KR20210141181A

KR20210141181A - 황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법 및 그 방법에 의한 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20210141181A
Application number: KR1020200058511A
Authority: KR
Inventors: 엄기안; 김상윤; 심준보; 장미란; 조운이; 송인규
Original assignee: 주식회사 휴온스내츄럴
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2021-11-23
Also published as: KR102491460B1

Abstract

본 발명은 황금 추출물의 배당체(glycoside)를 생물전환하여 비배당체(aglycone)를 증대시키는 방법 및 그 방법에 의한 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 황금(Scutellaria baicalensis)을 70% 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법은 종래 제조 방법에 비해 간편하고 저가의 비용과 빠른 시간으로 배당체인 바이칼린(Baicalin) 또는 우고노사이드(Wogonoside)를 비배당체인 바이칼레인(baicalein) 또는 우고닌(Wogonin)으로 증대시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 비배당체가 증가된 황금 추출물은 돼지유행성설사(porcine epidemic diarrhea, PED) virus에 대한 항-바이러스 효능이 우수하여, 상기 바이러스에 의해 발생되는 돼지유행성설사병의 예방 및 치료에 효과적이므로, 관련 약학 산업 뿐만 아니라 사료 및 사료첨가제로 이용될 수 있다.

Description

황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법 및 그 방법에 의한 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물{Method for increasing bioconversion of glycoside to aglycone using Scutellaria baicalensis extract and composition obtained thereby}

본 발명은 황금 추출물의 배당체를 비배당체로 증대시키는 방법 및 그 방법에 의한 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

식물에 존재하는 알칼로이드(alkaloid)류, 플라보노이드(flavonoid)류, 페놀 화합물(phenolic compound)류, 퀴논(quinone)류 등의 2차 대사산물들은 항생제 효능을 가지고 있으며[Choi et al., J Kor Plant Res 19(4): 491-496, 2006.], 인공적으로 합성된 화합물에 비해 부작용이 적은 장점이 있다.

천연물 유래의 다양한 생리활성물질은 대부분 당이 붙어 있는 형태인 배당체 형태로 존재하여 비배당체 형태보다 분자량이 크고 세포 내 낮은 흡수율로 생체내 이용률이 상대적으로 낮다. 반면 비배당체 구조는 장세포막 지질에서 용해도가 높아 장 세포막 투과가 용이하다[Kim et al., 2010, Korean J Food Cookery Sci 17:214-219]. 그 예로는 제니스테인(genistein), 진세노사이드(ginsenosides) 등이 있으며 이러한 물질들은 유효 생리물질이지만 대장까지의 이동 및 장내 미생물에 의한 비배당체 전환 시 많은 시간이 소요되기 때문에 체내 흡수율이 낮아 실질적으로 체내 흡수를 통한 유효 생리활성을 나타내는 metabolite form인 비배당체의 연구가 진행되고 있다 [(Kim et al., 2006, J Life Sci 16:136-140), (Quan et al., 2008, J Ginseng Res 32:226-231), (Lim et al., 2009, J Korean Soc Food Sci Nutr 38:1167-1173.)].

황금(Scutellaria baicalensis)은 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로 한약재로 사용된다. 지금까지 알려진 약효성분은 바이칼레인(Baicalein), 바이칼린(Baicalin), 우고닌(Wogonin), 우고노사이드(Wogonoside) 등이 있다. 중국에서는 고열, 마른기침, 토혈, 변비 등으로 황금이 사용되었으며[Kim et al., 2006, J Korean Soc Food Sci Nutr 35(5): 543-548)], 약리작용으로는 항균 [(Bae et al., 2005, J Kor Micribiol Biotechnol 33(1): 35-40: 2005), (Leach, 2011, Bioscience Horizons, 4: 119-127.)], 항곰팡이[(Wang et al., 2015, Microb Pathog, 87:21-9)], 항바이러스 (Nayak et al., 2014, J Antimicrob Chemother, 69:1298-1310.)] 및 간보호[(Pen et al., 2012, J Ethnopharmacol, 139:829-837.)] 등 다양한 효능을 가지고 있다. 특히 황금은 돼지 살모넬라에 다양한 항균효능이 있는 것으로 알려져 있다[(Kim et al., 2008, Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22:619-623.), (Kim et al., 2015, J. Int. Korean Med. 36:165-179.)].

최근 전 세계적으로 축산업에 항생제 사용을 제한하고 있으나 질병이 발생 시 밀집 사육 등으로 빠른 전염이 발생하여 폐사율이 급증하여 농가에 경제적 손실을 초래한다. 특히 살모넬라증은 살모넬라속 세균에 의해 발병하는 질환의 총칭이며 축산업에 큰 피해를 야기하고 있다. 양계에서는 Salmonella gallinarum에 의해 가금티푸스(fowl typhoid)가 발생하며, 양돈에서는 Salmonella choleraesius, Salmonella typhimurium 감염에 의해 돼지 살모넬라증(porcine salmonellosis) 가 발생한다. 또한 양돈에서는 살모넬라증 뿐만 아니라, 구토 및 수양성 설사를 유발하는 PED(porcine epidemic diarrhea) virus의 빈도 높은 감염으로 심각한 경제적 손실을 초래한다. 특히 Salmonella 균과 virus가 혼합 감염 시, 각각의 단독 감염보다 체중 감소 및 증가와 같은 부정적인 영향이 일어나며, 시너지로 더 높은 감염이 일어날 수 있다[(Yang et al., 2017, Korean J Vet Res, 57, 235-243.), (Wills et al., 2000, Vet Microbiol.71(3-4):177-192.)].

따라서 본 발명에서는 황금추출물의 생물전환을 통해 유효물질 중 비배당체 함량을 증대시켰으며, 생물전환된 황금추출물의 PED 바이러스의 항바러스능 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 황금 추출물의 배당체(glycoside)를 생물전환하여 비배당체(aglycone)를 증대시키는 방법 및 그 방법에 의한 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 황금 추출물의 배당체(glycoside)를 생물전환하여 비배당체(aglycone)를 증대시키는 방법에 의한 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물, PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물, 그리고 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 황금 추출물의 배당체(glycoside)를 생물전환하여 비배당체(aglycone)를 증대시키는 방법은 황금(Scutellaria baicalensis)을 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 가수분해효소는 펙티나아제(Pectinase), 베타-글루카나아제(β-glucanase), 셀룰라아제(Cellulase), 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), 베타-글루카나아제(β-glucanase), 글루칸 1,4-알파-글루코시다제(glucan 1,4-α-glucosidase), 베타-글루코시다제(β-glucosidase), 글루카나아제(glucanase) 및 아라비나나아제(arabinanase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

일 실시예에 있어서, 상기 배당체는 바이칼린(Baicalin), 우고노사이드 (Wogonoside), 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 글리시틴(glycitin), 사포닌(saponin), 프로시아니딘(procyanidin), 나린제닌(naringenin), 루티노오스(rutinose), 헤스파리딘(hesperidin), 모그로사이드 V(Mogroside V), 아미그달린(amygdalin) 및 3-페놀 쿠마린(3-Phenyl coumarin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 비배당체는 바이칼레인(baicalein), 우고닌(Wogonin), 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 사포제닌 (sapogenin), 3,4-하이드록시페닐아세트산(3,4-Hydroxyphenylaetic acid), 4-HPA, m-쿠마린산(m-coumaric acid), p-쿠마린산(p-coumaric acid), O-beta-D-glucuronides, 스틸베노이드(stilbenoids), 루틴(rutin), 헤스파레틴(hesparetin), 모그로사이드 IIIE(Mogroside IIIE), 멘데로니트릴(mendelonitrile) 및 벤즈알데하이드(benzaldehyde)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

일 실시예에 있어서, 황금 추출물 총 중량에 가수분해효소를 5 - 20%(w/w)로 처리하는 것을 특징으로 한다.

다른 일 실시예에 있어서, pH4 내지 9에서 30 내지 60도의 온도 조건으로 처리하는 것을 특징으로 한다.

일 실시예에 있어서, 황금(Scutellaria baicalensis)을 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, PEDv 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 황금(Scutellaria baicalensis)을 70% 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물의 제조방법을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 황금(Scutellaria baicalensis)을 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 생물전환 방법에 의한 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 생물전환 방법에 의한 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 생물전환 방법에 의한 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 생물전환 방법에 의한 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법은 종래 제조 방법에 비해 간편하고 저가의 비용과 빠른 시간으로 배당체인 바이칼린(Baicalin) 또는 우고노사이드(Wogonoside)를 비배당체인 바이칼레인(baicalein) 또는 우고닌(Wogonin)으로 증대시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 비배당체가 증가된 황금 추출물은 돼지유행성설사(porcine epidemic diarrhea, PED) virus에 대한 항-바이러스 효능이 우수하여, 상기 바이러스에 의해 발생되는 돼지유행성설사병의 예방 및 치료에 효과적이므로, 관련 약학 산업 뿐만 아니라 사료 및 사료첨가제로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 황금원물 3종, 황금추출물 1종 (Gianon)에 대한 유효물질(baicalin, baicalein, wogonoside, wogonin)의 함량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 생물전환 황금 추출물의 최적화 조건을 확인하기 위하여, 각 pH 조건 및 온도조건에 따른 baicalein 및 wogonin의 함량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 VERO-76 세포에 각 농도별 황금 추출물 희석액(1000배, 500배, 250배, 100배, 10배)을 처리한 후 시간별(24시간, 48시간) 세포 생존력(%)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 VERO-76 세포에 각 농도별 황금 추출물 희석액(1000배, 500배, 250배, 100배, 10배)을 처리 및 PEDv를 접종 후 날짜별(0, 1, 2, 3, 4일) 항바이러스 효능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 VERO-76 세포에 각 농도별 생물 전환 황금 추출물 희석액(1000배, 500배, 250배, 100배, 10배)을 처리한 후 시간별(24시간, 48시간) 세포 생존력(%)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 VERO-76 세포에 각 농도별 생물 전환 황금 추출물 희석액(1000배, 500배, 250배, 100배, 10배)을 처리 및 PEDv를 접종 후 날짜별(0, 1, 2, 3, 4일) 항바이러스 효능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 황금 추출물(Scutellaria baicalensis extract)에 가수분해효소(hydrolase)를 처리하는 단계를 포함하는, 황금 추출물의 배당체(glycoside)를 비배당체(aglycone)로 증대시키는 생물전환(bioconversion) 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "생물전환(bioconversion)"은 생물의 생리적 기능을 이용해 첨가된 물질을 화학적으로 변형된 형태로 전환시키는 과정을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 황금 추출물의 배당체를 비배당체로 증대시키는 것을 의미한다.

상기 가수분해효소는 펙티나아제(Pectinase), 베타-글루카나아제(β-glucanase), 셀룰라아제(Cellulase), 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), Viscozyme® L(β-glucanase), AMG(glucan 1,4-α-glucosidase), Plantase UF(pectinase), Pluszyme(β-glucosidase), Peclyve UF cleaner(glucanase, arabinanase) 및 Peclyve PR(pectinase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 펙티나아제(Pectinase)이나 본 발명의 황금 추출물의 배당체를 비배당체로 증대시키기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.

상기 배당체는 바이칼린(Baicalin), 우고노사이드(Wogonoside), 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 글리시틴(glycitin), 사포닌(saponin), 프로시아니딘(procyanidin), 나린제닌(naringenin), 루티노오스(rutinose), 헤스파리딘(hesperidin), 모그로사이드 V(Mogroside V), 아미그달린(amygdalin) 및 3-페놀 쿠마린(3-Phenyl coumarin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 바이칼린(Baicalin) 또는 우고노사이드(Wogonoside)이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 비배당체는 바이칼레인(baicalein), 우고닌 (Wogonin), 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 사포제닌 (sapogenin), 3,4-하이드록시페닐아세트산(3,4-Hydroxyphenylaetic acid), 4-HPA, m-쿠마린산(m-coumaric acid), p-쿠마린산(p-coumaric acid), O-beta-D-glucuronides, 스틸베노이드(stilbenoids), 루틴(rutin), 헤스파레틴(hesparetin), 모그로사이드 IIIE(Mogroside IIIE), 멘데로니트릴(mendelonitrile) 및 벤즈알데하이드(benzaldehyde)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 바람직하게는 바이칼레인(baicalein) 또는 우고닌(Wogonin)이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 처리는 황금 추출물 총 중량에 가수분해효소를 5-20%(w/w)로 처리할 수 있고, 바람직하게는 7-15%(w/w)이고, 더욱 바람직하게는 가수분해효소를 10%(w/w)으로 처리할 수 있다. 또한, 상기 처리는 pH4 내지 9에서 30 내지 60도의 온도 조건일 수 있고, 바람직하게는 pH4 내지 7에서 30 내지 50도이나, 본 발명의 황금 추출물의 배당체를 비배당체로 생물전환하는 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명은 종래 황금 원물 또는 황금 추출물의 유효물질 함량을 비교한 결과, 배당체의 함량이 높은 바이칼린(Baicalin) 및 우고노사이드(Wogonoside)를 포함하는 생물 전환을 위한 시료를 선발하였다. 그 후, 상기 선발된 시료에 10종류의 가수분해효소를 각각 처리한 결과, 펙티나아제가 가장 생물 전환 효소로서 우수함을 확인하였다. 생물 전환 최적화를 위하여, 각 다른 온도 및 pH로 효소 처리를 진행한 결과, 50℃ 및 pH5 조건에서 최적의 생물전환 조건이 나타남을 확인하였다.

본 발명에서 생물 전환을 위하여, 황금 추출물(기질)에 효소를 처리하여 최적 온도 및 pH의 조건으로 효소 반응을 할 수 있으며, 상기 "효소 반응"은 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 기질과 효소가 반응하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 생물전환 방법에 의하여 제조된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 돼지유행성설사(porcine epidemic diarrhea, PED) virus 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물에는 상기 생물전환 방법에 의하여 제조된 황금 추출물 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 단일 도메인 항체의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ug/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ug/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ug/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 생물전환 황금 추출물에 대한 PED 항바이러스 효능을 확인하기 위하여, 바이러스 함유량 및 세포독성 시험을 수행한 결과, 종래 기존 황금 추출물과 비교하여 본 발명의 생물전환 황금 추출물이 바이러스 함유량 및 세포 독성이 낮음을 확인하여, 본 발명의 생물전환 황금 추출물의 PED의 항바이러스 효과가 우수함을 확인하였다.

또한 본 발명은 생물전환 방법에 의하여 제조된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 생물전환 방법에 의하여 제조된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 PEDv의 생장을 억제하는 바, 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 유효성분 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 유효성분을 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예 사료를 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%으로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식 발효 사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 종래 사료에 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 사료에 첨가되는 성분의 일 예로서 곡류 분말, 고기 분말, 및 두류 등을 포함할 수 있다. 상기에서 곡류 분말은 쌀가루, 밀가루, 보리가루, 및 옥수수가루 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기에서 고기 분말은 닭고기, 소고기, 돼지고기, 및 타조 고기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 분말화한 고기분말을 사용할 수 있다. 상기에서 두류는 대두, 강낭콩, 완두콩, 및 검정콩 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 상기에서 언급한 종래 사료에 첨가되는 성분인 곡류분말, 고기분말, 및 두류 이외에도 사료의 영양성을 증대시키기 위해 영양제, 및 무기물 중에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가할 수 있으며, 사료 품질의 저하를 막기 위해 항곰팡이제, 항산화제, 항응고제, 유화제, 및 결착제 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, PEDv 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는, 황금 추출물의 배당체를 비배당체로 생물 전환하기 위한 조성물을 제공한다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 황금 원료 선정

황금원물 3종, 황금추출물 1종(Gianon)의 유효성분 바이칼린(baicalin), 바이칼레인(baicalein), 우고노사이드(wogonoside), 우고닌(wogonin)의 함량을 분석하고자 황금 1 g을 70% 에탄올에 200분의 1 부피비로 혼합한 후 가열용 맨틀(heating mantle)에서 85℃, 90분간 추출하였다. 추출된 시료는 0.2 um 필터에 여과한 뒤 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 상기 4종류의 유효성분을 분석하였다[Yu et al., 2013, Oncol Rep. 2013 Nov;30(5):2411-2418]. 표준품으로는 95% 바이칼린(Baicalin) (572667, sigma), 98% 바이칼레인(Baicalein) (465119, sigma), 95% 우고노사이드(Wogonoside) (SMB00081, sigma), 98% 우고닌(Wogonin) (W0769, sigma)를 사용하였으며, 분석 컬럼으로 RStech사의 칼럼 (C18-T51002546)으로 약 5 um의 입자 크기, 약 25 cm의 칼럼 길이 및 약 4.6 mm의 칼럼 직경을 사용하였다. 컬럼 온도는 30℃, 검출기 파장 275 nm에서 상기 시료를 각각 10 ul를 주입하고 0.8 ml/min의 속도로 80분간 이동상 용매 (18% Methanol, 25% acetonitrile, 57% water, 0.2% acetic acid)를 사용하여 시료를 전개하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 황금 원물 및 황금 추출물의 유효물질의 함량을 비교한 결과, 황금추출물에서 높은 바이칼린 및 우고노사이드함량을 확인할 수 있었으며, 황금추출물(Gianon)을 추후 생물 전환을 위한 시료로 사용하였다.

<실시예 2> 생물 전환 효소 선정

상기 선정된 황금추출물에 10종류의 가수분해효소 (hydrolase)를 각각 처리하여 생물전환을 확인하였다. 사용된 효소로는 β-glucanase(Yinong, China), Pectinase(Yinong, China), Cellulase(Yinong, China), Viscozyme L(Novozymes, Denmark), AMG(Novozymes, Denmark), Plantase UF(Vision, Korea), Pluszyme(Vision, Korea), β-glucuronidase(Sigma, USA), Peclyve UF cleaner(Lyven, France), Peclyve PR(Lyven, France)이다. 간단히 황금추출물을 pH4.5의 0.1 M acetate buffer에 10분의 1 부피비로 혼합 후 황금추출물 중량의 가수분해효소 10% 처리하여 각 효소별 적정 활성 온도에서 8시간 반응시켰다.

표 1에 나타난 바와 같이, Yinong사의 pectinase(EC number: 3.2.1.15, 30,000 U/g)로 생물전환 시 유효물질 중 우고닌이 약 1.7배 증가됨을 확인하였다.

<실시예 3> 황금 추출물의 생물 전환 최적화

상기 실시예 2에 따라 선정된 효소 pectinase를 이용한 황금추출물의 생물전환 공정을 최적화하고자 각기 다른 온도, pH 조건에서 효소처리를 진행하였다. 구체적으로, pH5에서 37도, pH5에서 60도, pH5에서 50도, pH6에서 50도, pH7에서 50도, pH8에서 50도의 조건으로 상기 효소를 처리하여, 생물 전환 최적화 조건을 확인하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 50℃ 및 pH5 조건에서 생물 전환 후 물질인 바이칼레인 및 우고닌 함량이 황금추출물 대비 각각 2.88배, 2.06배 증가된 것을 확인하였다.

<실시예 4> 항바이러스 효능 확인

4-1. 항바이러스 효능을 위한 본 발명의 생물 전환 황금 추출물 준비

황금추출물과 본 발명의 생물전환 황금추출물의 PEDv에 대한 항바이러스 효능을 확인하기 위하여 각각 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Bio basic)에 20분의 1 부피비로 혼합하여 20배 희석하였다. 추출된 시료의 지표물질 함량은 하기 표 2과 같다. 20배 희석된 시료를 다시 각각 10배, 100배, 250배, 500배, 1000배로 희석하여 세포독성 및 항바이러스 실험에 사용하였다. 사용된 바이러스는 PEDv(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, ISU46065)를 사용하였으며, 평가 물질의 바이러스에 대한 항바이러스 효력을 평가하기 위해 농림축산검역본부고시 제2016-91호의 동물용의약품 등 안전성유효성 심사에 관한 규정에 준하여 시험을 실시하였다.

4-2. PED 바이러스에 대한 본 발명의 생물 전환 황금 추출물의 항바이러스 효능 시험

PED 바이러스에 대한 본 발명의 생물 전환 황금 추출물의 항바이러스 효능 시험을 수행하기 위하여, 바이러스에 대한 항바이러스 효과는 병원체 대조군과 비교하여 10⁴ TCID₅₀/mL 이상 사멸이 확인되면 유효한 것으로 판정하였다. PED 바이러스 배양은 공시바이러스주를 VERO-76 세포주에 접종하여 계대배양하였으며, 5% 소태아혈청이 첨가된 DMEM 배지를 사용하고, 공시바이러스의 함유량을 미리 시험하여 10⁶TCID₅₀/mL이상인 것을 시험에 사용하였다. 황금추출물, 또는 본 발명의 생물 전환 황금추출물의 처리는 VERO-76 세포가 단층을 이룬 12 well tissue culture plate에 물질의 희석 별 반응액 1 ml씩 접종하고 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 2시간 동안 처리하였다. 그 후 반응액을 모두 제거하고 바이러스 300 ul씩을 분주하여 1시간 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 흡착시켰다. 1시간이 지난 후 바이러스를 제거하고 물질의 희석 별 반응액 2 ml로 교체한 후 5%, CO_2, 37℃ 배양기에서 5일 동안 배양하였다. 물질의 항바이러스능을 검사하기 위해 처리한 순간부터 24시간마다 각 배양액을 330 ul씩 수거하였으며, VERO-76 세포가 단층을 이룬 96 well tissue culture plate에 희석 별로 2반복 이상으로 희석별 반응액 100 ul씩 접종하고 후 5% CO₂ 37℃ 배양기에서 1시간 동안 흡착시켰다. 그 후 희석액을 모두 제거하고 세포 배양액으로 교체한 후 5%, CO_2, 37℃ 배양기에서 5일간 배양하였다. 바이러스의 존재유무는 CPE(Cytopathic effect)를 확인하여 최종 판정하였다. 바이러스 함유량 계산은 Kaerber method를 이용하였다(도 3b 및 도 4b).

또한, 세포독성 시험은 VERO-76 세포를 5% 태아혈청이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다. VERO-76 세포가 단층을 이룬 96 well tissue culture plate에 물질들의 희석별 반응액 100 ul씩 3반복 이상으로 분주하고 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간, 48시간 동안 각각 처리하였다. 24시간, 48시간이 지난 후 반응액을 버리고 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) (2.5 mg/ml) 100 ul씩을 분주하고 140분 동안 흡착시켰다. 140분이 지난 후 65℃ 건조기에서 16시간 이상으로 건조하였다. 세포독성 판정은 DMSO 100 ul씩을 분주하고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 물질 처치 48시간 내에 80% 이하의 세포생존이 관찰되면 유의성이 있는 세포독성으로 판정하였다(도 3a 및 도 4a).

도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, Vero-76 세포에 10배와 100배 희석된 황금 추출물을 처리 시 바이러스 증식이 관찰되지 않았으나 10배와 100배 희석된 황금 추출물을 처리 시 20% 이상의 세포독성을 보였으므로 PED에 대한 항바이러스 효과는 유효하지 않음을 확인하였다. 반면, 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생물 전환 황금 추출물은 병원체 대조군과 비교하여 100배와 250배 희석된 황금 추출물을 처리 시 세포독성은 대조군과 비교하여 유의성이 없었으며, 100%의 바이러스 증식 억제가 관찰되어 PEDv에 대한 항바이러스 효과가 유효함을 확인하였다.

Claims

황금(Scutellaria baicalensis)을 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, 황금 추출물의 배당체(glycoside)를 생물전환하여 비배당체(aglycone)를 증대시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 가수분해효소는 펙티나아제(Pectinase), 베타-글루카나아제(β-glucanase), 셀룰라아제(Cellulase), 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), 베타-글루카나아제(β-glucanase), 글루칸 1,4-알파-글루코시다제(glucan 1,4-α-glucosidase), 베타-글루코시다제(β-glucosidase), 글루카나아제(glucanase) 및 아라비나나아제(arabinanase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배당체는 바이칼린(Baicalin), 우고노사이드 (Wogonoside), 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 글리시틴(glycitin), 사포닌(saponin), 프로시아니딘(procyanidin), 나린제닌(naringenin), 루티노오스(rutinose), 헤스파리딘(hesperidin), 모그로사이드 V(Mogroside V), 아미그달린(amygdalin) 및 3-페놀 쿠마린(3-Phenyl coumarin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 비배당체는 바이칼레인(baicalein), 우고닌(Wogonin), 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein), 사포제닌 (sapogenin), 3,4-하이드록시페닐아세트산(3,4-Hydroxyphenylaetic acid), 4-HPA, m-쿠마린산(m-coumaric acid), p-쿠마린산(p-coumaric acid), O-beta-D-glucuronides, 스틸베노이드(stilbenoids), 루틴(rutin), 헤스파레틴(hesparetin), 모그로사이드 IIIE(Mogroside IIIE), 멘데로니트릴(mendelonitrile) 및 벤즈알데하이드(benzaldehyde)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 처리는 황금 추출물 총 중량에 가수분해효소를 5 - 20%(w/w)로 처리하는 것을 특징으로 하는 황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 처리는 pH4 내지 9에서 30 내지 60도의 온도 조건으로 처리하는 것을 특징으로 하는 황금 추출물의 배당체를 생물전환하여 비배당체를 증대시키는 방법.
황금(Scutellaria baicalensis)을 70% 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, PEDv 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법.
황금(Scutellaria baicalensis)을 70% 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물의 제조방법.
황금(Scutellaria baicalensis)을 70% 에탄올에 추출한 황금 추출물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물의 제조방법.
제1항의 생물전환 방법에 의한 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물.
제1항의 생물전환 방법에 의한 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항의 생물전환 방법에 의한 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
제1항의 생물전환 방법에 의한 가수분해효소가 처리된 황금 추출물을 유효성분으로 포함하는 PEDv 감염증의 예방 또는 개선용 사료첨가제 조성물.