JP2023523714A - 新規なイントロン断片 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示内容は、外来遺伝子の発現量を増加させることができる新規なイントロン断片(すなわち、非翻訳(untranslated)核酸配列)に関する。
真核生物のpre-mRNAは、実際の遺伝情報を含むエクソン(exon)とエクソンとの間に存在するイントロン(intron)から構成され、3’-末端にはポリA配列が存在する。イントロンは、mRNA代替スプライシング(alternativesplicing)に影響を及ぼし、タンパク質生産量を調節する(Huh,GS,et al.,“Regulation of Alternative pre-mRNA Splicing by a Novel Repeated Hexanucleotide Element,”Genes Dev 8(13):1561-74(Jul.1994);Parenteau,J.,et al.,“Introns Within Ribosomal Protein Genes Regulate the Production and Function of Yeast Ribosomes,”Cell 147(2):320-31(Oct.2011))。また、イントロンを含む外来遺伝子(transgenes)は、マウスにおいてイントロンがない場合に比べて10倍~100倍より効率的に転写され、さらに生存に影響を与えると報告されている(Brinster,RL,et al.,“Introns Increase Transcriptional Efficiency in Transgenic Mice,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85(3):836-40(Feb.1988);Parenteau,J.,et al.,“Introns Are Mediators of Cell Response to Starvation,”Nature 565(7741):612-617(Jan.2019))。このうち、イントロンによるタンパク質産生量の増加は、イントロン媒介増強(IME:intron-mediated enhancement)と呼ばれるが、このようなIME効果のために使用されるイントロンはほとんどかなり長いため、実際の使用において制約がある。一例として、最近、遺伝子治療用の伝達体として注目されているアデノ随伴ウイルス(AAV:adeno-associated virus)の場合、最大4.7kbp長の遺伝情報のみを挿入できるので、長い長さのイントロンを使用すれば、伝達できる遺伝子の範囲が非常に限られる。したがって、タンパク質発現増加能力は維持しながら、短いイントロン断片を発掘してAAVベクターに適用することができれば、非常に好ましいかもしれない。
〔発明が解決しようとする課題〕
〔関連出願についての相互参照事項〕
本出願は、2020年7月8日に出願された韓国特許出願第10-2020-0084038号及び2021年7月1日に出願された米国特許出願第17/365,884号の優先権を主張し、その全文が本明細書に参照として含まれる。
第1様態
配列リストの第1配列に示したEF-1αイントロン配列内のヌクレオチドのうち連続又は非連続ヌクレオチドが欠失した(truncated)配列を含む外来遺伝子発現用の伸長因子-1α(EF-1α)イントロン断片であって、(a)前記EF-1αイントロン断片が配列リストの第1配列に示した配列内の874~924番目の位置のヌクレオチドを必須に含み、(b)前記EF-1αイントロン断片が発現構築物中に存在する場合の配列リストの第1配列に示した配列内の874~924番目の位置のヌクレオチドのみからなるイントロン断片と比較して外来遺伝子発現を増加させるEF-1αイントロン断片。
第1様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~873番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第2様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~870番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第3様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~860番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第4様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~851番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第5様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~850番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第6様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~829番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第7様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~820番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第8様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~810番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第9様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~800番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第10様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~750番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第11様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~720番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第12様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~700番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第13様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~650番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第14様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~600番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第15様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~569番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第16様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~550番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第17様態において、前記連続又は非連続ヌクレオチドの欠失が、配列リストの第1配列に示した配列内の1~500番目の位置のヌクレオチドのうち、連続ヌクレオチドの欠失、前記欠失したヌクレオチドの間に欠失していないまま残っている非連続ヌクレオチドの欠失又は前記欠失した連続又は非連続ヌクレオチドの位置に相異なる種類のヌクレオチドの挿入を含む、EF-1αイントロン断片。
第7様態において、前記EF-1αイントロン断片が、配列リストの第2配列に示したヌクレオチド配列を含む、EF-1αイントロン断片。
第5様態において、前記EF-1αイントロン断片が、配列リストの第3配列に示したヌクレオチド配列を含む、EF-1αイントロン断片。
(a)外来遺伝子及び(b)前記外来遺伝子に作動可能に連結され、エンハンサー、プロモーター及び第1様態によるEF-1αイントロン断片を含む調節要素を含む外来遺伝子発現用の組換え発現構築物であって、前記外来遺伝子が宿主細胞から転写及び翻訳される組換え発現構築物。
第21様態において、前記エンハンサーはサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーである、組換え発現構築物。
第22様態において、前記サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーが配列リストの第4配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第21様態において、前記プロモーターがサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、EF-1αプロモーター及びβ-アクチンプロモーターからなる群から選択される、組換え発現構築物。
第24様態において、前記CMVプロモーターが、配列リストの第5配列又は第6配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第24様態において、前記EF-1αプロモーターが配列リストの第7配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第27様態
第24様態において、前記β-アクチンプロモーターが配列リストの第8配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第21様態において、前記EF-1αイントロン断片の上流にスプライシングドナー配列が連結されている、組換え発現構築物。
第28様態において、前記スプライシングドナー配列が、配列リストの第9配列又は第10配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第21様態において、前記組換え発現構築物がEF-1αエクソン2(E2)配列を含む、組換え発現構築物。
第30様態において、前記EF-1α E2配列が配列リストの第11配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第21様態において、前記組換え発現構築物がサイトメガロウイルス(CMV)、EF-1α又はβ-アクチンエクソン1(E1)配列を含む、組換え発現構築物。
第32様態において、前記CMV E1配列が配列リストの第12配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第32様態において、前記EF-1α E1配列が配列リストの第13配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第32様態において、前記β-アクチンE1配列が、配列リストの第14配列又は第15配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第21様態において、免疫細胞に特異的なmicroRNA(miRNA)に対する1つ以上のターゲット配列をさらに含む、組換え発現構築物。
第36様態において、前記miRNAがmiR142-3p又はmiR142-5である、組換え発現構築物。
第36様態において、前記miRNAに対するターゲット配列が、miR142-3p又はmiR142-5pの全長又は一部の配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴミア、短ヘアピンRNA(shRNA)分子、短干渉RNA(siRNA)分子、リボザイム、ペプチド核酸(PNA)オリゴヌクレオチド及びロックド核酸(LNA)オリゴヌクレオチドからなる群から選択される組換え発現構築物。
第38様態において、前記miR142-3pに対するターゲット配列が配列リストの第16配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第38様態において、前記miRNAのターゲット配列の数が2~6個である、組換え発現構築物。
第40様態において、前記miR142-3pに対するターゲット配列が配列リストの第17配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第21様態において、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE)配列をさらに含む、組換え発現構築物。
第42様態において、前記WPRE配列が配列リストの第18配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第21様態において、1つ以上のポリアデニル化(pA)配列をさらに含む、組換え発現構築物。
第44様態において、前記ポリアデニル化配列が、配列リストの第19~22配列に示したヌクレオチド配列からなる群から選択される、組換え発現構築物。
第21様態において、前記調節要素が、(1)配列リストの第4配列に示したCMVエンハンサー配列;(2)配列リストの第5配列又は第6配列に示したCMVプロモーター配列、配列リストの第7配列に示したEF-1αプロモーター配列又は配列リストの第8配列に示したチキンβ-アクチンプロモーター配列から選択されるプロモーター配列;(3)配列リストの第12配列に示したCMV E1配列、配列リストの第13配列に示したEF-1α E1配列又は配列リストの第14配列又は第15配列に示したチキンβ-アクチンE1配列;(4)配列リストの第9配列又は第10配列に示したスプライシングドナー配列;(5)請求項1に記載のEF-1αイントロン断片配列;及び(6)配列リストの第11配列に示したEF-1α E2配列を含む組換え発現構築物。
第21様態において、前記外来遺伝子が配列リストの第23配列に示したヌクレオチド配列を含む、組換え発現構築物。
第21様態による組換え発現構築物に形質導入された宿主細胞。
第21様態による組換え発現構築物及びrepとcap遺伝子を含む構築物に宿主細胞を形質導入することを含む組換えウイルスを産生するための方法。
(a)キャプシドタンパク質及び(b)第21様態による組換え発現構築物を含む組換えウイルス。
第50様態において、前記組換えウイルスがアデノ随伴ウイルス(AVV)である、組換えウイルス。
第51様態において、前記アデノ随伴ウイルスの血清型がAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9又はAAVrh10である、 組換えウイルス。
第21様態による組換え発現構築物又は第50様態による組換えウイルスを含む医薬組成物。
第53様態において、前記組成物が眼科疾患を予防又は治療するために使用される、医薬組成物。
第54様態において、前記眼科疾患が、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫及び黄斑腫脹からなる群から選択される、医薬組成物。
第21様態による組換え発現構築物又は第50様態による組換えウイルスの治療用の用途。
組換えアデノ随伴ウイルス及び薬学的に許容される担体を含む眼科疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、前記組換えアデノ随伴ウイルスが(a)AAV8型キャプシドタンパク質及び(b)配列リストの第23配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子及び前記外来遺伝子に作動可能に連結され:(1)配列リストの第4配列に示したサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー配列;(2)配列リストの第8配列に示したチキンβ-アクチンプロモーター配列;(3)配列リストの第15配列に示したチキンβ-アクチンエクソン1(E1)配列;(4)配列リストの第10配列に示したチキンβ-アクチンイントロンのスプライシングドナー配列;(5)配列リストの第1配列に示した配列内の1~829番目の位置のヌクレオチドのうち、連続又は非連続ヌクレオチドが欠失しており、配列リストの第1配列に示した配列内の830~924番目のヌクレオチドが必須に存在するEF-1αイントロン断片;及び(6)配列リストの第11配列に示したEF-1αエクソン2(E2)配列;を含む調節要素を含む外来遺伝子発現用の組換え発現構築物を含む医薬組成物。
本開示内容は、一般に、非翻訳核酸配列(本明細書では「イントロン」とも呼ばれる)及び外来遺伝子発現のためのそのような配列の用途に関する。本明細書に記載されているように、出願人は、EF-1αイントロン配列の特定の断片が外来遺伝子発現を増加させる優れた能力を示すことを確認した。本明細書に示されているように、一部の様態において、これらのEF-1αイントロン断片は、外来遺伝子発現を増加させることにおいて全長EF-1αイントロンと同等のレベル又はそれ以上である。本開示内容のさらなる様態は、本出願の全体を通して提供されている。
本開示内容の全体を通して、用語「1つ」又は「任意の」実体は、その実体の1つ以上を指すものである。例えば、「1つのポリペプチド」は、1つ以上のポリペプチドを表すと理解される。このように、用語「1つ」(又は「任意の」)、「1つ以上」及び「少なくとも1つ」は、本明細書で混用されることができる。
II.A.非翻訳核酸配列
本開示内容は、非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記非翻訳核酸配列が翻訳時に外来遺伝子の発現を増加させ得るポリヌクレオチドに関する。具体的には、本明細書は、全長EF-1αイントロンより短い伸長因子-1α(EF-1α)イントロン配列を提供する。
一部の様態において、本明細書に記載の非翻訳核酸配列を含むポリヌクレオチドは、外来遺伝子をさらに含む。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含むものであって、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第1配列の874~924番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるが、又は前記ヌクレオチドからなるが、配列リストの第1配列は含まない(例えば、配列リストの第57配列)。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第1配列の852~924番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるが、配列リストの第1配列は含まない(例えば、配列リストの第3配列)。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列は配列リストの第1配列の830~924番目のヌクレオチドを含むか、前記ヌクレオチドから必須になるか、又は前記ヌクレオチドからなるが、配列リストの第1配列は含まない(例えば、配列リストの第2配列)。
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは調節要素をさらに含む。したがって、一部の様態において、ポリヌクレオチドは、(1)調節要素、(2)本明細書に記載の非翻訳核酸配列、及び(3)外来遺伝子を含む。
一部の様態において、前記調節要素はエンハンサーである。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、(特定の順序なし)(1)エンハンサー、(2)非翻訳核酸配列、及び(3)外来遺伝子を含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、(5’から3’方向に):(1)エンハンサー、(2)非翻訳核酸配列、及び(3)外来遺伝子を含む。
一部の様態において、前記調節要素はプロモーターである。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、(特定の順序なし)(1)プロモーター、(2)非翻訳核酸配列、及び(3)外来遺伝子を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは(5’から3’方向に):(1)プロモーター、(2)非翻訳核酸配列、及び(3)外来遺伝子を含む。一部の様態において、前記調節要素はエンハンサー及びプロモーターの両方を含む。そのような様態では、ポリヌクレオチドは、(特定の順序なし)(1)エンハンサー、(2)プロモーター、(3)非翻訳核酸配列、及び(4)外来遺伝子を含み得る。一部の様態において、ポリヌクレオチドは(5から3’方向に):(1)エンハンサー、(2)プロモーター、(3)非翻訳核酸配列、及び(4)外来遺伝子を含む。当技術分野で知られている任意の適切なプロモーターを本開示内容で使用することができる。
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド(すなわち、非翻訳核酸配列を含む)はスプライシングドナー配列を含む。本明細書で使用する「スプライシングドナー配列」又は「スプライシングドナー部位」という用語は、イントロン(例えば、EF-1αイントロン)の5’末端に存在するグアニン-チミン(GT)が豊富なドメインを指す(イントロンとエクソンとの境界を暗示する)。本明細書に示されているように、そのような配列は、本開示内容の非翻訳核酸配列を生成するようにターゲット化され得る。一部の様態において、スプライシングドナー配列は、EF-1αイントロン断片(すなわち、非翻訳核酸配列)の上流に連結される。例えば、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、(特定の順序なし)(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)スプライシングドナー配列、(4)非翻訳核酸配列、及び(5)外来遺伝子を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは(5’から3’方向に):(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)スプライシングドナー配列、(4)非翻訳核酸配列及び(5)外来遺伝子を含む。
本明細書に示されているように、一部の様態において、本開示内容のポリヌクレオチドは1つ以上のエクソン配列をさらに含む。例えば、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドはEF-1αエクソン2(E2)配列を含む。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、以下の特徴部を含む(特定の順序なし):(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)スプライシングドナー配列、(4)非翻訳核酸配列、(5)EF-1α E2配列、及び(6)外来遺伝子。一部の様態において、そのようなポリヌクレオチドは(5’から3’方向に):(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)スプライシングドナー配列、(4)非翻訳核酸配列、(5)EF-1α E2配列、及び(6)外来遺伝子を含む。一部の様態において、前記EF-1α E2配列は、配列リストの第11配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する。一部の様態において、前記EF-1α E2配列は、配列リストの第11配列に示したヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載されているように、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドの調節要素は、免疫細胞に特異的なmicroRNA(miRNA)に対する1つ以上のターゲット配列(「miRNAターゲット配列」)を含む。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、以下の特徴部を含む(特定の順序なし):(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)E1配列(例えば、CMV E1配列、EF-1α E1配列及び/又はβ-アクチンE1配列)、(4)スプライシングドナー配列、(5)非翻訳核酸配列、(6)EF-1α E2配列、(7)外来遺伝子、及び(8)以上のmiRNAターゲット配列を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは(5’から3’方向に):(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)E1配列(例えば、CMV E1配列、EF-1α E1配列及び/又はβ-アクチンE1配列)、(4)スプライシングドナー配列、(5)非翻訳核酸配列、(6)EF-1α E2配列、(7)外来遺伝子、及び(8)1つ以上のmiRNAターゲット配列を含む。
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド(すなわち、非翻訳核酸配列を含む)は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE)配列をさらに含む。したがって、一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは(特定の順序なし)(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)E1配列(例えば、CMV E1配列、EF-1α E1配列及び/又はβ-アクチンE1配列)、(4)スプライシングドナー配列、(5)非翻訳核酸配列、(6)EF-1α E2配列、(7)外来遺伝子、(8)1つ以上のmiRNAターゲット配列、及び(9)WPRE配列を含む。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、(5’から3’方向に):(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)E1配列(例えば、CMV E1配列、EF-1α E1配列及び/又はβ-アクチンE1配列)、(4)スプライシングドナー配列、(5)非翻訳核酸配列、(6)EF-1α E2配列、(7)外来遺伝子、(8)1つ以上のmiRNAターゲット配列、及び(9)WPRE配列を含む。
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド(すなわち、非翻訳核酸配列を含む)は、1つ以上のポリアデニル化(pA)配列をさらに含む。したがって、一部の様態において、ポリヌクレオチドは(特定の順序なし)(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチンプロモーター)、(3)E1配列(例えば、CMV E1配列、EF-1α E1配列及び/又はβ-アクチンE1配列)、(4)スプライシングドナー配列、(5)非翻訳核酸配列、(6)EF-1α E2配列、(7)外来遺伝子、(8)1つ以上のmiRNAターゲット配列、(9)WPRE配列、及び(10)1つ以上のpA配列を含む。一部の様態において、ポリヌクレオチドは(5’から3’方向に):(1)エンハンサー(例えば、CMVエンハンサー)、(2)プロモーター(例えば、CMVプロモーター、EF-1αプロモーター及び/又はβ-アクチン)、(3)E1配列(例えば、CMV E1配列、EF-1α E1配列及び/又はβ-アクチンE1配列)、(4)スプライシングドナー配列、(5)非翻訳核酸配列、(6)EF-1α E2配列、(7)外来遺伝子、(8)1つ以上のmiRNAターゲット配列、(9)WPRE配列、及び(10)1つ以上のpA配列を含む。
一部の様態において、本明細書は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む)のうち任意のポリヌクレオチドを含むベクター(例えば、発現ベクター)を提供する。本明細書に記載されているように、そのようなベクターは、宿主細胞及び治療的介入をターゲットとする細胞における組換え発現に有用である。一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドの送達に有用なベクター(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む)はウイルスベクターを含む。本開示内容でベクターとして使用することができるウイルスの例には、レトロウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、レンチウイルス、ボックスウイルス、ワクシニアウイルス、ラブドウイルス、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV))、バキュロウイルス、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。一部の様態において、本開示内容で使用することができるベクターは非ウイルスベクターを含む。そのようなベクターの非限定的な例には、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体(YAC)、バクテリオファージ、及びそれらの組み合わせが含まれる。
一部の様態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む)は、AAVを用いて、例えば、細胞に送達される。一本鎖DNAウイルスとしてのアデノ随伴ウイルス(AAV)はヘルパー依存性ヒトパルボウイルスである。AAVゲノムは約4.7kbpの大きさを有し、ウイルス複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するrep遺伝子をコーディングするN末端、前記ウイルスのキャプシドタンパク質をコーディングするcap遺伝子をコーディングするC末端及び各末端に約145個の塩基が挿入された逆反復末端(ITR)からなる。前記145bpの逆反復末端(ITR)はT字状の構造を有し、ウイルス誘電体の複製時の複製原点の機能を果たし、一次的なパッケージング信号として作用する。前記ITRは、組換えAAV(rAAV)構築物を作製する際に唯一必要なシス作用(cis-acting)塩基配列である。前記IRTは、Repタンパク質の存在下ではエンハンサー活性を有するが、Repタンパク質が存在しない場合には非常に弱い活性を有する。組換えAAV構築物に外来遺伝子をクローニングする際に、これらの特徴を考慮してエンハンサー、プロモーター、pA等を適切に構成して発現構築物を作製する(RJ Samulski and N Muzycka,Annu.Rev.Virolo.2014.1:427-451)。4つのタンパク質がrep遺伝子から翻訳される。これらのタンパク質は、その分子量に応じてrep78、rep68、rep52及びrep40に分けられ、AAV DNA複製に重要な機能を果たす。cap遺伝子からは4つのタンパク質が翻訳される。このうち、VP1、VP2、VP3タンパク質はAAV粒子を構成する構造タンパク質であり、アセンブリ活性化タンパク質(AAP、assembly-activating protein)は前記構造タンパク質によるAAV粒子の形成を促進する。アデノ随伴ウイルスの効率的な複製のために、アデノウイルス又はヘルペスシンプレックスウイルスなどのヘルパーウイルスから由来する一部のタンパク質及びRNAを必要とする(Muzyczka N.Curr Top Microbiol Immunol 158、97-129、1992)。
本明細書は、また、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む)を含む非AAVベクターを提供する。
一部の様態において、本明細書は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、非翻訳核酸配列を含む)のうち任意のポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。例えば、一部の様態において、本明細書に記載の細胞は、外来遺伝子及び外来遺伝子発現用の非翻訳核酸配列を含む組換え発現構築物に形質導入、形質感染又は形質転換される。
本明細書に開示されている様々な核酸分子、細胞及びベクター(本明細書では「活性複合体(active compounds)」とも呼ばれる)は、投与に適した医薬組成物に混入されることができる。したがって、一部の様態において、本開示内容は、そのような医薬組成物に関する。
本明細書は、また、本明細書に開示された1つ以上のポリヌクレオチド(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む)、本明細書に開示された1つ以上のベクター(例えば、rAAV)、本明細書に開示された1つ以上の細胞、本明細書に開示される任意の医薬組成物又はそれらの任意の組み合わせを含むキットを開示する。一部の様態において、前記キットは、また、上述したもののうち任意のもの又はそれらの組み合わせを必要とする対象に投与するための説明書を含む。
VII.A.生産方法
本明細書は、また、外来遺伝子によってコーディングされるポリペプチドを産生する方法を開示する。一部の様態において、そのような方法は、適切な条件下で本明細書に記載の細胞(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸分子を含むポリヌクレオチドに形質導入される)を培養し、コーディングされたタンパク質を回収することを含む。特定の様態では、外来遺伝子によってコーディングされるポリペプチドを産生する方法は、本開示内容のポリヌクレオチド(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸分子を含む)を必要とする対象に投与して前記対象においてコーディングされたポリペプチドを生産することを含む。ポリペプチドを産生するそのような生体内方法に関するさらなる開示内容は、本開示内容の他のところに提供されている(例えば、治療的用途を参照)。
本明細書に記載の核酸分子(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む)、そのような核酸分子を有するベクター及び組換えウイルス(例えばrAAV)、及び本明細書に記載の方法は、多くの試験管内及び生体内での有用性を有する。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、例えば、ベクター、例えば、AAVベクターは、培養物、試験管内又は生体外で細胞に又はヒト対象、例えば、生体内に投与されて疾患を治療することができる。したがって、一部の様態において、本開示内容は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、外来遺伝子及び非翻訳核酸配列を含む)のうち任意のポリヌクレオチド、本明細書に記載の組換え発現構築物、本明細書に記載の細胞、本明細書に記載の医薬組成物又は本明細書に記載の組換えウイルスの治療のための使用を提供する。
〔図面の簡単な説明〕
本開示内容のこれら及び/又は他の様態及び利点は、添付図面を参照して前記様態の以下の説明から明らかでありより容易に理解される:
図1は、本明細書に記載のpAAV-eGFP発現構築物の開裂マップを示す。
〔発明を実施するための形態〕
材料及び方法
実施例1.エンハンサー-プロモーター-イントロン配列を含まないpAAV-eGFP構築物の製造
実施例1-1.bGHポリアデニル化信号配列の挿入
pcDNA5/FRT/TO構築物(Invitrogen,USA,Cat No.V6520-20)を鋳型とし、オリゴ#001、#002を用いて重合酵素連鎖反応(PCR)を行い、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化信号A配列(ポリA)断片を確保した。次に、pAAV-MCS-ムプロモータープラスミド(Cellbiolabs,USA,Cat No.VPK-411)のBglII/BstEII部位を用いてヒト成長ホルモン(hGH)ポリAを除去し、bGH poly Aを挿入した。
pUCIDT-KAN-eGFP構築物(GeneArt、Germany)由来のヒトコドン最適化eGFP遺伝子を確保し、これを実施例1-1で製造したpAAV-bGH構築物のBamHI/HindIII部位にクローニングした。
pUC57-WPRE構築物(GenScript、USA)からウッドチャック肝炎ウイルス後転写調節エレメント(WPRE)配列を確保し、これを実施例1-2で製造したpAAV-eGFP-bGH構築物のHindIII/BglII部位にクローニングした。
oligo#003と#004を、また、#005と#006をそれぞれアニーリングして、それぞれ2コピーのmiRNA142-3pターゲット配列を含む2つのDNA断片を用意した。2つの短いDNA断片を実施例1-3で製造したpAAV-eGFP-WPRE-bGH構築物のHindIII/SalI部位にクローニングして、合計4回のコピーのmiRNA142-3pターゲット配列が挿入されるようにした。これにより、エンハンサー-プロモーター-イントロン配列を含まないpAAV-eGFP構築物を製造した(図1)。
実施例2-1.CEEシリーズ(CEE-FL、CEE-T2、-T3、-T3、-T3.1、-T3.1.1、-T3.1.2、-T3.2、-T4)及びCE配列を含む構築物の製造
実施例2-1-1.CEE-FL(全長)塩基配列を含む構築物の製造
pMK-RQ3_PEM構築物(GeneArt,Germany)からCEE-FL(CMVエンハンサー(配列リストの第4配列)-CMVプロモーターの31bp(配列リストの第5配列)-EF-1αプロモーター(配列リストの第7配列)-EF-1αエクソン1の29bp(配列リストの第13配列)-EF-1αイントロン(配列リストの第1配列)-EF-1αエクソン2の9bp(配列リストの第11配列)DNA断片を確保し、これを実施例1で製造した構築物のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。
oligo#007/008の組み合わせと#009/010の組み合わせを用いて実施例2-1-1で製造した構築物を鋳型としてPCRを行い、Gibson Assembly(登録商標)(NEB、USA、Cat No.E2611)を介して2つのDNA断片を連結して、CEE-T2配列を有する構築物を製造した。
oligo#011/008の組合せと#012/010の組合せを用いて実施例2-1-1で製造した構築物を鋳型としてPCRを行い、Gibson Assemblyを介して二つのDNA断片を連結してCEE-T3配列を有する構築物を製造した。
oligo#013/008、#014/010の組み合わせを用いて実施例2-1-1で製造した構築物を鋳型としてPCRを行い、Gibson Assemblyを介して二つのDNA断片を連結してCEE-T3.1配列を有する構築物を製造した。
oligo#015/008、#016/010の組み合わせを用いて実施例2-1-1で製造した構築物を鋳型としてPCRを行い、Gibson Assemblyを介して二つのDNA断片を連結してCEE-T3.2配列を有する構築物を製造した。
oligo#017/008、#018/010の組み合わせを用いて実施例2-1-1で製造した構築物を鋳型としてPCRを行い、Gibson Assemblyを介して二つのDNA断片を連結してCEE-T4配列を有する構築物を製造した。
pUC57-T3.1.1構築物(GenScript,USA)からのCEE-T3.1.1塩基配列を確保して、実施例2-1-1で製造した構築物のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。
pUC57-T3.1.2構築物(GenScript、USA)からのCEE-T3.1.2塩基配列を確保して、実施例2-1-1で製造した構築物のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。
oligo#019、#020を用いて実施例2-1-1で製造した構築物からPCRによりCE断片を確保し、これを実施例2-1-1で製造した構築物のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。
実施例2-2-1.CCE-FL配列を含む構築物の製造
pMK-RQ4_PME構築物(GeneArt,Germany)からCCE-FL(CMVエンハンサー(配列リストの第4配列)-CMVプロモーター(配列リストの第6配列)-CMVエクソン1の30bp(配列リストの第12配列)-EF-1αエクソン1の29bp(配列リストの第13配列)-EF-1αイントロン(配列リストの第1配列)-EF-1αエクソン2の9bp(配列リストの第11配列)配列のDNA断片を確保して実施例1で確保したpAAV-eGFP構築物のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。
oligo#019、#021を用いて実施例2-2-1で製造した構築物からPCRによりCC断片を確保し、これを実施例2-2-1で製造した構築物のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。
実施例2-3-1.CAG-FL配列を含む構築物の製造
pCAG-Neo構築物(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,Japan,Cat No.163-25601)からCAG断片を確保し、実施例2-1で確保した構築物のSnaBI/BamHI部位にクローニングした。
pUC57-CA構築物(GenScript,USA)からCA断片を確保し、実施例2-3-1から製造した構築物のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。
oligo#022、#023を用いて実施例2-1-7で確保した構築物からPCRによりT3.1.1断片を確保し、これを実施例2-3-1から製造した構築物のAfeI/BamHI部位にクローニングした。
オリゴ#024と#025をアニールして確保したT3.1.2断片を確保し、これを実施例2-3-1から製造した構築物のAfeI/BamHI部位にクローニングした。
実施例2-4-1.CAE-FL配列を含む構築物の製造
pUC57-CAE構築物(GenScript,USA)からCAE(CMVエンハンサー(配列リストの第4配列)-チキンβ-アクチンプロモーター(SEQ ID NO:8)-チキンβ-アクチンエクソン1の32bp(SEQ ID NO:14)-EF-1αエクソン1の29bp(SEQ ID NO:13)-EF-1αイントロン924bp(SEQ ID NO:1)-EF-1αエクソン2の9bp(SEQ ID NO:11))断片を確保し、実施例1から製造した構築物のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。
oligo#026、#027を用いて実施例2-1-7で製造した構築物からCAE-T3.1.1断片を確保し、実施例2-1-7で製造した構築物のKpnI/BamHI部位にクローニングした。
oligo#026、#027を用いて実施例2-1-8で製造した構築物からCAE-T3.1.2断片を確保し、実施例2-1-8で製造した構築物のKpnI/BamHI部位にクローニングした。
oligo#028、#029を用いてpcDNA3.1(+)-IgG-アップリバーセプト構築物(GenScript,USA)からPCRで確保したアプリバーセプト遺伝子DNA断片を実施例2-3-1、実施例2-3-3、実施例2-3-4、実施例2-4-1、実施例2-4-2、実施例2-4-3から製造した構築物のBamHI/HindIIIサイトにそれぞれクローニングした。
実施例2-6-1.pcDNA3.1(+)-eGFP構築物の製造
実施例1で製造した構築物をBamHI/AfeIで切断して、eGFP遺伝子断片を確保し、これをpcDNA3.1(+)構築物のBamHI/EcoRV部位にクローニングした。
実施例2-1-1から製造した構築物をNdeI/BamHIで切断して確保し、これを実施例2-6-1で製造した構築物のNdeI/BamHI部位にクローニングした。
実施例2-1-9から製造した構築物をNdeI/BamHIで切断してCE断片を確保し、これを実施例2-6-1で製造した構築物のNdeI/BamHI部位にクローニングした。
実施例2-2-1から製造した構築物をNdeI/BamHIで切断してCCE断片を確保し、これを実施例2-6-1で製造した構築物のNdeI/BamHI部位にクローニングした。
実施例2-2-2から製造した構築物をNdeI/BamHIで切断してCC断片を確保し、これを実施例2-6-1で製造した構築物のNdeI/BamHI部位にクローニングした。
実施例2-4-1から製造した構築物をNdeI/BamHIで切断してCAE断片を確保し、これを実施例2-6-1で製造した構築物のNdeI/BamHI部位にクローニングした。
実施例2-3-2から製造した構築物をNdeI/BamHIで切断してCA断片を確保し、これを実施例2-6-1で製造した構築物のNdeI/BamHI部位にクローニングした。
クローニングを用いて確保した全ての構築物は、塩基配列分析(DNA sequencing)(MACROGEN、韓国、または、BIONEER、韓国)を通じて塩基配列を確認した。
HEK293及びHeLa細胞株はMEM培地(Gibco、USA、Cat No.42360-032)、ARPE-19細胞株はDMERM/F12培地(Gibco、USA、Cat No.11330-032)、RPE-1及びHep3B細胞株はDMEM培地(Gibco、USA、Cat.No.10569-010)を用いて5% CO2、37℃の条件で湿潤培養し、すべての培地に10% ウシ胎児血清(FBS,Gibco,USA,Cat No.16000-044)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Gioco,USA,CatNo.15140-163)を加えた。Expi293細胞株は、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したExpi293培地(Gibco、USA、Cat.No.A14351-01)を用いて8% CO2、37℃条件で250rpmで振って湿潤培養した。
実施例4-1.付着細胞の形質導入
形質導入のために、各細胞株をDPBS(Gibco、USA、Cat No.14190-250)を用いて2回洗浄した後、トリプシン-EDTA(Gibco、USA、Cat No.25200-114)を処理して培養皿から取り出して確保した後、12ウェルプレートに80%飽和度で接種した。24時間培養後、Lipofectamine3000(Thermo Fisher Scientific,USA,Cat No.L300075)を用いて各プラスミド(plasmid)DNAを用いて形質導入した。
AAV産生のために、1L エレンマイヤ培養フラスコに6×108細胞を220mlのexpi293培地に接種した。安定化のために約3~4時間培養した後、それぞれ3.73pmoleのpHelperプラスミドDNA、pUC-RC2プラスミドDNA又はpUC-RC8プラスミドDNA、外部遺伝子を含むAAV構築物プラスミドDNAを10mlのOpti-MEM(Gibco、USA、Cat No.51985-034)にそれぞれ溶かした。そして、DNA総量の二倍に該当するポリエチレンアミン(PEI、Polyscience、USA、Cat No.23966-1)を10mlのOpti-MEMで希釈した後、直ちに2つの溶液を混合して形質導入溶液を製造する。室温で30分間反応させた後、培養フラスコに合計20mlの形質導入溶液を入れた。
実施例5-1.AAV2の精製
実施例4-2の形質導入72時間後、細胞培養液を回収して遠心分離で培地を除去し、細胞を確保した。DPBSで細胞沈殿物を洗浄し、16mlのDPBSで細胞を再懸濁した。これを3回にわたって凍結/解凍サイクル(freezing/thawing cycle)を行い、細胞を溶解し、これを遠心分離してAAV2を含む上清を確保した。上清とAAVancedTMConcentration Reagent(System Bioscience、USA、Cat No.AAV110A-1)を4:1で混合した後、4℃で16時間混合してから遠心分離して上清を除去し、AAV2を含む沈殿物を確保した。Opti-MEM500μlで沈殿物を洗浄し、全ての上清を除去した後、最終的に氷冷DPBS400μlで再懸濁してAAVを得た。
実施例4-2の形質導入72時間後、細胞培養液を回収した。0.45μmのフィルターで細胞の残骸(cell debris)を除去し、アニオン交換法(anion exchange)及びアフィニティークロマトグラフィー法(affinity chromatography)を用いてAAVを得た。
実施例5で精製したAAV2の力価を決定するためにqPCR(Bio-Rad、USA、CFX96)を行った。DNaseI反応緩衝液(New England Biolab、USA、M0303S)で1時間37℃でANAVにDNaseIを処理した。その後、DNaseIが処理された試料にプロテイナーゼK(Invitrogen、USA、Cat No.AM2548)を55℃で30分間処理し、95℃で15分間反応させてプロテイナーゼKを不活性化した。製造した試料をqPCRの鋳型として使用し、標準曲線を求めるためにAAV構築物を使用し(7.4×108-7.4×104、10倍希釈)、Recombinant Adeno-associated Virus 2 Reference Standard Stock(rAAV2-RSS、ATCC、USA、Cat No.VR-1616)又はRecombinant Adeno-associated Virus 8 Reference Standard Stock(rAAV8-RSS、ATCC、USA、Cat No.VR-1816)を陽性対照群として使用した。力価決定のためのqPCRは2×SsoAdvanced Universal Probe Supermix(Bio-Rad、USA、Cat No.172-5282)とAAV2-ITR特異的プライマー(#030、#031)及びプローブ(#032、FAM-CACT CCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1)を使用した。95℃で10分間変性、95℃で30秒間反応、60℃で1分間反応からなる各qPCRサイクルを40回繰り返した。標準曲線と定量は、Bio-Rad CFX Maestro 1.1 software(Bio-Rad、USA)を用いて分析した。
AAV2形質導入のために、HEK293細胞を24ウェル培養プレートにウェル当たり4×105細胞を接種した。24時間後、各ウェルにMG132(Sigma-Aldrich、USA、Cat No.M7449)を5μMの濃度で8時間処理した。AAV2を25,000 MOI(Multiplicity of Infection)で処理し、72時間培養して形質導入した。
眼球の下部に31G注射針で穿孔後、IOキットの注射針を刺入して、針先端が眼球の壁面に当たる点で刺入を止めて投与を行った。網膜下注射が成功したかどうかは、投与直後にOCT上で網膜水泡(retinal bleb)が形成されたかどうかを確認する方法によって判断した。4週間後に眼球を摘出して、HaltTM Protease Inhibitor Cocktail 100×(Thermo Fisher Scientific、USA、CatNo.78429)を添加したRIPA溶液(Thermo Fisher Scientific、USA、Cat No.89900)200μlを添加して、Axygen tissue grinder(Axygen、cat#14-222-358)で眼球を潰して交換した。4℃で1時間反応した後、4℃で13,000gで15分間遠心分離で上清を確保した試料を分析した。
eGFPの発現は流動細胞分析(Beckman Coulter、USA、CytoFlex)によって測定した。eGFPの測定値は、一緒に形質導入したpCMV-dsRed(Clontech、Japan、Cat No.632416)構築物による赤色蛍光の測定に形質導入の効率を補正して計算した。形質導入72時間後、DPBSで細胞を洗浄し、トリプシンで分離した。1500rpmで5分間遠心分離して細胞を確保し、2%FBSを添加したDPBSを500μl添加して細胞を再懸濁した。流動細胞分析においては、FSC vs SSCプロットを通じて単一細胞領域を区別し、その中でFL1-A(緑色)及びFL2-A(赤色)を測定した。単一の蛍光ベクターがそれぞれ形質導入された試料を用いて(pEGFP-C1、Clontech、Japan、Cat No.PT3286-1及びpCMV-DsRed-Expression2)補完を進行した後、測定結果に反映した。すべての流動細胞分析の結果は、FlowJo software 10.5.3(Becton Dickinson & Company、USA)を用いて分析した。
分泌されるタンパク質の濃度を定量するためにELISAを行った。AAVを用いた形質導入48時間後、細胞培養液を確保して、1500rpmで5分間4℃で遠心分離した後、上清を取り、ELISAの試料として使用する。アップリバーセプトのELISA(Eagle bioscience、USA、Cat No.IG-AA115)は製造社から提供されたプロトコルに従って行った。ELISA結果は、Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific、USA)で測定し、SkanIt software(Thermo Fisher Scientific、USA)で分析した。細胞株を用いた実験は2つを1セットとして2回繰り返し、動物を用いた実験は眼球当たり1回行った。
ELISAを除く細胞株を用いた全ての実験は3回繰り返し実験を行った。結果はGraphPad Prism software 8.1.1(GraphPad Software、Inc.、USA)を用いて、2つのグループ間の比較はStudent’s-t-testで、3つのグループ以上の比較はOne-way ANOVAで分析した。動物実験の場合、Wilcoxon matched-pairs signed rank testで分析した。*はp<0.05、**はp<0.01、***はp<0.001を意味する。
実験結果
1.EF-1αプロモーターとの組み合わせにおけるEF-1αイントロンによるeGFP遺伝子の発現増加
サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーとヒト伸長因子1α(EF-1α)プロモーターの組み合わせによって調節されるeGFP遺伝子発現に対するEF-1αイントロンの効果をテストした。まず、ITRを含まない動物細胞発現構築物で比較した結果、使用したすべての細胞株(HEK293、HeLa、ARPE-19、RPE-1、Huh-7及びHep3B)でEF-1αイントロンによりeGFPの発現が増加した(459.6%、276.3%、181.8%、163.4%、471.1%、494.3%)(図2A)。同様に、ITRを含むpAAV構築物においてもEF-1αイントロンによりeGFPの発現が増加した(224.0%、167.7%、218.7%、229.5%、202.5%、260.5%)(図2B)。この結果は、EF-1αプロモーターと組み合わせたEF-1αイントロンが、様々な形態の外部遺伝子発現構築物における遺伝子発現を増加させることができることを提示している。
EF-1αプロモーターに加えて、他のプロモーターとの組み合わせによっても、EF-1αイントロンによる遺伝子発現の増加が観察されるかどうかを試験した。まず、サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーとCMVプロモーターの組み合わせによって誘導されるeGFP遺伝子の発現におけるEF-1αイントロンの効果を試験した。まず、ITRを含まない動物細胞発現構築物で比較した結果、eGFPの発現は、使用したすべての細胞株(HEK293、HeLa、ARPE-19、RPE-1、Huh-7及びHep3B)でEF-1αイントロンによって増加する(284.3%、464.0%、217.5%、180.4%、405.7%、370.6%)ことを確認した(図3A)。
3-A.EF-1αイントロンの配列が順次に欠失した一連のCEE構築物の製作
CEE-FL構築物は、CMVエンハンサー及びCMVプロモーターの一部(5’末端31bp)とEF-1αプロモーター、EF-1αエクソン1の29bp、EF-1αイントロン924bp、EF-1αエクソン2の9bpを含むように設計されている。イントロンのスプライシング機能に関連する核心配列には、5’末端側のスプライシングドナーと分岐点部位(BPS:branch point site)を含む3’末端側のスプライシング受容体が位置していた。遺伝子発現を増加させることができる最小長のEF-1αイントロン配列を見つけるために、イントロン5’末端側のスプライシングドナー配列を保存し、その後、順番にイントロン配列を欠失させた。すなわち、EF-1αイントロンのスプライシングドナー共通(consensus)配列と推定されるEF-1αイントロン5’末端の19bpまでを共通に含むが、その後、659bp(T2)、720bp(T3)、807bp(T3.1)、829bp(T3.1.1)、851bp(T3.1.2)、873bp(T3.2)、895bp(T4)が欠失したCEE構築物を実施例2-1と同様に製造した(図4A)。
5種類の動物細胞株において、EF-1αイントロン配列が全長であるもの(CEE-FL)と順次欠失したものまで、合計8種類の構築物からのeGFP発現を比較した。まず、HeLa、Hep3B、Huh-7細胞株では、全長EF-1αイントロンAと比較して、CEE-T2からCEE-T3.1.2まではeGFP遺伝子発現が維持されることを確認した。しかしながら、CEE-T3.2及びCEE-T4の場合、遺伝子発現は急激に減少した。次に、ARPE-19及びRPE-1細胞株では、CEE-T2の場合、CEE-FLに比べてeGFP発現が約50%レベルに減少したが、CEE-T3からCEE-T3.1.2まではCEE-FLに類似又は少しより高いeGFPの発現を示した。しかしながら、前記細胞株と同様に、CEE-T3.2及びCEE-T4では発現が急激に減少した。以上の結果は、EF-1αイントロンAにおいて遺伝子発現増加機能を保有するイントロンA断片はT2からT3.1.2までであり、そのうち最も短いものがT3.1.2である(又はT3.2より長い断片を意味する)(図4B)。
4-A.チキンβ-アクチンプロモーターと組み合わせたEF-1αイントロン断片T3.1.1及びT3.1.2の製作
CAE-FL構築物は、CMVエンハンサー及びチキンβ-アクチンプロモーター、チキンβ-アクチンエクソン1の32bp、EF-1αエクソン1の29bp、EF-1αイントロンA924bp、EF-1αエクソン2の9bpを含むように設計されている。CAは、EF-1αイントロン全体が欠失した構築物である。CAE-T3.1.1構築物は、EF-1αイントロン5’末端の19bpと3’末端のT3.1.1配列を含み、その間の829bpが欠失している点以外はCAE-FLと同じである。CAE-T3.1.2構築物は、EF-1αイントロンA5’末端の19bpと3’末端のT3.1.2配列を含み、その間の851bpが欠失している点以外はCAE-FLと同一である(図5A)。
EF-1αイントロンのすべてのヌクレオチドが完全欠失したCAと、部分的に欠失したEF-1αイントロンを含むCAE-T3.1.1とCAE-T3.1.2などの3種類の構築物を用いて、2種類の動物細胞株(HeLa、ARPE-19)でeGFP発現を比較した。CAE-T3.1.1及びCAE-T3.1.2群では、CA構築物群と比較して、HeLaでは330.5%、243.9%、ARPE-19では170.8%、165.9%レベルのeGFP発現が観察された(図5B)。このような結果は、EF-1αイントロンの断片であるT3.1.1とT3.1.2がチキンβ-アクチンプロモーターとの組み合わせでも遺伝子発現を増加させることができることを提示する。
CMVエンハンサー、チキンβ-アクチンプロモーター、チキンβ-アクチンエクソン1の93bpとイントロン43bpを維持した状態で、EF-1αイントロンの3’末端断片95bp(T3.1.1)もしくは73bp(T3.1.2)とEF-1αエクソン2の9bpを含むハイブリッドイントロン構造を有するCA-T3.1.1、CA-T3.1.2構築物を製作した。チキンβ-アクチンエクソン1及びチキンβ-アクチンイントロンの一部はスプライシングドナーの機能を提供し、EF-1αイントロンA断片はスプライシング受容体の機能を有すると予想した。対照群として、イントロン配列を含まないCA構築物を一緒に試験した(図5C)。
CA、CA-T3.1.1、CA-T3.1.2構築物をそれぞれHeLa及びHep3B細胞株に形質導入した後、遺伝子発現精度を比較した結果、イントロンのないCAに比べてCA-T3.1.1、CA-T3.1.2における遺伝子発現の増加(HeLa:215.7%,211.0%,Hep3B:155.0%、167.5%)であることを確認した。この結果は、EF-1αイントロン断片T3.1.1及びT3.1.2が他の遺伝子のスプライシングドナーと一緒に組み合わされた場合でも、遺伝子発現を増加させることができることを提示する(図5D)。
5-A.AAV2を用いた試験管内の遺伝子送達におけるT3.1.1及びT3.1.2断片による遺伝子発現の増加
AAVを用いて遺伝子を送達する場合でも、EF-1αイントロンの断片であるT3.1.1又はT3.1.2が遺伝子発現を効率的に誘導することができるかを確認するために、前記断片を含むAAV2(CA-T3.1.1、CA-T3.1.2、CAE-T3.1.1、CAE-T3.1.2)を産生した後、遺伝子発現調節部位でCAG-FL又はCAE-FLを含むAAV2と比較した。製作されたAAV2は、細胞外分泌能を有するアプリバーセプトタンパク質を発現するように設計された(シグナルペプチド配列は、hIgGシグナルペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を使用した:配列リストの第26配列)。MG132を処理したHEK293細胞株に25,000MOI条件でAAV2を感染させ、48時間後、ELISAを進行して細胞培養液中のアプリバーセプトの濃度を測定した。その結果、CAG-FLと比較したとき、CA-T3.1.1あるいはCA-T3.1.2を含むAAV2で感染させた場合、それぞれ200.1%及び213.1%のレベルにアプリバーセプトの発現が増加することを確認した。さらに、CAE-FLと比較した場合、CAE-T3.1.1及びCAE-T3.1.2のAAV2グループにおいて、それぞれ118.2%、166.5%のレベルでアプリバーセプトの発現が増加することを確認した(図6A)。以上の結果は、プラスミドDNAを用いて遺伝子を送達した場合と同様に、AAV2を用いて遺伝子を送達した場合でも、EF-1αイントロンA断片T3.1.1及びT3.1.2が遺伝子発現を効率的に増加させることができることを提示する。
AAVを用いて生体内に遺伝子を送達する場合でも、EF-1αイントロンの断片であるT3.1.1が遺伝子発現を効率的に誘導できるかを確認するために、前記断片を含むAAV8(CA-T3.1.1、CAE-T3.1.1)を産生した後、遺伝子発現調節部位でCAG-FL又はCAE-FLを含むAAV8と比較した。製作されたAAV8は、細胞外分泌能を有するアプリバーセプトタンパク質を発現するように設計された(シグナルペプチド配列は、hIgGシグナルペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を使用した:配列リストの第26配列)。ウイルスを産生した後、グループ別にマウス8匹の両眼に網膜下注射を通じてそれぞれ1×109vgのAAV8を送達し、28日後に各眼におけるアプリバーセプトの発現をELISAを通じて確認した。その結果、CAE-T3.1.1投与群では、CAE-FLグループに比べて147.6%レベルのアプリバーセプトの発現が観察され、CA-T3.1.1投与群では、CAG-FLグループに比べて118.7%レベルのアプリバーセプトの発現が観察された(図6B)。この結果は、生体内でもEF-1αイントロン断片T3.1.1が遺伝子発現を効率的に誘導できることを提示する。
Claims (90)
- 配列リストの第1配列の874~924番目のヌクレオチドと少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第1配列を含まない単離されたポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列が配列リストの第57配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列が配列リストの第57配列に示したヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列リストの第1配列の852~924番目のヌクレオチドと少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第1配列を含まない単離されたポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列が配列リストの第3配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列が配列リストの第3配列に示したヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 配列リストの第1配列の830~924番目のヌクレオチドと少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する非翻訳核酸配列を含み、前記非翻訳核酸配列が配列リストの第1配列を含まない単離されたポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列が配列リストの第2配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列が配列リストの第2配列に示したヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列の5’末端(「5’領域」)に少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも5つ、少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、少なくとも約30個、少なくとも約40個、少なくとも約50個、少なくとも約60個、少なくとも約70個、少なくとも約80個、少なくとも約90個又は少なくとも約100個のヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項1~9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列の5’領域に、配列リストの第1配列内の1~873番目の位置に該当する1つ以上の連続又は非連続ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列の3’末端(「3’領域」)に少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも5つ、少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、少なくとも約30個、少なくとも約40個、少なくとも約50個、少なくとも約60個、少なくとも約70個、少なくとも約80個、少なくとも約90個又は少なくとも約100個のヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項1~11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列が、(i)配列リストの第1配列の871~924番目(すなわち、配列リストの第58配列)、(ii)配列リストの第1配列の861~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第59配列)、(iii)配列リストの第1配列の852~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第60配列)、(iv)配列リストの第1配列の851~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第61配列)、(v)配列リストの第1配列の830~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第2配列)、(vi)配列リストの第1配列の821~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第63配列)、(vii)配列リストの第1配列811~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第64配列)、(viii)配列リストの第1配列の808~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第65配列)、(ix)配列リストの第1配列の801~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第66配列)、(x)配列リストの第1配列の751~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第67配列)、(xi)配列リストの第1配列の721~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第68配列)、(xii)配列リストの第1配列の701~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第69配列)、(xiii)配列番号1配列の651~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第70配列)、(xiv)配列リストの第1配列の601~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第71配列)、(xv)配列リストの第1配列の570~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第72配列)、(xvi)配列リストの第1配列の551~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第73配列)又は(xvii)配列リストの第1配列の501~924番目のヌクレオチド(すなわち、配列リストの第74配列)と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
- 外来遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項1~13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記外来遺伝子がポリペプチドとして翻訳され得ることを特徴とする、請求項14に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列は、翻訳時の基準発現と比較して前記外来遺伝子の発現を増加させることができるものであって、前記基準発現は非翻訳核酸配列のない状態及び/又は配列リストの第1配列に示したヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列が存在する状態で、翻訳時に該当外来遺伝子の発現を含むことを特徴とする、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
- 前記非翻訳核酸配列が前記外来遺伝子の発現を前記基準発現より少なくとも約1倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約1.6倍、少なくとも約1.7倍、少なくとも約1.8倍、少なくとも約1.9倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍又は少なくとも約10倍増加させることができることを特徴とする、請求項16に記載のポリヌクレオチド。
- プロモーターをさらに含むことを特徴とする、請求項1~17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターがサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、EF-1αプロモーター、β-アクチンプロモーター、GAPDHプロモーター、HSP70プロモーター、GRP78プロモーター、eIF4aプロモーター、AATプロモーター、TTRプロモーター、GFAPプロモーター、SV40プロモーター、SYN1プロモーター、GRKプロモーター、Rhoプロモーター又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項18に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターがEF-1αプロモーターであることを特徴とする、請求項19に記載のポリヌクレオチド。
- 前記EF-1αプロモーターが配列リストの第7配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項20に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターがCMVプロモーターを含むことを特徴とする、請求項19に記載のポリヌクレオチド。
- 前記CMVプロモーターが配列リストの第5配列又は第6配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項22に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターがβ-アクチンプロモーターを含むことを特徴とする、請求項19に記載のポリヌクレオチド。
- 前記β-アクチンプロモーターが配列リストの第8配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%。、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項24に記載のポリヌクレオチド。
- エンハンサーをさらに含むことを特徴とする、請求項1~25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記エンハンサーがサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー、SV40初期エンハンサー、アデノウイルス5 E1Aエンハンサー、HBVエンハンサー-1調節領域(Eh-1)、HPV-16又は-18E6/7長い調節領域(LCR)、HIV-1長い反復末端(LTR)又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項26に記載のポリヌクレオチド。
- 前記CMVエンハンサーが配列リストの第4配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項27に記載のポリヌクレオチド。
- スプライシングドナー配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1~28のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記スプライシングドナー配列が前記非翻訳核酸配列の上流に連結されていることを特徴とする、請求項29に記載のポリヌクレオチド。
- 前記スプライシングドナー配列が配列リストの第9配列又は第10配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%。、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項29又は30に記載のポリヌクレオチド。
- EF-1αエクソン2(E2)ヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1~31のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記EF-1αエクソン2(E2)ヌクレオチド配列が配列リストの第11配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項32に記載のポリヌクレオチド。
- サイトメガロウイルス(CMV)エクソン1(E1)配列、EF-1α E1配列、β-アクチンE1配列、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項1~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記CMV E1配列が配列リストの第12配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項34に記載のポリヌクレオチド。
- 前記EF-1α E1配列が配列リストの第13配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項34に記載のポリヌクレオチド。
- 前記β-アクチンE1配列が配列リストの第14配列又は第15配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%。、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項34に記載のポリヌクレオチド。
- 免疫細胞に特異的なmicroRNA(miRNA)に対する少なくとも1つのターゲット配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1~37のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記miRNAがmiR142-3p、miR142-5p又はその両方を含むことを特徴とする、請求項38に記載のポリヌクレオチド。
- 前記miRNAに対するターゲット配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴミア、短ヘアピンRNA(shRNA)分子、短干渉RNA(siRNA)分子、リボザイム、ペプチド核酸(PNA)オリゴヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)オリゴヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項38又は請求項39に記載のポリヌクレオチド。
- 前記miRNAのターゲット配列がmiR142-3p又はmiR142-5pの全長又は一部の配列に相補的であることを特徴とする、請求項41に記載のポリヌクレオチド。
- 前記miRNAのターゲット配列は、配列リストの第16配列又は配列リストの第17配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項38~41のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも2つのターゲット配列、少なくとも3つのターゲット配列、少なくとも4つのターゲット配列、少なくとも5つのターゲット配列、少なくとも6つのターゲット配列、少なくとも7つのターゲット配列、少なくとも8つのターゲット配列、少なくとも9つのターゲット配列又は少なくとも10個のターゲット配列を含むことを特徴とする、請求項38~42のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ターゲット配列のうち2つ以上が同じでいることを特徴とする、請求項43に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ターゲット配列は相異なることを特徴とする、請求項43に記載のポリヌクレオチド。
- ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE)配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1~45のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記WPRE配列が配列リストの第18配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項46に記載のポリヌクレオチド。
- 1つ以上のポリアデニル化(pA)配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1~47のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記pA配列が配列リストの第19配列~第22配列のいずれかに示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%。、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有することを特徴とする、請求項48に記載のポリヌクレオチド。
- 前記外来遺伝子が野生型ポリペプチド又はその任意の変異体、融合タンパク質、抗体又はその抗原結合断片、RNAベースの分子又はそれらの任意の組み合わせをコーディングすることを特徴とする、請求項14~49のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 前記外来遺伝子が配列リストの第23配列に示したヌクレオチド配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又は約100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項50に記載のポリヌクレオチド。
- 前記外来遺伝子が融合タンパク質をコーディングすることを特徴とする、請求項50又は51に記載のポリヌクレオチド。
- 前記融合タンパク質が血管内皮細胞成長因子(「VEGF」)の阻害剤を含むことを特徴とする、請求項50~52のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 前記VEGFの阻害剤がアプリバセプトを含むことを特徴とする、請求項53に記載のポリヌクレオチド。
- 前記RNAベースの分子が、miRNA、shRNA、siRNA、リボザイム又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする、 請求項50に記載のポリヌクレオチド。
- 組換え発現構築物であることを特徴とする、請求項1~55のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- (i)外来遺伝子及び(ii)前記外来遺伝子に作動可能に連結された調節要素を含むポリヌクレオチドであって、前記調節要素が(5’から3’方向に):
(1)配列リストの第4配列に示したCMVエンハンサー;
(2)配列リストの第5配列又は第6配列に示したCMVプロモーター配列、配列リストの第7配列に示したEF-1αプロモーター配列又は配列リストの第8配列に示したチキンβ-アクチンプロモーター配列から選択されるプロモーター;
(3)配列リストの第12配列に示したCMV E1配列、配列リストの第13配列に示したEF-1α E1配列又は配列リストの第14配列又は第15配列に示したチキンβ-アクチンE1配列から選択されるエクソン1(E1)配列;
(4)配列リストの第9配列又は第10配列に示したスプライシングドナー配列;
(5)配列リストの第2配列(TGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)、配列リストの第3配列(CCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)又は配列リストの第57配列(TTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列;及び
(6)配列リストの第11配列に示したEF-1α E2配列を含むポリヌクレオチド。 - 請求項1~57のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- ウイルスベクターであることを特徴とする、請求項58に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターは、アデノウイルス(例えば、遺伝子操作されたアデノウイルス)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、SV40型ウイルス、ポリオマウイルス、エプスタインバーウイルス、乳頭腫ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス(HSV)、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、ボックスウイルス、又はそれらの任意の組み合わせを含むことを特徴する、請求項59に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターがAAVであることを特徴とする、請求項60に記載のベクター。
- 遺伝子治療に使用するためのことを特徴とする、請求項58~61のいずれかに記載のベクター。
- 前記遺伝子によってコーディングされるポリペプチドの発現に使用するためのことを特徴とする、請求項58~62のいずれかに記載のベクター。
- 前記外来遺伝子が配列リストの第23配列に示したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項58~63のいずれかに記載のベクター。
- 請求項1~57のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項58~64のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
- 請求項58~64のいずれかに記載のベクター及びrep及びcap遺伝子を含む構築物に細胞を形質導入することを含む組換えウイルス粒子を産生するための方法。
- 産生された組換えウイルス粒子を分離することをさらに含むことを特徴とする、請求項66に記載の方法。
- 請求項66又は67に記載の方法によって産生された組換えウイルス粒子。
- (a)キャプシドタンパク質及び(b)請求項58~64のいずれかに記載のベクターを含む組換えウイルス粒子。
- アデノ随伴ウイルス(AVV)であることを特徴とする、請求項69に記載の組換えウイルス粒子。
- 前記AAVの血清型がAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9又はAAVrh10であることを特徴とする、請求項70に記載の組換えウイルス粒子。
- 前記AAVの血清型がAAV2であることを特徴とする、請求項71に記載の組換えウイルス粒子。
- 前記AAVの血清型がAAV8であることを特徴とする、請求項71に記載の組換えウイルス粒子。
- 前記AAVの血清型がAAV5であることを特徴とする、請求項71に記載の組換えウイルス粒子。
- 前記AAVの血清型がAAV9であることを特徴とする、請求項71に記載の組換えウイルス粒子。
- (a)請求項1~57のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項58~64のいずれかに記載のベクター、請求項65に記載の細胞又は請求項68~75のいずれかに記載の組換えウイルス粒子;及び
(b)薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。 - 組換えアデノ随伴ウイルス粒子と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
前記組換えアデノ随伴ウイルス粒子が、(a)AAV8型キャプシドタンパク質及び(b)(i)配列リストの第23配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子及び(ii)前記外来遺伝子に作動可能に連結され(5’から3’方向に):
(1)配列リストの第4配列に示したサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー配列;
(2)配列リストの第8配列に示したチキンβ-アクチンプロモーター配列;
(3)配列リストの第15配列に示したチキンβ-アクチンエクソン1(E1)配列;
(4)配列リストの第10配列に示したチキンβ-アクチンイントロンのスプライシングドナー配列;
(5)配列リストの第2配列(TGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)、配列リストの第3配列(CCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)又は配列リストの第57配列(TTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列;及び
(6)配列リストの第11配列に示したEF-1αエクソン2(E2)配列;を含む調節要素を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物。 - 組換えアデノ随伴ウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む眼科疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、
前記組換えアデノ随伴ウイルス粒子が、(a)AAV8型キャプシドタンパク質及び(b)(i)配列リストの第23配列に示したヌクレオチド配列を含む外来遺伝子及び(ii)前記外来遺伝子に作動可能に連結され(5’から3’方向に):
(1)配列リストの第4配列に示したサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー配列;
(2)配列リストの第8配列に示したチキンβ-アクチンプロモーター配列;
(3)配列リストの第15配列に示したチキンβ-アクチンエクソン1(E1)配列;
(4)配列リストの第10配列に示したチキンβ-アクチンイントロンのスプライシングドナー配列;
(5) 配列リストの第2配列 (TGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)、 配列リストの第3配列 (CCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)又は配列リストの第57配列 (TTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG)に示したヌクレオチド配列を含むか、前記ヌクレオチド配列から必須になるか、又は前記ヌクレオチド配列からなる非翻訳核酸配列;及び
(6)配列リストの第11配列に示したEF-1αエクソン2(E2)配列;を含む調節要素を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物。 - 前記眼科疾患は、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫、黄斑腫脹、又はそれらの組み合わせを含む用途であることを特徴とする、請求項78に記載の医薬組成物。
- 前記黄斑変性が年齢関連黄斑変性(AMD)を含む用途であることを特徴とする、請求項79に記載の医薬組成物。
- 細胞における外来遺伝子の発現を増加させる方法であって、
前記細胞を、請求項1~57のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項58~64のいずれかに記載のベクター又は請求項68~75のいずれかに記載の組換えウイルス粒子と接触させることを含む方法。 - 前記接触を生体内で行うことを特徴とする、請求項81に記載の方法。
- 前記接触前に、前記ポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス粒子を前記対象に投与することを含むことを特徴とする、請求項82に記載の方法。
- 前記接触を生体外で行うことを特徴とする、請求項81に記載の方法。
- 前記外来遺伝子の発現は、基準細胞における該当発現と比較して、少なくとも約1倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約1.6倍、少なくとも約1.7倍、少なくとも約1.8倍、少なくとも約1.9倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍又は少なくとも約10倍増加し、前記基準細胞は、前記非翻訳核酸配列が欠けているか、配列リストの第1配列に示したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ベクター又は組換えウイルス粒子と接触することを特徴とする、請求項81~84のいずれかに記載の方法。
- 必要な対象において疾患又は障害を治療する方法であって、請求項1~57のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項58~64のいずれかに記載のベクター又は請求項68~75のいずれかに記載の組換えウイルス粒子を前記対象に投与することを含む方法。
- 前記疾患又は障害が眼科疾患を含むことを特徴とする請求項86に記載の方法。
- 前記眼科疾患が、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管形成、黄斑変性、網膜変性、黄斑浮腫、網膜浮腫、黄斑腫脹、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項87に記載の方法。
- 前記黄斑変性が年齢関連黄斑変性(AMD)を含むことを特徴とする請求項88に記載の方法。
- 追加の治療薬を前記対象に投与することを含むことを特徴とする、請求項86~89のいずれかに記載の方法。
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