KR20220006039A - 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 및/또는 호흡기 장애 관련 미생물총과 연관된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종의 알칼리성 용해에 의해 얻을 수 있는 특정 박테리아 추출물의 신규한 투여 방법 및 투여 경로, 그리고 이를 필요로 하는 대상체에서 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환 및/또는 천명 관련 증상 및/또는 호흡기 장애와 관련된 미생물총과 관련된 질환을 치료하고/거나 예방하기 위한 전달 장치에 관한 것으로, 상기 방법은 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 치료 유효량의 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 박테리아 추출물은 알칼리성 용해에 의해 얻을 수 있다.

Description

천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 및/또는 호흡기 장애 관련 미생물총과 연관된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법

본 발명은 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종의 알칼리성 용해에 의해 얻을 수 있는 특정 박테리아 추출물의 신규한 투여 방법 및 투여 경로, 그리고 인간 대상체에서 천식(asthma), 천식 악화(asthma exacerbation), 알레르기성 천식 및/또는 천명(wheezing) 관련 증상 및/또는 호흡기 장애와 관련된 미생물총(microbiota)과 연관된 질환을 치료하고/하거나 예방하고, 천식 대상체에서의 보호 미생물총의 재편성(reorganization), 뿐만 아니라 건강한 대상체에서의 보호 면역에 대한 미생물총의 재편성을 위한 전달 장치에 관한 것이다.

만성 기도 질환, 예컨대 천식, 알레르기성 천식 및 다른 천명 장애는, 특히 소아에서 건강 관리의 주요한 문제 중 하나이다. 천식은 폐의 기도와 기관지의 염증 질환으로, 일시적으로 기도에 염증을 일으켜, 기도가 조여지고, 좁혀지게 된다. 천식은 폐로 흡입된 알레르겐 또는 자극제에 의한 1차 감염에 의해 유발될 수 있다. 증상은 호흡 곤란, 과도한 점액과 가래 생산, 천명, 기침 및 가슴 답답함(tightness in the chest)을 포함한다. 천식의 기저 원인은 유전적 요인과 환경적 요인의 복합 산물로서, 그 질병의 상당한 이종성(heterogeneity)을 발생시킨다. 천식의 유행은 최근 수십년 동안 서구 국가에서 급격히 증가하였는데, 이것은 환경적 노출의 변화 때문일 가능성이 크다.

또한, 최근의 증거는 천식 및 천명 장애의 발달에서 미생물총의 역할을 뒷받침하며, 미생물총의 변화가 만성 기도 질환 증상, 특히 천식 및 천명 천식과 연관된다는 것을 암시한다. 가설은 어린 시절의 노출(early life exposure)이 미생물총의 조성을 붕괴시키고, 그 결과 과민성 장애의 형태로 면역 조절 장애를 촉진시킬 수 있다는 것이다.

건강한 마이크로바이옴(microbiome)은 광범위한 병원체에 의한 군집화에 대한 저항성, 필수 영양소의 생합성과 흡수, 뿐만 아니라 건강한 장 상피를 유지하는 면역 방어와 자극, 및 적절히 조절된 전신 면역을 포함하는 다수의 이점을 숙주에게 제공한다. 따라서, 폐의 기도 및 장의 미생물총은 장의 다양한 병원성 감염을 포함하는 많은 질병과 장애의 발병에서 중요한 역할을 한다.

불균형의 환경에서는, 미생물총의 기능이 상실되거나 비정상이 되어, 병원체에 대한 취약성을 증가시키거나, 대사 특성을 변화시키거나, 국소 또는 전신 염증 또는 자가면역을 발생시킬 수 있는 전염증성 징후를 유도할 수 있다. 특히, 미생물총의 변화는 천식 및 천명과 같은 몇몇 만성 기도 질환 및 증상과 관련이 있다. 그 결과, 환자는 정상적인 장의 미생물총이 다양한 항생제의 사용 때문에 교란되는 경우, 병원성 감염에 더욱 취약해진다. 이러한 질병과 장애 중 다수는 환자의 삶의 질을 매우 감소시키고 궁극적으로는 치명적일 수 있는 만성 질환이다.

본 발명은, 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종의 알칼리성 용해에 의해 얻을 수 있는 특정 박테리아 추출물의 투여가, 기도 내의 알레르기성 염증을 예방하는 한편, 불균형을 이룬 미생물총과 명백히 연관된 천식 및 알레르기-유도된 악화로 고통받고 있는 숙주에서 건강한 마이크로바이옴을 회복시키는데 효과적이고 안전한 접근법을 제공한다는 놀라운 발견에 기초한다.

본 발명의 개요

본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명, 뿐만 아니라 미생물총-관련 장애를 치료하고/거나 예방하기 위한 박테리아 추출물의 신규한 투여 경로 및 투여량에 관한 것이다. 유사하거나 다양한 기도 염증 유도자를 사용하는 상이한 실험들이 도면에 도시되어 있다.

본 발명은 또한 시험 대상체에서 질병 또는 비정상 또는 불균형을 이룬 마이크로바이옴의 치료 또는 예방을 모니터링하는 방법에 관한 것으로: (a) 그램 양성 및/또는 그램 음성 박테리아 종의 알칼리성 용해에 의해 얻을 수 있는 치료 유효량의 정제된 박테리아 추출물을 시험 대상체에 처리하는 단계; (b) 상기 시험 대상체의 마이크로바이옴의 특징을 분석하는 단계; 및 (c) 상기 시험 대상체의 상기 마이크로바이옴의 특징 또는 패턴을 건강한 대상체의 마이크로바이옴 특징 또는 패턴과 비교하는 단계를 포함하되, 여기에서 치료 이전의 건강한 대상체의 마이크로바이옴의 특징과 시험 대상체의 마이크로바이옴의 특징의 유사성에 비해, 치료 유효량의 안정한 정제된 박테리아 추출물에 의한 치료 이후의 건강한 대상체의 마이크로바이옴 특징과 시험 대상체의 마이크로바이옴 특징의 유사성이 증가하는 것은, 효과적인 치료라는 표시이다. 유전자 연관성과 변화, 뿐만 아니라 시험 대상체와의 차이, 연관성 및 분류학적 변화를 설명하는 것을 목표로 하는 상이한 수치들도 또한 제시되었다.

도 1은 BALB/c 마우스를 사용하는 전형적인 천식의 알레르겐-유발 마우스 실험 모델에서의 BV 박테리아 추출물(BV)의 효과를 평가하기 위한 제1 연구에 사용된 프로토콜을 나타낸다.
도 2에서 (A)는 기관지폐포세척 (BAL: bronchoalveolar lavage) 호산구 증가증(eosinophilia)에 대한 BV의 효과를 나타내며, 이는 제2 연구에서 얻은 BAL 유체 중 세포 함량의 백분율로 표현되어 있다. 상기 연구는 BV 용량을 제외한 도 1의 프로토콜을 사용하여 실시되었다. 호산구 증가증 증가의 현저한 억제는, 14회 투여된 1 mg 용량의 BV를 사용하여 얻었다. (B)는 상이한 용량들을 이용하여 천식 모델에서의 BAL 호산구 증가증의 용량-의존적인 감소를 입증하는, BV의 효능의 또 다른 대표적인 예를 나타낸다.
도 3에서 (A)는 도 2와 같으나 상이한 실험으로부터 유래한 기관지폐포세척 (BAL) 호산구 증가증에 대한 BV의 효과를 나타내는데, 여기에서 BAL로부터의 호산구 증가증의 정도(content)는 총 세포 수로 표현되었다. (B)는 BV가 천식-유도된 폐 염증의 기본(cardinal) 분자 표현형: IL-5 및 IL-13의 BAL 단백질 수준(pg/mL)을 얼마나 억제하는지를 나타낸다.
도 4는 본원에서 폐 기능에 대해 판독 자료로서 설명된, 도 2 및 3에 도시된 기능적 효능 연관성의 대표적인 예를 나타낸다. 기도 과다 반응성(AHR)은 BV에 의해 상당히 예방되는데, 이전 연구의 모든 시험된 지점에서 1 mg 용량에서 최선의 효능이 나타났다. AHR의 상당한 감소는 OVA와 비교하여 표현되었다.
도 5는 BV가 어떻게 천식-유도된 폐 염증의 기본 세포 및 분자 표현형을 억제하는지를 입증하는 추가적인 실시예를 나타내는데, 이는 본원에서 BV-처리된 동물에 대한 PAS* 염색에 의해 탐지된 점액-분비 배상 세포의 매우 유의한 감소로 나타나 있다. *PAS=과요오드산 Schiff 염색.
도 6은 알테나리아 알테르나타(Alternaria alternata)에 의해 유발된 알레르기성 천식 모델에서의 BV의 보호 효과를 평가하는데 사용된 프로토콜을 나타낸다.
도 7은 비강 내 투여 이후 알테나리아 알레르기성 천식 모델에서의 BV의 보호 효과의 대표적인 예를 나타낸다. BV에 의한 효능의 모니터링은 BAL 차등 세포 함량에 기초하며, 본원에서 실시예 5에 기재된 실험 방식 이후 얻은 BAL 유체 내의 세포의 백분율로서 표현할 때, 호산구 증가증의 대략 40% 억제를 입증하였다
도 8은 알테나리아 모델에 대한 비강 내 BV의 효과를 나타낸다: 호흡계 저항성(Rrs)- 최대 반응(총 기도 저항성을 나타냄). Rrs 반응은 BV에 의해 현저히 예방되었고, 최선의 효능은 이전 연구로부터의 모든 시험된 지점에서 1 mg 용량에서 나타났다. AHR의 상당한 감소는 알테나리아에 비교하여 표현되었다.
도 9는 인간 기관지 상피 세포(16HBE14o-세포주)에서 스트레스- 및 알테나리아-유도된 장벽 기능의 손상(TEER, 상피 통과 전기 저항성으로 측정)의 BV에 의한 시험관 내 예방을 나타낸다.
도 10은 OVA-유도된 천식의 더 짧은 프로토콜을 나타낸다(도 1과 비교할 때, 39일 대신에 19일, 14회 대신에 8회 처리).
도 11은 도 10에 도시된 변형된 OVA-유도 방식에서 유래하였으나, BV에 의해서 차단되는 BAL 호산구 증가증 차단을 백분율(좌측) 뿐만 아니라 세포수(우측)로 나타낸다.
도 12는 C57 BL6 마우스에 대해 사용되고, BV에 의해 시험된 OVA-유도 천식에 대한 추가적인 프로토콜을 나타내는데, 이전과 같이, 비강 내 전달된 1 mg 용량/일/마우스에 의한 14회의 처리를 사용하였다.
도 13은 BV 박테리아 추출물이 호산구 증가증의 보호 감소, 뿐만 아니라 세포 백분율로 표현된 BAL에서의 호중구 증가증(neutrophilia)의 보호 증가를 유발한다는 것을 나타낸다.
도 14: WGCNA - OVA 및/또는 BV에 의해 조절되고, 도 1에서와 같이 처리되고, RNA-Seq에 의해 분석된 마우스 폐에서의 기본 천식 표현형과 연관된 유전자 그룹(모듈)의 확인. 각각의 박스는 각 모듈의 eigengene(모듈의 표준화된 유전자 발현 특성의 제1 주요 요소, 즉 표준화된 모듈 유전자 발현 데이터의 요약) 및 형질(BAL 호산구의 비율, AHR Z-점수) 및/또는 관심 있는 비교 대상들(OVA 대 PBS, OVA+BV 대 OVA) 사이의 관계에 대한 피어슨(Pearson)의 상관 계수(r)를 나타낸다. 유의도 수준은 각 박스 내의 괄호 안에서 q-값으로 나타나 있다. 각 모듈 내의 유전자의 수는, 각 모듈의 명칭 다음의 괄호 내에 있다. 색상의 강도는 연관성의 강도를 반영한다.
도 15는 호산구 증가증, AHR 및 OVA/BV 치료와 크게 연관된 WGCNA-확인된 모듈로부터의 핵심 유전자 세트에 대한 IPA(ingenuity pathway analysis)는, 기대된 바와 같이, AHR 및 호산구의 세포 움직임에 관한 경로에서 군집(cluster)을 이룬 이러한 유전자들 뿐만 아니라, Th2 세포의 이동과 분화 및 수지상 세포의 주화성에 관한 경로를 입증한다. 유전자의 핵심 세트를 식별하기 위한 전략은 좌측에 나타나 있다. 우측 패널은 이러한 핵심 유전자 세트(기호)의 일원들 중에서 풍부한, 선택된 생물학적 기능들(직사각형)을 나타낸다. 유전자에는 차등 발현 분석으로부터 나온 OVA+BV와 OVA 처리된 마우스 사이의 log₂(배수 변화)에 대한 값이 주석으로 붙어있다. 각각의 경로에 대한 풍부도(P-값) 및 예측 활성화 값(Z-점수)은, 각각의 직사각형에 쓰여져 있다. 기호의 형태와 색상은 모듈 멤버십에 상응한다: 청록색: 회색: 다이아몬드, 갈색: 회색 원, 청색: 속이 빈 원, 및 황색: 속이 빈 사각형.
도 16은 OVA, 또는 OVA 단독, 또는 PBS와 함께 또는 이들의 부재 하에 BV(1 또는 2.25 mg/마우스×14회의 처리)를 비강 내 처리한 마우스로부터의 장내 미생물총 샘플의 군집 분류(clustering)를 나타내는, 3회의 실험(#100, 101, 113)에 대한 비가중적 UniFrac 베타 다양성의 PCoA 플롯이다. 모든 처리는 서로 현저히 상이하였다(q<0.05; PERMANOVA).
도 17은 좌측은 도 16에 도시된 모든 그룹들과 샘플들에 대한 문(phylum) 수준의 분류학적 특성을 나타내는 것으로, 이는 군집 내의 차이점을 나타내고; 우측은, 관찰된 ESV 및 Shannon 다양성 지수에 의해 측정된 도 16에 도시된 모든 그룹들과 샘플들에 대한 알파 다양성을 나타내는데, 박스(box)는 25 내지 75% 사분위수(quartiles)를 나타내고, 휘스커(whisker)는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 18은 2개의 그룹: 임의의 BV(BV/OVA 및 BV 단독) 및 BV 없음(OVA 단독 및 PBS 단독)으로 나눈 도 16 및 17으로부터의 샘플의 선형 판별 분석 효과 크기 (LEfSe)를 나타내는데, 이들은 각 그룹에서 풍부한 분류군이며, 색깔로 표시되어 있다. 이 분석은 q < 0.05의 컷오프 및 LDA 점수 > 2를 사용하여, 다수의 분류학적 수준들에서의 차등적 특성들을 밝혔다. (B) 각각의 차등적 분류군의 계통발생학적 제시(g, 속; f, 과; o, 목; c, 계).

따라서, 본 발명은 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명 관련 증상, 뿐만 아니라 미생물총 관련 장애를 치료하고/하거나 예방이 필요한 대상체 또는 이러한 장애가 발달할 위험이 있는 대상체에서 상기 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이는 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종의 알칼리성 용해에 의해 얻을 수 있는 BV 박테리아 추출물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 박테리아 추출물은 경구, 비강 내 또는 기관 내 경로를 통해 투여될 수 있다. 특히 바람직한 투여의 경로는 비강 내 및 기관 내 경로를 포함한다.

천식 질환은 스테로이드 저항성 천식, 호중구성 천식 또는 비-알레르기성 천식일 수 있다. 알레르기성 질환 또는 장애는 호산구성 질병 또는 장애, 특히 결절(nodule), 호산구 증가증, 호산구성 류마티즘(eosinophilic rheumatism), 피부염(dermatitis) 및 부종(swelling)으로 이루어진 군(NERDS)으로부터 선택된 질병 또는 장애일 수 있다.

본 발명에 의한 BV 박테리아 추출물 투여의 비강 내 및 기관 내 경로는, 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명뿐만 아니라 연관된 미생물총 관련 호흡기 장애의 치료, 예방 또는 약화가 필요한 대상체에서 상기 질환 또는 장애를 치료하고/거나 예방하고/거나 약화시키는 방법에서 사용하는데 특히 유리한 것으로 나타났다.

본 출원인들은, 본원의 이하의 실시예에서, BV 박테리아 추출물을 투여하면 더 낮은 투여량에서도 알레르기성 천식에 대해 효율적으로 보호할 수 있고, 알레르겐-유발 기도 과다 반응성(AHR) 및 기도 염증을 완전히 보호하고, 상이한 폐 기도 염증 모델을 사용하여 호산구 증가증을 완전히 소멸시키며 호중구 증가증(neutrophilia)에 대한 보호 효과를 증가시키는 데 효율적이라는 사실을 입증하였다. 또한, 본 출원인들은, 경구 투여 시에 비해, 비강 내 또는 기관 내 경로를 통한 더 적은 투여량의 BV 박테리아 추출물 투여가 폐 유래 BAL에서 호산구 증가증을 완전히 소멸시킬 뿐만 아니라, 몇몇 TH2 사이토카인 IL13 및 IL5의 수준을 크게 감소시킨다는 사실을 보여주었다.

특히, 비강 내 또는 기관 내 투여는 더 낮은 투여량의 BV 박테리아 추출물의 사용을 허용하며, 심지어 이러한 더 낮은 투여량에서도 장내 마이크로바이옴 함량을 크게 재편성하도록 유도한다는 증거가 있고, 알레르기성 천식에 대한 보호 효과 및 마이크로바이옴의 변화를 통한 알레르기 반응의 실질적인 감소를 제공하였다.

"BV 박테리아 추출물"은, 국제 출원 WO2008/109669에 기재된 바와 같이 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 파이로게네시스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코쿠스 상퀴니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택된 하나 이상의 병원체를 알칼리성 용해시킴으로써 얻을 수 있는 박테리아 추출물을 지칭한다. 바람직하게는 10 초과의 pH에서의 알칼리성 용해에 의해 제조된 BV 박테리아 추출물의 제조 공정은, 또한 국제 출원 WO2008/109669에도 기재되어 있다. 바람직하게는, 상기 BV 박테리아 추출물은 상기 나열된 모든 병원체들의 조합을 포함할 수 있으며, 이는 호흡기 장애의 치료용으로 상표명 Broncho-Vaxom^® 하에 시판되고 있다.

전형적으로, BV 박테리아 추출물은 발효 이후, 열 불활성화와 알칼리성 용해와 여과에 의해 제조된다. 발효, 알칼리성 용해 및 여과는 당업계에 잘-알려져 있고, 특히 국제 출원 WO2008/109669에 기재된 바와 같다.

발효는 일반적으로 각각의 박테리아 균주를 배양 배지에서 적합한 광학 밀도로 성장시킴으로써 실시된다. 각 균주에 대하여, 충분한 양의 물질을 얻기 위해, 발효 배양은 접종 후 유효 종균 로트(working seed lot)에서 시작한 후, 더 큰 발효 용기에 접종할 수 있다. 예를 들어, 발효는 30 내지 40℃, 예컨대 37℃에서 약 3 내지 6 시간 동안 배양된 0.1 내지 1.0 리터와 같은 소규모 배양으로부터 시작하여, 700 nm에서의 3.0 내지 5.0의 광학 밀도(OD)를 얻을 수 있다. 소-규모 배양 단계 후, 더 큰 발효조에서의 1회 또는 일련의 추가적인 배양이 30℃ 내지 40℃에서 3 시간 내지 20 시간 동안, 예컨대 3 내지 10시간, 또는 8시간 동안 지속적으로 실시될 수 있다.

배양 배지는 바람직하게는 프리온-관련 질병( 즉 , 광우병, 스크래피(scrapie), 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jacob disease)) 또는 다른 질병의 위험이 없고, 따라서 동물-계 물질, 예컨대 소 또는 양과 같은 동물, 또는 프리온-계 질병을 전염시킬 수 있는 임의의 다른 동물로부터 채취한 혈청 또는 고기 추출물을 포함하지 않는 배지이다. 예를 들어, 비-동물 배지, 예컨대 식물-계 배지, 예컨대 콩-계 배지, 또는 합성 또는 반-합성 배지가 사용될 수 있다. 대안적으로, 말 혈청을 사용하는 배지, 또는 프리온 질환을 전파시키지 않는 동물 종으로부터 채취한 물질을 포함하는 배지가 사용될 수 있다. 배양 배지는 또한 이러한 질병의 위험이 없는 생물학적 추출물, 예컨대 효모 추출물 및 말 혈청을 포함할 수도 있다. 보충 성장 인자도 또한 일부 박테리아 종의 성장을 향상시키기 위해 도입될 수 있다.

발효 후, 각각의 박테리아 균주 또는 조합된 박테리아 균주로부터의 생물량(biomass)은, 일반적으로 열 처리에 의해 불활성화되고, 농축되어, 동결된다.

알칼리성 용해는 염기성 조건 하에서 박테리아 세포를 용해시키는데 사용되는데, 일반적으로 유기 또는 무기 염기를 사용함으로써 실시된다. 알칼리성 용해는 염기성 상태 하에서, 전형적으로 수산화 이온, 예컨대 NaOH로부터의 수산화 이온의 농축 용액에 의해 단일 박테리아 생물량, 또는 박테리아 생물량 또는 발효 배치의 혼합물에 대해 실시될 수 있다. 알칼리성 용해는 바람직하게는 약 10 초과의 pH에서 ±0.1의 pH의 오차로 실시될 수 있다. 용해의 지속 시간은 당업계의 숙련자에 의해 평가될 수 있고, 초기 박테리아 생물량에 따라 달라질 수 있다. 용해는 30 내지 60℃, 예컨대 30~40℃, 또는 35~40℃의 범위, 예컨대 37℃의 온도에서 실시될 수 있다. 일반적으로, 용해는 당업계의 숙련자에게 잘알려진 바와 같이 시각적 관찰에 기초하여 박테리아 세포가 모두 파괴된 것으로 보일 때 중단된다. 하나 초과의 동일한 박테리아 속의 균주를 사용할 때, 균주들은 함께 또는 개별적으로 용해될 수 있다. 따라서, 균주들은 용해 전 또는 후에 혼합될 수 있다.

이후 용해물은 원심분리 및/또는 여과에 의해 정제되어, 큰 세포 찌꺼기 또는 충분히 분해되지 않는 임의의 성분, 임의의 불용성 또는 미립자 물질을 제거하여, 용해성 박테리아 추출물을 얻는다. 원심분리와 여과를 포함하는 정제는, 추출물로부터 미립자 물질을 제거하는 것으로 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 용해물은 9000 g로 원심분리된 후, 1 라운드 이상의 여과를 거칠 수 있다. 전형적으로, 여과는 하나 이상의 필터, 예컨대 미세필터( 즉 , 미세여과) 또는 한외필터( 즉 , 한외여과)를 통한 추출물 또는 추출물들의 혼합물의 통과를 포함할 수 있는데, 이는 수 회의 통과 또는 수 회의 사이클 동안 반복될 수 있다. 예를 들어, 더 큰 기공의 필터에서 연속적인 여과 라운드를 거친 후, 더 작은 기공의 필터, 예컨대 0.2 마이크론 필터를 사용하여 미세여과를 실시할 수 있다. 한외여과도 또한 추출물로부터 용해성 물질을 추출하는 것을 돕는데 이용되어, 예를 들어, 추가적인 미세여과를 위해 한외여과 투과물을 재순환시킬 수 있다. 접선 유동 여과(TFF) 방법은 추출물을 여과하여, 큰 세포 찌꺼기로부터 용해된 분자들을 추출하는데 사용될 수 있다. 이것은 당업계에 잘 알려져 있고, 특히 문헌[Wayne P. Olson (Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, U.S.A., pp. 126-135)]에 기재되어 있다.

지금까지, BV 박테리아 추출물은 성인 및 소아에서 기도 감염을 예방하기 위해 경구로 환자에게 투여되어 왔다. 몇몇 임상 시험에서는, BV 박테리아 추출물의 (경구에 의한) 장 투여가 소아에서 급성 기도 질환으로부터 야기된 알레르기성 천식과 천명 공격을 예방할 수 있다는 사실이 입증되었다. 상기 BV 박테리아 추출물은 Broncho-Vaxom^®의 상표 하에 시판된다. BV 박테리아 추출물 약물은 경구에 의해 환자에게 투여되는 고체 형태, 일반적으로 캡슐이며, 성인 치료에서는 하루 한 캡슐의 7 mg의 동결 건조된 박테리아 추출물, 소아에 대해서는 하루 한 캡슐의 3.5 mg 동결 건조된 박테리아 추출물의 투여 요법을 따른다.

바람직한 실시 형태에 의하면, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명 관련 증상, 미생물총 관련 장애를 치료하고/거나 예방하는 방법에 관한 것으로, 비강 내 또는 기관 내 경로를 통해 치료 유효량의 BV 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명 관련 증상, 미생물총 관련 장애를 치료하고/거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 BV 박테리아 추출물에 관한 것으로, 상기 BV 박테리아 추출물은 비강 내 또는 기관 내 경로를 통해 상기 대상체에 투여된다.

BV 박테리아 추출물의 비강 내 또는 기관 내 투여는, 인간 대상체에서 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환 및/또는 천명 관련 증상 및/또는 미생물총 관련 장애와 연관된 질환, 천식이 있는 대상체에서의 보호 미생물총의 재편성, 뿐만 아니라 건강한 대상체에서 보호 면역에 대한 미생물총의 편성을 치료하고/거나 예방하는데 특히 유용하다.

"미생물총(microbiota)"이라는 용어는, 상업적, 공생 및/또는 병원성 미생물의 군집을 지칭한다. 미생물(microbe) 또는 미-생물(micro-organism)은 실제로 생태계의 모든 부분에 서식하며, 비강(nasal passages), 구강, 질, 피부, 위장관 및 비뇨생식관의 점막 내막(mucosal lining)을 포함하는 인간의 신체 어디에서나 발견된다. "마이크로바이옴(microbiome)"이라는 용어는, 미생물의 전체 집합과 숙주의 특정 신체 영역("서식지(habitat)") 내의 이러한 미생물들의 유전 정보를 지칭한다. 미생물의 각 타입은 미생물이 살아가는 장소에 따라 상이한 효과를 갖는다. 예를 들어, 포유류 유기체와 그 내부에 서식할 수 있는 미생물총의 조성은, 면역 기능, 영양소 처리 및 생리학적 상태의 다른 양태에 영향을 미칠 수 있다. 미생물총의 조성은 시간의 경과에 따라 달라질 수 있고, 연령, 식이, 항생제 노출 및 다른 환경적인 영향에 의해 영향을 받을 수 있다. 상이한 미생물 종들이 대부분 동일한 효과를 생성할 때, 그 미생물총은 일부 기능적인 잉여성(redundancy)을 갖는다고 일컬어진다. 유사한 효과를 생성하는 미생물 종의 첨가 또는 손실은, 미생물총이 포유류 시스템의 생리학적 상태에 대해 갖는 전체 효과에 거의 영향을 미치지 않을 수 있다. 그러나, 비록 소수로 존재하기는 하나 특정 미생물 종의 추가 또는 손실은, 포유류의 생리학적 상태에 유의한 효과를 생성할 수 있다.

"마이크로바이옴 불균형(microbiome imbalance)" 또는 "장내불균형(dysbiosis)"이라는 용어는, 시스템에서 유익한 미생물과 해로운 미생물 간에 불균형이 일어나는 상태를 지칭한다. 장내불균형은 유익한 미생물 종들의 다양성이 낮고/거나 미생물총내의 유익한 미생물의 기능적 잉여도가 결핍되었을 때 발생할 수 있다. 시스템에 대해 유익한 효과를 주는 것으로 간주되는 것을 생산하는 미생물 종이, 시스템에 대해 해로운 효과를 주는 것으로 간주되는 것을 생산하는 미생물 종과 적어도 동일하지 않을 때, 미생물 불균형이 생성되었다고 한다. 전형적으로, 장내불균형의 경우, 마이크로바이옴 특징은 변화된 마이크로바이옴의 재편성과 락토바실러스 분류군의 증가를 나타낸다.

본 발명은 또한 이러한 질병의 치료 및 예방 방법과, 천식이 있는 대상체에서의 보호 미생물총의 재편성뿐만 아니라 건강한 대상체에서의 보호 면역에 대한 이들의 구성에 제한된, 인간 대상체 내에서의 이들의 미생물총 관련 장애와의 연관성에 관한 것이기도 하다.

과거 수년 동안, 미국 국립보건원에 의한 인간 마이크로바이옴 프로젝트(HMP)라고 불리며, 국제 인간 마이크로바이옴 컨소시움(IHMC)으로 더욱 널리 알려진 국제적인 큰 노고는, 우리의 신체에 살고 있는 미생물을 특성화하는 것을 목표로 한다(http://hmpdacc.org/data_browser.php 참고). 대장에는 대략 100조 마리의 미생물들이 서식하는데, 이들은 상부 위장(GI) 관에 의해 흡수되지 않는 음식, 약물 및 식이 보조제를 대사화하는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 보인다. 또한, 이러한 미생물들 중 일부는 건강을 유지하는데 필요한 필수 영양소와 비타민을 생성한다. 대장 내 환경에서의 이러한 미생물 상호작용은, 인간 숙주의 대사-, 거동- 및 면역-조절 시스템을 알려주는 중요한 역할을 한다.

마이크로바이옴은 상재균, 공생균, 및 병원성 박테리아, 진균 및 바이러스를 포함하는데, 이는 생태학적 엔티티(entity)를 형성하고, 그들 자신 및 이들의 특정 숙주와 상호작용을 한다. 오랫동안, 미생물총의 군집화는 피부와 같은 체표면과 위장관에 제한된다고 추측되어 왔다. 그러나, 최근 유선, 난소, 자궁, 태반 및 폐를 포함하는 거의 모든 인간의 조직에 미생물이 서식한다는 사실이 명백해졌다. 따라서, 인간의 신체는 수십억의 미생물 서식체들이 군집을 이루고 있다. 이들은 다양하고 개별적으로 달라지며, 또한 연령에 따라서도 달라지는 생태학적 집단을 구성한다.

다양한 마이크로바이옴은 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 및 천명 관련 증상과 같은 다양한 다수의 병리학적 상태의 병인에 직접 관여하였다.

따라서, 상기 실시 형태에 기재된 BV 박테리아 추출물은, 자연적인 마이크로바이옴을 회복하는데 유익하고, 특히 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명 관련 증상, 미생물총 관련 장애를 치료하는데 유용하다.

제공된 치료 유효량의 BV 박테리아 추출물은, 대상체의 마이크로바이옴의 특징 또는 패턴을 건강한 대상체의 마이크로바이옴의 특징 또는 패턴과 더욱 유사하게 만들고, 이로 인해 마이크로바이옴 불균형과 관련된 임의의 병리학적 상태를 치료하고/거나 예방하게 한다. 더욱 건강한 시스템으로 간주되는 것은, 해로운 미생물을 제한하나 유익한 미생물의 발달을 촉진시킴으로써 확립되거나 재확립될 수 있다. 이 경우, 장내 미생물 상태(eubiosis state)가 촉진되는데, 시스템 내에 유익한 미생물 종의 다양성 및/또는 기능성 잉여도가 높으므로 시스템 내의 유익한 미생물은 우세한 효과를 갖는다.

BV 박테리아 추출물은 경구 투여에 적합한 임의의 형태, 예를 들어 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있고, 알약, 정제, 필름 정제(film table), 코팅된 정제, 캡슐, 시럽, 분말 및/또는 침전(deposit)으로 제형화될 수 있다.

바람직한 실시 형태에 의하면, BV 박테리아 추출물은 비강 내 및 기관 내 투여에 적합한 임의의 형태로서 액체, 기체 또는 고체 형태 중 하나로 존재할 수 있다. BV 박테리아 추출물이 액체 또는 에어로졸 형태로 존재할 때, 이들은 스프레이, 액적, 콜로이드, 미스트, 네뷸라(nebulae), 또는 분무된 증기(atomized vapor)로 제형화될 수 있다. 대안적으로, 이들은 고체 형태로 존재할 수 있으며, 이후 분말, 또는 부서지는(crushable) 정제로 제형화된다.

BV 박테리아 추출물 제제가 비강 내 경로를 통해 투여될 때, 이들은 바람직하게는 에멀전, 현탁제, 콜로이드 형태, 미스트, 네뷸라, 분무된 증기 또는 스프레이, 액적, 콜로이드, 미스트, 네뷸라, 분무된 증기, 비강 탐폰, 비강 에멀전, 분말, 연고, 크림, 로션, 겔, 페이스트, 고약(salve), 용액, 팅크제(tincture), 패치, 생체접착성 스트립으로부터 선택된 형태이다.

BV 박테리아 추출물 제제가 기관 내 경로를 통해 투여될 때, 전달은 고체 또는 액체의 에어로졸화, 및 입과 인두를 통한 에어로졸의 폐로의 전달을 요한다. BV 박테리아 추출물의 입자는, 건조 분말 에어로졸 또는 액체 에어로졸로서 폐에 투여될 수 있다. 건조 분말 에어로졸은 일반적으로 건조 분말 흡입기(DPI) 흡입 장치에 의해 폐로 투여된다. 건조 분말 흡입기는 호흡 작동식(breath actuated) 건조 분말 흡입기를 포함할 수 있는데, 예컨대 미국 특허 제7,434,579호에 기재되어 있다. 정량(metered-dose) 흡입기는 추진제, 추진제들의 혼합물, 또는 용매들의 혼합물에 현탁된 의약, 추진제들, 및/또는 가압 압축된 에어로졸 디스펜서 내의 다른 부형제들을 함유한다. MDI 생성물은 최대 수백 회의 정량의 BV 박테리아 추출물을 방출할 수 있다. 각각의 작동은 전형적으로 25 내지 140 마이크로리터의 부피로 전달되는, 수 마이크로그램(mcg) 내지 최대 밀리그램(mg)의 활성 성분을 함유할 수 있다.

다른 타입의 액체 에어로졸 장치는 네뷸라이저인데, 이는 제트, 진동 메쉬 또는 BV 박테리아 추출물의 입자를 함유하는 현탁제를 에어로졸화하기 위한 다른 수단을 사용한다.

액체, 반-고체, 고체 및 스프레이 의약의 제조 시, BV 박테리아 추출물은 원하는 경우, 임의의 첨가제, 예컨대 비히클, 결합제, 향료, 향미제, 감미제, 착색제, 방부제, 항산화제, 안정화제 및 계면활성제와 함께 제형화될 수 있다.

상기-언급된 약학적 제제를 제조하기 위해, BV 박테리아 추출물은 종래의 약학적 합성 기술에 의한 약학적으로 허용가능한 담체, 어주번트 및/또는 부형제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는, 표준 약학적 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 물, 및 에멀전, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀전, 및 다양한 타입의 습윤제 중 어느 것을 포함한다. 조성물은 고체의 약학적 부형제, 예컨대 전분, 셀룰로스, 탈크, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악(chalk), 실리카 겔, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 건조 탈지유 등을 추가로 함유할 수 있다. 액체 및 반고체의 부형제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등을 포함하는 다양한 오일로부터 선택될 수 있다. 특히 주사 용액을 위한 액체 담체는, 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 글리콜을 포함한다. 담체, 안정화제 및 어주번트의 예는, E. W. Martin에 의해 편집된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, 18판, 1990)]를 참고한다. 박테리아 추출물 제제는 또한 안정화제 및 방부제도 포함할 수 있다.

특정 실시 형태에서, 예를 들어, 흡수를 개선시키기 위해, 비강 내 체류 시간을 연장시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, BV 박테리아 추출물은 선택적으로 생체 접착성 중합체, 검, 예컨대 잔탄 검, 키토산( 예를 들어 , 고 정제된 양이온성 다당류), 펙틴, 또는 비강의 점막에 적용될 때 겔 또는 유화제와 같이 증점되는 임의의 탄수화물, 미소 구체, 예컨대, 전분, 알부민, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 또는 이들의 유도체, 젤라틴, 리포좀, 카르바머(carbamer), 폴리비닐 알코올, 알기네이트, 아키시아, 키토산 및/또는 셀룰로스( 예를 들어 , 메틸 또는 프로필; 하이드록실 또는 카르복시; 카르복시메틸 또는 하이드록실프로필)와 함께 제형화될 수 있다.

대안적으로, BV 박테리아 추출물 제제는 부서지는 정제(crushable tablet)로 제형화될 수 있다. 정제는　전체로 투여되거나, 예컨대 손가락 압력으로 가볍게 부서지고, 적절한 비히클에 살포될 수 있다.　부서지는　정제는 직접 압착 공정과　개별 하위 단위들의 코팅의 손상을 피하기 위한 공정에서 취하는 부형제를 사용하여 조심스럽게 제조될 수 있다. 부서지는　정제를 제조하기 위한 적합한 부형제는, 단당류 및 이당류, 당 폴리올 등 또는 이들의 조합을 포함하는, 전형적으로 씹어 먹을 수 있는(chewable) 정제에 사용하기 위한 것들을 포함한다. 예시적인 부형제는 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 만니톨, 락토스, 수크로스, 말토스 또는 이들의 조합을 포함한다. 선택적인 약학적 부형제, 예컨대 희석제, 윤활제, 활택제, 향미제, 착색제 등 또는 상기의 것들 중 적어도 하나를 포함하는 조합도 또한 압축 기질 내에 포함될 수 있다. 부서지는 정제는 약학 분야에 알려진 정제 제조 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

BV 박테리아 추출물 제제는 예를 들어, 금속 염화물, 가장 바람직하게는 염화은을 포함하는 콜로이드 형태로서 추가로 존재할 수 있다. BV 박테리아 추출물과 어주번트는 콜로이드 입자 내에 혼입되거나, 콜로이드 입자에 의해 캡슐화될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하나 이상의 박테리아 추출물과 어주번트는 콜로이드 입자의 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 입자 표면과의 소수성 상호작용을 통해 소수성 입자에 용이하게 흡착하거나 부착되어, 일부 중성 유화제를 대체한다.

BV 박테리아 추출물의 적합한 투여량은, 대상체의 상태, 연령 및 종에 따라 달라질 것이고, 당업계의 숙련자가 용이하게 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명에 의하면, 총 하루 투여량은 0.005 mg 내지 2 mg, 바람직하게는 0.05 mg 내지 1 mg, 가장 바람직하게는 0.5 mg 내지 1 mg의 범위 내일 수 있고, 이들은 단일 또는 분할된 용량으로 투여될 수 있고, 또한 상한은 지정된 것으로 밝혀진 경우 또한 최대 2 mg를 초과할 수 있다.

BV 박테리아 추출물은 비강 취입기 장치, 비강 내 흡입기, 비강 내 스프레이 장치, 아토마이저, 비강 스프레이 보틀, 단일 단위 용기, 펌프, 점적기, 스퀴즈 보틀, 네뷸라이저, 정량 흡입기(MDI), 가압 용량 흡입기, 취입기, 양-방향 장치, 투여 앰풀, 비강 패드, 비강 스폰지, 및 비강 캡슐에 의해 비강 내로 투여될 수 있다. 또한, 이를 필요로 하는 대상체에서 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명 관련 증상, 미생물총 관련 장애를 치료하고/하거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 전달 장치도 제공된다.

이러한 전달 장치는 비강 취입기 장치, 비강 내 흡입기, 비강 내 스프레이 장치, 아토마이저, 비강 스프레이 보틀, 단일 단위 용기, 펌프, 점적기, 스퀴즈 보틀, 네뷸라이저, 정량 흡입기(MDI), 가압 용량 흡입기, 취입기, 양-방향 장치, 투여 앰풀, 비강 패드, 비강 스폰지, 비강 캡슐 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

비강 스프레이는 에어로졸로서 또는 비-에어로졸 형태의 투여를 위한 액체, 고체의 비강 분무일 수 있다. 비강 전달 장치는 정확한 유효 투여량의 BV 박테리아 추출물을 칭량하여 비강에 투여할 수 있다. 비강 전달 장치는 단일 단위 전달 또는 다수의 단위 전달을 위한 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 정의된 바와 같은 치료 유효량의 BV 박테리아는 튜브, 카테터, 주사기, 팩테일(packtail), 가제(pledget), 비강 탐폰을 통해, 또는 US 특허 공개 US 2009/0326275, 2009/0291894, 2009/0281522 및 2009/0317377에 기재된 바와 같이 점막하 주입에 의해 전달될 수 있다.

비강 내 또는 기관 내 투여가 에어로졸에 의해 실시될 때, 에어로졸 스프레이는 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 탄화수소, 압축 공기, 질소, 이산화탄소, 또는 다른 적합한 기체와 같은 적합한 추진제를 갖는 가압 용기로부터 생성될 수 있다. 투여량 단위는 정량을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 펌프 스프레이 디스펜서는 정량 또는 특정 입자 또는 액적 크기를 갖는 용량을 분배할 수 있다. 본원에 사용된 "에어로졸"이라는 용어는 공기 중의 (또는 기체 중의) 액적 또는 고체 분말 중 어느 하나의 현탁제 또는 분산제를 지칭할 수 있다. 액적은 액체, 예컨대 물 또는 비-수성 용매 중의 약물의 용액, 현탁제 및 분산제로부터 형성될 수 있다. 에어로졸은 코를 통해 취입되거나 흡입될 수 있다. 에어로졸은 임의의 적합한 장치, 예컨대 MDI, 네뷸라이저, 또는 미스트 분무기에서 생성될 수 있다.

전형적으로, 에어로졸은 적합한 기계적인 장비를 사용하여 취입될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 장비는 저장기 및 분무기를 포함할 수 있는데, 이는 스프레이 형태의 약학적 용량을 방출시키도록 구성된 장치이다. 투여될 BV 박테리아 추출물의 수 회분의 용량이, 선택적으로 액체 용액 또는 현탁제 내, 또는 고체 미립자 혼합물과 같은 고체 미립자 제제 내의 저장기 내에 함유될 수 있다.

대안적으로, 네뷸라이저 장치가 사용될 수 있다. 이 장치들은 BV 박테리아 추출물이 미스트로서의 액체 내지 스프레이의 형태, 예컨대 미세화 입자의 형태로 투여되도록 하는 고속의 공기 스트림을 생성하며, 상기 입자의 90% 이상은 약 10 미만의 직경을 갖는다.

본 발명에 의한 BV 박테리아 추출물의 비강 내 또는 기관 내 투여를 위한 다른 전달 장치는, 전형적으로 흡기(inspiration) 동안 환자의 기류에 분산될 수 있는 자유-유동 분말의 형태로 치료 유효량을 투여하는 DPI 장치일 수 있다. 외부 에너지원을 사용하는 DPI 장치도 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 자유-유동 분말을 얻기 위해, BV 박테리아 추출물은 예를 들어 락토스와 같은 적합한 부형제와 함께 제형화될 수 있다. 건조 분말 제제는 예를 들어, 약 1 ㎛ 내지 100 ㎛의 입자 크기를 갖는 건조 락토스와 BV 박테리아 추출물의 마이크론 크기의 입자를 조합하고, 건조 블렌딩함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, BV 박테리아 추출물은 부형제 없이 제형화될 수 있다. 제제는 건조 분말 전달 장치에서 사용하기 위해 건조 분말 디스펜서 또는 흡입 카트리지 또는 캡슐에 로딩된다. 상업적으로 제공된 DPI 장치의 예는, Diskhaler(GlaxoSmith line, Research Triangle Park, N.C.)(미국 특허 제5,035,237호); Diskus(미국 특허 제6,378,519호); Turbuhaler(미국 특허 제4,524,769호); 및 Rotahaler(미국 특허 제4,353,365호)를 포함한다. 적합한 DPI 장치의 추가적인 예는, 미국 특허 제5,415,162호; 제5,239,993 호; 및 제5,715,810호에 추가로 기재되어 있다.

MDI 장치는 전형적으로 압축된 분사제 기체를 사용하여, 치료 유효량의 BV 박테리아 추출물을 방출한다. MDI 투여용 제제는 액화 분사제 중 활성 성분의 용액 또는 현탁제를 포함한다. 상기 제제는 MDI 장치의 일부를 형성하는 에어로졸 캐니스터(canister)에 로딩된다. 분사제의 예는, 하이드로플루오로알칸(HFA), 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134a) 및 1,1,1,2,3,3,3- 헵타플루오로-n-프로판, (HFA 227), 및 클로로플루오로카본, 예컨대 CC1₃F를 포함한다. MDI 투여용 HFA 제제의 추가적인 성분은, 보조-용매, 예컨대 에탄올, 펜탄, 물; 및 계면활성제, 예컨대 소르비탄 트리올레에이트, 올레산, 레시틴, 및 글리세린을 포함한다. MDI 장치는 특히 미국 특허 제5,225,183호 및 국제 공보 WO92/22286에 기재되어 있다.

BV 박테리아 추출물이 분말의 형태일 때, 이들은 비강 취입기(insufflator)를 사용하여 본 발명에 의한 비강 내 또는 기관 내 경로를 통해 투여될 수 있다. 전형적으로, 이들은 고체 표면, 예를 들어, 담체에 흡착될 수 있으므로, 미소 구체와 같은 형태의 분말로서 비강에 전달된다. 분말 또는 미소 구체는 취입기의 용기 내에 저장될 수 있고, 이후 건조한 공기-분배 형태로 투여될 수 있다. 대안적으로, 분말 또는 미소 구체는 캡슐, 예컨대 젤라틴 캡슐, 또는 비강 투여에 적합한 다른 단일 용량 단위로 충전될 수 있다.

본 발명의 BV 박테리아 추출물이 비강 스프레이 적용기를 통해 전달될 때, 이들을 비강 내 스프레이-투여 장치 또는 아토마이저 내에 두고, 콧구멍의 점막에 전달되기 위해 대상체의 콧구멍으로 스프레이함으로써 적용될 수 있다. 비강 내 스프레이를 위해, 최대 약 200 마이크로리터, 약 50 내지 약 150 마이크로리터, 또는 약 75 내지 약 120 마이크로리터가 적용될 수 있다. 하나 이상의 콧구멍에 투여될 수 있고, 원하는 경우 또는 필요할 때마다 적용될 수 있다. 마이크로리터 수준의 첫 번째 용량은 콧구멍으로 투여될 수 있다. 적합한 시기 이후, 액체의 양이 흡수될 때, 두 번째 용량이 동일한 콧구멍에 순차적으로 투여될 수 있거나, 다른 콧구멍에 투여될 수 있다. 전체 목표 치료 용량이 환자에게 투여될 때까지, 양쪽 콧구멍에 교대로 추가적인 계량된 스프레이가 적용될 수 있다. 동일한 콧구멍에 벤조디아제핀(benzodiazepine) 약물을 적용할 때에는, 그 간격은 수 초 내지 5 분, 바람직하게는 약 10 초 내지 약 1 분의 시간만큼 증가될 수 있다. 이것은 약물이 비강 점막을 통과하여 혈류로 들어갈 시간을 준다. 칭량된 스프레이제를 각각의 콧구멍에, 선택적으로 시간 간격을 두고 다수 회 적용하면, 조성물이 혈류로 완전히 흡수되고, 약물이 목구멍 뒤쪽으로 손실되는 것을 피하기에 충분할 정도로 소량씩 증량하면서 전체 치료 용량을 투여할 수 있게 된다.

BV 박테리아 추출물은 어주번트, 약학적으로 허용 가능한 용매 및 침투 개선제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 비강 내 전달을 위해, 침투 개선제는 비강 점막을 통한 조성물의 침투를 개선시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 하이드록실기를 함유하는 화합물이, 침투 개선제로서 사용될 수 있다. 이러한 하이드록실 기-함유 화합물의 일부는 또한 조성물에서 용매로 작용할 수도 있다. 침투 개선제로서 사용될 수 있는 하이드록실 기-함유 화합물의 비-제한적인 예는, 알코올(예컨대 에탄올), 디올(예컨대, 1,2-프로판디올이라고도 또한 알려진 프로필렌 글리콜; 1,3-프로판디올; 1,3-부탄디올, 1,2- 부탄디올, 2,3-부탄디올, 및 1,4 부탄디올을 포함하는 부틸렌 글리콜; 헥실렌 글리콜; 디프로필렌 글리콜, 1,5-펜탄디올, 1,2-펜탄디올, 1,8-옥탄디올, 에토헥사디올, p-메탄-3,8 디올, 2-메틸-2,4-펜탄디올), 트리올(예컨대 글리세린), 폴리올(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트, 및 소르비톨 에스테르을 포함하는, 다수의 하이드록실 기를 함유하는 적합한 중합체; 및 적합한 당 알코올), 사이클리톨(예컨대 피니톨, 이노시톨), 환형 디올(예컨대, 사이클로헥산 디올), 방향족 디올(예컨대 하이드로퀴논, 비스페놀 A, 레조르시톨 및 카테콜)을 포함한다.

당업계의 통상의 숙련자는, 본 발명의 교시가 또한 다른 침투 개선제에도 적용될 수 있을 것이라는 사실을 인식할 것이다. 이들은 단순 지방족, 불포화 또는 포화 에스테르를 포함할 수 있다. 이러한 에스테르의 비-제한적인 예는, 이소프로필 미리스테이트, 미리스틸 미리스테이트, 옥틸 팔미테이트 등을 포함한다. 다른 침투 개선제의 비-제한적인 예는, 알코올( 예를 들어 , 단쇄 및 장쇄 알코올), 다가 알코올, 아민 및 아미드, 우레아, 아미노산 및 이들의 에스테르, 아미드, 아존(azone) 또는 피롤리돈 및 이의 유도체, 테르펜, 지방산 및 이들의 에스테르, 마크로사이클 화합물, 술폭사이드, 텐시드(tenside), 벤질디메틸암모늄 클로라이드, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 시네올(cineole), 코카미도프로필 베타인, 코카미도프로필 하이드록시술테인(hydroxysultaine), 도데실 피리디늄 클로라이드, 도데실아민, 헥사데실 트리메틸암모니오프로판 술포네이트, 리모넨, 리놀레산(OA), 리놀렌산(LA), 멘톨, 메틸 라우레이트, 메틸피롤리돈, N-데실-2-피롤리돈, NLS, 니코틴 설페이트, 노닐-l,3-디옥솔란, 옥틸 트리메틸암모늄 브로마이드, 올레일 베타인, PP, 폴리에틸렌글리콜 도데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(트윈 20, 또는 폴리소르베이트 20), SLA, 소듐 올레에이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 옥틸 설페이트(SOS), 소르비탄 모노라우레이트(S20), 테트라케인, 및 Triton X-100을 포함한다.

본 발명에 사용할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 용매의 예는, 참고 도서, 예컨대 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients (5판, Pharmaceutical Press, London and American Pharmacists Association, Washington, 2006)]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 용매의 비-제한적인 예는, 프로필렌 글리콜, 예컨대 1,2-디하이드록시프로판, 2-하이드록시프로판올, 메틸 에틸렌 글리콜, 메틸 글리콜 또는 프로판-1,2-디올), 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 글리콜, Cremophor EL 또는 임의의 형태의 폴리에톡실화 캐스터 오일, 디프로필렌 글리콜, 디메틸 이소소르바이드, 프로필렌 카보네이트, N-메틸피롤리돈, 글리코퓨롤, 테트라에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 본원에서 상기 기재된 BV 박테리아 추출물 또는 BV 박테리아 추출물을 포함하는 전달 장치, 및 사용을 위한 매뉴얼 설명서를 포함하는 포장 삽입체를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.

첫 번째 시리즈의 실험: 천식 보호

실시예 1

OVA-유도된 천식 모델에 대한 다양한 투여량의 BV 박테리아 추출물의 효과

마취 시 비강 내 경로를 사용하여 6회 용량의 BV 박테리아 추출물 (또는 이하 본원에서 BV)을 2회의 개별 실험 (연구 1 및 2)에서 시험한 4마리의 마우스/그룹:

- 연구 1: 5-50-1000 마이크로그램/치료×14회의 처리.

- 연구 2: 1-10-100-1000-2250 마이크로그램/BV 치료×14회의 처리.

본 요법은 Amish 분진에 의한 상이한 경로를 사용하는 오발부민-유도된 (OVA) 천식 모델의 구성(setting up) 동안 실시된 이전 연구로부터 선택하였다 (Stein et al, N Engl J Med 2016; 375:411-421). BV의 용량은 바이러스 감염 모델을 사용하는 이전의 최적화 연구로부터 유래하였고, 이 실험 계획에서는 최대 1 및 2.2 mg/용량으로 확대되었다.

이를 위해, 1 상은 0일 내지 32일까지 2~3 일마다(총 14회), OVA-면역화 마우스에 BV 박테리아 추출물 용량을 증가(1, 5, 10, 50, 100 또는 1000 마이크로그램/마우스/치료)시키면서, 비강 내/흡입(i.n.) 경로를 통해 처리하는 용량-반응 실험을 디자인하였다. 1 mg/마우스 용량을 탐색 용량(exploratory capacity)으로 제안하였다.

2 상에서는, 동일한 프로토콜을 채택하여 최적 효과를 나타낸 BV 농도(1000 마이크로그램/마우스/치료)를 추가로 시험하였고, 더 높은 용량(2250 마이크로그램/마우스/치료)을 추가하여 최대 보호의 안정기(plateau)에 도달할 수 있는지 여부를 평가하였다.

OVA-유도된 천식 동물 모델

7~8 주-령의 수컷 BALB/c 마우스를 Envigo (미국)으로부터 구입하여, BIO5 연구소 동물 실험 시설에서 특정-감염원 불포함의 조건 하에 유지하였다. 동물들에게 표준 저알레르겐 식이를 공급하였다.

도 1로부터의 방식 예에서, BV 박테리아 추출 농축물을 0.9% 식염수에 희석하였다. OVA 모델은 참고 문헌 [Stein M 등]에서 채택하였다. 간략히, BV 박테리아 추출물(25 ㎕ (마이크로리터)의 식염수 중 1, 5, 10, 50, 100, 1000 마이크로그램/마우스/처리)을, 0일 내지 32일로부터 2-3 일마다(총 14회), 가벼운 이소플루란 마취 하에 7~8 주령의 BALB/c 마우스(Envigo)의 2개의 콧구멍에 균일하게 비강 내(i.n.) 주입하였고, 상기 마우스를 0일 및 14일차에 오발부민(OVA: V 등급, Sigma, 20 마이크로그램)-명반 (Pierce)에 의해 복강-내(i.p.) 감작시키고, 28일차 및 38일차에 OVA (50 마이크로그램)으로 비강 내로 면역을 유발하였다. 마우스 그룹은 치료, 감작 및 면역 유발의 시점에 식염수를 받았다. 실험 3에서는, 마우스의 그룹을 모의-처리하였다(sham treated).

완전하지 않은 이하의 판독 자료들을 사용하는 것이 포함된 39일차의 최종 평가가: 1) AHR의 침습적 측정, 2) 차등적 기관지폐포 세척(BAL) 세포; 3) 폐 사이토카인 RNA 및 단백질의 수준; 4) 선택된 폐 세포 집단의 분석; 5) 혈청 OVA-특이적 IgE의 측정.

초기 탐색(exploratory) 실험(연구 1 및 연구 2)에서, 분무된 메타콜린(methacholine)(0~40 및 0~60 mg/ml)의 농도 증가에 반응한 기도 저항성을, 케타민 및 자일라진(각각, 100 mg/kg 및 10 mg/kg)에 의해 마취되고, 판큐로늄 브로마이드 (4 μg/g)에 의해 마비된 동물에서 평가하였다. 기관을 절개하지 않고, 20-게이지의 캐뉼라(BD)를 삽입하고, 이를 단일 고정(tie) 봉합사로 제자리에 유지하였다. 이후, 마우스를 소형 산소 호흡기(FlexiVent FX, SCIREQ, Inc.)에 연결하고, 10 mL/kg의 1회 환기량(tidal volume), 66.67%의 들숨/날숨 비율, 150/분의 호흡 속도 및 30 cm H₂O의 최대 압력으로 환기시켰다. 최적 BV 박테리아 추출물 농도(1,000 마이크로그램/마우스/치료, 연구 3)에 의한 최종 실험에서, 정맥내 투여된 아세틸콜린(0~1 마이크로그램/마우스)의 용량의 증량에 반응한 기도 저항성을 측정하였다. PBS(2 mL) 중 차가운 1% BSA를 기관지 캐뉼라를 통해 기도에 전달하고, 가볍게 유체를 흡입함으로써 BAL을 얻었다. 세포를 Countess II FL 자동 세포 계수기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 계수하고, Hema 3(Fischer)에 의해 염색하고, 적어도 400개 세포/슬라이드를 평가한 후, 그 차이를 마우스 ID/그룹화에 대해 알지 못하는 조작자가 결정하였다. BAL 사이토카인(IL-5, IL-13, IL-17)을 ELISA(R&D)에 의해 측정하였다. 통계적 분석:

모든 변수에서의 통계적 차이를, 짝지어지지 않은(unpaired) 양 말단 스튜던트(Student) t 시험을 사용하여 평가하였다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의하였다.

실시예 2

천식의 OVA 모델에서의 BV 박테리아 추출물의 비강 내 투여 효과의 설명적인 예.

BAL 호산구 증가증을 기초로 한 효능의 모니터링은, 실시예 1에 기재된 실험 계획 이후의 백분율로 표현하였다. 폐 기도 과다 반응성(AHR)으로부터의 보호와 연관된 호산구 증가증의 감소에 대한 BV 박테리아 추출물의 효능을 평가하기 위해, 2개의 개별 실험을 다양한 용량의 BV에 의해 실시하였다. 1 mg의 BV의 용량에서 상당한 억제를 나타내며, 호산구 증가증을 감소시키는 최적 효능(Y 축)에 도달하였다. 사용된 용량과 무관하게, 위약 그룹에서는 호산구 증가증에 대한 효과가 완전히 나타나지 않았고, 또한 비-질병 동물에서 BV의 안전한 사용을 확인하였다. BV의 비강 내/흡입 전달은 천식-유도된 폐 염증의 기본 세포 표현형을 억제하였다.

실시예 3

실시예 2에 나타낸 데이터 세트와 동일하나, 다른 실험으로부터 유래된 BAL로부터의 호산구 증가증 함량을 세포 (도 3a) 및 분자 함량 (도 3b)으로 표현하였다. 실시예 2에서와 같이, BV 박테리아 추출물은 1 mg 용량에서 상당히 억제되어 BAL 호산구 증가증의 억제를 유도하였다. BAL(800'000개 초과의 세포) 내의 세포수 중 OVA에 의한 높은 호산구 증가증 유도를 고려하면, 거의 완전하고 매우 유의한(P=0.005) 호산구 증가증의 소멸(abrogation)은 이러한 생성물 부류에서는 예상치 못한 일이었다.

실시예 4

본 실시예는 AHR에 대한 BV 박테리아 추출물 보호를 입증하는 도 4에 도시된 두 그룹의 실험의 대표적인 예에 관한 것이며, 최선의 보호 효과는 1 mg 용량에서 얻었다. 도 2와 3에 도시된 호산구 증가증의 동반 소멸(concomitant abrogation)은, 폐 AHR의 기능적인 정지(functional shutdown)와 함께, 알레르기성 천식의 잘-확립된 모델에서의 비강 내 투여된 BV 박테리아 추출물의 보호 제공 능력을 입증하고 인증하며, 1 mg/일/마우스의 용량×14회의 치료가 알레르겐-유발 AHR 및 기도 염증에 대한 최적의 보호를 부여하는데 적절하다는 것을 나타낸다. 이 요법에 의해 달성된 보호는, 심지어 BV가 신생아 또는 어린 마우스가 아니라 성체에게 투여된 경우에도 현저하며, 이의 투여는 알레르겐에 대해 노출되기 전보다는 노출됨과 동시에 시작한다. 이에 더하여, BV 가 처리된 OVA 그룹(OVA/BV)에서의 폐 조직으로부터 채취한 기도 염증 배상 세포의 의사 부재(quasi absence) 상태는 도 5a에 나타나 있으며, 도 5b에 과요오드화산-Schiff (PAS)⁺-점액-분비 세포에서의 매우 큰 감소(P=0.00003)로서 정량화 되어 나타냈고, 도 4로부터의 AHR에 대한 보호를 기능적으로 확인한다.

실시예 5

방식(도 6)은 지시된 바와 같이 14회의 투여 요법 이후 1일 1 mg 용량을 사용하는 알테나리아(Alternaria) 알레르기성 천식 모델에서, 비강 내(i.n.) BV 박테리아 추출물의 실험 환경을 나타낸다.

실시예 6

BAL 차이를 사용하여 모니터링된, 알테나리아 알레르기성 천식 모델에서의 비강 내 BV 박테리아 추출물의 효과.

도 7에서, BAL 함량 중 호산구 증가증의 대략 40%의 억제는, 도 6에 도시된 바와 같이 1 mg 투여량(14회)을 사용하는 BV 박테리아 추출물에 의해 도달하였다. 이러한 천식의 인간 이식 모델(어주번트가 없는 동일한 비강 내 감작 및 면역 유발 경로)의 높은 관련성을 고려하면, 이 결과들은 알레르기-유도된 천식에서 BV 박테리아 추출물의 보호 역량을 명백히 나타내었다.

BALB/c 마우스(4~6 마리/그룹)를 0일 및 1일차에 알테나리아(Greer Laboratories: 50 ㎍의 건조 중량, 50 ㎕의 PBS 중 10 ㎍의 단백질)에 의해 비강 내 감작시키고, 17일, 18일 및 19일차에 알테나리아 (25 ㎍의 건조 중량, 50 ㎕ 중 5 ㎍의 단백질)에 의해 비강 내로 면역을 유발하였다.

BV(농축물, 50 ㎕ (각각의 콧구멍에서 25 ㎕) 중 1 mg을, -10일로부터 2 일차마다 14회 동안 투여하였다. 최종 평가는 20일차에 실시하였다. BAL 유체는 PBS(2 mL) 중 차가운 1% BSA를 기관지 캐뉼라를 통해 기도로 전달하고, 유체를 가볍게 흡입함으로써 얻었다. 세포를 Countess II FL 자동 세포 계수기 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 계수하였고, Hema 3(Fischer)에 의해 염색하고, 적어도 400개 세포/슬라이드를 평가한 후, 그 차이를 마우스 ID/그룹화에 대해 알지 못하는 조작자가 결정하였다.

실시예 7

폐 기능에 관해 도 8에서 판독 자료로서 예시된 기능적 효능 연관성의 대표적인 예를 나타내었다. 호흡계 저항성(Rrs) 반응은 BV 박테리아 추출물에 의해 현저히 예방되었고, 모든 시험된 지점에서 1 mg 용량에서 최선의 효능을 나타내었다. 알테나리아에 비해 AHR의 현저한 감소가 표현되었다.

정맥내 투여된 아세틸콜린(0 내지 2 ug/g 마우스)의 농도 증가에 반응한 기도 저항성은, 케타민 및 자일라진(각각, 100 및 10 mg/kg)에 의해 마취된 동물들에서 평가하였다. 마우스를 기관 절개하고, 18-게이지의 금속 캐뉼라를 기관에 삽관하고, 단단히 고정된 봉합사에 의해 공기 누출을 방지하였다. 작은 동물(FlexiVent, Scireq Inc., 캐나다)에 대해서는 기관지 캐뉼라를 컴퓨터-조절된 산소 호흡기에 연결시키고, 마우스를 150회 호흡/분, 10 mL/kg의 1회 환기량, 및 3 cm H₂O의 호기 말 양압(PEEP: positive end expiratory pressure)으로 기계적으로 환기시켰다. 동물을 따뜻한 패드 위에 두어 체온을 유지하고, 판큐로늄 브로마이드(1 mg/kg, i.p.)로 마비시켰다. 폐 용적의 이력을 표준화하기 위해, 폐에 30 cm H₂O의 압력으로 2회 공기를 주입하였다(폐포 동원, recruitment maneuver). 실온에서 식염수에 희석된 아세틸콜린 클로라이드(ACh)를, 0.25, 0.5, 1.0 및 2.0 μg/g 체중의 증가하는 용량으로 우측 경정맥을 통해 볼러스(bolus)로 주사하였다. 식염수는 대조군으로 사용하였다. 각각의 ACh 투여 직후, 측정을 시작하고, 5분 동안 30초마다 실시하였다. ACh의 각 투여 후 피크 반응을 결정하였다. 호흡 과정(Respiratory mechanics)은 정위상파(constant phase) 모델을 사용하여 평가하였는데, 이는 호흡 특성들을 중심 기도와 말초 기도로 나누고, 상이한 조직 특성들 사이에 구별하는 능력을 갖는다. 평가된 변수는 뉴턴 저항성(Rn), 근위 전도 기도 내 저항성의 밀접 근사치, 및 폐 조직 저항성과 관련되고 폐포 내에서의 에너지 분산을 반영하는 조직 습윤화(tissue damping)(G)이었다. 단지 0.9 이상의 결정 계수(COD) 만을 정위상파 모델에서 사용하였다.

이것이 도 7에서 입증된 바와 같이, BAL 내의 30 내지 40%의 호산구 증가증 감소는 폐의 기능성 판독 자료와 완전히 연관되는데, 이 경우 BV는 이러한 극히 급성인 알레르기성 천식 모델에서 AHR에 대한 거의 완전한 보호를 확고히 하였다.

이에 더하여, 장벽 기능의 척도인 TEER (상피 통과 전기 저항성)로서 표현된, 상피세포층의 치밀성(tightness)에 대한 BV의 보호 효과를 모니터링하여, BV에 의한 인간 기관지 상피 세포에서 스트레스- 및 알테나리아-유도된 손상의 예방을 나타내었다. 이것은 도 9에서 16HBE14o^- 세포주를 사용하는 약물 전달의 연구를 가능하게 하는 기도 세포의 시험관 내 모델에서 입증된다(참고 문헌: Forbes B, Int J Pharm. 2003, 257(1-2), 161-167).

실시예 8

도 10은 도 1에서 사용되었으나, OVA-유도된 천식에서 변화된 프로토콜의 대표적인 예를 나타낸다. BV의 예방 요법에 다시 사용된 모델은, 이하에서 8회 투여(치료 T1 내지 T8)로 감소된 후, 시간을 줄여서 다시 2회의 연속적인 OVA-유도된 감작과 면역 유발을 실시하였다(39일차 대신에 19일차에서의 최종 평가). BV에 의한 유의한 호산구 증가증의 차단은 더 적은 처리에서의 이러한 새로운 환경에서도 확인되었다.

실시예 9

도 2와 같은 백분율(좌측) 뿐만 아니라 세포 수(우측)로서 표현되었으나, 도 10에 도시된 변형된 OVA-유도된 계획으로부터 유래하는 기관지폐포세척(BAL) 호산구 증가증에 대한 BV의 효과를 나타낸다. 도 11은 BAL 내 호중구 동원의 상당한 증가와 함께, BV 박테리아 추출물에 의한 유의한 호산구 증가증 억제를 나타낸다. 1 mg/50 ul를 사용한 마우스의 수(n=4 마우스/그룹).

실시예 10

상이한 마우스(C57BL6)에서의 OVA-유도된 천식의 평가. 도 12는 도 1에서 사용되었으나, OVA-유도된 천식에서 변화된 프로토콜의 대표적인 예를 나타낸다. 모델을 14회(치료 T1 내지 T14)의 투여 이후 연속 2회의 OVA-유도된 감작 및 3회의 OVA 면역 유발을 사용하는, BV 박테리아 추출물의 예방 요법에 다시 사용하였다. 30일차에 최종 평가를 실시하였다.

실시예 11

본 실시예는 도 12에 도시되고, C57 BL6 마우스를 위해 개조된 방식을 사용하여, OVA 유도된 천식 모델에 대한 BV 박테리아 추출물의 비강 내 투여의 효과를 나타낸다. 효능의 모니터링은 도 13에서 총 BAL 세포 함량의 백분율(Y 축)로 표현된 BAL 호산구 증가증에 기초하였다. 결과는 폐 기도 과다 반응성(AHR)의 보호와 연관된 호산구 증가증을 감소시키는데 대한 BV의 효능을 보여주었다. 호산구 증가증을 감소시키는 최선의 효능은, 1 mg 용량의 BV에서 도달하였다.

실시예 12

핵심 폐-발현 유전자는 OVA를 처리한 마우스에서 기본 천식 표현형(AHR 및 BAL 호산구 증가증) 및/또는 Th2와 음성적으로 연관된 경로의 BV 클러스터, 및 도 14에 도시된 수지상 세포 이동과 강하게 연관되었다.

미분획된 폐 조직을 도 1에서와 같이 PB, BV, OVA 또는 OVA+BV로 처리한 27 마리의 Balb /c 마우스로부터 수집하고, RNA를 분리하고, RNA-시퀀싱(RNA-Seq)을 실시하였다. 발현 데이터를 24,538개의 유전자에 대해 추정하고, 필터링하여, 총 19,613개의 유전자를 보유하는 20%의 샘플에서 적어도 하나의 판독 자료를 갖는 유일한 유전자를 포함하였다. 가중화 유전자 공동-발현 분석(WGCNA)을 모든 19,613개의 유전자에 대한 전체 폐 발현 데이터에 대해 실시하였고, 공동-조절된 유전자 네트워크(모듈)은 사인(signed) 네트워크 알고리즘을 사용하여 구축하였다. 각 모듈 내의 발현 데이터를 모듈 eigengene 벡터(즉, 모듈의 제1 주요 요소)를 사용하여 요약하였고, 기도 및 보호와 관련된 면역 표현형과의 연관성은 피어슨(Pearson) 연관성을 사용하여 평가하였다. Ingenuity Pathway 분석을 사용하여, 차등적으로 발현된 기능들로부터 핵심 생물학적 용어 또는 기능에 대한 풍부도(enrichment)를 결정하였고, 이 경우 음의 값은 예측된 억제에 상응하고, 양의 값은 예측된 활성화에 상응한다.

도 15에 도시된 WGCNA는 총 16개의 공동-조절된 유전자 네트워크(모듈)를 확인하였는데, 이들 중 단지 4개만이 호산구 증가증 및 AHR 둘 다에 대해 강하고 유의하게 관련되었다(|Pearson의 r| > 0.5 및 P≤0.001). 청록색 및 갈색 모듈은 AHR 및 호산구 증가증과 양의 연관성을 갖고, BV+OVA 처리 (대 OVA)와는 음의 연관성을 가진 반면, 청색 및 황색 모듈은 AHR 및 호산구 증가증과 음의 연관성을 나타내고, BV+OVA 처리와는 양의 연관성을 나타내었다. 호산구 증가증 및 AHR(n=333, 도 15 좌측)과 크게 연관된, 갈색, 청록색, 청색, 녹색 및 황색 모듈로부터의 유전자 핵심 세트에 대한 Ingenuity Pathway 분석(IPA)에서는, 예상한 바와 같이, 유전자가 AHR 및 호산구의 세포 움직임과 관련된 경로뿐만 아니라 Th2 세포 및 수지상 세포의 이동과 관련된 경로에서 클러스터링된 BV+OVA에 의해 교란된다는 사실이 입증되었다(도 15 우측). 이들 경로 각각은 IPA에 의해 하향 조절될 것으로 예측되었다.

RNA-Seq에 의해 확인된 DC-관련 BV-유도된 전사 특징을 보고, 본 발명자들은 골수-유래 DC(BMDC)에 대한 BV 추출물의 시험관 내 투여의 효과를 조사하게 되었다. MHC 부류 II 및 보조 자극 분자(CD40, CD80 및 CD86)의 발현은, BV-처리된 BMDC에서 강하게 억제되었다. 따라서, 본 발명자들은 DC 재프로그래밍이 BV 박테리아 추출물의 알레르기성 천식에 대한 억제 효과를 설명하기에 충분한지 의문을 가졌다. 이러한 목적으로, 2 일 동안 BV 추출물에 의한 2 일-사전-치료와 함께 또는 이의 부재 하에, OVA에 의해 시험관내 펄스된 BMDC를, 미경험 Balb/c 마우스로 비강 내 전달한 후, 10 일 후에 OVA에 의해 연속 3일 동안 면역을 유발하였다. OVA-펄스된 BMDC는 AHR, BAL 호산구 증가증의 증가 및 폐와 기도의 배수 림프절(draining lymph node)에서의 타입-2 사이토카인 발현의 증가에 의해 밝혀진 바와 같이, 이러한 동물들에서 실험에 의한 천식을 효과적으로 유도하였다. 놀랍게도, BMDC를 BV 박테리아 추출물과 함께 사전 배양한 경우, 이러한 모든 알레르겐-유발 반응을 강하고 현저하게 억제하기에 충분하여, DC를 이 모델에서 BV-유도된 천식 보호의 주요 표적으로 확인하였다.

두 번째 시리즈의 실험: 미생물총의 변화

실시예 13: 쥣과의 장내 마이크로바이옴에 대한 비강 내 또는 기관 내 BV 박테리아 추출물의 효과.

이 실험에서는, BV 박테리아 추출물에 의해 직접 유도된 보호 효과가 입증되었다. 이러한 보호 효과는 시험된 마우스의 장내 미생물총의 변화를 통해 매개되었다. 천식 마우스 모델에서 BV 박테리아 추출물의 비강 내 및 기관 내 투여는, 장내 마이크로바이옴의 변화를 유도하는 것으로 나타났고, 알레르기 반응의 감소에 기여하는 것으로 여겨진다.

마우스에 BV 박테리아 추출물(2 일마다, 5, 50, 1000 또는 2500 마이크로그램/처리) 또는 PBS를 비강 내 처리하여 감작시키고, OVA 또는 PBS로 면역 반응을 유발하였다. 마이크로바이옴 분석을 위해 대변 샘플을 수집하였다.

PBS-단독 대조군과 비교하면, 베타 다양성 분석(비가중적 UniFrac)에서 나타난 바와 같이, OVA 또는 PBS 중 하나와 함께 1000 또는 2500 마이크로그램/처리의 BV 박테리아 추출물(즉, 임의의 고용량의 BV 박테리아 추출물) 을 받은 마우스에서 장내 미생물 군집 구조에서의 상당한 변화가 관찰되었다(도 16). 나아가, 락토바실러스는 임의의 고용량의 BV 박테리아 추출물 대 PBS-단독 처리된 마우스에서 상당히 풍부하였다.

이들 데이터는, BV 박테리아 추출물이 쥣과의 장내 미생물총에서 현저한 변화를 유도한다는 사실을 명백하게 보여주었다.

실시예 14: 고용량 및 저용량의 BV 박테리아 추출물을 비강 내 처리한 마우스의 장내 마이크로바이옴 특성에 대한 효과

마우스에 14회의 비강 내 용량(1 mg, 또는 2.25 mg)의 BV 박테리아 추출물을 투여하였다. OVA 감작은 0일차 및 15 일차에 실시하였고, OVA 면역 유발은 28 일차, 38 일차, 및 39 일차에 실시하였다. 대조군 마우스에는 OVA보다는 오히려 PBS를 투여하였다. 실험을 마칠 때(39 일차), 대변 펠렛을 모았다. PBS- 또는 OVA-면역 유발된 마우스에 BV1000 1 mg 용량, 또는 BV2250 = 2.25 mg 용량을 처리하였다. 장내 마이크로바이옴을 나타내는 대변 펠렛으로부터 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 Illumina MiSeq에서 16S rRNA 암플리콘(amplicon)의 시퀀싱을 하기 위해 Argonne National Laboratory로 보냈다. 서열 데이터를 QIIME2를 사용하여 분석하였고, R. 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe: Linear discriminant analysis effect size)를 실시하여, 다수의 분류학적 수준에서의 차등적 특징들을 밝혀냈다. 이 분석에서는 실험 100, 101, 및 113 내에서 q < 0.05의 컷오프와 2 미만의 LDA 점수를 사용하여 두 그룹의 샘플을 비교하였다: 임의의 BV(BV 치료 용량과 무관하게, BV/OVA 및 BV 단독) 및 BV 없음(OVA 단독 및 PBS 단독)(도 18). 차등적 특징들 간의 계통 발생학적 관계는, 또한 도 17에 특성화되어 있다(g, 속; f, 과; o, 목; c, 계).

이 데이터들은 비강 내 투여 BV 박테리아 추출물이 호산구 증가증 및 AHR로부터 보호할 수 있고, 또한 보호된 마우스에서 장내 마이크로바이옴의 유의한 재편성을 유발하며, 단쇄 지방산을 생산하고, 조절 면역/관용과 관련된 것으로 알려진 분류군(특히 락토바실러스, 도 18a 및 18b)을 증가시킨다는 것을 명백히 입증하였다. 또한, 이들 박테리아의 증가는 본 발명자들이 BV-처리되고, 천식-보호된 마우스에서 발견한 T 조절 세포의 유도에 기여한다고 여겨진다. 나아가, 16s rRNA 시퀀싱 실험으로부터 나온 결과들은 BV 박테리아 추출물의 비강 내 또는 기관 내 투여와 면역 조절 사이의 연관성을 명백히 입증하였다.

Claims (24)

1. 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종의 알칼리성 용해에 의해 얻어지며, 이를 필요로 하는 대상체에서 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명 관련 증상, 미생물총 관련 호흡기 장애를 치료하고/거나 예방하기 위한 방법에 사용되는 박테리아 추출물로서, 상기 박테리아 추출물은 이를 필요로 하는 상기 대상체에 치료 유효량으로 투여되는, 박테리아 추출물.
2. 제1항에 있어서, 상기 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종은 모락셀라 카타르할리스, 헤모필루스 인플루엔자, 크렙시엘라 뉴모니애, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 스트렙토코쿠스 파이로게네시스 및/또는 스트렙토코쿠스 상퀴니스 중에서 선택되는, 박테리아 추출물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 알칼리성 용해는 10 초과의 pH에서 수행되는, 박테리아 추출물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 경구 경로를 통해 상기 대상체에 투여되는, 박테리아 추출물.
5. 제4항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 고체 또는 액체 형태로 투여되는, 박테리아 추출물.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 알약, 정제, 필름 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 시럽, 분말 및/또는 침전으로서 제형화되는, 박테리아 추출물.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 비강 내 또는 기관 내 경로를 통해 상기 대상체에 투여되는, 박테리아 추출물.
8. 제7항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 1일 0.05 mg 내지 2 mg, 1일 0.1 mg 내지 1 mg, 1일 0.5 mg 내지 1 mg의 범위, 또는 1일 약 1 mg의 용량으로 상기 대상체에게 투여되는, 박테리아 추출물.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 고체, 액체 또는 에어로졸 제제의 형태로 투여되는, 박테리아 추출물.
10. 제9항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 액체 또는 에어로졸이고, 스프레이, 액적, 콜로이드, 미스트, 네뷸라 또는 분무된 증기로 제형화되는, 박테리아 추출물.
11. 제9항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 고체의 형태로 투여되고, 분말 또는 부서지는 정제로 제형화되는, 박테리아 추출물.
12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 비강 취입기 장치, 비강 내 흡입기, 비강 내 스프레이 장치, 아토마이저, 비강 스프레이 보틀, 단일 단위 용기, 펌프, 점적기, 스퀴즈 보틀, 네뷸라이저, 정량 흡입기(MDI), 가압 용량 흡입기, 취입기, 양-방향 장치, 투여 앰풀, 비강 패드, 비강 스폰지, 및 비강 캡슐을 포함하는 군으로부터 선택되는 전달 장치를 통해 투여되는, 박테리아 추출물.
13. 이를 필요로 하는 대상체에서 천식, 천식 악화, 알레르기성 천식 질환, 천명 관련 증상, 미생물총 관련 호흡기 장애를 치료하고/거나 예방하는 방법으로서, 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 치료 유효량의 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 박테리아 추출물은 알칼리성 용해에 의해 얻을 수 있는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아 종은 모락셀라 카타르할리스, 헤모필루스 인플루엔자, 크렙시엘라 뉴모니애, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 스트렙토코쿠스 파이로게네시스, 및/또는 스트렙토코쿠스 상퀴니스 중에서 선택되는, 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 알칼리성 용해는 10 초과의 pH에서 수행되는, 방법.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 경구 경로를 통해 상기 대상체에 투여되는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 고체의 형태 또는 액체 형태로 투여되는, 방법.
18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 알약, 정제, 필름 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 시럽, 분말 및/또는 침전(deposit)으로서 제형화되는, 방법.
19. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 비강 내 경로 또는 기관 내 경로를 통해 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 상기 대상체에게 1일 0.05 mg 내지 2 mg, 1일 0.1 mg 내지 1 mg, 1일 0.5 mg 내지 1 mg의 범위, 또는 1일 약 1 mg의 용량으로 투여되는, 방법.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 고체, 액체, 또는 에어로졸 제제의 형태로 투여되는, 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 액체 또는 에어로졸이고, 스프레이, 액적, 콜로이드, 미스트, 네뷸라 또는 분무된 증기로 제형화되는, 방법.
23. 제21항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 고체의 형태로 투여되고, 분말, 또는 부서지는 정제로 제형화되는, 방법.
24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 비강 취입기 장치, 비강 내 흡입기, 비강 내 스프레이 장치, 아토마이저, 비강 스프레이 보틀, 단일 단위 용기, 펌프, 점적기, 스퀴즈 보틀, 네뷸라이저, 정량 흡입기 (MDI), 가압 용량 흡입기, 취입기, 양-방향 장치, 투여 앰풀, 비강 패드, 비강 스폰지 및 비강 캡슐을 포함하는 군으로부터 선택되는 전달 장치를 통해 투여되는, 방법.

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