KR20210155257A

KR20210155257A - 염 처리를 통해 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR20210155257A
Application number: KR1020200072553A
Authority: KR
Inventors: 조병훈; 임균택
Original assignee: 경상국립대학교산학협력단
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2021-12-22
Also published as: KR102420704B1; WO2021256674A1

Abstract

본 발명은 염 처리를 통해 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 고정화 효소를 사용하는 생물공정, 식품, 제약, 바이오 관련 산업 등에서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

염 처리를 통해 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법{Method for increasing stability of target protein immobilized in silica nanoparticle by salt treatment}

본 발명은 염 처리를 통해 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

효소는 생체 촉매로서 기존의 화학 촉매에 비해서 환경 친화적이고 기질 특이성이 뛰어난 장점을 가지고 있다. 그러나 주변 환경에 매우 민감하게 반응하여 활성이 변하고 재활용이 어려우며, 반응 생성물로부터 분리·정제하는 것이 어려워 산업적으로 사용하는데 한계가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 다양한 연구가 이루어져 왔는데, 그 중 가장 활발히 연구된 것이 효소를 고정화하는 방법이다. 고정화 효소(immobilized enzyme)는 장기간 활성을 유지할 수 있고 반복 사용이 가능할 뿐만 아니라 생성물과 효소의 분리가 용이하여 산업현장에서 유용하게 활용할 수 있으므로 기존 효소의 단점을 극복할 수 있다. 또한, 유기용매에서의 반응과 고온 반응 등에서 효소의 안정성을 증대시킬 수 있어서 다양한 반응 시스템 개발이 가능하다. 에너지 소비 측면에서도 효소를 이용한 생물학적 공정은 온화한 조건에서 수행되어 에너지 소비가 절감되며, 효소의 기질 특이성에 의한 부산물 억제로 생산물의 품질 향상을 이룰 수 있다. 그리고 환경적인 측면에서도 공해물질의 발생을 억제할 수 있는 장점이 있다.

효소 고정화 방법은 결합 방법에 따라 이온교환법, 공유결합법, 가교법 등의 화학적 방법과 흡착법, 포괄법, 미세캡슐화법, 막(membrane) 이용법 등의 물리적 방법으로 구분될 수 있다. 다양한 효소 고정화 방법 중에서 졸-겔 공정(sol-gel process)에 의해 효소를 졸-겔 구조 안에 고정화시키고 이들을 고정화 효소로서 활용하는 연구가 많이 진행되고 있다. 이 방법은 효소가 존재하는 상태에서 이 주위로 졸-겔의 무기 지지체 연결 구조가 형성되고, 효소는 기공안에 존재하기 때문에 효소가 엉키거나 변형되는 것을 보호할 수 있으며 효소 고정화에서 가장 큰 문제인 분출되는 형상을 줄일 수 있다는 장점이 있다. 또한 졸-겔 공정에 의해서 형성되는 실리카 구조는 화학적으로 안정하고 친수성이며, 합성 시 비용이 적게 들고 유기 폴리머 등에 의해 고정화된 효소와 비교하여 기계적 강도와 열 안정성이 우수하고 세균으로부터 보호되는 장점이 있다. 하지만, 졸-겔 물질이 제조될 때 적용되는 가혹한 합성 조건과 시약으로 인하여 효소가 변하는 형상이 발생되기 쉽다는 단점도 존재한다. 최근에는 바비오실리카 형성에 관여하는 생물 유래 유기 분자들(단백질, 펩타이드 등)을 발굴하고 이를 활용하여 생체 모방 실리카를 생산·적용하는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있다. 생체 모방 실리카 합성법을 통해 상온·중성 pH 하에서 응집된 실리카 분말을 형성할 수 있으며 동시에 효소 고정화가 가능하다. 기존 졸-겔 공정을 통해 이러한 실리카 분말을 얻기 위해서는 겔 형성 이후 추가적인 고온 공정이 필요하며 시간이 오래 걸리는 단점을 지닌다. 또한 실리카 파우더 외부에 효소를 고정화하는 것만 가능하며, 내부에 효소를 고정화·담지하는 것은 불가능하다.

한편, 한국등록특허 제0837375호에는 양이온성 계면활성제인 벤조알코늄 클로라이드(benzoalkonium chloride), 미리스탈코늄클로라이드(miristalkonium chloride), 세틸피리디늄 클로라이드(Cetylpyridinium chloride), 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(cetyltrimethyl ammonium bromide) 또는 세틸트리메틸 암모늄 클로라이드(cetyltrimethyl ammonium chloride)를 이용한 '효소가 고정화된 실리카의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 알칼리 금속 클로라이드(Alkali metal chloride) 또는 나트륨 염(Sodium salts) 처리를 통해 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 소 유래 탄산무수화효소(bovine carbonic anhydrase, bCA) 코딩 유전자 또는 형광 단백질 DsRed(red fluorescent protein) 코딩 유전자;와 생체 모방 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide) R5 코딩 서열이 순차적으로 연결된 융합 단백질의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터로 대장균 균주를 형질전환하여 융합 단백질 bCA-R5 또는 DsRed-R5를 발현시키고, 상기 융합 단백질이 고정화된 실리카 합성을 위해, 융합단백질, 다양한 종류의 염(CsCl, LiCl, NaCl, KCl, RbCl, NaF, NaBr, NaI 또는 NaNO₃) 및 가수분해된 실리카 전구체(TMOS)를 혼합하여 bCA 또는 DsRed 단백질이 고정화된 실리카 나노입자를 제조하였다. 상기 융합 단백질 bCA-R5 또는 DsRed-R5가 고정화된 실리카 나노입자에 고온(60℃)을 처리한 결과, 단백질이 고정화된 실리카 합성 과정에서 염이 처리되지 않은 조건에 비해 염이 처리된 조건에서 합성된 실리카에 고정화되어 있는 bCA 또는 DsRed 단백질의 잔여 활성(residual activity)이 증가된 것을 확인하였고, 특히 염화세슘(CsCl)을 0.1M의 농도로 처리한 조건이 고정화 bCA 또는 DsRed 단백질의 열 안정성을 향상시킬 수 있는 최적의 염 처리 조건임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide)의 융합 단백질, 염 및 실리카 전구체를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 목적 단백질 코딩 유전자 및 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide) 코딩 서열이 순차적으로 연결된 융합 단백질의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드 R5의 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 융합 단백질에 염 및 실리카 전구체를 혼합하는 단계;를 포함하는, 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 염화세슘(CsCl)을 유효성분으로 함유하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 목적 단백질이 고정화된 실리카 합성 과정에서 염을 처리함에 따라 실리카에 고정화된 목적 단백질의 열 안정성을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 방법은 고정화 효소를 사용하는 생물공정, 식품, 제약, 바이오 관련 산업 등에서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 소 유래 탄산무수화효소(bCA)와 실리카 형성 펩타이드 R5가 결합된 융합 단백질 bCA-R5(A), 및 red 형광 단백질인 DsRed와 실리카 형성 펩타이드 R5가 결합된 융합 단백질 DsRed-R5(B)의 발현 경향을 확인한 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 겔 사진이다. (A); 형질전환된 세포에 1 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 단백질 발현을 유도한 결과, (B); 형질전환된 세포에 0.1 mM IPTG를 첨가하여 25℃에서 단백질 발현을 유도한 결과, S; 수용성(soluble) 분획, IS; 불용성(insoluble) 분획, 화살표; 재조합 단백질.
도 2는 융합 단백질 bCA-R5의 고정화 과정에서 처리된 염(LiCl, NaCl, KCl, RbCl, CsCl, NaF, NaBr, NaI 또는 NaNO₃)의 종류에 따른 실리카 합성량을 확인한 결과이다. 통계 분석은 t-test를 이용하였으며, bar graph 바로 위의 asterisk(*)는 염 첨가하지 않은 대조군 대비 비교 결과이다(^* p<0.05, ^** p<0.01). CsCl: 염화세슘(Cesium chloride), LiCl: 염화리튬(Lithium chloride), NaCl: 염화나트륨(Sodium chloride), KCl: 염화칼륨(Potassium chloride), RbCl: 염화루비듐(Rubidium chloride), NaF: 플루오린화나트륨(Sodium fluoride), NaBr: 브로민화나트륨(Sodium bromide), NaI: 아이오딘화나트륨(Sodium iodide), NaNO₃: 질산나트륨(Sodium nitrate).
도 3은 융합 단백질 bCA-R5 고정화 과정에서 염(CsCl)이 처리되지 않은 조건에서 합성된 bCA-R5@silica 입자와 염이 처리된 조건에서 합성된 bCA-R5@silica(0.1 M CsCl) 입자를 주자전자현미경(SEM)으로 관찰한 사진이다.
도 4는 융합 단백질 bCA-R5의 고정화 시 염 처리에 따른 고정화 bCA 효소의 열(60℃, 48시간) 안정성을 확인한 결과로, A는 Chloride salt(LiCl, NaCl, KCl, RbCl, CsCl)를 처리한 후 고정화 bCA의 잔여 활성(residual activity)을 측정한 결과이고, B는 Sodium salt(NaF, NaCl, NaBr, NaI 또는 NaNO₃)를 처리한 후 고정화 bCA의 잔여 활성을 측정한 결과이며, C는 고정화 bCA 효소의 잔여 활성이 가장 우수하였던 CsCl의 최적 농도를 확인하기 위해 다양한 농도(0.01 M, 0.1 M, 0.5 M 및 1 M)를 처리한 후 고정화 bCA 효소의 잔여 활성을 측정한 결과이다. 통계 분석은 t-test를 이용하였으며, bar graph 바로 위의 asterisk(*)는 염 첨가하지 않은 대조군 대비 비교 결과이다(^* p<0.05, ^** p<0.01, ^*** p<0.001).
도 5는 융합 단백질 bCA-R5, 융합 단백질 bCA-R5의 고정화 시 염이 처리되지 않은 조건에서 합성된 bCA-R5@silica, 및 염이 처리된 조건에서 합성된 bCA-R5@silica(0.1 M CsCl)를 고온(60℃)에서 반응시킨 후 고정화 bCA 효소의 잔여 활성(A) 및 반감기(B)를 측정한 결과이다.
도 6은 융합 단백질 bCA-R5의 투석 버퍼의 pH 조건에 따라 bCA-R5@silica 및 bCA-R5@silica(salt)에 고정화된 bCA 효소의 반감기 증가 배수(fold change in half life)를 보여주는 결과이다.
도 7은 융합 단백질 DsRed-R5의 고정화 시 염 처리에 따른 고정화 DsRed 단백질의 열(60℃, 24시간) 안정성을 확인한 결과로, 다양한 농도(0.1 M, 0.5 M 또는 1 M)의 CsCl를 처리하여 합성된 DsRed-R5@silica를 고온(60℃, 24시간)에서 반응시킨 후 고정화 DsRed 단백질의 형광 세기를 측정한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide)의 융합 단백질, 염 및 실리카 전구체를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "목적 단백질(target protein)"은 실리카 나노입자에 고정하고자 하는 단백질을 의미한다.

상기 목적 단백질은 의료, 연구용 및 산업용 단백질, 예를 들어, 효소, 형광 단백질, 항원, 항체, 세포수용체, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질일 수 있고, 바람직하게는 효소 단백질 또는 형광 단백질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase) 또는 DsRed(red fluorescent protein)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 탄산무수화효소는 바람직하게는 소 유래 탄산무수화효소(bovine carbonic anhydrase, bCA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 소 유래 탄산무수화효소 및 DsRed는 각각 서열번호 1 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 소 유래 탄산무수화효소 및 DsRed를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 2 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 실리카 형성 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 실리카 형성 펩타이드 R5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 실리카 형성 펩타이드 R5는 돌말류에서 발견된 라이신, 아르기닌 및 세린이 포함된 19개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드로, 폴리아민과 함께 실리카 형성을 위한 주형 및 촉매제로 작용한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 염은 알칼리 금속염(alkali metallic salt)일 수 있고, 바람직하게는 염화세슘(Cesium chloride, CsCl), 염화리튬(Lithium chloride, LiCl), 염화나트륨(Sodium chloride, NaCl), 염화칼륨(Potassium chloride, KCl), 염화루비듐(Rubidium chloride, RbCl), 플루오린화나트륨(Sodium fluoride, NaF), 브로민화나트륨(Sodium bromide, NaBr), 아이오딘화나트륨(Sodium iodide, NaI) 또는 질산나트륨(Sodium nitrate, NaNO₃)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 염화세슘일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

특히, 실리카에 단백질을 고정화할 시 염화세슘을 0.05~1 M의 최종농도로, 더욱 바람직하게는 염화세슘을 0.1M의 최종농도로 처리할 경우 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 효과가 우수하다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 실리카 전구체는 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS) 또는 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS)일 수 있고, 바람직하게는 TMOS일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

목적 단백질 코딩 유전자 및 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide) 코딩 서열이 순차적으로 연결된 융합 단백질의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;

상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드 R5의 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및

상기 수득한 융합 단백질에 염 및 실리카 전구체를 혼합하는 단계;를 포함하는, 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 목적 단백질인 소 유래 탄산무수화효소 코딩 유전자 및 실리카 형성 펩타이드 R5 코딩 서열이 순차적으로 연결되거나, 목적 단백질인 DsRed 코딩 유전자 및 실리카 형성 펩타이드 R5 코딩 서열이 순차적으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않고, 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질 코딩 유전자와 실리카 형성 펩타이드 R5 코딩 서열을 순차적으로 연결하여 구축될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 소 유래 탄산무수화 효소, DeRed 단백질, 염 및 실리카 전구체는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 염은 염화세슘(CsCl)일 수 있으며, 상기 염은 최종농도가 0.05~1M, 바람직하게는 0.1M이 되도록 혼합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 실리카 형성 펩타이드 R5는 상온 및 중성 pH에서 분말 형태의 실리카 나노입자를 형성하기 위해 사용한 것으로, 기존 화학적 실리카 합성법에서 분말 형태의 실리카 나노입자를 형성할 때 장시간 고온(약 600℃)에서 열처리하는 과정을 수행하지 않아도 되고, 실리카가 아주 느린 속도로 겔(gel) 형태로만 형성되거나 중성 pH 부근에서 겔이 형성되지 않는 점을 개선시킬 수 있다. 또한, 실리카 형성 펩타이드 R5를 이용한 단백질 고정화는 실리카 합성과 동시에 단백질을 내부에 가둬두는 캡슐화(encapsulation)를 통한 고정화가 일어나므로, 단백질 고정화 시 염을 처리할 경우 첨가된 염은 실리카 내부에서 실리카와 효소 간의 안정화를 증진시키는 역할을 한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 암피실린, 테트라사이클린 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 원핵 세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli BL21, E. coli JM109, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 숙주세포는 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 기술을 이용하여 목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드 R5의 융합 단백질의 발현에 적합한 배지에서 이루어질 수 있다. 적합한 배양 배지는 상업적으로 입수하시거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 제조방법은, 목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드 R5의 융합 단백질이 발현된 숙주세포로부터 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 방법은 예를 들어 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 분리된 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 투석, 전기영동, 분별 용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

또한, 본 발명은 염화세슘(CsCl)을 유효성분으로 함유하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 목적 단백질은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 균주 배양

유전자 재조합 벡터 제작을 위해서는 Escherichia coli TOP10 균주를, 단백질 발현을 위해서는 E. coli BL21(DE3) 균주를 사용하였다. 대장균은 LB(Luria-Bertani) 배지에서 37℃, 180 rpm 조건하에 배양되었으며 필요에 따라 50 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)이 첨가되었다.

2. 목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드 R5가 결합된 융합 단백질 클로닝

모델 효소로서 소 유래 탄산무수화효소(bovine carbonic anhydrase, bCA)와 red 형광 단백질인 monomeric DsRed를 선정하였다. bCA 코딩 유전자는 화학적으로 합성하였고 DsRed는 pDsRed-Monomer-N1으로부터 얻었으며, 상기 유전자들은 표 1의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 각 유전자의 PCR 산물은 우선 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝되었고, 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다. 이들 유전자를 pET-22b(+) 벡터에 NdeI 및 HindⅢ 제한효소를 이용하여 각각 클로닝하여 pET-bCA와 pET-DsRed를 제작하였다. 그리고, 실리카 형성 펩타이드 R5 코딩 서열이 융합된 플라스미드를 제작하기 위해 상기 pET-bCA 및 pET-DsRed를 각각 HindⅢ와 XhoI으로 절단한 후 이 사이에 표 1의 R5 프라이머를 결합한 유전자 조각을 삽입하여 pET-bCA-R5와 pET-DsRed-R5를 제작하였다. 재조합 단백질 발현 시 서열의 C-말단에는 pET-22b(+) 벡터로부터 제공되는 헥사 히스티딘 태그(Hexa histidine-tag)가 융합되어 발현된다.

목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드 R5의 융합 단백질 클로닝을 위한 프라이머 정보

프라이머 명칭	프라이머 서열(5'→3') (서열번호)
bCA	F: CATATGAGCCACCACTG (6)
	R: AAGCTTCTTCGGGAAGCC (7)
DsRed	F: CATATGGACAACACCGAGGACG (8)
	R: AAGCTTCTGGGAGCCGGAGT (9)
R5	F: AGCTTAGCAGCAAAAAATCTGGCTCCTATTCAGGCTCGAAAGGTTCTAAACGTCGCATTCTGC (10)
	R: TCGAGCAGAATGCGACGTTTAGAACCTTTCGAGCCTGAATAGGAGCCAGATTTTTTGCTGCTA (11)

밑줄 : 제한효소 서열

3. 단백질 발현 및 세포 분획

상기 제작된 재조합 벡터 pET-bCA-R5 또는 pET-DsRed-R5를 E. coli BL21(DE3) 균주에 도입하여 이들을 37℃, 180 rpm에서 배양하였다. 세포 농도가 OD₆₀₀에서 0.6~0.8에 도달했을 때 0.1 mM(DeRed의 경우) 또는 1 mM(bCA의 경우) IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 후 25℃(DeRed의 경우) 또는 37℃(bCA의 경우)에서 각각 20시간 또는 10시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 세포를 4℃, 4,000xg 조건으로 10분간 원심분리하여 세포를 회수하였고, 용해버퍼(lysis buffer; 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)를 사용하여 세포를 재현탁시켰다. 상기 현탁된 세포들은 차가운 상태에서 초음파 처리(ultrasonication)를 통해 파쇄하였고, 파쇄액을 4℃, 10,000 xg 조건으로 10분간 원심분리하였다. 이후 상등액은 수용성 분획물(soluble fraction, S)로 명명하였고, 펠렛은 동일한 부피의 용해 버퍼로 재현탁시켜 불용성 분획물(insoluble fraction, IS)로 명명하였다. 각각의 세포 분획물은 이후 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 쿠마씨 블루(coomassie blue) 염색을 통해 재조합 단백질의 발현 양상을 분석하였다.

4. 단백질 정제

재조합 벡터 pET-bCA-R5 및 pET-DsRed-R5로부터 발현된 융합 단백질 bCA-R5 및 DsRed-R5의 정제를 위해 파쇄액의 수용성 분획물에 니켈-니트릴로트리아세트산 아가로스 비즈(Ni²⁺-nitrilotriacetic acid agarose beads)를 첨가하여 단백질을 결합시킨 후 세척 버퍼(wash buffer; 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole, pH 8.0)를 이용하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하였다. 그 다음으로, 용출 버퍼(elution buffer; 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)를 이용하여 정제된 단백질을 수득하였고, 정제된 융합 단백질 bCA-R5 및 DsRed-R5를 각각 pH 7.5의 20 mM sodium phosphate buffer 및 pH 5.5의 20 mM sodium phosphate buffer로 투석시켜 버퍼를 교환하였다.

5. 단백질 정량

투석을 마친 융합 단백질 bCA-R5 및 DsRed-R5를 변성 버퍼(denaturing buffer; 6 M guanidine hydrochloride GuHCl/20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5)와 섞어 100℃에서 10분간 가열하여 변성시킨 후 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도와 단백질 아미노산 서열을 통해 계산된 280 nm에서의 흡광 계수를 통해 단백질의 농도를 확인하였다. 흡광 계수 계산은 ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)을 이용하여 수행되었다.

6. 생체 모방 실리카를 이용한 효소 고정화

융합 단백질 bCA-R5 또는 DsRed-R5이 고정화된 실리카 합성을 위해 단백질 용액 700 ㎕, 염 200 ㎕, TMOS(acid-hydrolyzed 1 M tetramethyl orthosilicate) 100 ㎕(7:2:1의 부피 비율)를 섞어 1시간 동안 반응시켰다. 실리카 합성 시 첨가된 염은 염화세슘(CsCl), 염화리튬(LiCl), 염화나트륨(NaCl), 염화칼륨(KCl), 염화루비듐(RbCl), 플루오린화나트륨(NaF), 브로민화나트륨(NaBr), 아이오딘화나트륨(NaI) 또는 질산나트륨(NaNO₃)은 모두 증류수에 녹였으며, 실리카 형성 시 염의 최종 농도가 0.1 M이 되도록 하였다. 염이 첨가되지 않은 샘플을 제조할 경우 증류수를 같은 비율로 첨가하였고, 1 M TMOS는 실리카 합성 전에 1 mM HCl을 이용하여 20분 동안 미리 가수분해시켰다. 융합 단백질이 고정화된 실리카는 각각 bCA-R5@silica 및 DsRed-R5@silica로 명명하였고, 고정화 시 염이 처리된 실리카는 각각 bCA-R5@silica(salt) 및 DsRed-R5@silica(salt)로 명명하였다. 합성된 실리카는 증류수로 2회 세척한 후 20 mM sodium phosphate buffer(pH 7.5)에 재현탁되었다.

7. 실리카 정량 분석

융합 단백질 bCA-R5 고정화 시 형성된 실리카의 양은 β-silicomolybdate assay를 통해 측정되었다. bCA-R5@silica 및 bCA-R5@silica(salt)를 증류수로 2번 세척한 후 다시 1 ㎖의 증류수에 재현탁하였고, 이 중 100 ㎖의 샘플을 취하여 0.5 M NaOH 900 ㎖와 섞어 1시간 동안 녹였다. 상기 녹인 샘플 40 ㎖, 증류수 160 ㎖, molybdate 용액 800 ㎖를 섞어 96웰 플레이트에 분주한 후 plate reader의 370 nm에서 흡광도를 측정하였다. Molybdate 용액의 제조방법은 다음과 같다: 1.35 ㎖의 HCl(37%)을 증류수에 희석하여 40.3 ㎖로 만들고, 774.2 mg의 AHT(ammonium heptamolybdate tetrahydrate)를 증류수에 녹여 9.7 ㎖의 용액을 만든 후 두 용액을 섞고 NaOH를 이용해 pH를 1.12로 맞췄다. 정량분석에 있어 calibration curve는 0.5 M NaOH에 녹아있는 실리콘 표준 용액(silicon standard solution)으로 수행되었다.

8. 단백질 활성 및 안정성 측정

실리카에 고정화된 bCA 활성은 CO₂ hydration assay를 이용하여 측정하였다. 차갑게 유지된 20 mM Tris buffer(100 μM phenol red, pH 8.3) 600 ㎕와 10 ㎕의 bCA 샘플과 섞어 1회용 큐벳에 넣은 뒤 4℃로 맞춰진 분광기에 넣어두었다. 차갑게 유지된 CO₂ 포화 용액 400 ㎕를 재빠르게 첨가하고 섞은 후 570 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. pH 7.5에 해당하는 흡광도인 1.1에서 pH 6.5에 해당하는 흡광도인 0.2까지 흡광도가 떨어지는 데 걸리는 시간(t)을 구하였다. 또한, bCA 샘플 대신에 투석 버퍼(dialysis buffer)를 이용하여 자연적인 CO₂ 수화(hydration) 반응에 의해 걸리는 시간(t0; blank)을 구하였으며, 효소 활성은 (t0-t)/t를 이용하여 계산하였다. 또한, 실리카에 고정화된 DsRed 활성은 형광세기 측정을 통해 확인하였다. DsRed-R5@silica 및 DsRed-R5@silica(salt) 샘플을 1/80로 희석하고 plate reader 상에서 excitation=550 nm, emission=590 nm으로 형광을 측정하였다. 열 안정성 측정을 위하여 각 샘플을 60℃에서 가열한 후 활성을 측정하였고, 이를 열 처리하지 않은 샘플의 활성과 비교하여 상대 활성을 나타내었다. 또한 시간에 따른 활성 감소 데이터를 이용하여 반감기를 계산하였다.

9. 단백질 고정화 시 pH 조건에 따른 염 처리 효과

융합 단백질 bCA-R5를 pH 5.5, 6.5, 7.5 또는 8.0의 버퍼(20 mM sodium phosphate)에서 투석함으로써, 단백질 고정화 과정에서 pH 조건에 따른 염 처리 효과를 비교하였다. 염은 염화세슘(CsCl)을 사용하였으며 최종 농도가 0.1M이 되도록 하였다. 각 pH 조건에서 합성된 실리카는 증류수로 2번 세척한 후 동일하게 pH 7.5 버퍼(20 mM sodium phosphate)에 재현탁하였고, 상기와 같은 방법으로 안정성을 측정하고 반감기를 계산하였다.

10. 실리카의 형태 분석

bCA-R5@silica 및 bCA-R5@silica(salt)를 증류수로 2회 세척하고 60℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 건조된 실리카 샘플은 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)을 통해 관찰되었다.

11. 단백질 구조 모델링 및 표면 전하 계산

단백질 구조 모델링을 위해 bCA는 PDB ID: 1V9E를, DsRed는 PDB ID: 2VAD를 이용하였으며 UCSF chimera 프로그램을 사용하여 시각화하였다. 그리고, 단백질 전체 표면적에 대한 charged 아미노산의 비율은 dssp 알고리즘 (https://www3.cmbi.umcn.nl/xssp/)에 적용하여 계산하였다. 단백질의 등전점 (isoelectric point)은 Compute pI/Mw(https://web.expas y.org/compute_pi/)를 이용하여 아미노산 서열로부터 계산되었다.

실시예 1. 융합 단백질 bCA-R5 및 DsRed-R5의 발현

소 유래 탄산무수화효소(bCA)와 실리카 형성 펩타이드 R5가 결합된 융합 단백질 bCA-R5를 37℃에서 1 mM IPTG 첨가를 통해 발현을 유도한 결과, 수용성 분획에서 과발현된 것을 확인하였다. 또한, red 형광 단백질인 DsRed와 실리카 형성 펩타이드 R5가 결합된 DsRed-R5를 25℃에서 0.1 mM IPTG 첨가를 통해 발현을 유도한 결과, bCA-R5와 마찬가지로 수용성 분획에서 과발현된 것을 확인하였다(도 1).

실시예 2. 융합 단백질 bCA-R5 및 DsRed-R5의 실리카 고정화

융합 단백질 bCA-R5(pI=6.5) 또는 DsRed-R5(pI=5.4)의 고정화는 각각의 등전점보다 높거나 비슷한 pH(각각 pH 7.5 및 pH 5.5) 조건에서 진행되었다. 그 결과, 실리카가 형성됨과 동시에 융합 단백질이 성공적으로 고정화되었고, 단백질 고정화 과정에서 0.1 M의 CsCl을 첨가한 경우에도 융합 단백질이 성공적으로 고정화되었음을 확인하였다.

실시예 3. 실리카 정량 및 SEM 분석

융합 단백질 bCA-R5 고정화 시 형성된 실리카는 β-silicomolybdate assay를 통해 분석하였다. 그 결과, 염이 처리되지 않은 조건에서 고정화가 이루어진 경우 2.75(±0.1) g/L의 실리카가 형성되었고, 염을 처리한 조건에서는 3.06~3.4 g/L의 실리카가 형성되었으며, 특히 다양한 염 중에서 CsCl을 처리했을 때 실리카가 3.4 g/L의 가장 높은 농도로 형성되었음을 확인하였다(도 2). 즉, 염을 처리하지 않은 조건에 비해 염을 처리한 조건에서 형성된 실리카의 농도가 약 10% 이상 증가하였으므로, 단백질 고정화 과정에서 염을 처리할 경우 실리카 합성량을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 합성된 실리카의 형태를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과, bCA-R5@silica(0.1 M CsCl) 입자는 bCA-R5@silica 입자에 비해 큰 구형의 입자를 형성하였고(도 3), 이를 통해 생체모방 실리카 고정화에서 염의 첨가는 실리카 입자 성장에 긍정적인 역할을 수행하고 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. bCA 효소 고정화 시 염 처리에 따른 열 안정성 분석

염 처리를 통해 고정화된 bCA의 열 안정성을 분석하기 위해, bCA-R5@silica와 bCA-R5@silica(salt)를 60℃에서 48시간 동안 가열한 후 고정화된 bCA 효소의 잔여 활성을 측정하였다.

우선, 다양한 chloride salt를 처리한 결과, 염이 처리되지 않은 조건에서 합성된 bCA-R5@silica 보다 염이 처리된 조건에서 합성된 bCA-R5@silica(LiCl, NaCl, KCl, RbCl 또는 CsCl)에서 잔여 활성이 증가하였으며, LiCl=NaCl<KCl<RbCl<CsCl 순으로 높은 잔여 활성을 보였다(도 4A). 또한, 다양한 sodium salt(NaF, NaCl, NaBr, NaI 또는 NaNO₃)를 처리한 경우에는 모든 실험군에서 유사한 수준으로 잔여 활성을 보였다(도 4B). 따라서 염에 의한 효소 안정화 효과는 양이온에 의존적인 것으로 보이며, Hofmeister series에 따라 수화가 잘 되지 않는 양이온일수록 안정화 효과가 큰 것으로 나타났다.

또한, 고정화 bCA 효소의 잔여 활성 증가에 가장 효과적이었던 CsCl의 최적 처리 농도를 선별하기 위해 다양한 농도(0.01 M, 0.1 M, 0.5 M 또는 1 M)로 테스트한 결과, 가열 후 고정화 bCA 효소의 잔여 활성이 CsCl 무처리 대조군에 비해 CsCl 처리군에서 증가한 것을 확인하였고, 특히 0.01 M의 CsCl 처리군에 비해 0.1 M, 0.5 M 또는 1 M의 CsCl 처리군에서 잔여 활성이 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 4C). 0.1 M, 0.5 M 또는 1 M의 CsCl 처리군은 서로 유사한 수준으로 높은 잔여 활성을 나타내었으므로, CsCl을 0.1 M의 농도로 처리하는 것이 가장 적절할 것으로 사료되었다.

그리고, 최적 농도인 0.1 M의 CsCl 존재 하에 bCA-R5를 고정화시킨 후 60℃에서 고정화된 bCA 효소의 잔여 활성 및 반감기를 측정한 결과, bCA-R5(비고정화) 및 bCA-R5@silica 보다 bCA-R5@silica(0.1 M CsCl)에 고정화된 bCA 효소의 잔여 활성이 장시간 유지되고 있음을 확인하였다(도 5A). 또한 고정화된 bCA 효소의 반감기는 bCA-R5(비고정화)에 비해 bCA-R5@silica에서 약 280배, bCA-R5@silica(0.1 M CsCl)에서 약 5,600배 증가한 것을 확인하였고, 특히 염이 처리되지 않은 bCA-R5@silica에 비해 염이 처리된 bCA-R5@silica(0.1 M CsCl)에서 고정화된 bCA의 반감기가 약 20배 증가된 것을 확인하였다(도 5B).

실시예 5. bCA 효소 고정화 시 pH 조건에 따른 염 처리 효과

bCA 효소의 실리카 고정화 과정에서 실리카와 상호작용할 수 있는 효소 표면의 특성이 중요할 것이라 예상되어, 융합 단백질 bCA-R5의 투석 버퍼 pH를 조정하여 서로 다른 표면 전하를 가지도록 하였다. 그리고 8.5 이상의 pH 조건에서는 실리카가 합성되지 않았기 때문에 pH 조정 범위는 5.5~8.0으로 설정하였고, 각 pH 조건에서 합성된 bCA-R5@silica 및 bCA-R5@silica(0.1 M CsCl)를 60℃에서 반응시킨 후 반감기를 측정함으로서 고정화된 bCA 효소의 열 안정성을 분석하였다.

그 결과, pH 5.5에 비해 pH 6.5, pH 7.5 및 pH 8.0 조건에서 고정화를 진행한 bCA-R5@silica(0.1 M CsCl) 반감기가 대체로 높은 수준을 나타내었다. 또한 pH 5.5 조건에서 염을 첨가하지 않은 대조군에 비해 CsCl 첨가 후 반감기 증가 폭이 약 1.3배로 가장 낮은 안정성 증가를 보인 반면, pH 8.0 조건에서는 반감기 증가 폭이 약 32배로 가장 높은 안정성 증가를 보였다(도 6). 따라서, bCA-R5@silica 대비 bCA-R5@silica(salt)의 높은 안정성 증가를 위해서는 고정화 시 효소의 표면 전하가 상대적으로 (-) 전하를 띠는 조건이 최적인 것으로 사료되었다.

실시예 6. DsRed 단백질 고정화 시 염 처리에 따른 열 안정성 분석

염 처리를 통해 고정화된 DsRed 단백질의 열 안정성을 분석하기 위해, DsRed-R5@silica와 DsRed-R5@silica(salt)를 60℃에서 24시간 동안 가열한 후 고정화된 DsRed 단백질의 형광 세기를 측정하였다.

그 결과, DsRed-R5@silica에 비해 DsRed-R5@silica(0.1M CsCl)에 고정화된 DsRed 단백질의 잔여 형광이 더 높았으며, 이를 통해 염 처리는 bCA-R5뿐만 아니라 고정화된 DsRed-R5의 안정성 향상에도 효과적임을 확인하였다. 상기 bCA-R5 결과(도 5C)와는 다르게 단백질 고정화 과정에서 처리된 CsCl의 농도에 비례하여 고정화된 DsRed 단백질의 잔여 형광 세기가 증가한 것을 확인하였다(도 7).

이러한 결과는 bCA와 DsRed의 염(salt) 요구량 차이에 의한 것으로 보이며, 효소의 표면에 존재하는 음전하 아미노산의 비율에 의해 달라지는 것으로 사료되었다. 많은 음전하 아미노산을 지닐수록 고정화 시 안정화를 위해 높은 농도의 염이 필요한 것으로 판단된다. 즉, bCA의 표면은 산성 아미노산(acidic amino acid)이 20.7%를 차지하고 있는 반면, DsRed의 표면은 산성 아미노산이 26.9%를 차지하고 있다. 따라서, 단백질 표면의 산성 아미노산의 비율이 높을 수록 안정화를 위해 더 높은 농도의 염이 필요할 것으로 사료되었다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for increasing stability of target protein immobilized in silica nanoparticle by salt treatment <130> PN20105 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 260 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 1 Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp 1 5 10 15 His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Asn Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp 20 25 30 Ile Asp Thr Lys Ala Val Val Gln Asp Pro Ala Leu Lys Pro Leu Ala 35 40 45 Leu Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ser Arg Arg Met Val Asn Asn Gly His 50 55 60 Ser Phe Asn Val Glu Tyr Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys 65 70 75 80 Asp Gly Pro Leu Thr Gly Thr Tyr Arg Leu Val Gln Phe His Phe His 85 90 95 Trp Gly Ser Ser Asp Asp Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Arg Lys 100 105 110 Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly 115 120 125 Asp Phe Gly Thr Ala Ala Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Val Gly 130 135 140 Val Phe Leu Lys Val Gly Asp Ala Asn Pro Ala Leu Gln Lys Val Leu 145 150 155 160 Asp Ala Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Thr Asp Phe Pro 165 170 175 Asn Phe Asp Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asn Val Leu Asp Tyr Trp Thr 180 185 190 Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Ser Val Thr Trp 195 200 205 Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Gln Gln Met Leu Lys 210 215 220 Phe Arg Thr Leu Asn Phe Asn Ala Glu Gly Glu Pro Glu Leu Leu Met 225 230 235 240 Leu Ala Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Val Arg 245 250 255 Gly Phe Pro Lys 260 <210> 2 <211> 780 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 atgagccacc actggggtta cggcaaacac aacggtccgg aacactggca caaggacttt 60 ccgattgcga acggtgaacg tcagagcccg gtggacattg ataccaaagc ggtggttcaa 120 gatccggcgc tgaagccgct ggcgctggtt tatggtgaag cgaccagccg tcgtatggtg 180 aacaacggcc acagctttaa cgttgagtac gacgatagcc aggacaaagc ggtgctgaag 240 gatggtccgc tgaccggcac ctatcgtctg gttcagttcc actttcactg gggtagcagc 300 gacgatcaag gcagcgaaca caccgtggac cgtaagaaat acgcggcgga gctgcacctg 360 gttcactgga acaccaaata tggtgatttt ggcaccgcgg cgcagcaacc ggatggtctg 420 gcggtggttg gcgtgtttct gaaagttggt gacgcgaacc cggcgctgca aaaggtgctg 480 gacgcgctgg atagcatcaa gaccaaaggc aagagcaccg acttcccgaa ctttgatccg 540 ggcagcctgc tgccgaacgt tctggattac tggacctatc cgggcagcct gaccaccccg 600 ccgctgctgg aaagcgtgac ctggatcgtt ctgaaagagc cgattagcgt gagcagccag 660 caaatgctga agttccgtac cctgaacttt aacgcggagg gtgaaccgga gctgctgatg 720 ctggcgaact ggcgtccggc gcagccgctg aaaaaccgtc aagttcgtgg cttcccgaag 780 780 <210> 3 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fluorescent protein <400> 3 Met Asp Asn Thr Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Gln Phe Lys Val 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Tyr Phe Glu Ile Glu Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Gln Val 35 40 45 Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln 50 55 60 Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Met Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Ser 85 90 95 Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Glu Val Gln Gln Asp Ser Ser 100 105 110 Leu Gln Asp Gly Thr Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Lys Gly Val Asn 115 120 125 Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Ala Gly Trp Glu 130 135 140 Pro Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu 145 150 155 160 Ile Ser His Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Asp 165 170 175 Phe Lys Thr Val Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Asn 180 185 190 His Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Asn His Asn Glu Asp Tyr 195 200 205 Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu His Ala Glu Ala Arg His Ser Gly Ser 210 215 220 Gln 225 <210> 4 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fluorescent protein <400> 4 atggacaaca ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcagt tcaaggtgcg catggagggc 60 tccgtgaacg gccactactt cgagatcgag ggcgagggcg agggcaagcc ctacgagggc 120 acccagaccg ccaagctgca ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180 ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240 gactacatga agctgtcctt ccccgagggc ttcacctggg agcgctccat gaacttcgag 300 gacggcggcg tggtggaggt gcagcaggac tcctccctgc aggacggcac cttcatctac 360 aaggtgaagt tcaagggcgt gaacttcccc gccgacggcc ccgtaatgca gaagaagact 420 gccggctggg agccctccac cgagaagctg tacccccagg acggcgtgct gaagggcgag 480 atctcccacg ccctgaagct gaaggacggc ggccactaca cctgcgactt caagaccgtg 540 tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcaaccact acgtggactc caagctggac 600 atcaccaacc acaacgagga ctacaccgtg gtggagcagt acgagcacgc cgaggcccgc 660 cactccggct cccag 675 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> silica forming peptide R5 <400> 5 Ser Ser Lys Lys Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Gly Ser Lys Arg 1 5 10 15 Arg Ile Leu <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 catatgagcc accactg 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aagcttcttc gggaagcc 18 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 catatggaca acaccgagga cg 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aagcttctgg gagccggagt 20 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agcttagcag caaaaaatct ggctcctatt caggctcgaa aggttctaaa cgtcgcattc 60 tgc 63 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tcgagcagaa tgcgacgttt agaacctttc gagcctgaat aggagccaga ttttttgctg 60 cta 63

Claims

목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide)의 융합 단백질, 염 및 실리카 전구체를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 실리카 형성 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 실리카 형성 펩타이드 R5인 것을 특징으로 하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 염은 알칼리 금속염인 것을 특징으로 하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법.
제3항에 있어서, 상기 알칼리 금속염은 염화세슘(CsCl), 염화리튬(LiCl), 염화나트륨(NaCl), 염화칼륨(KCl), 염화루비듐(RbCl), 플루오린화나트륨(NaF), 브로민화나트륨(NaBr), 아이오딘화나트륨(NaI) 또는 질산나트륨(NaNO₃)인 것을 특징으로 하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 실리카 전구체는 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate) 또는 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate)인 것을 특징으로 하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키는 방법.
목적 단백질 코딩 유전자 및 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide) 코딩 서열이 순차적으로 연결된 융합 단백질의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;
상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질 및 실리카 형성 펩타이드 R5의 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계; 및
상기 수득한 융합 단백질에 염 및 실리카 전구체를 혼합하는 단계;를 포함하는, 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 목적 단백질은 효소, 형광 단백질, 항원, 항체, 세포수용체, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 단백질인 것을 특징으로 하는 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 염은 염화세슘(CsCl)인 것을 특징으로 하는 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 염은 최종 농도가 0.05~1M이 되도록 혼합하는 것을 특징으로 하는 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자의 제조방법.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 고정화된 목적 단백질의 안정성이 증가된 실리카 나노입자.
염화세슘(CsCl)을 유효성분으로 함유하는 실리카 나노입자에 고정화된 목적 단백질의 안정성을 증가시키기 위한 조성물.