KR20210141511A

KR20210141511A - 신규 선택 마커-포함 세포주 및 단백질 생산을 위한 그의 용도

Info

Publication number: KR20210141511A
Application number: KR1020217029997A
Authority: KR
Inventors: 브루노 루이즈 두마스; 모하메드 내빌 루니스
Original assignee: 사노피
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2021-11-23
Also published as: EP3942054A1; BR112021018124A2; CA3134116A1; IL286419A; SG11202110105UA; MX2021011303A; AU2020242966A1; ZA202106718B; TW202102669A; CN113811615A; WO2020188021A1; JP2022526497A; US20220177909A1

Abstract

본 발명은 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 데히드로오로테이트 데히드로게나제 (DHODH) 유전자를 포함하는 세포주 및 재조합 단백질을 생산하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 선택 마커-포함 세포주 및 단백질 생산을 위한 그의 용도

본 발명은 단백질 생산을 위한 세포주 및 선택 마커에 관한 것이다.

재조합 단백질을 산업적 규모로 생산하는 것은 다량의 재조합 단백질을 생산하는 클론의 단리를 요구한다. 이종 유전자를 동물 숙주 세포 내로 도입하고, 첨가된 유전자의 발현에 대해 스크리닝하는 것은 길고 복잡한 과정이다. 이러한 과정은 형질감염 및 안정하게 장기간 발현되는 클론의 선택 및 상응하는 재조합 단백질에 대해 높은 발현율을 갖는 클론에 대한 스크리닝을 수반한다.

발현 벡터로부터 재조합 단백질을 발현하는 클론을 생성하는 경우에, 숙주 세포는 통상적으로 동일한 벡터 상의 관심 단백질 및 선택 마커 둘 다를 코딩하는 DNA 벡터로 형질감염된다. 따라서, 이러한 발현 벡터는 발현 벡터가 존재하는 클론의 선택을 가능하게 하는 선택 마커를 포함한다. 이러한 선택 마커는 또한 형질감염된 DNA의 공동-증폭을 유도하여, 고-생산자 클론의 단리를 가능하게 할 수 있다.

대부분의 선택 마커는 항생제 또는 다른 독성 물질에 대한 내성을 부여하는 단백질 또는 세포 생존에 필수적인 단백질이다. 예를 들어 G418, 히그로마이신, 퓨로마이신, 제오마이신, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 글루타민 신테타제 (GS) 및 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT)를 포함한 여러 이러한 선택 마커가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 특히, GS는 진핵 세포에서의 산업적 재조합 단백질 생산 분야에서 선택 마커로서 널리 사용된다. GS 유전자는 세포 성장에 필수적인 글루타민의 합성을 허용하고, MSX (L-메티오닌 술폭시민)에 의해 억제된다. MSX의 존재 하에, 보다 많은 양의 GS를 발현하는 세포만이 생존한다. 적절한 스크리닝 후에, 외인성 단백질을 생산하는 세포를 선택하는 것이 가능하다.

이전 출원 WO2016/062837에서, 본 발명자들은 선택 마커로서 데히드로오로테이트 데히드로게나제 (DHODH)의 사용에 기초한 발현 시스템을 개발하였다. DHODH는 피리미딘 합성에 요구되는 효소이다. 따라서, DHODH를 억제하는 화합물은 DNA 합성 및 이에 따른 세포 증식을 억제한다. 따라서, 이러한 선택 마커는 DHODH 억제제, 예컨대 레플루노미드 및 테리플루노미드와 조합되어 사용되는 DHODH를 코딩하는 발현 벡터를 포함한다.

그러나, 상기 선택 마커와 함께 사용되는 대부분의 억제제는 독성이다. DHODH 선택 마커의 경우에, 테리플루노미드는, 예를 들어 강력한 면역-억제자이고, 특히 그의 대규모 취급은 안전성 이유로 어려울 수 있다. GS 선택 마커의 경우에, MSX는 고용량에서 경련성이고, 따라서 또한 취급 문제를 일으킬 수 있다. DHFR 선택 마커의 경우에, 메토트렉세이트는 조혈 및 소화 독성을 나타내고, 이에 의해 또한 취급 문제를 일으키는 것으로 공지되어 있다.

따라서, 취급하기 어려운 화합물의 첨가 없이 관심 단백질-생산 클론의 선택을 수행할 수 있는 발현 시스템에 대한 필요가 존재한다.

본 발명은 이러한 필요를 충족시킨다.

본 발명은 관심 단백질-생산 세포가 세포주에서의 DHODH 유전자의 부분 또는 완전 불활성화로 인해 우리딘이 결여된 배지에서 선택될 수 있다는 본 발명자들의 상기 세포주 설계로부터 비롯된다. DHODH 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 이러한 세포주는 우리딘이 보충된 배지에서 전형적으로 성장하지만, 포유동물 DHODH를 코딩하는, 특히 돌연변이된 포유동물 DHODH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 관심 단백질을 발현시키기 위한 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 경우에, 배양 배지는 우리딘이 결여된 배양 배지에 의해 전형적으로 교체되고, 이에 의해 관심 단백질-생산 세포가 선택된다.

이러한 발현 시스템은 선택 압력으로서 억제제의 사용을 피함으로써 생산 세포의 생존율을 증가시키기 때문에 특히 유리하다. 본 발명자들은 이러한 독성의 감소가 높은 생산성과 연관되었다는 것을 추가로 입증하였다.

따라서, 본 발명은 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 데히드로오로테이트 데히드로게나제 (DHODH) 유전자를 포함하는 세포주에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 상기 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.

보다 특정한 실시양태에서, 세포주는 하기 단계에 의해 생산된다:

a) 세포 내의 내인성 DHODH 유전자를, 특히 유전자 편집 방법, 예컨대 CRISPR-Cas9 방법에 의해 불활성화시키는 단계, 및

b) 세포를 우리딘을 포함하는 배양 배지에서 내인성 DHODH 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 세포주를 생성하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계.

특정한 실시양태에서, 상기 세포주의 내인성 DHODH 유전자의 모든 대립유전자는 부분적으로 또는 완전히 불활성화된다.

추가 실시양태에서, 상기 세포주는 외인성 포유동물 DHODH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 재조합 단백질을 발현시키기 위한 적어도 1개의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 상기 외인성 DHODH는 서열식별번호(SEQ ID NO): 2의 서열 또는 서열식별번호: 4의 서열에 대해 적어도 60% 동일한 서열을 포함한다.

그의 특정한 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1의 서열 또는 서열식별번호: 3의 서열을 포함한다.

그의 또 다른 특정한 실시양태에서, 상기 재조합 단백질은 모노클로날 항체이다.

그의 또 다른 특정한 실시양태에서, 상기 벡터는 항체 경쇄의 클로닝에 적합한 제1 발현 카세트 및 항체 중쇄의 클로닝에 적합한 제2 발현 카세트를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기를 포함하는 발현 시스템이다:

(i) 상기 정의된 바와 같은 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 데히드로오로테이트 데히드로게나제 (DHODH) 유전자를 포함하는 세포주, 및

(ii) 외인성 포유동물 DHODH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 재조합 단백질을 발현시키기 위한 적어도 1개의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터이며, 여기서 상기 외인성 DHODH는 서열식별번호: 2의 서열 또는 서열식별번호: 4의 서열에 대해 적어도 60% 동일한 서열을 포함하는 것인 발현 벡터.

특정한 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1의 서열 또는 서열식별번호: 3의 서열을 포함한다.

또 다른 특정한 실시양태에서, 상기 재조합 단백질은 모노클로날 항체이다.

추가의 특정한 실시양태에서, 상기 벡터는 항체 경쇄의 클로닝에 적합한 제1 발현 카세트 및 항체 중쇄의 클로닝에 적합한 제2 발현 카세트를 포함한다.

본 발명은 추가로 (i) 상기 정의된 바와 같은 세포주 또는 상기 정의된 바와 같은 발현 시스템 및 (ii) 우리딘이 결여된 배양 배지에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 생산하는 시험관내 방법에 관한 것이다:

A) a1) 외인성 포유동물 DHODH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 재조합 단백질을 발현시키기 위한 적어도 1개의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 상기 외인성 DHODH는 서열식별번호: 2의 서열 또는 서열식별번호: 4의 서열에 대해 적어도 60% 동일한 서열을 포함하는 것인 상기 정의된 바와 같은 세포주를 제공하는 단계;

또는

a2) 상기 정의된 바와 같은 세포주를 제공하는 단계, 및

a2') 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 단계 a2)에서 제공된 세포주 내로 도입하는 단계;

또는

a3) 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 세포주를 제공하는 단계,

a3') 단계 a3)에서 제공된 세포주 내의 내인성 DHODH 유전자를 부분적으로 또는 완전히 불활성화시키는 단계, 및

a3") 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 단계 a3')에서 수득된 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 세포주 내로 도입하는 단계;

B) 상기 세포주를 재조합 단백질의 생산에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및

C) 상기 재조합 단백질을 단리 및/또는 정제하는 단계.

특정한 실시양태에서, 상기 방법의 단계 B)는 우리딘이 결여된 배양 배지에서 수행된다.

또 다른 특정한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 재조합 단백질을 제약 조성물로 제제화하는 단계 D)를 추가로 포함한다.

본 발명은 추가로 재조합 단백질을 생산하기 위한 상기 정의된 바와 같은 세포주, 상기 정의된 바와 같은 발현 시스템 또는 상기 정의된 바와 같은 키트의 용도에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 세포주, 발현 시스템 또는 키트는 우리딘이 결여된 배양 배지와 조합되어 사용된다.

도 1은 진뱅크(Genbank) NCBI에서 2018년 12월 21일에 이용가능한 진 ID(Gene ID): 100756632 하에 언급된 인간 DHODH 유전자의 게놈 구조를 보여준다.
도 2는 서열 번호1 DHODH 엑손2의 정렬을 보여준다. PAM: 프로토스페이서 인접 모티프 서열 (TGG).
도 3은 선택적 작용제로서 상이한 농도의 테리플루노미드의 존재 하에 항체를 생산하기 위한 상이한 KO (녹-아웃) DHODH 클론의 스크리닝을 보여준다.
도 4는 선택 마커로서 상이한 DHODH 변이체를 사용하여 생산된 단백질의 양 (mg/mL)을 보여준다.
도 5는 인간 DHODH G202A 또는 인간 GS 선택 마커 및 DHODH KO 또는 야생형 CHO 세포를 사용한 제14일에서의 리파제 생산을 보여준다.
도 6은 인간 DHODH G202A 또는 인간 GS 선택 마커 및 DHODH KO 또는 야생형 CHO 세포를 사용한 제14일에서의 모노클로날 항체 mAb-B 생산을 보여준다.
도 7은 인간 DHODH G202A 및/또는 인간 GS 선택 마커 및 DHODH KO 또는 야생형 CHO 세포를 사용한 제14일에서의 이중특이적 항체 생산을 보여준다.
도 8은 인간 DHODH G202A 및 인간 GS 선택 마커 및 DHODH KO 또는 야생형 CHO 세포를 사용한 제14일에서의 삼중특이적 항체 생산을 보여준다.

디히드로오로테이트 데히드로게나제

본원에 사용된 용어 "디히드로오로테이트 데히드로게나제" 또는 "DHODH"는 하기 반응에 의해 나타내어지는 바와 같이 디히드로오로테이트 (4,5-디히드로오로트산 또는 2,6-디옥소-1,3-디아지난-4-카르복실산)의 오로테이트 (오로트산 또는 1,2,3,6-테트라히드로-2,6-디옥소-4-피리미딘카르복실산)로의 전환을 촉매할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다:

(S)-디히드로오로테이트 + O₂ ↔ 오로테이트 + H₂O₂

이러한 폴리펩티드는 효소 위원회 (EC) 번호 1.3.3.1 하에 분류된다. 상기 반응을 촉매할 수 있는 폴리펩티드는 "DHODH 활성"을 나타낸다.

상기 반응은 DNA 및 RNA의 합성에 요구되는 우리딘 모노포스페이트 (rUMP)의 신생 합성에서의 제4 단계이다. 따라서, DHODH의 억제 또는 불활성화는 DNA 및 RNA 합성을 억제하는 효과를 가지며, 이에 따라 세포 증식을 억제한다.

세포주

본 발명은 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 데히드로오로테이트 데히드로게나제 (DHODH) 유전자를 포함하는 세포주에 관한 것이다.

세포주는 진핵 세포주, 예를 들어 포유동물 세포주, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 원숭이 세포주 또는 인간 세포주이다.

특정한 실시양태에서, 세포주는 CHO 세포주이다.

CHO 세포주는 산업적 단백질 생산에 통상적으로 사용되고, 많은 CHO 세포주가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 CHO 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 공중 이용가능한 세포주, 예컨대 CHO-K1 세포주 (ATCC 번호: CCL-61), CHO-S 세포주 (예를 들어 인비트로젠(Invitrogen) 및 깁코(Gibco)에 의해 시판됨), CHO DP-12 세포주 (ATCC 번호 CRL-12444 및 12445) 및 CHO 1-15 세포주 (ATCC 번호 CRL-9606)를 포함한다. 산업적 단백질 생산에 적합한 또 다른 세포주는 CHO 9E4 세포주이다. 9E4 세포주는 CHO-K1 세포주의 클론으로부터 단일 세포 클로닝 과정을 통해 확립되었다. 9E4 세포주의 확립은 실시예 1에 보다 심도있게 제시된다. CHO-K1 세포주는 푹(Puck)에 의해 1957년에 수득되었고, ATCC에 번호 CCL-61 하에 기탁되었다.

인간 세포, 예컨대 HEK293 (ATCC 번호 CRL-1573), HKB11 (ATCC 번호 CRL-12568), PER-C6 (크루셀(Crucell)), HT1080 (ATCC 번호 CRL-121), Jurkat, Daudi, Raji 및 CAP (ATCC 번호 CRL-1098) 세포가 또한 재조합 인간 단백질에 대한 천연 글리코실화 패턴을 수득하기 위해 단백질 생산에 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 세포주는 무혈청 배지 (예를 들어, 화학적-한정 배지)에서 및/또는 현탁액에서 성장할 수 있다. 이러한 세포주는 모 세포주를 무혈청 배지 및/또는 현탁액에서 성장하도록 적합화시킴으로써 (예를 들어, 단일 세포 클로닝을 통해, 점진적 적응을 통해 및/또는 "고갈 및 절약" 과정을 통해) 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 수득될 수 있다.

본 발명의 세포주는 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 데히드로오로테이트 데히드로게나제 (DHODH) 유전자를 포함하는 세포주이다.

"내인성 DHODH 유전자"는 본원에서 특정한 환경 조건 하에 특정한 발생 단계에서 상기 특정한 세포에 정상적으로 존재하는 DHODH 유전자를 의미한다.

"내인성 DHODH 유전자"는 상기 외인성 DHODH가 하기 정의된 발현 벡터에 의해 제공된다는 점에서 하기 정의된 "외인성 DHODH"와 구별되며, 이는 상기 발현 벡터가 상기 세포주에 도입된 경우에 본 발명의 세포주에 존재할 수 있다.

통상의 기술자로부터 이해되는 바와 같이, 내인성 DHODH 유전자는 세포주에 좌우될 것이다. 예를 들어, CHO 세포주에서, 내인성 DHODH 유전자는 차이니즈 햄스터 DHODH 유전자이고; 인간 세포주에서, 내인성 DHODH 유전자는 인간 DHODH 유전자이다.

전형적으로, 야생형 차이니즈 햄스터 DHODH는 서열식별번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 서열, 뿐만 아니라 DHODH 활성을 나타내는 그의 변이체를 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 햄스터 종에서 자연 발생하는 변이체 (예컨대 대립유전자 변이체 또는 스플라이스 변이체)에 상응할 수 있다.

전형적으로, 야생형 인간 DHODH는 서열식별번호: 4를 포함하거나 이로 이루어진 서열, 뿐만 아니라 DHODH 활성을 나타내는 그의 변이체를 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 인간 종에서 자연 발생하는 변이체 (예컨대 대립유전자 변이체 또는 스플라이스 변이체)에 상응할 수 있다.

본원에 사용된 "유전자"는 유전자 산물을 코딩하는 DNA 영역, 뿐만 아니라 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역 (이러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접하든 그렇지 않든)을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함한다.

유전자 "불활성화"는 상응하는 야생형 세포와 비교하여 유전자 발현의 임의의 감소를 지칭한다. 유전자 불활성화는 완전 (전체 불활성화 또는 녹-아웃)일 수 있거나 또는 부분 (예를 들어, 유전자가 정상보다 더 낮은 발현 수준을 나타내는 하이포모르프(hypomorph), 또는 영향을 미치는 활성의 부분 감소를 나타내는 돌연변이체 유전자의 산물)일 수 있다.

특정한 실시양태에서, 내인성 DHODH 유전자의 모든 대립유전자는 부분적으로 또는 완전히 불활성화된다.

특정한 실시양태에서, 상기 내인성 DHODH 유전자는 완전히 불활성화된다.

보다 특정한 실시양태에서, 내인성 DHODH 유전자의 모든 대립유전자는 완전히 불활성화된다.

특정한 실시양태에서, 내인성 DHODH 유전자는 문헌 [Aga et al. (2015) BMC Proceedings 9(suppl 9):P2]에 기재된 바와 같은 CRISPR-Cas9 방법을 사용하여 불활성화된다.

통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, CRISPR-Cas9 시스템은 Cas9 뉴클레아제가 부위-특이적 DNA 절단을 유도하도록 가이드하는 비코딩 RNA를 사용하는 원핵 적응 면역 반응 시스템이다. 이러한 DNA 손상은 비-상동 말단 연결 DNA 복구 경로 (NHEJ) 또는 상동성-지정 복구 (HDR) 경로를 통한 세포 DNA 복구 메카니즘에 의해 복구된다. 유전자 파괴를 생성하기 위해, DNA 표적에 특이적인 crRNA 서열 및 Cas9 단백질과 상호작용하는 tracrRNA 서열로 이루어진 단일 가이드 RNA (gRNA)는 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 Cas9 단백질의 재조합 형태에 결합한다. 생성된 복합체는 표적-특이적 이중-가닥 DNA 절단을 유발할 것이다. 절단 부위는 유전자 기능을 파괴할 수 있는 삽입/결실 (INDEL)을 생성할 수 있는 오류-유발 과정인 비상동 말단 연결 (NHEJ) DNA 복구 경로에 의해 복구될 것이다.

특정한 실시양태에서, DHODH 유전자의 적어도 1개의 엑손이, 특히 유전자 편집 방법, 예컨대 CRIPR-Cas9 방법에 의한 불활성화를 위해 표적화된다. 보다 특정한 실시양태에서, DHODH 단백질의 N-말단 부분을 코딩하는 DHODH 유전자의 부분이, 특히 유전자 편집 방법, 예컨대 CRISPR-Cas9 방법에 의한 불활성화를 위해 표적화된다. 또 다른 실시양태에서, DHODH 유전자의 제2 엑손이, 특히 유전자 편집 방법, 예컨대 CRISPR-Cas9 방법에 의한 불활성화를 위해 표적화된다.

한 실시양태에서, 서열 CAAGGATGATGGCTGCATCC (서열식별번호: 23) 또는 서열 GGATGCAGCCATCATCCTTG (서열식별번호: 5)의 20-뉴클레오티드 서열 또는 CHO 생존을 손상시키지 않으면서 녹 아웃 DHODH 유전자와 상용성인 임의의 서열이 DHODH 유전자의 제2 엑손을 표적화하는 gRNA를 생성하기 위한 상응하는 DNA 조각으로서 사용된다. 이러한 gRNA는 전형적으로 서열 CACCGCACCGGGATGCAGCCATCATCCTTG (서열식별번호: 6) 및 AAAACCAAGGATGATGGCTGCATCC (서열식별번호: 7)의 올리고뉴클레오티드를 사용하거나 또는 서열 GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT (서열식별번호: 24) 및 CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG (서열식별번호: 25)의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수득되며, 이들은 전형적으로 플라스미드의 고유한 제한 부위, 예컨대 pCM3561 플라스미드 (인비트로젠에 의해 상품화됨)의 BaeI 부위에서 클로닝되고, 이에 따라 클로닝된 DNA 서열은 U6 프로모터의 제어 하에 있으면서, 상기 플라스미드가 세포 내로 도입되었을 때, tracrRNA에 융합된 crRNA를 함유하는 단일 전사 단위로 전사되며, 여기서 crRNA 부분은 DHODH 유전자의 제2 엑손에 특이적이고 tracrRNA 부분은 Cas9 효소에 의해 인식된다.

DHODH 유전자에 대해 불활성화된 세포주를 확인하기 위해, 단일 세포는 전형적으로 웰 플레이트에서 한계 희석에 의해 단리되고, 적절한 전면생장률, 예를 들어 90% 전면생장률에 도달한 후, 세포는 적어도 2가지 조건, 예컨대 우리딘이 보충된 배양 배지 내 하나의 조건 및 우리딘이 결여된 배양 배지 내 또 다른 조건으로 분할된다. 관심 클론은 전형적으로 우리딘의 결여에 감수성인 클론이다.

단리되면, 이들 관심 세포는 피리미딘 염기를 포함하는 배양 배지, 특히 우리딘을 포함하는 배양 배지에서 배양될 수 있다.

"피리미딘 염기"는 본원에서 피리미딘 그 자체 및 골격으로서 피리미딘 핵을 갖는 다양한 피리미딘 유도체를 의미한다. 이러한 피리미딘 염기의 예는 우라실 핵산-관련 물질, 예컨대 우라실, 우리딘, 우리딘 포스페이트, 특히 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 우리딘 디포스페이트 (UDP) 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 데옥시우리딘, 데옥시우리딘 포스페이트, 특히 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트 (dUDP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP); 시토신 핵산-관련 물질, 예컨대 시토신, 시티딘, 시티딘 포스페이트, 특히 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 시티딘 디포스페이트 (CDP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 데옥시시티딘, 2'-데옥시시티딘, 데옥시시티딘 포스페이트, 특히 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP), 데옥시시티딘 디포스페이트 (dCDP) 및 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP); 티민, 티미딘, 티미딘 포스페이트, 특히 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 티미딘 디포스페이트 (TDP) 및 티미딘 트리포스페이트 (TTP), 데옥시티미딘, 데옥시티미딘 포스페이트, 특히 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트 (dTDP) 및 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 오로테이트를 포함한다.

특정한 실시양태에서, 상기 피리미딘 염기는 우리딘이다.

"우리딘"은 본원에서 하기 화학식의 뉴클레오시드를 의미한다.

"우리딘이 결여된 배양 배지"는 특정한 세포주의 성장에 적합한 임의의 기초 배양 배지를 의미하며, 여기서 상기 배지는 1 mM 미만의 우리딘을 포함하고, 특히 상기 배지는 어떠한 우리딘도 포함하지 않는다.

"우리딘을 포함하는 배양 배지"는 특정한 세포주의 성장에 적합한 임의의 기초 배양 배지를 의미하며, 여기서 상기 배지는 1 mM 내지 25 mM의 우리딘, 특히 5 mM 내지 10 mM의 우리딘을 추가로 포함한다.

"기초 배양 배지"는 본원에서 세포, 예를 들어 CHO 세포에 대한 노출에 적합한 비보충 배지를 의미한다. 통상의 기술자에 의해 이해될 바와 같이, 사용되는 기초 배양 배지는 사용되는 세포의 유형에 좌우될 것이다. 기초 배양 배지의 예는 CDCHO 배지, 옵티CHO(OPTiCHO)™ 배지, 펙토 CHO(Fecto CHO)™ 배지, 포르티CHO(FortiCHO)™ 배지, 엑스피CHO(ExpiCHO)™ 배지, 엑스-셀(Ex-Cell)™ 배지, 악티프로(ActiPRO)™ 배지, MAM PF77™ 배지 및 파워CHO(PowerCHO)™ 배지를 포함한다.

특정한 실시양태에서, 기초 배양 배지는 글루타민, 전형적으로 4 내지 6 mM의 글루타민이 추가로 보충된다.

따라서, 특정한 실시양태에서, 본 발명의 세포주는 하기 단계에 의해 생산된다:

CRISPR-Cas9 접근법에 의해 완전히 또는 부분적으로 불활성화된 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 CHO 세포주의 생산은 실시예 2 및 3에 보다 심도있게 예시된다.

완전히 또는 부분적으로 불활성화된 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 세포주, 예컨대 CHO 세포주의 생산은 관련 기술분야에 공지된 다양한 다른 분자 생물학 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 완전히 또는 부분적으로 불활성화된 내인성 DHODH 유전자를 갖는 세포주를 생성하는데 유용한 다른 유전자 편집 기술은 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 전사 인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)의 사용을 포함한다. Cre/Lox 방법은 또한 DHODH 유전자의 1개 이상 또는 모든 대립유전자를 녹-아웃시키는데 사용될 수 있다.

특정한 실시양태에서, 본 발명의 세포주는 하기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 추가로 포함한다.

상기 발현 벡터는 통상의 기술자에게 널리 공지된 임의의 적합한 기술, 예컨대 형질감염, 특히 전기천공 또는 화학적 형질감염 또는 형질도입에 의해 세포주 내로 도입될 수 있다.

특정한 실시양태에서, 본 발명의 상기 세포주는 본 발명의 발현 벡터와 상이한 선택 마커를 포함하는 추가의 발현 벡터, 전형적으로 글루타민 신테타제를 코딩하는 서열을 포함하는 추가의 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다.

외인성 DHODH

본 발명에서 사용된 발현 벡터에 의해 코딩되는 DHODH (추가로 "외인성 DHODH"로 지칭됨)는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 4에 대해 적어도 60%, 62%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%; 92%; 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이는 또한 단백질이 DHODH 활성을 보유하는 한, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 4의 적어도 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개의 연속 아미노산의 단편을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 외인성 DHODH는 서열식별번호: 2의 서열 및 서열식별번호: 4의 서열 둘 다에 대해 적어도 60%, 62%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%; 92%; 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 외인성 DHODH는 인간 DHODH, 즉 인간 기원의 DHODH이다.

본원에 사용된 용어 "인간 DHODH"는 서열식별번호: 4를 포함하거나 이로 이루어진 서열의 단백질, 뿐만 아니라 DHODH 활성을 나타내는 그의 변이체를 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 인간 종에서 자연 발생하는 변이체 (예컨대 대립유전자 변이체 또는 스플라이스 변이체)에 상응할 수 있다. 대안적으로, 이러한 변이체는 유전자 조작에 의해 수득된 변이체에 상응할 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 변이체는 서열식별번호: 4와 비교하여 최대 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18,17,16,15,14,13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 변이 (상기 변이는 치환, 삽입 및 결실을 포함함)의 존재만이 서열식별번호: 4의 서열과 상이하다.

특정한 실시양태에서, 상기 인간 DHODH는 야생형 서열과 비교하여 G202A 돌연변이를 포함하는 변이체, 전형적으로 아미노산 서열 서열식별번호: 26을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이다.

일부 실시양태에서, 외인성 DHODH는 햄스터 DHODH, 즉 햄스터 기원의 DHODH이다. 햄스터 DHODH는, 예를 들어 차이니즈 햄스터 (세툴루스 그리세우스(Cetulus griseus)) DHODH일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "차이니즈 햄스터 DHODH"는 서열식별번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 서열, 뿐만 아니라 DHODH 활성을 나타내는 그의 변이체를 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 햄스터 종에서 자연 발생하는 변이체 (예컨대 대립유전자 변이체 또는 스플라이스 변이체)에 상응할 수 있다. 대안적으로, 이러한 변이체는 유전자 조작에 의해 수득된 변이체에 상응할 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 변이체는 서열식별번호: 2와 비교하여 최대 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 변이 (상기 변이는 치환, 삽입 및 결실을 포함함)의 존재만이 서열식별번호: 2의 서열과 상이하다.

또 다른 실시양태에서, 변이체 DHODH는 DHODH 활성, 임의로 야생형 단백질과 동일한 수준의 활성, 또는 야생형 단백질의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140% 또는 그 초과의 수준의 활성을 가질 것이다.

본 발명의 질의 아미노산 서열에 대해 적어도, 예를 들어 95% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 의해, 대상 폴리펩티드 서열이 질의 아미노산 서열의 각각의 100개의 아미노산당 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 대상 폴리펩티드의 아미노산 서열이 질의 서열과 동일한 것으로 의도된다. 다시 말해서, 질의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해서는, 대상 서열 내 아미노산 잔기의 5% (100개 중 5개) 이하가 삽입되거나, 결실되거나 또는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.

서열 동일성은 변이체 서열의 전장, 참조 서열의 전장 또는 둘 다에 걸쳐 결정될 수 있다. 예를 들어, 동일성의 백분율은 전반적 정렬을 사용하여 계산될 수 있다 (즉, 2개의 서열이 그의 전체 길이에 걸쳐 비교됨). 2개 이상의 서열의 동일성 및 상동성을 비교하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch)의 전반적 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453)을 사용하여 2개 서열의 최적 정렬 (갭 포함)을 그의 전체 길이를 고려하면서 찾아내는 "니들" 프로그램이, 예를 들어 전반적 정렬을 수행하는 경우에 사용될 수 있다. 이러한 니들 프로그램은, 예를 들어 ebi.ac.uk 월드 와이드 웹 사이트에서 이용가능하다. 본 발명에 따른 동일성의 백분율은 바람직하게는 10.0인 "갭 개방(Gap Open)" 파라미터, 0.5인 "갭 연장(Gap Extend)" 파라미터, 블로섬(Blosum)62 매트릭스를 사용한 EMBOSS::니들 (전반적) 프로그램을 사용하여 계산된다.

참조 서열의 변이체는 참조 서열과 비교하여 돌연변이, 예컨대 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 치환의 경우에, 치환은 바람직하게는 하기 표에 나타낸 바와 같은 보존적 치환에 상응한다.

발현 벡터

본 발명의 문맥에 사용된 발현 벡터는 재조합 단백질의 생산에 적합하고, 디히드로오로테이트 데히드로게나제 (DHODH)를 코딩하는 서열을 포함한다.

발현 벡터는 바람직하게는 DNA 벡터이다.

본 발명의 문맥에 사용된 발현 벡터는 상기 섹션 "외인성 DHODH"에 정의된 바와 같은 외인성 DHODH를 코딩하는 서열을 포함한다.

구체적 실시양태에서, 발현 벡터가 도입될 세포주는 CHO 세포주이고, 외인성 DHODH는 이종 기원의 것이다 (즉, 외인성 DHODH는 햄스터 DHODH가 아님).

이러한 외인성 DHODH를 코딩하는 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 대안적으로, 이러한 DHODH를 코딩하는 서열의 삼중 코돈은 CHO 세포에서의 발현을 위해 편향될 수 있다. 최적 발현을 수득하기 위해 서열을 편향시키기 위한 소프트웨어 및 알고리즘은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Raab et al. (2010) Syst Synth Biol. 4:215-225]에 기재된 알고리즘을 포함한다. 이러한 알고리즘은 발현을 위한 최상의 이용가능한 코돈을 제공할 뿐만 아니라, GC 함량 및 비-목적 DNA 모티프의 부재를 고려한다.

예를 들어, 외인성 DHODH를 코딩하는 서열은 서열식별번호: 3의 서열 (즉, CHO 세포에서의 최적 발현을 위해 설계된 서열식별번호: 4의 인간 DHODH를 코딩하는 서열) 및/또는 서열식별번호: 1의 서열 (즉, CHO 세포에서의 최적 발현을 위해 설계된 서열식별번호: 2의 햄스터 DHODH를 코딩하는 서열)에 대해 적어도 60%, 62%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

한 실시양태에서, 외인성 DHODH를 코딩하는 서열은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

본 발명의 문맥에 사용된 발현 벡터에서, 상기 정의된 외인성 DHODH를 코딩하는 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다.

예를 들어, 상기 정의된 외인성 DHODH를 코딩하는 서열은, 예를 들어 DHODH의 발현을 구동하는데 적합한 프로모터, 예를 들어 원숭이 공포형성 바이러스 40 (SV40) 프로모터 (예를 들어 SV40의 후기 또는 초기 프로모터), CMV 프로모터, 신장 인자 1 프로모터, GAPDH 프로모터, RPL37 프로모터, 액틴 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다. 초기 SV40 프로모터는, 예를 들어 문헌 [Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310 및 Moreau et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:6047-6068]에 기재되어 있다. 특히, 상기 SV40 프로모터는 전장 프로모터이다. 상기 SV40 프로모터는 또한 72bp 반복부를 함유하는 복제 기점을 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 SV40 프로모터는 위치 128 내지 270이 제거된 SV40 프로모터가 아니며, 즉 상기 SV40 프로모터는 KIST 생물공학 연구소 유전자 은행(Gene Bank, Institute of Bioengineering, KIST)에 1997년 12월 17일에 기탁 번호: KCTC 8860 P 하에 기탁된 이. 콜라이(E. coli) 형질전환체를 형질전환시키는, 한국 특허 번호 10-0267720에 기재된 SV40 프로모터가 아니다.

다른 실시양태에서, 상기 정의된 외인성 DHODH를 코딩하는 서열은 SV40 프로모터의 제어 하에 놓이지 않는다.

재조합 단백질의 생산에 적합한 발현 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이러한 벡터는 전형적으로 생산이 요망되는 재조합 단백질의 클로닝 및 발현을 가능하게 하는 적어도 1개의 발현 카세트 및 복제 기점을 포함하는 발현 벡터에 상응한다. 발현 카세트는 전형적으로 5' 비번역 영역 (프로모터 및 임의로 인핸서 서열을 포함하거나 이로 이루어짐), 재조합 단백질을 코딩하는 서열의 클로닝을 가능하게 하는 1개 이상의 제한 부위, 3' 비번역 영역 (예를 들어 폴리A 신호) 및 임의로 1개 이상의 인트론을 포함한다. 프로모터 서열은 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 강한 프로모터, 예컨대, 예를 들어 인간 CMV 프로모터에 상응할 수 있다. 임의로, 본 발명의 문맥에 사용된 발현 벡터는 원핵 복제 기점 (예를 들어, 원핵 레플리콘, 예컨대 이. 콜라이 내의 ColE1) 및 적어도 원핵생물-선택적 마커 유전자 (원핵 선택 마커로도 공지됨)를 포함하여, 벡터가 원핵 세포에서 복제되도록 한다. 벡터를 복제하는 세포는 또한 원핵생물-선택적 마커 유전자를 발현하고, 따라서 확인 및 선택될 수 있다. 원핵생물-선택적 마커 유전자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 원핵생물-선택적 마커 유전자의 예는, 예를 들어 항생제 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어 암피실린, 클로람페니콜, 블라스티시딘 또는 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 서열)이다.

재조합 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 관심있는 임의의 단백질에 상응할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단백질"은 펩티드 (즉, 50개 미만의 아미노산의 아미노산 쇄), 폴리펩티드 (즉, 적어도 50개의 아미노산의 아미노산 쇄), 단량체 단백질 (즉, 1개의 아미노산 쇄로 이루어진 단백질) 및 다량체 단백질 (즉, 2개 이상의 아미노산 쇄로 이루어진 단백질, 예컨대, 예를 들어 모노클로날 항체)을 포괄하는 것으로 의도된다.

본 발명의 문맥에 사용된 발현 벡터는 전형적으로 단백질을 구성하는 상이한 아미노산 쇄의 수와 동일한 수의 발현 카세트 (예를 들어, 단량체 단백질 또는 동종이량체 단백질의 경우에 1개의 발현 카세트, 이종이량체 단백질 또는 모노클로날 항체의 경우에 2개 등)를 포함한다.

대안적으로, 본 발명의 문맥에 사용된 발현 벡터는 이종이량체 단백질 또는 모노클로날 항체의 생산이 요망되는 경우에도 단지 1개의 발현 카세트만을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 단백질의 다른 아미노산 쇄(들)를 코딩하는 서열(들)은 별개의 발현 벡터 상에 존재하며, 이는 본 발명에 따른 발현 벡터와 함께 숙주 세포주, 특히 CHO 세포주 내로 공동-형질감염된다.

이러한 경우에, 보충적인 별개의 발현 벡터는 본원에 기재된 DHODH 선택 마커와 상이한 선택 마커, 예컨대 DHFR, GS 또는 HPRT를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 문맥에 사용된 발현 벡터는 발현 카세트가 결여되어 있을 수 있다. 이러한 경우에, 재조합 단백질의 발현에 적합한 발현 카세트(들)는 별개의 벡터 상에 존재하며, 이는 본 발명에 따른 발현 벡터와 함께 숙주 세포주, 특히 본 발명의 DHODH-불활성화 세포주, 보다 특히 본 발명의 DHODH-불활성화 CHO 세포주 내로 공동-형질감염된다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 문맥에 사용된 발현 벡터는 하기를 포함한다:

- 초기 SV40 프로모터의 제어 하에 놓인, 상기 정의된 바와 같은 외인성 DHODH를 코딩하는 서열;

- 항체의 경쇄를 코딩하는 서열이 CMV 프로모터의 제어 하에 놓인 제1 발현 카세트;

- 항체의 중쇄를 코딩하는 서열이 CMV 프로모터의 제어 하에 놓인 제2 발현 카세트;

- 원핵 복제 기점; 및

- 원핵 세포에서 사용하기 위한 선택 마커, 즉 그의 천연 프로모터의 제어 하에 놓인, 암피실린에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 서열.

본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "재조합 단백질"은 생산이 요망되는 임의의 재조합 단백질을 지칭한다. 이는, 예를 들어 치료 및/또는 예방 단백질, 즉 의약 (백신 포함)으로서 사용하기 위한 것으로 의도된 단백질에 상응할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 생산이 요망되는 재조합 단백질은 DHODH가 아니다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 생산이 요망되는 재조합 단백질은 항체, 예를 들어 모노클로날 항체이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 생산이 요망되는 재조합 단백질은 항원 단백질이다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 임의의 이소형, 예컨대 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (이중특이적 및 삼중특이적 항체 포함), 항체 단편 (예컨대, 예를 들어 Fv, scFv, ds, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂ 단편), 단일 도메인 항체 및 그의 단편, 및 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 특이적 항원과 반응성인 항체는 재조합 방법, 예컨대 파지 또는 유사한 벡터 내의 재조합 항체의 라이브러리의 선택에 의해, 또는 항원 또는 항원-코딩 핵산으로 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다.

본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체이며, 즉 이러한 집단을 형성하는 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 본질적으로 동일하다. 이들 항체는 단일 에피토프 (또는 다중특이적 모노클로날 항체의 경우에 단일 에피토프 군)에 대해 지시되고, 따라서 고도로 특이적이다.

전형적 모노클로날 항체는 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 함유한다. 각각의 가변 영역은 "상보성-결정 영역" ("CDR") 또는 "초가변 영역"으로 불리는 3개의 절편을 함유하며, 이는 주로 항원의 에피토프에 결합하는 것을 담당한다. 이들은 통상적으로 N-말단으로부터 순차적으로 넘버링하여 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991] 참조). 가변 영역의 보다 고도로 보존된 부분은 "프레임워크 영역"으로 불린다.

모노클로날 항체는, 예를 들어 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다.

모노클로날 항체는 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적 항체일 수 있다.

생산이 요망되는 재조합 단백질이 모노클로날 항체인 경우에, 본 발명에 따른 발현 벡터는 항체 경쇄의 클로닝에 적합한 제1 발현 카세트 및 항체 중쇄의 클로닝에 적합한 제2 발현 카세트를 포함할 수 있다.

구체적 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 발현 카세트는 각각 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예를 들어 인간 또는 뮤린 CMV로부터의 CMV 프로모터를 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 제1 및 제2 발현 카세트는 하기를 포함한다:

- CMV 극초기 인핸서 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Teschendorf et al. (2002) Anticancer Res. 22:3325-3330]에 기재된 서열을 갖는 것); 또는

- 마우스 CMV로부터의 IE2 프로모터/인핸서 영역 (예를 들어, 문헌 [Chatellard et al. (2007) Biotechnol Bioeng. 96:106-117]에 기재된 서열을 갖는 것); 또는

- hCMV-MIE 조절 요소 (예를 들어, WO 89/01036에 기재된 서열을 갖는 것).

용어 "항원 단백질"은 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 단독으로 또는 아주반트와 조합하여 면역 반응을 생성할 수 있는 임의의 단백질을 포괄한다. 이는 예방 백신에서 또는 치료 백신에서 사용하기 위한 것으로 의도될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항원 단백질은 백신 단백질, 즉 예방 백신에 사용하기 위한 것으로 의도된 단백질이다.

발현 벡터는 관심 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 1개의 서열 (예를 들어, 단량체 단백질을 코딩하는 1개의 서열, 항체 쇄를 코딩하는 1개의 서열, 또는 각각 항체 경쇄 및 항체 중쇄를 코딩하는 2개의 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 비어있을 수 있다 (즉, 관심 재조합 단백질을 코딩하는 이러한 서열이 결여됨).

발현 시스템, 키트, 방법 및 용도

본 발명은 하기를 포함하는 발현 시스템을 제공한다:

(i) 상기 섹션 "세포주"에 정의된 바와 같이 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 DHODH 유전자를 포함하는, 상기 섹션 "세포주"에 정의된 바와 같은 세포주, 및

(ii) 상기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 발현 벡터.

본 발명의 발현 시스템은 각각 DHODH와 상이한 선택 마커, 예컨대 DHFR, GS 또는 HPRT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 재조합 단백질을 발현시키기 위한 적어도 1개의 발현 카세트를 포함하는 보충적인 별개의 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 발현 시스템은 상기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 보충적 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 (i) 상기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 발현 벡터 또는 본 발명에 따른 발현 시스템을 포함하는 본 발명에 따른 세포주 및 (ii) 상기 정의된 바와 같은 우리딘이 결여된 배양 배지를 포함하는 키트를 제공한다.

키트는 상기 기재된 바와 같은 외인성 DHODH-코딩 발현 벡터 (발현 시스템 내)를 포함할 수 있다. 이러한 키트에서, 벡터는 바람직하게는 비어있으며, 이것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 관심있는 단백질의 클로닝을 가능하게 하기 때문이다. 추가로, 발현 벡터는 바람직하게는 이러한 키트에서 세포주로부터 단리된다.

키트는 상기 섹션 "세포주"에 정의된 바와 같은 우리딘이 결여된 배양 배지를 추가로 포함한다.

키트는 세포주의 배양에 적합한 배지, 벡터를 세포주 내로 형질감염시키는데 적합한 배지, 패키징 물질 및/또는 발현 시스템의 사용에 대한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.

특정한 실시양태에서, 키트는 DHODH 억제제가 결여되어 있다.

DHODH 억제제의 예는 비신코닌산, 브레퀴나르 (6-플루오로-2-(2'-플루오로-1,1'-비페닐-4-일)-3-메틸-4-퀴놀린 카르복실산), 나프토퀴논 유도체, 예컨대 디클로로알릴 로손, 이속사졸 유도체, 예컨대 레플루노미드 (5-메틸-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-이속사졸-4-카르복스아미드) 및 그의 활성 대사물 테리플루노미드 ((2Z)-2-시아노-3-히드록시-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]부트-2-엔아미드), 퀴놀론 카르복실산, 나프토퀴논, 이속사졸, 페녹시퀴놀린, 레독살 및 유도체, 로손, 라파콜, 아토바쿠온 및 (8-클로로-4-(2-클로로-4-플루오로-페녹시)퀴놀린)을 포함한다. DHODH의 억제제는 DHODH 활성을 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%만큼 억제할 수 있다.

특정한 실시양태에서, 키트는 테리플루노미드가 결여되어 있다.

본 발명은 시험관내에서 재조합 단백질을 생산하기 위한, 상기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 본 발명에 따른 세포주, 본 발명에 따른 발현 시스템 또는 본 발명에 따른 키트의 용도를 추가로 제공한다.

특정한 실시양태에서, 상기 세포주, 발현 시스템 또는 키트는 상기 정의된 바와 같은 우리딘이 결여된, 보다 특히 DHODH 억제제가 부재하는 배양 배지와 조합되어 사용된다.

본 발명은 시험관내에서, 특히 DHODH 억제제의 부재 하에 높은 수준의 재조합 단백질을 생산하는 클론 세포 ("고생산 클론")를 단리하기 위한, 본 발명에 따른 발현 시스템, 상기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 본 발명에 따른 세포주 또는 본 발명에 따른 키트의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "높은 수준의 재조합 단백질"은 배양 배지에서 재조합 단백질의 농도가 적어도 0.05 g/l, 바람직하게는 적어도 0.1 g/l, 보다 바람직하게는 적어도 0.2 g/l, 보다 바람직하게는 0.3 내지 1 g/l인 것을 의미하는 것으로 의도된다. 재조합 단백질의 농도는 특히 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 웨스턴 블롯, 캘리퍼 기술 및 재조합 단백질에 상응하는 정제된 단백질의 농도 범위를 포함한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 생산하는 시험관내 방법을 추가로 제공한다:

A) a1) 상기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 본 발명에 따른 세포주를 제공하는 단계;

또는

a2) 본 발명에 따른 세포주를 제공하는 단계, 및

a2') 상기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 단계 a2)에서 제공된 세포주 내로 도입하는 단계;

또는

a3) 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 세포주를 제공하는 단계,

a3") 상기 섹션 "발현 벡터"에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 단계 a3')에서 수득된 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 세포주 내로 도입하는 단계;

C) 상기 재조합 단백질을 단리 및/또는 정제하는 단계.

특정한 실시양태에서, 상기 방법의 단계 B)는 우리딘이 결여된, 보다 특히 또한 DHODH 억제제가 결여된 배양 배지에서 수행되고, 특히 우리딘의 부재에도 불구하고, 특히 추가로 DHODH 억제제의 부재 하에 성장하는 형질감염된 세포를 선택하는 것으로 이루어진 하위-단계를 포함한다.

본 발명은 하기 단계를 포함하거나 이로 이루어진, 높은 수준의 재조합 단백질을 생산하는 클론 세포를 단리하는 시험관내 방법을 추가로 제공한다:

또는

a2) 본 발명에 따른 세포주를 제공하는 단계, 및

또는

a3) 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 세포주를 제공하는 단계,

C) 높은 수준의 재조합 단백질을 생산하는 클론을 단리하는 단계.

상기 발현 벡터는 단계 a2') 또는 a3")에서 통상의 기술자에게 널리 공지된 임의의 기술에 의해, 예컨대 형질감염에 의해, 특히 전기천공 또는 화학적 형질감염 또는 형질도입에 의해 상기 세포주 내로 도입될 수 있다.

재조합 단백질의 생산에 적합한 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 실시예에 기재된 프로토콜이 사용될 수 있다.

구체적 실시양태에서, 단계 B)에서 사용된 배양 배지는 감소하는 농도의 우리딘을 포함한다. 이는 벡터-유래 외인성 DHODH 유전자 (및 따라서 재조합 단백질을 코딩하는 서열)가 증폭된 클론을 선택하는 것을 가능하게 한다.

상기 방법은 재조합 단백질을 제약 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

명세서 전반에 걸쳐, 용어, 예컨대 "포함한다", "포함된" 및 "포함하는"은 대부분의 특허 관할구역에서, 바람직하게는 해당 관할구역에서 이들에 기인하는 의미를 가지며; 예를 들어 이들은 "포함한다", "포함된", "포함한" 등을 의미할 수 있다. 용어, 예컨대 "이루어진", "본질적으로 이루어진" 및 "본질적으로 이루어진다"는 대부분의 특허 관할구역에서, 바람직하게는 해당 관할구역에서 이들에 기인하는 의미를 가지며; 예를 들어 이들은 모든, 대부분 또는 무시할만한 양을 제외한 모든 다른 요소의 배제를 암시하고, 이들은 명백하게 언급되지 않은 요소를 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 또는 본 발명의 기초 또는 신규 특징에 영향을 미치는 요소는 배제한다.

여러 문헌이 본 명세서의 텍스트 전반에 걸쳐 인용된다. 본원에 인용된 각각의 문헌 (임의의 학술지 논문 또는 요약서, 공개 또는 비공개된 특허 출원, 허여된 특허, 제조업체의 명세서, 지침서 등 포함)은 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 본원에 인용된 임의의 문헌이 실제로 본 발명에 관한 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예를 참조하여 추가로 기재될 것이며, 이는 단지 예시적이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명은 청구범위에 의해 정의되며, 이는 발명의 상세한 설명 및 도면의 보조 하에 해석되어야 한다.

서열의 간단한 설명

실시예

실시예 1: CHO 9E4 세포주의 수득

본 실시예는 ATCC로부터 번호 ATCC CCL-61 하에 상업적으로 입수가능한 CHO-K1 세포주로부터 CHO 9E4 세포주를 수득하는 것을 기재한다.

1. CHO-K1 세포주

1969년에 소 혈청의 존재 하에 동결된 CHO-K1 세포 (ATCC CCL-61)의 바이알을 ATCC로부터 입수하였다.

2. 엑스-셀™ 302 배지에서의 바이알의 해동 및 CHO-LG-APF 뱅크의 제조

CHO-K1 바이알을 4 mM 글루타민이 보충된 엑스-셀™ 302 배지 (SAFC)에서 직접 해동하고, 정적 지지체 상에서, 이어서 스피너 안에서 증폭시켰다. 생성된 CHO-LG-APF 뱅크를 12 계대 및 17.3 세대 후에 엑스-셀™ 302 배지에서 동결시켰다.

3. 엑스-셀™ 302 배지에서의 CHO-LG-APF 뱅크의 해동 및 ABC-024 P22 뱅크의 제조

CHO-LG-APF 바이알을 엑스-셀™ 302 배지에서 해동하고, 증폭시켰다. 생성된 ABC-024 P22 뱅크를 18.5 세대 후에 해동하였다.

4. CMV07-024 뱅크의 CDCHO 융합 배지에의 적응 및 ABC-003 뱅크의 제조

CMV07-024 뱅크를 해동하고, 4 mM 글루타민이 보충된 엑스-셀™ CDCHO 융합 배지 (SAFC)에 직접 적응시키고, 엑스-셀™ CDCHO 융합 배지에서 ABC-003 뱅크를 동결시킬 때까지 12.5 세대에 걸쳐 진탕기에서 적응시켰다.

5. CDCHO 융합 배지에서의 ABC-003 뱅크의 해동 및 CDCHO 융합 배지에서의 ABC-053 뱅크의 제조

ABC-003 바이알을 CDCHO 융합 배지에서 해동하고, 희석 후, ABC-53 뱅크를 4.2 세대 후에 동결시켰다.

6. CDCHO 융합 배지에서의 ABC-053 뱅크의 해동, 선택, 클로닝 및 CDCHO 융합 배지에서의 P15A11 뱅크의 제조

ABC-053 뱅크를 4 mM 글루타민이 보충된 엑스-셀™ CDCHO 융합 배지 (SAFC)에서 해동하였다. 배양물의 증폭 후에, 이를 플레이트에서 한계 희석에 의해 클로닝한 후, CDCHO 융합 배지에서 증폭시켰다. 이러한 클로닝으로부터 생성된 클론 P15A11의 뱅크를 동결시켰다. 이러한 클로닝 및 증폭은 약 94 세대에 상응한다.

7. CDCHO 융합 배지에서의 P15A11 뱅크의 해동, CDCHO에서의 직접 계대에 의한 뱅크의 적응, 및 CDCHO 배지에서의 CHOSP10-002 뱅크의 제조

P15A11 뱅크를 4 mM 글루타민이 보충된 엑스-셀™ CDCHO 융합 배지 (SAFC)에서 해동하고, CDCHO 융합 배지에서 2 계대 후, 세포를 CDCHO 배지에서 희석하였다. CDCHO 배지에서 3 계대 후, CHOSP10-002 뱅크를 총 15.9 세대 후에 동결시켰다.

8. CDCHO 배지에서의 CHOSP10-002 뱅크의 해동, 증폭, 원심분리에 의한 덩어리의 제거 및 96-웰 플레이트에서의 덩어리의 부재 하에서의 계대배양에 의한 선택, 6-웰 플레이트 및 진탕기에서의 증폭에 이은 CDCHO 배지에서의 CHOSP10-012 뱅크의 제조

CHOSP10-002 뱅크를 6 mM 글루타민이 보충된 CDCHO 배지 (인비트로젠)에서 해동한 후, 증폭시켰다. 배양물을 원심분리하여 세포 덩어리를 제거하고, 상청액으로부터 단리된 세포만 배양을 계속하였다. 이 스테이지에서, 해동으로부터 11.3 세대가 생성되었다.

이 배양물을 96-웰 플레이트에서 웰당 10개 세포로 분할하였다. 현탁액 중에서 개별적으로 증대된 세포가 담긴 웰을 6-웰 플레이트에서, 이어서 진탕기에서 증폭시켰다. CHOSP10-012 뱅크가 동결될 때까지 추가의 23.2 세대가 존재하였다.

9. CHOSP10-012 뱅크의 해동, 증폭 및 CHOSP11-008 뱅크 (9E4 뱅크)의 제조

CHOSP10-012 뱅크를 6 mM 글루타민이 보충된 CDCHO 배지 (인비트로젠)에서 해동한 후, 에를렌마이어 스테이지로부터 17 l 생물반응기로 증폭시켰다.

9E4 뱅크를 총 10 세대 후에 동결시켰다.

실시예 2: DHODH 유전자가 무효화된 CHO 세포주의 생산

A - CRISPR CAS9 가이드 RNA (gRNA)의 설계 및 구축

CHO 세포에서 DHDOH 유전자를 무효화하기 위해, 본 발명자들은 햄스터 DHODH 유전자 서열을 회수하고, CHO 게놈에서 CRISPR-Cas9로의 형질감염을 위한 상이한 가이드 RNA (gRNA)를 설계하기 위한 공개적으로 입수가능한 테포르(Tefor) 소프트웨어를 사용함으로써 시작하였다. 인트론 및 엑손을 갖는 전체 CHO DHODH 서열을 도 1에 제시한다.

소프트웨어는 DHODH 유전자를 표적화할 수 있는 8개의 서열을 결정하였다:

8개의 서열을 시험하고 클로닝하였지만, 8개의 서열 중에서 오직 4개의 클로닝된 서열만이 형질감염되었고, 오직 1개만이 DHODH 유전자의 녹-아웃을 생성하는데 성공하였다. 도 2에 제시된 바와 같이 gRNA를 생성하기 위한 DNA의 상응하는 조각으로서 하기 20개의 뉴클레오티드 서열 GGATGCAGCCATCATCCTTG (서열식별번호: 5)를 사용하였다. 이는 DHODH 유전자의 제2 엑손을 표적화한다. 적절한 gRNA의 전사를 수득하기 위해, 2개의 올리고뉴클레오티드 CACCGGGATGCAGCCATCATCCTTG (올리고1, 서열식별번호: 6) 및 AAAACCAAGGATGATGGCTGCATCC (올리고2, 서열식별번호: 7)를 합성적으로 제조하고, 어닐링하고, pCM3561 (인비트로젠에 의해 상품화됨)의 고유한 BaeI 부위에서 클로닝하였다.

클로닝된 DNA 서열은 이에 의해 U6 프로모터의 제어 하에 있게 되고, DNA로 CHO 세포를 형질감염시키면, 이는 tracrRNA에 융합된 crRNA를 함유하는 단일 전사 유닛으로 전사되었다. crRNA 부분은 DHODH 유전자의 제2 엑손에 특이적인 한편, tracrRNA는 Cas9 효소 자체에 의해 인식되었다.

B-CRISPR-Cas9 유전자 편집을 위한 물질의 제조

실시예 1에 개시된 바와 같이 ATCC로부터 구입한 CHO K-1 세포로부터 CHO 9E4 세포를 단리 및 선택하고, 8% CO₂ 및 80% 습도를 갖는 인큐베이터 내에서 37℃에서 6 mM L-글루타민이 보충된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포의 성장을 위해 최적화된 CDCHO 무혈청 및 화학적-한정 배지에서 현탁 배양물로서 성장시키고 유지시켰다.

10 μg의 sgRNA 발현 벡터 (pCM3561)를 20 μM S-아데노실메티오닌 (SAM)이 보충된 5 유닛/μl의 BaeI 효소 1 μL로 25℃에서 1시간 동안 소화시킨 다음, 소화된 플라스미드를 1% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동에 의해 분리하였다. 이어서, 생성된 sgRNA 클로닝 벡터를 겔 추출 키트 (퀴아젠(Qiagen) 키트)에 의해 회수하였다.

sgRNA 클로닝 벡터 및 어닐링된 가이드 올리고뉴클레오티드를 T4 DNA 리가제 효소 (바이오랩스(Biolabs))를 사용하여 라이게이션하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다.

5 μL의 라이게이션 생성물을 50 μL의 이. 콜라이 DH5a 적격 세포 (인비트로젠)에 첨가하였다.

세포 및 DNA를 얼음 상에서 30분 인큐베이션한 다음, 42℃에서 45초 동안 열 쇼크를 가하였다. 500 mL S.O.C 배지를 첨가한 후, 37℃ (800 rpm)에서의 1-시간 인큐베이션은 박테리아에게 플라스미드 백본 상에 코딩된 항생제 내성 단백질을 생성할 시간을 제공하였다. 인큐베이션 후, 각각의 튜브를 100 μg/mL 암피실린이 보충된 1개의 코팅된 LB 상에 스프레딩하였다. 디쉬를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 음성 대조군 (삽입물 DNA 대신 물을 가짐)을 사용하여 형질전환의 성공을 평가하였다.

증폭 단계의 경우, 구축당 2개의 콜로니를 선택하고, 밤새 인큐베이터에 놓아둔 (37℃, 700 rpm) 튜브 내의 100 μg/ml의 암피실린이 보충된 LB 배지 2 mL 중에 시딩하였다. 밤새 인큐베이션된 배양물을 원심분리에 의해 수거하였다. 퀴아프렙 미니프렙 키트(QIAprep Miniprep Kit)™ (퀴아젠)를 사용하여 증폭된 DNA를 회수하였다 (EB 완충제 중 용리). 이어서, 관심 가이드 올리고뉴클레오티드의 서열을 생어 서열분석 (센스 및 안티센스 서열분석, GATC 캄파니(GATC Company))에 의해 체크하였다. 벡터 NTI 소프트웨어 (써모피셔 사이언티픽(Thermofisher Scientific)) 상에서 정렬에 의해 확인한 후, 상응하는 콜로니를 사용하여 100 μg/ml의 암피실린이 보충된 200 mL의 LB 배지에 시딩하였다. 24시간 인큐베이션 후에, 박테리아를 4℃에서 15분 동안 6000 g에서 원심분리함으로써 수거하였다. 엔도프리 플라스미드 맥시 키트(EndoFree Plasmid Maxi Kit)™ (퀴아젠)를 사용하여 맥시프렙을 제조하였다. 실온 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 1시간-원심분리 (4℃, 8000 rpm) 후, DNA 펠릿을 내독소-무함유 실온 70% 에탄올로 세척하였다. 짧은 새로운 원심분리 후, 펠릿을 1시간 동안 공기-건조시키고, 적합한 부피의 내독소-무함유 멸균수에 재용해시켜 5 mg/mL의 DNA 농도를 얻었다. 나노드롭 장치를 사용하여 DNA 농도를 측정하였다.

4개의 상이한 플라스미드, 즉 pBH6840 플라스미드 (KO DHODH SEQ1), pBH6841 플라스미드 (KO DHODH SEQ4), pBH6842 플라스미드 (KO DHODH SEQ5) 및 pBH6843 플라스미드 (KO DHODH SEQ7)를 제조하였다. CHO DHODH 유전자 내의 이들 플라스미드의 표적을 서열식별번호: 22의 서열 상에 제시한다.

DNA 서열분석은 GATC 서브콘트랙터(subcontractor) - 유로핀스 게노믹스 캄파니(Eurofins Genomics Company)에 의해 수행하였다.

C-CRISPR-Cas9 유전자 편집

맥스사이트(MaxCyte) STX 및 그의 CHO 규정된 프로토콜을 사용하여 전기천공에 의해 형질감염을 수행하였다. 이는 OC-100 (형질감염당 2천만개 세포) 프로세싱 어셈블리에서 수행하였다.

형질감염 전날, 세포를 6 mM L-글루타민이 보충된 CDCHO 배지에 1.5x10⁶개 세포/mL로 시딩하였다.

형질감염 당일에, 세포를 바이셀(ViCell) 장치 (베크만 & 쿨터(Beckman & Coulter))로 넘버링하였다. 필요한 수의 세포를 250 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다.

각각의 형질감염 조건에 대해, 20x10⁶개의 세포를 250 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 70 μL 맥스사이트 완충제로 재현탁시켰다. 30 μg의 DNA를 첨가하고, 믹스 (세포, 완충제 및 DNA)를 100 μL 맥스사이트 전기천공 카세트로 옮겼다. 사용된 프로세싱 어셈블리는 100 μL 카세트에 특이적인 OC-100이었고, CHO에 대해 최적화된 프로그램을 선택하였다.

하기 형질감염을 수행하였다.

전기천공 후, 세포를 25 mL 작업 에를렌마이어 플라스크로 옮겼다. 이를 37℃, 5% CO₂ 정적 인큐베이터 내에 45분 동안 두었다. 이어서, 6 mM L-글루타민이 보충된 CDCHO 배지 25 mL를 첨가하여 세포를 재현탁시키고, 에를렌마이어 플라스크를 37℃, 5% CO₂, 70% 습도, 110 rpm 진탕기에 두었다.

전기천공 다음날, 상기 기재된 CHO9E4 형질감염된 풀로부터의 한계 희석에 의해 웰당 단일 세포로 시딩하였다. 약 20일 후, 세포가 대략 90% 전면생장률이고 현미경 하에 검사했을 때 건강한 것으로 보이면, 세포를 우리딘의 존재 또는 부재 하의 2개의 새로운 96 웰 플레이트로 분할하였다.

우리딘의 결여에 대한 그의 감수성에 대해 여러 클론을 선택하였다. 이들 클론을 6 mM의 글루타민 및 5 mM의 우리딘이 보충된 CDCHO 배지에서의 성장에 적응시켰다.

유전자 편집이 성공했는지 확인하기 위해, 퀴아젠 DN이지 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 CRISPR-Cas9 클론 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 표적 유전자좌를 CRISPR-Cas9에 의해 표적화된 DHODH 유전자좌의 영역에 대한 적절한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, PCR 생성물을 잠재적으로 결실된 영역을 커버하는 PCR 단편을 사용하여 NGS에 의해 서열분석하였다.

실시예 3: DHODH 유전자가 무효화된 CHO 세포주의 대안적 생산

A - CRISPR CAS9 가이드 RNA (gRNA)의 설계 및 구축

CHO 세포에서 DHDOH 유전자를 무효화하기 위해, 본 발명자들은 햄스터 DHODH 유전자 서열을 회수하고, CHO 게놈에서 CRISPR-Cas9로의 형질감염을 위한 상이한 가이드 RNA (gRNA)를 설계하기 위한 공개적으로 입수가능한 테포르 소프트웨어를 사용함으로써 시작하였다.

8개의 서열을 시험하고 클로닝하였지만, 8개의 서열 중에서 오직 4개의 클로닝된 서열만이 형질감염되었고, 오직 1개만이 DHODH 유전자의 녹-아웃을 생성하는데 성공하였다. gRNA를 생성하기 위한 DNA의 상응하는 조각으로서 하기 20개의 뉴클레오티드 서열 GGATGCAGCCATCATCCTTG (서열식별번호: 5)를 사용하였다. 이는 DHODH 유전자의 제2 엑손을 표적화한다. 적절한 gRNA의 전사를 수득하기 위해, 2개의 올리고뉴클레오티드 GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT (올리고1', 서열식별번호: 24) 및 CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG (올리고2', 서열식별번호: 25)를 합성적으로 제조하고, 어닐링하고, pCM3561 (인비트로젠에 의해 상품화됨)의 고유한 BaeI 부위에서 클로닝하였다.

B-CRISPR-Cas9 유전자 편집을 위한 물질의 제조

10 μg의 sgRNA 발현 벡터 (pCM3561)를 20 μM S-아데노실메티오닌 (SAM)이 보충된 5 유닛/μl의 BaeI 효소 1 μL로 25℃에서 1시간 동안 소화시킨 다음, 소화된 플라스미드를 1% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동에 의해 분리하였다. 이어서, 생성된 sgRNA 클로닝 벡터를 겔 추출 키트 (퀴아젠 키트)에 의해 회수하였다.

sgRNA 클로닝 벡터 및 어닐링된 가이드 올리고뉴클레오티드를 T4 DNA 리가제 효소 (바이오랩스)를 사용하여 라이게이션하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다.

증폭 단계의 경우, 구축당 2개의 콜로니를 선택하고, 밤새 인큐베이터에 놓아둔 (37℃, 700 rpm) 튜브 내의 100 μg/ml의 암피실린이 보충된 LB 배지 2 mL 중에 시딩하였다. 밤새 인큐베이션된 배양물을 원심분리에 의해 수거하였다. 퀴아프렙 미니프렙 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 증폭된 DNA를 회수하였다 (EB 완충제 중 용리). 이어서, 관심 가이드 올리고뉴클레오티드의 서열을 생어 서열분석 (센스 및 안티센스 서열분석, GATC 캄파니)에 의해 체크하였다. 벡터 NTI 소프트웨어 (써모피셔 사이언티픽) 상에서 정렬에 의해 확인한 후, 상응하는 콜로니를 사용하여 100 μg/ml의 암피실린이 보충된 200 mL의 LB 배지에 시딩하였다. 24시간 인큐베이션 후에, 박테리아를 4℃에서 15분 동안 6000 g에서 원심분리함으로써 수거하였다. 엔도프리 플라스미드 맥시 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 맥시프렙을 제조하였다. 실온 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 1시간-원심분리 (4℃, 8000 rpm) 후, DNA 펠릿을 내독소-무함유 실온 70% 에탄올로 세척하였다. 짧은 새로운 원심분리 후, 펠릿을 1시간 동안 공기-건조시키고, 적합한 부피의 내독소-무함유 멸균수에 재용해시켜 5 mg/mL의 DNA 농도를 얻었다. 나노드롭 장치를 사용하여 DNA 농도를 측정하였다.

4개의 상이한 플라스미드, 즉 pBH6840 플라스미드 (KO DHODH SEQ1), pBH6841 플라스미드 (KO DHODH SEQ4), pBH6842 플라스미드 (KO DHODH SEQ5) 및 pBH6843 플라스미드 (KO DHODH SEQ7)를 제조하였다.

DNA 서열분석은 GATC 서브콘트랙터 - 유로핀스 게노믹스 캄파니에 의해 수행하였다.

C-CRISPR-Cas9 유전자 편집

맥스사이트 STX 및 그의 CHO 규정된 프로토콜을 사용하여 전기천공에 의해 형질감염을 수행하였다. 이는 OC-100 (형질감염당 2천만개 세포) 프로세싱 어셈블리에서 수행하였다.

형질감염 당일에, 세포를 바이셀 장치 (베크만 & 쿨터)로 넘버링하였다. 필요한 수의 세포를 250 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다.

하기 형질감염을 수행하였다.

실시예 4: 재조합 단백질을 생산하기 위한 DHODH-결핍 CHO 세포주의 사용

실시예 2 또는 3에서 수득한 유효 DHODH-결핍 CHO 클론에 대해 항체 생산을 시험하여 이들 클론이 테리플루노미드의 부재 하에 항체를 발현할 수 있는지를 확인하였다.

설계된 벡터를 5 mg/mL의 농도로 생산 및 제조하였다. 트랜스포사제를 코딩하는 플라스미드인 pBH6209를 제외하고, 이들은 모두 생산 세포의 게놈 내 플라스미드의 통합을 위한 트랜스포손 시스템의 사용을 가능하게 하는 ITR을 갖는다.

사용된 세포주는 CHO 9E4_SP11 야생형 및 DHODH에 대한 KO2 및 KO19 녹아웃이었다.

CHO 9E4_SP11을 6 mM L-글루타민이 첨가된 CDCHO 배지에서 배양하였다.

KO2 및 KO19를 6 mM L-글루타민 및 5 mM 우리딘이 첨가된 CDCHO 배지에서 배양하였다.

시작 시 이들을 25 mL-작업 에를렌마이어 플라스크에서 배양하고, 필요한 생존 세포의 수에 도달할 때까지 증폭시켰다.

맥스사이트 STX 장치 상에서 맥스사이트에 의해 개발된 고효율 전기천공 프로토콜을 사용하여 상이한 단백질을 생산하였다.

세포를 형질감염 1일 전에 1.5x10⁶개로 분할하였다.

형질감염 당일에, 세포를 2개의 벡터: 피기백(PiggyBac) 인식 부위 (역전된 말단 반복부, ITR)가 플랭킹된 인간 항 CD38 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 발현 카세트 및 DHODH 선택 마커를 함유하는 DNA 플라스미드 발현 벡터 (WO2016/062837에 기재된 바와 같음), 및 TTAA 부위에서 CHO 게놈 내로의 트랜스포손의 가동화를 촉매하는 트랜스포사겐(Transposagen)으로부터의 트랜스포사제 벡터로 공동형질감염시켰다.

각각의 형질감염 조건에 대해, 80x10⁶개의 세포를 250 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 250 μL 맥스사이트 완충제로 재현탁시켰다. 120 μg의 DNA를 첨가하고, 믹스 (세포, 완충제 및 DNA)를 400 μL 맥스사이트 전기천공 카세트로 옮겼다. 사용된 프로세싱 어셈블리는 400 μL 카세트에 특이적인 OC-400이었고, CHO에 대해 최적화된 프로그램을 선택하였다.

회복기를 위해, 형질감염된 세포를 즉시 125 ml 플라스크로 교반 없이 37℃에서 40분 동안 옮겨두었다. 6 mM 글루타민 (KO 세포의 경우 + 5 mM 우리딘)이 보충된 25 mL 미리 가온된 CDCHO 배지를 첨가하고, 형질감염된 배양물을 8% CO₂ 및 80% 습도를 갖는 인큐베이터에서 37℃에서 유지시켰다. 형질감염 1-일 후에, 세포를 원심분리하고, 6 mM 글루타민, 30% FeedB (깁코) 및 상이한 양의 테리플루노미드 (0, 5, 15 및 25 μM)가 보충된 CD 옵티CHO™ 선택 배지 (깁코)에 1x10⁶개 세포/mL로 재현탁시켰다.

형질감염-후 제14일에, 세포를 200 g에서 10분 동안 25℃에서 원심분리하였다. 상청액을 0.22 μm PES 필터를 통해 여과하고, 옥텟 장치를 사용하여 항체 역가를 측정하였다.

도 3에 제시된 바와 같이, 2개의 클론 (KO2 및 KO19)은 테리플루노미드의 부재 하에 우수한 생산을 나타내었고, 게놈 NGS는 이들 2개의 클론이 DHODH 유전자좌의 2개의 대립유전자에서 녹아웃 돌연변이를 함유하였음을 보여주었다.

놀랍게도, 모든 KO 클론은 심지어 선택적 작용제로서 테리플루노미드의 부재 하에서도 항체를 생산하였다. 2개의 클론 KO2 및 KO19를 추가의 연구를 위해 선택하였다. 또한, 이들 인용된 클론은 DHODH 유전자의 동형접합 녹아웃을 나타낸 유일한 클론이었다.

따라서, 본 실시예는 본 발명이 임의의 선택 압력을 사용하지 않으면서 항체의 생산을 허용하는 한 세트의 세포주 및 벡터를 제공함을 보여준다.

실시예 5: 3종의 인간 DHODH 변이체의 평가

손상된 형태의 인간 DHODH의 사용이 CHO 게놈 내로의 통합 카피수를 증진시키고, 그에 의해 보다 우수한 생산성을 가능하게 하는지 확인하기 위해, DHODH KO2, KO19 및 WT CHO 9E4 세포주를 밀러 증후군 환자에서 기재된 3종의 인간 DHODH cDNA 변이체 (R135C, G202A 및 R346W, 특히 문헌 [Fang et al., (2012) Biosci. 32:631-639] 참조)로 형질감염시켰다. 대조군 벡터로서, 인간 WT DHODH를 코딩하는 cDNA를 보유하는 플라스미드로 형질감염시켰다.

SalI-BglII 제한 효소로 소화시킨 인간 항 CD38 모노클로날 항체, mAb-A (pBH6204)를 코딩하는 플라스미드 벡터 50 ng을 각각의 변이체 (R135C, G202A, 및 R346W)에 상응하는 SalI-BglII 정제된 DNA 단편 37.5 ng과 혼합하였다. 1 μL의 T4-DNA 리가제 (바이오랩스) 및 농축된 라이게이션 완충제를 첨가한 후, 라이게이션 반응 (최종 부피 10 μL)을 실온에서 10분 동안 수행하였다.

이어서, 이 DNA 풀의 분취물을 사용하여 이. 콜라이 적격 세포 (스텔라(Stellar)™, 다카라(Takara))를 형질전환시켰다.

제조업체의 권장사항에 따라 상업적으로 입수가능한 퀴아젠 플라스미드 미니프렙 키트 (퀴아젠)를 사용하여 소규모 플라스미드 제조를 수행하였다.

603개의 센스 (서열 GTTGGCCTTCCAATGGCTT, 서열식별번호: 41) 및 503개의 안티센스 (서열 GTTCCTTCACAAAGAT, 서열식별번호: 42) 올리고뉴클레오티드를 사용한 DNA 서열분석을 GATC 서브콘트랙터 - 유로핀스 게노믹스 캄파니에 의해 수행하였다.

맥스사이트 STX를 사용하여 전기천공에 의해 DHODH 변이체의 형질감염을 수행하였다. 이는 상기 기재된 바와 같이 OC-100 프로세싱 어셈블리에서 수행된다.

형질감염 1일 후에, 세포를 원심분리하고, 6 mM 글루타민이 보충되고 9E4 CHO 세포의 경우 25 μM의 테리플루노미드가 보충되고 KO2 및 KO19 클론의 경우 테리플루노미드가 없는 CD CHO 선택 배지에 1x10⁶개 세포/mL로 재현탁시켰다.

2 계대 후, 30%의 FeedB 및 6 mM의 글루타민이 보충되고 9E4 CHO 세포의 경우 25 μM의 테리플루노미드가 보충되고 KO2 및 KO19 클론의 경우 테리플루노미드가 없는 0.3x10⁶개 세포/mL의 CD 옵티CHO 배지에서 mAb-A의 생산이 시작되었다.

형질감염-후 제14일에, 세포를 200g에서 10분 동안 25℃에서 원심분리하였다. 상청액을 0.22 μm PES 필터를 통해 여과하고, 옥텟 장치를 사용하여 항체 역가를 측정하였다.

도 4에 제시된 바와 같이, WT CHO 9E4 및 DHODH KO 클론에 대한 R138C 및 R346W DHODH 돌연변이에 의해 어떠한 유의한 효과도 관찰되지 않았다. 다른 한편으로는, G202A 돌연변이는 WT CHO 9E4 세포주에 의한 그램 규모의 항체 생산을 수득하고 DHODH KO2 및 KO19 클론의 생산성을 증진시키는 것을 가능하게 하였다.

실시예 6: 본 발명의 발현 시스템을 사용한 단백질 생산

본 발명의 발현 시스템을 사용하여, 특히 상기 실시예 3에 개시된 유효 클론 CHO 9E4 KO2 및 KO19 상에 상기 개시된 G202A 돌연변이를 포함하는 인간 DHODH cDNA를 사용하여 상이한 유형의 단백질을 생산하여, 선택 마커로서 인간 글루타민 신테타제 (GS)를 사용하여 최종 생산성이 선행 기술의 발현 시스템과 적어도 동일한 범위에 있는지 확인하였다.

하기 단백질을 생산하였다:

- 리파제:

o 모노시스트론 cDNA PLBL2-His를 사용하고,

o 선택 마커 hDHODH G202A 플라스미드 또는 hGS 플라스미드를 사용함,

- 모노클로날 항체 (mAb-B):

o 항체의 VH 및 VL 쇄를 코딩하는 비시스트론 cDNA를 사용하고,

o 선택 마커 hDHODH G202A 플라스미드 또는 hGS 플라스미드를 사용함;

- 이중특이적 항체:

o (i) 항체의 VH 및 VL 쇄를 코딩하는 비시스트론 cDNA 또는 (ii) 항체의 VH 및 VL 쇄를 각각 코딩하는 2개의 모노시스트론 cDNA를 사용하고,

o 선택 마커 (i) hDHODH G202A 플라스미드 (비시스트론 cDNA의 경우) 또는 (ii) 2개의 hDHODH G202A 플라스미드 또는 hDHODH G202A 플라스미드 및 hGS 플라스미드 (모노시스트론 cDNA의 경우)를 사용함;

- 삼중특이적 항체:

o 2개의 비시스트론 cDNA를 사용하고,

o 선택 마커 hDHODH G202A 플라스미드 및 hGS 플라스미드를 사용함.

펙토프로(FectoPRO)® 형질감염 1일 전에, 세포를 6 mM 글루타민 및 5 mM 우리딘이 보충된 CD CHO 배지 중에 1.5x10⁶개 세포/mL로 희석하였다.

형질감염 당일에, 세포 현탁액을 6 mM L-글루타민 및 5 mM 우리딘이 보충된 CD CHO 중에 1.1x10⁶개 세포/ml로 희석하였다. 펙토프로® 시약을 5초 동안 볼텍싱하고, 스핀 다운시킨 후, 빈 50 mL 튜브에 25 μL / 튜브로 첨가하였다. 제2의 50 mL 튜브에서, 12.5 μg의 cDNA를 CD CHO 배지 중에 희석하고, 희석된 DNA를 순수한 펙토프로® 시약에 모두 한 번에 부었다. 용액이 즉시 균질화되었고, 이를 10분 동안 인큐베이션하였다. 펙토프로®/DNA 형질감염 믹스를 세포에 붓고, 배양물을 37℃, 190 rpm 및 8%의 CO₂ 수준에서 인큐베이션하였다.

형질감염 24시간 후에, 세포를 인비트로젠™ 카운테스(Countess)™ 장치로 계수하였다. 전세포 배양물을 200g에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 미리 가온된 생산 배지 2 5mL로 하기 개시된 조건에서 재현탁시켰다.

3개 이상의 서브유닛을 포함하는 복합 단백질의 경우에, 상기 기재된 형질감염 프로토콜을 다시 사용하여 제2 형질감염을 수행한다.

- 리파제 모노시스트론 벡터의 경우 (His 태그를 갖는 단백질)

MSX: L-메티오닌 술폭시민; Gln: 글루타민; Uri: 우리딘; TNF: 테리플루노미드

- 모노클로날 항체 mAb-B 비시스트론 VH 및 VL 벡터의 경우:

MSX: L-메티오닌 술폭시민; Gln: 글루타민; Uri: 우리딘; TNF: 테리플루노미드; FeedB: 상업용 공급물

- 이중특이적 항체 비시스트론 또는 2개의 모노시스트론 VH 및 VL 벡터의 경우:

- 삼중특이적 항체 비시스트론 VH 및 VL 벡터의 경우:

형질감염 72시간 후에, 세포를 인비트로젠™ 카운테스™ 장치로 계수하고, 또 다른 배지 교체에 의해 단백질 생산을 부스팅하였다. 또한, 형질감염된 세포 생존율을 형질감염 3 및 7일 후에 측정하였다.

형질감염-후 제14일에, 세포를 200g에서 10분 동안 25℃에서 원심분리하였다. 상청액을 0.22 μm PES 필터를 통해 여과하고, 옥텟 장치를 사용하여 단백질 역가를 측정하였다.

하기 결과를 수득하였다.

a) 리파제

제14일의 리파제 생산을 도 5에 제시한다.

이들 결과는 둘 다의 KO DHODH 세포주가 테리플루노미드 선택 압력의 부재 하에 리파제를 생산하는 능력을 가지며, 이는 생산 세포에 대한 독성을 감소시킬 수 있음을 보여준다.

또한, KO DHODH 세포주는 (야생형 9E4 CHO 세포에서) 선행 기술 GS 시스템과 동일한 범위로, 즉 25 ml 규모에서 1 g/l로 리파제를 생산할 수 있었다.

b) 모노클로날 항체 mAb-B

제14일의 모노클로날 항체 mAb-B 생산을 도 6에 제시한다.

이들 결과는 KO DHODH 세포주가 이러한 특정한 항체의 생산 동안 상이하게 거동하였음을 보여준다. 실제로, 둘 다의 클론이 선행 기술 테리플루노미드 생산보다 더 우수한 생산성을 제공하더라도, KO19 클론이 KO2 클론보다 유의하게 더 우수한 생산성을 제공하였다.

최상의 KO 세포주 (KO19)에서, 항체 생산은 (야생형 9E4 CHO 세포에서) 선행 기술 GS 시스템과 동일한 범위, 25 ml 규모에서 약 0.67 g/l였다.

또한, KO 세포주를 사용하여 증가된 생존율을 관찰하였다.

c) 이중특이적 항체

제14일의 이중특이적 항체 생산을 도 7에 제시한다.

이중특이적 항체는 모든 시험된 사례에서 단일특이적 항체만큼 효율적으로 생산되지 않았다. 그러나, 이러한 종류의 이중특이적 항체를 생산하는 어려움에도 불구하고, 최상의 KO 세포주의 생산성은 (야생형 9E4 CHO 세포에서) 선행 기술 GS 시스템과 동일한 범위, 25 ml 규모에서 약 0.145 g/l였다.

또한, KO 세포주를 사용하여 증가된 생존율을 관찰하였다.

d) 삼중특이적 항체

제14일의 삼중특이적 항체 생산을 도 8에 제시한다.

모든 조건에서, 2종의 KO 세포주는 선행 기술 선택 시스템과 동일한 범위, 즉 현저한 0.5 g/l의 결과를 제공하였다.

따라서, 본 실시예는 KO DHODH CHO 클론이 다양한 단백질 포맷 (단백질, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체)의 발현에 적합함을 확인시켜 준다. 이들 클론은 심지어 복합 단백질을 생산하기 위해 이중 형질감염에 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> Novel selection marker-comprising cell line and uses thereof for protein production <130> BET 18P4548 <150> EP19305331.1 <151> 2019-03-19 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1188 <212> DNA <213> Cricetus cricetus <400> 1 atggcttggc ggcagatgcg gaagagagcc ctggacgccg ctatcatcct gggaggcgga 60 ggcctgctgt tcacctctta cctgacagcc accggcgacg accacttcta cgccgagtac 120 ctgatgcctg ccctgcagag actgctggac cctgagtctg cccaccggct ggccatcaga 180 ttcacctccc tgggcctgct gcccagagcc accttccagg actccgacat gctggaagtg 240 cgggtgctgg gccacaagtt cagaaacccc gtgggaatcg ccgctggctt cgacaagcac 300 ggcgaggctg tggacggcct gtacaagctg ggcttcggct tcgtggaagt gggctccgtg 360 acaccccagc cccaggaagg caaccccaga cctagagtgt tccggctgcc tgaggaccag 420 gccgtgatca acagatacgg cttcaactcc cacggcctgt ccgtggtgga acaccggctg 480 agagccagac agcagaagca gaacaagctg accgccgacg gcctgcccct gggcatcaat 540 ctgggcaaga acaagacctc cgaggacgct gccgccgact acgtggaagg cgtgcgagtg 600 ctgggacctc tggccgatta cctggtcgtg aacgtgtcct cccccaacac cgctggcctg 660 agaagcctgc agggaaaggc cgagctgaga aggctgctgg ccaaggtgct gcaggaacgg 720 gacgctctga agggcgccca gaaacctgcc gtgctcgtga agatcgcccc tgacctgacc 780 gcccaggaca aagaggatat cgcctccgtg gccagagagc tgggcatcga cggactgatc 840 gtgaccaaca ccaccgtgtc tcggcctacc ggactgcagg gcgctctgag atctgagatg 900 ggcggcctgt ctggcaagcc tctgagggac ctgtccaccc agaccatcag agagatgtac 960 accctgaccc agggccggat ccccatcatt ggagtgggcg gagtgtcctc tggccaggac 1020 gccctggaaa agatccaggc tggcgcctct ctggtgcagc tgtataccgc cctgaccttt 1080 ctgggccctc ccgtggtggt gcgagtgaag agagaactgg aagccctgct gaaagagcgg 1140 ggcttcaaca ccgtgaccga ggccatcggc gctgaccaca gaagatga 1188 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Cricetus cricetus <400> 2 Met Ala Trp Arg Gln Met Arg Lys Arg Ala Leu Asp Ala Ala Ile Ile 1 5 10 15 Leu Gly Gly Gly Gly Leu Leu Phe Thr Ser Tyr Leu Thr Ala Thr Gly 20 25 30 Asp Asp His Phe Tyr Ala Glu Tyr Leu Met Pro Ala Leu Gln Arg Leu 35 40 45 Leu Asp Pro Glu Ser Ala His Arg Leu Ala Ile Arg Phe Thr Ser Leu 50 55 60 Gly Leu Leu Pro Arg Ala Thr Phe Gln Asp Ser Asp Met Leu Glu Val 65 70 75 80 Arg Val Leu Gly His Lys Phe Arg Asn Pro Val Gly Ile Ala Ala Gly 85 90 95 Phe Asp Lys His Gly Glu Ala Val Asp Gly Leu Tyr Lys Leu Gly Phe 100 105 110 Gly Phe Val Glu Val Gly Ser Val Thr Pro Gln Pro Gln Glu Gly Asn 115 120 125 Pro Arg Pro Arg Val Phe Arg Leu Pro Glu Asp Gln Ala Val Ile Asn 130 135 140 Arg Tyr Gly Phe Asn Ser His Gly Leu Ser Val Val Glu His Arg Leu 145 150 155 160 Arg Ala Arg Gln Gln Lys Gln Asn Lys Leu Thr Ala Asp Gly Leu Pro 165 170 175 Leu Gly Ile Asn Leu Gly Lys Asn Lys Thr Ser Glu Asp Ala Ala Ala 180 185 190 Asp Tyr Val Glu Gly Val Arg Val Leu Gly Pro Leu Ala Asp Tyr Leu 195 200 205 Val Val Asn Val Ser Ser Pro Asn Thr Ala Gly Leu Arg Ser Leu Gln 210 215 220 Gly Lys Ala Glu Leu Arg Arg Leu Leu Ala Lys Val Leu Gln Glu Arg 225 230 235 240 Asp Ala Leu Lys Gly Ala Gln Lys Pro Ala Val Leu Val Lys Ile Ala 245 250 255 Pro Asp Leu Thr Ala Gln Asp Lys Glu Asp Ile Ala Ser Val Ala Arg 260 265 270 Glu Leu Gly Ile Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Thr Thr Val Ser Arg 275 280 285 Pro Thr Gly Leu Gln Gly Ala Leu Arg Ser Glu Met Gly Gly Leu Ser 290 295 300 Gly Lys Pro Leu Arg Asp Leu Ser Thr Gln Thr Ile Arg Glu Met Tyr 305 310 315 320 Thr Leu Thr Gln Gly Arg Ile Pro Ile Ile Gly Val Gly Gly Val Ser 325 330 335 Ser Gly Gln Asp Ala Leu Glu Lys Ile Gln Ala Gly Ala Ser Leu Val 340 345 350 Gln Leu Tyr Thr Ala Leu Thr Phe Leu Gly Pro Pro Val Val Val Arg 355 360 365 Val Lys Arg Glu Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Asn Thr 370 375 380 Val Thr Glu Ala Ile Gly Ala Asp His Arg Arg 385 390 395 <210> 3 <211> 1188 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcttggc ggcacctgaa gaagagggcc caggacgccg tgatcatcct gggaggcgga 60 ggcctgctgt tcgcctctta cctgatggct accggcgacg agcggttcta cgccgagcat 120 ctgatgccca cactgcaggg cctgctggac cctgagtctg cccatagact ggccgtgcgg 180 ttcacctccc tgggactgct gcctagagcc cggttccagg actccgacat gctggaagtg 240 cgggtgctgg gccacaagtt cagaaacccc gtgggaatcg ccgctggctt cgacaagcac 300 ggcgaggctg tggacggcct gtacaagatg ggcttcggct tcgtggaaat cggctccgtg 360 acccccaagc cccaggaagg caaccccaga cctcgggtgt tcagactgcc tgaggaccag 420 gctgtgatca acagatacgg cttcaactcc cacggcctgt ccgtggtgga acaccggctg 480 agagccagac agcagaagca ggccaagctg accgaggatg gcctgcctct gggagtgaac 540 ctgggcaaga acaagacctc cgtggacgcc gccgaggatt acgctgaagg cgtgcgagtg 600 ctgggacccc tggctgatta cctggtcgtg aacgtgtcct cccccaacac cgctggcctg 660 agatctctgc agggcaaggc cgagctgcgg agactgctga caaaggtgct gcaggaacgc 720 gacggcctgc ggagagtgca tagacctgcc gtgctcgtga agatcgcccc cgacctgacc 780 agccaggaca aagaggatat cgcctccgtc gtgaaagagc tgggcatcga cggactgatc 840 gtgaccaaca ccaccgtgtc taggcctgcc ggactgcagg gggctctgag atctgaaacc 900 ggcggactgt ccggcaagcc tctgagggat ctgtccaccc agaccatcag agagatgtac 960 gccctgaccc agggccgggt gccaatcatt ggagtgggcg gagtgtcctc cggccaggat 1020 gccctggaaa agatcagagc cggcgcttcc ctggtgcagc tgtacaccgc tctgaccttt 1080 tggggccctc ccgtcgtggg caaagtgaag agagagctgg aagccctgct gaaagagcag 1140 ggatttggcg gcgtgaccga tgccatcggc gctgaccaca gaagatga 1188 <210> 4 <211> 395 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Trp Arg His Leu Lys Lys Arg Ala Gln Asp Ala Val Ile Ile 1 5 10 15 Leu Gly Gly Gly Gly Leu Leu Phe Ala Ser Tyr Leu Met Ala Thr Gly 20 25 30 Asp Glu Arg Phe Tyr Ala Glu His Leu Met Pro Thr Leu Gln Gly Leu 35 40 45 Leu Asp Pro Glu Ser Ala His Arg Leu Ala Val Arg Phe Thr Ser Leu 50 55 60 Gly Leu Leu Pro Arg Ala Arg Phe Gln Asp Ser Asp Met Leu Glu Val 65 70 75 80 Arg Val Leu Gly His Lys Phe Arg Asn Pro Val Gly Ile Ala Ala Gly 85 90 95 Phe Asp Lys His Gly Glu Ala Val Asp Gly Leu Tyr Lys Met Gly Phe 100 105 110 Gly Phe Val Glu Ile Gly Ser Val Thr Pro Lys Pro Gln Glu Gly Asn 115 120 125 Pro Arg Pro Arg Val Phe Arg Leu Pro Glu Asp Gln Ala Val Ile Asn 130 135 140 Arg Tyr Gly Phe Asn Ser His Gly Leu Ser Val Val Glu His Arg Leu 145 150 155 160 Arg Ala Arg Gln Gln Lys Gln Ala Lys Leu Thr Glu Asp Gly Leu Pro 165 170 175 Leu Gly Val Asn Leu Gly Lys Asn Lys Thr Ser Val Asp Ala Ala Glu 180 185 190 Asp Tyr Ala Glu Gly Val Arg Val Leu Gly Pro Leu Ala Asp Tyr Leu 195 200 205 Val Val Asn Val Ser Ser Pro Asn Thr Ala Gly Leu Arg Ser Leu Gln 210 215 220 Gly Lys Ala Glu Leu Arg Arg Leu Leu Thr Lys Val Leu Gln Glu Arg 225 230 235 240 Asp Gly Leu Arg Arg Val His Arg Pro Ala Val Leu Val Lys Ile Ala 245 250 255 Pro Asp Leu Thr Ser Gln Asp Lys Glu Asp Ile Ala Ser Val Val Lys 260 265 270 Glu Leu Gly Ile Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Thr Thr Val Ser Arg 275 280 285 Pro Ala Gly Leu Gln Gly Ala Leu Arg Ser Glu Thr Gly Gly Leu Ser 290 295 300 Gly Lys Pro Leu Arg Asp Leu Ser Thr Gln Thr Ile Arg Glu Met Tyr 305 310 315 320 Ala Leu Thr Gln Gly Arg Val Pro Ile Ile Gly Val Gly Gly Val Ser 325 330 335 Ser Gly Gln Asp Ala Leu Glu Lys Ile Arg Ala Gly Ala Ser Leu Val 340 345 350 Gln Leu Tyr Thr Ala Leu Thr Phe Trp Gly Pro Pro Val Val Gly Lys 355 360 365 Val Lys Arg Glu Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gly Phe Gly Gly 370 375 380 Val Thr Asp Ala Ile Gly Ala Asp His Arg Arg 385 390 395 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> corresponding piece of DNA for generating gRNA <400> 5 ggatgcagcc atcatccttg 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence1) <400> 6 caccgggatg cagccatcat ccttg 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence1) <400> 7 aaaaccaagg atgatggctg catcc 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence2) <400> 8 caccggatgc agccatcatc cttgg 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence2) <400> 9 aaaacccaag gatgatggct gcatc 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence3) <400> 10 caccggcagc catcatcctt ggggg 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence3) <400> 11 aaaacccccc aaggatgatg gctgc 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence4) <400> 12 caccggccat catccttggg ggagg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence4) <400> 13 aaaaccctcc cccaaggatg atggc 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence5) <400> 14 caccggctat tcgcttcacg tccct 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence5) <400> 15 aaaacaggga cgtgaagcga atagc 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence6) <400> 16 caccggcctc tacaaactgg gcttt 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence6) <400> 17 aaaacaaagc ccagtttgta gaggc 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence7) <400> 18 caccgggctt tgggtttgtc gaggt 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence7) <400> 19 aaaacacctc gacaaaccca aagcc 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence8) <400> 20 caccggctgg tctgaggagc ctaca 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence8) <400> 21 aaaactgtag gctcctcaga ccagc 25 <210> 22 <211> 14437 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <222> (1992)..(2015) <223> target of plasmids pBH6840 KO DHODH SEQ1 and pBH6841 KO DHODH SEQ4 <220> <221> misc_feature <222> (2129)..(2147) <223> target of plasmid pBH6842 KO DHODH SEQ5 <220> <221> misc_feature <222> (4015)..(4047) <223> target of plasmid pBH6843 KO DHODH SEQ7 <400> 22 ccgagcccac attctccaat ggagtggagg cagaggcggg cccagtggca gaaggagcat 60 ggcgtggaga cagatgagag tgagtctgtt gcgggtgctt acgcttgttc ggaaaacagg 120 ttgggagtgg acgaggctgg gagattgaaa ggctggggcc cttgcagtgt gggctgcatg 180 tgtgctcagc taggggcatg caaaaagcaa gcgtgctggg cagaggctga gttgattgtg 240 agagatcgcg ggcttttttt tttttttttt tcttaaactg agctagtatc gggcccctgt 300 gagcacatgg tggctagcat tatggaaagg atccagggcg gaatgaaata agacacgcag 360 ccacccttcc agataaagtg tggttagaat gggagtcccg tgcgaagagt ccgtagattg 420 tgtccctggc ttgggaaaga gtgcgcagat attgtttctt gacacgtgag aatttctccc 480 tccagaggag ggagaatgaa tacttggttt gctgtacagg caaatctgat cacatcctct 540 acttccttat ttagtggaca aatcccatta aaaatataat cactgattgt ggtgaggggt 600 tgtgctgtga catgggagct ggaaccgaac tctgcactta accactgaac catctccagc 660 ccccaaatct gtattttggc tgacaccccc acatttctcc taccttactt taagaaatgc 720 tttcctttta gttccaaaca gacctgtctt cctctacccc attctctggc ccttctcatt 780 ggcttcagcc acctagagat tccttctcca gctgcttcct cctctttagc 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cattccctca 1680 ttaactagta aaaattttcc catgtgaccc ctagggggca gtactgcctg tcttgaaaat 1740 tccctgcctg gtccttagga aaatattcag ggctagaacc catgtaagca gtgtaggtac 1800 tgcatctacc tttgtagatg tgtaagtggg caggatatga agggggacag tgtgagcagg 1860 gaaggactgt cactttgtgt agttgttatg tcctctgggc aggtgtgaag ggtcaggaag 1920 ggtactgcag gctggtctga tggggttccc catggggcct tttctctccc ccactagaag 1980 cgggccctgg atgcagccat catccttggg ggaggaggac ttctcttcac ctcttacctg 2040 acagccacgg gcgatgacca tttctatgct gaatatctga tgccggccct gcagaggctg 2100 ctagacccag aatcagccca ccggctagct attcgcttca cgtccctggg gctccttcct 2160 cgagctacat ttcaggactc tgacatgctg gtaggtcccc cggtcaccct gtgttacatt 2220 tgtgtttgta ggggaggtca catccttcag cacttcggta ttcctctgct gccactgggc 2280 ttttgaaaac cagagctgca ggttcacaag cagctgggac ctggagccca gcccgaggaa 2340 gggacttttc ttctgtgtta caccctgtac ttacagaaca gcactcagca tatagccggt 2400 gcttacagct ttaatcctca cagataccct ttgagggagg tcctatctca tctccatcta 2460 caaatcagga aactgaggta cagactaagt aagtgacttg cccaaggtca cacagctggg 2520 aggtggcagg accaggattc aaacctatag agtttgactc cagtgtccaa ccttggtcac 2580 tggcctgcct tgctgagatc cctctgctga acaggaacat cttctggagt cattaagcag 2640 ctactggatg caggggacag ggtcagcagg gaagggctgt cacttgtaga tactgtgtcc 2700 tctgtctgga taggtgtgaa gtctcagagt gggtgctgca gcctggcctg atgggtccgt 2760 cctttccccc catcagaagc agaccctggc tgtagtcatc accctgaggg gtggaggact 2820 taagtcctag gcaacctcct gccccagcca cattcagcca caactcactc ctgtggccca 2880 cctggcacca tttataacag agccagtgtg gcccttctac tgtctctctg aatgctcccc 2940 ttttgagatg ggcctaggtt gtccaggttg gtctcaaact tggggtccca aatgatttca 3000 gaatctcagc ttcctgagta agtgggatca cacagtatgc accactgtgc gcagtggtcc 3060 ctgttccccg atagccaggc cggttgatac tcttagcccg attcaccttt ctcggttttc 3120 taagtcttca gttttctatc atgacgagac tctcctgggg gagggggatg gctgggtgct 3180 tctggaatgc ttggctgacc cggtctcctg attgaccggt tttaccataa tctcaaagaa 3240 gcctgacatc aacaccccag gctctgtcac acagccaggg atgagaactg gcttgagggt 3300 agcctcaagg aaggcctgtt ctagctgaac ttctcgcctc atggttatga 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caaaatactt 5040 gtgtttctga tttggctgtt acaagtgact tcgggtctta ggatgatggt acttgggaca 5100 gggagtggtg agggacaggc acctgtgctc ttgggcatgt gcgaacttag ccttcttgct 5160 catatacaca gtgtgtgttc agtataggca tgctaacgga tgggtattta cacctgcaga 5220 cccacatgcc acaatccatg cagtgttgct ctggctgcaa gcaacaaagt gatgtaacca 5280 gatctcattt gttatcattc ttgtcactag cacaaaataa ctgacagcag gcagcttaag 5340 gaatggggtc aggtattttg gctcacagtt tgaggggaca cgccctcccg gtggcaggag 5400 cctgaggcag agggtcactc tgtacctaca gtgaggaagc agcaagggaa ggatgctggt 5460 gcttgggtct ctttctccgt cttgctcagc tggggtgtga atccatggtg ctgcccatgt 5520 ttgcggtggg tcttccctgc tccattcaac cttcccagaa acagtcttcc agacacacaa 5580 caggtgtgtt tccatggtga ctctaagtca catctagttg acaatgaagc ataaccagtg 5640 gtgagagcat ggaaatggtc tcaggtacgt tttccaaact gccacctttt aattccaccc 5700 cttacctgtg ggtttatgtg ctccaggtac ggattcaaca gccacgggct ctcagtggtg 5760 gaacacaggc tacgggccag acagcagaag cagaacaagc tcactgcagg taaactcagg 5820 tgttgtggga gggacttact aactctatta caaagaaaca tggggagggc atgggattca 5880 gcaataagaa acaaatgagc aaacaattaa aaccccacag aacaactcag gggattgtcc 5940 agcttctacc acagcctcaa aggtctcaac cagatggcat aattcagcaa aaccttgctg 6000 gtctctggca tccatggaac ctgaattgtg tcttaactta ggggcttgaa gatcagcaga 6060 gagcatgtgt ggagctaaga tgcgccccga gttcatcttc ccacatcccg ccctgctgct 6120 gtccttctgt tcactgtgta aatagtgtgt attagttctg gaagagctac agaagagaat 6180 agagttgtca cactcctgtc cttccactca ggggaccagc tgtcctcaaa tctcacttcg 6240 gaaacaacct ttgcttttgg tggattctca tggagacgct ccagtttgtc ctctgtggtc 6300 tgcatggctc tctgaagtgc attttggggt caaagccctg ggtggtggcc cccctcccca 6360 tgtctccctg tgtggcttct gcagtccatg gagatttttc tcctttgcct ctggaatgtc 6420 tttcaggagg tcttagtctc atttgatgtc cccatagtgt gacaattaag ccaaggactt 6480 ctgcatttat ttgaggagct aaggaagaga gggctgaagc atttgacgag tttagagggt 6540 gggaacagga aatgacaatg tttaaaaaaa cccctggttt tgacggaacc gggtctgcca 6600 gccctgtaga accttgaaca caatgtttgt ggtttgtggc gttctcctgc ctcctgcctt 6660 ccgtttcttc gttttaatgc cttctgtggg ctaggtttat tgccattgtc 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gatagttgaa 7560 aacatttcct agtgttttcc tgtgtagctc aggctggcct cagacttaca gcaatcctcc 7620 tgcagactaa atttccatgt gtggcctcca gtgttttata cttttgtttt taatcatttc 7680 acatacagtc ccttgaccaa ggctcatgag attcaggttg ttcttgctga catgcccatc 7740 aatacctgcc tactctctct tttgttatct ctcaaaccac tgatctgtga atatagcaag 7800 tgtcattggg agtcatttta ttgctacata cttcaagaag agcagtagta tttgtttttt 7860 tccccatgtc cctgatttgt ctggactcag atccttggcc acccatgcag tcagtgttgg 7920 ggatgggttc catctcatgg attgggcctt aaatacaatc agattctggt tggttactcc 7980 cgcagctttg tgctactgtt tcactagtgc atccagggca ggtcatcatt gtagatcaaa 8040 agatgtgtag cggggttggt gtttaccttt ctcctttggt aacatgcaga atacctccca 8100 gtaccatgga caccaccaga gggatgaagg ctgtaggtag gcaccagctc gacttctccc 8160 tatttaataa cttgtgtagg tgttgtcttt agcaatagag ccttgtcagt tttcagagag 8220 caaccaatat ccttgacaat agcctgggtt gtttgggtat tctcatgggg cccctttggc 8280 caacaacttc tttgaaagtc tggtcaaatt cttcactaaa accatctggc actgggcatt 8340 ttttggttgg gaggctttta tgactgcttc tattttacta ggggttataa 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ccccttggct gactacctgg tggtgaatgt 11760 gtccagtccc aacactgctg gtctgaggag cctacaggga aaggctgagc tgcgccgcct 11820 gctggccaag gtgtgtcatt acaccatcac atgcctgttg tccttactcc ttttcattct 11880 tcaggtgaag attcaggaca actgaggaga aactgttctt cacagctggc ctaggagccc 11940 tcatcacaca ttttccaagt accctctcat gtctcacagc cccggtcata cacaatagac 12000 agttcactgc tttaaaacca caggcaagca gagcagagca ggcggggctc ccatgtatca 12060 ctctgtcccc agaactgtga atgctcagca cttgtgacac acctccttgt ttgttttcag 12120 gaacaaaatc aaaacccttg agcagttatc tcggcggggg gtgcgggggt gggggaattg 12180 ctggtgcttt agttgacctt aggtgaaaat gctggcctgc actgcggggc tatgggctgg 12240 gtccccatct ctggcttgtc aacctaggtg ctgcaggaga gggacgcttt gaagggagcg 12300 cagaagccag cagtgctggt gaagatcgcc cccgacctca cggcccagga caaggaggac 12360 attgccagtg tggcgagaga ggtttgagtt ggggtggtcc agggcagggt gggggtagcc 12420 ttcatcgtcc actgctgctg ggataacaca gaagggcatg attggtgact tcctctgtgt 12480 gaagtggaca gctggttgat tgtctgtcat tgtatagttc atctggtagc aaacagtgag 12540 tttgaaaatg tgtttggtga gtctttttct tgcttctgat ctgtcttcat ccagaaagtc 12600 tgaggcctgt gctagtctct gccagtctca cctgggactt agaatggtgt ctgtcccttt 12660 ccagcttgtg taaacaccag gcttctctgg ctaaaaaggt agtaggaaca cagtctgctg 12720 ttctggactt cagtcttgtt ctactgtgta ctccctgaga tactcacaga cagcttgttc 12780 taagggtcaa actctgtgta ggcactgtga tgggttcagc aggagatgct gctgtgtctt 12840 cagcattgag aggctaattc tgatggcttc tccaatcaag atgtaggtga ggcctgtgag 12900 ggtcttgctc tgcagagctg gcccctggcc tggtggctgc ttcaatcctc aaaagacagt 12960 ttccttgagt acttcagatc catggcttaa ggctcttttt ctgtcttgtg ctgcagctgg 13020 gcattgatgg attaattgtc acaaacacca cagtgagtcg cccgactggc ctccaaggtg 13080 ctctgcgttc tgagatggga ggactgagcg ggaagccact ccgagatctg tcgacccaga 13140 ccatccggga gatgtacacc ctcactcaag gtaaggcttt tttgtttgtt tgtttgaggc 13200 aggatttctc tgtttaacac ctctggctgt cctggaactc acttggtaga ccaggctggc 13260 ctggaactca cagcttccct agtgctggga ttaaaggcat gtgccaccat tgcctggcta 13320 aggcaagact tctttggaca aatgtgaggt cctggatctt ccctcattca ctgtgtttgc 13380 tgagaactct ggttctgccc tcatcggctg tgtttgctgg gactgaggcc tgatggagcc 13440 ctgggtcttt agccctccct tcccggcctt gctatgtgct tctctccagg caggattccc 13500 attatcgggg ttggtggtgt gagcagtggg caagatgcgc tggagaagat ccaggcaggg 13560 gcctccctgg tgcagctgta cacggccctc accttcctgg ggccacccgt cgtggtcagg 13620 gtcaagcgtg agctggaggc acttctaaag tgagtagggt tcgatgcagc tgagacgtag 13680 aaagtgacac ttgtcatcag tctattgtgt actcccagag ggccggaggg aacactgagg 13740 gcatggtggg acgatttctc tgctgcagct ttggccaagg acaaacagtg ccagaggaat 13800 tcagaatgct tctgaggcag ggctcattac aaggcaggac ttgccacttg cccaggggct 13860 gggcatggag gatgaagtag taatttacat tgactcagtg tctggaagct gcaggttata 13920 aagtcacttc ccttcctgca cagaaggcct ggctgtacat atgtgcaggg gcctgggtga 13980 gggcagagta gcagtggttg taaggtgtgt tgggtgggac ggtgtggtaa gcggtgtgct 14040 catggtgagt gtgggcttcc ttaggacagg ctatttgttt tctgtccaga gagcggggtt 14100 ttaacacagt cacagaagcc attggagcag atcatcggag gtgacggttc ctgccagatg 14160 ccccatccag aacgtgccca ccaactcaag caagccttgt ggctgcatca taagaggaag 14220 atctgtctca agctatgtcc cttgactgtg tgacctggct ggactgcata agccagtcac 14280 ggttatcact agacagtaaa ggctttctct aatgagacca tgaactctac agtcactttc 14340 tggatctaag tcctgggatc cctcagtatt ataaggacat tggctctttg ggaggaaaaa 14400 tcatggagaa aataaagcca tttcaatctg ttttcaa 14437 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> corresponding piece of DNA for generating gRNA <400> 23 caaggatgat ggctgcatcc 20 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence1') <400> 24 ggatgcagcc atcatccttg gtttt 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence1') <400> 25 caaggatgat ggctgcatcc cggtg 25 <210> 26 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of human DHODH G202A <400> 26 Met Ala Trp Arg His Leu Lys Lys Arg Ala Gln Asp Ala Val Ile Ile 1 5 10 15 Leu Gly Gly Gly Gly Leu Leu Phe Ala Ser Tyr Leu Met Ala Thr Gly 20 25 30 Asp Glu Arg Phe Tyr Ala Glu His Leu Met Pro Thr Leu Gln Gly Leu 35 40 45 Leu Asp Pro Glu Ser Ala His Arg Leu Ala Val Arg Phe Thr Ser Leu 50 55 60 Gly Leu Leu Pro Arg Ala Arg Phe Gln Asp Ser Asp Met Leu Glu Val 65 70 75 80 Arg Val Leu Gly His Lys Phe Arg Asn Pro Val Gly Ile Ala Ala Gly 85 90 95 Phe Asp Lys His Gly Glu Ala Val Asp Gly Leu Tyr Lys Met Gly Phe 100 105 110 Gly Phe Val Glu Ile Gly Ser Val Thr Pro Lys Pro Gln Glu Gly Asn 115 120 125 Pro Arg Pro Arg Val Phe Arg Leu Pro Glu Asp Gln Ala Val Ile Asn 130 135 140 Arg Tyr Gly Phe Asn Ser His Gly Leu Ser Val Val Glu His Arg Leu 145 150 155 160 Arg Ala Arg Gln Gln Lys Gln Ala Lys Leu Thr Glu Asp Gly Leu Pro 165 170 175 Leu Gly Val Asn Leu Gly Lys Asn Lys Thr Ser Val Asp Ala Ala Glu 180 185 190 Asp Tyr Ala Glu Gly Val Arg Val Leu Ala Pro Leu Ala Asp Tyr Leu 195 200 205 Val Val Asn Val Ser Ser Pro Asn Thr Ala Gly Leu Arg Ser Leu Gln 210 215 220 Gly Lys Ala Glu Leu Arg Arg Leu Leu Thr Lys Val Leu Gln Glu Arg 225 230 235 240 Asp Gly Leu Arg Arg Val His Arg Pro Ala Val Leu Val Lys Ile Ala 245 250 255 Pro Asp Leu Thr Ser Gln Asp Lys Glu Asp Ile Ala Ser Val Val Lys 260 265 270 Glu Leu Gly Ile Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Thr Thr Val Ser Arg 275 280 285 Pro Ala Gly Leu Gln Gly Ala Leu Arg Ser Glu Thr Gly Gly Leu Ser 290 295 300 Gly Lys Pro Leu Arg Asp Leu Ser Thr Gln Thr Ile Arg Glu Met Tyr 305 310 315 320 Ala Leu Thr Gln Gly Arg Val Pro Ile Ile Gly Val Gly Gly Val Ser 325 330 335 Ser Gly Gln Asp Ala Leu Glu Lys Ile Arg Ala Gly Ala Ser Leu Val 340 345 350 Gln Leu Tyr Thr Ala Leu Thr Phe Trp Gly Pro Pro Val Val Gly Lys 355 360 365 Val Lys Arg Glu Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gly Phe Gly Gly 370 375 380 Val Thr Asp Ala Ile Gly Ala Asp His Arg Arg 385 390 395 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence2') <400> 27 gatgcagcca tcatccttgg gtttt 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence2') <400> 28 ccaaggatga tggctgcatc cggtg 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence3') <400> 29 gcagccatca tccttggggg gtttt 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence3') <400> 30 cccccaagga tgatggctgc cggtg 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence4') <400> 31 gccatcatcc ttgggggagg gtttt 25 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence4') <400> 32 cctcccccaa ggatgatggc cggtg 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence5') <400> 33 gctattcgct tcacgtccct gtttt 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence5') <400> 34 agggacgtga agcgaatagc cggtg 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence6') <400> 35 gcctctacaa actgggcttt gtttt 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence6') <400> 36 aaagcccagt ttgtagaggc cggtg 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence7') <400> 37 ggctttgggt ttgtcgaggt gtttt 25 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence7') <400> 38 acctcgacaa acccaaagcc cggtg 25 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence8') <400> 39 gctggtctga ggagcctaca gtttt 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide used for obtaining gRNA (Sequence8') <400> 40 tgtaggctcc tcagaccagc cggtg 25 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 603 sense oligonucleotide <400> 41 gttggccttc caatggctt 19 <210> 42 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 503 antisense oligonucleotide <400> 42 gttccttcac aaagat 16 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence including targeted sequence and PAM <400> 43 ggatgcagcc atcatccttg g 21 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense DHODH exon2 sequence region including CrispR sequence n? <400> 44 gacgaaacac cgggatgcag ccatcatcct tggttttaga 40 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense DHODH exon2 sequence region including CrispR sequence n? <400> 45 tctaaaacca aggatgatgg ctgcatcccg gtgtttcgtc 40

Claims

부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 데히드로오로테이트 데히드로게나제 (DHODH) 유전자를 포함하는 세포주.
제1항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주인 세포주.
제1항 또는 제2항에 있어서,
a) 세포 내의 내인성 DHODH 유전자를 불활성화시키는 단계, 및
b) 세포를 우리딘을 포함하는 배양 배지에서 내인성 DHODH 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 세포주를 생성하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계
에 의해 생산된 세포주.
제3항에 있어서, 내인성 DHODH 유전자가 유전자-편집 방법에 의해 불활성화된 것인 세포주.
제4항에 있어서, 내인성 DHODH 유전자가 CRISPR-Cas9 방법에 의해 불활성화된 것인 세포주.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 DHODH 유전자의 1개 이상 또는 모든 대립유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 것인 세포주.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 포유동물 DHODH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 재조합 단백질을 발현시키기 위한 적어도 1개의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 상기 외인성 DHODH는 서열식별번호: 2의 서열 또는 서열식별번호: 4의 서열에 대해 적어도 60% 동일한 서열을 포함하는 것인 세포주.
(i) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 세포주, 및
(ii) 포유동물 DHODH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 재조합 단백질을 발현시키기 위한 적어도 1개의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터이며, 여기서 상기 DHODH는 서열식별번호: 2의 서열 또는 서열식별번호: 4의 서열에 대해 적어도 60% 동일한 서열을 포함하는 것인 발현 벡터
를 포함하는 발현 시스템.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 1의 서열 또는 서열식별번호: 3의 서열을 포함하는 것인 세포주 또는 발현 시스템.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 모노클로날 항체인 세포주 또는 발현 시스템.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 항체 경쇄의 클로닝에 적합한 제1 발현 카세트 및 항체 중쇄의 클로닝에 적합한 제2 발현 카세트를 포함하는 것인 세포주 또는 발현 시스템.
(i) 제7항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 세포주 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템 및 (ii) 우리딘이 결여된, 특히 추가로 DHODH 억제제가 결여된 배양 배지를 포함하는 키트.
A) a1) 제7항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 세포주를 제공하는 단계;
또는
a2) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 세포주를 제공하는 단계, 및
a2') 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 단계 a2)에서 제공된 세포주 내로 도입하는 단계;
또는
a3) 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 세포주를 제공하는 단계,
a3') 단계 a3)에서 제공된 세포주 내의 내인성 DHODH 유전자를 부분적으로 또는 완전히 불활성화시키는 단계, 및
a3") 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 단계 a3')에서 수득된 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 내인성 DHODH 유전자를 포함하는 세포주 내로 도입하는 단계;
B) 상기 세포주를 재조합 단백질의 생산에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및
C) 상기 재조합 단백질을 단리 및/또는 정제하는 단계
를 포함하는, 재조합 단백질을 생산하는 시험관내 방법.
제13항에 있어서, 단계 B)가 우리딘이 결여된, 특히 추가로 DHODH 억제제가 결여된 배양 배지에서 수행되는 것인 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 재조합 단백질을 제약 조성물로 제제화하는 단계 D)를 추가로 포함하는 방법.
재조합 단백질을 생산하기 위한, 제7항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 세포주, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템 또는 제12항에 따른 키트의 용도.
제16항에 있어서, 세포주, 발현 시스템 또는 키트가 우리딘이 결여된, 특히 DHODH 억제제가 부재하는 배양 배지와 조합되어 사용되는 것인 용도.