KR20210131427A - 관류 적용을 위한 접선형 유동 여과 장치 - Google Patents
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Abstract
관류 시스템을 위한 필터 요소(20, 100) 및 방법이 제공된다. 필터 요소 시트는 약 0.65 ㎛ 이상의 평균 세공 크기를 갖는 미세 다공성 막(63, 112) 및 직조 섬유를 포함하고 약 35 % 이상의 개방 면적을 갖는 공급 스페이서(25, 120)를 포함한다. 필터 요소 시트는 필터 요소 내에, 예를 들어 나선형으로 감긴 형식으로 또는 카세트 형식으로 배열될 수 있다. 관류 시스템은 하나 이상의 필터 요소 및 하나 이상의 필터 요소를 통한 액체 공급물의 유동을 제어하도록 구성된 펌프를 포함한다.
Description
관련 출원(들)
본 출원은 2017년 6월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/513,793의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시가 본 명세서에 참조로 포함된다.
모노클로날 항체(mAbs)는 예를 들어 암, 이식 거부 및 심혈관 질환을 포함하는, 다양한 증상에 대한 치료제로서 사용된다. 예를 들어, 공급형-배치 방법 및 관류 과정을 포함하여, 숙주 세포로부터 mAb를 생산 및 수확하기 위한 다양한 바이오 제약 제조 기술이 존재한다. 공급형-배치 생물반응기 시스템에서, 세포는 정해진 시간 동안, 예를 들어 약 7 내지 약 21 일에 걸쳐 배치로 배양되는데, 그 시점 이후에는 배지 영양소가 숙주 세포에 의해 소비되어 폐기물이 축적된다. 세포 배양 기간 후, 배치는 관심있는 단백질(예를 들어, 모노클로날 항체, 또는 mAb와 같은 생성물)이 세포 덩어리로부터 분리되는 수확 단계를 거친다. 공급형-배치 시스템과 달리, 관류 생물반응기는 더 오랜 기간 동안, 예를 들어 몇 주 또는 몇 개월에 걸쳐 세포를 배양하는데, 그 기간 동안 세포에 신선한 배지를 지속적으로 공급하고, 소모된 배지를 제거하고, 제품을 수확한다. 관류 시스템은 공급형-배치 시스템에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 예를 들어, 제품이 지속적으로 수확되고 정제될 때, 관심 단백질이 높은 수준의 폐기물에 노출되기 전에 관류 시스템에서 제품 분해가 감소된다. 추가적으로, 관류 생물반응기는 상당히 작은 공간을 차지하면서 공급형-배치 생물반응기와 유사한 생성물 수율을 생성할 수 있다. 관류는 공급형-배치 과정에 비해 장점으로 인해 바이오 제약 산업에서 선호되는 제조 기술이 되고 있다. 그러나, 관류 과정은 각 생산 과정 전반에 걸쳐 유지되는 고밀도의 숙주 세포 및 계속적인 수확에 의존하는데, 이는 여러 번의 여과 반복을 수반하고, 및 숙주 세포에 물리적 손상을 유발할 수 있다.
발명의 요약
종래의 관류 시스템 및 과정은 숙주 세포를 손상시킬 수 있는 방해를 피하기 위해 개방 공급물 채널을 갖는 필터 요소를 사용한다. 그러나, 이러한 종래의 시스템 및 공정에 사용되는 필터 요소는 수명이 상대적으로 짧으며, 막 막힘으로 인해 낮은 수확량의 상당히 감소된 체질이 나타났다. 기존 개방 채널 및 중공사 장치와 비교하여 mAb의 개선된 체질 및 처리량을 나타내는 관류 시스템 및 방법을 위한 필터 요소가 제공된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 평균 세공 크기가 약 0.65 ㎛ 이상인 미세 다공성 막 및 직조 섬유를 포함하고 약 35 % 이상의 개방 면적을 갖는 공급 스페이서를 포함하는 필터 요소 시트를 포함한다.
직조 섬유를 포함하고 약 35 % 이상의 개방 면적을 갖는 공급 스페이서는 여과 동안 숙주 세포가 손상되지 않도록, 필터 요소의 공급물 채널 내에서 낮은 전단률을 제공할 수 있다. 공급 스페이서는 예를 들어, 약 35 % 내지 약 55 %의 개방 면적을 가질 수 있고, 약 270 ㎛ 이상, 예를 들어 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 섬유 직경을 갖는 섬유를 포함할 수 있다. 공급 스페이서의 세공 크기는 예를 들어 약 0.8 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 또는 약 1.0 ㎛ 내지 약 5 ㎛일 수 있다. 공급 스페이서의 섬유 밀도는 약 6 섬유/cm 내지 약 13 섬유/cm일 수 있다. 공급 스페이서의 섬유는 이대일 능직 패턴 또는 일대일 직조 패턴으로 직조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 바와 같은 하나 이상의 필터 요소 시트를 포함하는 필터 요소를 제공한다. 필터 요소는 나선형으로 감긴 필터 요소 또는 카세트 필터 요소일 수 있다.
추가적 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 바와 같은 하나 이상의 필터 요소 및 하나 이상의 필터 요소를 통한 액체 공급물의 유동을 제어하도록 구성된 펌프를 포함하는 관류 시스템을 포함한다.
이러한 관류 시스템은 예를 들어, 접선형 유동 여과(TFF) 모드, 재순환 모드 및/또는 교대 유동 모드에서 작동하도록 구성될 수 있다. 펌프는 예를 들어, 자기 부상 펌프, 연동 펌프 또는 다이어프램 펌프일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 필터 요소의 공급물 채널을 통해 액체 공급물을 통과시키고 액체 공급물을 필터 요소 내의 접선형 유동 여과(TFF)에 의해 투과물 및 보유물로 분리하는 것을 포함하는 관류 과정에 관한 것이다. 필터 요소는 미세 여과 막 및 공급물 채널 내에 위치된 직조 공급 스페이서를 포함한다. 세포 및 표적 단백질은 액체 공급물에 존재할 수 있다.
추가적 실시양태에서, 본 발명의 관류 공정은 또한 투과물에서 표적 단백질을 회수하고/하거나 세포를 보유물에 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보유물의 적어도 일부는 적어도 하나의 필터 요소를 통해 재순환될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 하나 이상의 필터 요소를 통한 액체의 유동은 필터 요소의 자체 세정을 위해 교대될 수 있다. 관류 과정은 또한 보유물에 다량의 신선한 배지를 공급하고 보유물 및 신선한 배지를 생물반응기로 복귀시키는 것을 포함할 수 있다. 관류 공정은 계속적으로 수행될 수 있으며, 초기 관류 실행의 보유물은 후속 관류 실행의 액체 공급물이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 함유하는 액체 공급물로부터 표적 단백질을 수확하기 위한 관류 공정을 제공한다. 이 방법은 표적 단백질 및 숙주 세포를 함유하는 액체 공급물을 하나 이상의 필터 요소의 공급물 채널로 전달하고, 표적 단백질을 하나 이상의 필터 요소 내의 숙주 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 필터 요소는 미세 여과 막 및 공급물 채널 내에 위치된 직조 공급 스페이서를 포함한다. 표적 단백질은 예를 들어 모노클로날 항체일 수 있으며, 이는 TFF에 의해 숙주 세포로부터 분리되고 하나 이상의 필터 요소로부터 회수될 수 있다. 관류 공정은 하나 이상의 필터 요소로부터 숙주 세포를 회수하는 단계, 회수된 숙주 세포에 대량의 신선한 배지를 공급하는 단계, 및 회수된 숙주 세포를 생물반응기로 복귀시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 관류 공정은 계속적으로 수행될 수 있으며, 초기 관류 실행의 회수된 숙주 세포는 후속 관류 실행의 액체 공급물이다.
본 발명의 관류 공정은 개방 채널 여과 장치를 포함하는 종래의 관류 과정에 비해 개선된 체질을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질의 약 80 % 이상, 약 90 % 이상, 또는 약 95 % 이상이 필터 요소의 약 500 L/㎡ 이상의 수확량으로 액체 공급물로부터 회수될 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 단백질의 약 80 % 이상, 약 90 % 이상 또는 약 95 % 이상이 필터 요소의 약 1000 L/㎡ 이상의 수확량으로 액체 공급물로부터 회수될 수 있다.
전술한 내용은 유사한 도면 부호가 상이한 도면에 걸쳐 동일한 부분을 나타내는 첨부 도면에 도시된 바와 같이 본 발명의 예시적인 실시양태에 대한 다음의 보다 구체적인 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 축척대로 도시된 것은 아니며, 대신 본 발명의 실시양태를 설명하는데 중점을 두었다.
도 1은 나선형으로 감긴 필터 요소의 예를 도시한 도면이다.
도 2는 카세트 필터 요소의 예의 분해도이다.
도 3은 TFF 시스템의 예를 나타내는 개략도이다.
도 4a는 직조 섬유 공급 스페이서의 시뮬레이션 이미지이다.
도 4b는 도 3a의 직조 섬유 공급 스페이서의 3 차원 그래프이다.
도 4c는 도 4a의 직조 섬유 공급 스페이서의 전단 모델링 결과의 3 차원 그래프이다.
도 5는 직조 섬유 공급 스페이서를 갖는 환경에서 모델링된 전단 속도의 그래프이다.
도 6은 직조 섬유 공급 스페이서에 대한 모델 결과 및 실험 결과의 표이다.
도 7은 접선형 유동 여과 장치의 체질 대 수확량의 실험 결과의 그래프이다.
도 8a는 개방 채널 여과 장치에서 막 막힘의 실험 결과의 그래프이다.
도 8b는 프로스탁(Prostak)TM 한외 여과(UF) 스크린을 갖는 장치에서 막 막힘의 실험 결과의 그래프이다.
도 8c는 D3 스크린을 갖는 장치에서 막 막힘의 실험 결과의 그래프이다.
도 8d는 D 스크린을 갖는 장치에서 막 막힘의 실험 결과의 그래프이다.
도 9는 1 미크론 막 및 D3 스크린을 갖는 접선형 유동 여과 장치의 체질 대 수확량의 실험 결과의 그래프이다.
도 10은 1 미크론 막 및 일대일 직조 스크린을 갖는 접선형 유동 여과 장치의 체질 대 수확량의 실험 결과의 그래프이다.
도 1은 나선형으로 감긴 필터 요소의 예를 도시한 도면이다.
도 2는 카세트 필터 요소의 예의 분해도이다.
도 3은 TFF 시스템의 예를 나타내는 개략도이다.
도 4a는 직조 섬유 공급 스페이서의 시뮬레이션 이미지이다.
도 4b는 도 3a의 직조 섬유 공급 스페이서의 3 차원 그래프이다.
도 4c는 도 4a의 직조 섬유 공급 스페이서의 전단 모델링 결과의 3 차원 그래프이다.
도 5는 직조 섬유 공급 스페이서를 갖는 환경에서 모델링된 전단 속도의 그래프이다.
도 6은 직조 섬유 공급 스페이서에 대한 모델 결과 및 실험 결과의 표이다.
도 7은 접선형 유동 여과 장치의 체질 대 수확량의 실험 결과의 그래프이다.
도 8a는 개방 채널 여과 장치에서 막 막힘의 실험 결과의 그래프이다.
도 8b는 프로스탁(Prostak)TM 한외 여과(UF) 스크린을 갖는 장치에서 막 막힘의 실험 결과의 그래프이다.
도 8c는 D3 스크린을 갖는 장치에서 막 막힘의 실험 결과의 그래프이다.
도 8d는 D 스크린을 갖는 장치에서 막 막힘의 실험 결과의 그래프이다.
도 9는 1 미크론 막 및 D3 스크린을 갖는 접선형 유동 여과 장치의 체질 대 수확량의 실험 결과의 그래프이다.
도 10은 1 미크론 막 및 일대일 직조 스크린을 갖는 접선형 유동 여과 장치의 체질 대 수확량의 실험 결과의 그래프이다.
발명의 상세한 설명
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "하나의" 및 "그"는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수를 포함한다.
표현 "나선형으로 감긴 필터 요소"는 코어 주위에 나선형으로 감긴 여과 막을 지칭한다. 나선형으로 감긴 필터 요소는 하우징 내에 함유될 수 있고 다르게는 나선형으로 감긴 필터 모듈로 지칭될 수 있다.
"압력 강하"는 필터 요소의 길이에 걸친 공급물 채널 내의 압력 강하(예를 들어, psid)를 지칭한다.
"환류"는 면적 정규화된 유량이다.
"투과물 환류"는 투과물 채널에서 투과물의 면적 정규화된 유량(예를 들어, 리터/hr/㎡, 1mh)이다.
"교차 환류"는 공급물 채널에서 보유물의 면적 정규화된 평균 유량(예를 들어, 리터/분/㎡, LMM)이다.
"교차 유동"은 필터 또는 일련의 필터에서 공급물 채널의 입구와 출구 사이의 보유물 유량이다. 달리 언급되지 않는 한, "교차 유동"은 평균 교차 유동을 지칭한다.
용어 "전단"은 압력에 의해 생성되는 물질의 구조에서의 변형을 지칭한다.
용어 "전단률"은 점진적인 변형이 적용될 때의 속도를 지칭한다(예를 들어, s-1).
용어 "공급물", "공급물 샘플" 및 "공급물 스트림"은 분리를 위해 여과 모듈에 도입되는 용액을 지칭한다.
용어 "분리"는 일반적으로 공급물 샘플을 두 개의 스트림, 투과물 스트림 및 보유물 스트림으로 분리하는 작용을 지칭한다.
용어 "투과물" 및 "투과물 스트림"은 막을 통해 투과된 공급물의 해당 부분을 지칭한다.
용어 "보유물" 및 "보유물 스트림"은 막에 의해 유지된 용액의 부분을 지칭하고, 보유물은 유지 종이 농축된 스트림이다.
"공급물 채널"은 공급물을 위한 여과 조립체, 모듈 또는 요소에서의 도관을 지칭한다.
"투과물 채널"은 투과물을 위한 여과 조립체, 모듈 또는 요소에서의 도관을 지칭한다.
"유로"라는 표현은 여과되는 용액이 통과하는 여과 막(예를 들어, 한외 여과 막, 미세 여과 막)을 포함하는 채널을 의미한다(예를 들어, 접선형 유동 모드). 유로는 접선형 유동을 지원하는 임의의 토폴로지(topology)(예를 들어, 직선형, 코일형, 지그재그 방식으로 배열됨)를 가질 수 있다. 유로는 중공사 막에 의해 형성된 채널의 예에서와 같이, 개방되거나, 예를 들어 직조 또는 부직포 스페이서에 의해 이격된 평평한 막에 의해 형성된 직사각형 채널의 경우와 같이, 하나 또는 그 이상의 유동 방해를 가질 수 있다.
"TFF 조립체", "TFF 시스템" 및 "TFF 장치"는 단일 패스 모드 및/또는 재순환 모드(예를 들어, 전체 또는 부분 재순환) 및/또는 교대 유동 모드에서 작동하도록 구성된 접선형 유동 여과 시스템을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
"단일 잎 나선”은 하나의 연속적인 공급물 채널로 형성될 수 있는 나선형으로 감긴 필터 요소이다. 일반적으로 이들은 하나의 막 시트로 제조된다.
"다엽 나선”은 복수의 공급물 채널을 갖는 나선형으로 감긴 필터 요소이다. 일반적으로 이들은 하나 초과의 막 시트로 제조되지만; 하나의 막 시트로도 제조될 수 있다.
"카세트 홀더"는 하나 또는 그 이상의 카세트를 위한 압축 조립체를 지칭한다. 전형적으로, 카세트 홀더가 하나 초과의 카세트를 함유할 때, 카세트는 병렬 처리를 위해 구성되지만, 일부 실시양태에서, 카세트는 직렬 처리를 위해 구성될 수 있다.
"카세트"는 TFF 공정에 적합한 여과(예를 들어, 한외 여과 또는 미세 여과) 막 시트(들)를 포함하는 카트리지 또는 평판 모듈을 지칭한다.
"여과 막"은 TFF 시스템과 같은, 여과 시스템에 사용될 수 있는 선택적으로 투과성인 막을 지칭한다.
용어 "미세 여과 막" 및 "MF 막"은 약 0.1 마이크로미터 내지 약 10 마이크로미터 범위의 세공 크기를 갖는 막을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
"유체 연결된"은 공급물 채널, 보유물 채널 및/또는 투과물 채널과 같은, 액체를 위한 하나 또는 그 이상의 도관에 의해 서로 연결된 복수의 나선형으로 감긴 막 TFF 모듈을 지칭한다.
"생성물"은 표적 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 생성물은 모노클로날 항체(mAb)와 같은 관심 생체 분자(예를 들어, 단백질)일 것이다.
"처리"는 관심 생성물을 함유하는 공급물을 여과(예를 들어, TFF에 의해)하고 이어서 생성물을(예를 들어, 정제된 형태로) 회수하는 행위를 지칭한다. 생성물은 여과 막의 세공 크기 및 생성물 크기에 따라 보유물 스트림 또는 투과물 스트림 중 하나의 여과 시스템(예를 들어, TFF 조립체)으로부터 회수될 수 있다.
"병렬 처리", "병렬적 처리", "병렬 작업" 및 "병렬적 작업"이라는 표현은 공급물을 공급물 채널 또는 분기관으로부터 조립체의 각 처리 유닛으로 직접 공급함으로써 유체 연결된 복수의 처리 유닛을 함유하는 TFF 조립체에서 생성물을 처리하는 것을 지칭한다.
"직렬 처리", "직렬적 처리", "직렬 작업" 및 "직렬적 작업"이라는 표현은 공급물을 공급물 채널로부터 조립체의 첫 처리 유닛으로만 직접 공급함으로써 유체 연결된 복수의 처리 유닛을 함유하는 TFF 조립체에서 생성물을 처리하는 것을 지칭한다. 직렬 공정에서, 조립체 내의 다른 후속 공정 유닛들 각각은, 선행 공정 유닛의 보유물 라인으로부터 공급물을 수신한다(예를 들어, 제1 공정 유닛으로부터의 보유물은 제2의 인접한 공정 유닛에 대한 공급물로 기능한다).
본 발명의 예시적인 실시양태에 대한 설명이 이어진다.
관류 시스템의 접선형 유동 여과
관류 시스템 및 방법은, 공급형-배치식 시스템과 대조적으로, 세포 배양 배지의 계속적 여과에 관련된다. 여과 동안, mAb와 같은 표적 단백질, 및 세포 폐기물(예를 들어, 락트산 및 암모니아)과 같은 다른 임의의 가용성 성분은, 세포 배양 배지로부터 제거된다. 관류 시스템(대안적으로 세포 보유 시스템이라고 지칭됨)은 관류 시스템에 함유된 세포가 여과 장비를 반복적으로 통과하여 세포에 물리적 손상을 유발할 수 있으며, 결과적으로 시스템의 생산성을 감소시킬 수 있기 때문에 공급형-배치 시스템에 비해 고유한 문제가 존재한다. 관류 시스템에서 여과 동안 세포 손상을 최소화하여 표적 단백질의 지속적인 생산을 위해 가능한 한 많은 세포를 유지하는 것이 바람직하다.
접선형 유동 여과(TFF)는 크기, 분자량 또는 다른 차이에 기초하여 액체 용액 또는 현탁액 중의 성분을 분리하기 위해 막을 사용하는 분리 공정이다. TFF는 관류 공정에서 세포 배양 배지에서 표적 단백질을 제거하는 동시에 배지 내에 세포를 유지하는 데 사용된다. TFF 공정에서, 유체는 막 표면을 따라 접선 방향으로 펌핑되며, 막을 통과하기에는 너무 큰 입자, 분자 또는 세포는 제거되어 공정 탱크로 되돌아간다. TFF 공정은 공정 유체가 충분히 정화, 농축 또는 정제될 때까지 막을 가로질러 유체의 추가적인 통과(예를 들어, 재순환)가 관련될 수 있다. TFF의 교차 유동 특성은 막 막힘을 최소화하여, 배치 당 대량 처리가 가능하게 한다. 막은 나선형으로 감긴 필터 요소(도 1) 및 카세트 필터 요소(도 2)와 같은, 다양한 구성일 수 있는 필터 요소 내에 함유된다.
관류 시스템에 사용되는 현재의 TFF 장치는 중공사 장치 및 오픈 채널 카세트 장치를 포함하며, 또한 판-프레임 장치로 지칭된다. 현재 사용 가능한 관류 시스템 여과 장치의 예로는 XCellTM ATF 시스템(레필젠(Repligen), 월섬, 매사추세츠) 및 중공사 장치인, 크로스플로(KrosFlo)® Perfusion System(스펙트럼 래버러토리즈, 란초 도밍구에즈, 캘리포니아주) 및 카세트 장치인, 프로스탁TM 미세 여과 모듈(밀리포어시그마(MilliporeSigma), 빌레리카, 매사추세츠주)이 있다. 이들 장치는 공급물 스트림 내의 세포에 대한 물리적 손상을 제한하기 위해, 개방된 공급물 채널을 함유하고, 두 장치 모두 막힘(즉, 막의 벽을 따른 입자의 축적)을 최소화하기 위해 높은 교차 유량을 요구한다. 막 막힘은 막을 통한 표적 단백질 및 폐기물의 통과(즉, 체질)가 감소하기 때문에 생성물 회수를 감소시킨다. 결국, 막 막힘은 장치의 고장을 초래할 수 있으며, 여과 동안 생성물이 더 이상 회수되지 않는다.
저-전단 공급 스페이서가 있는 관류 필터 요소
여과 동안 세포 손상을 최소화하면서, 개방 채널 장치와 비교하여 mAb의 개선된 체질 및 처리량을 나타내는 관류 시스템용 필터 요소가 제공된다. 특히, 개방 미세 다공성 막(들) 및 저-전단 공급 스페이서(들)의 조합을 포함하는 관류 필터 요소 시트가 제공된다. 저-전단 공급 스페이서와 개방막(예를 들어, 약 0.65 ㎛ 초과, 약 1.0 ㎛ 초과, 또는 약 3 ㎛ 초과의 세공 크기를 갖는 막)의 조합은 공급물 채널에서 혼합을 촉진하여 막힘을 최소화하는 한편, 또한 세포 안정성 한계 내에 있는 막 및 섬유 표면에서 전단률을 유지한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 미세 다공성 막 및 직조 섬유 공급 스페이서를 포함하는 관류 필터 요소 시트를 포함한다. 미세 다공성 막은 약 0.65 ㎛ 이상(예를 들어, 0.62 ㎛, 0.65 ㎛, 0.67 ㎛, 0.8 ㎛), 약 1.0 ㎛ 이상(예를 들어, 0.95 ㎛, 1.0 ㎛, 1.2 ㎛), 또는 약 3.0 ㎛ 이상(예를 들어, 2.9 ㎛, 3.0 ㎛, 5 ㎛)의 평균 세공 크기를 가질 수 있다. 평균 세공 크기는 약 0.8 ㎛ 내지 약 10 ㎛(예를 들어, 0.77 ㎛, 0.8 ㎛, 0.9 ㎛, 2 ㎛, 4 ㎛, 6 ㎛, 8 ㎛, 10.3 ㎛), 또는 약 1.0 ㎛ 내지 약 5 ㎛(예를 들어, 0.97 ㎛, 1.2 ㎛, 3 ㎛, 5.3 ㎛)일 수 있다. 평균 세공 크기는 세포 배양액 내에 세포를 유지하면서, 세포 배양액으로부터 표적 단백질 및/또는 폐기물을 체질하도록 선택될 수 있다. 적합한 미세 다공성 막의 예는 하기 표 1에 열거된 막을 포함한다.
| 막 | 세공 크기 (μm) |
투과도(ml/min/cm2) | 제조사 |
| 셀룰로오스 아세테이트 | 0.8 | 81.3 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 셀룰로오스 아세테이트 | 1.2 | 180 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 셀룰로오스 아세테이트 | 3 | 500 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 셀룰로오스 아세테이트 | 5 | 375 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 혼합 셀룰로오스 에스테르 | 0.8 | 165 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 혼합 셀룰로오스 에스테르 | 1 | 220 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 혼합 셀룰로오스 에스테르 | 3 | 300 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 혼합 셀룰로오스 에스테르 | 5 | 400 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 혼합 셀룰로오스 에스테르 | 1.2 | 270 | 밀리포어시그마(MilliporeSigma) |
| 혼합 셀룰로오스 에스테르 | 3 | 320 | 밀리포어시그마(MilliporeSigma) |
| 혼합 셀룰로오스 에스테르 | 5 | 580 | 밀리포어시그마(MilliporeSigma) |
| 듀포어(PVDF) | 1 | >100 | 밀리포어시그마(MilliporeSigma) |
| 듀포어(PVDF) | 1.2 | >100 | 밀리포어시그마(MilliporeSigma) |
| 듀포어(PVDF) | 5 | >208 | 밀리포어시그마(MilliporeSigma) |
| 나일론 | 0.8 | 120 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 나일론 | 1.2 | 190 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 폴리카보네이트 | 0.8 | 90 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 폴리카보네이트 | 1 | 130 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 폴리카보네이트 | 2 | 300 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 폴리카보네이트 | 3 | 440 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 폴리에스테르 | 0.8 | 90 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 폴리에스테르 | 1 | 130 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 폴리에스테르 | 2 | 300 | 스털리테크(Sterlitech) |
| 폴리에스테르 | 3 | 440 | 스털리테크(Sterlitech) |
| PES | 0.8 | 117 | 스털리테크(Sterlitech) |
| PES | 1.2 | 143 | 스털리테크(Sterlitech) |
| PES | 5 | 186 | 스털리테크(Sterlitech) |
공급 스페이서는 이대일 능직 패턴 또는 일대일 직조 패턴으로 직조된 직조 섬유를 포함할 수 있다. 공급 스페이서는 적어도 약 35 %, 또는 약 35 % 내지 약 55 %(예를 들어, 34.5 %, 35 %, 36 %, 39 %, 40 %, 50 %, 55 %, 55.5 %)의 개방 면적을 가질 수 있다. 공급 스페이서의 섬유 밀도는 약 6 섬유/cm 내지 약 13 섬유/cm(예를 들어, 5.5 섬유/㎝, 6 섬유/㎝, 8 섬유/㎝, 10.6 섬유/㎝, 12.2 섬유/㎝, 13.5 섬유/㎝)일 수 있다. 공급 스페이서 섬유는 약 270 ㎛ 이상(예를 들어, 265 ㎛, 270 ㎛, 275 ㎛), 또는 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛(예를 들어, 290 ㎛, 300 ㎛, 400 ㎛, 500 ㎛, 510 ㎛)의 평균 섬유 직경을 가질 수 있다.
적합한 공급 스페이서의 실시예는 이대일 능직 패턴, 36 %의 개방 면적, 섬유 밀도 12.2 섬유/㎝, 섬유 직경 340 ㎛ 및 두께 610 ㎛을 갖는 D-스크린 프로필텍스(Propyltex)® 번호: 05-500/36, 세파(Sefar), QC, 캐나다), 및 이대일 능직 패턴, 39 %의 개방 면적, 10.6 섬유/㎝의 섬유 밀도, 360 ㎛의 섬유 직경 및 645 ㎛의 두께를 갖는 D3 스크린(프로필텍스®스크린, 제품 번호: 05-590/39, 세파, QC, 캐나다)을 포함한다. 적합한 공급 스페이서의 다른 실시예는 일대일 직조 패턴, 46 %의 개방 면적, 섬유 밀도 8 섬유/㎝, 섬유 직경 400 미크론, 및 두께 785 미크론을 갖는 E 스크린 페텍스(PETEX)®스크린, 제품 번호 07-840/46, 세파, QC, 캐나다)이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 설명된 여과 시트를 포함하는 필터 요소를 제공한다. 필터 요소는 나선형으로 감긴 필터 요소 또는 카세트 필터 요소일 수 있다.
공급물 유동 방향을 나타내는 화살표 및 막 엔벨로프(115) 내의 투과물 유동 방향을 나타내는 화살표와 함께, 나선형으로 감긴 필터 요소(100)의 실시예가 도 1에 도시되어 있다. 막 엔벨로프(115)는 선택적인 투과 스페이서(117) 위에 접힌 막(112)을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 막 엔벨로프(115)는 나선형으로 감긴 필터 요소에 포함될 수 있다. 막 엔벨로프(들)(115)는 공급 스페이서(들)(120)의 외부 표면과 평면 접촉한다. 막 엔벨로프(들)(115) 및 공급 스페이서(들)(120)는 천공된 투과물 수집 파이프(130)에 감겨있다.
관류 공정에서, 세포 배양 배지는 막(112)의 공급측으로 도입된다. 액체 공급물(예를 들어, 세포 배양 배지)은 막(112)의 표면을 가로 질러 및 공급 스페이서(120)를 통해 및 따라 이동하여, 그것은 투과물과 보유물로 분리된다. 구체적으로, 표적 단백질은 막(112)을 통과하고 수집 튜브(130)를 통해 필터를 빠져나가는 투과물로부터 회수된다. 세포는 보유되어 필터를 빠져나가는 보유물로부터 회수된다. 이어서, 보유물 중의 세포 배양 배지를 생물반응기로 되돌릴 수 있고, 투과물에 함유된 표적 단백질을 추가 처리를 위해 별도의 용기에 수집할 수 있다.
카세트 필터(20)의 실시예가 도 2에 도시되어 있다. 카세트 필터(20)는 하나 이상의 공급 판(25) 및 하나 이상의 막 판(27)을 갖는 카세트 필터 요소(28)를 포함한다. 공급 판(25)은 직조 섬유 공급 스페이서를 포함하거나 부분적으로 형성될 수 있다. 막판(27)은 막(63)을 포함한다. 필터 요소(28)는 분기관(32)과 분기관(34) 사이에 위치된다. 분기관(32)은 공급물 입구(12)와 보유물 출구(36)를 포함한다. 분기관(34)은 투과물 출구(38)와 공급물 입구(40)를 포함한다. 공급물 및 막 판(25, 27) 상에 위치된 구멍(48, 49)은 필터(20)로 유입되는 액체 공급물(예를 들어, 공급물 입구(12, 40)를 통해)이 화살표(51, 53, 55, 및 57)로 순차적으로 표시되는 경로로 이동하여 투과물 및 보유물로 분리되도록 하는 구성으로 밀봉된다. 막(63)을 통과하지 않는 보유물은 보유물 도관(44)으로 이동하고 보유물 출구(36)를 통해 필터를 빠져 나간다(화살표 67로 도시됨). 막(63)을 통과한 투과물은, 이어서 화살표(59, 61, 65)로 표시된 경로를 따라 순차적으로 이동하고, 투과물 도관(42)을 통해 이동하고 투과물 출구(38)를 통해 필터를 빠져 나간다.
본 발명의 필터 요소(예를 들어, 나선형으로 감긴 필터 요소 또는 카세트 필터 요소)는 관류 시스템에 사용되는 기존의 중공사 및 카세트 장치에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 모노클로날 항체의 정제를 위한 통상적인 여과 장치는 전형적으로 평균 세공 크기가 약 0.2 ㎛ 내지 약 0.5 ㎛인 막을 포함한다. 대조적으로, 본 발명의 실시양태에 포함된 미세 다공성 막은 약 0.65 ㎛ 이상, 예를 들어, 약 1.0 ㎛ 이상, 또는 약 3 ㎛ 이상의 평균 세공 크기를 갖는 "개방" 미세 다공성 막으로 간주될 수 있다. 본 명세서의 실시예 3 및 5의 결과는 개방 미세 다공성 막이 0.2 ㎛ 또는 0.5 ㎛의 세공 크기를 갖는 막을 갖는 통상적인 여과 장치에 비해 개선된 체질 성능을 제공한다는 것을 입증한다. 막 세공 크기가 증가함에 따라, 더 많은 세포 파편이 막을 통과할 가능성이 있다. 본 발명의 발명자에 의해 이해되고 임의의 특정 이론을 고수하지 않으면서, 세포 파편 단편은 정전기 및 소수성 상호 작용을 통해 단백질 및 DNA와 상호 작용하여 통상적인 관류 여과 장치에서 막 표면 상에 겔형 층을 형성하는 것으로 여겨진다. 이러한 상호 작용은 "더 촘촘한" 막(예를 들어, 세공 크기가 0.2 ㎛ 또는 0.5 ㎛인 막)을 갖는 장치에서 막힘을 증가시키고 체질을 감소시킨다. 추가적으로, 공급 스크린은 필터를 통해 이동하는 세포에 허용되지 않는 전단 응력을 가하는 것으로 여겨지므로, 기존 관류 장치에 포함되지 않으며, 이는 세포 보유 시스템에서 바람직하지 않다. 종래의 여과 장치의 체질 성능은 작동 중에 급격히 감소하여, 도 7에 도시된 바와 같이, 단지 200 L/m2 또는 400 L/m2의 수확량 후에 체질이 대략 40 %로 감소된다. 실시예 3 및 5에 추가로 설명된 바와 같이, 개방된 미세 다공성 막 및 직조 섬유 공급 스페이서 시트를 갖는, 본 발명의 예시적인 실시양태는, 약 500 L/m2 이상(예를 들어, 약 1 ㎛의 막 세공 크기) 또는 약 1000 L/m2 이상(예를 들어, 약 3 ㎛ 또는 약 5 ㎛의 막 세공 크기)의 수확량에 대해 약 100 % 체질을 달성할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 필터 요소의 실시예는 기존 관류 필터와 비교하여, 더 긴 작동 기간에 걸쳐 개선된 체질을 나타낸다. 또한, 본 명세서의 실시예 1-4의 결과는 약 35 % 이상의 개방 면적을 갖는 직조 섬유 스페이서 시트가 공급물 채널을 통과하는 세포에 대해 허용 가능한 전단률을 초래하면서 막힘을 감소시키기 위해 공급물 채널에서 충분한 난류를 촉진할 수 있음을 입증한다.
관류 시스템
본 발명의 필터 요소는 관류 시스템을 포함할 수 있다. 관류 시스템은 본 명세서에 설명된 하나 이상의 나선형으로 감긴 필터 요소 또는 카세트 필터 요소를 갖는 TFF 시스템을 포함할 수 있다. 하나 초과의 필터 요소를 갖는 시스템에서, 필터 요소는 직렬 또는 병렬로, 또는 둘 다, 유체적으로 연결될 수 있다.
예시적인 TFF 시스템(300)이 도 3에 도시되어 있다. 공급 탱크에서 가압된 공급물은 나선형으로 감긴 필터 모듈의 공급 포트 또는 카세트 필터의 분기관에 연결된다. 공급물은 적용되는 트랜스-채널 압력 강하에서 TFF 장치(들)의 막 라이닝된 공급물 채널을 통해 흐르며, 전형적으로 펌프를 사용하여 공급물을 가압함으로써 달성된다. 공급물 스트림으로부터의 일부 용매는 막의 표면을 통해 투과물 채널로 흐르고 투과성 종의 일부(예를 들어, 표적 단백질, 폐기물)를 운반한다. 남아있는 농축된 공급물 스트림은 모듈 또는 분기관에서 보유물 포트를 통해 흐른다. 모듈의 투과물 포트에서 흘러 나오는 투과물은 수집되거나(예를 들어, 표적 단백질의 경우) 또는 폐기되는(예를 들어, 폐기물의 경우), 공정에 의존하는 위치로 보내진다.
TFF 시스템은 재순환 모드에서 작동될 수 있으며, 여기서 보유물의 전부 또는 일부는 추가적 여과를 위해 필터 요소(들)로 복귀된다. 관류 시스템에서, 여과 후, 보유물은 생물반응기로 되돌아 가서 세포 배양 배지가 TFF 시스템을 통해 재순환되기 전에 일정 시간 동안 유지될 수 있다.
재순환 TFF 방법에 사용되는 필터 요소를 함유하는 TFF 시스템은 시스템의 전부 또는 일부를 통해 보유물을 재순환시키기 위한 하나 이상의 펌프 또는 제어 밸브 및 보유물을 재순환(예를 들어, 운반)하기 위한 하나 이상의 도관을 포함할 수 있다. 재순환된 보유물의 양은, 예를 들어, 펌프 또는 밸브를 사용하여 제어될 수 있다. 유량계는 펌프 또는 밸브에 재순환된 보유물의 양을 제어하기 위한 공정 값을 제공하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 설명된 TFF 시스템은 보유물의 재순환을 제어하기 위한 밸브 또는 펌프 및/또는 유량계를 추가로 포함할 수 있다. 밸브 또는 펌프 및/또는 유량계는 보유물 출구 또는 시스템으로부터 보유물을 보유물 리셉터클로 운반하는 유동 라인 상에 위치될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 밸브 또는 펌프 및/또는 유량계는 투과물 출구 상에 또는 시스템 밖으로 투과물을 운반하는 유동 라인에 배치되어 투과물 유동을 제어하거나 제한할 수 있다.
TFF 시스템 작동 동안 달성 가능한 최대 환류는 투과물 배출을 위한 적절한 막횡단 압력(TMP)을 선택함으로써 얻을 수 있다. 이는 압력 의존적이며 물질 전달이 제한된 작업 영역에 적용된다. 나선형으로 감긴 필터의 경우, 원하는 TMP의 달성은 모듈의 끝에서 측정하여 결정된다. 예를 들어, 두 개의 투과물 출구를 갖는 카세트의 경우, 원하는 TMP의 달성은 평균 공급물 채널 압력에 의해 결정된다. 막횡단 압력은 막을 통한 압력 강하 및 투과물 채널로부터 투과물을 배출하기 위한 최대 압력을 모두 지원하기에 충분해야 한다. 대안적으로 또는 추가적으로, TFF 시스템 작동 동안 달성 가능한 최대 환류는 투과물 배출을 위한 적절한 투과물 유량을 선택함으로써 얻을 수 있다. 투과물 밸브 또는 펌프를 사용하여 투과물 유량을 일정한 값으로 제어할 수 있다. 관류 적용의 경우, 제어되지 않은 투과물 스트림에서 가능한 것보다 낮은 수준으로 투과물 유량을 유지하고 보다 안정적인 흐름을 유지하는 것이 바람직할 수 있다.
TFF 시스템은 또한 교대식 유동 모드로 작동될 수 있다. 교대 유동 모드는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 첫 번째 방법에서, 펌프, 예를 들어 다이어프램 펌프는 필터 요소의 보유물 포트에 연결된다. 공급물은 펌프에 의해 필터 요소의 공급물 포트로 당겨져 필터 내 공급물 채널을 통해, 보유물 포트 밖으로 및 펌프로 이동한다. 이어서, 펌프는 역전되고 액체 배지(이전의 공급 용액을 포함함)는 펌프로부터 나와, 필터 요소의 보유물 측면을 통해 공급물 채널 내로, 필터의 공급물 포트 밖으로, 그리고 생물반응기로 다시 간다. 두 번째 방법에서, 펌프는 필터 요소(들)를 통해 액체 배지를 교대로 밀고 당긴다. 예를 들어, 액체 공급물은 전형적으로 필터 요소의 공급물 측으로 도입된다. 공급물은 펌프(예를 들어, 필터 요소의 공급물 포트에 연결된 펌프)를 통해 생물반응기로부터 끌어당겨지고 공급 포트를 통해 필터 요소 내로 밀린다. 액체 배지는 이어서 공급물 채널을 통해, 보유물 포트 밖으로, 및 다시 생물반응기로 이동한다. 이어서 펌프는 방향을 반대로 하여 생물반응기에서 보유물 포트를 통해 필터 요소로 공급물을 끌어 당긴다. 액체 배지는 이어서 공급물 채널을 통해, 공급 포트 밖으로 이동하며, 및 펌프를 통해, 생물반응기로 밀려 들어간다. 세번째 방법에서, TFF 시스템은 펌프 및 밸브 블록을 사용함으로써 교대 유동 모드로 작동될 수 있다. 이 방법에서, 펌프는 생물반응기로부터 액체 배지의 유동을 연속적으로 끌어당겨서 배지를 장치의 공급물 채널로 민다. 펌프를 통과한 후, 밸브는 필터로 유입되는 액체 배지의 유동 방향을 변경하는 데 사용된다. 예를 들어, 액체 배지의 유동은 초기에 펌프를 통과하여 필터의 공급물 포트로 유입된다. 배지는 공급물 채널을 통과하고 보유물 포트를 통해 필터를 빠져나와 생물반응기로 되돌아간다. 일정 시간이 지나면, 밸브가 위치를 전환하여, 펌프의 액체 배지 유동이 필터의 보유물 포트로 들어가게 하고, 공급물 채널을 통과한 다음, 공급물 포트를 통해 필터를 빠져나가고, 이어서 생물반응기로 되돌아간다. 교대 흐름은 필터 막의 역 세척을 만들어 막을 자체 청소하고 막힘을 줄인다.
도 3에 나타난 공급물 펌프는 재순환 모드 및/또는 교대 유동 모드에서 작동하도록 구성될 수 있다. 공급물 펌프는 자기 부상 펌프, 다이어프램 펌프, 연동 펌프 또는 회전식 베인 펌프와 같이, 세포에 손상을 주지 않는 펌프일 수 있다. 적합한 자기 부상 펌프의 예로는 레비트로닉스® 퓨랄레브® 시리즈 펌프(레비트로닉스 테크놀로지스, 프라밍햄, 매사추세츠주)가 있다. 적합한 다이어프램 펌프의 예로는 레필젠 XCell™ ATF 펌프(레필젠, 월섬, 매사추세츠주)가 포함된다. 적합한 연동 펌프의 예에는 왓슨 말로우 시리즈(Watson Marlow Series) 500 및 시리즈 600 펌프(왓슨 말로우, 매사추세츠주, 윌밍턴, 매사추세츠주)가 포함된다.
관류 공정
하나의 실시양태에서, 본 발명은 액체 공급물을 본 발명의 하나 이상의 필터 요소를 통해 통과시키는 단계, 액체 공급물을 필터 요소에서 투과물 및 보유물로 분리하는 단계; 및 필터 요소로부터 투과물 및 보유물의 적어도 일부를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 액체 공급물은 세포 및 표적 단백질을 함유하는 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 표적 단백질은 투과물에서 회수될 수 있고 세포는 보유물에서 유지될 수 있다.
공정은 필터 요소(들)를 통해 보유물의 적어도 일부를 재순환시키는 단계를 포함할 수 있다. 세포 배양 배지로부터 생성물을 계속적으로 수확하기 위해 재순환을 지속적으로 또는 규칙적인 간격으로 수행할 수 있다.
추가적으로, 시동 동안 보유물의 전부 또는 일부를 재순환시키는 것은 시스템이 평형에 도달하고 보유물이 생성물 용기에 수집하기 전에 원하는 농도를 달성하도록 보장하는 방법을 제공한다. 또한, 보다 강력한 공정을 제공하기 위해 처리 중에 시스템 혼란에 응답하는 편리한 방법을 제공한다. 재순환된 보유물 분획물은 세포 농도, 새로운 막 투과성, 막 막힘, 막 투과성 또는 막 질량 전달 또는 압력 강하가 배치마다 다양하더라도 매 실행 마다 제품 수집 용기로의 일정한 보유물 농도 및/또는 일정한 투과물 유량을 보장하기 위해 시스템이 튜닝될 수 있는 방법으로 펌프 또는 제어 밸브의 조절을 통해 조정될 수 있다. 이 전략은 후속 작업의 성공이 이전 작업의 출력에 의존하는 연속적인 처리와 관련하여 특별한 이점이 있다. 보유물의 재순환은 증가된 교차 유동 속도를 통해 세정 효과를 향상시키고 재순환을 통한 세정 용액을 감소시킬 수 있다.
재순환되는 보유물은 TFF 시스템 내에서 또는 그 전에 임의의 상류 위치(예를 들어, TFF 시스템의 상류에 위치한 생물반응기)로 복귀될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 보유물은 공급 탱크로 재순환된다. 다른 실시양태에서, 보유물은 TFF 시스템의 공급물 유입구 이전에 공급물 펌프 근처의 공급 라인으로 재순환된다.
실시양태에서, 본 명세서에 설명된 방법은 관류를 수행하는 것을 포함한다(예를 들어, 생물반응기로부터 단백질 생성물 및 세포 폐기물 성분을 제거하고 액체 공급물에 신선한 배지를 공급함). 관류는 연속적인 생체 처리가 일어나는 투석여과의 한 유형이다. 관류 세포 배양 배지가 주기적으로 여과되어 표적 단백질 및 폐기물을 제거함에 따라, 신선한 배지가 주기적으로 또는 계속적으로 재공급될 수 있다. 한 실시양태에서, 관류는 TFF 시스템으로부터 투과물이 제거되는 것과 동일한 속도로 신선한 배지를 생물반응기에 첨가함으로써 수행되며, 당해 기술 분야에서 계속 또는 일정한 부피의 관류로 공지된 방법이다. 관류 또는 투석 여과를 수행하기 위해, TFF 시스템은 신선한 배지 또는 투석 여과 용액을 위한 저장조 또는 용기 및 신선한 배지 또는 투석 여과 용액을 신선한 배지 또는 투석 여과 용액 용기로부터 생물반응기로 운반하기 위한 하나 또는 그 이상의 도관을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 설명된 방법은 필터 요소(들)를 통한 액체의 교대 유동을 추가로 포함한다. 방법은 액체 공급물이 보유물 측을 통해 필터로 들어가고 일정 시간 동안 공급물 측을 통해 빠져 나와서 막을 역 세척하도록 공급 펌프의 방향을 반전시키는 단계를 포함할 수 있다. 유동 방향은 예를 들어 약 12 초 이상 마다 역전될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 함유하는 액체 공급물로부터 표적 단백질을 수확하기 위한 관류 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 표적 단백질 및 숙주 세포를 함유하는 액체 공급물을 본 발명의 하나 이상의 필터 요소의 공급물 채널로 전달하고, 표적 단백질을 필터 요소(들)에서 숙주 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다. 표적 단백질은 모노클로날 항체일 수 있으며, 이는 TFF에 의해 숙주 세포로부터 분리되고 필터 요소(들)의 투과물로부터 회수된다.
상기 및 본 명세서의 실시예 4에 기재된 바와 같이, 본 발명의 관류 공정은 개방 채널 카세트 필터 요소 및 중공사 필터 요소의 사용과 관련되는 관류 공정에 비해 몇 가지 이점을 제공한다. 구체적으로, 개방 미세 다공성 막 및 저-전단 공급 스페이서를 포함하는 필터에 숙주 세포를 함유하는 액체 공급물을 전달하는 것을 포함하는 관류 공정은, 필터 요소의 수명을 증가시킨다. 예를 들어, 도 7에 도시되고 실시예 4와 관련하여 추가로 설명된 바와 같이, 통상적인 관류 공정에 비해 본 발명의 관류 공정을 사용하여 더 많은 양의 표적 단백질을 세포 배양 용액으로부터 더 오랜 시간 동안 회수할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 단백질의 약 80 % 이상, 약 90 % 이상 또는 약 95 % 이상이 필터 요소의 약 500 L/m2 이상, 약 800 L/m2 이상, 또는 약 1000 L/m2 이상의 수확량으로 세포 배양 용액으로부터 회수될 수 있다.
실시예
실시예 1: 공급 스페이서 스크린의 모델링
전단율에 대한 공급물 스크린 파라미터의 효과를 평가하기 위해 모델링 연구를 수행하였다. 오토데스크 인벤터(Autodesk Inventor)(오토데스크, Inc. 보스톤, 매사추세츠주)의 매개변수 기하학 기능을 사용하여 모델에 대해 세 개의 공급물 스크린 각각의 기하형태가 생성되었다. 모델링된 공급물 스크린은 다음을 포함하였다:(1) 이대일 능직 패턴, 32 %의 개방 면적, 16.2 섬유/㎝의 섬유 밀도, 섬유 직경 270 ㎛, 및 두께 515 ㎛를 갖는 C-스크린(프로필텍스®스크린, 세파, QC, 캐나다); (2) 이대일 능직 패턴, 36 %의 개방 면적, 12.2 섬유/㎝의 섬유 밀도, 섬유 직경 340 ㎛, 및 두께 610 ㎛를 갖는 D-스크린(프로필텍스®스크린, 세파, QC, 캐나다); 및 (3) 이대일 능직 패턴, 39 %의 개방 면적, 10.6 섬유/㎝의 섬유 밀도, 섬유 직경 360 ㎛, 두께 645 ㎛을 갖는 D3-스크린(프로필텍스®스크린, 세파, QC, 캐나다). 도 4a는 D3 직조 섬유 공급 스페이서 기하형태의 시뮬레이션을 나타낸다.
이어서 공급물 스크린 기하형태를 COMSOL 멀티피직스(Multiphysics)® Modeling Software(COMSOL, Inc., 벌링톤, 매사추세츠주)로 가져와서 압력 강하, 속도 및 전단 속도를 평가하였다. 도 4b는 도 4a의 D3 직조 섬유 공급 스페이서를 포함하는 환경의 모델을 나타낸다. 모델은 COMSOL 소프트웨어의 입자 추적 모듈을 사용하여 작성되었다. 입자 이동을 위한 경계 조건은 비 투과성 상부 판, 직조 섬유 공급 스페이서의 기하형태 및 투과성 막 표면을 포함하였다. 모델의 막 특성은 밀리포어시그마 0.65 미크론 듀라포어(Durapore)®막을 기준으로 한다. 모델은 표 2에 요약된 조건을 기반으로 작성되었다.
| 공급물 유동 (㎖/min) | 보유물 압력(psi) | 투과물 압력(psi) | 전체 막 면적(㎠) | 입자 반지름(㎛) | 입자 밀도(kg/㎥) | 농도 (num./㎖) |
| 50.7 | 3.35 | 3.06 | 74.1 | 5 | 1000-1050 | 2e7 |
도 4c는 공급물 채널에 6 LMM 교차 유동 환류가 있는 도 4b의 모델의 속도 크기를 나타낸다. 각각의 스크린에 대한 막 및 섬유 표면 둘 모두에서의 최대 전단 속도는 도 5에 도시되어 있다. 약 3500 s-1의 전단 속도는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 대해 허용되는 한계이며, 이는 mAb와 같은, 치료 단백질의 생산에 사용되는 주된 숙주 세포 유형이다. 도 5에 도시된 바와 같이, C-스크린을 함유하는 관류 필터 요소 시트의 막 및 섬유 표면 둘 모두에서의 전단 속도가 허용 한계를 초과하여, 그러한 시트를 함유하는 필터 요소를 통해 이동하는 CHO 세포가 용납 할 수 없는 높은 전단력을 경험할 것이다. 도 5에서 또한 도시된 바와 같이, D-스크린 또는 D3-스크린을 함유하는 관류 필터 요소의 전단 속도는 허용 가능한 한계 미만이었다.
실시예 2: 실험 결과와 모델 결과의 비교
펠리콘(Pellicon)®3 마이크로 판 및 프레임 형식으로 배열된 단일 필터 요소 시트를 각각 포함하는, 두 개의 원형 필터 요소가 생성되었다. 두 필터 요소 시트 모두 0.65 미크론 듀라포어® 막을 포함한다. 하나의 필터 요소 시트는 D-스크린 공급 스페이서를 함유하고 다른 하나는 D3-스크린 공급 스페이서를 포함하였다. 필터 요소는 CHO 셀벤토(Cellvento)™ 110 배지에서 CHO-S 세포를 밀리리터당 3천만 내지 6천만 개의 세포 밀도로 함유하는 세포 배양액과 함께 악타크로쓰플로우(AKTAcrossflow)™ 시스템(GE Healthcare Lifesciences, 말보로, 매사추세츠주)에서 시험이 진행되었다. 공급물, 보유물 및 투과물 유량은 실험 동안 제어되었고 공급물 압력 측정은, 도 6에 도시된 바와 같이 얻어졌다. 얻어진 실험 공급물 압력을 상응하는 보유물 및 투과물 압력 값을 사용하여 모델링된 장치의 압력과 비교하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 모델링된 장치의 결과는 시제품 장치로 측정된 공급물 압력 값과 잘 연관되어있다. 이와 같이, 모델은 시제품 장치의 공급물 채널에서 세포에 의해 경험되는 전단의 정확한 추정치를 제공하는 것으로 도시된다.
실시예 3: 필터 요소 및 펌프 테스트
시판되는 필터 요소를 갖는 네 개의 시스템 및 시제품 필터 요소를 갖는 네 개의 시스템을 포함하는 여섯 개의 상이한 세포 보유 시스템(즉, 관류 시스템)을 평가하였다. 시스템에는 다음이 포함된다:
(1) 다이어프램 펌프 및 0.13 ㎡, 0.2 미크론 PES 중공사 필터 요소를 갖는 XCell™ATF-2 시스템(레필젠, 월섬, 매사추세츠주). 시스템은 권장 교차 유량으로 교대 유동 모드로 작동되었다.
(2) 다이어프램 펌프 및 0.13 ㎡, 0.5 미크론 PES 중공사 필터 요소를 갖는 XCell™ATF-2 시스템. 시스템은 권장 교차 유량으로 교대 유동 모드로 작동되었다.
(3) 자기 부상 펌프(레비트로닉스®) 및 0.13 ㎡, 0.5 미크론 PES 중공사 필터 요소. 시스템은 권장 교차 유동 속도로 재순환 모드에서 작동되었다.
(4) 0.06 ㎡, 0.22 미크론 PVDF 막을 갖는 연동 펌프(왓슨 말로우) 및 프로스탁™ 카세트(밀리포어시그마, 빌레리카, 매사추세츠주). 시스템은 권장 교차 유동 속도로 재순환 모드에서 작동되었다.
(5) 연동 펌프(왓슨 말로우)와 함께 0.06 ㎡, 3 미크론 트랙 에칭 막(스털리테크) 및 D3 공급 스페이서(세파)를 포함하는 나선형 감긴 필터 요소. 시스템은 권장 교차 유동 속도로 재순환 모드에서 작동되었다.
(6) 레비트로닉스 자기 부상 펌프와 함께 0.06 ㎡, 3 미크론 트랙 에칭 막(스털리테크) 및 D3 공급 스페이서(세파)를 포함하는 나선형 감긴 필터 요소. 시스템은 권장 교차 유동 속도로 재순환 모드에서 작동되었다.
(7) 레필젠 다이어프램 펌프에 의해 0.06 ㎡, 3 미크론 트랙 에칭 막(스털리테크) 및 D3 공급 스페이서(세파)를 포함하는 나선형 감긴 필터 요소. 시스템은 권장 교차 유량으로 교대 유량 모드로 작동되었다.
(8) 레필젠 다이어프램 펌프에 의해 0.06 ㎡, 5 미크론 듀라포어® 막(밀리포어시그마) 및 D3 공급 스페이서(세파)를 포함하는 나선형 감긴 필터 요소. 시스템은 권장 교차 유량으로 교대 유량 모드로 작동되었다.
모든 시스템을 CHO 세포를 포함하는 공급물로 시험하였다. 특히, 밀리포어시그마 모비우스(Mobius)®3 L 일회용 생물반응기에 CHO-S 세포주 및 CHO 셀벤토 110 배지를 사용하여 밀리리터당 5 천만 개의 세포를 접종했다. 세포를 3 일째에 밀리리터당 4백만 세포까지 성장시켰으며, 이때 세포 보유 시스템이 온라인 상태가 되었다. 3-6 일에 걸쳐 매일 용기 부피의 관류 속도가 1에서 3으로 증가한 후, 이어서 나머지 실행 동안 3으로 유지되었다. 밀리리터당 3천만 내지 6천만 개의 세포 범위에서 세포 밀도를 유지하기 위해 매일 세포 출혈이 7 일에 시작되었다.
결과는 도 7에 도시되어 있다. 각각의 장치의 막 면적이 변함에 따라, 각각의 장치의 체질 성능은 장치 처리량(L/㎡, 공정 부피)의 함수로서 도시된다. 도 7에 도시된 바와 같이, 시스템(5)-(8)은 시스템(1)-(4)에 비해 처리량의 함수로서 제품 체질이 상당히 개선되었음을 보여주었다. 추가적으로, 교대 유동 모드에서 작동하는, 시스템(8)은 가장 높은 %의 제품 체질을 보여주었다.
실시예 4: 막 막힘 테스트
개방된 공급물 채널 및 다양한 스크린을 포함하는 공급물 채널을 포함하여, 상이한 공급물 채널 구성을 평가하기 위해 밀리포어시그마에서 개발한 단일 층 시험 셀에서 0.65 미크론 듀라포어® 막(밀리포어시그마)으로 네 개의 단일 층 필터 요소를 제조하였다. 필터 요소는 악타크로쓰플로우™ 시스템에서 테스트를 거쳐 공급물 채널 효율(개방형 스크린과 다양한 스크린)을 비교했다. 시스템은 투과물 펌프를 사용하여 작동시켜 TMP를 제어하였다. 시스템은 완전한 재순환 모드에서 작동하여, 보유물과 투과물을 모두 공급 탱크로 보낸다. 시스템에 대해 교차 유동을 설정하고 환류 대 TMP의 이동을 수행했다. 1, 2, 3, 4 및 5 psi의 막 횡단 압력 값이 이들 실험을 위해 표적화되었다. 용액을 각각의 설정된 TMP에서 30 분 동안 재순환시키고 환류를 모니터링 하였다. 안정적인 환류가 관찰된 값에 대해 실험을 수행하였다. 환류가 감소하면 장치 내에서 막힘이 발생한다. 모든 안정적인 환류 값은 교차 유동 및 TMP의 함수로 표시된다.
테스트 필터 요소는 다음을 포함한다:
(1) 개방 공급물 채널 (공급 스페이서가 포함되지 않음),
(2) 프로스탁™ 한외 여과(UF) 스크린(66 % 개방 면적, 6.5 섬유/㎝의 섬유 밀도, 326 ㎛ 섬유 직경, 590 ㎛ 두께),
(3) D-스크린 및
(4) D3-스크린.
시험 필터 요소의 측정된 교차 유동 환류(LMH)가 도 8a-8d에 도시되어 있다. 도 8a에 도시된 바와 같이, 시험 필터 요소(1)는 막 표면에 걸쳐 가장 낮은 환류 값을 나타내었고, 이는 개방 채널 장치에서 가장 많은 양의 막 막힘이 발생했음을 나타낸다. 도 8b 내지도 8d에서 도시된 바와 같이, 필터 요소(3) 및 (4)는 필터 요소(2)보다 더 높은 환류 값을 나타내었고, 이는 D-스크린 및 D3-스크린이 각각 막 표면에서의 감소된 입자 축적이 보다 밀접하게 직조된 UF 스크린보다 많다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 1 미크론 막의 모델링/시험
0.06 ㎡, 1 미크론 듀라포어® 막(밀리포어시그마) 및 D3 공급 스페이서(세파)를 포함하는 나선형으로 감긴 필터 요소를 레필젠 다이어프램 펌프로 시험 하였다. 시스템은 권장 교차 유량으로 교대 유량 모드로 작동되었다. 시스템을 CHO 세포를 포함하는 공급물로 시험하였다. 특히, 밀리포어시그마 모비우스®3 L 일회용 생물반응기에 CHO-S 세포주 및 CHO 셀벤토 110 배지를 사용하여 밀리리터당 5천만 개의 세포를 접종했다. 세포를 3 일째에 밀리리터당 4백만 세포까지 성장시켰으며, 이때 세포 보유 시스템이 온라인 상태가 되었다. 3-6 일에 걸쳐 매일 용기 부피의 관류 속도가 1에서 3으로 증가한 후, 나머지 실행 동안 3으로 유지되었다. 밀리리터당 3천만 내지 6천만 개의 세포 범위에서 세포 밀도를 유지하기 위해 매일 세포 출혈이 7 일에 시작되었다. 결과는 도 9에 도시되어 있다. 도 9에 도시된 바와 같이, 1 마이크론 듀라포어® 막은 대략 900 L/㎡의 처리량까지 상당히 개선된 체질을 달성하였다.
실시예 6: 일대일 직조 공급물 스크린의 모델링/테스트
레필젠 다이어프램 펌프와 함께, 0.06 ㎡, 1 미크론 듀라포어® 막(밀리포어시그마) 및 일대일 공급 스페이서(46 % 개방 면적, 8.0 n/cm 섬유 밀도, 400 ㎛ 섬유 직경, 785 ㎛ 두께, 세파)를 포함하는 나선형 감긴 필터 요소. 시스템은 권장 교차 유량으로 교대 유량 모드로 작동되었다. 시스템을 CHO 세포를 포함하는 공급물로 시험하였다. 특히 CHO-S 세포주 및 CHO 셀벤토 110 배지를 사용하여 밀리리터당 5천만 세포로 밀리포어시그마 모비우스®3 L 일회용 생물반응기를 접종하였다. 세포를 3 일째에 밀리리터당 4백만 세포까지 성장시켰으며, 이때 세포 보유 시스템이 온라인 상태가 되었다. 3-6 일에 걸쳐 매일 용기 부피의 관류 속도가 1에서 3으로 증가한 후, 나머지 실행 동안 3으로 유지되었다. 밀리리터당 3천만 내지 6천만 개의 세포 범위에서 세포 밀도를 유지하기 위해 매일 세포 출혈이 7 일에 시작되었다.
결과는 도 10에 도시되어 있다. 도 10에 도시된 바와 같이, 일대일 스크린은 대략 500 L/㎡의 처리량까지 상당히 개선된 체질을 달성하였다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개 출원 및 참고 문헌의 교시는 전문이 참고로 포함된다.
본 발명이 예시적인 실시양태를 참조하여 특히 도시되고 설명되었지만, 당업자는 첨부된 청구 범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
Claims (1)
- 약 0.65 ㎛ 이상의 평균 세공 크기를 갖는 미세 다공성 막; 및
직조 섬유를 포함하고 약 35 % 이상의 개방 면적을 갖는 공급 스페이서
를 포함하는 관류 필터 요소 시트.
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