KR20210132678A - 취약 x 정신 지체 단백질 간섭 올리고뉴클레오타이드 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

취약 x 정신 지체 단백질 간섭 올리고뉴클레오타이드 및 이를 사용하는 방법 Download PDF

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프란세스카 비티
살바토레 벨린비아
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노그라 파마 리미티드
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Abstract

취약 X 정신 지체 단백질(FMRP)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열 및 FMRP의 증가된 활성 또는 발현과 관련된 결장직장암 및 염증성 장 질환(예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염)과 같은 장 질환을 치료하기 위해 이를 사용하는 방법이 본원에 개시된다. 장 질환을 치료하는 데 유용한 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학 조성물 및 장 질환을 치료하는 데 사용되는 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약제의 제조가 또한 개시된다.

Description

취약 X 정신 지체 단백질 간섭 올리고뉴클레오타이드 및 이를 사용하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 2월 26일에 출원된 미국 가출원 제62/810,697호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
RNA 결합 단백질(RBP)은 전사후 조절 과정의 거의 모든 단계에 관여하여, 세포에서 각 전사체의 운명 및 기능을 좌우하고 세포 항상성을 보장한다. RBP는 단백질뿐만 아니라 코딩 및 비코딩 RNA와 매우 역동적인 상호작용을 확립하여, RNA 스플라이싱, 폴리아데닐화, 안정성, 국소화, 번역, 및 분해를 조절하는 리보핵단백질 복합체로 불리는 기능적 단위를 생성한다.
RBP는 상이한 유형의 암에서 조절되지 않아 종양형성촉진 및 종양 억제자 단백질, 및 염증 매개체의 발현 및 기능에 영향을 미친다는 것이 이제 명백해졌다. 몇 가지 연구들은 RBP가 인접한 정상 조직에 비해 암에서 비정상적으로 발현되고 이들의 발현이 환자의 예후와 상관관계가 있다는 증거를 제공하였다. 최근에, 취약 X 정신 지체 단백질(fragile X mental retardation protein, FMRP)은 많은 상이한 유형의 인간 암의 발달 및 성장을 제어하는 데 중추적으로 중요하다는 것 때문에 인정을 받고 있다. FMRP의 돌연변이 또는 부재는 인간에서 유전적 지적 장애의 가장 흔한 형태인 취약 X 증후군(FXS)을 유발한다. FMRP는 RNA 대사의 다수의 단계에 관여하는 RBP이다. 뇌에서, 그의 기능적 부재는 시냅스에서의 세포골격 조직 및 수용체 이동성의 결함으로 인해 손상된 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 유발한다. 표적 mRNA의 신원, 비코딩 RNA의 존재 및/또는 세포 맥락에 따라, FMRP는 번역의 부정적인 조절자로서 작용할 수 있거나, mRNA의 안정성을 조절할 수 있거나, mRNA 수송을 조절할 수 있거나, 또는 RNA 편집에 영향을 미칠 수 있다. 흥미롭게도, FMRP 조절된 mRNA는 암 진행 및 전이를 제어하는 몇 가지 메커니즘에 관여한다.
수렴하는 증거는 상이한 유형의 암에서 FMRP의 관여를 강조한다: FMRP를 코딩하는 FMR1 유전자는 상이한 조직 및 암 세포 유형에서 발현되고; FMR1 상염색체 파라로그(autosomal paralog) 및 상호작용자인 FXR1은 최근에 삼중 음성 유방암에서 원격 전이의 예측자로서 확인되었고, 몇 가지 FMRP mRNA 표적들은 암 진행에 관여한다. 더욱이, 일반 인구에서의 비율과 비교하여, FSX 환자에서 표준화된 암 발병률은 유의하게 더 낮으며, FSX 환자는 특정 형태의 암으로부터 보호될 수 있다.
결장직장암(CRC)은 전 세계적으로 가장 흔한 암 중 하나이며, 매년 50만 명이 넘는 사망을 유발한다. CRC 종양유발의 모델은 암 개시 및 진행에 필요한 몇 가지 유전적 변화를 포함한다. 이러한 변화는 정상 점막에서 선종 폴립(adenomatous polyp)으로 진행한 다음 암종으로 진행하는 것을 담당하는 종양발생 및/또는 종양 억제 신호전달 경로의 변경에 의해 크게 좌우된다. 결장 종양 세포가 내인성 신호 및 세포외 신호에 대한 응답으로 단백질 발현 수준의 신속하고 강력한 조절을 가능하게 하는 전사후 메커니즘을 장악하여 국소 미세환경에 대한 세포 적응을 유도한다는 것이 명백해졌다.
역학/유전 연구들은 또한 확장된 트리뉴클레오타이드(CGG) 반복 요소를 포함하는 FMR1의 전돌연변이 대립유전자를 보유한 여성에서 면역 관련 장애(예컨대, 갑상선염, 류마티스성 관절염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 및 다발성 경화증)의 빈번한 발생을 보고하였다. 이러한 FMRP 유전자 변경이 면역 병리학 소인을 유발하는 기본적인 메커니즘은 아직 알려져 있지 않지만, 최근 두 가지 연구는 FSX를 갖는 어린이에서 변경된 사이토카인 프로파일을 보고하였다.
염증성 장 질환(IBD)은 미국에서 대략 140만 명의 환자가 고통받는 위장관의 만성 염증성 장애이다. 이는 미국에서 5가지의 가장 널리 퍼진 위장관 질환 부담 중 하나이며, 전체 의료 비용은 17억 달러를 초과한다. 매년 미국에서, IBD는 700,000건이 넘는 의사 방문, 100,000건의 입원, 및 119,000명의 환자의 장애의 원인이다. 현재 의학적 치료법이 없기 때문에, 질환 관리는 평생의 치료가 필요하다.
IBD의 가장 흔한 두 가지 형태는 크론병과 궤양성 대장염이다. 크론병은 전체 위장관에 영향을 미칠 수 있지만, 주로 회장(소장의 말단 또는 하부) 및 대장에 영향을 미친다. 궤양성 대장염은 주로 결장과 직장에 영향을 미친다. 염증성 장 질환의 병인은 완전히 이해되지 않지만, 환경적 및 유전적 인자 모두가 질환에서 역할을 하는 것으로 여겨진다. 환경적 구성요소는 섭취한 식품 및 약물에의 노출에 의해 영향을 받는 장의 세균총의 변경을 포함할 수 있다.
IBD는 복통, 구토, 설사, 직장 출혈, 심한 경련, 근육 경련, 체중 손실, 영양실조, 열병, 및 빈혈과 관련된다. IBD 환자는 또한 피부 병변, 관절 통증, 눈 염증, 및 간 장애를 겪을 수 있고, 궤양성 대장염을 겪는 어린이는 성장 결함을 겪을 수 있다. 이러한 증상은 거의 치명적이진 않지만 환자의 삶의 질을 감소시킨다.
따라서, CRC 및 IBD와 같은 장 질환을 치료하는 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 절실하다. 광범위한 환자에 대해 증상으로부터의 효과적이고 영구적인 경감을 제공하고 부정적인 부작용이나 관해 및/또는 염증의 주기와 관련이 없는 치료 방법을 확인하는 것이 추가로 필요하다.
취약 X 정신 지체 단백질(fragile X mental retardation protein, FMRP)의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 이를 사용하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 FMRP의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 장 질환은 결장직장암 또는 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염일 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 네크롭토시스(necroptosis)를 유도한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 FMRP의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 고형 종양, 종양 침습, 또는 종양 전이를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 종양 침습 또는 종양 전이를 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 결장직장암 종양 침습 또는 결장직장암 종양 전이를 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, FMRP의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
5'-CCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 1),
5'-CTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 2),
5'-TCCACCACCAGCTCCTCC-3'(서열번호: 3),
5'-CTTCCACCACCAGCTCC-3'(서열번호: 4), 및
5'-TCACCCTTTATCATCCTC-3'(서열번호: 5)
으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
추가의 구현예에서, FMRP의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6),
5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7),
5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8),
5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9), 및
5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)
으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이의 보체를 포함한다.
일부 구현예에서, FMRP의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6),
5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7),
5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8),
5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9), 및
5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)
으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이의 보체로 구성된다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결이 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 알킬포스포네이트 연결, 아미노알킬포스포트리에스테르 연결, 알킬렌 포스포네이트 연결, 포스피네이트 연결, 포스포라미데이트 연결, 포스포로모르폴리데이트 연결, 포스포로피페라지데이트 연결, 아미노알킬포스포라미데이트 연결, 티오포스포라미데이트 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 티오포스페이트 연결, 셀레노포스페이트 연결, 또는 보라노포스페이트 연결인 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열의 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, 서열의 적어도 하나의 뉴클레오사이드 연결은 메틸포스포네이트 연결이다.
본원에 기재된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 포함된 뉴클레오타이드의 수는 다양할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 수용체 상호작용 단백질 키나아제 1(RIP1 또는 RIPK1) - 수용체 상호작용 단백질 키나아제 3(RIP3 또는 RIPK3) - 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 단백질(MLKL) 복합체의 활성화를 통해 네크롭토시스를 유도한다. 예를 들어, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RIPK1의 발현을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다.
일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드, 예를 들어, 5-메틸시티딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 데옥시시티딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트, 또는 5-메틸-2'-데옥시시티딘-5'-모노포스포로티오에이트를 포함한다. 특정 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드, 예를 들어, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸티미딘, 2'-O-메틸우리딘, 또는 2'-O-메틸아데노신을 포함한다. 일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 5-메틸 시토신 또는 5-메틸구아닌을 포함한다. 일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오사이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오사이드, 또는 2'-플루오로-β-D-아라비노뉴클레오사이드를 포함한다.
일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 가교 핵산, 잠금 핵산(LNA), 구속 에틸(cET) 핵산, 트리사이클로-DNA(tcDNA), 2'-O,4'-C-에틸렌 연결 핵산(ENA), 또는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다.
일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 FMRP siRNA, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 장내로 또는 비경구로 환자에게 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 경구로, 설하로, 위로, 또는 직장으로 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 환자에 대한 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 투여는 정맥내, 종양내, 공장내, 회장내, 결장내, 또는 직장내이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FRMP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간 환자에서 장 질환의 치료를 위한 것이다.
또한 본원에 기재된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물이 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 경구, 설하, 위, 또는 직장 투여에 적합하다. 다른 구현예에서 약학 조성물은 정맥내, 종양내, 공장내, 회장내, 결장내, 또는 직장내 투여에 적합하다.
또한 장 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도가 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 장 질환은 CRC, 또는 IBD, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염이다. 다른 구현예에서, 약제는 장내로 또는 비경구로 환자에게 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 약제는 경구, 설하, 위, 또는 직장 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 약제는 정맥내, 종양내, 공장내, 회장내, 결장내, 또는 직장내 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 약제는 인간에서 장 질환의 치료를 위한 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 고형 종양, 종양 침습, 또는 종양 전이의 치료를 위한 약제의 제조에서의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
도 1a는 인간 CRC 샘플(IgG=아이소타입 대조군; NC=정상 대조군의 결장 샘플; P=종양주위 샘플; T=종양 샘플)에서의 FMRP에 대한 염색을 보여주는 면역조직학적 이미지이다. 도 1b는 RT-PCR 분석에 의해 결정된 바와 같이 종양주위(P) 및 CRC 종양 샘플(T)에서의 FMRP mRNA 발현 수준을 보여주는 선 그래프이다(**p<0.01). 도 1c는 CRC 환자로부터의 쌍을 이룬 종양주위(P) 및 CRC 종양 샘플(T)에서의 FMRP 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 도 1d는 웨스턴 블롯 분석의 정량적 농도측정에 의해 측정된 바와 같이 쌍을 이룬 종양주위(P) 및 CRC 종양 샘플(T)에서의 β-액틴 발현 대비 FMRP 단백질 발현을 보여주는 그래프이다(상대적 발현은 임의의 단위(a.u.)로 표시됨).
도 2a는 처리되지 않은 야생형(WT) 및 FMR1 넉아웃(KO) 마우스, 또는 아족시메탄(Azoxymethane, AOM)의 복강내 주사 21주 후의 마우스의 결장의 내시경 이미지이다. 도 2b는 AOM의 복강내 주사 후 21주에 WT 및 FMR1 KO 마우스의 결장에서의 종양 부하(좌측) 및 종양 크기(우측)를 보여주는 막대 그래프이다(*p<0.05, **p<0.01). 도 2c는 AOM이 복강내로 주사된 WT 및 FMR1 KO 마우스의 %　생존을 보여주는 그래프이다. 도 2d는 WT 및 FMR1 KO 마우스에서의 AOM 유도된 종양으로부터 제조된 샘플의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여주는 조직학적 이미지이다. 도 2e는 처리되지 않은 WT 마우스, 및 AOM 처리된 마우스로부터 제조된 결장 샘플(P=종양주위 샘플; T= CRC 종양 샘플)에서의 FMRP 및 β-액틴(로딩 대조군) 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 도 2f는 WT 및 FMR1 KO 마우스에서의 AOM 유도된 종양으로부터 제조된 샘플의 TUNEL 염색을 보여주는 조직학적 이미지이다. 도 2g는 WT 및 FMR1 KO 마우스로부터의 AOM 유도된 종양 샘플에서 Ki67에 대한 염색을 보여주는 면역조직학적 이미지이다.
도 3a는 DLD-1 및 HCT-116 인간 결장암 세포주, 및 HCEC-1ct 비암성 인간 결장 상피 세포주에서의 FMRP 및 β-액틴(로딩 대조군) 단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도 3b는 도 3a에 기재된 웨스턴 블롯의 농도측정 분석에 의해 결정된 바와 같이 DLD-1, HCT-116, 및 HCEC-1ct 세포주에서의 β-액틴 발현 대비 FMRP 단백질 발현을 보여주는 그래프이다(상대적 발현은 임의의 단위(a.u.)로 표시됨)(**p<0.01, ***p<0.001). 도 3c는 FMRP 발현에 대해 염색된 DLD-1, HCT-116, 및 HCEC-1ct 세포를 보여주는 면역형광 이미지이다. 도 3d, 3g, 및 3i는 48시간 동안 각각 센스 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(U=처리되지 않음; S=센스; AS=안티센스)로 처리된 DLD-1 세포, HCT-116 세포, 및 HCEC-1ct 세포에서의 FMRP 및 β-액틴(로딩 대조군) 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 도 3e, 3h, 및 3j는 센스 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(Neg = 음성 염색 대조군; U=처리되지 않음; S=센스; AS=안티센스)로 처리되고 프로피디움 아이오다이드(PI) 및 아넥신 V(AnnV)로 염색된 각각 DLD-1 세포, HCT-116 세포, 및 HCEC-1ct 세포의 유세포분석법 점 도표를 보여준다. 도 3f 및 3k는 각각 도 3e 및 3j의 상응하는 유세포분석법 점 도표 데이터의 막대 그래프를 보여준다(**p<0.01).
도 4a는 처리되지 않은 CRC 세포(U), 센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(S)로 처리된 CRC 세포, 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS)로 처리된 CRC 세포, 또는 스타우로스포린(스타우로)으로 처리된 CRC 세포에서의 카스파아제 8 및 카스파아제 3에 대한 염색을 보여주는 유세포분석법 히스토그램이다. 도 4b는 도 4a의 상응하는 유세포분석법 데이터의 막대 그래프이다(***p<0.001). 도 4c는 PI 및 AnnV-염색된 CRC 세포의 유세포분석에 의해 결정된 바와 같은 상대적 세포 사멸을 보여주는 막대 그래프이다. CRC 세포는 전처리를 받지 않았거나 센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(S), 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS), 또는 스타우로스포린(스타우로)로 처리하기 전에 범-카스파아제 억제제(Cas in)로 전처리되었다. 도 4d는 처리되지 않은 DLD-1 세포(U) 또는 센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(S) 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS)로 처리된 DLD-1 세포의 Brdu 및 PI 염색을 보여주는 유세포분석법 점 도표이다. 도 4e는 도 4d의 상응하는 유세포분석법 점 도표 데이터를 보여주는 막대 그래프이다. 도 4f는 36시간 동안 BrdU 혼입 분석에 의해 평가된 HCT-116 세포 증식을 보여주는 막대 그래프이다(U=처리되지 않음; S=센스; AS=안티센스). 도 4g는 36시간 동안 센스 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드로 처리된 HCT-116 세포에서의 세포 주기 분포를 보여주는 막대 그래프이다(U=처리되지 않음; S=센스; AS=안티센스).
도 5는 인간 CRC 세포 용해물의 RNA 면역침전을 보여준다. 도 5a는 인간 CRC 세포 용해물의 RNA 면역침전에 사용된 FMRP 항체의 특이성을 확인하는 웨스턴 블롯이다. 도 5b는 액틴, E-카드헤린, RIPK3, 및 RIPK1에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR 분석에 의해 결정된 바와 같은 FMRP 공동 침전된 mRNA의 농축을 보여주는 막대 그래프이다. 도 5c는 액틴, 비멘틴(vimentin), RIPK3, 및 RIPK1에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR 분석에 의해 결정된 바와 같은 CRC 세포주 용해물로부터의 FMRP 공동 침전된 mRNA의 농축을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6a는 처리되지 않은 인간 결장 세포주(U), 또는 FMRP 센스 올리고뉴클레오타이드(S)로 처리된 인간 결장 세포주, 또는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AS)로 처리된 인간 결장 세포주에서의 FMRP, 포스포-RIPK1(pRIPK1), RIPK1, 포스포-RIPK3(pRIPK3), RIPK3, 포스포-MLKL(pMLKL), MLKL, 및 β-액틴(로딩 대조군)의 단백질/포스포-단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도 6b, 6c, 및 6d는 도 6a에 기재된 웨스턴 블롯의 농도측정 분석에 의해 결정된 바와 같이 각각 pRIPK1, pRIPK3, 및 pMLKL 발현 수준을 보여주는 막대 그래프이다(**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). 도 6e 및 6f는 각각 RIPK1 특이적 억제제(NEC1) 또는 MLKL 특이적 억제제(NSA), 및 센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(S) 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS) 중 하나로 처리된 PI 및 AnnV 염색된 인간 CRC 세포주의 유세포분석에 의해 결정된 바와 같은 상대적 세포 사멸을 보여주는 막대 그래프이다. 도 6g는 처리되지 않은 HCEC-1ct 세포, FMRP 센스 올리고뉴클레오타이드(S)로 처리된 HCEC-1ct 세포, 또는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AS)로 처리된 HCEC-1ct 세포에서 FMRP, pRIPK1, RIPK1, pRIPK3, RIPK3, pMLKL, MLKL, 및 β-액틴(로딩 대조군)의 단백질/포스포-단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다.
도 7a는 종양주위(P) 및 CRC 종양 샘플(T)에서의 CREB mRNA 발현 수준의 RT-PCR 분석을 보여주는 선 그래프이다(***p<0.001). 도 7b는 CRC 환자로부터의 일치 쌍 종양주위(P) 및 CRC 종양 샘플(T)에서의 CREB, FMRP 및 β-액틴(로딩 대조군) 단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도 7c는 도 7b에 기재된 웨스턴 블롯의 농도측정 분석에 의해 결정된 바와 같은 β-액틴 발현 대비 CREB 단백질 발현을 보여주는 막대 그래프이다(**p<0.01). 도 7d는 처리되지 않은 CRC 세포주(U), FMRP 센스 올리고뉴클레오타이드(S)로 처리된 CRC 세포주, 또는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AS)로 처리된 CRC 세포주의 CREB, FMRP, 및 β-액틴(로딩 대조군) 단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도 7e 및 7f는 도 7d에 기재된 웨스턴 블롯의 농도측정 분석에 의해 결정된 바와 같이 β-액틴 발현 대비 각각 CREB 및 FMRP 단백질 발현을 보여주는 막대 그래프이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 8a는 센스 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(U=처리되지 않음; S=센스; AS=안티센스)로 처리되고 삽입물 제거시(T0), 및 24시간 및 48시간 인큐베이션 후(각각 T24 및 T48) ibidi® 배양 삽입물의 각각의 측면 상에 시딩된 HCT-116 세포의 세포 이동을 보여주는 현미경 이미지이다. 도 8b는 도 8a의 현미경 이미지에 상응하는 세포로 덮힌 영역의 백분율을 보여주는 막대 그래프이다(T24: U 대 AS, **p<0.01; S 대 AS *p<0.05; T48: U 대 AS 및 S 대 AS, ***p<0.001). 도 8c 및 8d는 48시간 인큐베이션 후 Matrigel® 코팅된 Transwell® 삽입물을 가로질러 이동한 센스 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(U=처리되지 않음; S=센스; AS=안티센스)로 처리된 HCT-116 세포의 각각의 현미경 이미지 및 상응하는 세포수 막대 그래프이다(***p<0.001, ****p<0.0001). 도 8e는 48시간 동안 센스 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(U=처리되지 않음; S=센스; AS=안티센스)로 처리된 HCT-116 세포에서의 FMRP, E-카드헤린, β-카테닌, 및 β-액틴(로딩 대조군) 단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도 8f 및 8g는 도 8e에 기재된 웨스턴 블롯의 농도측정 분석에 의해 결정된 바와 같이 HCT-116 세포에서의 β-액틴 발현 대비 각각 E-카드헤린 및 β-카테닌 단백질 발현을 보여주는 막대 그래프이다(**p<0.01, ***p<0.001).
도 9a는 처리되지 않은 HCT-116 세포(U) 또는 48시간 동안 센스 올리고뉴클레오타이드(S), 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS)로 처리된 HCT-116 세포에서의 FMRP, MCC, 및 β-액틴(로딩 대조군) 단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도　9b는 도 9a에 기재된 웨스턴 블롯의 농도측정 분석에 의해 결정된 바와 같이 HCT-116 세포에서의 β-액틴 발현 대비 MCC 단백질 발현을 보여주는 막대 그래프이다. 도 9c는 처리되지 않은 HCT-116 세포(U) 또는 48시간 동안 센스 올리고뉴클레오타이드(S), 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS), 및/또는 대조군 siRNA(siRNA Ctrl) 또는 MCC에 특이적인 siRNA(siRNA MCC)로 처리된 HCT-116 세포에서의 MCC, FMRP, E-카드헤린, β-카테닌, 및 β-액틴(로딩 대조군) 단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯이다. 도 9d 및 9e는 도 9c에 기재된 웨스턴 블롯의 농도측정 분석에 의해 결정된 바와 같이 HCT-116 세포에서의 β-액틴 발현 대비 각각 E-카드헤린 및 β-카테닌 단백질 발현을 보여주는 막대 그래프이다(*p<0.05, **p<0.01). 도 9f는 센스 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(U=처리되지 않음; S=센스; AS=안티센스), 및/또는 siRNA Ctrl 또는 siRNA MCC로 처리되고 삽입물 제거시(T0), 및 24시간 및 48시간 인큐베이션 후(각각 T24 및 T48) ibidi® 배양 삽입물의 각각의 측면 상에 시딩된 HCT-116 세포의 세포 이동을 보여주는 현미경 이미지이다. 도 9g는 도 9f의 현미경 이미지에 상응하는 세포로 덮힌 영역의 백분율을 보여주는 막대 그래프이다(T24: 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA MCC로 형질감염된 HCT-116 세포 대 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드 단독으로 형질감염된 HCT-116 세포, ***p<0.001; T48: 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA MCC로 형질감염된 HCT-116 세포 대 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드 단독으로 형질감염된 HCT-116 세포, ****p<0.0001).
FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드
본원에 사용된 바와 같이 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적 단백질(예컨대, FMRP)을 코딩하는 메신저 RNA(mRNA)에 상보적인 짧은 합성 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 뉴클레아제의 활성화를 야기할 수 있는 이중 가닥 분자를 생산하는 mRNA에 혼성화하고, 이는 이중 가닥 분자를 인식하고 분해하여, mRNA의 번역을 방지한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 및, 비제한적으로, 2'-O-알킬, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 및 모르폴리노 올리고머 화학을 포함하는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 mRNA(예컨대, FMRP)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가닥 핵산 분자일 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 FMRP mRNA에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 표적 mRNA에 대한 FRMP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 혼성화는 DNA/RNA 하이브리드 가닥을 인식하고 분해하여 표적 단백질(예컨대, FMRP)의 번역을 방지하는 RNAse H와 같은 유비쿼터스 뉴클레아제의 활성화를 야기할 수 있는 이중 가닥 DNA/RNA 하이브리드를 생산한다.
대안적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 자가 상보적인 센스 및 안티센스 영역을 갖는 단일 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 다른 구현예에서, 이중 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2개의 별개의 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있고, 여기서 하나의 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥이고, 다른 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 가닥이며, 안티센스 가닥은 표적 mRNA(예컨대, FMRP)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 혼입된 뉴클레오타이드 서열의 표적화 부분이 FMRP mRNA 서열에 완전히 또는 거의 완전히 상보적이도록 설계될 수 있다. 이러한 상보적인 또는 거의 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 혼입은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 주어진 표적에 대해 높은 정도의 특이성을 갖도록 조작하는 것을 허용한다. 특이성은 해리 상수와 같은 매개 변수, 또는 단백질 또는 RNA 발현 수준의 변화와 같은 다른 기준의 측정 또는 FMRP 활성 또는 발현을 측정하는 다른 분석을 통해 평가될 수 있다.
본 개시내용은 분해를 위해 FMRP mRNA를 표적화할 수 있거나, mRNA 스플라이싱을 방해할 수 있거나, FMRP 유전자 발현 또는 단백질 번역을 방지할 수 있는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 결합을 위한 인간 FMRP mRNA의 다양한 영역을 표적화할 수 있다. 인간 FMRP mRNA는 NCBI 참조 서열의 서열을 갖는다: NM_001185075(서열번호: 18), NM_001185076(서열번호: 19), NM_001185081(서열번호: 20), NM_001185082(서열번호: 21), 또는 NM_002024(서열번호: 22).
본원에 개시된 바와 같은 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5 내지 100 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 10 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 14 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 10 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 14 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 14 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 15 내지 22개의 올리고뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 18 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 18 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 20 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 예를 들어, 20 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 FMRP mRNA 서열의 하나 또는 하나 초과의 부분에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 모르폴리노 올리고머, microRNA, 및 이러한 화합물을 포함하는 조성물, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물일 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, FMRP를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
5'-CCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 1),
5'-CTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 2),
5'-TCCACCACCAGCTCCTCC-3'(서열번호: 3),
5'-CTTCCACCACCAGCTCC-3'(서열번호: 4), 및
5'-TCACCCTTTATCATCCTC-3'(서열번호: 5)
중 어느 하나로부터 선택된 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 길이에 대해 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함함), 또는 이의 보체를 포함한다.
추가의 구현예에서, FMRP를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6),
5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7),
5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8),
5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9), 및
5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)
중 어느 하나로부터 선택된 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 길이에 대해 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함함), 또는 이의 보체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-메틸시티딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 데옥시시티딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트, 및 5-메틸-2'-데옥시시티딘-5'-모노포스포로티오에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸티미딘, 2'-O-메틸우리딘, 및 2'-O-메틸아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-메틸 시토신 및 5-메틸구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오사이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오사이드, 및 2'-플루오로-β-D-아라비노뉴클레오사이드로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 가교 핵산, 잠금 핵산(LNA), 구속 에틸(cET) 핵산, 트리사이클로-DNA(tcDNA), 2'-O,4'-C-에틸렌 연결 핵산(ENA), 및 펩타이드 핵산(PNA)으로부터 선택된 군 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 변형된 연결, 예컨대 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 알킬포스포네이트 연결, 아미노알킬포스포트리에스테르 연결, 알킬렌 포스포네이트 연결, 포스피네이트 연결, 포스포라미데이트 연결, 포스포로모르폴리데이트 연결, 포스포로피페라지데이트 연결, 및 아미노알킬포스포라미데이트 연결, 티오포스포라미데이트 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 티오포스페이트 연결, 셀레노포스페이트 연결, 및/또는 보라노포스페이트 연결을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 1, 2개 이상, 예컨대, 모든 뉴클레오사이드간 연결(들)은 포스포로티오에이트 연결일 수 있다. 다른 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 1, 2개 이상, 예컨대, 모든 뉴클레오사이드간 연결(들)은 메틸포스포네이트 연결일 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-CCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 1)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-CCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 1)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-CTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 2)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-CTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 2)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-TCCACCACCAGCTCCTCC-3'(서열번호: 3)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-TCCACCACCAGCTCCTCC-3'(서열번호: 3)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-CTTCCACCACCAGCTCC-3'(서열번호: 4)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-CTTCCACCACCAGCTCC-3'(서열번호: 4)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-TCACCCTTTATCATCCTC-3'(서열번호: 5)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-TCACCCTTTATCATCCTC-3'(서열번호: 5)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
또 다른 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)의 서열을 포함하는, FMRP에 대한 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)을 포함하는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 하나 초과의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 1-10 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 siRNA이다. 예를 들어, FMRP siRNA는
5'-CCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 1),
5'-CTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 2),
5'-TCCACCACCAGCTCCTCC-3'(서열번호: 3),
5'-CTTCCACCACCAGCTCC-3'(서열번호: 4),
5'-TCACCCTTTATCATCCTC-3'(서열번호: 5),
5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6),
5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7),
5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8),
5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9), 및
5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10) 중 어느 하나의 서열, 또는 서열번호: 1-10 중 어느 하나의 서열을 포함하는 FMRP siRNA의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, FMRP siRNA는 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 알킬포스포네이트 연결, 아미노알킬포스포트리에스테르 연결, 알킬렌 포스포네이트 연결, 포스피네이트 연결, 포스포라미데이트 연결, 포스포로모르폴리데이트 연결, 포스포로피페라지데이트 연결, 아미노알킬포스포라미데이트 연결, 티오포스포라미데이트 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 티오포스페이트 연결, 셀레노포스페이트 연결, 및 보라노포스페이트 연결로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결을 포함한다. 특정 구현예에서, FMRP siRNA의 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, FMRP siRNA의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 1-5, 1-10, 1-14, 1-15, 1-16, 1-19, 5-10, 5-14, 5-15, 5-19, 10-14, 10-15, 또는 10-19개의 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 구현예에서, FMRP siRNA의 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
다양한 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, FMRP siRNA)는 선택적으로 서열 내에 적어도 하나의 변형된 핵염기, 예컨대, 5-메틸시토신, 및/또는 적어도 하나의 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드를 가질 수 있고, 이는, 예를 들어, 5' 또는 3' 말단 중 하나에만, 또는 5' 및 3' 말단 모두에, 또는 올리고뉴클레오타이드 서열을 따라 위치한다.
FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, FMRP siRNA)는 선택적으로 적어도 하나의 변형된 당을 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 당 모이어티는 2'-OH기가 OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, 및 I(여기서, R은 알킬 또는 아릴이고 R'는 알킬렌임)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에 의해 대체될 수 있는 리보스일 수 있다.
일부 구현예에서, 특정 개시된 뉴클레오타이드는 변형되거나 변이를 가질 수 있으며, 예를 들어, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, FMRP siRNA) 내의 특정 시티딘은, 예컨대, 비제한적으로, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트 및 5-메틸-2'-데옥시시티딘-5'-모노포스포로티오에이트를 포함하는 5-메틸-2'-데옥시시티딘일 수 있다.
특정 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, FMRP siRNA)는 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드, 예를 들어, 2'-O-메틸(2'-OMe) 리보뉴클레오사이드, 예를 들어, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸티미딘, 2'-O-메틸우리딘, 및/또는 2'-O-메틸아데노신을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, FMRP siRNA)는 또한 5-메틸 피리미딘, 예를 들어, 5-메틸시토신, 및/또는 5 메틸퓨린, 예를 들어, 5-메틸구아닌을 포함하는 하나 이상의 화학적으로 변형된 염기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, FMRP siRNA)는 하나 이상의 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-MOE) 뉴클레오사이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오사이드, 2'-플루오로-β-D-아라비노뉴클레오사이드, 가교 핵산, 잠금 핵산(LNA), 구속 에틸(cET) 핵산, 트리사이클로-DNA(tcDNA), 2'-O,4'-C-에틸렌 연결 핵산(ENA), 및/또는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 고려되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예컨대, FMRP siRNA)의 적어도 하나의 뉴클레오타이드간 연결은 O,O-연결된 포스포로티오에이트이다. 예를 들어, 서열번호: 1-10의 뉴클레오타이드간 연결 각각은 O,O-연결된 포스포로티오에이트일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물은 선택적으로 1 내지 24개 이상의 O,O-연결된 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함할 수 있는 개시된 서열의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 약학적으로 허용가능한 염, 예컨대, 나트륨 염을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 고려되는 염은 완전히 중화된 것을 포함하고, 예컨대, 각각의 포스포로티오에이트 연결은 Na+와 같은 이온과 결합된다. 올리고뉴클레오타이드는 자연발생 핵염기, 당, 및 공유 뉴클레오사이드간(백본) 연결뿐만 아니라 비자연발생 부분을 포함할 수 있다.
개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 동위원소(isotopologue), 이를 함유하는 약학 조성물, 및 이를 사용하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 복수의 수소(H)를 포함하는 서열번호: 1-10의 중수소화 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 본원에 제공되며, 여기서 복수의 수소 중 하나 이상의 수소는 중수소(D)에 의해 대체된다.
장 질환
본 개시내용은 장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "장 질환"은 위 다음의 소화관의 부분, 즉 소장, 대장, 결장, 및 직장에 영향을 미치는 임의의 질환, 장애, 및/또는 증후군을 지칭한다. 예를 들어, 장 질환은, 비제한적으로, 결장암, 염증성 장 질환, 가족성 대장폴립증(familial adenomatous polyposis), 가드너 증후군(Gardner syndrome), 터코트 증후군(Turcot syndrome), 린치 증후군(Lynch syndrome), 셀리악병(coeliac disease), 위장관 유암종, 소장암, 십이지장암, 소장암, 및 위장관 기질 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 장 질환을 겪는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
결장직장암
본원에 사용된 바와 같이, "결장직장암"은 결장 및/또는 직장에 영향을 미치는 임의의 암을 지칭한다. 결장직장암은 종양 억제자 유전자를 약화시키고 결장 또는 직장 상피 세포에서 종양형성 유전자를 활성화시키는 유전적 및/또는 후성적 변경의 점진적인 축적을 유발하는 임의의 하나 또는 하나 초과의 환경적 및 유전적 인자에 의해 유발될 수 있다. 결장직장 신생물은 종종 악성 형질전환을 가속화하는 게놈 및/또는 후성유전체 안정성의 상실과 관련되어 있다.
상당한 이질성이 결장직장암에 존재하는 특정 유전자 돌연변이에 존재하며, 이는 비제한적으로, APC, CTNNB1, KRAS, BRAF, SMAD4, TGFBR2, TP53, PIK3CA, ARID1A, SOX9, FAM123B, 및 ERBB2의 변경을 포함한다. 결장직장암은 종종 조절장애된 Wnt 신호전달을 초래하는 돌연변이에 의해 개시되며, 종양은 RAS-RAF-MAPK, TGFβ, 및 PI3K-AKT 경로를 포함하는 다른 신호전달 경로의 추가 조절장애시에 진행된다. 개시된 서열은 Wnt, RAS-RAF-MAPK, TGFβ, 및 PI3K-AKT 경로 모두에서 종양형성 유전자, 종양 억제자, 및 핵심 신호전달 단백질의 발현을 전사후에 조절할 수 있다. 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 결장직장암을 겪는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
염증성 장 질환
본원에 사용된 바와 같이, "염증성 장 질환"은 크론병, 궤양성 대장염, 위십이지장 크론병, 크론(육아종) 대장염, 교원성 대장염, 림프구성 장염, 허혈성 대장염, 전환성 대장염, 베체트병, 현미경 대장염, 궤양성 직장염, 직장구불창자염(proctosigmoiditis), 공회장염(jejunoileitis), 좌측 대장염, 전대장염(pancolitis), 회장결장염(ileocolitis), 및 불확정 대장염(indeterminate colitis)을 포함하는 다수의 만성 염증성 질환을 지칭한다. 크론병 및 궤양성 대장염은 염증성 장 질환의 가장 흔한 두 가지 형태이다. 염증성 장 질환은 소화기관의 자가면역 질환이다. 크론병은 말단 회장을 포함하여 위장관의 임의의 부분에 국한될 수 있으며, 위장관의 모든 세포 유형에 영향을 미칠 수 있다. 궤양성 대장염은 결장 및 직장에 국한되고, 점막 세포에만 영향을 미친다. 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장 질환을 겪고 있는 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
염증성 장 질환은 복통, 구토, 설사, 직장 출혈, 심한 경련, 근육 경련, 체중 손실, 영양실조, 열병, 빈혈, 피부 병변, 관절 통증, 눈 염증, 간 장애, 관절염, 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 및 비갑상선 질환 증후군을 포함하는 증상과 관련이 있으며, 개시된 안티센스 화합물을 사용하여 이러한 증상을 치료하는 것, 예컨대 성장 결함을 또한 겪을 수 있는 궤양성 대장염을 겪고 있는 어린이를 치료하는 것이 또한 구현예에서 고려된다. 일부 구현예에서, 예컨대, 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 환자에게 투여함으로써 이러한 증상을 약화 또는 치료하는 방법이 본원에서 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, "네크롭토시스(necroptosis)"는 조절된 카스파아제 독립적 세포 사멸을 지칭하며, 이는 아폽토시스 내성 암 세포를 제거하기 위한 대안적인 방법일 수 있다. 핵심 네크롭토시스 경로는 '네크로좀(necrosome)'으로도 불리는 수용체 상호작용 단백질 키나아제 1(RIP1 또는 RIPK1)-수용체 상호작용 단백질 키나아제 3(RIP3 또는 RIPK3)-혼합 계통 키나아제 도메인 유사 단백질(MLKL) 복합체로 구성된다. 네크로좀은 반응성 산소 종(ROS) 폭발(burst)의 생성, 원형질막 투과, 및 비가역적 네크롭토시스 실행 메커니즘을 추가로 유도하는 세포질 ATP 환원과 같은 하류 효과기 기능을 개시한다. 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 네크롭토시스를 조절함으로써 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, "필요로 하는 환자"는 장 질환의 증상 또는 징후 중 어느 것을 겪고 있는 환자, 장 질환의 증상 또는 징후 중 어느 것을 겪을 수 있는 환자, 또는 장 질환을 치료하기 위한 본 개시내용의 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 환자를 지칭한다. 필요로 하는 환자는 장 질환을 발병할 위험을 갖는 것으로 진단된 환자, 과거에 장 질환을 겪었던 환자, 또는 이전에 장 질환을 위해 치료를 받았던 환자를 포함할 수 있다. FMRP 발현 또는 활성의 수준 증가와 관련된 장 질환을 겪는 개체가 특히 관련이 있다.
용어 "치료하다," "치료," "치료하는 것" 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 측면에서 예방적일 수 있고/거나 질환 및/또는 질환으로 인한 부작용을 부분적으로 또는 완전히 치유하는 측면에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포함하며, (a) 질환에 취약할 수 있으나 아직 질환을 갖는 것으로 진단받지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 중증도 또는 범위 증가를 방지하는 것; (c) 질환을 경감하는 것, 즉 질환의 부분적인 또는 완전한 개선을 유발하는 것; 또는 (d) 질환의 재발을 방지하는 것, 즉 질환의 증상의 이전의 성공적인 치료 또는 질환의 치료 후에 질환이 활성 상태로 돌아가는 것을 방지하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유효량"은 환자에게 투여될 때 병태의 증상을 적어도 부분적으로 치료 또는 개선하는 데 충분한 제제의 양을 지칭한다. 유효량은 병태의 중증도, 구성요소의 투여 경로, 및 치료되는 환자의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다. 따라서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량은 환자에 대한 제제의 투여가 대상체에서 장 질환이 발생하는 것을 방지하거나, 장 질환 진행을 방지하거나(예컨대, 직장 출혈, 빈혈, 또는 위장관 염증과 같은 장 질환의 증상의 발병 또는 증가된 중증도를 방지하거나), 또는 장 질환의 모든 관련 증상을 완화 또는 완전히 개선, 즉 질환의 퇴행을 유발하도록 환자에서 장 질환을 치료하는 데 필요한 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 양이다.
일부 구현예에서, 개시된 방법은 적어도 1 μg, 적어도 5 μg, 적어도 10 μg, 적어도 20 μg, 적어도 30 μg, 적어도 40 μg, 적어도 50 μg, 적어도 60 μg, 적어도 70 μg, 적어도 80 μg, 적어도 90 μg, 또는 적어도 100 μg의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 35 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 10 mg, 10 mg 내지 20 mg, 20 mg 내지 30 mg, 30 mg 내지 40 mg, 40 mg 내지 50 mg, 50 mg 내지 60 mg, form 60 mg 내지 70 mg, 70 mg 내지 80 mg, 80 mg 내지 90 mg, 90 mg 내지 100 mg, 100 mg 내지 150 mg, 150 mg 내지 200 mg, 200 mg 내지 250 mg, 250 mg 내지 300 mg, 300 mg 내지 350 mg, 350 mg 내지 400 mg, 400 mg 내지 450 mg, 450 mg 내지 500 mg, 500 mg 내지 600 mg, 600 mg 내지 700 mg, 700 mg 내지 800 mg, 800 mg 내지 900 mg, 900 mg 내지 1 g, 1 mg 내지 50 mg, 20 mg 내지 40 mg, 또는 1 mg 내지 500 mg의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
치료 효능은 장 질환과 관련된 전체 증상의 평가, 조직 조직학의 분석, 생화학적 분석, 이미징 방법, 예를 들어, 자기 공명 이미징, 또는 다른 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료 효능은 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 장 질환을 겪고 있는 환자에게 투여한 후 복통, 구토, 설사, 직장 출혈, 경련, 근육 경련, 체중 손실, 영양실조, 열병, 빈혈 또는 장 질환과 관련된 전체 병리학의 다른 양태의 변화와 같은 질환의 전체 증상을 분석함으로써 평가될 수 있다.
치료 효능은 또한, 예를 들어, 조직 생검(예컨대, 종양 또는 위장관 조직 생검)을 수득하고 전체 조직 또는 세포 형태학 또는 염색 특성을 평가함으로써, 조직 또는 세포 수준에서 평가될 수 있다. 단백질 또는 RNA 발현을 검사하는 생화학적 분석이 또한 치료 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역세포화학적, 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅, 또는 노던 블롯팅 방법, 또는 정량적 또는 반정량적 중합효소 연쇄 반응과 같은 RNA 수준을 평가하는 데 유용한 방법을 통해 FMRP, 카스파아제(예컨대, 카스파아제 3 또는 카스파아제 8), RIPK1, 포스포-RIPK1, RIPK3, 포스포-RIPK3, MLKL, 포스포-MLKL, CREB, IL-6, IL-8, TNF-알파, 또는 결장직장암, 네크롭토시스, 염증성 장 질환, 또는 염증성 사이토카인 생산을 나타내는 또 다른 단백질 또는 유전자 생성물의 수준을 평가할 수 있다. 또한 대변, 혈장, 또는 혈청에서 발견되는 유용한 바이오마커의 존재 또는 발현 수준을 평가하여 질환 상태 및 치료 효능을 평가할 수 있다.
치료 효능을 평가할 때, 유효한 평가를 보장하기 위해 적합한 대조군이 선택될 수 있다. 예를 들어, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여 후 장 질환을 갖는 환자에서 평가된 증상을 치료 전에 또는 치료 과정에서 더 이른 시점에 동일한 환자 또는 장 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 또 다른 환자에서의 상기 증상과 비교할 수 있다. 대안적으로, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여 후 장 조직의 생화학적 또는 조직학적 분석의 결과를 동일한 환자 또는 장 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 개체 또는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여하기 전의 동일한 환자로부터의 장 조직의 것과 비교할 수 있다. 추가로, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여 후 혈액, 혈청, 세포, 또는 대변 샘플을 장 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 개체로부터의 또는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자에게 투여하기 전의 동일한 환자로부터의 대등한 샘플과 비교할 수 있다.
FMRP 억제의 검증은 FMRP 발현 수준 또는 활성의 직접 또는 간접 평가에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, FMRP 단백질 또는 RNA 발현을 측정하는 생화학적 분석은 전체 FMRP 억제를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전체 FMRP 수준을 평가하기 위해 웨스턴 블롯에 의해 장 조직에서 FMRP 단백질 수준을 측정할 수 있다. 또한 전체 FMRP 억제를 결정하기 위해 노던 블롯 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 FMRP mRNA 수준을 측정할 수 있다. 또한 면역세포화학적 또는 면역조직화학 방법을 통해 해리된 세포, 해리되지 않은 조직, 또는 대변에서 FMRP 활성/발현을 나타내는 FMRP 단백질 수준 또는 또 다른 단백질의 수준을 평가할 수 있다.
FMRP 억제는 또한 네크롭토시스와 관련된 RIPK1의 향상된 발현 및/또는 RIPK1-RIPK3-MLKL 복합체의 활성화와 같은 매개변수를 측정함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯에 의해 장 조직에서 포스포-RIPK1, 포스포-RIPK3, 또는 포스포-MLKL 수준을 측정할 수 있다.
FMRP 하향조절은 또한 CREB 발현과 같은 매개변수를 측정함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, CREB 단백질 또는 RNA 발현을 측정하는 생화학적 분석이 전체 FMRP 억제를 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯에 의해 장 조직에서 CREB 단백질 수준을 측정할 수 있다. 또한 전체 FMRP 억제를 결정하기 위해 노던 블롯 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 CREB mRNA 수준을 측정할 수 있다. 또한 면역세포화학적 또는 면역조직화학 방법을 통해 해리된 세포, 해리되지 않은 조직, 또는 대변에서 CREB 단백질 수준 또는 CREB 활성/발현을 나타내는 또 다른 단백질의 수준을 평가할 수 있다.
본 개시내용은 결장암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 결장암의 치료는 하기 중 하나 또는 하나 초과를 초래하는 것으로 고려된다: 예컨대, 질환의 완전한 개선; 종양의 수 및/또는 등급의 감소; 전이의 감소; 재발의 감소; 및 증상(예컨대, 설사, 변비, 혈변, 직장 출혈, 복통, 쇠약, 피로, 및 체중 손실)의 발생 또는 중증도의 감소.
본 개시내용은 또한 IBD(예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염)를 치료하기 위한 방법을 제공한다. IBD의 치료는 하기 중 하나 또는 하나 초과를 초래하는 것으로 고려된다: 예컨대, 질환의 완전한 개선; 염증성 사이토카인 생산 및 면역 세포의 장 침습의 감소를 포함하는 염증의 감소; 장/점막 구조의 복원; 재발 감소; 및 증상(예컨대, 설사, 변비, 혈변, 출혈, 복통, 쇠약, 피로, 및 체중 손실)의 발생 또는 중증도의 감소. "염증성 사이토카인 생산"은 염증성 사이토카인 반응을 개시 및/또는 촉진하는 사이토카인의 발현을 지칭한다. "염증성 사이토카인 반응"은 과립구 모집, 림프구 모집, 전신 염증(특히, 위장관 또는 이의 일부 또는 일부들의 전신 염증), 열병, 조직 파괴, 쇼크, 및/또는 사멸을 특징으로 할 수 있는 면역 반응을 지칭한다. 염증성 사이토카인 반응은 개별적인 사이토카인이 이들의 동족 세포 표면 수용체에 결합한 후 세포 기능 및 유전자 발현을 변경하는 세포내 신호전달의 캐스케이드를 특징으로 할 수 있다. 염증성 사이토카인은, 비제한적으로 IL-1, IL-6, IL-8, 및 TNFα를 포함한다. 염증성 사이토카인의 발현은, 예를 들어, 대식세포, 단핵구, 고유판 단핵 세포, 또는 위장관의 다른 세포 또는 면역 체계의 세포에서 발생할 수 있다. 염증성 사이토카인 생산을 억제하는 방법은 염증성 장 질환을 겪고 있는 환자에서 일부 또는 모든 염증성 사이토카인의 발현 수준을 감소시키는 방법을 포함한다. 염증성 사이토카인 생산을 억제하는 방법은 또한 염증성 질환을 겪고 있는 환자의 세포에서 일부 또는 모든 염증성 사이토카인의 발현 수준을 감소시키는 방법을 포함한다.
본 개시내용은 또한 장 질환을 겪고 있는 환자의 세포에서 FMRP를 억제하는 방법을 제공한다. FMRP는 위장관, 면역 체계, 및 혈액의 세포를 포함하는 FMRP 발현 또는 활성이 발생하는 임의의 세포에서 억제될 수 있다. 위장관의 세포(위, 십이지장, 공장, 회장, 결장, 직장 및 항문관의 세포 포함)는 원주 상피 세포(columnar epithelial cell), 점막 상피 세포(mucosal epithelial cell), 효소원 세포(zymogenic cell), 목 점액 세포(neck mucus cell), 체벽 세포(parietal cell, 가스트린 세포(gastrin cell), 배상 세포(goblet cell), 파네스 세포(paneth cell), 희소점액 세포(oligomucus cell), 및 융모 흡수 세포(villus absorptive cell)를 포함한다. 면역 체계의 세포는 백혈구, 식세포(예컨대, 대식세포, 호중구, 및 수지상 세포), 단핵구, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 자연 살해 세포, 선천 세포, 림프구, B 세포, 및 T 세포를 포함한다. 혈액 세포는 적혈구 및 백혈구(백혈구, 단핵구, 및 혈소판)를 포함한다.
종양 침습 및 종양 전이
종양 침습은 암 세포의 주변 조직 내로의 확장, 파열, 침투, 및 퍼짐을 야기하는 암성 세포의 증식 및 종양 크기의 증가를 지칭한다. 종양 전이는 암 세포가 원발성 종양 부위로부터 떨어져 나오고, 혈액 또는 림프를 통해 이동하고, 신체의 다른 장기 및 조직에서 새로운 종양을 형성할 때 발생한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량은 고형 종양, 종양 침습, 또는 종양 전이를 치료하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량은 종양 침습 또는 종양 전이를 예방 또는 개선하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량은 결장직장암 종양 침습 또는 결장직장암 종양 전이를 예방 또는 개선하는 데 사용될 수 있다.
약학 조성물 및 투여 경로
본 개시내용은 또한 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물의 환자에 대한 투여를 통해 장 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 장 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 FMRP 및 약학적으로 허용가능한 담체를 표적화하는 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학 조성물"은, 예를 들어, 장 질환을 치료하기 위해, 포유동물, 예컨대, 인간에게 투여되는 약학적으로 허용가능한 담체 중의 치료적 화합물의 특정 양, 예컨대, 치료적 화합물의 유효량을 함유하는 혼합물을 의미한다. 일부 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 고려된다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 염증성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제"는 용어 "약학 조성물"과 본질적으로 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 합리적인 이익/위험 비율에 부합하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충액, 담체, 및 부형제를 의미한다. 담체(들)는 제제의 다른 성분과 양립가능하고 수여자에게 해롭지 않다는 점에서 "허용가능"해야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 약학적 투여와 양립가능한 완충액, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 환자에게 경구로 투여되고, 소화기관 또는 소화관 내에서 캡슐화된 물질의 흡수 부위를 조절하기에 적합한 장용 코팅을 포함한다. 예를 들어, 장용 코팅은 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 이의 임의의 약학 조성물은 장내 또는 비경구 전달, 또는 종양내 주사를 포함하는 하나 또는 몇 가지 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 장내 또는 장 투여 또는 전달은 위장관을 통한 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 환자에게의 투여를 지칭하며, 경구, 설하, 위 및 직장 전달을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비경구 투여는 위장관 이외의 경로를 통한 환자에게의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 투여를 지칭하며, 비제한적으로, 정맥내, 종양내, 비강내, 경피, 피하, 근육내, 복강내, 장내(예컨대, 공장내, 회장내), 결장내, 또는 직장내 주사 또는 주입을 포함한다.
예를 들어, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 대상체에게 피하로 환자에게 투여될 수 있다. 특정 예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 대상체에게 경구로 투여될 수 있다. 다양한 예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 비경구 투여를 통해 위장관 시스템, 또는 위장관 시스템의 특정 영역(예컨대, 공장, 회장, 결장, 또는 직장)에 직접 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 개시된 것과 같은 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학 조성물은 투여 단위 형태로 제공될 수 있고, 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립되도록 제제화되어야 한다. 유용한 제제는 약학적 분야에서 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(Mack Publishing Company, 1990)]을 참고한다.
약학 제제는, 예를 들어, 멸균이다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 여과 멸균은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행될 수 있다.
비경구 투여
본 개시내용의 약학 조성물은 비경구 투여용으로 제제화될 수 있고, 예컨대, 정맥내, 종양내, 근육내, 피하, 병변내, 장내(예컨대, 공장내, 회장내), 결장내, 또는 직장내, 또는 복강내 경로를 통한 주사용으로 제제화될 수 있다. 수성 조성물, 예컨대 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 수성 약학 조성물의 제조는 본 개시내용에 비추어 당업자에에 공지되어 있을 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사제로서 제조될 수 있고, 주사 전에 액체의 첨가시 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 사용하기에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있으며, 제제는 또한 유화될 수 있다.
주사제에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균이어야 하며, 쉬운 주사가능성이 존재할 정도까지 유체이어야 한다. 그것은 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로오스와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 또한, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드(bland) 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성 비경구로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액, 현탁액, 또는 유화액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, U.S.P., 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 일 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1%(w/v) 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 및 0.1%(v/v) TWEEN™ 80을 포함하는 담체 액체에 현탁될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 본 개시내용의 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 다양한 양의 상기 열거된 다른 성분과 함께 필요한 양의 적절한 용매 중의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 혼입한 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다. 주사용 제제는, 예를 들어, 박테리아 보유 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다.
근육내 주사를 위한 더 농축되거나 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 또한 고려된다. 이와 관련하여, 용매로서 DMSO의 사용은 매우 빠른 침투를 초래하여 고농도의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 작은 영역에 전달할 것이기 때문에 바람직하다.
이러한 용액에서 사용하기 위한 적합한 보존제는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티모레살 등을 포함한다. 적합한 완충액은 pH를 약 pH 6 내지 pH 8, 및 예를 들어, 약 pH 7 내지 pH 7.5로 유지하는데 충분한 양의 붕산, 나트륨 및 칼륨 바이카르보네이트, 나트륨 및 칼륨 보레이트, 나트륨 및 칼륨 10 카르보네이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 바이포스페이트 등을 포함한다. 적합한 등장성 제제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로스, 글리세린, 염화 칼륨, 프로필렌 글리콜, 염화 나트륨 등이므로, 용액의 염화나트륨 당량은 0.9 ± 0.2%의 범위이다. 적합한 항산화제 및 안정화제는 나트륨 바이설파이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 티오설파이트, 티오우레아 등을 포함한다. 적합한 습윤제 및 정화제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 틸록사폴(tyloxapol)을 포함한다. 적합한 점도 증가제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글리세린, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸프로필셀룰로오스, 라놀린, 메틸셀룰로오스, 바셀린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스 등을 포함한다.
장내 투여
일부 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경구, 설하, 위, 또는 직장 전달에 적합한 조성물이 본원에서 고려된다.
예를 들어, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 경구 전달에 적합할 수 있으며, 예컨대, 조성물이 예컨대, 환자의 위장관에 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 전달할 수 있도록 장용 코팅, 예컨대, 위 내성 코팅을 포함하는 정제일 수 있다. 예를 들어, 환자에 대한 이러한 투여는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 환자의 위장관의 환부에 직접 적용하는 국소 효과를 초래할 수 있다. 환자에 대한 이러한 투여는 일부 구현예에서 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 원치 않는 전신 흡수를 실질적으로 피할 수 있다.
예를 들어, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 서열번호: 1 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 과립을 포함하는(예컨대, 적어도 부분적으로 과립으로부터 형성되는) 경구 투여용 정제가 제공된다. 이러한 정제는 장용 코팅으로 코팅될 수 있다. 고려되는 정제는 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 충진제, 결합제, 붕해제, 및/또는 윤활제뿐만 아니라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 예컨대 원터그린(wintergreen), 오렌지, 자일리톨, 소르비톨, 프럭토스, 및 말토덱스트린, 및 방향제, 보존제 및/또는 항산화제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 고려되는 약학 제제는 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 서열번호: 1 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 약학적으로 허용가능한 충진제를 포함하는 과립내 상(intra-granular phase)를 포함한다. 예를 들어, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 충진제는, 선택적으로, 다른 부형제와 함께 혼합되어, 과립으로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 과립내 상은 습식 과립화를 사용하여 형성될 수 있고, 예컨대, 액체(예컨대, 물)가 블렌딩된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 화합물 및 충진제에 첨가된 다음, 조합물이 건조, 밀링 및/또는 체질되어 과립을 생산한다. 당업자는 과립내 상을 달성하기 위해 다른 과정이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 고려되는 제제는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있고 과립내 상과 블렌딩되어 개시된 제제를 형성할 수 있는 과립외 상(extra-granular phase)을 포함한다
개시된 제제는 충진제를 포함하는 과립내 상을 포함할 수 있다. 예시적인 충진제는, 비제한적으로, 셀룰로오스, 젤라틴, 인산 칼슘, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 소르비톨, 미세결정 셀룰로오스, 펙틴, 폴리아크릴레이트, 덱스트로스, 셀룰로오스 아세테이트, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 부분적으로 전호화된 전분, 칼슘 카르보네이트, 및 이의 조합을 포함하는 다른 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 개시된 제제는 과립내 상 및/또는 일반적으로 약학 제제의 성분들을 함께 유지하는 기능을 할 수 있는 결합제를 포함하는 과립외 상을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 결합제는, 비제한적으로, 다음을 포함할 수 있다: 전분, 당, 셀룰로오스 또는 변형된 셀룰로오스, 예컨대 하이드록시프로필 셀룰로오스, 락토스, 전호화된 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 저치환된 하이드록시프로필 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 당 알콜 및 이의 조합을 포함하는 다른 것을 포함한다.
예컨대, 과립내 상 및/또는 과립외 상을 포함하는 제제는 붕해제, 예컨대, 비제한적으로, 전분, 셀룰로오스, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 전분 글리콜레이트, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 알기네이트, 옥수수 전분, 크로스카르멜로스 나트륨, 가교된 카르복시메틸 셀룰로오스, 저치환된 하이드록시프로필 셀룰로오스, 아카시아, 및 이의 조합을 포함하는 다른 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 과립내 상 및/또는 과립외 상는 붕해제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 고려되는 제제는 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 만니톨, 미세결정 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 및 나트륨 전분 글리콜레이트 또는 이의 조합으로부터 선택된 부형제를 포함하는 과립내 상, 및 미세결정 셀룰로오스, 나트륨 전분 글리콜레이트, 및 마그네슘 스테아레이트 또는 이의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 과립외 상을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 윤활제를 포함할 수 있으며, 예컨대, 과립외 상은 윤활제를 함유할 수 있다. 윤활제는 비제한적으로 탈크, 실리카, 지방, 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 인산 칼슘, 실리콘 디옥사이드, 칼슘 실리케이트, 인산 칼슘, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 금속성 스테아레이트, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 나트륨 벤조에이트, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 아세테이트, 칼슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 염화 나트륨, 마그네슘 라우릴 설페이트, 탈크, 및 스테아린산을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학 제제는 장용 코팅을 포함한다. 일반적으로, 장용 코팅은 소화관을 따라 약물이 흡수되는 위치를 제어하는 경구 약물을 위한 장벽을 생성한다. 장용 코팅은 pH에 따라 상이한 속도로 붕해하는 중합체를 포함할 수 있다. 장용 코팅은 예를 들어, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 셀룰로오스 아세테이트 석시네이트, 하이드록실프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 메틸 메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 메타크릴산 공중합체 유형 C, 폴리비닐 아세테이트-프탈레이트, 및 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트를 포함할 수 있다.
예시적인 장용 코팅은 오파드라이(Opadry)® AMB, 아크릴-EZE®, 유드라짓(Eudragit)® 등급을 포함한다. 일부 구현예에서, 장용 코팅은 고려되는 정제의 약 5 중량% 내지 약 10 중량%, 약 5 중량% 내지 약 20 중량%, 8 내지 약 15 중량%, 약 8 중량% 내지 약 20 중량%, 약 10 중량% 내지 약 20 중량%, 또는 약 12 내지 약 20 중량%, 또는 약 18 중량%를 차지할 수 있다. 예를 들어, 장용 코팅은 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 고려되는 구현예에서, 약 0.5 중량% 내지 약 70 중량%, 예컨대 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 1 중량% 내지 약 20 중량%의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하거나 본질적으로 구성되는 정제가 제공된다. 이러한 정제는 예를 들어, 약 0.5 중량% 내지 약 60 중량%의 만니톨, 예컨대 약 30 중량% 내지 약 50 중량% 만니톨, 예컨대 약 40 중량% 만니톨; 및/또는 약 20 중량% 내지 약 40 중량%의 미세결정 셀룰로오스, 또는 약 10 중량% 내지 약 30 중량%의 미세결정 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 정제는 약 30 중량% 내지 약 60 중량%, 예컨대 약 45 중량% 내지 약 65 중량%, 또는 대안적으로, 약 5 내지 약 10 중량%의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 약 30 중량% 내지 약 50 중량%, 또는 대안적으로, 약 5 중량% 내지 약 15 중량% 만니톨, 약 5 중량% 내지 약 15 중량% 미세결정 셀룰로오스, 약 0 중량% 내지 약 4 중량%, 또는 약 1 중량% 내지 약 7 중량% 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 약 0 중량% 내지 약 4 중량%, 예컨대 약 2 중량% 내지 약 4 중량% 나트륨 전분 글리콜레이트를 포함하는 과립내 상을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경구 투여를 위한 약학적 정제 제제는 과립내 상을 포함하고, 과립내 상은 개시된 FMRP 안티센스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염(예컨대, 나트륨 염), 및 약학적으로 허용가능한 충진제를 포함하며, 이는 또한 붕해제와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있는 과립외 상을 포함한다. 과립외 상은 미세결정 셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트, 및 이의 혼합물로부터 선택된 구성요소를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 또한 정제의 약 12 중량% 내지 20 중량%의 장용 코팅을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경구 사용을 위한 약학적으로 허용가능한 정제는 약 0.5 중량% 내지 10 중량%의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 약 30 중량% 내지 50 중량% 만니톨, 약 10 중량% 내지 30 중량% 미세결정 셀룰로오스, 및 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 장용 코팅을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 경구 사용을 위한 약학적으로 허용가능한 정제는 약 5 내지 약 10 중량%의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 약 40 중량% 만니톨, 약 8 중량% 미세결정 셀룰로오스, 약 5 중량% 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 및 약 2 중량% 나트륨 전분 글리콜레이트를 포함하는 과립내 상; 약 17 중량% 미세결정 셀룰로오스, 약 2 중량% 나트륨 전분 글리콜레이트, 약 0.4 중량% 마그네슘 스테아레이트를 포함하는 과립외 상; 및 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 정제 위의 장용 코팅을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 약 13 중량% 또는 약 15 중량%, 16 중량%, 17 중량% 또는 18 중량%, 예컨대, 아크릴-EZE®를 포함하는 장용 코팅을 함유할 수 있다(예컨대, 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있는 PCT 공개 WO제2010/054826호 참고).
코팅이 용해되고 활성 성분이 방출되는 시점에서의 속도가 그의 용해 속도이다. 일부 구현예에서, 정제는, 예컨대, pH 7.2를 갖는 포스페이트 완충액에서 100 rpm 및 37℃에서 USP/EP 유형 2 장치(패들)에서 시험될 때, 약 120분 내지 약 240분 후, 예를 들어 180분 후 방출되는 약 50% 내지 약 100%의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용해 프로파일을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 정제는, 예컨대, pH 1.0을 갖는 희석된 HCl에서 100 rpm 및 37℃에서 USP/EP 유형 2 장치(패들)에서 시험될 때, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 실질적으로 어느 것도 120분 후에 방출되지 않는 용해 프로파일을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 정제는, 예컨대 pH 6.6을 갖는 포스페이트 완충액에서 100 rpm 및 37℃에서 USP/EP 유형 2 장치(패들)에서 시험될 때, 30분 후 방출되는 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 50% 이하의 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용해 프로파일을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 제제, 예컨대, 정제는 환자에게 경구 투여될 때 환자에서 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 최소 혈장 농도를 초래할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 개시된 제제는 환자에게 경구 투여될 때 환자의 결장 또는 직장에, 예컨대, 환자의 환부 또는 병에 걸린 부위에 국소적으로 전달된다.
개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 환자에 대한 투여는 직장 방식을 통해 발생할 수 있다. 직장 투여용 약학 조성물은 포말, 용액(관장제), 및 좌제를 포함한다(Block, Chapter 87 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990).
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 개시된 질환 및 장애의 치료에 관한 적어도 하나의 다른 제제를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고려되는 다른 제제는 환자에게 공동 투여될 수 있다(예컨대, 순차적으로 또는 동시에).
예를 들어, 이러한 제제는, 비제한적으로, 화학요법제, 예컨대 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노시드, 비스-클로로에틸니트로소우레아, 부설판, 미토마이신 C, 액티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 하이드록시프로게스테론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카르바진, 프로카르바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미톡산트론, 암사크린, 클로람부실, 메틸사이클로헥실니트로소우레아, 질소 머스타드, 멜팔란, 사이클로포스파미드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈(CA), 5-아자시티딘, 하이드록시우레아, 데옥시코포르마이신, 4-하이드록시퍼옥시사이클로포스포르아미드, 5-플루오로우라실(5-FU), 5-플루오로데옥시우리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜치신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드, 트리메트렉세이트, 테니포사이드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)을 포함한다.
제제는 또한 글루코코르티코이드, 세포증식억제제, 항체, 이뮤노필린에 작용하는 제제, 인터페론, 오피오이드, TNF 결합 단백질, 미코페놀레이트, 및 작은 생물학적 제제를 포함하는 면역억제제를 포함한다. 예를 들어, 고려되는 면역억제제는, 비제한적으로: 타크로리무스, 사이클로스포린, 피메크로리무스, 시로리무스, 에베로리무스, 미코페놀산, 핑골리모드, 덱사메타손, 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 레플루노미드, 테리플루노미드, 아나킨라, 항-흉선세포 글로불린, 항-림프구 글루불린, 무로모납-CD3, 아푸투주맙, 리툭시맙, 테플리주맙, 에팔리주맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, 아달리무맙, 인플릭시맙, 세르톨리주맙 페골, 나탈리주맙, 및 에타네르셉트를 포함한다. 다른 제제는 항생제, 지사제, 완하제, 진통제, 철분 보충제, 및 칼슘 또는 비타민 D 또는 B-12 보충제를 포함한다.
투여량 및 투여 빈도
예시적인 제제는 약 35 mg 내지 약 500 mg의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나 본질적으로 구성되는 투여 형태를 포함한다. 예를 들어, 약 35 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 또는 250 mg의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제제가 본원에서 고려된다. 일 구현예에서, 제제는 약 40 mg, 80 mg, 또는 160 mg의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 적어도 100 μg의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제제는 약 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 또는 25 mg의 개시된 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 환자에게 투여되는 양은 치료될 질환 또는 징후의 유형 및 정도, 환자의 전반적인 건강 및 크기, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 생체내 효능, 약학 제제, 및 투여 경로와 같은 변수에 따라 달라질 것이다. 원하는 혈액 수준 또는 조직 수준을 빠르게 달성하기 위해 초기 투여량은 상한 수준을 넘어 증가될 수 있다. 초기 투여량은 최적보다 작을 수 있고, 투여량은 치료 과정 동안 점진적으로 증가될 수 있다. 인간 투여량은, 예컨대, 40 mg으로부터 160 mg까지 실행하도록 설계된 통상적인 I상 용량 증량 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투여량 및 치료되는 질환과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투여 빈도는 1일 1회, 1주 1회 및 2주 1회이다. 일부 구현예에서, 투여는 7일 동안 1일 1회이다.
진단 방법
본 개시내용은 또한 환자의 하나 이상의 생물학적 샘플에서 FMRP 발현 신호의 수준을 검출하는 것에 의존하는 장 질환을 갖는 환자를 진단하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "FMRP 발현 신호"는 FMR1 유전자 발현, FMR1 유전자 생성물, 또는 FMRP 활성의 임의의 표시를 지칭할 수 있다. FMR1 유전자 생성물은 RNA(예컨대, mRNA), 펩타이드, 및 단백질(예컨대, FMRP, 변이체, 유사체, 및/또는 이의 일부)를 포함한다. 평가될 수 있는 FMR1 유전자 발현의 지수는, 비제한적으로, 유전자 발현을 조절하는 세포 구성요소와의 FMR1 유전자 또는 크로마틴 상태 FMR1 유전자 상호작용, FMR1 유전자 생성물 발현 수준(예컨대, FMRP RNA 발현 수준, FMRP 단백질 발현 수준), 또는 FMRP RNA 또는 단백질과 전사, 번역, 또는 번역후 가공 기계와의 상호작용을 포함한다. FMRP 활성의 지수는, 비제한적으로, RIPK/MLKL 경로 활성화의 평가(예컨대, RIPK1, RIPK3 및/또는 MLKL 인산화의 평가) 및 CREB 발현(예컨대, mRNA 및 단백질 발현)을 포함한다.
FMRP 발현 신호의 검출은 생체내, 시험관내, 또는 생체외 방법을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 시험관내에서 수행될 수 있다. 검출 방법은 환자의 혈액, 혈청, 대변, 조직, 또는 세포에서의 검출을 포함할 수 있다. 검출은 전체 조직, 조직 외식편, 세포 배양액, 해리된 세포, 세포 추출물, 또는 혈액 또는 혈청을 포함하는 체액에서 FMRP 발현 신호를 측정함으로써 달성될 수 있다. 고려되는 검출 방법은 웨스턴 블롯팅, 유세포분석법, ELISA, 다른 정량적 결합 분석, 세포 또는 조직 성장 분석, 노던 블롯, 정량적 또는 반정량적 중합효소 연쇄 반응, 의학적 이미징 방법(예컨대, MRI), 또는 면역염색 방법(예컨대, 면역조직화학 또는 면역세포화학)과 같은 FMR1 유전자 생성물 발현의 수준을 측정하는 분석을 포함한다.
실시예
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 예시 목적으로만 제공되며, 본 개시내용의 범위 또는 내용을 어떤 식으로든 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: FMRP는 인간 결장직장암에서 상향조절된다
CRC 종양유발에서 FMRP의 역할을 조사하기 위해, 인간 CRC 샘플에서의 FMRP mRNA의 수준 및 단백질 수준을 분석하였다. 본 실시예는 인간 CRC 샘플에서 증가된 FMRP 발현의 존재를 입증한다.
환자 및 샘플
인간 CRC 종양 및 인접한 거시적으로 영향을 받지 않은 영역의 일치 쌍 샘플을 토르 베르가타(Tor Vergata) 대학 병원(이탈리아 로마)에서 산발성 CRC에 대한 결장 절제술을 받은 48명의 환자로부터 채취하였다. 환자들은 수술 전에 방사선 요법이나 화학요법을 받지 않았다.
면역조직화학
면역조직화학을 정상 조직 및 CRC 환자의 쌍을 이룬 종양 및 종양주위 샘플의 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 절편 상에서 수행하였다. 결장 절편을 탈파라핀화하고, 자일렌 및 에탄올을 사용하여 탈수시키고, 98℃의 항온조(Dako Agilent Technologies, Glostrup, Denmark)에서 30분 동안 Tris-EDTA 시트레이트 완충액(pH 7.8)에서 항원 검색을 수행하였다. 면역조직화학 염색을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션된 인간 FMRP에 대한 모노클론 항체(최종 희석 1:500, LifeSpan BioSciences, Inc.)를 사용하여 수행한 후 크로모겐으로서 3,3'디아미노벤지딘(DAB)을 이용한 바이오틴이 없는 HRP-중합체 검출 기술(MACH 4TM 유니버설 HRP-중합체 키트, Biocare Medical, Pacheco, CA)을 수행하였다. 절편을 헤마톡실린으로 대조 염색하고, 탈수시키고, 장착하였다. 아이소타입 대조군 IgG 염색된 절편을 상기 기재된 바와 같이 동일한 면역조직화학 조건 하에서 제조하여, 일차 항체를 정제된 마우스 정상 IgG 대조군 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 대체하였다.
FMRP 발현을 인간 CRC 종양 및 인접한 영역의 일치 쌍의 샘플로부터 채취한 절편(n=40) 및 정상 대조군(NC)의 결장으로부터 채취한 샘플에서 분석하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, FMRP 단백질 발현은 종양주위 영역(P) 및 NC와 비교하여 CRC 종양 샘플(T)에서 유의하게 증가되었다. FMRP는 상대적으로 더 낮은 수준의 FMRP를 발현하는 인접한 비종양 영역 및 NC와 비교하여 CRC 샘플의 대략 61%(24/40)에서 강하게 발현되었다.
FMRP mRNA 발현
RNA를 제조사의 지침에 따라 PureLink® mRNA 미니 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.)를 사용하여 인간 CRC 및 인접한 거시적으로 영향을 받지 않은 영역의 일치 쌍 샘플로부터 추출하였다. 일정한 양의 RNA(샘플당 1 μg)를 상보적 DNA(cDNA)로 역전사시키고, 이를 하기 조건을 사용하여 증폭시켰다: 95℃에서 1분 동안 변성; 인간 FMRP의 경우 59℃, 인간/마우스 β-액틴의 경우 60℃에서 30초 동안 어닐링; 72℃에서 30초 연장. β-액틴을 하우스 키핑 유전자로서 사용하였다. 유전자 발현을 △△Ct 알고리즘을 사용하여 계산하였다. 프라이머 서열은 다음과 같았다: 인간 FMRP(정방향 5'-GTTGAGCGGCCGAGTTTGTCAG-3'(서열번호: 11); 역방향 5'-CCCACTGGGAGAGGATTATTTGGG-3'(서열번호: 12)), 인간 및 마우스 β-액틴(정방향 5'-AAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'(서열번호: 13); 역방향 5'-AGCCAGTCCAGACGCAGGAT-3'(서열번호: 14)).
도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이, RT-PCR은 면역조직화학 분석을 확인하였고 FMRP mRNA가 동일한 환자의 거시적으로 영향을 받지 않은 영역으로부터 채취한 종양주위 샘플(P)과 비교하여 인간 CRC 종양 샘플(T)에서 유의하게 상향조절되었음을 보여주었다.
FMRP 단백질 발현
총 단백질을 인간 결장 조직으로부터 추출하고, 1 mM 디티오트레이톨(DTT), 10 mg/ml 아프로티닌, 10 mg/ml 류펩틴, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 1 mM Na3VO4, 및 1 mM NaF가 보충된 10 mM HEPES [pH 7.9], 10 mM KCl, 0.1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.2 mM 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 및 0.5% Nonidet P40을 함유하는 얼음 위에서 용해시켰다. 용해물을 원심분리에 의해 정화시키고, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 블롯을 FMRP에 대한 항체(Cell Signaling, Danvers, MA)와 함께 인큐베이션한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제에 접합된 2차 항체(Dako, Milan, Italy)와 함께 인큐베이션하였다. 분석 후, 각각의 블롯을 스트리핑하고, 마우스-항-인간 모노클론 β-액틴 항체(Sigma-Aldrich)와 함께 인큐베이션하여 레인의 등가 로딩을 확인하였다.
도 1c 및 1d에서 볼 수 있는 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 면역조직화학 및 RT-PCR 분석을 확인하였고, FMRP 단백질이 동일한 환자의 거시적으로 영향을 받지 않은 영역으로부터 채취한 종양주위 샘플(P)과 비교하여 인간 CRC 종양 샘플(T)에서 유의하게 상향조절되었음을 보여주었다.
실시예 2: FMR1 넉아웃 마우스는 아족시메탄 ( Azoxymethane ) 유도된 종양유발에 내성이다
CRC에서의 FMRP의 역할을 분석하기 위해, 아족시메탄(AOM)에 의해 유도된 산발성 CRC의 마우스 모델을 사용하였다. 본 실시예는 AOM 유도된 CRC 모델에서 FMR1 넉아웃 마우스의 종양 내성 표현형을 설명한다.
CRC의 AOM 유도
야생형(WT) 및 FMR1 넉아웃(KO) 마우스에게 종양 형성을 유도하기 위해 5주 동안 1주 1회 복강내로 알킬화제인 AOM(10 mg/kg; Sigma Aldrich, Milan, Italy)을 주사하였다. 마우스를 종양 형성에 대해 모니터링하고, 희생 7일 전에 고해상도 내시경 시스템을 사용하여 내시경으로 스크리닝하였다. 22주에, 마우스를 자궁 탈구(cervical dislocation)에 의해 희생시키고, 분석을 위해 결장 조직을 수집하였다.
결장검 검사(colonoscopy)를 맹검 방식으로 수행하여 고해상도 마우스 내시경 시스템을 사용하여 종양 형성을 모니터링하였다. 21주에 수행된 내시경 검사 동안 종양을 검출하였다. 처리 종료 후, 종양을 계수하여 결장 병변의 총 수를 결정하였다. 모든 종양을 이들의 크기에 기초하여 평가하고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌[Becker C. et al., Gut. 2005;54(7):950-4.]에 기재된 프로토콜을 사용하여 점수를 매겼다. 간략하게, 종양을 다음과 같이 등급을 매겼다: 등급 1(매우 작지만 검출가능한 종양), 등급 2(결장 둘레의 최대 8분의 1을 덮는 종양), 등급 3(결장 둘레의 최대 4분의 1일을 덮는 종양), 등급 4(결장 둘레의 최대 절반을 덮는 종양), 및 등급 5(결장 둘레의 절반 초과를 덮는 종양).
도 2a 및 2b에서 볼 수 있는 바와 같이, AOM으로 처리된 WT 마우스는 다수의 큰 종양을 발달시킨 반면, AOM 처리된 FMR1 KO 마우스에서의 종양의 수 및 크기는 유의하게 감소되었다. 이들 결과는 22주에 희생된 마우스에서의 종양의 직접 평가에 의해 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 도 2c에서 볼 수 있는 바와 같이, AOM 처리된 WT 마우스는 AOM 처리된 FMR1 KO 동물과 비교하여 20% 생존율 감소를 나타내었다.
면역조직화학
조직학적 분석을 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 후 종양 및 종양주위 영역에서 WT 및 FMR1 KO 마우스로부터 채취한 마우스 결장 동결절편 상에서 수행하였다. 결장 절편을 탈파라핀화하고, 자일렌 및 에탄올을 사용하여 탈수시키고, 98℃의 항온조(Dako Agilent Technologies, Glostrup, Denmark)에서 30분 동안 Tris-EDTA 시트레이트 완충액(pH 7.8)에서 항원 검색을 수행하였다. 면역조직화학 염색을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션된 인간 FMRP에 대한 모노클론 항체(최종 희석 1:500, LifeSpan BioSciences, Inc.)를 사용하여 수행한 후 크로모겐으로서 3,3'디아미노벤지딘(DAB)을 이용한 바이오틴이 없는 HRP-중합체 검출 기술(MACH 4TM 유니버설 HRP-중합체 키트, Biocare Medical, Pacheco, CA)을 수행하였다. 절편을 헤마톡실린으로 대조 염색하고, 탈수시키고, 장착하였다. 아이소타입 대조군 IgG 염색된 절편을 상기 기재된 바와 같은 동일한 면역조직화학 조건 하에서 준비하여, 일차 항체를 정제된 마우스 정상 IgG 대조군 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 대체하였다.
AOM 처리의 부재시에, FMRP-KO 마우스의 장은 정상이었고 WT 마우스와 비교하여 거시적 이상은 없었다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 도 2d에 나타낸 바와 같이, AOM 처리 후 22주에 절제된 종양은 WT 마우스가 전반적 이형성증(pervasive dysplasia)을 갖는 종양을 발달시킨 반면, FMR1 KO 동물은 이형성증 영역에 인접한 정상 점막 조직 구조를 보존하였음을 보여주었다.
FMRP 단백질 발현
총 단백질을 마우스 결장 조직으로부터 추출하고, 1 mM 디티오트레이톨(DTT), 10 mg/ml 아프로티닌, 10 mg/ml 류펩틴, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 1 mM Na3VO4, 및 1 mM NaF가 보충된 10 mM HEPES [pH 7.9], 10 mM KCl, 0.1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.2 mM 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 및 0.5% Nonidet P40을 함유하는 완충액에서 얼음 위에서 용해시켰다. 용해물을 원심분리에 의해 정화시키고, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 블롯을 FMRP에 대한 항체(Cell Signaling, Danvers, MA)와 함께 인큐베이션한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제에 접합된 2차 항체(Dako, Milan, Italy)와 함께 인큐베이션하였다. 분석 후, 각각의 블롯을 스트리핑(stripping)하고, 마우스-항-인간 모노클론 β-액틴 항체(Sigma-Aldrich)와 함께 인큐베이션하여 레인의 등가 로딩을 확인하였다.
도 2e에 나타낸 바와 같이, 인간 CRC 샘플과 일치하게도, FMRP 단백질 발현은 동일한 동물의 인접한 종양주위 영역(P)과 비교하여 AOM 처리된 WT 마우스의 점막 종양(T)에서 증가되었다.
TUNEL 및 Ki67 염색
FMR1 KO 동물에서 관찰된 종양유발 감소가 세포 사멸 증가 또는 종양 세포 증식 감소로 인한 것인지 결정하기 위해, Ki67에 대한 TUNEL 염색 및 면역조직화학 염색을 수행하였다. WT 및 FMR1 KO 마우스로부터 채취한 결장 동결절편에서, 제조사의 지침에 따라 TUNEL in situ 세포 사멸 검출 키트(Roche Applied Science)를 사용하여 아폽토시스 세포를 검출하였다. 3-아미노-9-에틸카르바졸을 크로모겐으로서 사용하였고, 절편을 헤마톡실린으로 대조 염색하였다. 아폽토시스 세포 핵은 청자색 배경에 대해 적색으로 염색된 구조로서 나타났다.
면역조직화학 절편을 또한 실온에서 30분 동안 마우스 Ki67에 대한 마우스 모노클론 항체(클론 MIB-5, 최종 희석 1:100, DaKO, Agilent, Santa Clara, CA, USA)와 함께 인큐베이션한 후, 크로모겐으로서 3,3'디아미노벤지딘을 사용한 바이오틴이 없는 HRP 중합체 검출(Ultravision Detection System, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 수행하였다. 절편을 헤마톡실린으로 대조 염색하고, 탈수시키고, 장착하였다.
도 2f에 나타낸 바와 같이, TUNEL 염색은 AOM 처리된 FMR1 KO 마우스가 AOM 처리된 WT 동물과 비교하여 증가된 수준의 DNA 단편화를 나타내었음을 밝혀내었다. 그러나, 도 2g에서 볼 수 있는 바와 같이, Ki67 양성 세포의 수에는 차이가 관찰되지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 FMRP가 세포 사멸에 대한 종양 내성 증가와 관련된다는 것을 시사한다.
실시예 3: FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 CRC 세포주에서 세포 사멸을 유도한다
FMRP가 CRC 생존에 얼마나 영향을 미치는지 결정하기 위해, 인간 CRC 상피 세포주에서의 세포 사멸을 특정 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하였다. 본 실시예는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 아폽토시스 독립적 메커니즘을 통해 CRC 세포주에서 세포 사멸을 유도할 수 있음을 입증한다.
결장직장암 세포 배양액에서의 FMRP 발현
인간 CRC 세포주 DLD-1 및 HCT-116을 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA)으로부터 수득하고, 각각 RPMI 1640(DLD-1) 및 McCoy 5A(HCT-116) 배지에서 배양하였다. 모든 배지에 10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Lonza, Verviers, Belgium)을 보충하였다. 정상 인간 결장 상피 세포주(HCEC-1ct)를 EVERCYTE GmbH(Vienna, Austria)로부터 수득하고, ColoUp® 배지(EVERCYTE GmbH)에서 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO2, 완전 가습 인큐베이터에서 유지시켰다. 세포주 용해물을 제조하고, 이전 실시예 2에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동/면역블롯에 의해 분석하였다. 면역형광 염색을 위해, 세포주를 4℃에서 10분 동안 3.7% 포름알데히드로 고정시키고, 실온에서 10분 동안 0.1% 트리톤으로 투과시키고 실온에서 1시간 동안 차단시켰다(1% 소 혈청 알부민, 트윈 0.1%, 글리세린 2%). 고정되고 차단된 세포를 4℃에서 밤새 항-FMRP 모노클론 항체(1:500, Cell Signaling, Danvers, MA)와 함께 인큐베이션하였다. PBS로 세척 후, 2차 항체 염소 항-토끼 Alexa 488(1:2000, A11008; Invitrogen)을 실온에서 1시간 동안 적용하였다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(P36931; Invitrogen)을 갖는 Prolong gold® 변색방지 시약을 사용하여 장착하고, Leica 응용 세트 소프트웨어(V4.6.2)를 갖는 Leica DMI4000 B 현미경에 의해 분석하였다.
도 3a-3c에 나타낸 바와 같이, FMRP는 HCEC-1ct 상피 세포(즉, 정상 결장 세포)와 비교하여 CRC 인간 세포주(DLD-1 및 HCT-116)에서 더 높게 발현되었다.
결장직장암 세포 배양에서의 FMRP 넉다운
인간 FMRP에 상보적인 포스포로티오에이트 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드[5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6)] 및 단일 가닥 센스 올리고뉴클레오타이드[5'-ATGGAGGAGCTGGTGGTGGA-3'(서열번호: 15)]를 합성하였다. CRC 세포주 및 HCEC-1ct 세포를 제조사의 지침에 따라 Opti-MEM 배지 및 리포펙타민 3000 시약(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 24 및 48시간 동안 FMRP 안티센스(AS)(최종 농도 0.5-100 nM) 또는 FMRP 센스 올리고뉴클레오타이드(S)(최종 농도 100 nM)로 형질감염시켰다.
도 3d, 3g, 및 3i에서 볼 수 있는 바와 같이, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AS)를 이용한 DLD-1 세포(도 3c), HCT-116 세포(도 3g), 및 HCEC-1ct 세포(도 3i)의 처리는 FMRP 발현을 유의하게 억제하였고, 센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서 유의한 억제가 관찰되지 않았다.
FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리된 세포에서의 세포 사멸
세포를 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AS)(최종 농도 0.5 nM 및 100 nM) 또는 FMRP 센스 올리고뉴클레오타이드(S)(최종 농도 100 nM)로 형질감염시켰다. 24시간(도 3e, 3f, 3j 및 3k) 또는 48시간(도 3h) 후, 세포를 수집하고, 아넥신 V(AV) 완충액에서 2회 세척하고, 제조사의 지침에 따라 FITC-아넥신 V(최종 희석 1:100; Immunotools, Friesoythe, Germany)으로 염색하고, 4℃에서 30분 동안 5 mg/ml의 프로피디움 아이오다이드(PI)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 또한 36시간 동안 FMRP 센스 올리고뉴클레오타이드 또는 FMRP AS 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 100 nM)로 형질감염시키고, 활성화된 카스파아제 3 및 카스파아제 8에 대해 분석하였다. 양성 및 음성 대조군으로서, 세포를 각각 스타우로스포린(최종 농도 1 μM, Sigma-Aldrich Milan, Italy) 또는 Q-VD-OPh(범-카스파아제 억제제; 최종 농도 1 μM)(R&D Systems, Inc, Minneapolis, MN)로 처리하였다. 추가로, 형질감염 36시간 후(도 4f 및 4g) 또는 48시간 후(도 4d 및 4e), 세포를 60분 동안 10　M 브로모데옥시우리딘으로 펄스하고, 70% 차가운 에탄올에서 고정시키고, -20℃에서 적어도 3시간 동안 보관하였다. 이후, 세포를 2 M HCl에서 변성시키고, 항-브로모데옥시우리딘 모노클론 항체(Immunotech, Marseille, France)로 염색한 다음, 플루오레세인 이소티오시아네이트 접합된 2차 항-마우스 면역글로불린 G(Molecular Probes, Milan, Italy) 및 100 g/mL PI로 염색하였다. 형광을 Gallios 유세포 분석기(Beckman Coulter, Life Sciences, Pasadena, CA, USA)를 사용하여 측정하고, Kaluza 소프트웨어(Beckman Coulter)를 사용하여 분석하였다. 생존가능한 세포는 AV-/PI- 세포로 간주되었다.
도 3e 및 3f에 나타낸 바와 같이, DLD-1 세포를 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하는 것은 증가된 수의 아넥신V+ 또는 아넥신V+PI+ 세포를 초래하였고, 이는 이러한 CRC 세포가 자발적 아폽토시스 또는 네크롭토시스를 겪고 있었음을 나타낸다. 그러나, 도 3h, 3j 및 3k에 나타낸 바와 같이, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 HCT-116 세포 또는 HCRC-1ct 세포는 증가된 수의 아넥신V+ 또는 아넥신V+PI+ 세포를 나타내지 않았다. 세포주 내로 형질감염된 특정 FMRP siRNA를 사용하여 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음).
FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유도된 세포 사멸의 메커니즘을 분석하기 위해, 프로-아폽토시스 카스파아제 8 및 카스파아제 3의 활성화에 대한 FMRP 넉다운의 효과를 분석하였다. 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, CRC 세포를 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리하는 것은 활성화된 카스파아제 3-양성 또는 활성화된 카스파아제 8-양성 세포의 백분율을 변경하지 않았다. 예상대로, 스타우로스포린(스타우로)은 활성화된 카스파아제 3 양성 세포의 백분율을 유의하게 증가시켰다.
도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포를 범-카스파아제 억제제(Q-VD-OPh; Cas in)로 전처리하는 것은 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유도된 세포 사멸을 변경하지 않았다. 더욱이, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유도된 세포 사멸이 세포 성장 정지에 이차적인지 여부를 확인하기 위해, DLD-1 세포주에서의 세포 주기 진행을 분석하였다. 도 4d - 4g에 나타낸 바와 같이, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 사멸의 유도 전 G2/M, S, 또는 G0/G1 세포 주기 단계에서 세포의 상대적 백분율에 영향을 미치지 않았다. 함께, 이러한 발견은 FMRP가 세포 주기에 영향을 미치지 않는 아폽토시스 독립적 경로를 통해 CRC 세포 사멸에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
실시예 4: FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 네크롭토시스를 유도한다
암 세포는 프로그램화된 세포 사멸을 피하기 위해 다양한 메커니즘을 개발하였다. 네크롭토시스는 아폽토시스 내성 세포를 제거하기 위한 대안적인 메커니즘인 조절되고 카스파아제 독립적인 세포 사멸 경로이다. 이 실시예는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 네크롭토시스 경로의 활성화를 통해 CRC 세포에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 입증한다.
FMRP는 네크롭토시스 경로와 관련된 mRNA와 관련된다
인간 CRC 샘플 및 CRC 세포주로부터의 FMRP를 실시간 PCR에 의해 결합된 전사체의 확인을 위해 FMRP 특이적 항체(도 5a)를 사용하여 그의 관련된 RNA와 함께 면역침전시켰다. β-액틴을 음성 대조군으로서 사용하였고, E-카드헤린 및 비멘틴을 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 5b 및 5c에 나타낸 바와 같이, RIPK3 mRNA는 인간 CRC 샘플 또는 CRC 세포주에서 FMRP와 함께 공동 면역침전하지 않는다. 대조적으로, 유의한 수준의 RIPK1 mRNA는 IgG 아이소타입 대조군과 비교하여 FMRP와 공동 면역 침전되었다.
FMRP와 네크롭토시스 경로의 구성요소와의 연관성을 확인하기 위해, 세포를 처리되지 않은 채로 두거나 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 0.5 nM 및 100 nM) 또는 FMRP 센스 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 100 nM)로 형질감염시키고; pMLKL 억제제(네크로설폰아미드, NSA; 최종 농도 1 μM)(Calbiochem); 또는 pRIPK1 억제제(네크로스타틴1, NEC1; 최종 농도 10 μM)(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI USA)와 함께 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포를 수집하고, 웨스턴 블롯에 의해 분석하거나 이전에 실시예 1-3에 기재된 바와 같이 유세포분석을 위해 FITC-아넥신 V 및 PI로 염색하였다.
도 6a-6d에 나타낸 바와 같이, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리는 인간 CRC 세포주에서 RIPK1의 총 단백질 발현 수준을 증가시켰다. FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리는 추가로 RIPK1, RIPK3, 및 MLKL의 인산화 증가를 초래하였다. 그러나, 도 6g에서 볼 수 있는 바와 같이, FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 HCEC-1ct 세포에서 유사한 인산화 증가가 관찰되지 않았다.
도 6e 및 6f에 나타낸 바와 같이, RIPK1 특이적 억제제인 네크로스타틴 1(NEC1), 및 MLKL 특이적 억제제인 네크로설폰아미드(NSA)와 함께 인큐베이션된 인간 CRC 세포주는 FMRP 안티센스 올리고뉴클레오타이드 유도된 세포 사멸로부터 보호되었다. 종합하면, 이들 결과는 FMRP가 RIPK1 신호전달 캐스케이드를 억제하여 네크롭토시스를 억제함으로써 네크롭토시스를 폐지한다는 것을 시사한다.
실시예 5: FMRP 발현은 CREB에 의해 조절된다
몇 가지 세포내 단백질 키나아제, 예컨대, mTOR 및 MAPK, 및 전사 인자, 예컨대, CREB는 FMRP 발현을 긍정적으로 조절하는 것으로 보고되었다. 이 실시예는 FMRP 발현이 CREB 전사 인자에 의해 긍정적으로 조절된다는 것을 입증한다.
CREB mRNA 발현 및 단백질 발현
CREB가 FMRP 발현을 조절하는지 평가하기 위해, CRC 세포주를 24 또는 48시간 동안 CREB 안티센스(ASc)(5'-GCATCTCCACTCTGCTGGTT-3')(서열번호: 16) 또는 CREB 센스(Ss)(5'-AACCAGCAGAGTGGAGATGC-3')(서열번호: 17)(최종 농도 200 nM)로 형질감염시켰다. mRNA 및 총 단백질 용해물을 제조하고, 이전에 실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이 RT-PCR 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, 인간 CRC 종양(T)은 종양주위 샘플(P)에서의 수준과 비교하여 유의하게 더 높은 수준의 CREB mRNA 전사체를 가지고 있었다. 유사하게, 도 7b 및 7c에 나타낸 바와 같이, CREB 단백질 발현은 종양주위 조직 샘플(P)과 비교하여 인간 CRC 종양(T)에서 유의하게 더 높다.
CREB가 CRC 세포주에서 FMRP 발현을 조절하는지 여부를 조사하기 위해, CREB 발현을 특정 AS 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 억제하였다. 도 7d - 7f에 나타낸 바와 같이, CREB 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 인간 CRC 세포주는 처리되지 않은 세포 또는 센스 올리고뉴클레오타이드 대조군으로 처리된 세포와 비교하여 CREB 단백질의 감소된 발현을 가지고 있었다. 더욱이, CREB 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리는 FMRP 단백질 발현의 수반되는 감소를 초래하였다. 이러한 발견은 인간 CRC에서 CREB가 FMRP 발현을 긍정적으로 조절한다는 것을 시사한다.
실시예 6: FMRP 수준은 CRC 이동 및 침습에 영향을 미친다
CRC 이동 및 침습에서의 FMRP의 역할을 조사하기 위해, 상처 봉합 및 세포 침습의 시험관내 모델을 사용하였다. 이 실시예는 FMRP가 결장직장암에서 및 특히 증가된 림프절 전이를 갖는 환자에서 프로모터 메틸화에 의해 유전자가 침묵되는 종양 억제자인 E-카드헤린, β-카테닌, 및 MCC(mutated in colorectal cancer)를 포함하는 세포 이동 및 침습과 관련된 단백질을 조절한다는 것을 설명한다.
FMRP 수준은 E- 카드헤린 및 β- 카테닌 조절에 의해 CRC 세포 이동 및 침습에 영향을 미친다
종양 세포 이동 및 침습에서의 FMRP의 역할을 조사하기 위해, HCT-116 세포를 ibidi® 배양 인서트(insert)의 각 측면에 시딩하고 컨플루언스까지 성장시킨 다음, 처리되지 않은 채로 두거나(U) 센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(S)(최종 농도 0,5 nM) 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS)(최종 농도 0.5 nM)로 형질감염시켰다. 추가로, HCT-116 세포를 Matrigel®이 미리 코팅된 Transwell® 인서트에 시딩하고, 처리되지 않은 채로 두거나(U) 또는 48시간 동안 센스 올리고뉴클레오타이드(S)(최종 농도 100 nM) 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS)(최종 농도 0.5 nM)로 형질감염시켰다.
도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, HCT-116 세포를 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드로 형질감염시키는 것은 처리되지 않은 세포 또는 센스 올리고뉴클레오타이드로 형질감염된 세포와 비교하여 가성(pseudo) "상처"를 덮는 세포의 백분율을 유의하게 감소시켰다. 그래프는 3개의 개별 실험의 세포로 덮힌 영역의 평균 백분율 ± S.D를 나타낸다.
유사하게, 도 8c 및 8d에 나타낸 바와 같이, 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드로 형질감염된 HCT-116 세포는 처리되지 않은 세포 또는 센스 올리고뉴클레오타이드로 형질감염된 세포와 비교하여 Matrigel® 코팅된 Transwell® 인서트를 가로질러 유의하게 감소된 이동을 나타내었다. 그래프는 3개의 개별 실험의 이동하는 세포의 평균 수 ± S.D를 나타낸다.
FMRP가 세포 부착, 세포골격 리모델링, 및 종양 이동 및 침습의 억제와 관련된 핵심 단백질인 E-카드헤린 및/또는 β-카테닌의 수준을 조절하는지 여부를 결정하기 위해, 세포를 처리되지 않은 채로 두거나(U), 또는 48시간 동안 FMRP 센스(S) 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 0.5 nM) 또는 FMRP 안티센스(AS) 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 0.5 nM)로 형질감염시켰다.
도 8e - 8g에 나타낸 바와 같이, 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드를 이용한 HCT-116 세포의 형질감염은 처리되지 않은 세포 또는 센스 올리고뉴클레오타이드로 형질감염된 세포와 비교하여 E-카드헤린 및 β-카테닌의 발현을 유의하게 증가시켰다. 도 8f 및 8g는 임의의 단위(a.u.)로 값을 표현하고, 3개의 개별 실험의 평균 ± S.D를 나타낸다.
FMRP는 E- 카드헤린 및 β- 카테닌 발현을 조절하는 단백질인 MCC를 하향 조절한다
FMRP가 E-카드헤린/β-카테닌 복합체와 상호작용하는 것으로 알려진 단백질인 MCC를 조절하는지 여부를 조사하기 위해, HCT-116 세포를 처리되지 않은 채로 두거나(U) 또는 48시간 동안 센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(S)(최종 농도 0.5 nM) 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(AS)(최종 농도 0.5 nM)로 형질감염시켰다.
도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이, 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드로 형질감염된 HCT-116 세포는 처리되지 않은 세포 또는 센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드로 형질감염된 세포와 비교하여 MCC의 유의하게 증가된 발현을 나타내었다.
최근 연구는 결장직장 세포에서 E-카드헤린/β-카테닌 복합체 매개 세포-세포 부착의 조절에서의 MCC의 신규한 종양 억제자 기능을 설명하였다. MCC가 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드로 형질감염된 HCT-116 세포에서 E-카드헤린 및 β-카테닌 발현의 관찰된 증가를 매개하는지 조사하기 위해(예컨대, 도 8e-8g), 세포를 처리되지 않은 채로 두거나(U) 또는 48시간 동안 센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 0.5 nM), 또는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 0.5 nM), 및/또는 대조군 siRNA(siRNA Ctrl) 또는 MCC(siRNA MCC)에 특이적인 siRNA로 형질감염시켰다.
대표적인 웨스턴 블롯(도 9c) 및 상응하는 정량 분석(도 9d 및 9e)에 나타낸 바와 같이, siRNA MCC의 존재는 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드 단독으로 형질감염된 세포에서 E-카드헤린 및 β-카테닌의 상향 조절된 발현을 폐지하였다.
E-카드헤린/β-카테닌 복합체의 MCC 조절이 또한 결장직장 세포주 이동 및 침습의 관찰된 억제에 필요한지 여부를 결정하기 위해(예컨대, 도 8a 및 8b), HCT-116 세포를 ibidi® 배양 인서트의 각 측면에 시딩하고, 컨플루언스까지 성장시킨 다음, 처리되지 않은 채로 두거나(U) 또는 센스 올리고뉴클레오타이드(S)(최종 농도 0.5 nM) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AS)(최종 농도 0.5 nM) 및/또는 siRNA Ctrl 또는 siRNA MCC로 형질감염시켰다.
도 9f 및 9g에 나타낸 바와 같이, MCC에 특이적인 siRNA의 존재는 결장직장암 세포주 이동 및 침습의 안티센스 FMRP 올리고뉴클레오타이드 매개 억제를 유의하게 감소시켰다. 함께, 이러한 데이터는 FMRP가 MCC/E-카드헤린/β-카테닌 복합체를 조절함으로써 결장암 세포에서 세포-세포 부착을 제어한다는 것을 시사한다.
참조에 의한 통합
본원에 인용된 특허 문서 및 과학 논문 각각의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
균등물
본 개시내용은 이의 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 전술한 구현예는 본원에 기재된 개시내용을 제한하기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 본 개시내용의 범위는 전술한 설명이 아닌 첨부된 청구범위에 의해 표시되며, 청구범위의 균등의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변경은 그 안에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Nogra Pharma Limited <120> FRAGILE X MENTAL RETARDATION PROTEIN INTERFERING OLIGONUCLEOTIDES AND METHODS OF USING SAME <130> GIU-059WO <150> 62/810,697 <151> 2019-02-26 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Antisense Oligonucleotide <400> 1 ccaccaccag ctcctcca 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Antisense Oligonucleotide <400> 2 cttccaccac cagctcct 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Antisense Oligonucleotide <400> 3 tccaccacca gctcctcc 18 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Antisense Oligonucleotide <400> 4 cttccaccac cagctcc 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Antisense 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primer (human FMRP) <400> 11 gttgagcggc cgagtttgtc ag 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Synthetic primer (human FMRP) <400> 12 cccactggga gaggattatt tggg 24 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Synthetic primer (human and mouse b-actin) <400> 13 aagatgaccc agatcatgtt tgagacc 27 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Synthetic primer (human and mouse b-actin) <400> 14 agccagtcca gacgcaggat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Antisense Oligonucleotide <400> 15 atggaggagc tggtggtgga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Antisense Oligonucleotide <400> 16 gcatctccac tctgctggtt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Note= Description of Artificial Sequence: Sense Oligonucleotide <400> 17 aaccagcaga gtggagatgc 20 <210> 18 <211> 4140 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 acttccggtg gagggccgcc tctgagcggg cggcgggccg acggcgagcg cgggcggcgg 60 cggtgacgga ggcgccgctg ccagggggcg tgcggcagcg cggcggcggc ggcggcggcg 120 gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg ctgggcctcg agcgcccgca 180 gcccacctct cgggggcggg ctcccggcgc tagcagggct gaagagaaga tggaggagct 240 ggtggtggaa gtgcggggct ccaatggcgc tttctacaag gcatttgtaa aggatgttca 300 tgaagattca ataacagttg catttgaaaa caactggcag cctgataggc agattccatt 360 tcatgatgtc agattcccac ctcctgtagg ttataataaa gatataaatg aaagtgatga 420 agttgaggtg tattccagag caaatgaaaa agagccttgc tgttggtggt tagctaaagt 480 gaggatgata aagggtgagt tttatgtgat agaatatgca gcatgtgatg caacttacaa 540 tgaaattgtc acaattgaac gtctaagatc tgttaatccc aacaaacctg ccacaaaaga 600 tactttccat aagatcaagc tggatgtgcc agaagactta cggcaaatgt gtgccaaaga 660 ggcggcacat aaggatttta aaaaggcagt tggtgccttt tctgtaactt atgatccaga 720 aaattatcag cttgtcattt tgtccatcaa tgaagtcacc tcaaagcgag cacatatgct 780 gattgacatg cactttcgga gtctgcgcac taagttgtct ctgataatga gaaatgaaga 840 agctagtaag cagctggaga gttcaaggca gcttgcctcg agatttcatg aacagtttat 900 cgtaagagaa gatctgatgg gtctagctat tggtactcat ggtgctaata ttcagcaagc 960 tagaaaagta cctggggtca ctgctattga tctagatgaa gatacctgca catttcatat 1020 ttatggagag gatcaggatg cagtgaaaaa agctagaagc tttctcgaat ttgctgaaga 1080 tgtaatacaa gttccaagga acttagtagg caaagtaata ggaaaaaatg gaaagctgat 1140 tcaggagatt gtggacaagt caggagttgt gagggtgagg attgaggctg aaaatgagaa 1200 aaatgttcca caagaagagg aaattatgcc accaaattcc cttccttcca ataattcaag 1260 ggttggacct aatgccccag aagaaaaaaa acatttagat ataaaggaaa acagcaccca 1320 tttttctcaa cctaacagta caaaagtcca gagggtgtta gtggcttcat cagttgtagc 1380 aggggaatcc cagaaacctg aactcaaggc ttggcagggt atggtaccat ttgtttttgt 1440 gggaacaaag gacagcatcg ctaatgccac tgttcttttg gattatcacc tgaactattt 1500 aaagctccaa cagaggaaga gagggagagc ttcctgcgca gaggagacgg acggcggcgt 1560 ggagggggag gaagaggaca aggaggaaga ggacgtggag gaggcttcaa aggaaacgac 1620 gatcactccc gaacagataa tcgtccacgt aatccaagag aggctaaagg aagaacaaca 1680 gatggatccc ttcagatcag agttgactgc aataatgaaa ggagtgtcca cactaaaaca 1740 ttacagaata cctccagtga aggtagtcgg ctgcgcacgg gtaaagatcg taaccagaag 1800 aaagagaagc cagacagcgt ggatggtcag caaccactcg tgaatggagt accctaaact 1860 gcataattct gaagttatat ttcctatacc atttccgtaa ttcttattcc atattagaaa 1920 actttgttag gccaaagaca aatagtaggc aagatggcac agggcatgaa atgaacacaa 1980 attatgctaa gaatttttta ttttttggta ttggccataa gcaacaattt tcagatttgc 2040 acaaaaagat accttaaaat ttgaaacatt gcttttaaaa ctacttagca cttcagggca 2100 gattttagtt ttattttcta aagtactgag cagtgatatt ctttgttaat ttggaccatt 2160 ttcctgcatt gggtgatcat tcaccagtac attctcagtt tttcttaata tatagcattt 2220 atggtaatca tattagactt ctgttttcaa tctcgtatag aagtcttcat gaaatgctat 2280 gtcatttcat gtcctgtgtc agtttatgtt ttggtccact tttccagtat tttagtggac 2340 cctgaaatgt gtgtgatgtg acatttgtca ttttcattag caaaaaaagt tgtatgatct 2400 gtgccttttt tatatcttgg caggtaggaa tattatattt ggatgcagag ttcagggaag 2460 ataagttgga aacactaaat gttaaagatg tagcaaaccc tgtcaaacat tagtacttta 2520 tagaagaatg catgctttcc atattttttt ccttacataa acatcaggtt aggcagtata 2580 aagaatagga cttgtttttg tttttgtttt gttgcactga agtttgataa atagtgttat 2640 tgagagagat gtgtaatttt tctgtataga caggagaaga aagaactatc ttcatctgag 2700 agaggctaaa atgttttcag ctaggaacaa atcttcctgg tcgaaagtta gtaggatatg 2760 cctgctcttt ggcctgatga ccaattttaa cttagagctt ttttttttta attttgtctg 2820 ccccaagttt tgtgaaattt ttcatatttt aatttcaagc ttattttgga gagataggaa 2880 ggtcatttcc atgtatgcat aataatcctg caaagtacag gtactttgtc taagaaacat 2940 tggaagcagg ttaaatgttt tgtaaacttt gaaatatatg gtctaatgtt taagcagaat 3000 tggaaaagac taagatcggt taacaaataa caactttttt ttcttttttt cttttgtttt 3060 ttgaagtgtt ggggtttggt tttgtttttt gagtcttttt tttttaagtg aaatttattg 3120 aggaaaaata tgtgaaggac cttcactcta agatgttata tttttcttaa aaagtaactc 3180 ctagtagggg taccactgaa tctgtacaga gccgtaaaaa ctgaagttct gcctctgatg 3240 tattttgtga gtttgtttct ttgaattttc attttacagt tacttttcct tgcatacaaa 3300 caagcatata aaatggcaac aaactgcaca tgatttcaca aatattaaaa agtcttttaa 3360 aaagtattgc caaacattaa tgttgatttc tagttattta ttctgggaat gtatagtatt 3420 tgaaaacaga aattggtacc ttgcacacat catctgtaag ctgtttggtt ttaaaatact 3480 gtagataatt aaccaaggta gaatgacctt gtaatgtaac tgctcttggg caatattctc 3540 tgtacatatt agcgacaaca gattggattt tatgttgaca tttgtttggt tatagtgcaa 3600 tatattttgt atgcaagcag tttcaataaa gtttgatctt cctctgctaa attgatgttg 3660 atgcaatcct tacaaatgat tgcttttaaa attttaagct aggaaaagaa atctatagaa 3720 agtgttctgt tacaaaatgt aactgttacc attggaaatt tcacgtcata ggaagttagc 3780 ctttatctac caactttcaa gaacttgttt aataaagcga aaaactcaac caaatggtac 3840 aaaaccacag tgtaccatta aaatatgcac taagtctctt ttttacaaag gctgtattca 3900 gcaaggcgct aacttgctta aatgtgaatt actaacttct aaaactgtac tttgattcac 3960 atgttttcaa atggagttgg agttcattca tattacaata tttgtgtgct aaacgtgtat 4020 gtttttcagt tcaaagtcat gatgttttta aaatcttatt aaagtttcaa aaatctgaag 4080 attgtttatc tagatgtaaa tttttattaa aaagttgcac ttatgaaaaa gcaaaaaatt 4140 <210> 19 <211> 4348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 acttccggtg gagggccgcc tctgagcggg cggcgggccg acggcgagcg cgggcggcgg 60 cggtgacgga ggcgccgctg ccagggggcg tgcggcagcg cggcggcggc ggcggcggcg 120 gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg ctgggcctcg agcgcccgca 180 gcccacctct cgggggcggg ctcccggcgc tagcagggct gaagagaaga tggaggagct 240 ggtggtggaa gtgcggggct ccaatggcgc tttctacaag gcatttgtaa aggatgttca 300 tgaagattca ataacagttg catttgaaaa caactggcag cctgataggc agattccatt 360 tcatgatgtc agattcccac ctcctgtagg ttataataaa gatataaatg aaagtgatga 420 agttgaggtg tattccagag caaatgaaaa agagccttgc tgttggtggt tagctaaagt 480 gaggatgata aagggtgagt tttatgtgat agaatatgca gcatgtgatg caacttacaa 540 tgaaattgtc acaattgaac gtctaagatc tgttaatccc aacaaacctg ccacaaaaga 600 tactttccat aagatcaagc tggatgtgcc agaagactta cggcaaatgt gtgccaaaga 660 ggcggcacat aaggatttta aaaaggcagt tggtgccttt tctgtaactt atgatccaga 720 aaattatcag cttgtcattt tgtccatcaa 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agggggcacg gcagacgcgg 1620 tcctggatat acttcaggaa ctaattctga agcatcaaat gcttctgaaa cagaatctga 1680 ccacagagac gaactcagtg attggtcatt agctccaaca gaggaagaga gggagagctt 1740 cctgcgcaga ggagacggac ggcggcgtgg agggggagga agaggacaag gaggaagagg 1800 acgtggagga ggcttcaaag gaaacgacga tcactcccga acagataatc gtccacgtaa 1860 tccaagagag gctaaaggaa gaacaacaga tggatccctt cagatcagag ttgactgcaa 1920 taatgaaagg agtgtccaca ctaaaacatt acagaatacc tccagtgaag gtagtcggct 1980 gcgcacgggt aaagatcgta accagaagaa agagaagcca gacagcgtgg atggtcagca 2040 accactcgtg aatggagtac cctaaactgc ataattctga agttatattt cctataccat 2100 ttccgtaatt cttattccat attagaaaac tttgttaggc caaagacaaa tagtaggcaa 2160 gatggcacag ggcatgaaat gaacacaaat tatgctaaga attttttatt ttttggtatt 2220 ggccataagc aacaattttc agatttgcac aaaaagatac cttaaaattt gaaacattgc 2280 ttttaaaact acttagcact tcagggcaga ttttagtttt attttctaaa gtactgagca 2340 gtgatattct ttgttaattt ggaccatttt cctgcattgg gtgatcattc accagtacat 2400 tctcagtttt tcttaatata tagcatttat ggtaatcata 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ggtttggttt tgttttttga 3300 gtcttttttt tttaagtgaa atttattgag gaaaaatatg tgaaggacct tcactctaag 3360 atgttatatt tttcttaaaa agtaactcct agtaggggta ccactgaatc tgtacagagc 3420 cgtaaaaact gaagttctgc ctctgatgta ttttgtgagt ttgtttcttt gaattttcat 3480 tttacagtta cttttccttg catacaaaca agcatataaa atggcaacaa actgcacatg 3540 atttcacaaa tattaaaaag tcttttaaaa agtattgcca aacattaatg ttgatttcta 3600 gttatttatt ctgggaatgt atagtatttg aaaacagaaa ttggtacctt gcacacatca 3660 tctgtaagct gtttggtttt aaaatactgt agataattaa ccaaggtaga atgaccttgt 3720 aatgtaactg ctcttgggca atattctctg tacatattag cgacaacaga ttggatttta 3780 tgttgacatt tgtttggtta tagtgcaata tattttgtat gcaagcagtt tcaataaagt 3840 ttgatcttcc tctgctaaat tgatgttgat gcaatcctta caaatgattg cttttaaaat 3900 tttaagctag gaaaagaaat ctatagaaag tgttctgtta caaaatgtaa ctgttaccat 3960 tggaaatttc acgtcatagg aagttagcct ttatctacca actttcaaga acttgtttaa 4020 taaagcgaaa aactcaacca aatggtacaa aaccacagtg taccattaaa atatgcacta 4080 agtctctttt ttacaaaggc tgtattcagc aaggcgctaa cttgcttaaa tgtgaattac 4140 taacttctaa aactgtactt tgattcacat gttttcaaat ggagttggag ttcattcata 4200 ttacaatatt tgtgtgctaa acgtgtatgt ttttcagttc aaagtcatga tgtttttaaa 4260 atcttattaa agtttcaaaa atctgaagat tgtttatcta gatgtaaatt tttattaaaa 4320 agttgcactt atgaaaaagc aaaaaatt 4348 <210> 20 <211> 4107 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ctcagtcagg cgctcagctc cgtttcggtt tcacttccgg tggagggccg cctctgagcg 60 ggcggcgggc cgacggcgag cgcgggcggc ggcggtgacg gaggcgccgc tgccaggggg 120 cgtgcggcag cgcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggaggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggctgggcct cgagcgcccg cagcccacct ctcgggggcg ggctcccggc 240 gctagcaggg ctgaagagaa gatggaggag ctggtggtgg aagtgcgggg ctccaatggc 300 gctttctaca aggcatttgt aaaggatgtt catgaagatt caataacagt tgcatttgaa 360 aacaactggc agcctgatag gcagattcca tttcatgatg tcagattccc acctcctgta 420 ggttataata aagatataaa tgaaagtgat gaagttgagg tgtattccag agcaaatgaa 480 aaagagcctt gctgttggtg gttagctaaa gtgaggatga taaagggtga gttttatgtg 540 atagaatatg cagcatgtga tgcaacttac aatgaaattg tcacaattga acgtctaaga 600 tctgttaatc ccaacaaacc tgccacaaaa gatactttcc ataagatcaa gctggatgtg 660 ccagaagact tacggcaaat gtgtgccaaa gaggcggcac ataaggattt taaaaaggca 720 gttggtgcct tttctgtaac ttatgatcca gaaaattatc agcttgtcat tttgtccatc 780 aatgaagtca cctcaaagcg agcacatatg ctgattgaca tgcactttcg gagtctgcgc 840 actaagttgt ctctgataat gagaaatgaa gaagctagta agcagctgga gagttcaagg 900 cagcttgcct cgagatttca tgaacagttt atcgtaagag aagatctgat gggtctagct 960 attggtactc atggtgctaa tattcagcaa gctagaaaag tacctggggt cactgctatt 1020 gatctagatg aagatacctg cacatttcat atttatggag aggatcagga tgcagtgaaa 1080 aaagctagaa gctttctcga atttgctgaa gatgtaatac aagttccaag gaacttagta 1140 ggcaaagtaa taggaaaaaa tggaaagctg attcaggaga ttgtggacaa gtcaggagtt 1200 gtgagggtga ggattgaggc tgaaaatgag aaaaatgttc cacaagaaga ggaaattatg 1260 ccaccaaatt cccttccttc caataattca agggttggac ctaatgcccc agaagaaaaa 1320 aaacatttag atataaagga aaacagcacc catttttctc aacctaacag tacaaaagtc 1380 cagaggggta tggtaccatt tgtttttgtg ggaacaaagg acagcatcgc taatgccact 1440 gttcttttgg attatcacct gaactattta aagctccaac agaggaagag agggagagct 1500 tcctgcgcag aggagacgga cggcggcgtg gagggggagg aagaggacaa ggaggaagag 1560 gacgtggagg aggcttcaaa ggaaacgacg atcactcccg aacagataat cgtccacgta 1620 atccaagaga ggctaaagga agaacaacag atggatccct tcagatcaga gttgactgca 1680 ataatgaaag gagtgtccac actaaaacat tacagaatac ctccagtgaa ggtagtcggc 1740 tgcgcacggg taaagatcgt aaccagaaga aagagaagcc agacagcgtg gatggtcagc 1800 aaccactcgt gaatggagta ccctaaactg cataattctg aagttatatt tcctatacca 1860 tttccgtaat tcttattcca tattagaaaa ctttgttagg ccaaagacaa atagtaggca 1920 agatggcaca gggcatgaaa tgaacacaaa ttatgctaag aattttttat tttttggtat 1980 tggccataag caacaatttt cagatttgca caaaaagata ccttaaaatt tgaaacattg 2040 cttttaaaac tacttagcac ttcagggcag attttagttt tattttctaa agtactgagc 2100 agtgatattc tttgttaatt tggaccattt tcctgcattg ggtgatcatt caccagtaca 2160 ttctcagttt ttcttaatat atagcattta tggtaatcat attagacttc tgttttcaat 2220 ctcgtataga agtcttcatg aaatgctatg tcatttcatg tcctgtgtca gtttatgttt 2280 tggtccactt ttccagtatt ttagtggacc ctgaaatgtg tgtgatgtga catttgtcat 2340 tttcattagc aaaaaaagtt gtatgatctg tgcctttttt atatcttggc aggtaggaat 2400 attatatttg gatgcagagt tcagggaaga taagttggaa acactaaatg ttaaagatgt 2460 agcaaaccct gtcaaacatt agtactttat agaagaatgc atgctttcca tatttttttc 2520 cttacataaa catcaggtta ggcagtataa agaataggac ttgtttttgt ttttgttttg 2580 ttgcactgaa gtttgataaa tagtgttatt gagagagatg tgtaattttt ctgtatagac 2640 aggagaagaa agaactatct tcatctgaga gaggctaaaa tgttttcagc taggaacaaa 2700 tcttcctggt cgaaagttag taggatatgc ctgctctttg gcctgatgac caattttaac 2760 ttagagcttt ttttttttaa ttttgtctgc cccaagtttt gtgaaatttt tcatatttta 2820 atttcaagct tattttggag agataggaag gtcatttcca tgtatgcata ataatcctgc 2880 aaagtacagg tactttgtct aagaaacatt ggaagcaggt taaatgtttt gtaaactttg 2940 aaatatatgg tctaatgttt aagcagaatt ggaaaagact aagatcggtt aacaaataac 3000 aacttttttt tctttttttc ttttgttttt tgaagtgttg gggtttggtt ttgttttttg 3060 agtctttttt ttttaagtga aatttattga ggaaaaatat gtgaaggacc ttcactctaa 3120 gatgttatat ttttcttaaa aagtaactcc tagtaggggt accactgaat ctgtacagag 3180 ccgtaaaaac tgaagttctg cctctgatgt attttgtgag tttgtttctt tgaattttca 3240 ttttacagtt acttttcctt gcatacaaac aagcatataa aatggcaaca aactgcacat 3300 gatttcacaa atattaaaaa gtcttttaaa aagtattgcc aaacattaat gttgatttct 3360 agttatttat tctgggaatg tatagtattt gaaaacagaa attggtacct tgcacacatc 3420 atctgtaagc tgtttggttt taaaatactg tagataatta accaaggtag aatgaccttg 3480 taatgtaact gctcttgggc aatattctct gtacatatta gcgacaacag attggatttt 3540 atgttgacat ttgtttggtt atagtgcaat atattttgta tgcaagcagt ttcaataaag 3600 tttgatcttc ctctgctaaa ttgatgttga tgcaatcctt acaaatgatt gcttttaaaa 3660 ttttaagcta ggaaaagaaa tctatagaaa gtgttctgtt acaaaatgta actgttacca 3720 ttggaaattt cacgtcatag gaagttagcc tttatctacc aactttcaag aacttgttta 3780 ataaagcgaa aaactcaacc aaatggtaca aaaccacagt gtaccattaa aatatgcact 3840 aagtctcttt tttacaaagg ctgtattcag caaggcgcta acttgcttaa atgtgaatta 3900 ctaacttcta aaactgtact ttgattcaca tgttttcaaa tggagttgga gttcattcat 3960 attacaatat ttgtgtgcta aacgtgtatg tttttcagtt caaagtcatg atgtttttaa 4020 aatcttatta aagtttcaaa aatctgaaga ttgtttatct agatgtaaat ttttattaaa 4080 aagttgcact tatgaaaaag caaaaaa 4107 <210> 21 <211> 4303 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ctcagtcagg cgctcagctc cgtttcggtt tcacttccgg tggagggccg cctctgagcg 60 ggcggcgggc cgacggcgag cgcgggcggc ggcggtgacg gaggcgccgc tgccaggggg 120 cgtgcggcag cgcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggaggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggctgggcct cgagcgcccg cagcccacct ctcgggggcg ggctcccggc 240 gctagcaggg ctgaagagaa gatggaggag ctggtggtgg aagtgcgggg ctccaatggc 300 gctttctaca aggcatttgt aaaggatgtt catgaagatt caataacagt tgcatttgaa 360 aacaactggc agcctgatag gcagattcca tttcatgatg tcagattccc acctcctgta 420 ggttataata aagatataaa tgaaagtgat gaagttgagg tgtattccag agcaaatgaa 480 aaagagcctt gctgttggtg gttagctaaa gtgaggatga taaagggtga gttttatgtg 540 atagaatatg cagcatgtga tgcaacttac aatgaaattg tcacaattga acgtctaaga 600 tctgttaatc ccaacaaacc tgccacaaaa gatactttcc ataagatcaa gctggatgtg 660 ccagaagact tacggcaaat gtgtgccaaa gaggcggcac ataaggattt taaaaaggca 720 gttggtgcct tttctgtaac ttatgatcca gaaaattatc agcttgtcat tttgtccatc 780 aatgaagtca cctcaaagcg agcacatatg ctgattgaca tgcactttcg gagtctgcgc 840 actaagttgt ctctgataat gagaaatgaa gaagctagta agcagctgga gagttcaagg 900 cagcttgcct cgagatttca tgaacagttt atcgtaagag aagatctgat gggtctagct 960 attggtactc atggtgctaa tattcagcaa gctagaaaag tacctggggt cactgctatt 1020 gatctagatg aagatacctg cacatttcat atttatggag aggatcagga tgcagtgaaa 1080 aaagctagaa gctttctcga atttgctgaa gatgtaatac aagttccaag gaacttagta 1140 ggcaaagtaa taggaaaaaa tggaaagctg attcaggaga ttgtggacaa gtcaggagtt 1200 gtgagggtga ggattgaggc tgaaaatgag aaaaatgttc cacaagaaga ggaaattatg 1260 ccaccaaatt cccttccttc caataattca agggttggac ctaatgcccc agaagaaaaa 1320 aaacatttag atataaagga aaacagcacc catttttctc aacctaacag tacaaaagtc 1380 cagaggggta tggtaccatt tgtttttgtg ggaacaaagg acagcatcgc taatgccact 1440 gttcttttgg attatcacct gaactattta aaggaagtag accagttgcg tttggagaga 1500 ttacaaattg atgagcagtt gcgacagatt ggagctagtt ctagaccacc accaaatcgt 1560 acagataagg aaaaaagcta tgtgactgat gatggtcaag gaatgggtcg aggtagtaga 1620 ccttacagaa atagggggca cggcagacgc ggtcctggat atacttcagc tccaacagag 1680 gaagagaggg agagcttcct gcgcagagga gacggacggc ggcgtggagg gggaggaaga 1740 ggacaaggag gaagaggacg tggaggaggc ttcaaaggaa acgacgatca ctcccgaaca 1800 gataatcgtc cacgtaatcc aagagaggct aaaggaagaa caacagatgg atcccttcag 1860 atcagagttg actgcaataa tgaaaggagt gtccacacta aaacattaca gaatacctcc 1920 agtgaaggta gtcggctgcg cacgggtaaa gatcgtaacc agaagaaaga gaagccagac 1980 agcgtggatg gtcagcaacc actcgtgaat ggagtaccct aaactgcata attctgaagt 2040 tatatttcct ataccatttc cgtaattctt attccatatt agaaaacttt gttaggccaa 2100 agacaaatag taggcaagat ggcacagggc atgaaatgaa cacaaattat gctaagaatt 2160 ttttattttt tggtattggc cataagcaac aattttcaga tttgcacaaa aagatacctt 2220 aaaatttgaa acattgcttt taaaactact tagcacttca gggcagattt tagttttatt 2280 ttctaaagta ctgagcagtg atattctttg ttaatttgga ccattttcct gcattgggtg 2340 atcattcacc agtacattct cagtttttct taatatatag catttatggt aatcatatta 2400 gacttctgtt ttcaatctcg tatagaagtc ttcatgaaat gctatgtcat ttcatgtcct 2460 gtgtcagttt atgttttggt ccacttttcc agtattttag tggaccctga aatgtgtgtg 2520 atgtgacatt tgtcattttc attagcaaaa aaagttgtat gatctgtgcc ttttttatat 2580 cttggcaggt aggaatatta tatttggatg cagagttcag ggaagataag ttggaaacac 2640 taaatgttaa agatgtagca aaccctgtca aacattagta ctttatagaa gaatgcatgc 2700 tttccatatt tttttcctta cataaacatc aggttaggca gtataaagaa taggacttgt 2760 ttttgttttt gttttgttgc actgaagttt gataaatagt gttattgaga gagatgtgta 2820 atttttctgt atagacagga gaagaaagaa ctatcttcat ctgagagagg ctaaaatgtt 2880 ttcagctagg aacaaatctt cctggtcgaa agttagtagg atatgcctgc tctttggcct 2940 gatgaccaat tttaacttag agcttttttt ttttaatttt gtctgcccca agttttgtga 3000 aatttttcat attttaattt caagcttatt ttggagagat aggaaggtca tttccatgta 3060 tgcataataa tcctgcaaag tacaggtact ttgtctaaga aacattggaa gcaggttaaa 3120 tgttttgtaa actttgaaat atatggtcta atgtttaagc agaattggaa aagactaaga 3180 tcggttaaca aataacaact tttttttctt tttttctttt gttttttgaa gtgttggggt 3240 ttggttttgt tttttgagtc tttttttttt aagtgaaatt tattgaggaa aaatatgtga 3300 aggaccttca ctctaagatg ttatattttt cttaaaaagt aactcctagt aggggtacca 3360 ctgaatctgt acagagccgt aaaaactgaa gttctgcctc tgatgtattt tgtgagtttg 3420 tttctttgaa ttttcatttt acagttactt ttccttgcat acaaacaagc atataaaatg 3480 gcaacaaact gcacatgatt tcacaaatat taaaaagtct tttaaaaagt attgccaaac 3540 attaatgttg atttctagtt atttattctg ggaatgtata gtatttgaaa acagaaattg 3600 gtaccttgca cacatcatct gtaagctgtt tggttttaaa atactgtaga taattaacca 3660 aggtagaatg accttgtaat gtaactgctc ttgggcaata ttctctgtac atattagcga 3720 caacagattg gattttatgt tgacatttgt ttggttatag tgcaatatat tttgtatgca 3780 agcagtttca ataaagtttg atcttcctct gctaaattga tgttgatgca atccttacaa 3840 atgattgctt ttaaaatttt aagctaggaa aagaaatcta tagaaagtgt tctgttacaa 3900 aatgtaactg ttaccattgg aaatttcacg tcataggaag ttagccttta tctaccaact 3960 ttcaagaact tgtttaataa agcgaaaaac tcaaccaaat ggtacaaaac cacagtgtac 4020 cattaaaata tgcactaagt ctctttttta caaaggctgt attcagcaag gcgctaactt 4080 gcttaaatgt gaattactaa cttctaaaac tgtactttga ttcacatgtt ttcaaatgga 4140 gttggagttc attcatatta caatatttgt gtgctaaacg tgtatgtttt tcagttcaaa 4200 gtcatgatgt ttttaaaatc ttattaaagt ttcaaaaatc tgaagattgt ttatctagat 4260 gtaaattttt attaaaaagt tgcacttatg aaaaagcaaa aaa 4303 <210> 22 <211> 4441 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ctcagtcagg cgctcagctc cgtttcggtt tcacttccgg tggagggccg cctctgagcg 60 ggcggcgggc cgacggcgag cgcgggcggc ggcggtgacg gaggcgccgc tgccaggggg 120 cgtgcggcag cgcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggaggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggctgggcct cgagcgcccg cagcccacct ctcgggggcg ggctcccggc 240 gctagcaggg ctgaagagaa gatggaggag ctggtggtgg aagtgcgggg ctccaatggc 300 gctttctaca aggcatttgt aaaggatgtt catgaagatt caataacagt tgcatttgaa 360 aacaactggc agcctgatag gcagattcca tttcatgatg tcagattccc acctcctgta 420 ggttataata aagatataaa tgaaagtgat gaagttgagg tgtattccag agcaaatgaa 480 aaagagcctt gctgttggtg gttagctaaa gtgaggatga taaagggtga gttttatgtg 540 atagaatatg cagcatgtga tgcaacttac aatgaaattg tcacaattga acgtctaaga 600 tctgttaatc ccaacaaacc tgccacaaaa gatactttcc ataagatcaa gctggatgtg 660 ccagaagact tacggcaaat gtgtgccaaa gaggcggcac ataaggattt taaaaaggca 720 gttggtgcct tttctgtaac ttatgatcca gaaaattatc agcttgtcat tttgtccatc 780 aatgaagtca cctcaaagcg agcacatatg ctgattgaca tgcactttcg gagtctgcgc 840 actaagttgt ctctgataat gagaaatgaa gaagctagta agcagctgga gagttcaagg 900 cagcttgcct cgagatttca tgaacagttt atcgtaagag aagatctgat gggtctagct 960 attggtactc atggtgctaa tattcagcaa gctagaaaag tacctggggt cactgctatt 1020 gatctagatg aagatacctg cacatttcat atttatggag aggatcagga tgcagtgaaa 1080 aaagctagaa gctttctcga atttgctgaa gatgtaatac aagttccaag gaacttagta 1140 ggcaaagtaa taggaaaaaa tggaaagctg attcaggaga ttgtggacaa gtcaggagtt 1200 gtgagggtga ggattgaggc tgaaaatgag aaaaatgttc cacaagaaga ggaaattatg 1260 ccaccaaatt cccttccttc caataattca agggttggac ctaatgcccc agaagaaaaa 1320 aaacatttag atataaagga aaacagcacc catttttctc aacctaacag tacaaaagtc 1380 cagagggtgt tagtggcttc atcagttgta gcaggggaat cccagaaacc tgaactcaag 1440 gcttggcagg gtatggtacc atttgttttt gtgggaacaa aggacagcat cgctaatgcc 1500 actgttcttt tggattatca cctgaactat ttaaaggaag tagaccagtt gcgtttggag 1560 agattacaaa ttgatgagca gttgcgacag attggagcta gttctagacc accaccaaat 1620 cgtacagata aggaaaaaag ctatgtgact gatgatggtc aaggaatggg tcgaggtagt 1680 agaccttaca gaaatagggg gcacggcaga cgcggtcctg gatatacttc aggaactaat 1740 tctgaagcat caaatgcttc tgaaacagaa tctgaccaca gagacgaact cagtgattgg 1800 tcattagctc caacagagga agagagggag agcttcctgc gcagaggaga cggacggcgg 1860 cgtggagggg gaggaagagg acaaggagga agaggacgtg gaggaggctt caaaggaaac 1920 gacgatcact cccgaacaga taatcgtcca cgtaatccaa gagaggctaa aggaagaaca 1980 acagatggat cccttcagat cagagttgac tgcaataatg aaaggagtgt ccacactaaa 2040 acattacaga atacctccag tgaaggtagt cggctgcgca cgggtaaaga tcgtaaccag 2100 aagaaagaga agccagacag cgtggatggt cagcaaccac tcgtgaatgg agtaccctaa 2160 actgcataat tctgaagtta tatttcctat accatttccg taattcttat tccatattag 2220 aaaactttgt taggccaaag acaaatagta ggcaagatgg cacagggcat gaaatgaaca 2280 caaattatgc taagaatttt ttattttttg gtattggcca taagcaacaa ttttcagatt 2340 tgcacaaaaa gataccttaa aatttgaaac attgctttta aaactactta gcacttcagg 2400 gcagatttta gttttatttt ctaaagtact gagcagtgat attctttgtt aatttggacc 2460 attttcctgc attgggtgat cattcaccag tacattctca gtttttctta atatatagca 2520 tttatggtaa tcatattaga cttctgtttt caatctcgta tagaagtctt catgaaatgc 2580 tatgtcattt catgtcctgt gtcagtttat gttttggtcc acttttccag tattttagtg 2640 gaccctgaaa tgtgtgtgat gtgacatttg tcattttcat tagcaaaaaa agttgtatga 2700 tctgtgcctt ttttatatct tggcaggtag gaatattata tttggatgca gagttcaggg 2760 aagataagtt ggaaacacta aatgttaaag atgtagcaaa ccctgtcaaa cattagtact 2820 ttatagaaga atgcatgctt tccatatttt tttccttaca taaacatcag gttaggcagt 2880 ataaagaata ggacttgttt ttgtttttgt tttgttgcac tgaagtttga taaatagtgt 2940 tattgagaga gatgtgtaat ttttctgtat agacaggaga agaaagaact atcttcatct 3000 gagagaggct aaaatgtttt cagctaggaa caaatcttcc tggtcgaaag ttagtaggat 3060 atgcctgctc tttggcctga tgaccaattt taacttagag cttttttttt ttaattttgt 3120 ctgccccaag ttttgtgaaa tttttcatat tttaatttca agcttatttt ggagagatag 3180 gaaggtcatt tccatgtatg cataataatc ctgcaaagta caggtacttt gtctaagaaa 3240 cattggaagc aggttaaatg ttttgtaaac tttgaaatat atggtctaat gtttaagcag 3300 aattggaaaa gactaagatc ggttaacaaa taacaacttt tttttctttt tttcttttgt 3360 tttttgaagt gttggggttt ggttttgttt tttgagtctt ttttttttaa gtgaaattta 3420 ttgaggaaaa atatgtgaag gaccttcact ctaagatgtt atatttttct taaaaagtaa 3480 ctcctagtag gggtaccact gaatctgtac agagccgtaa aaactgaagt tctgcctctg 3540 atgtattttg tgagtttgtt tctttgaatt ttcattttac agttactttt ccttgcatac 3600 aaacaagcat ataaaatggc aacaaactgc acatgatttc acaaatatta aaaagtcttt 3660 taaaaagtat tgccaaacat taatgttgat ttctagttat ttattctggg aatgtatagt 3720 atttgaaaac agaaattggt accttgcaca catcatctgt aagctgtttg gttttaaaat 3780 actgtagata attaaccaag gtagaatgac cttgtaatgt aactgctctt gggcaatatt 3840 ctctgtacat attagcgaca acagattgga ttttatgttg acatttgttt ggttatagtg 3900 caatatattt tgtatgcaag cagtttcaat aaagtttgat cttcctctgc taaattgatg 3960 ttgatgcaat ccttacaaat gattgctttt aaaattttaa gctaggaaaa gaaatctata 4020 gaaagtgttc tgttacaaaa tgtaactgtt accattggaa atttcacgtc ataggaagtt 4080 agcctttatc taccaacttt caagaacttg tttaataaag cgaaaaactc aaccaaatgg 4140 tacaaaacca cagtgtacca ttaaaatatg cactaagtct cttttttaca aaggctgtat 4200 tcagcaaggc gctaacttgc ttaaatgtga attactaact tctaaaactg tactttgatt 4260 cacatgtttt caaatggagt tggagttcat tcatattaca atatttgtgt gctaaacgtg 4320 tatgtttttc agttcaaagt catgatgttt ttaaaatctt attaaagttt caaaaatctg 4380 aagattgttt atctagatgt aaatttttat taaaaagttg cacttatgaa aaagcaaaaa 4440 a 4441

Claims (71)

  1. 취약 X 정신 지체 단백질(FMRP)의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 장 질환을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 장 질환은 결장직장암인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 장 질환은 염증성 장 질환인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인 방법.
  5. 취약 X 정신 지체 단백질(FMRP)의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 고형 종양, 종양 침습, 또는 종양 전이를 치료하는 방법.
  6. 취약 X 정신 지체 단백질(FMRP)의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 종양 침습 또는 종양 전이를 예방 또는 개선하는 방법.
  7. 취약 X 정신 지체 단백질(FMRP)의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 결장직장암 종양 침습 또는 결장직장 종양 전이를 예방 또는 개선하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 네크롭토시스(necroptosis)를 유도하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    5'-CCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 1),
    5'-CTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 2),
    5'-TCCACCACCAGCTCCTCC-3'(서열번호: 3),
    5'-CTTCCACCACCAGCTCC-3'(서열번호: 4), 및
    5'-TCACCCTTTATCATCCTC-3'(서열번호: 5)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이의 보체를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6),
    5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7),
    5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8),
    5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9), 및
    5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이의 보체를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-메틸시티딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 데옥시시티딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트, 및 5-메틸-2'-데옥시시티딘-5'-모노포스포로티오에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸티미딘, 2'-O-메틸우리딘, 및 2'-O-메틸아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-메틸 시토신 및 5-메틸구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오사이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오사이드, 및 2'-플루오로-β-D-아라비노뉴클레오사이드로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 가교 핵산, 잠금 핵산(LNA), 구속 에틸(cET) 핵산, 트리사이클로-DNA(tcDNA), 2'-O,4'-C-에틸렌 연결된 핵산(ENA), 및 펩타이드 핵산(PNA)으로부터 선택된 군 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 알킬포스포네이트 연결, 아미노알킬포스포트리에스테르 연결, 알킬렌 포스포네이트 연결, 포스피네이트 연결, 포스포라미데이트 연결, 포스포로모르폴리데이트 연결, 포스포로피페라지데이트 연결, 아미노알킬포스포라미데이트 연결, 티오포스포라미데이트 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 티오포스페이트 연결, 셀레노포스페이트 연결, 및 보라노포스페이트 연결로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 메틸포스포네이트 연결을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 20 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는
    5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6),
    5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7),
    5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8),
    5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9), 및
    5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 이의 보체로 구성되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 메틸포스포네이트 연결을 포함하는 것인 방법.
  29. 제8항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 수용체 상호작용 단백질 키나아제 1(RIPK1), 수용체 상호작용 단백질 키나아제 3(RIPK3), 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 단백질(MLKL)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 하나 초과의 키나아제의 증가된 활성화를 유도하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 장내로 또는 비경구로 환자에게 투여되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 장내 투여는 경구, 설하, 위, 또는 직장인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 비경구 투여는 정맥내, 종양내, 공장내, 회장내, 결장내, 또는 직장내인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 인간인 방법.
  34. 5'-CCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 1),
    5'-CTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 2),
    5'-TCCACCACCAGCTCCTCC-3'(서열번호: 3),
    5'-CTTCCACCACCAGCTCC-3'(서열번호: 4), 및
    5'-TCACCCTTTATCATCCTC-3'(서열번호: 5)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이의 보체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  35. 제34항에 있어서,
    5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6),
    5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7),
    5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8),
    5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9), 및
    5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이의 보체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 5-메틸시티딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 데옥시시티딘, 5-메틸-2'-데옥시시티딘 5'-모노포스페이트, 및 5-메틸-2'-데옥시시티딘-5'-모노포스포로티오에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸티미딘, 2'-O-메틸우리딘, 및 2'-O-메틸아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 5-메틸 시토신 및 5-메틸구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오사이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오사이드, 및 2'-플루오로-β-D-아라비노뉴클레오사이드로부터 선택된 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 가교 핵산, 잠금 핵산(LNA), 구속 에틸(cET) 핵산, 트리사이클로-DNA(tcDNA), 2'-O,4'-C-에틸렌 연결 핵산(ENA), 및 펩타이드 핵산(PNA)으로부터 선택된 군 중 하나 이상을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 알킬포스포네이트 연결, 아미노알킬포스포트리에스테르 연결, 알킬렌 포스포네이트 연결, 포스피네이트 연결, 포스포라미데이트 연결, 포스포로모르폴리데이트 연결, 포스포로피페라지데이트 연결, 아미노알킬포스포라미데이트 연결, 티오포스포라미데이트 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 티오포스페이트 연결, 셀레노포스페이트 연결, 및 보라노포스페이트 연결로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  46. 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결인 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  47. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 메틸포스포네이트 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  48. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 20 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이인 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  49. 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 20 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이인 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  50. 제34항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은
    5'-TCCACCACCAGCTCCTCCAT-3'(서열번호: 6),
    5'-ACTTCCACCACCAGCTCCTC-3'(서열번호: 7),
    5'-TTCCACCACCAGCTCCTCCA-3'(서열번호: 8),
    5'-ACTTCCACCACCAGCTCCT-3'(서열번호: 9), 및
    5'-CTCACCCTTTATCATCCTCA-3'(서열번호: 10)
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 이의 보체로 구성되는 것인 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  51. 제50항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오사이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결인 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  53. 제50항에 있어서, 적어도 하나의 메틸포스포네이트 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  54. 제34항 또는 제35항에 있어서, FMRP siRNA, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  55. 제54항에 있어서, FMRP siRNA는 포스포로티오에이트 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 알킬포스포네이트 연결, 아미노알킬포스포트리에스테르 연결, 알킬렌 포스포네이트 연결, 포스피네이트 연결, 포스포라미데이트 연결, 포스포로모르폴리데이트 연결, 포스포로피페라지데이트 연결, 아미노알킬포스포라미데이트 연결, 티오포스포라미데이트 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 티오포스페이트 연결, 셀레노포스페이트 연결, 및 보라노포스페이트 연결로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오사이드간 연결을 포함하는 것인 FMRP siRNA.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, FMRP siRNA는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인 FMRP siRNA.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, FMRP siRNA의 모든 뉴클레오사이드 연결은 포스포로티오에이트 연결인 FMRP siRNA.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, FMRP siRNA의 적어도 하나의 시티딘은 5-메틸시티딘으로 대체되는 것인 FMRP siRNA.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, FMRP siRNA는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 20 내지 40, 또는 20 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이인 FMRP siRNA.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, FMRP siRNA는 20 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이인 FMRP siRNA.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, FMRP siRNA는 20 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이인 FMRP siRNA.
  62. 제32항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항의 FMRP siRNA; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물.
  63. 장 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제32항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항의 FMRP siRNA의 용도.
  64. 제63항에 있어서, 장 질환은 결장직장암인 용도.
  65. 제63항에 있어서, 장 질환은 염증성 장 질환인 용도.
  66. 제65항에 있어서, 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인 용도.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 약제는 장내로 또는 비경구로 환자에게 투여되는 것인 용도.
  68. 제67항에 있어서, 장내 투여는 경구, 설하, 위, 또는 직장인 용도.
  69. 제67항에 있어서, 비경구 투여는 정맥내, 종양내, 공장내, 회장내, 결장내, 또는 직장내인 용도.
  70. 제63항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 약제는 인간에서 장 질환의 치료를 위한 것인 용도.
  71. 고형 종양, 종양 침습, 또는 종양 전이의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제32항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항의 FMRP siRNA의 용도.
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CN105296474B (zh) * 2009-03-24 2020-05-12 奥斯瑞根公司 对fmr1和fmr2基因5’非翻译区进行表征的pcr方法
US20120231015A1 (en) * 2009-11-06 2012-09-13 Emory University Fragile x mental retardation protein (fmrp), compositions, and methods related thereto
EP2588865A1 (en) * 2010-07-02 2013-05-08 Vib Vzw The role of fragile x mental retardation gene and protein in cancer metastasis
CN103981253A (zh) * 2014-03-27 2014-08-13 江苏佰龄全基因生物医学技术有限公司 一种用于检测脆性x染色体综合征的cgg重复数及agg插入信息的pcr试剂盒
WO2017049192A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating fmr1 expression
WO2017075038A1 (en) * 2015-10-26 2017-05-04 Rana Therapeutics, Inc. Nanoparticle formulations for delivery of nucleic acid complexes

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