KR20210149435A - 자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가측정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가측정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가측정 방법은 피검자로부터 채혈된 혈액 중 항핵항체 양성 판정된 혈청 시험체를 준비하고, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가를 고려하여 상기 혈청 시험체의 선별(1:80) 희석혈청과 최소한의 희석액 개수를 이용하고 형광강도(FI) 값의 선형 기울기 감소 추세에 기반하여 최종 역가를 구함으로써, 종래 연속 희석 시리즈 또는 단일-웰 적정을 이용한 항핵항체 검사 대비 정확도가 우수하고, 비용이 효율적이며 신속한 예측이 가능하여, 자가면역질환 진단에 유효하다.

Description

자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가측정 방법{TITRATION METHOD IN ANTI-NUCLEAR ANTIBODY TESTING FOR THE DIAGNOSIS OF AUTOIMMUNE DISEASES}

본 발명은 자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가측정 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 피검자로부터 채혈된 혈액 중 항핵항체 양성 판정된 혈청 시험체를 준비하고, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가를 고려하여 상기 혈청 시험체의 선별(1:80) 희석혈청과 최소한의 희석액 개수를 이용하고 형광강도(FI) 값의 선형 기울기 감소 추세에 기반하여 최종 역가(endpoint titer)를 구하는, 항핵항체 역가측정 방법에 관한 것이다.

항핵항체(anti-nuclear antibody)는 세포핵 내에 존재하는 다양한 항원군에 대한 자기항체군의 총칭으로 정의할 수 있으며, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군 등의 각종 자가면역질환에서 나타나는 자가항체이다.

상기 항핵항체는 자가면역질환검사의 핵심이라 할 만큼, 류마티스 질환을 비롯한 다양한 자가면역질환들을 진단하는 데 있어서 가장 중요한 혈청학적 검사 중의 하나이고, 이는 질환의 진단에 이용되며, 질병의 활성도나 예후를 알 수 있는 지표로도 사용되고 있다.

최근 류마티스질환 진단을 위한 항핵항체(anti-nuclear antibody) 검사에서, 자동화된 시스템에 의하여 형광염색한 슬라이드를 형광현미경으로 촬영한 이미지를 획득하여 형광강도(fluorescence intensity, FI)를 측정하고 시험 샘플의 양성/음성 판정 및 반응패턴별로 예측한 역가(titer)를 제공하는 자동화 장비가 사용되고 있다.

일반적으로 항핵항체는 형광현미경을 통하여 관찰되는 형광체의 분포에 따른 염색패턴 모양으로 분류할 수 있는데, 이러한 항핵항체의 염색패턴에 따른 분류에는 다양한 종류(homogenous, speckled, centromere, nucleolar, nuclear dot, fine speckled, coarse speckled, dense fine speckled)가 있다.

항핵항체의 염색패턴에 따른 각각의 분류에 해당하는 특이 자가항체는 그 수가 매우 다양하며 자가항체에 대응하는 관련 질환 역시 다양하여 수많은 조합이 있을 수 있다.

비특허문헌 1에는 류마티스 관절염 환자들에서 항핵항체의 발현빈도, 양상, 역가 그리고 항ENA항체에 대해 조사한 결과를 보고하고 있는데, 류마티스 인자가 양성인 류마티스 관절염 환자의 47.5%에서 항핵항체가 양성이었고, 류마티스 관절염에서 항핵항체의 역가는 1:80 이하의 저역가가 많았으며(63.1%), 항핵항체의 역가에 따른 비교에서 고역가군은 저역가군에 비해 연령이 높고 혈색소가 낮았다는 결과를 보고하고 있다.

핵 성분의 항원에 대하여 순환하는 자가항체를 검출하는 것은 전신성 류마티스 질환 및 다른 자가면역질환의 진단과 연구에 중요한 도구이다. 항핵항체를 검출하기 위해 많은 검사기법이 개발되었지만, 배양된 세포를 이용한 간접 면역 형광법에 의한 항핵항체의 검출법이 가장 널리 사용되고 있다.

대표적으로, 단일-웰 적정(Single-well titration)은 단일 선별(1:80) 희석혈청에서의 역가를 예측하는 방법으로, 항핵항체의 반응패턴을 필요로 할 뿐만 아니라 상대적으로 높은 오류(∼20%)를 범한다.

다른 방법으로서, 실제 2배수 연속 희석 계열(1:80, 160, 320, 640, 1280??)을 준비하여 검사하는 방법은 시약소모가 많아 비용을 증가시키는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 종래 문제점을 개선하고자 노력한 결과, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가를 고려하여 상기 혈청 시험체의 선별(1:80) 희석혈청과 최소한의 희석액 개수를 이용하고 형광강도(FI) 값의 선형 기울기 감소 추세에 기반하여 최종 역가를 구하는 방법을 제공하고, 상기 최종 역가의 예측방법이 종래 연속 희석 시리즈 또는 단일-웰 적정을 이용한 항핵항체 검사 대비 정확도가 우수하고, 비용이 효율적이며 신속한 예측의 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국특허 제2008-7011124호 (2008.08.12 공개)

대한내과학회지 1999, 제56권 제6호, 745-752.

본 발명의 목적은 자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 검사에서 선형 기울기 기반의 적정에 따른 항핵항체 역가를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가 측정방법에 있어서, 피검자로부터 채혈된 혈액 중 항핵항체 양성 판정된 혈청 시험체를 준비하고, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가를 고려하여 상기 혈청 시험체의 선별(1:80) 희석혈청으로부터 2 내지 3개의 혈청 희석에 따라 형광강도(FI) 값의 선형 기울기 감소 추세에 기반하여 최종 역가(endpoint titer)를 구하는 것으로 이루어진 항핵항체 역가측정 방법을 제공한다.

상기에서 최종 역가는 혈청의 희석배수(X축)에 따른 FI 값(Y축)을 선형-로그(X-Y) 모델링하여 산출된 것이 바람직하다.

이때, 상기 희석배수는 선별(1:80) 희석혈청(D1)으로부터 혈청 희석액(D2)-혈청 희석액(D3)으로 조합되고, 상기 혈청 희석액(D3) 역가가 혈청 희석액(D2) 역가의 2배수로 희석된 것이다.

더욱 구체적으로, 상기 희석배수는 희석혈청(D1)-혈청 희석액(D2)-혈청 희석액(D3)으로 조합될 때, 1:80-1:160-1:320 희석조합, 1:80-1:320-1:640 희석조합, 1:80-1:640-1:1280 희석조합, 1:80-1:1280-1:2560 희석조합 및 1:80-1:2560-1:5120 희석조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 형태가 적용된다.

본 발명의 항핵항체 역가측정 방법은 선형 기울기 기반의 적정에 따른 항핵항체 검사를 이용함으로써, 혼합형 항핵항체 반응패턴 및 세포질(cytoplasmic) 항핵항체 반응패턴에서도 역가를 구할 수 있다.

본 발명의 항핵항체 역가측정 방법에 따르면, 종래 연속 희석 시리즈 또는 단일-웰 적정을 이용한 항핵항체 검사와는 달리 반응패턴을 미리 입력할 필요가 없다.

또한, 본 발명의 항핵항체 역가측정 방법은 2 내지 3개의 혈청 희석액만을 이용하므로, 전체 시리즈별로 희석액을 준비하는 경우보다 검사비용이 절감된다.

특히, 본 발명의 항핵항체 역가측정 방법은 종래 연속 희석 시리즈 또는 단일-웰 적정을 이용한 항핵항체 검사대비 오류율이 낮아 정확도가 우수하고, 혼합형 항핵항체 반응패턴 및 세포질(cytoplasmic) 항핵항체 반응패턴에서도 역가를 구할 수 있어, 전신성 홍반성 루프스, 염증성 근변증(idiopathic inflammatory myopathies, IIM) 및 전신자가면역 류마티스성 질환의 특정 자가면역질환 진단에 유효하게 활용될 수 있다.

도 1은 종래 항핵항체 검사에서 실제 환자들로부터 반응패턴별로 연속 희석하여 역가를 결정하는 방법을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 선형 기울기 기반의 적정에 따른 항핵항체 검사에 의한 산출원리를 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명의 선형 기울기 기반의 적정에 따른 항핵항체 검사에 있어서, 3개의 희석액간의 형광강도의 감소경향을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가측정 방법에 있어서,

피검자로부터 채혈된 혈액 중 항핵항체 양성 판정된 혈청 시험체를 준비하고, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가를 고려하여 상기 혈청 시험체의 선별(1:80) 희석혈청으로부터 2 내지 3개의 혈청 희석에 따라 형광강도(Fluorescence Intensity, FI) 값의 선형 기울기 감소 추세에 기반하여 최종 역가(endpoint titer)를 구하는 것으로 이루어진 항핵항체 역가측정 방법을 제공한다.

항핵항체는 Hep-2 (human epithelial cell tumor line) 세포주를 이용하여 검사하고, 면역형광법(immunofluorescence assay)으로 수행한다. 이러한 항핵항체를 정량적으로 검사 시에는 1:40, 1:80, 1:160··· 등 역가(titer)로 표시된다.

항핵항체 검사는 두 단계의 순서로 진행되는데, 첫 단계인 항핵항체 선별검사(screening)는 피검자로부터 채혈하여 분리한 혈청을 1:80으로 희석하여 검사가 시행된다. 선별검사가 양성인 경우, 두 번째 단계인 항핵항체 역가 검사(titration)를 시행한다.

항핵항체의 검사결과에는 염색패턴에 대한 정보가 추가적으로 주어지기도 하는데 이러한 추가정보를 토대로 이와 관련된 특이 자가항체와 연관 질환에 대한 실마리를 얻을 수 있다.

도 1은 종래 항핵항체 검사에서 실제 환자들에서 반응패턴별로 80부터 2배수 연속희석을 시행하여 역가를 결정하는 방법을 나타낸다.

그러나, 연속 희석 시리즈에 따른 항핵항체 검사는 실제 2배수 연속 희석 계열(1:80, 160, 320, 640, 1280??)을 준비하여 검사해야 하므로, 시약소모가 많아 비용을 증가한다.

또한, 종래 단일-웰 적정(Single-well titration)에 따른 항핵항체 검사는 단일 선별(1:80) 희석혈청에서의 역가를 예측하는 방법으로, 항핵항체의 반응패턴을 필요로 할 뿐만 아니라 상대적으로 오류율(∼20%)이 높고, 프로존 효과를 확인할 수 없으며, 혼합형 항핵항체 반응패턴 및 세포질 항핵항체 반응패턴에서는 적용할 수 없다. 따라서, 자가면역질환 중 혼합형 항핵항체 반응패턴을 보이는 전신성 홍반성 루프스 진단에는 활용할 수 없어, 제한적인 항핵항체 역가측정 방법에 해당한다.

반면에 본 발명은 항핵항체 검사에서 선형 기울기 기반의 적정(Line Slope-Based Titration)에 따른 역가측정 방법을 제공한다.

구체적으로, 피검자로부터 채혈된 혈액 중 항핵항체 양성 판정된 혈청 시험체를 준비하고, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가를 고려하여 상기 혈청 시험체의 선별(1:80) 희석혈청과 최소한의 희석액 개수를 이용하고 형광강도(FI) 값의 선형 기울기 감소 추세에 기반하여 최종 역가를 구하여 자가면역질환을 진단할 수 있다.

본 발명의 선형 기울기 기반의 적정(Line Slope-Based Titration)에 따른 항핵항체 역가측정 방법에서 혈청의 희석배수(X축)에 따른 FI 값(Y축)을 선형-로그(linear-log, X-Y) 모델링하여 최종 역가를 결정하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 희석배수는 선별(1:80) 희석혈청(D1)으로부터 혈청 희석액(D2)-혈청 희석액(D3)으로 조합되고, 상기 혈청 희석액(D3) 역가가 혈청 희석액(D2) 역가의 2배수로 희석된 것이다.

더욱 구체적으로, 상기 희석배수는 희석혈청(D1)-혈청 희석액(D2)-혈청 희석액(D3)으로 조합될 때, 1:80-1:160-1:320 희석조합, 1:80-1:320-1:640 희석조합, 1:80-1:640-1:1280 희석조합, 1:80-1:1280-1:2560 희석조합 및 1:80-1:2560-1:5120 희석조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 형태가 적용된다[표 2].

구체적으로, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가가 알려져 있지 않다면, 상기 희석배수는 1:80 및 1:320으로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 피검자의 이전 최종 역가가 알려져 있지 않을 경우, 1:80 및 1:320의 희석배수로 희석된 혈청 샘플의 FI 값(Y축)을 기반으로 한 선형-로그(linear-log, X-Y) 모델링에 의하여 가장 정확한 최종 역가의 예측이 가능하다.

도 2는 본 발명의 선형 기울기 기반의 적정에 따른 항핵항체 검사에 의한 산출원리를 나타낸 것으로, 1) 환자의 선별(1:80) 희석혈청에서의 FI 값은 1960 (P1)이고, 1:640 희석액서의 FI값은 489 (P3)이다. 2) 선형-로그 모델(Linear-log, X-Y model)의 XY 그래프에서 위 두 점을 이용한 직선 방정식 Ln(Y)= -0.002475X + 7.779를 이용하여 구할 수 있다. 3) 상기 방정식에 Y에 FI 컷오프인 48을 대입하여 얻은 X값은 1,579이다. 4) 상기 X값(1,579)보다 작은 최대 2배수 희석배수는 1:1,280이다. 5) 결론적으로 이 환자의 항핵항체 검사의 역가를 1:1,280로 결정한다.

반면에, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가가 알려져 있다면, 상기 희석배수는 1:80 및 상기 최종 역가에 해당하는 희석배수로 이루어질 수 있다.

구체적으로 피검자의 선별 희석혈청의 희석배수인 1:80에서부터 2배수로 희석하여 준비한 연속 희석 시리즈(serial dilution series)에서 항핵항체 양성 반응이 일어난 최대 희석배수의 역수를 최종 역가로 결정한다(예: 양성인 최대 희석배수가 1:640이면 역가는 640).

이상의 본 발명의 선형 기울기 기반의 적정(Line Slope-Based Titration)에 따른 항핵항체의 역가측정 방법은 어떠한 혼합형 항핵항체 패턴(Mixed Anti-Nuclear antibody pattern)에서도 역가를 구할 수 있으므로, 혼합형 항핵항체 반응패턴을 가지는 전신성 홍반성 루프스 진단에 유용하다.

또한, 본 발명의 자가면역질환 진단방법은 선형 기울기 기반의 적정(Line Slope-Based Titration)에 따른 항핵항체 검사를 이용하여 세포질(cytoplasmic) 항핵항체 반응패턴에서도 역가를 구할 수 있다.

전신성 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE)는 다양한 자가항원에 대한 자가항체가 존재하여 피부, 신장, 신경계, 폐, 심장, 조혈기관과 근육, 관절을 침범하여 염증 반응과 조직 손상을 초래하는 전신 자가면역질환이다.

또한, 항핵항체 반응패턴 중 세포질 항핵항체(cytoplasmic ANA) 감지는 염증성 근변증(idiopathic inflammatory myopathies, IIM), 전신자가면역 류마티스성 질환(Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases, SARD)의 변이종 진단에 유효할 것이다. 이에, 본 발명의 선형 기울기 기반의 적정에 따라, 세포질 항핵항체(cytoplasmic ANA)는 7/77(9.1%)의 낮은 오류율을 보이며 정확하게 최종 역가를 결정할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 실시예를 상세하게 설명한다.

그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해서 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해서 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 선형 기울기 기반의 적정에 따른 항핵항체 역가 예측 방법

단계 1: 항핵항체 시험을 위한 시험체 준비

환자 혈액은 진단 목적으로만 채혈되었으며, 항핵항체 양성 판정된 총 759명의 환자 혈청 시험체를 준비하고, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 항핵항체 반응패턴으로 분류하였다.

단계 2: 항핵항체 시험

QUANTA-Lyser 기기와 NOVA Lite HEp-2 IgG 항핵항체 키트를 사용하여 표본 희석에서 최종 세척 단계까지 항핵항체 슬라이드 처리를 완전히 자동화하여 수행하고, 기기(NOVA View)를 사용하여, 염색된 HEp-2 세포의 디지털 이미지를 획득하였다. 양성과 음성 형광강도(FI) 값을 구분할 수 있는 컷오프 값은 48 LIU(light intensity unit)이었고, 두 명의 전문가가 독립적으로 QUANTA Link(INOVA Diagnostics)를 사용하여 고해상도 및 고대비율의 LCD 모니터에서 상기 이미지를 검토하였다.

단계 3: 선형 기울기 기반의 적정(Line Slope-Based Titration)

선경사 적정에 대한 희석액의 최소한의 수로 준비하기 위하여, 이전 항핵항체 시험의 환자결과를 고려하였다.

각 시험체당 2이상의 희석액을 준비하였다. 즉, 선별희석혈청 (D1, 1:80)에 추가 희석액(D2) 및 최대 희석액(D3)를 더하여 준비하였다. 환자의 이전 역가를 안다면, D3은 알고 있는 역가에 상응하는 희석액으로 준비하였다.

반면에, 환자의 이전 역가를 모를 경우, 선별 희석에서 FI 등급에 기초하여 D3를 준비하였다: 일례로, 등급1+는 1:160, 등급2+는 1:320, 등급3+는 1:640 및 등급4+는 1:1280으로 준비하였다.

D2는 D3에서 희석을 뺀다. 예를 들면, D3가 1:320이면, D2는 1:160으로 희석되며, 이를 D1-D2-D3로 표현하면, 1:80 - 1:160 - 1:320이다.

즉, 환자의 이전 역가가 1280일 때, 연속 희석은 1:80 - 1:640 - 1:1280로 준비된다. 총 환자수 759명(n = 759)에 대해, 준비된 선형 기울기 기반의 적정은 하기 표 2에 기재되었다.

도 2는 본 발명의 선형 기울기 기반의 적정의 산출원리를 나타낸 것이다.

구체적으로, X 축은 희석배율 역가이고, Y 축은 형광강도(FI)을 나타내고, 3종의 준비된 희석액 D1, D2 및 D3가 좌표계에 표시된다.

상기 3점을 사용하여 그릴 수 있는 선(line)의 수는 3점 모두에 대한 회귀선, P1-P2 선, P2-P3 선, P1-P3 선으로 총 4개이다. 이때, 상기 P1-P2 선, P2-P3 선, P1-P3 선은 3점 사이의 한 쌍의 점을 연결한다.

상기 X 좌표 값은 48 LIU의 Y 좌표 값(FI 임계치, NOVA View 시스템)으로부터 산출되며 마침내, 최종 역가는 최대 두배 희석의 역수에 따라 결정되었으며, 이는 산출된 X 좌표 값과 동일하거나 작은 값으로 결정된다.

<비교예 1> 연속 희석 시리즈에 따른 역가 예측 방법

상기 실시예 1의 단계 1 및 단계 2의 항핵항체 시험에서, 최종 역가를 얻기 위하여, 양성 혈청 시험체를 PBS(phosphate-buffered saline)용액에서 1:80 내지 1:2,560시리즈별로 희석(serial dilution)하였다. 상기 연속 희석에서, 최종 역가는 음성으로 전환되기 직전 희석 배수에 따라 결정되었다.

도 1은 종래 항핵항체 검사에서 실제 환자들에서 반응패턴별로 80부터 2배수 연속희석을 시행하여 역가를 결정하는 방법을 나타낸다.

항핵항체 선별(screening) 검사를 위해, 혈청을 1:80으로 희석시켰다. FI 값이 48 미만이더라도, 디지털 이미지 또는 형광 현미경에서 HEp-2 세포가 뚜렷한 형광 및 식별 가능한 항핵항체 반응패턴을 나타낸다면, 해당 시험체를 양성으로 간주하였다.

도 1에서 X축에 가장 낮은 역가(80)의 형광강도(FI)를 청색으로 표시하고, 이를 기준으로 배가의 희석액을 X축으로 배열하고 항핵항체 반응패턴별을 분류하였다.

<비교예 2> 단일-웰 적정에 따른 역가 예측 방법

상기 실시예 1의 단계 1 및 단계 2의 항핵항체 시험에서, 양성 판정된 시험체에 대하여 HEp-2 세포 염색에 따라 5가지 반응패턴으로 분류되었다: 균질(homogeneous), 반점(speckled), 핵(nucleolar), 동원체(centromere) 및 세포질(cytoplasmic)로 분류되고, 선별 희석에서 단일-웰 적정을 수행하였다.

혼합패턴으로 나타날 경우, 더 밝은 형광을 내는 반응패턴을 선택하여 단일-웰 적정을 수행하였다. NOVA View 시스템에 의한 단일-웰 적정은 (1) 혼합형 항핵항체 반응패턴 및 (2) 세포질 항핵항체 반응패턴과 같은 중요한 항핵항체에 적용될 수 없다.

<실험예 1> 선형 기울기 기반의 적정에 있어서, 준비된 3개의 희석액과 형광강도의 관계

원칙적으로, FI 값이 낮을수록 시험체는 더 높은 희석액으로 얻어져야 한다. 이를 뒷받침한 결과로, 3개의 희석액(D1, D2 및 D3)의 FI 값은 각 시험체 내에서 비교되었다.

대부분의 경우(710명/총 754명, 93.9%), D1, D2 및 D3 순으로 감소 추세를 보였다. 그러나, 일부 D2보다 작은 D1(29명/총756명, 3.8%), D3보다 작은 D2(14명/총 755명, 1.9%) 및 D3보다 작은 D1(9명/총 755명, 1.2%)의 역전 경향이 관찰되었다.

선별 희석(D1)에서, D2보다 작은 D1 샘플(1955±880 LIU[n=29])은 D2보다 큰 D1샘플(1069±1037 LIU[n=727])보다 높은 FI 값을 나타냈다(P<0.00001). 이와 같은 결과는 반전된 샘플의 희석혈청에서 프로존 효과(prozone effect)가 발생해야 한다는 것을 시사한다.

도 3은 본 발명의 선형 기울기 기반의 적정에 있어서, 3개의 희석액간의 형광강도의 감소경향을 나타낸 것이다.

<실험예 2> 선형 기울기 기반의 모델별 3개 희석점의 선형성에 대한 라인-피팅 효율성 평가

상기 실험예 1의 FI 값의 추세 감소 분석에서와 같이, X 축은 희석배수이고, Y 축은 형광강도(FI) 값으로 지정되었다.

각 축에 대하여, 선형-선형(linear-linear scale), 로그-선형(log-linear scale), 선형-로그(linear-log scale) 및 로그-로그(log-log scale) 등 총 4개의 후보 모델에 적용하였다.

상기 플롯에서, 각 샘플 당 연속 희석 시리즈의 3개의 희석점에 대한 선형성을 간단한 회귀 분석으로 평가하였다.

상기 회귀선(regression line)(R2 값(결정 계수, coefficient of determination) 및 P)에 대한 두 가지 통계적 파라미터는 라인-피팅 효율성을 반영하고, 4가지 스케일 모델을 비교할 수 있다.

총 시험체 759 중, 역전된 경향을 보이는 샘플(D1 <D2, D2 <D3 또는 D1 <D3, n=49)은 프로존 효과가 나타난 것으로 의심되어 실험에서 배제하였다.

D1, D2 및 D3 순으로 감소 추세를 보이는 나머지 시험체(n=710) 중에서, R² >0.96값과 P<0.05값이 하기 표 3에 기재되었다.

상기 표 3의 결과로부터, 로그-로그 모델은 가장 높은 R²비율(64.6 %)에도 불구하고 상대적으로 낮은 P 값(27.9%)을 나타냈다.

상기 결과로부터 X-Y 플롯은 선형-로그 모델의 경우 두 비율(P<0.05값과 R² >0.96값)에서 가장 적합한 것으로 확인되었으며, 이 모델의 경우, 적정 오류율이 4.2%로 P1-P3 라인 기울기를 사용하는 4개의 모델 중에서 가장 낮았다.

<실험예 3> 개별 항핵항체 반응패턴에 따른 회귀선의 기울기 값 측정

연속 희석 시리즈에서 3개 희석점의 형광강도(FI) 값의 감소경향을 보이는 경우만을 고려할 때, 하기 표 4 및 표 5에 제시된 바와 같이, 회귀선의 기울기 값은 다른 항핵항체 반응패턴과 동일하지 않은 것으로 확인되었다(P<0.0005, ANOVA).

또한, 하기 표 6에 나타난 바와 같이, 2개의 다른 항핵항체 반응패턴 사이의 회귀선의 기울기 값의 다중비교를 살피면, 항핵항체 반응패턴 10쌍 중 6개에서 유의미한 것으로 확인되었다(P<0.05, post-hoc test).

상기 결과로부터 혈청의 선형 기울기는 항핵항체 반응패턴을 반영할 수 있고, 따라서, 그 최종 역가는 상기 산출된 선형 기울기에 기반하여 예측할 수 있다.

실험예 4> 다양한 방법에 의한 적정 오류율 확인

하기 표 7에는 개별 예측 방법에 따른 적정 오류율이 정리되었다(n=759). 항핵항체 반응패턴에 관계없이 모든 시험체를 고려할 때 비교예 1의 단일 웰 적정의 경우 오류율(오류 수/총 수)은 152/674(22.6%)로서, 이전에 보고된 값과 유사한 결과를 보였다.

반면에, 실시예 1의 선형 기울기 기반의 적정 중 회귀선(31/710, 4.4%) 또는 P1-P3선(31/746, 4.2%)은 가장 낮은 오류율을 나타냈으며, 두 방법 모두 단일-웰 적정 오류율 대비 현저히 낮은 오류율을 나타내는 것으로 확인되었다(P<0.000000001).

하기 표 7의 개별 항핵항체 반응패턴에 따른 통계에 따르면, 선형 기술기 기반의 적정(회귀선 또는 P1-P3선)의 오류율이 핵 패턴을 제외한 모든 항핵항체 반응패턴에서 단일-웰 적정 대비 상당히 낮은 결과를 보였다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (5)

1. 자가면역질환 진단을 위한 항핵항체 역가측정 방법에 있어서,
   피검자로부터 채혈된 혈액 중 항핵항체 양성 판정된 혈청 시험체를 준비하고, 피검자의 과거 검사 결과치를 통한 형광강도(FI) 값이나 최종 역가를 고려하여 상기 혈청 시험체의 선별(1:80) 희석혈청으로부터 2 내지 3개의 혈청 희석에 따라 형광강도(Fluorescence Intensity, FI) 값의 선형 기울기 감소 추세에 기반하여 최종 역가(endpoint titer)를 구하는 것으로 이루어진 항핵항체 역가측정 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 최종 역가가 혈청의 희석배수(X축)에 따른 FI 값(Y축)을 선형-로그(X-Y) 모델링하여 산출된 것을 특징으로 하는 항핵항체 역가측정 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 희석배수가 선별(1:80) 희석혈청(D1)으로부터 혈청 희석액(D2)-혈청 희석액(D3)으로 조합되고,
   상기 혈청 희석액(D3)의 역가가 혈청 희석액(D2) 역가의 2배수로 희석된 것을 특징으로 하는 항핵항체 역가측정 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 희석배수가 희석혈청(D1)-혈청 희석액(D2)-혈청 희석액(D3)으로 조합될 때,
   1:80-1:160-1:320 희석조합, 1:80-1:320-1:640 희석조합, 1:80-1:640-1:1280 희석조합, 1:80-1:1280-1:2560 희석조합 및 1:80-1:2560-1:5120 희석조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항핵항체 역가측정 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 항핵항체 역가측정 방법에 의해 혼합형 항핵항체 반응패턴 및 세포질 항핵항체 반응패턴의 역가를 구하는 것을 특징으로 하는 항핵항체 역가측정 방법.

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