단편들은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인식되어 있다.
상기 프로모터 서열은 전형적으로 그의 3' 말단에서 전사 개시 부위와 경계를 이루고 배경 이상의 검출 가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 최소수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 방향(5' 방향)으로 연장되어 있다. 상기 프로모터 서열 내에는 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(공통 서열) 뿐 아니라 전사 개시 부위(예를 들어 뉴클레아제 S1과 맵핑에 의해 편리하게 정의됨)도 발견될 것이다. 일부 양태에서, 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 프로모터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "유전자 조절 영역" 또는 "조절 영역"은 코딩 영역의 상류(5' 비코딩 서열), 내에 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치하여 관련 코딩 영역의 전사, RNA 처리, 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 부위, 이펙터 결합 부위 또는 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현용으로 의도된 경우에, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)는 프로모터 및/또는 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 연관된 다른 발현(예를 들어 전사) 조절 요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 연관에 있어서, 유전자 산물을 위한 코딩 영역은 상기 유전자 산물의 발현이 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 놓이도록 하는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 연관된다. 예를 들어 코딩 영역과 프로모터는 프로모터 기능의 유도가 상기 코딩 영역에 의해 코딩되는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA의 전사를 일으키고 상기 프로모터와 코딩 영역 간 연결 특성이 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우에 "작동 가능하게 연관된다". 프로모터 외 다른 발현 조절 요소들, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 또한 유전자 산물 발현을 지시하는 코딩 영역과 작동 가능하게 연관될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "대상", "환자", "개체" 및 "숙주" 및 이들의 변이체는 호환 가능하며 본 명세서에 기재된 조성물들(예를 들어 폴리뉴클레오타이드, 재조합 발현 구축물, 세포, 약제학적 조성물 또는 재조합 바이러스) 중 임의의 조성물이 투여되는 임의의 포유류 대상을 지칭한다. 비제한적인 예로는 진단, 처치 또는 치료가 필요한 인간, 가축(예를 들어 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물(예를 들어 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그 등), 특히 인간을 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간의 치료 및 수의학적 용도 모두에 적용 가능하다.
본 명세서에서 사용하는 문구 "필요로 하는 대상"은 본 명세서에 기재된 조성물의 투여 이익이 있을 포유류 대상과 같은 대상을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료 유효량"은 필요로 하는 대상에 대해 원하는 치료 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻기에 충분한 본 개시 내용의 조성물(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드)을 포함하는 시약 또는 악제학적 복합체의 양이다. 치료 유효량은 예방을 치료로 볼 수 있기 때문에 "예방 유효량"일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "외래 유전자"는 재조합 발현 구축물에서 코딩되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역의 발현 산물, 폴리펩타이드 또는 다중-폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 촉진 또는 조절 핵산을 지칭한다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 삽입(또는 형질도입)되는 세포에 이종(즉, 세포에서 자연적으로 발현되지 않는 것)일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 예를 들어 질환 또는 병태의 중증도 감소, 질환 경과 기간의 감소, 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 개선 또는 제거, 질환 또는 병태를 반드시 치유하지 않고도 질환 또는 병태가 있는 대상에게 유익한 효과를 제공하는 것을 지칭한다. 상기 용어는 또한 질환 또는 병태 또는 이의 증상을 예방 또는 방지하는 것을 포함한다.
용어 "상류"는 기준 뉴클레오타이드 서열에 대해 5'에 위치해 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "벡터" 또는 "구축물"은 핵산 또는 유전자가 삽입될 수 있는 임의의 비히클(vehicle), 예를 들어 핵산 서열이 삽입되어 복제될 수 있는 세포 내 도입될 수 있는 전달 비히클을 지칭한다. 벡터 내로 삽입될 수 있는 상기 핵산 서열은 외생 또는 이종일 수 있다. 상기 핵산 서열은 외래 유전자일 수 있다. 구축물의 예는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들어 AAV)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 상기 벡터 또는 구축물을 제작할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등). 본 명세서에서 사용하는 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물"은 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한 벡터 또는 구축물을 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 구축물에는 다양한 조절요소를 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절 서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 다른 기능도 제공하는 뉴클레오타이드 서열도 포함될 수 있다.
벡터는 상기 벡터를 혼입한 세포의 선택 또는 식별을 위해 제공되는 선택성 마커 또는 리포터를 코딩하도록 조작될 수 있다. 선택성 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 포함된 다른 코딩 영역을 통합 및 발현하는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 가능하게 한다. 당업계에 공지되어 있고 사용하고 있는 선택성 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 바이알라포스 제초제, 설폰아미드 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라아제 유전자 등을 포함한다. 당업계에 공지되어 있고 사용하고 있는 리포터의 예는 루시퍼라아제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-갈락토시다아제(LacZ), β-글루쿠로니다아제(Gus) 등을 포함한다. 선택성 마커는 리포터인 것으로 볼 수도 있다.
II. 폴리뉴클레오타이드
II.A. 비번역 핵산 서열
본 개시 내용은 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 비번역 핵산 서열이 번역시 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 명세서는 전장 EF-1α 인트론보다 짧은 신장 인자-1 알파(EF-1α) 인트론 서열을 제공한다.
신장 인자 1 알파(EF-1α)는 6번 염색체에 위치해 있는 유전자이다(GenBank 수탁번호 NC_000006.12의 73,489,308번째 내지 73,525,587번째 뉴클레오타이드; 음성 가닥 방향). EF-1α 유전자는 8개의 엑손과 7개의 인트론을 포함하고 mRNA 번역에 중요한 역할을 하는(예를 들어 아미노아실-tRNA를 삼원 복합체 eEF1A1-GTP-aa-tRNA로서 리보솜의 A 부위로 운반하는) 진핵생물 신장 인자 1A(eEF1A1 및 eEF1A라고도 알려짐) 단백질을 코딩한다. Scaggiante et al., Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 19(4): 256-265(2015년 3월)를 참조할 것. 상기 전장 EF-1α 인트론의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열(924개 뉴클레오타이드 길이)에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편 서열)은 전장 EF-1α 인트론(또는 당업계에 공지되어 있는 그 밖의 다른 인트론)에 비해 뚜렷한 이점을 제공한다. 예를 들어 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 전장 EF-1α 인트론보다 외래 유전자의 발현을 더 크게 증가시킬 수 있다. 또한 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열이 전장의 대응물보다 더 짧기 때문에, 일부 양태에서, 이들을 더 큰 외래 유전자와 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어 AAV 캡시드(본 명세서에 기재된 것들과 같은)는 최대 약 4.7 kb의 핵산을 수용할 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 유전자 발현을 훨씬 더 증가시키기 위해 더 큰 외래 유전자 및/또는 추가 시스-요소(cis-elements)를 본 명세서에 기재된 EF-1α 인트론 단편(즉, 비번역 핵산 서열)과 통합할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열의 874번째 내지 924번째 위치의 뉴클레오타이드를 포함하지만 서열목록 제1서열은 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 874 번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진다. 일부 양태에서, 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 874 번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 이루어진다. 이러한 EF-1α 인트론 단편은 본 명세서에서 "T3.2 단편"이라고도 하며 서열목록 제57서열에 나타나 있다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖되, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하지만 서열목록 제1서열을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진다. 일부 양태에서, 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 이루어진다. 이러한 EF-1α 인트론 단편은 본 명세서에서 "T3.1.2 단편"이라고도 하고 서열목록 제3서열에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖되, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하지만 서열목록 제1서열을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어진다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드로 이루어진다. 이러한 EF-1α 인트론 단편은 본 명세서에서 "T3.1.1 단편"이라고도 하고 서열목록 제2서열에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖되, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열을 포함하지 않는다.
본 개시 내용으로부터 명백한 바와 같이, 상술한 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째, 852번째 내지 924번째 및 830번째 내지 924번째 위치 - 즉, 각각 서열목록 제57서열, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제2서열) 외에도, 일부 양태에서, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 것과 같이 5' 영역에 EF-1α 인트론 서열의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 양태에서, 상기 5' 영역에 추가된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째, 852번째 내지 924번째 또는 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드의 상류의 어디에라도 추가될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 5' 영역에 추가된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 전장 EF-1α 인트론 서열, 즉 서열목록 제1서열로부터 유래된다. 일부 양태에서, 상기 5' 영역 및/또는 3' 영역에 추가된 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 전장 EF-1α 인트론 서열, 즉 서열목록 제1서열에 이종인 임의의 서열로부터 유래된다.
따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 873번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 추가로 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; "T3.2 단편"; 서열목록 제57서열).
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 870번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제58서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 870번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 870번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 870번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 870번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 860번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제59서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 860번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 860번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 860번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 860번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 851번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제60서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 851번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 851번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 851번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 851번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 850번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제61서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 850번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 850번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 850번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 850번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 829번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제2서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 829번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 829번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 829번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 829번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 820번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제63서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 820번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 820번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 820번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 820번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 810번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제64서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 810번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 810번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 810번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 810번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 807번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제65서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 807번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 807번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 807번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 807번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 800번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 801번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제66서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 800번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 800번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 800번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 800번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 750번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 751번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제67서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 750번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 750번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 750번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 750번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 720번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제68서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 720번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 720번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 720번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 720번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 700번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 701번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제69서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 700번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 700번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 700번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 700번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 650번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 651번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제70서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 650번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 650번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 650번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 650번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 600번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 601번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제71서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 600번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 600번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 600번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 600번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 569번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제72서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 569번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 569번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 569번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 569번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 550번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 551번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제73서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 550번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 550번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 550번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 550번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열에 나타낸 서열 내 1번째 내지 500번째 위치의 뉴클레오타이드로부터 유래된 임의의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다(결과적으로 서열목록 제1서열의 501번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어진 EF-1α 인트론 단편; 즉 서열목록 제74서열). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 1번째 내지 500번째 뉴클레오타이드 위치 내로부터 유래된 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 단 상기 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 500번째 뉴클레오타이드 위치의 전체 길이는 아니다(예를 들어 서열목록 제1서열의 1번째 내지 500번째 뉴클레오타이드보다 짧다). 일부 양태에서, 이러한 비번역 핵산 서열은 상기 비번역 핵산 서열의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 하나 이상의 서로 다른 유형의 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제1서열의 1번째 내지 500번째 뉴클레오타이드 위치로부터 유래되지 않은 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열은 (i) 서열목록 제1서열의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제58서열), (ii) 서열목록 제1서열의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제59서열), (iii) 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제60서열), (iv) 서열목록 제1서열의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제61서열), (v) 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제2서열), (vi) 서열목록 제1서열의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제63서열), (vii) 서열목록 제1서열의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제64서열), (viii) 서열목록 제1서열의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제65서열), (ix) 서열목록 제1서열의 801번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제66서열), (x) 서열목록 제1서열의 751번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제67서열), (xi) 서열목록 제1서열의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제68서열), (xii) 서열목록 제1서열의 701번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제69서열), (xiii) 서열목록 제1서열의 651번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제70서열), (xiv) 서열목록 제1서열의 601번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제71서열), (xv) 서열목록 제1서열의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제72서열), (xvi) 서열목록 제1서열의 551번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제73서열) 또는 (xvii) 서열목록 제1서열의 501번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제74서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 871번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제58서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제59서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제60서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제61서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제2서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제63서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제64서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제65서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 801번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제66서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 751번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제67서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제68서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 701번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제69서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 651번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제70서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 601번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제71서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제72서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 551번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제73서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 501번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제74서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다.
상기 개시 내용으로부터 명백한 바와 같이, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 5' 말단("5' 영역")에 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 3' 말단("3' 영역")에 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 5' 말단("5' 영역")과 3' 말단("3' 영역") 모두에 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 상기 비번역 핵산 서열의 5' 영역에 서열목록 제1서열 내 1번째 내지 873번째 위치에 해당하는 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
II.B. 외래 유전자
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 외래 유전자를 더 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 것으로, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어지지만 서열목록 제1서열은 포함하지 않는다(예를 들어 서열목록 제57서열). 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 것으로, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어지지만 서열목록 제1서열은 포함하지 않는다(예를 들어 서열목록 제3서열). 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 것으로, 상기 비번역 핵산 서열은 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드를 포함하거나 상기 뉴클레오타이드로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드로 이루어지지만 서열목록 제1서열은 포함하지 않는다(예를 들어 서열목록 제2서열).
본 개시 내용에 유용한 외래 유전자는 상기 외래 유전자가 세포에 형질도입시 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 따라서 임의의 적합한 관심있는 외래 유전자를 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열에서 사용할 수 있다. 일부 양태에서, 외래 유전자는 폴리펩타이드(또는 이의 임의의 변이체), 융합 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, RNA-기반 분자(예를 들어 miRNA, shRNA, 라이보자임, siRNA) 또는 이들의 임의의 조합을 코딩한다.
일부 양태에서, 외래 유전자는 본 명세서에 기재된 것들과 같은 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질을 코딩한다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 대상 또는 환자의 신체 내에서 지속적인 발현을 목적으로 하는, 특정 질환의 치료용 펩타이드를 코딩한다. 일부 양태에서, 외래 유전자는 서열목록 제23서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 외래 유전자는 융합 단백질을 코딩하되, 상기 융합 단백질은 혈관 내피세포 성장 인자("VEGF")의 저해제이다. 일부 양태에서, 상기 VEGF의 저해제는 애플리버셉트(EYLEA® 및 ZALTRAP®)를 포함한다.
II.C. 조절 요소
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 조절 요소를 더 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (1) 조절 요소, (2) 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "조절 요소"는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 조절하는(예를 들어 증가 또는 감소시키는) 핵산 서열을 지칭한다. 본 개시 내용에 유용한 조절 요소는 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 또는 β-액틴 프로모터), 엑손(예를 들어 엑손 1 또는 엑손 2), 스플라이싱 공여체 서열, 수용체 서열 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조절 요소는 전사 종결을 위한 서열(예를 들어 poly A), 외래 유전자를 안정적으로 발현시키기 위한 서열(예를 들어 WPRE 서열), 외래 유전자-특이적 면역의 발생을 감소시키기 위한 서열(예를 들어 miRNA 타겟 서열) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
II.C.1. 인핸서
일부 양태에서, 상기 조절 요소는 인핸서이다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 인핸서, (2) 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서, (2) 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자를 포함한다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 인핸서를 본 개시 내용에서 사용할 수 있다. 적합한 인핸서의 비제한적인 예로는: 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, SV40 초기 인핸서, 아데노바이러스 5 E1A 인핸서, HBV 인핸서-1 조절 영역(Eh-1), HPV-16 또는 -18 E6/7 긴 조절 영역(LCR), HIV-1 긴 반복말단(LTR) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인핸서는 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서이다. 일부 양태에서, 상기 CMV 인핸서는 서열목록 제4서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서는 서열목록 제4서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.2. 프로모터
일부 양태에서, 상기 조절 요소는 프로모터이다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 프로모터, (2) 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 프로모터, (2) 비번역 핵산 서열 및 (3) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 조절 요소는 인핸서 및 프로모터 2개 모두를 포함한다. 이러한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 인핸서, (2) 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서, (2) 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함한다. 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 프로모터를 본 개시 내용에서 사용할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF-1α 프로모터, β-액틴 프로모터, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 70-kDa 열 충격 단백질(HSP70) 프로모터, 78-kDa 포도당-조절 단백질(GRP78) 프로모터, 진핵생물 개시 인자-4A(eIF4a) 프로모터, 알파-1-항트립신(AAT) 프로모터, 트랜스티레틴(TTR) 프로모터, 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 원숭이 공포 바이러스 40(SV40) 프로모터의 초기 프로모터, 시냅신 I(SYN1) 프로모터, G 단백질-결합 수용체 키나아제(GRK) 프로모터, 로돕신(Rho) 프로모터 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에 유용한 프로모터는 CMV 프로모터이다. 따라서 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) CMV 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CMV 프로모터는 서열목록 제5서열 또는 제6서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CMV 프로모터는 서열목록 제5서열 또는 제6서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 프로모터는 EF-1α 프로모터이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) EF-1α 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α 프로모터는 서열목록 제7서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α 프로모터는 서열목록 제7서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 프로모터는 β-액틴 프로모터이다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) β-액틴 프로모터, (3) 비번역 핵산 서열 및 (4) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 β-액틴 프로모터는 서열목록 제8서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 β-액틴 프로모터는 서열목록 제8서열에 나타낸 것과 같은 치킨 β-액틴 프로모터이다.
본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이(도 4A 참조), 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)는 다중 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CMV 프로모터 및 EF-1α 프로모터 2개 모두를 포함한다. 이러한 양태에서, 상기 CMV 프로모터는 서열목록 제5서열에 나타낸 서열(즉, 서열목록 제6서열의 5'-말단으로부터의 처음 31개의 뉴클레오타이드)과 같이 전장 CMV 프로모터의 일부일 수 있다.
II.C.3. 스플라이싱 공여체 서열
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(즉, 비번역 핵산 서열을 포함)는 스플라이싱 공여체 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "스플라이싱 공여체 서열" 또는 "스플라이싱 공여체 부위"는 인트론(예를 들어 EF-1α 인트론)의 5'-말단에 존재하는 구아닌-티민(GT)이 풍부한 도메인을 지칭한다(인트론과 엑손 사이의 경계를 암시함). 본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이, 이러한 서열은 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열을 생성하도록 타겟화될 수 있다. 일부 양태에서, 스플라이싱 공여체 서열은 EF-1α 인트론 단편(즉, 비번역 핵산 서열)의 상류에 연결된다. 예를 들어 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 (특정 순서 없이) (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) 스플라이싱 공여체 서열, (4) 비번역 핵산 서열 및 (5) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) 스플라이싱 공여체 서열, (4) 비번역 핵산 서열 및 (5) 외래 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에 유용한 스플라이싱 공여체 서열은 서열목록 제9서열 또는 서열목록 제10서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 스플라이싱 공여체 서열은 서열목록 제9서열 또는 제10서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.4. 엑손 서열
본 명세서에서 입증하고 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 엑손 서열을 더 포함한다. 예를 들어 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 다음과 같은 특징부를 포함한다(특정 순서 없이): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) 스플라이싱 공여체 서열, (4) 비번역 핵산 서열, (5) EF-1α E2 서열 및 (6) 외래 유전자. 일부 양태에서, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) 스플라이싱 공여체 서열, (4) 비번역 핵산 서열, (5) EF-1α E2 서열 및 (6) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E2 서열은 서열목록 제11서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E2 서열은 서열목록 제11서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 하나 이상의 엑손 서열은 사이토메갈로바이러스(CMV), EF-1α 또는 β-액틴 엑손 1(E1) 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 E1 및 E2 서열 2개 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β-액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열 및 (7) 외래 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β-액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열 및 (7) 외래 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 E1 서열은 CMV E1 서열이다. 일부 양태에서, 상기 CMV E1 서열은 서열목록 제12서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 CMV E1 서열은 서열목록 제12서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 E1 서열은 EF-1α E1 서열이다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E1 서열은 서열목록 제13서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 EF-1α E1 서열은 서열목록 제13서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 E1 서열은 β-액틴 E1 서열이다. 일부 양태에서, 상기 β-액틴 E1 서열은 서열목록 제14서열 또는 제15서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 β-액틴 E1 서열은 서열목록 제14서열 또는 제15서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.5. miRNA 타겟 서열
본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 조절 요소는 면역세포에 특이적인 microRNA(miRNA)에 대한 하나 이상의 타겟 서열("miRNA 타겟 서열")을 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 다음과 같은 특징부를 포함한다(특정 순서 없이): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β-액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자 및 (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β-액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자 및 (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 miRNA 타겟 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 miRNA에 대한 상기 타겟 서열의 수는 약 2 내지 약 6개(예를 들어 2 내지 6개)이다. 일부 양태에서, 상기 다중 miRNA 타겟 서열들은 동일하다. 일부 양태에서, 상기 다중 miRNA 타겟 서열들 중 하나 이상은 서로 다르다.
본 개시 내용으로부터 명백한 바와 같이, 하나 이상의 miRNA 타겟 서열을 포함하면 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 특이성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어 특정 세포 유형(예를 들어 면역세포)에서 상기 외래 유전자의 저해가 바람직할 때, 면역세포에 특이적인 miRNA에 대한 타겟 서열을 사용하여 면역세포 내에서 외래 유전자의 발현을 억제할 수 있으며, 그 결과 면역세포에 의한 외래 유전자-특이적 면역의 발생을 차단할 수 있다. 따라서 서로 다른 miRNA 타겟 서열들을 사용함으로써 서로 다른 세포/조직에서 외래 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 miRNA 타겟 서열을 본 개시 내용에서 사용할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 miRNA 타겟 서열은 miR142-3p 또는 miR142-5p에 특이적이다. 일부 양태에서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열은 miR142-3p 또는 miR142-5p의 전장 또는 일부 서열에 상보적인 서열을 가진 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어, 소헤어핀 RNA(shRNA) 분자, 소방해 RNA(siRNA) 분자, 라이보자임, 펩타이드 핵산(PNA) 올리고뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합들로부터 선택된다.
일부 양태에서, 상기 miRNA 타겟 서열은 서열목록 제16서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 miRNA 타겟 서열은 서열목록 제17서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 miRNA 타겟 서열은 서열목록 제16서열 또는 서열목록 제17서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.6. WPRE 서열
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(즉, 비번역 핵산 서열을 포함)는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE) 서열을 더 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β-액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자, (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열 및 (9) WPRE 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β-액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자, (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열 및 (9) WPRE 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 WPRE 서열은 서열목록 제18서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 WPRE 서열은 서열목록 제18서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
II.C.7. 폴리아데닐화 서열
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(즉, 비번역 핵산 서열을 포함)는 하나 이상의 폴리아데닐화(pA) 서열을 더 포함한다. 따라서 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (특정 순서 없이) (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴 프로모터), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β-액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자, (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열, (9) WPRE 서열 및 (10) 하나 이상의 pA 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 인핸서(예를 들어 CMV 인핸서), (2) 프로모터(예를 들어 CMV 프로모터, EF-1α 프로모터 및/또는 β-액틴), (3) E1 서열(예를 들어 CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 및/또는 β-액틴 E1 서열), (4) 스플라이싱 공여체 서열, (5) 비번역 핵산 서열, (6) EF-1α E2 서열, (7) 외래 유전자, (8) 하나 이상의 miRNA 타겟 서열, (9) WPRE 서열 및 (10) 하나 이상의 pA 서열을 포함한다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 pA 서열을 본 개시 내용에서 사용할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리아데닐화 서열의 예는 인간 성장 호르몬(hGH) pA 서열, 소 성장 호르몬(bGH) pA 서열, 원숭이 공포 바이러스 40(SV40) 초기 pA 서열 및 SV40 후기 pA 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열목록 제19서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열목록 제20서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열목록 제21서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 pA 서열은 서열목록 제22서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 상기 폴리아데닐화 서열은 서열목록 제19서열 내지 제22서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상술한 바와 같이, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 (i) 외래 유전자(예를 들어 서열목록 제23서열) 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하되, 상기 조절 요소는 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 서열목록 제4서열에 나타낸 CMV 인핸서 서열, (2) 서열목록 제5서열 또는 제6서열에 나타낸 CMV 프로모터 서열, 서열목록 제7서열에 나타낸 EF-1α 프로모터 서열 또는 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열, (3) 서열목록 제12서열에 나타낸 CMV E1 서열, 서열목록 제13서열에 나타낸 EF-1α E1 서열 또는 서열목록 제14서열 또는 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 E1 서열, (4) 서열목록 제9서열 또는 제10서열에 나타낸 스플라이싱 공여체 서열, (5) 서열목록 제2서열, 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 EF-1α 인트론 단편 서열(즉, 비번역 핵산 서열) 및 (6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α E2 서열을 포함한다.
III. 벡터
일부 양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함) 중 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 제공한다. 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 이러한 벡터는 숙주 세포 및 치료적 개입을 타겟으로 하는 세포에서 재조합 발현에 유용하다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 전달에 유용한 벡터(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)는 바이러스 벡터를 포함한다. 본 개시 내용에서 벡터로 사용할 수 있는 바이러스의 예는 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 백시니아 바이러스, 랍도바이러스, 아데노바이러스, 헬퍼-의존적 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 배큘로바이러스 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 양태에서, 본 개시 내용에서 사용될 수 있는 벡터는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 벡터의 비제한적인 예는 플라스미드, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리오파지 및 이들의 조합을 포함한다.
III.A. 아데노-연관 바이러스(AAV)
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)는 AAV를 사용하여 예를 들어 세포로 전달된다. 단일 가닥 DNA 바이러스로서 아데노-연관 바이러스(AAV)는 헬퍼-의존적 인간 파보바이러스이다. 상기 AAV 게놈은 약 4.7 kbp의 크기를 가지며 바이러스 복제와 바이러스 유전자의 발현에 관여하는 rep 유전자를 코딩하는 N-말단, 상기 바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 cap 유전자를 코딩하는 C-말단 및 각 말단에 약 145개의 염기가 삽입된 역반복말단(ITR)으로 이루어진다. 상기 145 bp 역반복말단(ITR)은 T자 모양의 구조를 갖고, 바이러스 유전체 복제시 복제원점의 기능을 하며, 1차적인 패키징 신호로 작용한다. 상기 ITR은 재조합 AAV(rAAV) 구축물을 만들 때 유일하게 필요한 시스 작용(cis-acting) 염기서열이다. 상기 IRT은 Rep 단백질 존재 하에서는 인핸서 활성을 갖지만, Rep 단백질이 없을 때에는 매우 약한 활성을 갖는다. 재조합 AAV 구축물에 외래 유전자를 클로닝할 때 이들 특징을 고려하여 인핸서, 프로모터, pA 등을 적절히 구성하여 발현 구축물을 제작한다(RJ Samulski and N Muzyczka, Annu. Rev. Virolo. 2014. 1:427-451). 4개의 단백질이 rep 유전자로부터 번역된다. 이들 단백질은 그 분자량에 따라 rep78, rep68, rep52 및 rep40으로 구분되며, AAV DNA 복제에 중요한 기능을 수행한다. cap 유전자로부터는 4개의 단백질이 번역된다. 이중, VP1, VP2, VP3 단백질은 AAV 입자를 구성하는 구조단백질들이며, 조립-활성화 단백질(AAP, assembly-activating protein)은 상기 구조단백질들에 의한 AAV 입자의 형성(assembly)을 촉진한다. 아데노-연관 바이러스의 효율적 복제를 위해 아데노바이러스 혹은 헤르페스 심플렉스 바이러스 같은 헬퍼 바이러스로부터 유래한 일부 단백질들 및 RNA들을 필요로 한다(Muzyczka N. Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129, 1992).
AAV는 세포에 외래 DNA를 전달하기 위한 벡터로서 매력적이게 하는 독특한 특징을 가지고 있다. 배양물에서 세포의 AAV 감염은 일반적으로 비세포변성이었고, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 무증후성이면서 무증상이다. 나아가 AAV는 서로 다른 유형의 많은 포유류 세포를 감염시켜 생체내 서로 다른 많은 조직들을 표적으로 할 가능성이 있다. AAV는 또한 다른 형태의 유전자 전달에 비해 약한 면역 반응을 촉진하고 분열 및 정지 세포 모두에서 비통합 에피솜 벡터 DNA(non-integrating, episomal vector DNA)를 기반으로 지속 발현하는 것을 포함하여 유전자 전달을 위한 특히 매력적인 바이러스 시스템이게 하는 추가 장점을 갖고 있다. 또한 AAV는 아데노바이러스를 비활성화하는 데 사용되는 조건(수 시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 견디므로 rAAV-기반 백신의 저온 보존은 그다지 중요하지 않게 된다.
본 개시 내용에서 사용할 수 있는 아데노-연관 바이러스의 유형 또는 혈청형은 AAVrh.10(AAVrh10), AAV-DJ(AAVDJ), AAV-DJ8(AAVDJ8), AAV1, AAV2, AAV2G9, AAV3, AAV3a, AAV3b, AAV3-3, AAV4, AAV4-4, AAV5, AAV6, AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, AAV7, AAV7.2, AAV8, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV16.3, AAV24.1, AAV27.3, AAV42.12, AAV42-1b, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAV1-7/rh.48, AAV1-8/rh.49, AAV2-15/rh.62, AAV2-3/rh.61, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3-9/rh.52, AAV3-11/rh.53, AAV4-8/r11.64, AAV4-9/rh.54, AAV4-19/rh.55, AAV5-3/rh.57, AAV5-22/rh.58, AAV7.3/hu.7, AAV16.8/hu.10, AAV16.12/hu.11, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV106.1/hu.37, AAV114.3/hu.40, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV161.10/hu.60, AAV161.6/hu.61, AAV33.12/hu.17, AAV33.4/hu.15, AAV33.8/hu.16, AAV52/hu.19, AAV52.1/hu.20, AAV58.2/hu.25, AAVA3.3, AAVA3.4, AAVA3.5, AAVA3.7, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAVF3, AAVF5, AAVH2, AAVrh.72, AAVhu.8, AAVrh.68, AAVrh.70, AAVpi.1, AAVpi.3, AAVpi.2, AAVrh.60, AAVrh.44, AAVrh.65, AAVrh.55, AAVrh.47, AAVrh.69, AAVrh.45, AAVrh.59, AAVhu.12, AAVH6, AAVLK03, AAVH-1/hu.1, AAVH-5/hu.3, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG-9/hu.39, AAVN721-8/rh.43, AAVCh.5, AAVCh.5R1, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5R1, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAVhu.1, AAVhu.2, AAVhu.3, AAVhu.4, AAVhu.5, AAVhu.6, AAVhu.7, AAVhu.9, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.13, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.17, AAVhu.18, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44R1, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48R1, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.14/9, AAVhu.t19, AAVrh.2, AAVrh.2R, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.46, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.61, AAVrh.64, AAVrh.64R1, AAVrh.64R2, AAVrh.67, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh8R, AAVrh8R A586R 변이체, AAVrh8R R533A 변이체, AAAV, BAAV, 염소 AAV, 소 AAV, AAVhE1.1, AAVhEr1.5, AAVhER1.14, AAVhEr1.14, AAVhEr1.8, AAVhEr1.16, AAVhEr1.18, AAVhEr1.35, AAVhEr1.7, AAVhEr1.36, AAVhEr2.29, AAVhEr2.4, AAVhEr2.16, AAVhEr2.16, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhER1.23, AAVhEr3.1, AAV2.5T, AAV-PAEC, AAV-LK01, AAV-LK02, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV-LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK16, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV-LK19, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC8, AAV-PAEC11, AAV-PAEC12, AAV-2-pre-miRNA-101, AAV-8h, AAV-8b, AAV-h, AAV-b, AAV SM 10-2, AAV Shuffle 100-1, AAV Shuffle 100-3, AAV Shuffle 100-7, AAV Shuffle 10-2, AAV Shuffle 10-6, AAV Shuffle 10-8, AAV Shuffle 100-2, AAV SM 10-1, AAV SM 10-8, AAV SM 100-3, AAV SM 100-10, B P61 AAV, B P62 AAV, B P63 AAV, AAVrh.50, AAVrh.43, AAVrh.62, AAVrh.48, AAVhu.19, AAVhu.11, AAVhu.53, AAV4-8/rh.64, AAVLG-9/hu.39, AAV54.5/hu.23, AAV54.2/hu.22, AAV54.7/hu.24, AAV54.1/hu.21, AAV54.4R/hu.27, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV128.1/hu.43, true type AAV(ttAAV), UPENN AAV 10 및 일본 AAV 10 혈청형을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 양태에서, 상기 아데노-연관 바이러스의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh10이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV2이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV5이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV8이다. 일부 양태에서, 상기 AAV의 혈청형은 AAV9이다.
III.B. 비-AAV 벡터
본 명세서는 또한 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)를 포함하는 비-AAV 벡터를 제공한다.
일부 양태에서, 상기 벡터는 플라스미드, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리오파지 또는 진핵생물 바이러스 DNA일 수 있다. 상술한 AAV 벡터 외에도, 단백질 발현에 유용한 것으로서 당업계에 공지되어 있는 다수의 다른 벡터 백본(vector backbone)을 사용할 수 있다. 이러한 벡터에는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 원숭이 바이러스 40(SV40), 사이토메갈로바이러스(CMV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 및 몰로니 쥐 백혈병 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 한 부류의 벡터는 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스 또는 셈리키 포레스트 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 포함한다. 이러한 벡터들은 상업적으로 얻을 수 있거나 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 기재된 서열들로부터 조립될 수 있다.
본 명세서에 기재된 AAV 벡터에 관한 특정 개시 내용을 비-AAV 벡터에 동등하게 적용할 수 있다는 점은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 달리 표시하지 않는 한, 용어 "벡터"는 AAV 및 비-AAV 벡터를 모두 포함한다.
IV. 세포
일부 양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 비번역 핵산 서열을 포함) 중 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 제공한다. 예를 들어 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 외래 유전자 및 외래 유전자 발현용 비번역 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 구축물로 형질도입, 형질감염 또는 형질전환된다.
어느 하나의 이론에 구속되지 않는 것은 아니지만, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포(예를 들어 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입됨)는 본 명세서에 기재된 외래 유전자에 의해 코딩되는 것(예를 들어 VEGF 저해제)과 같은 단백질을 생산하기 위해 유용하다. 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열(즉, EF-1α 인트론 단편)은 세포에서 상기 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질("코딩된 단백질")의 발현을 향상시킬 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포(예를 들어 외래 유전자 및 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입됨)는 기준 세포에 비해 상기 코딩된 단백질의 더 큰 발현을 일으킨다. 일부 양태에서, 상기 기준 세포는 해당 폴리뉴클레오타이드로 형질도입되지만 비번역 핵산 서열이 결여되어 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 시험관내에서 상기 외래 유전자에 의해 코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 특정 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 생체내에서(예를 들어 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 투여받은 대상에서) 코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 세포는 시험관내 및 생체내 모두에서 코딩된 단백질을 생산할 수 있다.
일부 양태에서, (예를 들어 시험관내에서) 외래 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 생산하기 위해 사용할 수 있는 세포는 숙주 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "숙주 세포"는 상기 발현 구축물(예를 들어, 벡터)로 형질도입되어 발현 구축물을 복제하거나 발현 구축물에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 생물의 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "형질도입"은 형질감염과 형질전환을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 숙주 세포는 상기 발현 구축물에 의해 형질도입, 형질감염 또는 형질전환될 수 있다. 이 과정은 외생의 핵산분자가 숙주 세포 내에 전달되거나 도입되는 것을 의미한다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 트랜스제닉 포유동물 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 양태에서, 상기 원핵 세포는 박테리아 세포이다.
일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포이다. 일부 양태에서, 상기 곤충 세포는 Sf9이다. 일부 양태에서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 포유동물 세포의 비제한적 예는 HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, HepG2, Hep3B, Huh-7, C8D1a, Neuro2A, CHO, MES13, BHK-21, COS7, COP5, A549, MCF-7, HC70, HCC1428, BT-549, PC3, LNCaP, Capan-1, Panc-1, MIA PaCa-2, SW480, HCT166, LoVo, A172, MKN-45, MKN-74, Kato-III, NCI-N87, HT-144, SK-MEL-2, SH-SY5Y, C6, HT-22, PC-12, NIH3T3 세포 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, (예를 들어 생체내에서) 본 명세서에 기재된 외래 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 생산하기 위해 사용할 수 있는 세포는 인간 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 인간 세포는 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 투여 받은 대상의 세포이다. 특정 양태에서, 상기 인간 세포는 공여체(예를 들어 건강한 인간 대상)로부터 유래한다.
V. 약제학적 조성물
본 명세서에 개시된 다양한 핵산 분자, 세포 및 벡터(본 명세서에서 "활성 복합체(active compounds)"라고도 함)는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 개시 내용은 이러한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 (a) 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함) 중 임의의 폴리뉴클레오타이드 및 (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다. 일부 양태에서, 본 명세서는 (a) 본 명세서에 기재된 벡터(예를 들어 rAAV) 및 (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다. 일부 양태에서, 본 명세서는 (a) 본 명세서에 기재된 세포 및 (b) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 재조합 아데노-연관 바이러스 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하되, 상기 재조합 아데노-연관 바이러스가 (a) AAV 8형 캡시드 단백질 및 (b) (i) 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외래 유전자 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 조절 요소가 (5'로부터 3' 방향으로): (1) 서열목록 제4서열에 나타낸 CMV 인핸서 서열; (2) 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열; (3) 서열목록 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열; (4) 서열목록 제10서열에 나타낸 치킨 β-액틴 인트론의 스플라이싱 공여체 서열; (5) 서열목록 제2서열, 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 비번역 핵산 서열; 및 (6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함한다.
본 개시 내용에서 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 사용되는 것들이다. 상기 약학적으로 허용되는 담체의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 개시 내용의 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제의 상세한 내용은 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에서 찾을 수 있다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제제화된다. 적합한 비경구 투여 경로의 예는 정맥내 주입, 경피 투여, 피하 주입, 근육내 주입, 유리체내 주입, 망막하 주입, 맥락막위공간 주입, 점안 투여, 뇌실내 주입, 척추강내 주입, 양막 내 주입, 동맥내 주입, 관절광내 주입, 심장내 주입, 음경해면체내 주입, 뇌내 주입, 뇌수조 주입, 관상내 주입, 두개내 주입, 경막내 주입, 경막외 주입, 해마내 주입, 비강내 주입, 골강내 주입, 복강내 주입, 흉강내 주입, 척수내 주입, 흉곽내 주입, 흉선내 주입, 자궁내 주입, 질내 주입, 심실내 주입, 방광내 주입, 결막하 주입, 종양내 주입, 국소 주입, 복강 주입 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 0.0001 내지 100 mg/kg의 1일 투여량으로 투여된다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 제공되거나 다용량 용기에 분배될 수 있다. 상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수 있다. 상기 제형은 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.
VI. 키트
본 명세서는 또한 본 명세서에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함), 본 명세서에 개시된 하나 이상의 벡터(예를 들어 rAAV), 본 명세서에 개시된 하나 이상의 세포, 본 명세서에 개시된 임의의 약제학적 조성물 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 키트를 개시한다. 일부 양태에서, 상기 키트는 또한 상술한 것들 중 임의의 것 또는 이들의 조합을 필요로 하는 대상에 투여를 위한 설명서를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "키트" 및 "시스템"은 일부 양태에서 하나 이상의 다른 유형의 요소 또는 성분(예를 들어 다른 유형의 생화학적 시약, 용기, 시판용 패키징과 같은 패키지, 사용 설명서 등)과 조합한 본 명세서에 개시된 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 벡터(예를 들어 rAAV), 본 명세서에 개시된 하나 이상의 숙주 세포, 본 명세서에 개시된 임의의 약제학적 조성물 또는 이들의 임의의 조합을 지칭하도록 의도된다.
VII. 용도 및 방법
VII.A. 생산 방법
본 명세서는 또한 외래 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 개시한다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 적합한 조건에서 본 명세서에 기재된 세포(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입됨)를 배양하고 코딩된 단백질을 회수하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 외래 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 분자를 포함)를 필요로 하는 대상에 투여하여 상기 대상에서 코딩된 폴리펩타이드를 생산하는 것을 포함한다. 폴리펩타이드를 생산하는 이러한 생체내 방법에 관한 추가 개시 내용은 본 개시 내용의 다른 곳에 제공되어 있다(예를 들어 치료적 용도 참조).
일부 양태에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 이러한 재조합 AAV를 생산하는 방법은 본 명세서에 기재된 AAV 벡터로 형질감염된 세포를 재조합 AAV를 생산하는 조건에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 세포 배양물의 상청액으로부터 재조합 AAV를 회수하는 것을 더 포함한다.
일부 양태에서, 상기 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터는 (i) 상기 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 AAV 구축물(예를 들어 도 6C 참조), (ii) rep 및 cap 유전자를 함유한 구축물 및 (iii) 외래 유전자를 숙주 세포에 형질도입하기 위한 헬퍼 구축물을 사용하여 제작할 수 있다. 이러한 양태에서, 상기 헬퍼 구축물은 AAV 게놈 복제 및 유전자 전사를 촉진하는 E2A 유전자, AAV mRNA가 핵으로부터 세포질로 이동할 수 있도록 하는 E4 유전자 및 번역을 조절하는 역할을 하는 2개의 VA RNA를 생성하는 VA 영역을 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 상술한 3개의 구축물은 숙주 세포에 형질도입을 위한 2개의 구축물에 의해 대체될 수 있다. 이러한 양태에서, AAV 구축물은 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하고, 별도의 구축물은 상기 rep 및 cap 유전자, E2A 유전자, E4 유전자 및 VA 영역을 포함한다. 본 명세서에 기재된 AAV 입자를 생산하기 위한 추가 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 각각 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 Clement et al., Mol Ther Methods Clin Dev 3: 16002(2016년3월); Clark, Kidney Int. 61: S9-15(2002년1월); 및 Xiao et al., J Virol 72(3): 2224-32(1998년3월)를 참조할 것.
VII.B. 치료적 용도
본 명세서에 기재된 핵산 분자(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열 포함), 이러한 핵산 분자를 보유한 벡터 및 재조합 바이러스(예를 들어 rAAV) 및 본 명세서에 기재된 방법은 많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다. 예를 들어 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 벡터, 예를 들어 AAV 벡터는 배양물, 시험관내 또는 생체외에서 세포에 또는 인간 대상, 예를 들어 생체내 투여되어 질환을 치료할 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드들(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함)중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 본 명세서에 기재된 재조합 발현 구축물, 본 명세서에 기재된 세포, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 또는 본 명세서에 기재된 재조합 바이러스의 치료용 용도를 제공한다.
일부 양태에서, 본 명세서는 필요로 하는 대상에서 외래 유전자를 발현시키는 방법으로서, 상기 대상에 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 외래 유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함), 본 명세서에 개시된 벡터, 본 명세서에 개시된 재조합 바이러스(예를 들어 rAAV), 본 명세서에 개시된 세포 또는 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하되, 상기 투여 후 대상에서 외래 유전자의 발현이 증가되는 방법을 개시한다.
본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이, 본 개시 내용의 비번역 핵산 서열은 상기 외래 유전자가 번역될 때 상기 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서 일부 양태에서, 본 개시 내용은 세포에서 외래 유전자의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포를 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이들, 벡터들 또는 재조합 바이러스들(예를 들어 rAAV) 중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 접촉을 생체외 또는 생체내에서 진행할 수 있다. 상기 접촉을 생체내에서 진행할 때 상기 방법은 접촉 전에 대상에 상기 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들 또는 재조합 바이러스들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 접촉 후 외래 유전자의 발현은 기준 발현에 비해 적어도 약 1배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배 또는 적어도 약 10배 이상 증가한다. 일부 양태에서, 상기 기준 발현은 접촉 전 세포 내 외래 유전자의 발현이다. 일부 양태에서, 상기 기준 발현은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스(예를 들어 비번역 핵산 서열이 결여되어 있거나 서열목록 제1서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함)와 접촉하지 않은 해당 세포 내 외래 유전자의 발현이다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 필요로 하는 대상에서 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 상기 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들, 세포들, 재조합 바이러스들 또는 약제학적 조성물들 중 임의의 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 재조합 바이러스 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용으로부터 명백한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 조성물(예를 들어 폴리뉴클레오타이드, 재조합 발현 구축물, 세포, 약제학적 조성물 또는 재조합 바이러스)은 예를 들어 외래 유전자를 변형시킴으로써 임의의 대상 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시 내용에 의해 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 질환은 한정되지 않으며 약물의 투여 횟수를 줄일 필요가 있는 모든 질환을 포함한다. 이러한 질환의 비제한적인 예는 안과 질환을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 안과 질환은 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시 내용에 의해 치료할 수 있는 안과 질환은 황반변성을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 황반변성은 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함한다. 연령-관련 황반변성은 건성(위축성) 황반변성과 습성(신생혈관성 또는 삼출성) 황반변성으로 나눌 수 있다. 연령-관련 황반변성은 초기 AMD, 중기 AMD 및 후기 또는 진행성 AMD(지도 모양 위축)로 나눌 수도 있다. 일부 양태에서, 본 개시 내용에 의해 치료할 수 있는 안과 질환은 당뇨병성 망막병증을 포함한다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR)이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 당뇨병성 황반병증이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 당뇨병성 황반부종이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 망막 내의 허혈성 손상과 관련된 임의의 망막병증이다. 달리 명시되지 않는 한, 본 개시 내용은 모든 형태의 AMD 및/또는 당뇨병성 망막병증을 치료하기 위해 사용할 수 있다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 지속적인 외래 유전자 발현을 달성할 수 있는 유전자 치료제 또는 질환 치료용 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 바이러스 전달 시스템을 사용하면 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월 또는 약 1년 이상의 간격으로 본 명세서에 기재된 조성물의 투여가 가능하다. 일부 양태에서, 상기 간격은 약 2 내지 약 3개월이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 약 6개월이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 약 1년이다. 일부 양태에서, 상기 간격은 적어도 약 1년이다. 즉, 본 명세서에 기재된 바이러스 전달 시스템을 사용하면 상기 조성물의 투여 횟수를 획기적으로 감소시켜 의사, 환자 또는 대상으로 하여금 상기 조성물의 반복 투여에 의해 초래되는 불편함을 피할 수 있게 한다. 환자의 증상 또는 필요에 따라, 상기 조성물을 초기에는 1 내지 2주 간격으로 적어도 2 내지 3회 투여할 수 있고, 그 다음에는 2 내지 3개월마다, 6개월마다 또는 1년 이상마다 1회 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 참조하여 본 개시 내용을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 본 개시 내용의 요지에 따라 본 개시 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지 않음은 당업자에게 자명할 것이다.
본 개시 내용의 이들 및/또는 다른 양태 및 이점들은 첨부 도면을 참고로 하여 상기 양태들의 후술하는 설명으로부터 분명하고 더욱 용이하게 이해될 것이다:
도 1은 본 명세서에 기재된 pAAV-eGFP 발현 구축물의 개열지도를 보여주고 있다.
도 2A 및 2B는 EF-1α 프로모터("CEE-FL")와 함께 전장 EF-1α 인트론을 포함한 발현 구축물로 형질도입된 세포에서 eGFP의 발현 증가를 보여주고 있다. 대조군 세포는 EF-1α 인트론("CE")이 결여된 해당 발현 구축물로 형질도입되었다. 도 2A에서는 ITR-결여 동물 세포 발현 구축물을 사용하였다. 도 2B에서는 ITR-함유 pAAV 발현 구축물을 사용하였다. 도 2A 및 2B 모두에서, 다음과 같은 형질도입된 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B) 내 eGFP 발현이 나타나 있다.
도 3A, 3B 및 3C는 다양한 프로모터("CCE-FL")와 함께 전장 EF-1α 인트론을 포함한 발현 구성물로 형질도입된 세포에서 eGFP의 발현을 보여주고 있다. 대조군 세포는 EF-1α 인트론이 결여된 해당 발현 구축물로 형질도입되었다. 도 3A에서, CMV 인핸서와 CMV 프로모터의 조합을 동물 세포 발현 구축물(즉, ITR 결여)에 삽입하여 상기 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. 도 3B에서, CMV 인핸서 및 CMV 프로모터의 조합을 pAAV 발현 구축물에 삽입하여 상기 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. 도 3C에서는, 상기 세포를 CMV 인핸서 및 치킨-β 액틴 프로모터의 조합을 포함한 동물 세포 발현 구축물로 형질도입하였다. 도 3A, 3B 및 3C 각각에서, 다음과 같은 형질도입된 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B) 내 eGFP 발현이 나타나 있다.
도 4A 및 4B는 유전자 발현에 대한 다양한 EF-1α 인트론 단편 서열(즉, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열)의 증가 또는 감소 효과를 보여주고 있다. 도 4A는 EF-1α 인트론 서열을 순차적으로 결실시킴으로써 제조된 일련의 CEE 구축물을 개략적으로 보여주고 있다. 나타낸 각각의 구축물은 다음을 포함하였다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) CMV 프로모터 일부(5' 말단으로부터 처음 31개 염기쌍) 및 EF-1α 프로모터(201개 염기쌍)를 포함한 프로모터; 및 (3) EF-1α 엑손 1(E1) 서열(29개 염기쌍). 대조군 "CE" 구축물은 EF-1 알파 인트론 서열을 포함하여 어떠한 추가 성분도 포함하지 않았다. 다른 구축물들은 다음과 같은 추가 성분들을 더 포함하였다: (4) 전장 EF-1 알파 인트론 서열(즉, 서열목록 제1서열)의 5'-말단으로부터 처음 19개의 염기쌍으로 이루어진 스플라이스 공여체 서열; (5) EF-1α 인트론 서열; 및 (6) EF-1α 엑손 2(E2) 서열(9개 염기쌍). 상기 EF-1α 인트론 서열은 전장 서열(924개 염기쌍)("CEE-FL") 또는; (ii) 서열목록 제1서열의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(355개 염기쌍)("CEE-T2"); (iii) 서열목록 제1서열의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(204개 염기쌍)("CEE-T3"); (iv) 서열목록 제1서열의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(117 염기쌍)("CEE-T3.1"); (v) 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(95개 염기쌍)("CEE-T3.1.1"); (vi) 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(73개 염기쌍)("CEE-T3.1.2"); (vii) 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(51개 염기쌍)("CEE-T3.2"); 및 (viii) 서열목록 제1서열의 896번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(29개 염기쌍)("CEE-T4")를 포함하였다. 상기 구축물 각각의 총 길이는 우측에 제공되어 있다. 도 4B는 5개의 서로 다른 세포주(HeLa, Hep3B, Huh-7, ARPE-19 및 RPE-1)에서 eGFP(즉, 외래 유전자) 발현에 대한 서로 다른 EF-1α 인트론 서열(전장 또는 결실됨)의 효과를 보여주고 있다. ARPE-19 및 RPE-1 세포는 망막으로부터 유래되었다. Huh-7 및 Hep3B 세포는 간으로부터 유래되었다. HeLa 세포는 자궁경부로부터 유래되었다. eGFP 발현은 CEE-FL 구축물을 사용하여 외래 유전자로 형질도입된 세포에서 관찰된 발현율(%)로서 나타내었다. "ns" = 유의성 없음. "**" = p<0.01 및 "***" = p<0.001.
도 5A, 5B, 5C 및 5D는 외래 유전자 발현을 증가시키는 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1(즉, 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(95개 염기쌍) 및 T3.1.2(즉, 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(73개 염기쌍)의 능력을 보여주고 있다. 도 5A는 다음과 같은 추가 성분과 함께 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 및 T3.1.2를 포함한 일련의 CAE 구축물을 개략적으로 보여주고 있다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) 치킨 β-액틴 프로모터(279개 염기쌍); (3) 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열(32개 염기쌍); (4) EF-1α 엑손 1(E1) 서열(29개 염기쌍); (5) 전장 EF-1α 인트론 서열(즉, 서열목록 제1서열)의 5'-말단으로부터 처음 19개의 염기쌍으로 이루어진 스플라이싱 공여체 서열; 및 (6) EF-1α 엑손 2(E2) 서열(9개 염기쌍). 대조군 "CA" 구축물은 CMV 인핸서, 치킨 β-액틴 프로모터 및 치킨 β-액틴 E1 서열만을 포함하였다. 대조군 "CAE-FL" 구축물은 전장 EF-1α 인트론 서열을 포함하였다. 상기 구축물의 총 길이는 좌측에 제공되어 있다. 도 5B는 CAE-T3.1.1 및 CAE-T3.1.2 구축물을 사용하여 형질도입된 HeLa(좌측 그래프) 및 ARPE-19(우측 그래프) 세포에서 eGFP(즉, 외래 유전자) 발현을 보여주고 있다. 유전자 발현은 CA 구축물(즉, EF-1α 인트론 서열 결여)을 사용하여 형질도입된 해당 세포에서의 발현율(%)로 나타내었다. 도 5C는 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 또는 T3.1.2 및 치킨 β-액틴 인트론 단편을 모두 포함하는 일련의 하이브리드 인트론 CA 구축물(즉, CA-T3.1.1 및 CA-T3.1.2 구축물)을 개략적으로 보여주고 있다. 상기 2개의 구축물은: (1) CMV 인핸서; (2) 치킨 β-액틴 프로모터; (3) 치킨 β-액틴 E1 서열; 및 (4) EF-1α E2 서열을 추가로 포함하였다. 대조군 "CAG-FL" 구축물은 다음을 포함하였다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) 치킨 β-액틴 프로모터(279개 염기쌍); (3) 치킨 β-액틴 E1 서열(93개 염기쌍); (4) 키메라 인트론(치킨 β-액틴 및 토끼 β-글로빈의 인트론 포함)(924개 염기쌍); 및 (5) 토끼 β-글로빈 엑손 3(E3) 서열(48개 염기쌍). "CA" 구축물은 도 5A에 기재된 것과 동일하다. 도 5D는 구축물 CA-T3.1.1 및 CA-T3.1.2를 사용하여 형질도입된 HeLa(좌측 그래프) 및 Hep3B(우측 그래프) 세포에서 eGFP 발현을 보여주고 있다. 유전자 발현은 CA 구축물(즉, EF-1α 인트론 서열 결여)을 사용하여 형질도입된 해당 세포에서 발현율(%)로 나타내었다.
도 6A, 6B 및 6C는 AAV를 사용하여 유전자를 전달하는 경우에서의 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 및 T3.1.2의 외래 유전자(즉, 애플리버셉트) 발현 증가 효과를 보여주고 있다. 도 6A는 시험관내 유전자 전달에 있어서 T3.1.1 및 T3.1.2 단편에 의한 유전자 발현 증가 효과를 보여주고 있다. 도 6B는 생체내 유전자 전달에 있어서 T3.1.1 및 T3.1.2 단편에 의한 유전자 발현 증가 효과를 보여주고 있다. 도 6C는 외래 유전자로서 애플리버셉트를 삽입한 pAAV-CA-T3.1.1 벡터의 개열지도이다.
도 1은 본 명세서에 기재된 pAAV-eGFP 발현 구축물의 개열지도를 보여주고 있다.
도 2A 및 2B는 EF-1α 프로모터("CEE-FL")와 함께 전장 EF-1α 인트론을 포함한 발현 구축물로 형질도입된 세포에서 eGFP의 발현 증가를 보여주고 있다. 대조군 세포는 EF-1α 인트론("CE")이 결여된 해당 발현 구축물로 형질도입되었다. 도 2A에서는 ITR-결여 동물 세포 발현 구축물을 사용하였다. 도 2B에서는 ITR-함유 pAAV 발현 구축물을 사용하였다. 도 2A 및 2B 모두에서, 다음과 같은 형질도입된 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B) 내 eGFP 발현이 나타나 있다.
도 3A, 3B 및 3C는 다양한 프로모터("CCE-FL")와 함께 전장 EF-1α 인트론을 포함한 발현 구성물로 형질도입된 세포에서 eGFP의 발현을 보여주고 있다. 대조군 세포는 EF-1α 인트론이 결여된 해당 발현 구축물로 형질도입되었다. 도 3A에서, CMV 인핸서와 CMV 프로모터의 조합을 동물 세포 발현 구축물(즉, ITR 결여)에 삽입하여 상기 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. 도 3B에서, CMV 인핸서 및 CMV 프로모터의 조합을 pAAV 발현 구축물에 삽입하여 상기 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. 도 3C에서는, 상기 세포를 CMV 인핸서 및 치킨-β 액틴 프로모터의 조합을 포함한 동물 세포 발현 구축물로 형질도입하였다. 도 3A, 3B 및 3C 각각에서, 다음과 같은 형질도입된 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B) 내 eGFP 발현이 나타나 있다.
도 4A 및 4B는 유전자 발현에 대한 다양한 EF-1α 인트론 단편 서열(즉, 본 명세서에 기재된 비번역 핵산 서열)의 증가 또는 감소 효과를 보여주고 있다. 도 4A는 EF-1α 인트론 서열을 순차적으로 결실시킴으로써 제조된 일련의 CEE 구축물을 개략적으로 보여주고 있다. 나타낸 각각의 구축물은 다음을 포함하였다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) CMV 프로모터 일부(5' 말단으로부터 처음 31개 염기쌍) 및 EF-1α 프로모터(201개 염기쌍)를 포함한 프로모터; 및 (3) EF-1α 엑손 1(E1) 서열(29개 염기쌍). 대조군 "CE" 구축물은 EF-1 알파 인트론 서열을 포함하여 어떠한 추가 성분도 포함하지 않았다. 다른 구축물들은 다음과 같은 추가 성분들을 더 포함하였다: (4) 전장 EF-1 알파 인트론 서열(즉, 서열목록 제1서열)의 5'-말단으로부터 처음 19개의 염기쌍으로 이루어진 스플라이스 공여체 서열; (5) EF-1α 인트론 서열; 및 (6) EF-1α 엑손 2(E2) 서열(9개 염기쌍). 상기 EF-1α 인트론 서열은 전장 서열(924개 염기쌍)("CEE-FL") 또는; (ii) 서열목록 제1서열의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(355개 염기쌍)("CEE-T2"); (iii) 서열목록 제1서열의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(204개 염기쌍)("CEE-T3"); (iv) 서열목록 제1서열의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(117 염기쌍)("CEE-T3.1"); (v) 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(95개 염기쌍)("CEE-T3.1.1"); (vi) 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(73개 염기쌍)("CEE-T3.1.2"); (vii) 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(51개 염기쌍)("CEE-T3.2"); 및 (viii) 서열목록 제1서열의 896번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(29개 염기쌍)("CEE-T4")를 포함하였다. 상기 구축물 각각의 총 길이는 우측에 제공되어 있다. 도 4B는 5개의 서로 다른 세포주(HeLa, Hep3B, Huh-7, ARPE-19 및 RPE-1)에서 eGFP(즉, 외래 유전자) 발현에 대한 서로 다른 EF-1α 인트론 서열(전장 또는 결실됨)의 효과를 보여주고 있다. ARPE-19 및 RPE-1 세포는 망막으로부터 유래되었다. Huh-7 및 Hep3B 세포는 간으로부터 유래되었다. HeLa 세포는 자궁경부로부터 유래되었다. eGFP 발현은 CEE-FL 구축물을 사용하여 외래 유전자로 형질도입된 세포에서 관찰된 발현율(%)로서 나타내었다. "ns" = 유의성 없음. "**" = p<0.01 및 "***" = p<0.001.
도 5A, 5B, 5C 및 5D는 외래 유전자 발현을 증가시키는 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1(즉, 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(95개 염기쌍) 및 T3.1.2(즉, 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(73개 염기쌍)의 능력을 보여주고 있다. 도 5A는 다음과 같은 추가 성분과 함께 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 및 T3.1.2를 포함한 일련의 CAE 구축물을 개략적으로 보여주고 있다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) 치킨 β-액틴 프로모터(279개 염기쌍); (3) 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열(32개 염기쌍); (4) EF-1α 엑손 1(E1) 서열(29개 염기쌍); (5) 전장 EF-1α 인트론 서열(즉, 서열목록 제1서열)의 5'-말단으로부터 처음 19개의 염기쌍으로 이루어진 스플라이싱 공여체 서열; 및 (6) EF-1α 엑손 2(E2) 서열(9개 염기쌍). 대조군 "CA" 구축물은 CMV 인핸서, 치킨 β-액틴 프로모터 및 치킨 β-액틴 E1 서열만을 포함하였다. 대조군 "CAE-FL" 구축물은 전장 EF-1α 인트론 서열을 포함하였다. 상기 구축물의 총 길이는 좌측에 제공되어 있다. 도 5B는 CAE-T3.1.1 및 CAE-T3.1.2 구축물을 사용하여 형질도입된 HeLa(좌측 그래프) 및 ARPE-19(우측 그래프) 세포에서 eGFP(즉, 외래 유전자) 발현을 보여주고 있다. 유전자 발현은 CA 구축물(즉, EF-1α 인트론 서열 결여)을 사용하여 형질도입된 해당 세포에서의 발현율(%)로 나타내었다. 도 5C는 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 또는 T3.1.2 및 치킨 β-액틴 인트론 단편을 모두 포함하는 일련의 하이브리드 인트론 CA 구축물(즉, CA-T3.1.1 및 CA-T3.1.2 구축물)을 개략적으로 보여주고 있다. 상기 2개의 구축물은: (1) CMV 인핸서; (2) 치킨 β-액틴 프로모터; (3) 치킨 β-액틴 E1 서열; 및 (4) EF-1α E2 서열을 추가로 포함하였다. 대조군 "CAG-FL" 구축물은 다음을 포함하였다: (1) CMV 인핸서(380개 염기쌍); (2) 치킨 β-액틴 프로모터(279개 염기쌍); (3) 치킨 β-액틴 E1 서열(93개 염기쌍); (4) 키메라 인트론(치킨 β-액틴 및 토끼 β-글로빈의 인트론 포함)(924개 염기쌍); 및 (5) 토끼 β-글로빈 엑손 3(E3) 서열(48개 염기쌍). "CA" 구축물은 도 5A에 기재된 것과 동일하다. 도 5D는 구축물 CA-T3.1.1 및 CA-T3.1.2를 사용하여 형질도입된 HeLa(좌측 그래프) 및 Hep3B(우측 그래프) 세포에서 eGFP 발현을 보여주고 있다. 유전자 발현은 CA 구축물(즉, EF-1α 인트론 서열 결여)을 사용하여 형질도입된 해당 세포에서 발현율(%)로 나타내었다.
도 6A, 6B 및 6C는 AAV를 사용하여 유전자를 전달하는 경우에서의 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 및 T3.1.2의 외래 유전자(즉, 애플리버셉트) 발현 증가 효과를 보여주고 있다. 도 6A는 시험관내 유전자 전달에 있어서 T3.1.1 및 T3.1.2 단편에 의한 유전자 발현 증가 효과를 보여주고 있다. 도 6B는 생체내 유전자 전달에 있어서 T3.1.1 및 T3.1.2 단편에 의한 유전자 발현 증가 효과를 보여주고 있다. 도 6C는 외래 유전자로서 애플리버셉트를 삽입한 pAAV-CA-T3.1.1 벡터의 개열지도이다.
재료 및 방법
실시예 1. 인핸서-프로모터-인트론 서열을 포함하지 않는 pAAV-eGFP 구축물 제조
실시예 1-1. bGH 폴리아데닐화 신호 서열의 삽입
pcDNA5/FRT/TO 구축물(Invitrogen, USA, Cat No. V6520-20)을 주형으로 하고 oligo #001, #002를 이용해서 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호 A 서열(poly A) 단편을 확보하였다. 다음으로 pAAV-MCS-무프로모터 플라스미드(Cellbiolabs, USA, Cat No. VPK-411)의 BglII/BstEII 부위를 사용하여 인간 성장 호르몬(hGH) poly A를 제거하고 bGH poly A를 삽입하였다.
실시예 1-2. eGFP의 삽입
pUCIDT-KAN-eGFP 구축물(GeneArt, Germany)에서 유래한 인간 코돈 최적화 eGFP 유전자를 확보하여 이를 실시예 1-1에서 제조한 pAAV-bGH 구축물의 BamHI/HindIII 부위에 클로닝하였다.
실시예 1-3. WPRE 서열의 삽입
pUC57-WPRE 구축물(GenScript, USA)에서 우드척 간염 바이러스 후전사 조절 요소(WPRE) 서열을 확보하여 이를 실시예 1-2에서 제조한 pAAV-eGFP-bGH 구축물의 HindIII/BglII 부위에 클로닝하였다.
실시예 1-4. 4 카피(copy)의 miRNA142-3p 타겟서열의 삽입
Oligo #003과 #004을, 그리고 #005과 #006를 각각 어닐링(annealing)하여 각각 2 카피의 miRNA142-3p 타겟서열을 포함하는 두 개의 DNA단편을 준비하였다. 두개의 짧은 DNA단편을 실시예 1-3에서 제조한 pAAV-eGFP-WPRE-bGH 구축물의 HindIII/SalI 부위에 클로닝하여 도합 4 카피의 miRNA142-3p 타겟서열이 삽입되도록 하였다. 이를 통해 인핸서-프로모터-인트론 서열을 포함하지 않는 pAAV-eGFP 구축물을 제조하였다(도 1).
실시예 2. 여러 종류의 인핸서-프로모터-인트론 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-1. CEE 시리즈(CEE-FL, CEE-T2, -T3, -T3, -T3.1, -T3.1.1, -T3.1.2, -T3.2, -T4) 및 CE 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-1-1. CEE-FL(전장) 염기 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ3_PEM 구축물(GeneArt, Germany)로부터 CEE-FL(CMV 인핸서(서열목록 제4서열)-CMV 프로모터의 31 bp(서열목록 제5서열)-EF-1α 프로모터(서열목록 제7서열)-EF-1α 엑손 1의 29 bp(서열목록 제13서열)-EF-1α 인트론(서열목록 제1서열)-EF-1α 엑손 2의 9 bp(서열목록 제11서열)) DNA 단편을 확보하였고 이를 실시예 1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-1-2. CEE-T2 염기 서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #007/008 조합과 #009/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly®(NEB, USA, Cat No. E2611)를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T2 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-3. CEE-T3 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #011/008 조합과 #012/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T3 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-4. CEE-T3.1 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #013/008, #014/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T3.1 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-5. CEE-T3.2 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #015/008, #016/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T3.2 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-6. CEE-T4 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #017/008, #018/010 조합을 이용해서 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물을 주형으로 PCR을 수행하였고 Gibson Assembly를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 CEE-T4 서열을 갖는 구축물을 제조하였다.
실시예 2-1-7. CEE-T3.1.1 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
pUC57-T3.1.1 구축물(GenScript, USA)로부터의 CEE-T3.1.1 염기서열을 확보하여 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-1-8. CEE-T3.1.2 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
pUC57-T3.1.2 구축물(GenScript, USA)로부터의 CEE-T3.1.2 염기서열을 확보하여 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-1-9. CE 염기서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #019, #020을 이용하여 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물로부터 PCR을 통해 CE단편을 확보하고 이를 실시예 2-1-1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-2. CCE-FL, CC 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-2-1. CCE-FL 서열을 포함하는 구축물의 제조
pMK-RQ4_PME 구축물(GeneArt, Germany)로부터 CCE-FL(CMV 인핸서(서열목록 제4서열)-CMV 프로모터(서열목록 제6서열)-CMV 엑손 1의 30 bp(서열목록 제12서열)-EF-1α 엑손 1의 29 bp(서열목록 제13서열)-EF-1α 인트론(서열목록 제1서열)-EF-1α 엑손 2의 9 bp(서열목록 제11서열) 서열의 DNA 단편을 확보하여 실시예 1에서 확보한 pAAV-eGFP 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-2-2. CC서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #019, #021을 이용하여 실시예 2-2-1에서 제조한 구축물로부터 PCR을 통해 CC 단편을 확보하고 이를 실시예 2-2-1에서 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-3. CAG-FL, CA-T3.1.1, CA-T3.1.2, CA 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-3-1. CAG-FL 서열을 포함하는 구축물의 제조
pCAG-Neo 구축물(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan, Cat No. 163-25601)로부터 CAG 단편을 확보하여 실시예 2-1에서 확보한 구축물의 SnaBI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-3-2. CA 서열을 포함하는 구축물의 제조
pUC57-CA 구축물(GenScript, USA)로부터 CA 단편을 확보하여 실시예 2-3-1로부터 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-3-3. CA-T3.1.1 서열을 포함하는 구축물의 제조
oligo #022, #023을 이용해 실시예 2-1-7에서 확보한 구축물로부터 PCR을 통해 T3.1.1 단편을 확보하여 이를 실시예 2-3-1로부터 제조한 구축물의 AfeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-3-4. CA-T3.1.2 서열을 포함하는 구축물의 제조
oligo #024와 #025을 어닐링하여 통해 확보한 T3.1.2 단편을 확보하여 이를 실시예 2-3-1로부터 제조한 구축물의 AfeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-4. CAE-FL, CAE-T3.1.1, CAE-T3.1.2 서열을 포함하는 구축물들의 제조
실시예 2-4-1. CAE-FL 서열을 포함하는 구축물의 제조
pUC57-CAE 구축물(GenScript, USA)로부터 CAE(CMV 인핸서(서열목록 제4서열)-치킨 β-액틴 프로모터(SEQ ID NO: 8)-치킨 β-액틴 엑손 1의 32 bp(SEQ ID NO: 14)-EF-1α 엑손 1의 29 bp(SEQ ID NO: 13)-EF-1α 인트론 924 bp(SEQ ID NO: 1)-EF-1α 엑손 2의 9 bp(SEQ ID NO: 11)) 단편을 확보하여 실시예 1로부터 제조한 구축물의 EcoRI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-4-2. CAE-T3.1.1 서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #026, #027를 이용하여 실시예 2-1-7에서 제조한 구축물로부터 CAE-T3.1.1 단편을 확보하여 실시예 2-1-7에서 제조한 구축물의 KpnI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-4-3. CAE-T3.1.2 서열을 포함하는 구축물의 제조
Oligo #026, #027를 이용하여 실시예 2-1-8에서 제조한 구축물로부터 CAE-T3.1.2 단편을 확보하여 실시예 2-1-8에서 제조한 구축물의 KpnI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-5. 애플리버셉트 유전자를 포함하는 pAAV 구축물들의 제조
Oligo #028, #029을 이용하여 pcDNA3.1(+)-IgG-애플리버셉트 구축물(GenScript, USA) 로부터 PCR로 확보한 애플리버셉트 유전자 DNA 단편을 실시예 2-3-1, 실시예 2-3-3, 실시예 2-3-4, 실시예 2-4-1, 실시예 2-4-2, 실시예 2-4-3로부터 제조한 구축물들의 BamHI/HindIII site에 각각 클로닝 하였다.
실시예 2-6. ITR 서열이 존재하지 않는 동물세포 발현 구축물들의 제조
실시예 2-6-1. pcDNA3.1(+)-eGFP 구축물 제조
실시예 1에서 제조한 구축물을 BamHI/AfeI으로 잘라 eGFP 유전자 단편을 확보하였고 이를 pcDNA3.1(+) 구축물의 BamHI/EcoRV 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-6-2. CEE 서열이 포함되는 동물세포 발현 구축물의 제조
실시예 2-1-1로부터 제조한 구축물을 NdeI/BamHI으로 잘라 확보하였고 이를 실시예 2-6-1에서 제조한 구축물의 NdeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-6-3. CE 서열이 포함되는 동물세포 발현 구축물의 제조
실시예 2-1-9로부터 제조한 구축물을 NdeI/BamHI으로 잘라 CE 단편을 확보하였고 이를 실시예 2-6-1에서 제조한 구축물의 NdeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-6-4. CCE 서열이 포함되는 동물세포 발현 구축물의 제조
실시예 2-2-1로부터 제조한 구축물을 NdeI/BamHI으로 잘라 CCE 단편을 확보하였고 이를 실시예 2-6-1에서 제조한 구축물의 NdeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-6-5. CC 서열이 포함되는 동물세포 발현 구축물의 제조
실시예 2-2-2로부터 제조한 구축물을 NdeI/BamHI으로 잘라 CC 단편을 확보하였고 이를 실시예 2-6-1에서 제조한 구축물의 NdeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-6-6. CAE 서열이 포함되는 동물세포 발현 구축물의 제조
실시예 2-4-1로부터 제조한 구축물을 NdeI/BamHI으로 잘라 CAE 단편을 확보하였고 이를 실시예 2-6-1에서 제조한 구축물의 NdeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-6-7. CA 서열이 포함되는 동물세포 발현 구축물의 제조
실시예 2-3-2로부터 제조한 구축물을 NdeI/BamHI으로 잘라 CA 단편을 확보하였고 이를 실시예 2-6-1에서 제조한 구축물의 NdeI/BamHI 부위에 클로닝하였다.
실시예 2-7. 염기서열의 확인
클로닝을 이용하여 확보한 모든 구축물들은 염기서열 분석(DNA sequencing)(마크로젠, Korea, 또는 바이오닉스, Korea)을 통하여 염기 서열을 확인하였다.
실시예 3. 세포배양
HEK293과 HeLa 세포주는 MEM 배지(Gibco, USA, Cat No. 42360-032), ARPE-19 세포주는 DMERM/F12 배지(Gibco, USA, Cat No. 11330-032), RPE-1과 Hep3B 세포주는 DMEM 배지(Gibco, USA, Cat. No. 10569-010)를 이용하여 5% CO2, 37℃ 조건으로 습윤 배양하였으며, 모든 배지에 10% 우태아혈청(FBS, Gibco, USA, Cat No. 16000-044), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gioco, USA, Cat No. 15140-163)을 첨가하였다. Expi293 세포주는 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 Expi293 배지(Gibco, USA, Cat. No. A14351-01)를 이용하여 8% CO2, 37℃ 조건으로 250 rpm으로 흔들며 습윤 배양하였다.
실시예 4. 형질도입(transduction)
실시예 4-1. 부착세포의 형질도입
형질도입을 위해, 각 세포주들을 DPBS(Gibco, USA, Cat No. 14190-250)를 이용해 2회 세척 후 트립신-EDTA(Gibco, USA, Cat No. 25200-114)를 처리하여 배양 접시에서 떼어내어 확보한 뒤 12-웰 플레이트에 80% 포화도로 접종하였다. 24시간 배양 후, Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific, USA, Cat No. L300075)을 이용하여 각각의 플라스미드(plasmid) DNA를 이용해 형질도입하였다.
실시예 4-2. AAV 생산을 위한 부유세포의 형질도입
AAV 생산을 위하여, 1 L 엘렌마이어 배양 플라스크에 6×108 세포를 220 ml의 expi293 배지에 접종하였다. 안정화를 위해 약 3~4시간 배양 후, 각각 3.73 pmole의 pHelper 플라스미드 DNA, pUC-RC2 플라스미드 DNA 또는 pUC-RC8 플라스미드 DNA, 외부 유전자를 포함한 AAV 구축물 플라스미드 DNA를 10 ml의 Opti-MEM(Gibco, USA, Cat No. 51985-034)에 각각 녹여주었다. 그리고 DNA 총량의 두배에 해당하는 폴리에틸렌아민(PEI, Polyscience, USA, Cat No. 23966-1)를 10 ml의 Opti-MEM에 희석시킨 후, 즉시 두 개의 용액을 섞어 형질도입 용액을 제조한다. 상온에서 30분간 반응시킨 후 배양 플라스크로 총 20 ml의 형질도입 용액을 넣어주었다.
실시예 5. AAV의 정제
실시예 5-1. AAV2 정제
실시예 4-2의 형질도입 72시간 후, 세포배양액을 수거하여 원심분리로 배지를 제거하고 세포를 확보하였다. DPBS로 세포 침전물을 씻어주고 16 ml의 DPBS로 세포를 재현탁하였다. 이를 3회에 걸쳐 동결/해동 사이클(freezing/thawing cycle)을 수행하여 세포들을 용해하고 이를 원심분리하여 AAV2를 포함하는 상층액을 확보하였다. 상층액과 AAVancedTM Concentration Reagent(System Bioscience, USA, Cat No. AAV110A-1)를 4:1로 혼합한 뒤 4℃에서 16시간동안 섞어준 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 AAV2를 포함하는 침전물을 확보하였다. Opti-MEM 500 ㎕로 침전물을 씻어주고 모든 상층액을 제거한 뒤, 최종적으로 얼음 냉각 DPBS 400 ㎕로 재현탁하여 AAV를 얻었다.
실시예 5-2. AAV8 정제
실시예 4-2의 형질도입 72시간 후, 세포배양액을 수거하였다. 0.45 ㎛의 필터로 세포의 잔해(cell debris)를 제거하고 음이온 교환법(anion exchange) 및 친화성 크로마토그라피법(affinity chromatography)을 사용하여 AAV를 얻었다.
실시예 6. AAV의 역가 결정
실시예 5에서 정제한 AAV2의 역가를 결정하기 위하여 qPCR(Bio-Rad, USA, CFX96)을 수행하였다. DNase I 반응 완충액(New England Biolab, USA, M0303S)에서 1시간 동안 37℃로 AAV에 DNase I을 처리하였다. 이후 DNase I이 처리된 시료에 proteinase K(Invitrogen, USA, Cat No. AM2548)를 55℃에서 30분간 처리하고, 95℃에서 15분간 반응시켜 proteinase K 불활성화시켰다. 준비된 시료들을 qPCR의 주형으로 사용하고, 표준곡선을 구하기 위하여 AAV 구축물 사용하며(7.4×108-7.4×104, 10-배 희석), Recombinant Adeno-associated Virus 2 Reference Standard Stock(rAAV2-RSS, ATCC, USA, Cat No. VR-1616) 혹은 Recombinant Adeno-associated Virus 8 Reference Standard Stock(rAAV8-RSS, ATCC, USA, Cat No. VR-1816)을 양성 대조군으로 사용하였다. 역가 결정을 위한 qPCR은 2×SsoAdvanced Universal Probe Supermix(Bio-Rad, USA, Cat No. 172-5282)와 AAV2-ITR 특이적 프라이머(#030, #031) 및 프로브(#032, FAM-CACT CCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1)를 사용하였다. 95℃에서 10분 동안 변성, 95℃에서 30초 동안 반응, 60℃에서 1분 동안 반응으로 이루어진 각 qPCR cycle을 40회 반복하였다. 표준곡선과 정량은 Bio-Rad CFX Maestro 1.1 software(Bio-Rad, USA)를 이용하여 분석하였다.
실시예 7. 시험관내에서 AAV2를 이용한 형질도입
AAV2 형질도입을 위하여, HEK293 세포를 24-웰 배양 플레이트에 웰당 4×105 세포를 접종하였다. 24시간 후, 각 웰에 MG132(Sigma-Aldrich, USA, Cat No. M7449)를 5 μM의 농도로 8시간 동안 처리하였다. AAV2를 25,000 MOI (Multiplicity of Infection)로 처리하고, 72시간 동안 배양하여 형질도입하였다.
실시예 8. 생체내에서 AAV8를 이용한 형질도입
안구의 아래쪽에 31G 주사바늘로 천공 후 IO kit의 주사바늘을 자입하여 바 늘 끝부분이 안구의 벽면에 닿는 지점에서 자입을 멈추고 투여를 실시하였다. 망 막하 주사(subretinal injection)의 성공 여부는 투여 직후 OCT 상에서 망막 수포(retinal bleb)의 형성 여부를 확인하는 방법으로 판단하였다. 4주 후 안구를 적출하여 Halt™ Protease Inhibitor Cocktail 100×(Thermo Fisher Scientific, USA, Cat No. 78429)이 첨가된 RIPA 용액(Thermo Fisher Scientific, USA, Cat No. 89900) 200㎕를 첨가하여 Axygen tissue grinder(Axygen, cat# 14-222-358)로 안구를 으깨고 갈아주었다. 4℃에서 1시간 반응한 후 4℃에서 13,000 g로 15분간 원심분리로 상등액을 확보한 시료를 분석하였다.
실시예 9. 유세포 분석을 통한 GFP 유전자의 발현 강도 측정
eGFP의 발현은 유세포분석(Beckman Coulter, USA, CytoFlex)을 통해 측정하였다. eGFP의 측정값은 함께 형질도입한 pCMV-dsRed(Clontech, Japan, Cat No.632416) 구축물에 의한 붉은색 형광의 측정으로 형질도입의 효율을 보정하여 계 산하였다. 형질도입 72시간 후 DPBS로 세포를 세척하고 트립신으로 떼어내었다. 1500 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 확보하고 2% FBS가 첨가된 DPBS를 500㎕ 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 유세포분석에 있어서, FSC vs SSC plot을 통하여 단일 세포 영역을 구분지었고, 그 중에서 FL1-A(녹색) 및 FL2-A(적색)를 측정하였다. 단일 형광 벡터가 각각 형질도입된 시료들을 이용하여 (pEGFP-C1, Clontech, Japan, Cat No. PT3286-1 and pCMV-DsRed-Expression2) 보완을 진행 후 측정 결과에 반영하였다. 모든 유세포분석 결과는 FlowJo software 10.5.3(Becton Dickinson & Company, USA)를 이용하여 분석하였다.
실시예 10. ELISA를 통한 애플리버셉트의 발현량 측정
분비되는 단백질의 농도를 정량하기 위하여 ELISA를 수행하였다. AAV를 이 용한 형질도입 48시간 후 세포 배양액을 확보하여 1500 rpm으로 5분간 4℃에서 원 심분리한 뒤 상층액을 취하여 ELISA의 시료로 사용한다. 애플리버셉트의 ELISA (Eagle bioscience, USA, Cat No. IG-AA115)는 제조사에서 제공한 프로토콜을 따라 수행하였다. ELISA 결과는 Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, USA)로 측정하였고, SkanIt software(Thermo Fisher Scientific, USA)로 분석하였다. 세포주를 이용한 실험은 2개를 한 세트로 2회 반 복하였고, 동물을 이용한 실험은 안구당 1회 수행하였다.
실시예 11. 통계분석방법
ELISA를 제외한 세포주를 이용한 모든 실험은 3회 반복실험을 진행하였다. 결과는 GraphPad Prism software 8.1.1(GraphPad Software, Inc., USA)을 이용하여, 두 그룹 간의 비교는 Student's-t-test로, 세 그룹 이상의 비교는 One-way ANOVA로 분석하였다. 동물실험의 경우 Wilcoxon matched-pairs signed rank test 로 분석하였다. *는 p<0.05, **는 p<0.01, ***는 p<0.001을 의미한다.
| Oligo 번호 | 서열번호 | 서열(5'→3') |
| 001 | 24 | GGAAGATCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGC |
| 002 | 25 | CACGTGGTTACCCCATAGAGCCCACCGCATC |
| 003 | 26 | AGCTTTCCATAAAGTAGGAAACACTACACGATTCCATAAAGTAGGAAACACTACAACGTTC |
| 004 | 27 | TAGTGTTTCCTACTTTATGGAATCGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA |
| 005 | 28 | CATAAAGTAGGAAACACTACATCACTCCATAAAGTAGGAAACACTACAG |
| 006 | 29 | TCGACTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAGTGATGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAACGTTG |
| 007 | 30 | GTGTGTGGTTTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG |
| 008 | 31 | CGGTGATGACGGTGAAAACC |
| 009 | 32 | CCCTGCAGCAAACCACACACGGCACTTACC |
| 010 | 33 | GGTTTTCACCGTCATCACCG |
| 011 | 34 | GTGTGTGGTTTCGAGCTTTTGGAGTACGTCG |
| 012 | 35 | AAAAGCTCGAAACCACACACGGCACTTACC |
| 013 | 36 | GTGTGTGGTTGTTAGGCCAGCTTGGCAC |
| 014 | 37 | CTGGCCTAACAACCACACACGGCACTTACC |
| 015 | 38 | GTGTGTGGTTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTG |
| 016 | 39 | TTGAGAATGAAACCACACACGGCACTTACC |
| 017 | 40 | GTGTGTGGTTTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGG |
| 018 | 41 | CTTTGAACCAAACCACACACGGCACTTACC |
| 019 | 42 | CCGGAATTCTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG |
| 020 | 43 | CGCGGATCCCTGTGTTCTGGCGGCAAAC |
| 021 | 44 | CGCGGATCCCGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAG |
| 022 | 45 | TGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTG |
| 023 | 46 | CCCAAGCTTGGATCCTCACGACACCTGAAATG |
| 024 | 47 | CCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGATCCA |
| 025 | 48 | AGCTTGGATCCTCACGACACCTGAAATGGAAGAAAAAAACTTTGAACCACTGTCTGAGGCTTGAGAATGAACCAAGATCCAAACTCAAAAAGG |
| 026 | 49 | CGGGGTACCTTCGCAACGGGTTTGCCG |
| 027 | 50 | CGCGGATCCTCACGACACCTG |
| 028 | 51 | TGAGGATCCGCCACCATGGAGTTTGG |
| 029 | 52 | CGCAAGCTTCAGTAGCGCTTTAGCCAGGAGACAAGCTCAGAGACTTCTG |
| 030 | 53 | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| 031 | 54 | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| 032 | 55 | FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 |
본 개시 내용에서 사용한 올리고뉴클레오타이드 서열
실험결과
1. EF-1α 프로모터와의 조합에서 EF-1α 인트론에 의한 eGFP 유전자의 발현 증가
사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서와 인간 신장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터의 조합에 의해 조절되는 eGFP 유전자 발현에 있어서 EF-1α 인트론이 미치는 영향을 테스트하였다. 먼저 ITR을 포함하지 않는 동물세포 발현 구축물에서 비교해 본 결과, 사용한 모든 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B)에서 EF-1α 인트론에 의해 eGFP의 발현이 증가(459.6%, 276.3%, 181.8%, 163.4%, 471.1%, 494.3%)하였다(도 2A). 마찬가지로 ITR을 포함하는 pAAV 구축물에서도 EF-1α 인트론에 의해 eGFP의 발현이 증가(224.0%, 167.7%, 218.7%, 229.5%, 202.5%, 260.5%)하였다(도 2B). 이 결과는 EF-1α 프로모터와 조합한 EF-1α 인트론이 여러 형태의 외부 유전자 발현 구축물에서 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
2. 다양한 프로모터들과의 조합에서 EF-1α 인트론에 의한 eGFP 유전자의 발현 증가
EF-1α 프로모터 이외에 다른 프로모터들과의 조합을 통해서도 EF-1α 인트론에 의한 유전자 발현 증가가 관찰되는지 시험하였다. 먼저 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서와 CMV 프로모터의 조합에 의해 유도되는 eGFP 유전자의 발현에 있어서 EF-1α 인트론이 미치는 영향을 테스트하였다. 먼저 ITR을 포함하지 않는 동물세포 발현 구축물에서 비교해 본 결과, eGFP의 발현은 사용한 모든 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B)에서 EF-1α 인트론에 의해 증가함(284.3%, 464.0%, 217.5%, 180.4%, 405.7%, 370.6%)을 확인하였다(도 3A).
유사하게 ITR을 포함하는 pAAV 구축물에서도 EF-1α 인트론은 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서와 CMV 프로모터의 조합에 의해 조절되는 eGFP의 발현을 증가시킴(241.4%, 494.8%, 266.8%, 185.5%, 415.5%, 367.8%)을 확인하였다(도 3B).
다음으로는 CMV 인핸서와 치킨 β-액틴 프로모터의 조합에 의해 조절되는 eGFP 유전자의 발현에 EF- 1α 인트론이 미치는 영향을 확인하였다. 동물세포 발현 구축물에서 비교해 본 결과, 사용한 모든 세포주(HEK293, HeLa, ARPE-19, RPE-1, Huh-7 및 Hep3B)에서 EF-1α 인트론이 eGFP의 발현을 증가시킴(415.2%, 396.7%, 233.9%, 217.9%, 353.7%, 297.7%)을 확인하였다(도 3C). 이러한 결과들은 EF-1α 프로모터 이외에 다양한 프로모터들과 조합된 상태에서도 EF-1α 인트론에 의해 유 전자 발현이 증가됨을 제시한다.
3. 유전자 발현 증가 효과를 보이는 최소 길이의 EF-1α 인트론 단편 결정
3-A. EF-1α 인트론의 서열이 순차적으로 결실된 일련의 CEE 구축물들 제작
CEE-FL 구축물은 CMV 인핸서 및 CMV 프로 모터 일부(5' 말단 31 bp)와 EF-1α 프로모터, EF-1α 엑손 1의 29 bp, EF-1α 인트론 924 bp, EF-1α 엑손 2의 9 bp를 포함하도록 설계되었다. 인트론의 스플라이싱 기능과 관련되는 핵심서열에는 5' 말단 쪽 스플라이싱 공여체와 분기점 부위(branch point site, BPS)를 포함하는 3' 말단쪽 스플라이싱 수용체가 위치하였다. 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 최소 길이의 EF-1α 인트론 서열을 찾기 위해서 인트론 5' 말단 쪽의 스플라이싱 공여체 서열은 보존하되 그 이후로는 순차적으로 인트론 서열이 결실되도록 하였다. 즉, EF-1α 인트론의 스플라이싱 공여체 공통(consensus) 서열로 추정되는 EF- 1α 인트론 5' 말단의 19 bp까지를 공통으로 포함하되 이후 659 bp(T2), 720 bp(T3), 807 bp(T3.1), 829 bp(T3.1.1), 851 bp(T3.1.2), 873 bp(T3.2), 895 bp(T4)가 결실된 CEE 구축물들을 실시예 2-1에서와 같이 제조하였다(도 4A).
3-B. EF-1α 인트론 서열의 순차적 결실에 따른 유전자 발현 증가 또는 감소 효과
다섯 종류의 동물세포주에서 EF-1α 인트론 서열이 전장인 것(CEE-FL)과 순 차적으로 결실된 것까지 총 8종류의 구축물들로부터의 eGFP 발현을 비교하였다. 먼저 HeLa, Hep3B, Huh-7 세포주들에서는 전장 EF-1α 인트론 A와 비교하여 볼 때, CEE-T2로부터 CEE-T3.1.2까지는 eGFP 유전자 발현이 유지됨을 확인하였다. 그러나 CEE-T3.2 및 CEE-T4의 경우 유전자 발현이 급격하게 감소하였다. 다음으로 ARPE-19와 RPE-1 세포주에서는 CEE-T2의 경우에 CEE-FL에 비해 eGFP 발현이 약 50% 수준으로 감소하였지만, CEE-T3부터 CEE-T3.1.2까지는 CEE-FL과 비슷하거나 좀 더 높은 eGFP의 발현을 보여주었다. 그러나 앞의 세포주들에서와 동일하게 CEE-T3.2 및 CEE-T4에서는 발현이 급격히 감소하였다. 이상의 결과들은 EF-1α 인트론 A에서 유전자 발현 증가 기능을 보유한 인트론 A 단편은 T2부터 T3.1.2까지이며, 그 중 가장 짧은 것이 T3.1.2임(또는 T3.2 보다 긴 단편을 의미)을 제시한다(도 4B).
4. EF-1α 인트론 단편인 T3.1.1 및 T3.1.2에 의한 유전자 발현 증가
4-A. 치킨 β-액틴 프로모터와 조합된 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 및 T3.1.2의 제작
CAE-FL 구축물은 CMV 인핸서 및 치킨 β-액틴 프로모터, 치킨 β- 액틴 엑손 1의 32 bp와, EF-1α 엑손 1의 29 bp, EF-1α 인트론 A 924 bp, EF-1α 엑손 2의 9 bp를 포함하도록 설계되었다. CA는 EF-1α 인트론 전체가 결실된 구축물이다. CAE-T3.1.1 구축물은 EF-1α 인트론 5' 말단의 19 bp와 3' 말단의 T3.1.1 서열을 포함하고 그 사이의 829 bp가 결실되어 있는 점 이외에는 CAE-FL과 동일하다. CAE-T3.1.2 구축물은 EF-1α 인트론 A 5' 말단의 19 bp와 3' 말단의 T3.1.2 서열을 포함하고 그 사이의 851 bp가 결실되어 있는 점 이외에는 CAE-FL과 동일하다(도 5A).
4-B. 치킨 β-액틴 프로모터와 조합된 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1 또는 T3.1.2에 의한 유전자 발현 증가
EF-1α 인트론의 모든 뉴클레오타이드가 완전 결실된 CA와, 부분 결실된 EF-1α 인트론을 포함한 CAE-T3.1.1과 CAE-T3.1.2 등 3종류의 구축물을 이용하여 두 종류의 동물세포주(HeLa, ARPE-19)에서 eGFP 발현을 비교하였다. CAE-T3.1.1 및 CAE-T3.1.2 군에서는 CA 구축물 군과 비교할 때 HeLa에서는 330.5%, 243.9%, ARPE-19에서는 170.8%, 165.9% 수준의 eGFP 발현이 관찰되었다(도 5B). 이러한 결과는 EF-1α 인트론의 단편인 T3.1.1과 T3.1.2가 치킨 β-액틴 프로모터와의 조합에서도 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
4-C. EF-1α 인트론 단편인 T3.1.1 및 T3.1.2와 치킨 β-액틴의 스플라이싱 공여체가 조합된 구축물의 제작
CMV 인핸서, 치킨 β-액틴 프로모터, 치킨 β-액틴 엑손 1의 93 bp와 인트론 43 bp를 유지한 상태에서 EF-1α 인트론의 3' 말단 단편 95 bp(T3.1.1) 혹은 73 bp(T3.1.2)와 EF-1α 엑손 2의 9 bp를 포함하는 하이브리드 인트론 구조를 갖는 CA-T3.1.1, CA-T3.1.2 구축물을 제작하였다. 치킨 β-액틴 엑손 1 및 치킨 β-액틴 인트론 일부는 스플라이싱 공여체의 기능을 제공해 주며, EF-1α 인트론 A 단편은 스플라이싱 수용체 기능을 할 것으로 기대하였다. 대조군으로 인트론 서열이 없는 CA 구축물을 함께 테스트하였다(도 5C).
4-D. 치킨 β-액틴의 스플라이싱 공여체 단편과 EF-1α 인트론 A의 3' 말단 단편인 T3.1.1 및 T3.1.2가 하이브리드된 인트론에 의한 유전자 발현 증가
CA, CA-T3.1.1, CA-T3.1.2 구축물을 각각 HeLa 및 Hep3B 세포주에 형질도입 을 한 뒤 유전자 발현정도를 비교한 결과, 인트론이 없는 CA에 대비하여 CA- T3.1.1, CA-T3.1.2에서 유전자 발현이 증가 (HeLa : 215.7%, 211.0%, Hep3B : 155.0%, 167.5%)됨을 확인하였다. 이러한 결과는 EF-1α 인트론 단편인 T3.1.1과 T3.1.2가 다른 유전자의 스플라이싱 공여체와 함께 조합된 경우에도 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 제시한다(도 5D).
5. AAV를 이용하여 유전자를 전달하는 경우에서의 T3.1.1 및 T3.1.2 단편에 의한 유전자 발현 증가
5-A. AAV2를 이용한 시험관내 유전자 전달에 있어서 T3.1.1 및 T3.1.2 단편에 의한 유전자 발현 증가
AAV를 이용하여 유전자를 전달하는 경우에도 EF-1α 인트론의 단편인 T3.1.1 혹은 T3.1.2가 유전자 발현을 효율적으로 유도할 수 있는지 확인하기 위하여 상기 단편을 포함한 AAV2들(CA-T3.1.1, CA-T3.1.2, CAE-T3.1.1, CAE-T3.1.2)을 생산한 후 유전자발현 조절부위로 CAG-FL 혹은 CAE-FL를 포함한 AAV2와 비교하였다. 제작한 AAV2들은 세포 외부 분비능을 가진 애플리버셉트 단백질을 발현하도록 설계되었다(시그널 펩타이드 서열은 hIgG 시그널 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서 열을 사용하였다: 서열목록 제26서열). MG132를 처리한 HEK293 세포주에 25,000 MOI 조건으로 AAV2를 감염시켰고, 48시간 후 ELISA를 진행하여 세포배양액에서의 애플리버셉트의 농도를 측정하였다. 그 결과, CAG-FL와 비교했을 때 CA-T3.1.1 혹 은 CA-T3.1.2를 포함한 AAV2로 감염시킨 경우 각각 200.1%와 213.1% 수준으로 애플리버셉트의 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한, CAE-FL와 비교한 경우 CAE- T3.1.1 및 CAE-T3.1.2 AAV2 그룹에서 각각 118.2%, 166.5% 수준으로 애플리버셉트의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 6A). 이상의 결과는 플라스미드 DNA를 이용하여 유전자를 전달한 경우와 유사하게 AAV2를 이용하여 유전자를 전달한 경우에서도 EF-1α 인트론 A 단편 T3.1.1 및 T3.1.2가 유전자 발현을 효율적으로 증가시킬 수 있음을 제시한다.
5-B. AAV8을 이용한 생체내 유전자 전달에 있어서 T3.1.1 및 T3.1.2 단편에 의한 유전자 발현 증가
AAV를 이용하여 생체내로 유전자를 전달하는 경우에도 EF-1α 인트론의 단편인 T3.1.1이 유전자 발현을 효율적으로 유도할 수 있는지 확인하기 위하여 상기 단편을 포함한 AAV8들(CA-T 3.1.1, CAE-T3.1.1)을 생산한 후 유전자발현 조절부위로 CAG-FL 혹은 CAE-FL를 포함한 AAV8와 비교하였다. 제작한 AAV8들은 세포 외부 분비능을 가진 애플리버셉트 단백질을 발현하도록 설계되었다(시그널 펩타이드 서열은 hIgG 시그널 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 사용하였다: 서열목록 제 26서열). 바이러스들을 생산한 후 그룹별로 생쥐 8마리의 양쪽 안구에 망막하 주사를 통해 각각 1×109 vg의 AAV8를 전달하고 28일 후 각 안구에서의 애플리버셉트의 발현을 ELISA를 통하여 확인하였다. 그 결과 CAE-T3.1.1 투여군에서는 CAE-FL 그룹 대비 147.6% 수준의 애플리버셉트의 발현이 관찰되었으며 CA-T3.1.1 투여군에 서는 CAG-FL 그룹 대비 118.7% 수준의 애플리버셉트의 발현이 관찰되었다(도 6B). 이러한 결과는 생체내에서도 EF-1α 인트론 단편 T3.1.1이 유전자 발현을 효율적 으로 유도할 수 있음을 제시한다.
상기 외래 유전자로 애플리버셉트를 삽입한 pAAV-CA-T3.1.1 벡터의 개열지도는 도 6C와 같다.
본 출원에서 인용된 모든 공보, 특허, 특허출원 및 그 밖의 다른 문헌들을 각각의 개별 공보, 특허, 특허출원 또는 그 밖의 다른 문헌이 모든 목적을 위해 개별적으로 참고로서 포함되는 것으로 나타내었더라도 동일하게 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참고로서 포함된다.
이상, 상술한 양태를 참조하여 본 개시 내용을 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 개시 내용의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 삽입에 의해 다양한 수정 및 변경이 가능함을 이해할 것이다. 이러한 수정 및 변경은 본 개시 내용의 범위 내에 있음을 이해할 것이다.
<110> NEURACLE GENETICS INC.
<120> NOVEL INTRON FRAGMENTS
<130> PCT766
<150> KR 10-2020-0084038
<151> 2020-07-08
<150> US 17/365,884
<151> 2021-07-01
<160> 74
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<210> 1
<211> 924
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron FL
<400> 1
cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt acttccacgc 60
ccctggctgc agtacgtgat tcttgatccc gagcttcggg ttggaagtgg gtgggagagt 120
tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg cctcgtgctt gagttgaggc ctggcttggg 180
cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat 240
aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga cctgctgcga cgcttttttt ctggcaagat 300
agtcttgtaa atgcgggcca agatctgcac actggtattt cggtttttgg ggccgcgggc 360
ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg 420
ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc ctgctctggt gcctggcctc 480
gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg 540
tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg 600
cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca 660
gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc 720
tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt 780
ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc 840
ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt 900
caaagttttt ttcttccatt tcag 924
<210> 2
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment T3.1.1
<400> 2
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 60
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<211> 380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV enhancer
<400> 4
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg 380
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV promoter fragment
<400> 5
gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg c 31
<210> 6
<211> 218
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV promoter
<400> 6
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccg 218
<210> 7
<211> 201
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha promoter
<400> 7
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60
gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180
tagtcgccgt gaacgttctt t 201
<210> 8
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chicken beta-actin promoter
<400> 8
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 60
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 120
gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt 180
gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg 240
cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcg 279
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha splicing donor
<400> 9
gtaagtgccg tgtgtggtt 19
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chicken beta-actin splicing donor
<400> 10
gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agc 43
<210> 11
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha exon 2 fragment
<400> 11
gtgtcgtga 9
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV exon 1 fragment
<400> 12
tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg 30
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha exon 1 fragment
<400> 13
ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacag 29
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chicken beta-actin exon 1 fragment 1
<400> 14
ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg cc 32
<210> 15
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chicken beta-actin exon 1 fragment 2
<400> 15
ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 60
ccccggctct gactgaccgc gttactccca cag 93
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR142-3p target sequence
<400> 16
tccataaagt aggaaacact aca 23
<210> 17
<211> 104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Four repeats of miR142-3p target sequence with spacer
<400> 17
tccataaagt aggaaacact acacgattcc ataaagtagg aaacactaca acgttccata 60
aagtaggaaa cactacatca ctccataaag taggaaacac taca 104
<210> 18
<211> 589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WPRE
<400> 18
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 19
<211> 477
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hGH pA sequence
<400> 19
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180
acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240
ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300
ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360
ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420
tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtcctt 477
<210> 20
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bGH pA sequence
<400> 20
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 21
<211> 122
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 early pA sequence
<400> 21
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
ta 122
<210> 22
<211> 134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 late pA sequence
<400> 22
atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 60
taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 120
ggaggttttt taaa 134
<210> 23
<211> 1296
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Aflibercept
<400> 23
tctgataccg gcagaccctt cgtggaaatg tacagcgaga tccccgagat catccacatg 60
accgagggca gagagctggt catcccttgc agagtgacaa gccccaacat caccgtgaca 120
ctgaagaagt tccctctgga cacactgatc cccgacggca agagaatcat ctgggacagc 180
cggaagggct tcatcatcag caacgccacc tacaaagaga tcggcctgct gacatgcgag 240
gccacagtga atggccacct gtacaagacc aactacctga cacacagaca gaccaacacc 300
atcatcgacg tggtgctgag cccttctcac ggcattgagc tgtctgtggg agagaagctg 360
gtgctgaatt gcaccgccag aaccgagctg aacgtgggca tcgacttcaa ctgggagtac 420
cccagcagca agcaccagca caagaaactg gtcaaccggg acctgaaaac ccagagcggc 480
agcgagatga agaaattcct gagcaccctg accatcgacg gcgtgacaag aagcgatcag 540
ggcctgtaca catgtgccgc cagctctggc ctgatgacca agaaaaacag caccttcgtg 600
cgggtgcacg agaaggacaa gacccacaca tgtcctccat gtcctgctcc agaactgctc 660
ggcggaccct ccgttttcct gtttccacct aagcctaagg acaccctgat gatcagcaga 720
acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtctcacg aggaccccga agtgaagttc 780
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 840
tacaactcca catacagagt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 900
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgctcctat cgagaaaacc 960
atctccaagg ccaagggcca gccaagagaa ccccaggttt acacactgcc tccaagcagg 1020
gacgagctga caaagaatca ggtgtccctg acctgcctgg tcaagggctt ctacccttcc 1080
gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gacaacccct 1140
cctgtgctgg acagcgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc 1200
agatggcagc agggcaacgt gttcagctgt tctgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1260
tacacccaga agtctctgag cttgtctcct ggctaa 1296
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #001
<400> 24
ggaagatctc tgtgccttct agttgccagc 30
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #002
<400> 25
cacgtggtta ccccatagag cccaccgcat c 31
<210> 26
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #003
<400> 26
agctttccat aaagtaggaa acactacacg attccataaa gtaggaaaca ctacaacgtt 60
c 61
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #004
<400> 27
tagtgtttcc tactttatgg aatcgtgtag tgtttcctac tttatgga 48
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #005
<400> 28
cataaagtag gaaacactac atcactccat aaagtaggaa acactacag 49
<210> 29
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #006
<400> 29
tcgactgtag tgtttcctac tttatggagt gatgtagtgt ttcctacttt atggaacgtt 60
g 61
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #007
<400> 30
gtgtgtggtt tgctgcaggg agctcaaaat g 31
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #008
<400> 31
cggtgatgac ggtgaaaacc 20
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #009
<400> 32
ccctgcagca aaccacacac ggcacttacc 30
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #010
<400> 33
ggttttcacc gtcatcaccg 20
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #011
<400> 34
gtgtgtggtt tcgagctttt ggagtacgtc g 31
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #012
<400> 35
aaaagctcga aaccacacac ggcacttacc 30
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #013
<400> 36
gtgtgtggtt gttaggccag cttggcac 28
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #014
<400> 37
ctggcctaac aaccacacac ggcacttacc 30
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #015
<400> 38
gtgtgtggtt tcattctcaa gcctcagaca gtg 33
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #016
<400> 39
ttgagaatga aaccacacac ggcacttacc 30
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #017
<400> 40
gtgtgtggtt tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg 40
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #018
<400> 41
ctttgaacca aaccacacac ggcacttacc 30
<210> 42
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #019
<400> 42
ccggaattct gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac gg 52
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #020
<400> 43
cgcggatccc tgtgttctgg cggcaaac 28
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #021
<400> 44
cgcggatccc ggttcactaa acgagctctg cttatatag 39
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #022
<400> 45
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg 30
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #023
<400> 46
cccaagcttg gatcctcacg acacctgaaa tg 32
<210> 47
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #024
<400> 47
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 60
tcttccattt caggtgtcgt gaggatcca 89
<210> 48
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #025
<400> 48
agcttggatc ctcacgacac ctgaaatgga agaaaaaaac tttgaaccac tgtctgaggc 60
ttgagaatga accaagatcc aaactcaaaa agg 93
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #026
<400> 49
cggggtacct tcgcaacggg tttgccg 27
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #027
<400> 50
cgcggatcct cacgacacct g 21
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #028
<400> 51
tgaggatccg ccaccatgga gtttgg 26
<210> 52
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #029
<400> 52
cgcaagcttc agtagcgctt tagccaggag acaagctcag agacttctg 49
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #030
<400> 53
ggaaccccta gtgatggagt t 21
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #031
<400> 54
cggcctcagt gagcga 16
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo #032
<400> 55
cactccctct ctgcgcgctc g 21
<210> 56
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIgG signal peptide sequence
<400> 56
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt ttagaggtgt ccagtgt 57
<210> 57
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment T3.2
<400> 57
ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca g 51
<210> 58
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 58
tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcag 54
<210> 59
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 59
gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt 60
tcag 64
<210> 60
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 60
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 60
tcttccattt cag 73
<210> 61
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 61
ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt 60
ttcttccatt tcag 74
<210> 62
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 62
ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt 60
caaagttttt ttcttccatt tcag 84
<210> 63
<211> 104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 63
ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc 60
tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcag 104
<210> 64
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 64
aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct 60
tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcag 114
<210> 65
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 65
gttaggccag cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga 60
tcttggttca ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcag 117
<210> 66
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 66
gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga 60
gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt 120
tcag 124
<210> 67
<211> 174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 67
tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt 60
aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct 120
tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcag 174
<210> 68
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 68
tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt 60
ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc 120
ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt 180
caaagttttt ttcttccatt tcag 204
<210> 69
<211> 224
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 69
ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg 60
ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt 120
ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc 180
tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcag 224
<210> 70
<211> 274
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 70
tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct 60
cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc 120
gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat 180
gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca 240
gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcag 274
<210> 71
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 71
cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca 60
gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc 120
tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt 180
ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc 240
ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt 300
caaagttttt ttcttccatt tcag 324
<210> 72
<211> 355
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 72
tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc 60
cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta 120
ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg 180
ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt 240
taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc 300
ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcag 355
<210> 73
<211> 374
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 73
gatggccgct tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag 60
agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt 120
catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt 180
ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg 240
agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg 300
ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt 360
ttcttccatt tcag 374
<210> 74
<211> 424
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF-1 alpha intron fragment
<400> 74
gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct 60
tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg 120
tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc 180
cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc 240
gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga 300
gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga 360
gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt 420
tcag 424
Claims (90)
- 서열목록 제1서열의 874번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 비번역 핵산 서열을 포함하되, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제1서열을 포함하지 않는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제57서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드.
- 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 비번역 핵산 서열을 포함하되, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제1서열을 포함하지 않는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제4항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제3서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제4항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제3서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드.
- 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 비번역 핵산 서열을 포함하되, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제1서열을 포함하지 않는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제7항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제2서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제7항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열이 서열목록 제2서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열의 5' 말단("5' 영역")에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제10항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열의 5' 영역에 서열목록 제1서열 내 1번째 내지 873번째 위치에 해당하는 하나 이상의 연속 또는 비연속 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열의 3' 말단("3' 영역")에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 40개, 적어도 약 50개, 적어도 약 60개, 적어도 약 70개, 적어도 약 80개, 적어도 약 90개 또는 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열이 (i) 서열목록 제1서열의 871번째 내지 924번째(즉, 서열목록 제58서열), (ii) 서열목록 제1서열의 861번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제59서열), (iii) 서열목록 제1서열의 852번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제60서열), (iv) 서열목록 제1서열의 851번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제61서열), (v) 서열목록 제1서열의 830번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제2서열), (vi) 서열목록 제1서열의 821번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제63서열), (vii) 서열목록 제1서열 811번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제64서열), (viii) 서열목록 제1서열의 808번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제65서열), (ix) 서열목록 제1서열의 801번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제66서열), (x) 서열목록 제1서열의 751번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제67서열), (xi) 서열목록 제1서열의 721번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제68서열), (xii) 서열목록 제1서열의 701번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제69서열), (xiii) 서열목록 제1서열의 651번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제70서열), (xiv) 서열목록 제1서열의 601번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제71서열), (xv) 서열목록 제1서열의 570번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제72서열), (xvi) 서열목록 제1서열의 551번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제73서열) 또는 (xvii) 서열목록 제1서열의 501번째 내지 924번째 뉴클레오타이드(즉, 서열목록 제74서열)와 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 외래 유전자를 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제14항에 있어서, 상기 외래 유전자가 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오타이드.
- 제15항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열은 번역시 기준 발현 대비 상기 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 것으로, 상기 기준 발현은 비번역 핵산 서열이 없는 상태 및/또는 서열목록 제1서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 상태에서 번역시 해당 외래 유전자의 발현을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제16항에 있어서, 상기 비번역 핵산 서열이 상기 외래 유전자의 발현을 상기 기준 발현보다 적어도 약 1배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배 또는 적어도 약 10배 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터를 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제18항에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF-1α 프로모터, β-액틴 프로모터, GAPDH 프로모터, HSP70 프로모터, GRP78 프로모터, eIF4a 프로모터, AAT 프로모터, TTR 프로모터, GFAP 프로모터, SV40 프로모터, SYN1 프로모터, GRK 프로모터, Rho 프로모터 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제19항에 있어서, 상기 프로모터가 EF-1α 프로모터인 폴리뉴클레오타이드.
- 제20항에 있어서, 상기 EF-1α 프로모터가 서열목록 제7서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제19항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제22항에 있어서, 상기 CMV 프로모터가 서열목록 제5서열 또는 제6서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제19항에 있어서, 상기 프로모터가 β-액틴 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제24항에 있어서, 상기 β-액틴 프로모터가 서열목록 제8서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서를 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제26항에 있어서, 상기 인핸서가 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, SV40 초기 인핸서, 아데노바이러스 5 E1A 인핸서, HBV 인핸서-1 조절 영역(Eh-1), HPV-16 또는 -18 E6/7 긴 조절 영역(LCR), HIV-1 긴 반복말단(LTR) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제27항에 있어서, 상기 CMV 인핸서가 서열목록 제4서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 스플라이싱 공여체 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제29항에 있어서, 상기 스플라이싱 공여체 서열이 상기 비번역 핵산 서열의 상류에 연결되어 있는 폴리뉴클레오타이드.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 스플라이싱 공여체 서열이 서열목록 제9서열 또는 제10서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, EF-1α 엑손 2(E2) 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제32항에 있어서, 상기 EF-1α 엑손 2(E2) 뉴클레오타이드 서열이 서열목록 제11서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 엑손 1(E1) 서열, EF-1α E1 서열, β-액틴 E1 서열 또는 이들의 임의의 조합을 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제34항에 있어서, 상기 CMV E1 서열이 서열목록 제12서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오타이드.
- 제34항에 있어서, 상기 EF-1α E1 서열이 서열목록 제13서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오타이드.
- 제34항에 있어서, 상기 β-액틴 E1 서열이 서열목록 제14서열 또는 제15서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역세포에 특이적인 microRNA(miRNA)에 대한 적어도 하나의 타겟 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제38항에 있어서, 상기 miRNA가 miR142-3p, miR142-5p 또는 2개 모두를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열이 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어, 소헤어핀 RNA(shRNA) 분자, 소방해 RNA(siRNA) 분자, 라이보자임, 펩타이드 핵산(PNA) 올리고뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제41항에 있어서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열이 miR142-3p 또는 miR142-5p의 전장 또는 일부 서열에 상보적인 폴리뉴클레오타이드.
- 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA에 대한 타겟 서열이 서열목록 제16서열 또는 서열목록 제17서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 타겟 서열, 적어도 3개의 타겟 서열, 적어도 4개의 타겟 서열, 적어도 5개의 타겟 서열, 적어도 6개의 타겟 서열, 적어도 7개의 타겟 서열, 적어도 8개의 타겟 서열, 적어도 9개의 타겟 서열 또는 적어도 10개의 타겟 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제43항에 있어서, 상기 타겟 서열 중 2개 이상이 동일한 폴리뉴클레오타이드.
- 제43항에 있어서, 상기 타겟 서열은 서로 다른 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE) 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제46항에 있어서, 상기 WPRE 서열이 서열목록 제18서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리아데닐화(pA) 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제48항에 있어서, 상기 pA 서열이 서열목록 제19서열 내지 제22서열 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
- 제14항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외래 유전자가 야생형 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 변이체, 융합 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, RNA-기반 분자 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제50항에 있어서, 상기 외래 유전자가 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 외래 유전자가 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 혈관 내피세포 성장 인자("VEGF")의 저해제를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제53항에 있어서, 상기 VEGF의 저해제가 애플리버셉트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제50항에 있어서, 상기 RNA-기반 분자가 miRNA, shRNA, siRNA, 라이보자임 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 발현 구축물인 폴리뉴클레오타이드.
- (i) 외래 유전자 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 조절 요소가 (5'로부터 3' 방향으로):
(1) 서열목록 제4서열에 나타낸 CMV 인핸서;
(2) 서열목록 제5서열 또는 제6서열에 나타낸 CMV 프로모터 서열, 서열목록 제7서열에 나타낸 EF-1α 프로모터 서열 또는 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열로부터 선택되는 프로모터;
(3) 서열목록 제12서열에 나타낸 CMV E1 서열, 서열목록 제13서열에 나타낸 EF-1α E1 서열 또는 서열목록 제14서열 또는 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 E1 서열로부터 선택되는 엑손 1(E1) 서열;
(4) 서열목록 제9서열 또는 제10서열에 나타낸 스플라이싱 공여체 서열;
(5) 서열목록 제2서열(TGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG), 서열목록 제3서열(CCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG) 또는 서열목록 제57서열(TTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 비번역 핵산 서열; 및
(6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α E2 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드. - 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
- 제58항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
- 제59항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스(예를 들어 유전자 조작된 아데노바이러스), 아데노-연관 바이러스(AAV), 렌티바이러스, SV40-형 바이러스, 폴리오마바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 유두종 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 백시니아 바이러스, 소아마비 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 벡터.
- 제60항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 AAV인 벡터.
- 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 치료에 사용하기 위한 벡터.
- 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 발현에 사용하기 위한 벡터.
- 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외래 유전자가 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
- 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및 rep 및 cap 유전자를 함유한 구축물로 세포를 형질도입하는 것을 포함하는 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위한 방법.
- 제66항에 있어서, 생산된 재조합 바이러스 입자를 분리하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제66항 또는 제67항의 방법에 의해 생산된 재조합 바이러스 입자.
- (a) 캡시드 단백질 및 (b) 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자.
- 제69항에 있어서, 아데노-연관 바이러스(AVV)인 재조합 바이러스 입자.
- 제70항에 있어서, 상기 AAV의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAVrh10인 재조합 바이러스 입자.
- 제71항에 있어서, 상기 AAV의 혈청형이 AAV2인 재조합 바이러스 입자.
- 제71항에 있어서, 상기 AAV의 혈청형이 AAV8인 재조합 바이러스 입자.
- 제71항에 있어서, 상기 AAV의 혈청형이 AAV5인 재조합 바이러스 입자.
- 제71항에 있어서, 상기 AAV의 혈청형이 AAV9인 재조합 바이러스 입자.
- (a) 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제65항에 따른 세포 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 입자; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 재조합 아데노-연관 바이러스 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 재조합 아데노-연관 바이러스 입자가 (a) AAV 8형 캡시드 단백질 및 (b) (i) 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외래 유전자 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결되고 (5'로부터 3' 방향으로):
(1) 서열목록 제4서열에 나타낸 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 서열;
(2) 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열;
(3) 서열목록 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열;
(4) 서열목록 제10서열에 나타낸 치킨 β-액틴 인트론의 스플라이싱 공여체 서열;
(5) 서열목록 제2서열(TGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG), 서열목록 제3서열(CCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG) 또는 서열목록 제57서열(TTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 비번역 핵산 서열; 및
(6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함하는 조절 요소;를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물. - 재조합 아데노-연관 바이러스 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안과 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 재조합 아데노-연관 바이러스 입자가 (a) AAV 8형 캡시드 단백질 및 (b) (i) 서열목록 제23서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 외래 유전자 및 (ii) 상기 외래 유전자에 작동 가능하게 연결되고 (5'로부터 3' 방향으로):
(1) 서열목록 제4서열에 나타낸 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 서열;
(2) 서열목록 제8서열에 나타낸 치킨 β-액틴 프로모터 서열;
(3) 서열목록 제15서열에 나타낸 치킨 β-액틴 엑손 1(E1) 서열;
(4) 서열목록 제10서열에 나타낸 치킨 β-액틴 인트론의 스플라이싱 공여체 서열;
(5) 서열목록 제2서열 (TGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG), 서열목록 제3서열(CCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG) 또는 서열목록 제57서열(TTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 뉴클레오타이드 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 비번역 핵산 서열; 및
(6) 서열목록 제11서열에 나타낸 EF-1α 엑손 2(E2) 서열을 포함하는 조절 요소;를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물. - 제78항에 있어서, 상기 안과 질환이 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기 또는 이들의 조합을 포함하는 용도의 약제학적 조성물.
- 제79항에 있어서, 상기 황반변성이 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함하는 용도의 약제학적 조성물.
- 세포에서 외래 유전자의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포를 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 입자와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
- 제81항에 있어서, 상기 접촉을 생체내에서 진행하는 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 접촉 전에 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스 입자를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제81항에 있어서, 상기 접촉을 생체외에서 진행하는 방법.
- 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외래 유전자의 발현이 기준 세포에서의 해당 발현에 비해 적어도 약 1배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배 또는 적어도 약 10배 증가하는 것으로, 상기 기준 세포는 상기 비번역 핵산 서열이 결여되어 있거나 서열목록 제1서열에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 재조합 바이러스 입자와 접촉하는 방법.
- 필요로 하는 대상에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 입자를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제86항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 안과 질환을 포함하는 방법.
- 제87항에 있어서, 상기 안과 질환이 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성, 황반변성, 망막변성, 황반부종, 망막부종, 황반부기 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
- 제88항에 있어서, 상기 황반변성이 연령-관련 황반변성(AMD)을 포함하는 방법.
- 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
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