KR102107515B1

KR102107515B1 - 실리카 합성을 위한 재조합 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102107515B1
Application number: KR1020160049155A
Authority: KR
Inventors: 백승필; 기미란
Original assignee: 고려대학교 세종산학협력단
Priority date: 2016-04-22
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2020-05-07
Also published as: KR20170120810A

Abstract

본 발명은 실리카 합성을 위한 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서, 상기 재조합 단백질은 가용성 발현을 통한 실리카의 형성뿐만 아니라, 불용성 상태의 얇은 막 (sheet) 형태로도 제조될 수 있으며, 칼슘과의 높은 결합능에 따른 골 재생 또는 분화 촉진 효과를 확인할 수 있었는바, 본 발명은 골 이식재 및 조직 공학용 지지체 분야의 핵심 기술로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

실리카 합성을 위한 재조합 단백질 및 이의 용도 {Recombinant protein capable of silica deposition and use thereof}

본 발명은 실리카 합성을 위한 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

산업화 이후 한정된 육상 가용자원의 소비 급증에 따른 육상 자원 소재의 고갈로 인한 새로운 유용자원 개발이 국가적 미래를 위한 중요 이슈가 되고 있다. 따라서 미국, 유럽, 일본 등의 선진국들은 신규 원천 소재 개발 및 확보에 국가 역량을 집중시키고 있다. 여기에 더하여 환경오염으로 인한 지구 온난화 및 기후 변화 등은 인류의 생존을 위협하는 요인으로 작용하고 있어 경제 성장과 환경 보호를 동시에 추구하는 새로운 패러다임이 대두되고 있다.

해양 자원을 이용하여 환경 친화적인 생물학적 생산방법을 통해 신소재를 생산화는 방법은 원천 기술의 확보뿐 아니라 친환경 산업으로 인한 국가적인 저탄소 녹색성장의 견인차 역할을 할 기술로 기대된다. 특히, 실리카는 특정 화학종들과 공유 결합이 가능하기 때문에 새로운 하이브리드 소재 (유기-무기 복합체) 합성에 중요하고, 또한, 생체 적합한 소재로서 각 개별 소재의 단점을 보완할 수 있는 우수한 특성을 가지고 있다. 현재 실리카의 공업적 생산 공정은 고온, 강산 또는 강염기 조건이 요구되고 환경적으로 유해한 부산물 생성의 문제점이 있다.

그러나 해양 생명체인 스펀지와 규조류의 추출물 또는 유전학적 정보를 바탕으로 실리카를 생합성 하는 효소 및 펩타이드가 발견됨으로써 이들에 의해 생산된 환경 친화적 바이오실리카 및 이의 다양한 용도로의 응용성으로 인해 전 세계적으로 해양 유래 바이오 실리카 복합 소재 개발이 이슈화 되고 있는 실정이다 (Cha et al., 2000, Nature 403:pp.289-292; Kroger et al, 1999, Science 286: pp.1129-1132; Poulsen & Kroger, 2004, J Biol Chem 279: pp.42993-42999; Shimizu et al, 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95: pp.6234-6238). 따라서 생물학적 합성방법을 통한 바이오실리카 소재 확보를 위한 원천 기술의 보유는 매우 중요하다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은, 실리카 합성을 위한 재조합 단백질 및 이를 통한 실리카 합성방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 단백질 및 상기 단백질의 표면에 코팅되어 있는 실리카를 포함하는, 실리카 복합체를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 포함하는, 골 대체제를 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, 실리카 합성용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 실리카 전구체, 인지질, 또는 하이드록시아파타이트를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는, 실리카 합성방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질; 및 상기 단백질의 표면에 코팅되어 있는 실리카를 포함하는, 실리카 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 포함하는 골 대체제를 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 단백질은 가용성 발현을 통한 실리카의 형성뿐만 아니라, 불용성 상태의 얇은 막 (sheet) 형태로도 제조될 수 있으며, 칼슘과의 높은 결합능에 따른 골 재생 또는 분화 촉진 효과를 확인할 수 있었는바, 본 발명은 골 이식재 및 조직 공학용 지지체 분야의 핵심 기술로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은, Amphimedon queenslandica 유래의 　cathepsin L1-like 성숙 단백질 본래의 cDNA (mSL-cDNA), 코돈 최적화에 따른 cDNA (mSL_opt-cDNA) 및 이들간 염기서열을 비교한 결과이다.
도 2는, 실리카 형성 단백질 (mSL)의 SDS-PAGE 전기영동 결과로서, (a) 가용성 및 불용성 분획, (b) 변성 조건에서의 정제 분획, 및 (c) 재구성 완충 용액의 투석한 후, 회수한 분획에 대한 결과이다.
도 3은, 실리카 형성 단백질 (mSL)과 Silicateine 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과이다 (XP_003383726; cathepsin L1-like [Amphimedon queenslandica], BAG74343; silicatein-M2 [Ephydatia fluviatilis], CAI91573; silicatein a4 [Lubomirskia baicalensis], CAI43319; silicatein alpha [Lubomirskia baicalensis], CAI91571; silicatein a2 [Lubomirskia baicalensis], BAE54434; silicatein [Ephydatia fluviatilis]).
도 4는, (a) 실리카 형성 단백질 (mSL), 및 (b) 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)의 E. coli 발현시 cleavage site를 Signal P 4.1 Server를 이용하여 분석한 결과이다.
도 5는, 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)의 정제 분획을 SDS-PAGE 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 6은, 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)의 실리카 합성 활성을 버퍼 및 실리카 전구체의 종류에 따라 확인한 결과이다.
도 7은, 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 이용한 실리카 시트의 제조 과정별 생성물을 주사전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 8은, 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 이용한 하이드로겔의 제조과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 9a는, tyramine이 공유 결합된 젤라틴 1%-아가로오스 0.5%-0.01% mSLSN 용액 (1), 상기용액에 10 unit의 HRP, 5mM의 H₂O₂가 첨가된 용액 (2)이며, 도 9b는, 제조된 각각의 하이드로겔 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 10은, 배양 용기를 제조된 각각의 하이드로겔로 코팅하고 조골 세포를 배양시킨 후, 칼슘 침착 정도를 위상차 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 11은, 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)의 칼슘 결합능을 bovine serum albumin (BSA) 단백질과 정량적으로 비교한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명자들은, cathepsin L1-like 단백질을 이용하여 제조한 실리카 형성 단백질 (mSL)에서, 40번째 알라닌 잔기를 세린으로, 41번째 히스티딘 잔기를 아스파리진으로 치환시킴으로써, 가용화를 위한 정제과정에서도 안정성이 유지되는 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 제조하였으며, 상기 재조합 단백질은 실리카 전구체로부터 실리카를 침전시키는 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 칼슘과의 높은 결합능에 의해 골 재생 또는 분화를 촉진시킴을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, 실리카 합성용 조성물을 제공한다.

본 발명의 단백질은 Amphimedon queenslandica 유래의 　cathepsin L1-like로부터 분리한 서열번호 2의 단백질에서, 40번째 알라닌 잔기를 세린으로, 41번째 히스티딘 잔기를 아스파리진으로 치환시킨 것으로서, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 실리카 합성 및 골 재생 촉진 활성을 나타내는 특성을 지니고 있을뿐만 아니라, 이러한 특성은 가용성 및 불용성 상태에서도 유지될 수 있다. 또한, 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 상기 단백질은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있으며, 예를 들어, 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서, "재조합 벡터"란 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터, pET42b, pETDuet, pQE80 등에 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pET42b를 사용하였으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체를 제공한다.

상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 숙주 세포로는 대장균 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균 (예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모 (예를 들어, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 (Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사 (Neurosporacrassa)) 등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주 세포로 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균을 사용할 수 있다. 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 임의의 숙주 세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 재조합 벡터를 대장균 균주 BL21 (DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조하였다.

한편, 본 발명의 실리카 합성용 조성물은 필요한 경우, 인지질, 또는 하이드록시아파타이트를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체의 배양물을 분리 정제하는 단계를 포함하는 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)의 제조방법을 제공한다.

상기 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)은 통상의 배양방법에 따라 형질전환체를 배양하여 정제하는 것이 바람직하다. 상기 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)은 재조합 벡터에 도입되는 인서트 즉, 코딩 유전자의 염기서열에 따라 단백질 특성에 영향을 주지 않을 정도의 범위에 한하여 아미노산 서열의 일부에 대한 변형이 있을 수 있다. 상기 변형은 결실, 삽입 또는 치환에 의한 변형을 의미한다.

상기 실리카 전구체는 테트라메틸 오르토실리케이트, 테트라에틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드, 또는 테트라 에틸 게르마늄 등일 수 있으며, 이들을 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)은 상온 및 상압의 조건에서 약염기 즉, pH 6 에서 8의 수용액 하에서 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성할 수 있다. 본 발명의 실리카 합성방법을 보다 구체적으로 설명하면, 50mM Tris-HCl 용액 (pH 6 내지 8)에 녹아 있는 실리카 전구체 및 본 발명의 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 1% 내지 10%의 중량비로 혼합하고, 상온, 상압의 조건에서 반응 시킨 후 원심분리하여 실리카를 침전시킴으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질; 및 상기 단백질의 표면에 코팅되어 있는 실리카를 포함하는, 실리카 복합체를 제공한다. 본 발명의 실리카 복합체는 실리카 성분이 침전물로 뭉치지 않고, 단일막으로 도포될 수 있도록 인지질과 함께 사용할 수 있으며, 하이드록시아파타이트와 같은 무기물을 이용하여 무기물과 실리카 기반의 복합체를 형성할 수도 있다. 이 뿐만 아니라, 단백질의 가용성 또는 불용성 상태에 따라, 시트 또는 하이드로겔 형태로도 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 골 대체제, 치아 대체제, 골세포 분화 배지의 세포 배양 코팅제 또는 3차원 스캐폴드 소재로서의 용도를 제공하며, 골 재생 또는 분화 효과를 보다 증진키기 위하여, 상기 단백질의 표면에 코팅되어 있는 실리카를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 실리카 형성 단백질의 제조

1-1. 균주 등의 준비

발현 균주로 E. coli BL21 (DE3), 발현 벡터로 Nocagen사의 pET42b vector를 사용하였다. 균주 선별을 위한 항생제, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride), Lysozyme, 및 DNase는 Sigma-aldrich사, Protein assay reagent는 Thermo Fisher scientific사로부터 구매하여 사용하였다. 실시예에서 사용한 모든 시약은 analytical grade 수준이었으며, 모든 수용액은 deionized distilled water를 사용하여 준비하였다.

1-2. 실리카 형성 단백질 및 이의 발현 벡터의 제조

실리카의 생성을 촉진하는 것으로 알려진 Silicatein-alpha (GenBank ID: CAI46305.1)와 높은 서열 유사성을 나타내는 단백질을 탐색한 결과, Amphimedon queenslandica 유래의 cathepsin L1-like 단백질 (GenBank ID: XP_003383726.1)을 도출하였고, 상기 단백질의 cDNA 서열를 수집하였다. 대장균에서의 발현을 최적화하기 위해, 상기 cDNA 서열 중 성숙 단백질을 암호화하는 염기서열에 대해 코돈 최적화를 실시하여 서열번호 1의 mSL_opt-cDNA를 합성하였다 (이하의 실시예에서는 mSL_opt를 mSL로 명명함). 이후, 상기 cDNA의 상보적인 서열을 이용하여 유전자 증폭을 위한 PCR용 프라이머를 제작하였으며, 구체적인 프라이머의 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

PCR은 94℃ 3분 1회, 94℃ 30초-55℃ 30초-72℃ 30초 30회 반복, 72℃ 6분 1회 수행하였고, 이후, 정제된 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector에 삽입하였으며, 유전자 서열 분석으로 합성한 DNA를 확인하였다. 복제한 T-vector로부터 제한효소 NdeⅠ/HindⅢ를 이용하여 DNA 절편을 분리하였으며, 동일한 제한효소로 처리한 pET42b vector에 상기 DNA 절편을 삽입하고, T4 ligase를 이용하여 연결시켰다. 이후, E. coli XL1-blue에 형질전환시켜 mSL 발현 벡터를 생산하는 균주를 확보하였으며, 유전자 서열 분석을 통해 생산된 msL 발현 벡터를 검증하였다.

1-3. 실리카 형성 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 1-2에 따른 mSL 발현 벡터를 E. coli BL21에 도입하여 서열번호 2의 mSL 단백질을 발현시킨 결과, mSL 단백질은 불용성 inclusion body 형태로 발현되었다. 따라서, 상기 mSL 단백질을 8M의 urea가 첨가된 300mM NaCl-50mM 인산완충 용액에 용해시킨 후, 변성 (Denaturation) 조건에서 Thermo Fisher scientific 사의 프로토콜에 따라 His-tag 결합 코발트 레진을 이용하여 이를 정제하였다. 이후, mSL 단백질의 재구성 (refoldinig)을 위하여, 재구성 완충용액 (0.8M guanidine-HCl, 0.5 M L-arginine (L-Arg), 3mM DTT, 1 mM EDTA, and 0.1% Tritox X-100, pH 10.0)에 변성된 단백질 1의 부피 비율로 한 방울씩 섞어가며 희석하고, 냉장고에서 1시간 가량 교반시킨 후, 본래 단백질 부피 1로 농축하였다. 농축된 단백질은 순차적으로 2차 재구성 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 10% sucrose, 30 mM L-arginine, pH 9.0) 및 3차 재구성 용액 (50mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 각각 12시간 이상 투석하여, 가용성의 단백질을 회수하였다. 정제 및 회수된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였으며, 단백질의 농도는 Bradford assay로 정량하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 가용성 분획 및 불용성 분획에서 27kDa의 밴드가 관찰된 반면, 변성 조건에서의 정제 분획 및 3차 재구성 용액으로 투석한 후 회수한 분획 모두에서 종전에서 관찰되지 않았던 2개의 단백질 밴드를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 가용화를 위한 mSL 단백질의 정제 과정에서 단백질 일부가 가수 분해됨을 알 수 있었다.

1-4. 재조합 실리카 형성 단백질의 제조

본 실시예에서는, 가용화를 위한 정제과정에서도 본연의 단백질 구조를 유지할 수 있는, 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 제조하고자 하였다. 우선, Signal P 4.1 Server (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 분석한 결과, 40번 알라닌 (A)과 41번 히스티딘 (H) 사이가 본래 스펀지 숙주에서는 잘리지 않지만, E. coli BL21에 msL 발현 벡터를 도입하여 발현시킨 경우, 가수분해 효소에 의해 분해되는 것으로 예상되었다. 이에, 가수분해되는 40번 및 41번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키기 위해 cathepsin과 유사하면서 상대적으로 안정한 구조를 가지는 Silicateine 단백질의 아미노산 서열과 비교하였으며 (도 3 참조), 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 40번 및 41번 아미노산을 각각 세린 (S), 아스파라진 (N)으로 치환시킬 경우, 단백질의 안정성이 증대될 수 있을 것으로 판단할 수 있었다.

이후, 상기 결과에 기초하여 mSL 단백질의 A40H41이 S40N41로 치환된 서열번호 5의 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)을 site-directed mutagenesis를 통해 제조하였다. 구체적으로, 상기 mSL DNA 서열이 포함되어 있는 T-vector를 주형으로, 하기 표 2의 프라이머, 및 Pfu DNA polymerase를 사용하여 유전자를 증폭시켰다.

[표 2]

PCR은 95℃ 3분 1회, 95℃ 30초-60℃ 30초-72℃ 9분 30회 반복, 72℃ 10분 1회 수행하였고, PCR 산물에 DpnI 제한 효소를 처리하여 overnight 동안 반응시킨 후, E. coli XL1-Blue에 형질전환시켰으며, 유전자 서열 분석을 통해 치환된 아미노산 서열을 확인하였다. 복제한 T-vector로부터 제한효소 NdeⅠ/HindⅢ를 이용하여 DNA 절편을 분리하였으며, 동일한 제한효소로 처리한 pET42b vector에 상기 DNA 절편을 삽입하고, T4 ligase를 이용하여 연결시켰다. 이후, E. coli XL1-blue에 형질전환시켜 mSLSN 발현 벡터를 생산하는 균주를 확보하였으며, 유전자 서열 분석을 통해 생산된 mSLSN 발현 벡터를 검증하였다. 발현 벡터는 E. coli BL21 (DE3)로 형질전환시켜, 상기 mSLSN 단백질을 발현시킨 후, 이의 불용성 분획을 urea로 가용화하고, 변성 조건에서 정제한 뒤, 정제된 단백질을 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 종전 mSL 단백질과 달리, mSLSN 단백질은 변성 조건의 정제 분획에서도 단일의 단백질 밴드를 확인할 수 있었다. 상기 결과는 mSL 단백질의 A40H41을 S40N41로 치환시킴으로써, 가용화를 위한 정제과정에서 야기되는 단백질의 가수분해가 방지됨을 나타내며, 상기 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)은 불용성 상태뿐만 아니라, 가용성 상태에서도 본래의 특성을 그대로 유지될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2. 재조합 실리카 형성 단백질의 실리카 합성 활성 확인

본 실시예에서는, 재조합 실리카 형성 단백질 (mSLSN)의 실리카 합성 활성을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 50mM의 NaH₂PO₄ 완충용액 (pH 7.5) 또는 20mM의 Tris-HCl (pH 8.0)에 20mM의 실리카 전구체 (TMOS (tetramethyl orthosilicate) 또는 TEOS (tetraethyl orthosilicate))를 첨가하고, 60㎍의 mSLSN 단백질이 포함되어 있는 500㎕ 반응계에서 overnight 동안 반응시켰다. 이후, 4000g에서 10초간 원심 분리하여 합성된 실리카를 침전시키고 알코올로 2번, 증류수로 2번 침전물을 수세한 후, 공기 중에서 침전물을 건조시켰다. 건조된 실리카 침전물은 정량 분석을 위해 1M NaOH 용액에 넣어 95℃에서 30분간 반응시켜 분해시킨 후, 몰리브데이트와 실리카가 반응하여 노란색의 발색 반응물을 형성하는 원리를 이용하여 발색반응을 유도하였다. 이 반응에 사용된 용액들은 1M의 염산용액, 0.1 N 황산용액에 녹인 0.2% 암모늄몰리브데이트 (SolA), 5% 옥살산 용액 (SolB), 10% aceton에 녹아있는 200mM 아스코브르산 용액과 0.6%의 SDS (sodium dodecyl sulfate) 용액을 1:1로 섞은 SolC 용액이며, SolA부터 SolC 까지 동량을 순차적으로 넣어주어 실리카를 발색시켰다. 생성된 실리카 농도와 발색 세기가 비례 관계인 것을 이용하여 700nm에서의 흡광도를 측정하여 합성된 실리카의 농도를 계산하였다. 한편, 대조구로는 동일한 반응계에서, 단백질이 포함되지 않은 군 (con), bovine serum albumin (BSA)이 포함된 군 (BSA)을 이용하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 침전된 실리카의 양을 암모늄 몰리브데이트 법으로 정량하여 단백질 단위 mg당 형성되는 실리카의 양으로 정량화한 결과, mSLSN 단백질을 첨가한 경우, 대조구에 비해 실리카 합성에 의한 침전 반응이 보다 활발히 진행됨을 알 수 있었다.

실시예 3. mSLSN 단백질을 이용한 실리카 시트의 제조

본 실시예에서는, 불용성 상태의 mSLSN 단백질 및 실리카 전구체를 이용하여 실리카 시트를 제조하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-3의 변성 (Denaturation) 조건에 따라 mSLSN 단백질을 정제한 후, 1M urea가 포함된 1x PBS 또는 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 buffer로 투석을 진행하였으며, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 buffer로 투석을 진행한 경우, 생성된 단백질 막을 동결 건조시켰다. 이후, HCl로 가수분해시킨 3%의 TEOS가 첨가된 에탄올 용액 (3% silicic acid)과 72 mM choline chlorie를 1:1로 섞어 만든 용액에 4일간 침지시켜 mSLSN 단백질 막을 실리카로 미네랄화하였다. 이후, 각 단계의 실리카 막 또는 시트의 구조를 주사전자현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 투석이 진행됨에 따라 투석막 안쪽에 단백질이 시트 모양의 얇은 막으로 침전됨을 확인할 수 있었으며, 동결 건조된 경우, 얇은 막의 파티클이 네트워크처럼 연결되어 층층이 쌓여있는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 실리카로 미네랄화시킨 경우, 불용성 상태의 mSLSN 단백질 막 위로 실리카가 침전되어 mSLSN 단백질 막 구조의 형태대로 미네랄화됨을 확인할 수 있었다. 아울러, 실리카 미네랄화 전의 단백질 막은 매우 약하여 쉽게 모양이 찢어지고 흩어졌으나, 실리카 미네랄화된 후의 실리카 시트는 그 모양이 그대로 유지되었는바, 상기 미네랄화된 mSLSN 단백질 기반의 실리카 시트는 조직 공학적 지지체로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. mSLSN 단백질을 이용한 하이드로겔의 제조 및 골 재생 촉진 효과의 확인

본 실시예에서는, 가용성 상태인, 상기 실시예 1-3의 재구성 (Refoldinig) 조건에 따른 mSLSN 단백질이 포함된 실리카 하이드로겔을 제조하고, 이의 골 재생 효과를 확인하고자 하였다.

4-1. mSLSN 단백질을 이용한 하이드로겔의 제조

도 8에 나타낸 바와 같이, tyramine을 이용한 효소 매개의 교차 반응을 통한 하이드로겔의 제조방법을 활용하여 mSLSN 단백질이 포함된 1%의 젤라틴-0.5%의 아가로오스 하이드로겔을 제조하였다 (Kurisawa et al., 2005). 구체적으로, 0.3g의 젤라틴 (돼지 피부 유래)을 50mM의 30ml의 MES에 녹인 후, 60℃에서 4시간 반응시켰다. 다시 상온으로 온도를 낮춘 후, 0.25g의 tyramine hydrochloride, 0.15g의 1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide (EDC), 0.06g의 NHS를 순차적으로 첨가한 후, 30분간 반응시켰다. 이후, 젤라틴-tyramine 반응액을 투석막에 넣고 증류수에 대하여 투석을 실시하고, tyramine이 흡광도 275nm에서 검출되지 않을 때까지 투석을 실시하였다. 투석 후, tyramine이 결합된 젤라틴 용액을 동결건조하였으며, 동결건조된 1%의 gelatin-tyramine, 낮은 온도에서 겔화 되는 0.5%의 agarose (Sigma)에 0.01%-0.1%의 mSLSN이 포함된 용액을 혼합하여 50mM의 Tris-HCl, pH 8.0에서 투석을 진행하였다. 이후, ml당 10unit의 horse radish peroxidase (HRP), 및 최종 농도 5mM의 H₂O₂를 첨가하여 겔화 반응을 유도하였다. 겔화 반응 후, 이를 10 mM TMOS (1x PBS) 용액에 침지하고 하루 동안 정치시켜 실리카 미네랄화 반응을 유도하였다.

이후, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔의 제조 과정의 각 단계에서 생성된 하이드로겔 (1% gelatin-0.5% agarose, 1% gelatin-0.5% agarose-mSLSN, 1% gelatin-0.5% agarose- mSLSN-SiO₂)의 표면을 주사전자현미경으로 관찰하였으며, HRP-H₂O₂에 의한 효소 반응으로 mSLSN 표면 또는 젤라틴에 결합된 tyrosine간 교차결합을 형성함으로써 겔화 반응이 진행되고, 상기 반응에 의해 제조된 하이드로겔 위에 실리카가 미네랄화됨을 알 수 있었다.

4-2. 골 재생 촉진 효과의 확인

상기 실시예 4-1에서 제조된 하이드로겔에 대한 MC 3T3 E1 조골세포의 골 재생 능력을 비교하기 위하여, 96-well 플레이트에 각 하이드로겔을 50㎕씩 첨가하고, 건조시킨 후, 배양용기에 이를 코팅하였다. 또한, 실리카 하이드로겔의 효과를 확인하기 위하여, 상기 코팅된 배양용기를 10mM의 TMOS 용액이 첨가된 1x PBS에 하루 동안 정치시켜 실리카 미네랄화 반응을 유도하고, 3회 수세한 후, 이를 건조시켰다. 각각의 하이드로겔로 코팅된 배양용기를 70%의 에탄올로 소독하고 증류수와 PBS로 수세한 후, 하루 동안 정치시켜 건조된 하이드로겔을 수화시키고 MEM-alpha 성장 배지에 조골 세포를 접종하였다. 접종 후 1주일간은 성장 배지에서 배양시켰으며, 이로부터 18일째까지는 성장 배지에 10mM glycerophosphate 및 50μM ascorbic acid가 포함된 골 분화 배지에서 배양시켰다. 18일째 배지를 제거하고 PBS로 수세한 후, 차가운 메탄올로 세포를 고정화시키고, 증류수로 수세한 뒤, Alizarin Red S로 10분간 염색하였다. 이후 다시 1x PBS로 3번 수세한 후, 침착된 칼슘의 정도를 위상차 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, mSLSN 단백질이 첨가된 하이드로겔의 경우, 칼슘의 침착이 증진되었으며, 특히, mSLSN 단백질 첨가와 함께 실리카 미네랄화가 유도된 하이드로겔의 경우, 이러한 효과가 현격하게 향상됨을 확인할 수 있었는바, 상기 하이드로겔 조성물은 골 재생 또는 분화의 촉진에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. mSLSN 단백질의 칼슘 결합능 확인

상기 실시예 4-1에서는 mSLSN 단백질이 첨가된 하이드로겔의 칼슘 침착 증진, 및 골 재생 촉진 효과를 확인하였으며, 이에 기반하여 본 실시예에서는, mSLSN 단백질 자체의 칼슘 결합능을 확인하고자 하였다. 구체적으로, mSLSN 단백질을 인산칼슘 powder와 반응시킨 후, 원심분리시켰으며, 이후, 침전된 인산칼슘에 결합된 단백질과 상층액에 남은 단백질의 양을 비교하여 칼슘 결합능을 평가하였다. 한편, 대조구로는 bovine serum albumin (BSA) 단백질을 이용하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조구의 경우, 칼슘 결합능이 30%에 불과하였던 반면, mSLSN 단백질은 80%가 결합되어 있었는바, mSLSN 단백질은 칼슘 결합력을 증진시켜 골세포 분화 촉진에 영향을 미침을 확인할 수 있었다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Recombinant protein capable of silica deposition and use thereof <130> P16U13C0789 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSL_opt-cDNA <400> 1 atgccggaag aagttgactg gcgcaccaaa aatgcggtca cgggcgtgaa agatcagggc 60 caatgcggta gttgttatgc gttttccgca gtgggtgcac tggaaggtgc acaggctctg 120 gcgcatgaca aactggttca cctgagtgaa caaaacattg tcgattgctc catcccgtac 180 ggcaataaag gttgtaacgg cggtaacatg tacgaatctt ttcgctacat catcgacaac 240 gatggcattg accgtgaaga tggttataaa tacaccggcc gccagggtca atgtaaattc 300 gatcgtaaag ccattggcgg tcgccaggtt ggcattatcc atatcccgac cggttcagaa 360 gcagaactgc aatcggcact ggcaacggct ggtccggtgt cagttgccat tgacggtagc 420 tctaatgcat tccgtttcta cgaaaaaggt gttttcgatg aaccgaactg ctcgaccacg 480 aaactgaccc atgctggcct gattatcggc tatggcaaga aaaaaggtaa accgtactgg 540 ctggtcaaaa atagttgggg cccgcactgg ggcatgaaag gttatattat gatggctcgc 600 aacaaagcga atcagtgtgg tatcgcaacc gcggccagct tcccgacgct gtaa 654 <210> 2 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mSL protein <400> 2 Met Pro Glu Glu Val Asp Trp Arg Thr Lys Asn Ala Val Thr Gly Val 1 5 10 15 Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Tyr Ala Phe Ser Ala Val Gly 20 25 30 Ala Leu Glu Gly Ala Gln Ala Leu Ala His Asp Lys Leu Val His Leu 35 40 45 Ser Glu Gln Asn Ile Val Asp Cys Ser Ile Pro Tyr Gly Asn Lys Gly 50 55 60 Cys Asn Gly Gly Asn Met Tyr Glu Ser Phe Arg Tyr Ile Ile Asp Asn 65 70 75 80 Asp Gly Ile Asp Arg Glu Asp Gly Tyr Lys Tyr Thr Gly Arg Gln Gly 85 90 95 Gln Cys Lys Phe Asp Arg Lys Ala Ile Gly Gly Arg Gln Val Gly Ile 100 105 110 Ile His Ile Pro Thr Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Ser Ala Leu Ala 115 120 125 Thr Ala Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Gly Ser Ser Asn Ala Phe 130 135 140 Arg Phe Tyr Glu Lys Gly Val Phe Asp Glu Pro Asn Cys Ser Thr Thr 145 150 155 160 Lys Leu Thr His Ala Gly Leu Ile Ile Gly Tyr Gly Lys Lys Lys Gly 165 170 175 Lys Pro Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Pro His Trp Gly Met 180 185 190 Lys Gly Tyr Ile Met Met Ala Arg Asn Lys Ala Asn Gln Cys Gly Ile 195 200 205 Ala Thr Ala Ala Ser Phe Pro Thr Leu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 210 215 220 His His His His His His His His 225 230 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSL_opt-cDNA Foward <400> 3 catatgccgg aagaagttga ctggcgca 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSL_opt-cDNA Reverse <400> 4 aagcttcagc gtcgggaagc tggccgc 27 <210> 5 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mSLSN protein <400> 5 Met Pro Glu Glu Val Asp Trp Arg Thr Lys Asn Ala Val Thr Gly Val 1 5 10 15 Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Tyr Ala Phe Ser Ala Val Gly 20 25 30 Ala Leu Glu Gly Ala Gln Ala Leu Ser Asn Asp Lys Leu Val His Leu 35 40 45 Ser Glu Gln Asn Ile Val Asp Cys Ser Ile Pro Tyr Gly Asn Lys Gly 50 55 60 Cys Asn Gly Gly Asn Met Tyr Glu Ser Phe Arg Tyr Ile Ile Asp Asn 65 70 75 80 Asp Gly Ile Asp Arg Glu Asp Gly Tyr Lys Tyr Thr Gly Arg Gln Gly 85 90 95 Gln Cys Lys Phe Asp Arg Lys Ala Ile Gly Gly Arg Gln Val Gly Ile 100 105 110 Ile His Ile Pro Thr Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Ser Ala Leu Ala 115 120 125 Thr Ala Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Gly Ser Ser Asn Ala Phe 130 135 140 Arg Phe Tyr Glu Lys Gly Val Phe Asp Glu Pro Asn Cys Ser Thr Thr 145 150 155 160 Lys Leu Thr His Ala Gly Leu Ile Ile Gly Tyr Gly Lys Lys Lys Gly 165 170 175 Lys Pro Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Pro His Trp Gly Met 180 185 190 Lys Gly Tyr Ile Met Met Ala Arg Asn Lys Ala Asn Gln Cys Gly Ile 195 200 205 Ala Thr Ala Ala Ser Phe Pro Thr Leu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 210 215 220 His His His His His His His His 225 230 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSLSN-cDNA Foward <400> 6 caggctctgt cgaatgacaa actggttcac ctga 34 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSLSN-cDNA Reverse <400> 7 cagtttgtca ttcgacagag cctgtgcacc ttccagt 37

Claims

서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 및
실리카 전구체
를 포함하는, 실리카 합성용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 실리카 전구체는 테트라메틸 오르토실리케이트, 테트라에틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는, 실리카 합성용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 인지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 실리카 합성용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 하이드록시아파타이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 실리카 합성용 조성물.
서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 및 실리카 전구체를 반응시키는 단계를 포함하는, 실리카 합성방법.
제6항에 있어서,
상기 실리카 전구체는 실리카 전구체는 테트라메틸 오르토실리케이트, 테트라에틸 오르토실리케이트, 메틸 트리에톡시실란, 페닐 트리에톡시실란, 디메틸 디메톡시 실란, 에틸 트리에톡시실란, 티타니아 테트라이소프로폭사이드 및 테트라에틸 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는, 실리카 합성방법.
서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 막을 실리카로 미네랄화한 실리카 시트 형태 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 포함된 젤라틴-아가로오스 하이드로겔 위에 실리카가 미네랄화된 하이드로겔 형태의 실리카 복합체.
제8항에 있어서,
상기 복합체는 인지질이 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 실리카 복합체.
제8항에 있어서,
상기 복합체는 하이드록시아파타이트가 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 실리카 복합체.
삭제
청구항 8의 실리카 복합체를 포함하는, 골 대체제.
삭제